JPS6149955B2 - - Google Patents

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JPS6149955B2
JPS6149955B2 JP59044070A JP4407084A JPS6149955B2 JP S6149955 B2 JPS6149955 B2 JP S6149955B2 JP 59044070 A JP59044070 A JP 59044070A JP 4407084 A JP4407084 A JP 4407084A JP S6149955 B2 JPS6149955 B2 JP S6149955B2
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JP
Japan
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enzyme
starch
maltopentaose
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maltose
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JP59044070A
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English (en)
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JPS60188061A (ja
Inventor
Shoichi Kobayashi
Takashi Okemoto
Keiji Kainuma
Hitoshi Hashimoto
Kozo Hara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ensuiko Seito Kk
NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Original Assignee
Ensuiko Seito Kk
NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
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Publication date
Application filed by Ensuiko Seito Kk, NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO filed Critical Ensuiko Seito Kk
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明はシユードモナス(Pseudomonas)KO
―8940に関し、さらに詳しくはマルトペンタオー
ス生成酵素の産性能を有するシユードモナスKO
―8940に関する。 近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめら
れているが、現在工業的に大量生産されているも
のはマルトースのみである。マルトース以外には
マルトトリオースが試薬用として、またマルトペ
ンタオースがアミラーゼ活性測定用としてそれぞ
れ少量生産されているにすぎない。 しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサ
オースのマルトオリゴ糖を特異的に生産する微生
物起源のアミラーゼが次々に発見され、澱粉から
各種オリゴ糖の生産が容易に行なえるようになつ
てきた。たとえばマルトペンタオースに関しては
Arch.Biochem.Biophys.,155,290(1973)およ
び日本農芸化学会昭和57年度大会要旨集178頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの
酵素は反応初期からのマルトペンタオース以外の
各種糖を生成するものであり、マルトペンタオー
スのみを生成するアミラーゼは未だ知られていな
い。 そこで本発明者らは、デンプン類からマルトペ
ンタオースを効率よく生成する酵素を産生する微
生物の探索を行ない、沖縄県の土壌から新しく細
菌を分離し、この細菌を培養することにより目的
とするマルトペンタオース生成酵素が得られるこ
とを見出し、この知見に基いて本発明を完成し
た。 すなわち本発明は、色素を生成せず、デンプン
の加水分解が陽性であり、その分解生成物がマル
トペンタオースであり、アラビノース,キシロー
ス,グルコース,マンノース,フラクトース,ガ
ラクトース,麦芽糖,シヨ糖,乳糖,トレハロー
ス,ソルビツト,マンニツト,イノシツト,グリ
セリンおよびデンプンからの酸およびガスの生成
が陰性であるシユードモナスKO―8940に関す
る。 上記特性を有する本菌は、ポテトスターチ1
%、肉エキス0.7%、ポリペプトン1%および
NaC0.3%を含む培地(PH6.5)に少量の土壌を
加え、40℃で3日間培養することにより得られ、
この方法を繰返して本菌を単離した。 以下に、シユードモナスKO―8940の菌学的性
質を記載する。 1 形態的性質 栄養細胞の大きさは0.5〜0.75μ×1〜3μ
(0.5μ×2μ)で桿菌であり、胞子は形成しな
い。 鞭毛は極鞭毛であり、運動性がある。(第1図
参照) グラム染色性は陰性であり、抗酸性はな。 尚、上記の形態は肉エキス10g,ペプトン10
g,NaC5g,寒天15g,水1(PH7.4)の
組成の培地における生育状態について観察された
ものである。 2 各種培地上での生育状態 肉汁寒天平板培養では点状,台状で波状、表面
はしわ状でにぶい光沢があり、半透明、色調はや
や赤みのかかつた乳白色を示す。 肉汁寒天斜面培養では接種線上に一様に生育
し、辺縁は鋸歯状、隆起は薄く、表面は平滑ある
いはしわ状で湿つている。にぶい光沢があり、半
透明で、やや赤味のかかつた乳白色を示す。 肉汁液体培養では混濁し菌膜が生成する。 肉汁ゼラチン穿刺培養ではほとんど生育しない
ため、ゼラチンの液化は認められない。 リトマスミルク(10%,PH7)での生育状態は
悪い。 PHはややアルカリ側で凝固は認められない。 3 生理的性質 生育PHの範囲はPH6〜9であり、PH7.5〜8が
最適である。 生育温度の範囲は45℃以下であり、40℃付近が
