JP3183970B2 - シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法 - Google Patents
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、シクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼの製造方法に関し、
より詳細には、バチルス属に属する新菌株を用いた糖転
移活性の強いシクロマルトデキストリングルカノトラン
スフェラーゼの製造方法に関するものである。
トリングルカノトランスフェラーゼの製造方法に関し、
より詳細には、バチルス属に属する新菌株を用いた糖転
移活性の強いシクロマルトデキストリングルカノトラン
スフェラーゼの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】シクロ
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼは、一
般にバチルスマセランス(Bacillus macerans) 、バチル
ス メガテリウム(Bacillus megaterium) 、バチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s) 、バチルス サーキュランス(Bacillus circulan
s)、クレブシラ ニューモニエ(Klebsiella pneumonia
e) 等の細菌を適当な培地で培養して得られるものであ
る。例えば、生物化学実験法第２５巻、澱粉・関連糖質
酵素実験法（学会出版センター、１９８９年）にその培
養方法及び条件等が記載されている。
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼは、一
般にバチルスマセランス(Bacillus macerans) 、バチル
ス メガテリウム(Bacillus megaterium) 、バチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s) 、バチルス サーキュランス(Bacillus circulan
s)、クレブシラ ニューモニエ(Klebsiella pneumonia
e) 等の細菌を適当な培地で培養して得られるものであ
る。例えば、生物化学実験法第２５巻、澱粉・関連糖質
酵素実験法（学会出版センター、１９８９年）にその培
養方法及び条件等が記載されている。
【０００３】このシクロマルトデキストリングルカノト
ランスフェラーゼは、主に澱粉又は澱粉系糖質を加水分
解して、α−、β−、γ−シクロデキストリン、主とし
てβ−シクロデキストリンを生成し、またこれを開環的
に加水分解する特異な酵素として知られている。この作
用により得られるシクロデキストリンとは、グルコース
が６分子以上α−１，４結合した環状のオリゴ糖であ
り、グルコース６分子、７分子、８分子のものが各々α
−、β−、γ−シクロデキストリンと呼ばれている。
ランスフェラーゼは、主に澱粉又は澱粉系糖質を加水分
解して、α−、β−、γ−シクロデキストリン、主とし
てβ−シクロデキストリンを生成し、またこれを開環的
に加水分解する特異な酵素として知られている。この作
用により得られるシクロデキストリンとは、グルコース
が６分子以上α−１，４結合した環状のオリゴ糖であ
り、グルコース６分子、７分子、８分子のものが各々α
−、β−、γ−シクロデキストリンと呼ばれている。
【０００４】シクロデキストリンは、外側が親水性、内
側が疎水性のドーナツ状の構造を有し、適当な大きさの
疎水性分子をその中に包接することができる。このため
に、物質の安定化、可溶化、酸化防止などの目的で、広
く食品、医薬品、化粧品、化学品分野で利用されてい
る。また、シクロマルトデキストリングルカノトランス
フェラーゼは、糖転移活性を有することが知られてお
り、各種の有用な特徴を持つオリゴ糖、配糖体等の糖鎖
の合成にも利用されている。
側が疎水性のドーナツ状の構造を有し、適当な大きさの
疎水性分子をその中に包接することができる。このため
に、物質の安定化、可溶化、酸化防止などの目的で、広
く食品、医薬品、化粧品、化学品分野で利用されてい
る。また、シクロマルトデキストリングルカノトランス
フェラーゼは、糖転移活性を有することが知られてお
り、各種の有用な特徴を持つオリゴ糖、配糖体等の糖鎖
の合成にも利用されている。
【０００５】しかし、従来のシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼは、その糖転移活性があま
り強くないために、より糖転移活性の強いシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼが求められて
いる。
グルカノトランスフェラーゼは、その糖転移活性があま
り強くないために、より糖転移活性の強いシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼが求められて
いる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明によれば、バチ
