KR960014108B1 - 미생물 직접 발효에 의한 사이클로덱스트린(Cyclodexrin)의 제조방법 - Google Patents

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Description

미생물 직접 발효에 의한 사이클로덱스크린(Cyclodextrin)의 제조방법

본 발명은 사이클로덱스클린(Cyclodextrin, 이하 CD라 칭함)을 생산함에 있어서, 시이클로덱스트린 글루카노 트랜스퍼라제(Cyclodextrin glucanotransferase 2, 4, 1, 19 이하 CGTase라 칭함.) 효소 생성 미생물을 가용성 전분 및 전분 가수분해물을 주원료로 하는 발효배지에 호기적으로 배양하면서, 일정시간간격으로 기질을 추가하여 배양액내에 직접적으로 사이클로덱스트린을 생산하는 것에 관한 것이다.

일반적으로 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)은 전분(starch)에서 CD를 생산하는 효소인 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(Cyclodextrin glucanotransferase 2, 4, 1, 19)를 미생물 발효배양액으로부터 생성 분리 정제한 후에 이 효소를 기질인 전분 혹은 전분가수분해물과 반응시켜서 CD를 생산 분리하는 다단계 공정에 의해서 제조되고 있다.

CD는 6~12개의 포도당이 알파 1, 4 글루코시드(α-1, 4 gluco-side) 결합으로 환산이 된 비환원성 말토 올리고당(Malto-oligosaccharide)으로서 산업적으로 주로 이용되고 있는 것은 포도당 수가 6, 7, 8개의 것이며 각각 알파-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, 이하 α-CD라 칭함), 베타-사이클로덱스크린(β-cyclodextrin, 이하 β-CD라 칭함), 감마-사이클로덱스크린(γ-cyclodextrin, 이하 γ-CD라 칭함)의 3종류가 있다.

이들 3종류는 모두 환상의 구조이며, 그 중앙에 분자공동을 갖고 있어 이곳에 여러 가지 유기화합물과 금속 화합물질을 흡입 혹은 결합하여 포접 화합물(Inclusion Body)을 형성하는 기능을 갖고 있다.

이와 같은 CD의 성질을 이용하여 휘발물질의 비휘발화, 산화 분해 작용으로부터의 보호, 용해성, 색, 맛등의 변화 유도, 혹은 변화 방지, 반응성의 변화 등의 용도개발로 식품 및 약품의 보조제로서 각광을 받고 있는 신기능 물질의 하나이다.

이러한 CD는 1904년 샤르딘져(Schardinger)가 그 제법 및 분리법을 발표한 이후 1939년 틸든(Tilden)과 허드슨(Hudson)이 CD 생성효소인 CGTase를 발견하면서 최근 바실러스 서부틸러스(Bacillus subtilis) 배양액에서의 CGTase 제조법 (일본공개 특허공보 소화 61-132183호), 바실러스 코아귤란스(Bacillus Coagulans)에 속하는 균주를 이용하여 신규의 CGTase의 조제 및 β-CD의 생산(일본공개특허공보 평성 1-199575호).

바실러스 서틸러스(Bacillus subtills) 균주에 CGTase 유전자를 클로링(cloning)하여 CGTase 한외여과막에 고정시킨 후 전분과 당의 기질용액을 통액시켜 말토올리고당(Malto Oligosaccharide)을 생산하는 방법(일본공개특허공보 평상 1-179698호), CGTase를 전분 가분해물에 처리하여 CD를 조제할 때 수용성 유기용매를 첨가하여 CD의 생산을 증가시키는 방법(일본공개특허공보 평성 1-37510호)등이 알려져 있다.

일반적으로 미생물에 의해서 생산되는 효소를 이용할때는 목적효소를 생산하는 미생물을 배양한후(1차 공정), 이용가능할 정도로 분리 정제한 다음(2차 공정), 생산가능한 물질을 조제하는 생산공정(3차 공정)에 투입하게 되며, CGTase를 이용하여 CD를 생산할때도 이와 같은 3-4단계 공정을 거쳐야만 목적 생산물질인 CD를 생산하게 되는 것이다.

즉, 기존 CD 생산방법은 효소생산을 위한 발효공정, 효소의 정제공정, 기질과 효소의 반응공정, 그리고 목적생산물의 회수 공정등의 4단계 공정으로 구성되어 있다.

다시 한번 설명하면, 상기의 모든 방법은 CD를 만들 수 있는 효소인 CGTase를 생성하는 미생성물을 발효공정에서 배양하여 그 배양으로부터 CGTase를 분리 정제한 후에 별도의 공정에서 가용성 전분과 반응시킨 후 CD를 제조하어 반응액내의 각각의 CD를 분리 정제하게 되는 4단계 공정으로 목적 생성물을 생산하게 되는 것이다.