ルス属に属するＤＫ−１１３９菌株又はその変異株を培
養し、その培養物からシクロマルトデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼを採取することを特徴とするシク
ロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製
造方法が提供される。
ルス属に属するＤＫ−１１３９菌株又はその変異株を培
養し、その培養物からシクロマルトデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼを採取することを特徴とするシク
ロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製
造方法が提供される。
【０００７】この発明に利用するバチルス属に属するＤ
Ｋ−１１３９菌株は、長野県大町市の畑土壌より分離さ
れたものであり、微工研菌寄第１３１９９号として寄託
されている。バチルス属に属するＤＫ−１１３９菌株の
菌学的性質は以下のとおりである。一般的な細菌用培地
には生育しにくいため、生育状態の観察には以下の培地
組成のものを使用した。
Ｋ−１１３９菌株は、長野県大町市の畑土壌より分離さ
れたものであり、微工研菌寄第１３１９９号として寄託
されている。バチルス属に属するＤＫ−１１３９菌株の
菌学的性質は以下のとおりである。一般的な細菌用培地
には生育しにくいため、生育状態の観察には以下の培地
組成のものを使用した。
【０００８】 可溶性デンプン 1.0 ％ 酵母エキス 0.5 ％ ペプトン 0.5 ％ リン酸２カリウム 0.1 ％ 硫酸マグネシウム・７水和物 0.02％ 炭酸ナトリウム 1.0 ％ 形態 １）形 桿菌 ２）大きさ 0.6〜0.9×２〜10μｍ ３）芽胞形態 卵円型 ４）胞子嚢 膨脹しない ５）運動性 あり ６）グラム染色 陽性 ７）コロニー 淡黄褐色でやや光沢があり、薄く平
滑で透明
滑で透明
【０００９】生理学的性質 以下の生理学的検査に使用した培地は、試験用培地に炭
酸ナトリウムを１％加えておよそｐＨ10に調整したもの
を使用した。 １）カタラーゼ 陽性 ２）オキシダーゼ 陽性 ３）ＶＰテスト 陰性 ４）クエン酸塩の利用 陰性 ５）ゼラチン水解 陽性 ６）デンプン水解 陽性 ７）硝酸塩の還元 陽性 ８）インドール生成 陰性 ９）塩化ナトリウム存在下での生育 ２％、５％で生育し、７％、10％では生育しない 10）生育温度 25℃、30℃、35℃で生育し、50℃、55℃では生育しない 11）生育ｐＨ ｐＨ7.0 では生育しない ｐＨ8.0 、9.0 で生育する ｐＨ10.0ではたいへんよく生育する 12）酸素に対する態度 好気性 以上の菌学的性質から、本菌はバチルス属に属する細菌
であると同定された。バージーズ マニュアル オブ
システマティック バクテリオロジー(Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology)には、アルカリ性バチル
ス属に属する菌株として３種類が記載されているが、本
菌とは細胞の形態、塩化ナトリウムに対する耐性、硝酸
塩還元性等が異なり、上記特徴を有する菌種の記載はな
く、新規な菌株であると考えられる。
酸ナトリウムを１％加えておよそｐＨ10に調整したもの
を使用した。 １）カタラーゼ 陽性 ２）オキシダーゼ 陽性 ３）ＶＰテスト 陰性 ４）クエン酸塩の利用 陰性 ５）ゼラチン水解 陽性 ６）デンプン水解 陽性 ７）硝酸塩の還元 陽性 ８）インドール生成 陰性 ９）塩化ナトリウム存在下での生育 ２％、５％で生育し、７％、10％では生育しない 10）生育温度 25℃、30℃、35℃で生育し、50℃、55℃では生育しない 11）生育ｐＨ ｐＨ7.0 では生育しない ｐＨ8.0 、9.0 で生育する ｐＨ10.0ではたいへんよく生育する 12）酸素に対する態度 好気性 以上の菌学的性質から、本菌はバチルス属に属する細菌
であると同定された。バージーズ マニュアル オブ
システマティック バクテリオロジー(Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology)には、アルカリ性バチル
ス属に属する菌株として３種類が記載されているが、本
菌とは細胞の形態、塩化ナトリウムに対する耐性、硝酸
塩還元性等が異なり、上記特徴を有する菌種の記載はな
く、新規な菌株であると考えられる。
【００１０】この発明のシクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼの製造方法には、上記のバチル
ス属に属するＤＫ−１１３９菌株又はその変異株が用い
られる。ここに使用された“変異株”とは、自然に又は
故意もしくはその他で適用されるかにかかわりなく外部
の剤により生ずる変異菌を含むものである。変異株を作
る適当な方法としては、Ｈ．Ｉ．ラドラー氏、国際原子
力エネルギー局、ウィンでのシンポジウムの議事録、１
９７３年、第２４１頁の“工業用微生物への照射と放射
性同位性元素”の中での「微生物の発展技術」に述べら
れた方法が含まれる。これには次のことが含まれてい
る。 ｉ）イオン化照射（例えばＸ線やγ線照射）、紫外線
光、紫外線光と感光剤（例えば８−メトキシプソラレ
ン）、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ピリミジン塩基同
族体（例えば５−ブロムウラシル）、アクリジン類、ア
ルキル化剤（例えばマスタードガス、エチルメタンスル
ホン酸塩）、過酸化水素、フェノール類、ホルムアルデ
ヒド、熱など。 ii）くみかえ、形質変換、形質導入、溶原化、溶原的変
換や突然変異用の選択的手法のような遺伝学的手法。
カノトランスフェラーゼの製造方法には、上記のバチル
ス属に属するＤＫ−１１３９菌株又はその変異株が用い
られる。ここに使用された“変異株”とは、自然に又は
故意もしくはその他で適用されるかにかかわりなく外部
の剤により生ずる変異菌を含むものである。変異株を作
る適当な方法としては、Ｈ．Ｉ．ラドラー氏、国際原子
力エネルギー局、ウィンでのシンポジウムの議事録、１
９７３年、第２４１頁の“工業用微生物への照射と放射
性同位性元素”の中での「微生物の発展技術」に述べら
れた方法が含まれる。これには次のことが含まれてい
る。 ｉ）イオン化照射（例えばＸ線やγ線照射）、紫外線
光、紫外線光と感光剤（例えば８−メトキシプソラレ
ン）、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ピリミジン塩基同
族体（例えば５−ブロムウラシル）、アクリジン類、ア
ルキル化剤（例えばマスタードガス、エチルメタンスル
ホン酸塩）、過酸化水素、フェノール類、ホルムアルデ
ヒド、熱など。 ii）くみかえ、形質変換、形質導入、溶原化、溶原的変
換や突然変異用の選択的手法のような遺伝学的手法。
【００１１】この発明のバチルス属に属するＤＫ−１１
３９菌株又はその変異株を培養する方法としては、好気
的表面培養又は深部培養のいずれでもよく、その中で深
部培養が望ましい。培地としては、微生物の培養の一般
に使用される炭素源、窒素源、無機塩類を適切に組み合
わせたものを用いることができる。例えば、炭素源とし
てはデンプン、デキストリン、グルコース等、窒素源と
してはコーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、大豆粉、硝酸塩、アンモニウム塩等、無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、カリウム塩等があげられる。
３９菌株又はその変異株を培養する方法としては、好気
的表面培養又は深部培養のいずれでもよく、その中で深
部培養が望ましい。培地としては、微生物の培養の一般
に使用される炭素源、窒素源、無機塩類を適切に組み合
わせたものを用いることができる。例えば、炭素源とし
てはデンプン、デキストリン、グルコース等、窒素源と
してはコーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、大豆粉、硝酸塩、アンモニウム塩等、無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、カリウム塩等があげられる。
【００１２】培養は、25〜45℃、好ましくは30〜40℃の
温度範囲で、ｐＨ８〜12で行うのが適切であり、ｐＨ９
〜11で行うのが好ましい。培養期間は通常１〜７日間で
あるが、シクロマルトデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼ産生が最大に達したときに培養を終了すればよ
い。この発明のシクロマルトデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼを培養終了後の培養液から抽出、精製す
る方法としては、通常、種々の酵素を抽出、精製する際
に用いられる方法のいずれを使用してもよい。例えば、
培養液を遠心分離又は濾過することにより菌体等を分離
した後、限外濾過、塩析、溶媒沈澱、透析、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、電気泳動、凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法を適宜組み
合わせて使用することができる。その中で特に、β−シ
クロデキストリンポリマーカラムを用いた吸着クロマト
グラフィーとセファデックスＧ−200 を用いたゲル濾過
を組み合わせて使用する方法が好ましい。
温度範囲で、ｐＨ８〜12で行うのが適切であり、ｐＨ９
〜11で行うのが好ましい。培養期間は通常１〜７日間で
あるが、シクロマルトデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼ産生が最大に達したときに培養を終了すればよ
い。この発明のシクロマルトデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼを培養終了後の培養液から抽出、精製す
る方法としては、通常、種々の酵素を抽出、精製する際
に用いられる方法のいずれを使用してもよい。例えば、
培養液を遠心分離又は濾過することにより菌体等を分離
した後、限外濾過、塩析、溶媒沈澱、透析、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、電気泳動、凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法を適宜組み