이와 같은 미생물을 배양하여 효소를 분리 정제한 후 그 다음공정에서 제품 혹은 반제품화된 효소를 이용하여 목적 생산물을 제조할 때 효소의 분리공정이 매우 어렵고 복잡하며 경제적으로도 많은 원가 부담을 갖게 되는 것이다.

본 발명자등은 이와 같은 복잡하고 경제적으로도 원가가 높은 CD 생산법을 실험해 오던 중 복잡한 공정을 단순화시킬 수 있는 새로운 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

즉, CD를 생산할 때 미생물에서부터 CGTase를 생성시켜 분리정제하는 것이 아니고 CGTase를 생성하는 균주를 배양하면서 배양액내에서 직접 CD를 생산축적시켜 분리하는 특정을 가질뿐만 아니라 다단의 공정을 단순화 시킨 것이다.

다시 설명하면 미생물이 배양액내에 생성한 CGTase를 분리 정제하여 기질과 반응시키는 방법이 아니고 배양액 내에 가용성 전분 혹은 전부가수분해물질을 기질로 추가함으로써 CD를 배양액 내에 축적시킨 후 축적된 CD를 직접 분리 정제하여 생산하는 직접발효법에 의한 CD의 생산방법을 발명하게 된 것이다.

본 발명에 주로 사용된 CD 생산 균주는 토양에서 분리한 바실러스속(Bacillus sp. KCTC-8510P) 균주를 이용하였으며, 이 균주는 β-CD와 γ-CD를 생산하여 α-CD를 생산하지 않는 CGTase효소를 균체외 효소(extracellular enzyme)로 분비하는 것을 특징으로 하고 있다.

그외 사용균주로는 바실러스 마세란스 (Bacillus macerans KCTC 3070), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans ATCC 21783), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans ATCC 7050)등으로 CGTast 생성균주는 대부분이 이용가능한 것으로 나타났다.

표 1)에 나타난 바와 같이 상기의 각 균주를 배양하면서 배양액내에 직접적으로 생산 축적되는 전체 CD의 양을 측정해 본 결과, 바실러스속(Bacillus sp. KCTC-8510P)균과 바실러스 마세란스(Bacillus macerans KCTC 3070)균주는 다량의 CD를 축적했으며, 바실러tm 서큘란스(Bacillus circulans ATCC 21783)와 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans ATCC 7050)균주는 다소 낮은 농도로 축적되는 것을 확인할 수 있었다.

그림1. 기존의 CD 생산공정과 본 발명의 CD 생산공정비교

이와 같은 본 발명의 방법은 상기 그림1. 의 비교에서 알 수 있듯이 기존방법에 비해 매우 특이한 신규의 방법이며 단순화된 공정으로서 CD를 생성할 수 있는 특징을 지니고 있는 것이다.

본 발명에 사용한 효소활성 측정방법은 기질로 4%의 가용성 전분을 0.05몰(M) 인산완충용액에 녹여 효소액 0.1밀리리터(㎖)를 첨가한 후 50℃에서 10분간 반응시킨다.

반응중지는 30밀리몰(mM) 수산화나트륨 3.5㎖를 반응액에 첨가하였다.

5mM 탄산나트륨(NaCO₃)에 녹인 0.02%의 페놀프탈레인 용액 0.5㎖를 가한 후, 550 나노미터(nm)에서 흡광도를 측정하여 색이 감소하는 정도를 효소역가로 하였다.

CD를 생산할 때 배양액내 CD의 축적 및 CGTase 활성의 변화는 그림 2)에 도시된 바와같이 24시간 이전에 CGTase 활성은 급격히 증가하나 48시간 이후에는 평형상태를 유지하였다.

한편 CD의 축적은 60시간까지는 급격히 증가하였으나, 60시간 이후에는 기질을 첨가하여도 CD의 축정량은 증가하지 않는 것으로 나타났다.

이러한 현상은 40~50㎎/㎖의 총 CD가 축적됨으로써 기질인 가용성 전분을 CD로 전환시키는 CGTase의 작용을 저해시키는 것을 기인하는 것으로 판단되어진다.

그림2. 균주의 배양시간별CD의 축적량과 CGTase의 역가변화

이하 본 발명에서 실시예에서 상세하게 설명된다.