合わせて使用することができる。その中で特に、β−シ
クロデキストリンポリマーカラムを用いた吸着クロマト
グラフィーとセファデックスＧ−200 を用いたゲル濾過
を組み合わせて使用する方法が好ましい。
【００１３】上記の方法によって得られるシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼは、澱粉又は
澱粉系糖質を加水分解してα−、β−、γ−シクロデキ
ストリン及びデキストリンを生成する作用を有し、かつ
グルコシル基供与体からグルコシル基受容体にグルコー
ス残基を転移して種々のオリゴ糖や配糖体等を生成する
作用を有している。グルコシル基供与体としてはグルコ
ースリン酸、オリゴ糖等が含まれ、グルコシル基受容体
としては単糖、オリゴ糖、アルコール、フェノール、リ
ン酸、ヌクレオチド等が含まれる。
デキストリングルカノトランスフェラーゼは、澱粉又は
澱粉系糖質を加水分解してα−、β−、γ−シクロデキ
ストリン及びデキストリンを生成する作用を有し、かつ
グルコシル基供与体からグルコシル基受容体にグルコー
ス残基を転移して種々のオリゴ糖や配糖体等を生成する
作用を有している。グルコシル基供与体としてはグルコ
ースリン酸、オリゴ糖等が含まれ、グルコシル基受容体
としては単糖、オリゴ糖、アルコール、フェノール、リ
ン酸、ヌクレオチド等が含まれる。
【００１４】そこで、この発明のシクロマルトデキスト
リングルカノトランスフェラーゼの糊精化力（澱粉分解
力）に対するショ糖を受容体とした糖転移活性化（糊精
化力が活性１単位のときのショ糖を受容体とした糖転移
活性の活性単位数）を求めると8.36であり、これは、従
来糖転移活性が強いことで知られていた特公昭53-27791
号に開示のバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillu
s stearothermophilus) の産生するシクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼが1.84であったのに
比べ、著しく高い値となっている。従って、この発明の
方法により得られるシクロマルトデキストリングルカノ
トランスフェラーゼは、従来公知のものに比べ、非常に
強い糖転移活性を示すという顕著な作用を有するもので
ある。
リングルカノトランスフェラーゼの糊精化力（澱粉分解
力）に対するショ糖を受容体とした糖転移活性化（糊精
化力が活性１単位のときのショ糖を受容体とした糖転移
活性の活性単位数）を求めると8.36であり、これは、従
来糖転移活性が強いことで知られていた特公昭53-27791
号に開示のバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillu
s stearothermophilus) の産生するシクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼが1.84であったのに
比べ、著しく高い値となっている。従って、この発明の
方法により得られるシクロマルトデキストリングルカノ
トランスフェラーゼは、従来公知のものに比べ、非常に
強い糖転移活性を示すという顕著な作用を有するもので
ある。
【００１５】
【実施例】この発明のシクロマルトデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼの製造方法及び得られたシクロマ
ルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの酵素特
性を実施例で説明する。シクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼの糊精化力とショ糖を受容体と
した糖転移活性力は、以下の方法で測定した。 測定方法１（糊精化力） １mMの塩化カルシウムを含む 0.02M酢酸緩衝液（ｐＨ5.
5 ）に、0.3 ％( w/v) となるように可溶性澱粉を溶解
させたものを基質溶液とし、この基質溶液５mlにこの発
明の酵素液0.2ml を加え、40℃で10分間反応させた。そ
の後、その反応液0.5ml を 0.02N硫酸15mlの中に入れ、
反応を停止させた。反応停止後、0.1Nヨード液0.2ml を
加えて混合し、660nm における吸光度を測定した。予め
作成しておいた検量線から残存澱粉量を求め、糊精化力
を決定した。なお、活性１単位は、40℃、10分間で可溶
性澱粉15mgのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とし
た。
ノトランスフェラーゼの製造方法及び得られたシクロマ
ルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの酵素特
性を実施例で説明する。シクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼの糊精化力とショ糖を受容体と
した糖転移活性力は、以下の方法で測定した。 測定方法１（糊精化力） １mMの塩化カルシウムを含む 0.02M酢酸緩衝液（ｐＨ5.
5 ）に、0.3 ％( w/v) となるように可溶性澱粉を溶解
させたものを基質溶液とし、この基質溶液５mlにこの発
明の酵素液0.2ml を加え、40℃で10分間反応させた。そ
の後、その反応液0.5ml を 0.02N硫酸15mlの中に入れ、
反応を停止させた。反応停止後、0.1Nヨード液0.2ml を
加えて混合し、660nm における吸光度を測定した。予め
作成しておいた検量線から残存澱粉量を求め、糊精化力
を決定した。なお、活性１単位は、40℃、10分間で可溶
性澱粉15mgのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とし
た。
【００１６】 測定方法２（ショ糖を受容性とした糖転移活性力） この方法は、特公昭53-27791号に開示の方法に準じてい
る。２mMの塩化カルシウムを含む 0.03M酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ5.5 ）に、各々6.7 ％(w/v ) となるように可溶性澱
粉及びショ糖を溶解させたものを基質溶液とし、この基
質溶液３mlにこの発明の酵素液１mlを加え、40℃で10分
間反応させた。その後、その反応液0.5ml を1N塩酸９ml
の中に入れ、反応を停止させた。反応停止後、0.5ml を
サンプリングし、 0.02N硫酸15mlの中に入れ、さらに0.
1Nのヨード液0.2ml を加えて混合した後、660nm の吸光
度を測定した。予め作成しておいた検量線から残存澱粉
量を求め、ショ糖を受容性とした糖転移活性力を決定し
た。なお、活性１単位は、40℃、10分間で可溶性デンプ
ン200mg のヨウ素呈色を10％減少させる酵素量とした。
る。２mMの塩化カルシウムを含む 0.03M酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ5.5 ）に、各々6.7 ％(w/v ) となるように可溶性澱
粉及びショ糖を溶解させたものを基質溶液とし、この基
質溶液３mlにこの発明の酵素液１mlを加え、40℃で10分
間反応させた。その後、その反応液0.5ml を1N塩酸９ml
の中に入れ、反応を停止させた。反応停止後、0.5ml を
サンプリングし、 0.02N硫酸15mlの中に入れ、さらに0.
1Nのヨード液0.2ml を加えて混合した後、660nm の吸光
度を測定した。予め作成しておいた検量線から残存澱粉
量を求め、ショ糖を受容性とした糖転移活性力を決定し
た。なお、活性１単位は、40℃、10分間で可溶性デンプ
ン200mg のヨウ素呈色を10％減少させる酵素量とした。
【００１７】実施例１ 可溶性デンプン 1.0％( w/v 以下同じ) 、ペプトン 0.5
％、酵母エキス 0.5％、燐酸水素二カリウム 0.1％、硫
酸マグネシウム0.01％、炭酸ナトリウム 1.0％を含む滅
菌された培地（ｐＨ10.0）７L を 10L容培養槽に入れ、
これにバチルス属に属するＤＫ−１１３９菌株の前培養
液100ml を植菌し、温度35℃、攪拌回転数300rpm、通気
量 3.5L/分で４日間培養した。
％、酵母エキス 0.5％、燐酸水素二カリウム 0.1％、硫
酸マグネシウム0.01％、炭酸ナトリウム 1.0％を含む滅
菌された培地（ｐＨ10.0）７L を 10L容培養槽に入れ、
これにバチルス属に属するＤＫ−１１３９菌株の前培養
液100ml を植菌し、温度35℃、攪拌回転数300rpm、通気
量 3.5L/分で４日間培養した。
【００１８】培養液を遠心分離し、上澄液を粗酵素とし
て酵素力価（糊精化力）を測定したところ11.7U/mgタン
パクの比活性であった。この粗酵素液に終濃度10％とな
るように硫酸ナトリウムを溶解し、予め10％硫酸ナトリ
ウムにて平衡化したβ−シクロデキストリンポリマーカ
ラム（ 1.5×30cm）に吸着させ、蒸留水にて溶出させ
た。
て酵素力価（糊精化力）を測定したところ11.7U/mgタン
パクの比活性であった。この粗酵素液に終濃度10％とな
るように硫酸ナトリウムを溶解し、予め10％硫酸ナトリ
ウムにて平衡化したβ−シクロデキストリンポリマーカ
ラム（ 1.5×30cm）に吸着させ、蒸留水にて溶出させ
た。
【００１９】得られた活性画分を、予め10mM燐酸緩衝液
（ｐＨ6.8 ）で平衡化したセファデックスＧ−200 でゲ
ル濾過した。ゲル濾過により得られた活性画分は、電気
泳動的にほぼ単一のバンドを示し、精製酵素（172U/mg
タンパク）であると考えられた。得られた酵素の酵素特
性を測定し、以下の結果を得た。
（ｐＨ6.8 ）で平衡化したセファデックスＧ−200 でゲ
ル濾過した。ゲル濾過により得られた活性画分は、電気