실시예 1

사용균주 : 바실러스속 Bacillus sp. (KCTC-8510P)

사용배지 : 1)종배지 : 1% 가용성 전분(soluble starch), 0.5% 폴리펩톤(polypepton), 0.5% 이이스트 추출액(yeast extract), 0.1% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄, 1% Na₂CO₃pH 10.9, 2)발효배지 : 2% 가용성 전분 혹은 전분가수분해물, 0.5% 폴리펩톤(polypepton), 0.5% 이이스트 추출액(yeast extract), 0.1% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄, 1% Na₂CO₃, pH 10.0, 3)추가배지 : 20% 가용성 전분 혹은 전분가수분해물, 0.5% 이이스트추출액 pH 10.9

30㎖의 종배지를 500㎖ 진탕 플라스크에 분주하여 멸균냉각한 후 고체배지상에서 생육한 균주를 접종하여 24시간, 37℃에서 160회 원심 진탕하면서 배양한 액을 종배양액으로 사용한다.

300㎖의 발효배지를 1리터 진탕 플라스크에 분주하여 멸균 냉각한 후 종배양액을 10%(30㎖) 접종하여 37℃에서 160회 원심 진탕하면서 72시간 배양한다.

배양시간 24, 48시간에 기질의 최종농도가 각각4%가 되도록 강용성 전분을 첨가하였다.

배양액내의 전체 CD 축적량은 24.8㎎/㎖이고 CGTase의 역가는 3.0unit/㎖로 나타났다.

실시예 2

실시예 1의 발효베지를 5L 소형 발효조에 2L에 사입하여 멸균 냉각 준비한다.

여기에 미리 준비한 종균 배양액 200㎖를 접종하여 280rpm, 2vvm의 통기 조건으로 37℃에서 72시간 배양한다.

pH의 조절은 초기 10.9로 조절하며, 그 후는 조절하지 않는다.

발효도중의 기질인 가용성 전분의 첨가는 배양시간 24, 36, 48, 60 시간에 각각 기질의 최종농도가 4%가 되도록 첨가하면서 배양하였다.

발효 종료시 배양액내 총 CD의 축적량은 43.6㎎/㎖였고, CGTase의 역가는 5.1unit/㎖로 나타났다.

실시예 3

실시예 2의 발효배지중 가용성 전분을 전분 가수 분해물로 교체하고 그외는 동일한 방법으로 실시한다.

배양 종료액 내의 총 CD 축적량은 32㎎/㎖이었으며, CGTase의 역가는 4.8unit/㎖로 나타났다.

실시예 4

바실런스 마세란스(Bacillus macerans) KCTC 3070 균주를 바실러스 속(Bacillus sp.)(KCTC 8510P) 대신에 실시예 1의 종배지에서 탄산나트륨(Na₂CO₃)이 제외된 배지에 접종하여 실시예 1과 동일한 방법으로 종배양을 실시하고, 실시예 1의 발효배지에서 탄산나트륨(Na₂CO₃)이 제외된 발효배지를 이용 실시예2와 동일한 방법으로 배양하되 pH는 7.0으로 하여 배양하였다.

배양액의 총 CD량은 39.3㎎/㎖였고, CGTase 역가는 4.7unit/㎖로 나타났다.

실시예 5

실시예 1과 동일한 방법으로 행하나 바실러스 속(Bacillus sp.)(KCTC 8510P) 대신 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) ATCC 21783 균주를 접종하여 배양하였다.

배양 종료액의 총 CD양은 12.2㎎/㎖였고, CGTase 역가는 2.3unit/㎖로 나타났다.

실시예 6

바실러스 속(Bacillus sp.)(KCTC-8510P) 대신 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) ATCC 7050 균주를 접종한 후 실시예 4와 같이 배양하였다.

배양 종료액의 총 CD양은 9.7㎎/㎖였고, CGTase 역가는 1.9unit/㎖로 나타났다.

Claims (2)

1. 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)을 생산함에 있어서 사이클로덱스크린 글루카노트랜스퍼라제(Cyclodextrin glucanotransferase) 생성 미생물인 바실러스 속(Bacillus sp. KCTC-8510P), 바실리스 미세란스(Bacillus macerans, KCTC-3070), 바실런스 서큘란스(Bacillus circulas, ATCC-21783), 바실러스 코아큘란스(Bacillus coagulans, ATCC-7050)균주중 하나를 가용성 전분 및 전분가수 분해물을 주원료로 하는 발효배지에 호기적으로 배양하면서 일정 시간간격으로 기질을 추가하여 배양액내에 직접적으로 사이클로덱스트린을 생성 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물 직접발효에 의한 사이클로덱스트린의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 통기량을 2VVM으로 조절하면서 기질의 추가를 배양 24시간 이후 12시간 간격으로 최종 농도가 4%가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트린의 제조방법.