泳動的にほぼ単一のバンドを示し、精製酵素（172U/mg
タンパク）であると考えられた。得られた酵素の酵素特
性を測定し、以下の結果を得た。
【００２０】１．作用 澱粉またはその部分分解物等の澱粉系糖質を作用させる
と、種々のシクロデキストリンが生成した。生成したシ
クロデキストリンの組成を以下のようにして決定した。
10％(w/v) となるように、可溶性澱粉を溶解した酢酸緩
衝液（ｐＨ6.0 ）に、得られた酵素を添加して50℃で反
応させ、各時間ごとにサンプリングし、沸騰水中で酵素
を失活させ試料溶液とした。この試料溶液中のα−、β
−、γ−シクロデキストリンを高速液体クロマトグラフ
ィーで分離、定量した。図１は、上記により得られた試
料溶液中の各シクロデキストリンの濃度と反応時間の関
係を示したグラフである。図中、はβ−シクロデキスト
リン、△はγ−シクロデキストリン、□はα−シクロデ
キストリンを示す。図１から明らかなように、反応直後
からβ−シクロデキストリンが多く生成し、α−シクロ
デキストリンの生成が最も少なかった。
と、種々のシクロデキストリンが生成した。生成したシ
クロデキストリンの組成を以下のようにして決定した。
10％(w/v) となるように、可溶性澱粉を溶解した酢酸緩
衝液（ｐＨ6.0 ）に、得られた酵素を添加して50℃で反
応させ、各時間ごとにサンプリングし、沸騰水中で酵素
を失活させ試料溶液とした。この試料溶液中のα−、β
−、γ−シクロデキストリンを高速液体クロマトグラフ
ィーで分離、定量した。図１は、上記により得られた試
料溶液中の各シクロデキストリンの濃度と反応時間の関
係を示したグラフである。図中、はβ−シクロデキスト
リン、△はγ−シクロデキストリン、□はα−シクロデ
キストリンを示す。図１から明らかなように、反応直後
からβ−シクロデキストリンが多く生成し、α−シクロ
デキストリンの生成が最も少なかった。
【００２１】２．至適ｐＨ 至適ｐＨは、測定方法１（糊精化力）に従って、酢酸緩
衝液（ｐＨ 3.5〜6.5）又はトリス−マレイン酸緩衝液
（ｐＨ 6.0〜8.5 ）を用いて基質溶液を調整し、得られ
た酵素の糊精化力を測定することにより決定した。図２
は、上記により得られた酵素の糊精化力（相対活性を％
で示した）とｐＨの関係を示したグラフである。図２か
ら明らかなように、得られた酵素はｐＨ 4.5〜8.5 の範
囲で強い活性を示し、至適ｐＨは 4.5〜6.5 であり、広
い至適ｐＨ範囲を有していた。
衝液（ｐＨ 3.5〜6.5）又はトリス−マレイン酸緩衝液
（ｐＨ 6.0〜8.5 ）を用いて基質溶液を調整し、得られ
た酵素の糊精化力を測定することにより決定した。図２
は、上記により得られた酵素の糊精化力（相対活性を％
で示した）とｐＨの関係を示したグラフである。図２か
ら明らかなように、得られた酵素はｐＨ 4.5〜8.5 の範
囲で強い活性を示し、至適ｐＨは 4.5〜6.5 であり、広
い至適ｐＨ範囲を有していた。
【００２２】３．ｐＨ安定性 ｐＨ安定性は、得られた酵素を20mMのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ 5.0〜8.0 ）又はグリシン・塩化ナトリウム・水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ 8.5〜10.5）で緩衝化し、その
緩衝化した酵素0.5ml を40℃で２時間処理した後、測定
方法１（糊精化力）に従って糊精化力を測定することに
より決定した。図３は、上記により得られた酵素の糊精
化力（相対活性を％で示した）とｐＨの関係を示したグ
ラフである。図３から明らかなように、得られた酵素は
ｐＨ 6.0〜10.0で安定であった。
Ｈ 5.0〜8.0 ）又はグリシン・塩化ナトリウム・水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ 8.5〜10.5）で緩衝化し、その
緩衝化した酵素0.5ml を40℃で２時間処理した後、測定
方法１（糊精化力）に従って糊精化力を測定することに
より決定した。図３は、上記により得られた酵素の糊精
化力（相対活性を％で示した）とｐＨの関係を示したグ
ラフである。図３から明らかなように、得られた酵素は
ｐＨ 6.0〜10.0で安定であった。
【００２３】４．熱安定性 熱安定性は、得られた酵素を20mMのトリス−塩酸緩衝液
に加えて各温度で15分間熱処理し、その後冷却して測定
方法１（糊精化力）に従って糊精化力を測定することに
より決定した。図４は、得られた酵素の糊精化力（相対
活性を％で示した）と温度の関係を示したグラフ（破線
は 0.01M塩化カルシウム添加の場合を示す）である。図
４から明らかなように、得られた酵素は60℃の熱処理で
も全く失活することなく、65℃の使用も十分可能である
と考えられた。
に加えて各温度で15分間熱処理し、その後冷却して測定
方法１（糊精化力）に従って糊精化力を測定することに
より決定した。図４は、得られた酵素の糊精化力（相対
活性を％で示した）と温度の関係を示したグラフ（破線
は 0.01M塩化カルシウム添加の場合を示す）である。図
４から明らかなように、得られた酵素は60℃の熱処理で
も全く失活することなく、65℃の使用も十分可能である
と考えられた。
【００２４】５．分子量 ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により、分子量を
決定した。分子量の決定には、日本バイオ・ラッド ラ
ボラトリーズ（株）社製の標準分子量マーカー（ 14400
〜97400 ）を使用した。その結果、得られた酵素の分子
量は約94000 であった。
決定した。分子量の決定には、日本バイオ・ラッド ラ
ボラトリーズ（株）社製の標準分子量マーカー（ 14400
〜97400 ）を使用した。その結果、得られた酵素の分子
量は約94000 であった。
【００２５】６．等電点 等電点電気泳動法により、等電点を決定した。その結
果、得られた酵素の等電点は4.1 であった。
果、得られた酵素の等電点は4.1 であった。
【００２６】７．糊精化力に対するショ糖を受容体とし
た糖転移活性比 得られた酵素の糊精化力と糖転移活性力を測定し、糊精
化力が活性１単位のときのショ糖を受容体とした糖転移
活性の活性単位数を求めて、糊精化力に対するショ糖を
受容体とした糖転移活性比を決定した。その結果、得ら
れた酵素の糊精化力に対するショ糖を受容体とした糖転
移活性比は、8.36であった。
た糖転移活性比 得られた酵素の糊精化力と糖転移活性力を測定し、糊精
化力が活性１単位のときのショ糖を受容体とした糖転移
活性の活性単位数を求めて、糊精化力に対するショ糖を
受容体とした糖転移活性比を決定した。その結果、得ら
れた酵素の糊精化力に対するショ糖を受容体とした糖転
移活性比は、8.36であった。
【図１】この発明により得られる酵素により生成した各
シクロデキストリンの濃度と反応時間の関係を示したグ
ラフである。
シクロデキストリンの濃度と反応時間の関係を示したグ
ラフである。
【図２】この発明により得られる酵素の糊精化力とｐＨ
の関係を示したグラフである。
の関係を示したグラフである。
【図３】この発明により得られる酵素の糊精化力とｐＨ
の関係を示したグラフである。
の関係を示したグラフである。
【図４】この発明により得られる酵素の糊精化力と温度
の関係を示したグラフである。
の関係を示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 バチルス(Bacillus)属に属するＤＫ-１
１３９菌株(寄託番号ＦＥＲＭＰ‐１３１９９)又はその
変異株を培養し、その培養物からシクロマルトデキスト
リングルカノトランスフェラーゼを採取することを特徴
とするシクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30131392A JP3183970B2 (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30131392A JP3183970B2 (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141855A JPH06141855A (ja) | 1994-05-24 |
| JP3183970B2 true JP3183970B2 (ja) | 2001-07-09 |
Family
ID=17895352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30131392A Expired - Fee Related JP3183970B2 (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3183970B2 (ja) |
-
1992
- 1992-11-11 JP JP30131392A patent/JP3183970B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06141855A (ja) | 1994-05-24 |
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