最適である。 硝酸塩を還元し、脱窒反応は陽性であるが、ガ
スの発生は認められない。 MRテスト,VP反応,ウレアーゼ反応は陰性で
ある。 インドール,硫化水素の生成は認められない。 オキシダーゼ反応,カタラーゼ反応は陽性であ
る。 クエン酸,硝酸塩,アンモニウム塩を利用して
生育する。 デンプンの加水分解は陽性である。 色素は生成しない。 酸素に対する態度は好気的である。 2%食塩で良好に生育するが3%以上では生育
しない。 O―Fテストは好気的でわずかに生育するが、
酸の生成は認められない。 アラビノース,キシロース,グルコース,マン
ノース,フラクトース,ガラクトース,麦芽糖,
シヨ糖,乳糖,トレハロース,ソルビツト,マン
ニツト,イノシツト,グリセリン,デンプンを含
む培地に生育するが、酸の生成およびガスの発生
は認められない。 以上の性質をBergey’s Manual of
Determinative Bacteriology(第8版)の分類基
準により検索すると、本菌はシユードモナス属に
分類される。本菌をシユードモナス属に属する既
知の類縁菌と比較すると、以下のような差異が認
められる。
【表】
【表】 上表から明らかなように、本菌は類縁菌とは諸
性質が異なつており、本菌に最も類似しているシ
ユードモナス・ストウツエリは上記性質のほか外
観的にも相違点がある。すなわち、肉汁寒天斜面
培養においてシユードモナス・ストウツエリは辺
縁,表面ともに滑らかであり、赤味を帯びている
のに対し、本菌は辺縁は鋸歯状で、表面もしわ状
であり、やや赤味のかかつた乳白色である。その
ほか、本菌は各種の糖を含む培地で生育するが、
酸を生成しない点で既知の類縁菌と明らかな差異
がある。 したがつて、本菌は新菌であると考えられ、本
発明者らは本菌をシユードモナス・エスピー
(Pseudomonas sp.)KO―8940と命名した。本
菌は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM
P―7456として受託されている。 本発明の微生物は新規なマルトペンタオース生
成酵素を生産する能力を有している。本酵素を生
産する能力を有している。本酵素を生産するため
の微生物の培養条件について検討した。まず、基
本培地として肉エキス,ポリペプトン,食塩およ
び炭素源を含むものを用い、炭素源については第
2表に示した各種物質を1%使用した。この培地
にシユードモナスKO―8940(FERM P―
7456)を植菌し、40℃で3日間振とう培養を行な
つた。このときの活性比率(マルトースを100と
したときの値)を第2表に示す。表から明らかな
ように、炭素源としてはマルトースが最良であ
り、デンプンの中では米デンプン、甘藷デンプン
を用いたときにかなり高い活性が得られた。ま
た、各種粉アメを用いたときの活性比率はDEが
高くなると共に高くなり、ハイマルト―スシロツ
プではマルトースと同程度の活性が得られた。
【表】
【表】 次に、窒素源について検討するため、肉エキス
0.7%,マルトース1%,食塩0.3%を含む培地に
各種物質1%を添加し、40℃で3日間振とう培養
を行なつた。このときの活性比率(硫酸アンモニ
ウムを100としたときの値)を第3表に示す。表
から明らかなように、硫酸アンモニウムまたは硝
酸アンモニウムを用いたときに著しく高い活性が
得られた。
【表】 さらに、マルトース,硫酸アンモニウムおよび
肉エキスのそれぞれの濃度について検討した結
果、最適の培地組成はマルトース0.8%、硫酸ア
ンモニウム1%および肉エキス0.8%を含むもの
であることが判明した。したがつて、培養に用い
る培地としては、上記知見を参考にして、供試菌
株が良好な活性にて目的とする酵素を生産し得る
組成のものを選定すべきである。 次に、培養日数による活性変化について検討し
たところ、第3図に示すような結果が得られた。
図示した如く、培養1日で70%以上の活性が得ら
れ、3日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、
その後は活性が減少する。したがつて、酵素の生
産には1〜3日間の培養が適当であり、通常は3
日間培養した後、培養液中の不溶分等を遠沈除去
して得た上澄を粗酵素として用いればよい。な
お、培養条件については目的とする酵素の生産量
が最大となるように選定すべきである。また、培
養液から酵素を採取・精製するには既知の方法を
適当に組合せて行なえばよい。 酵素の精製は各種の方法により行なうことが出
来るが、その1例を示すと、次の通りである。 4℃の低温で、粗酵素液に硫酸アンモニウムを
加え、0.2〜0.5飽和で沈殿する画分を集め、
10mMリン酸緩衝液(PH7.5)に溶解する。この
酵素液を同緩衝液に対して一晩透析したものにつ
いて以後の操作を行なう。なお、この硫安塩析で
の回収率は約80%である。次に、DEAE―セルロ
ースカラムクロマトグラフイー,ゲル過クロマ
トグラフイーなどにより精製してデイスクゲル電
気泳動的に単一バンドを示す標品を得ることがで
きる(第2図)。 このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の
性質を検討した。結果を以下に示す。 (1) 作用 本酵素を可溶性デンプンに作用させたときの反
応経過は第4図および第5図に示したとおりであ
る。図から明らからなように、本酵素は反応初期
にマルトペンタオースを生成し、その後時間の経
過と共にマルトースとマルトトリオースに水解さ
れる。 したがつて、マルトペンタオールを効率的に生
産するには、本酵素を、たとえばメンブランリア
クターのような容器中で液化デンプンに作用さ
せ、生成糖を限外過膜を用いて反応系外に取り
出す方法を採用することが望ましい。 本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下
のオリゴ糖を基質にした場合、次の通りである。
なお、略号はG1:グルコース,G2:マルトー
ス,G3:マルトトリオース,…G5:マルトペン
タオース,…G8:マルトオクタオースを示す。 この作用形式から、G2とG3の混合物を生産
し、酵母によりG2を消化させてG3を製品とした
り、またG2とG3の混合物を製品とすることもで
きる。 このように、重合度が小さい基質を用いた場
合、本酵素はいわゆるExo型のアミラーゼとして
の作用を示すが、重合度の大きいデキストリンに
はEndo型のアミラーゼとして作用する。したが
つて、デンプンは本酵素の作用によつて切り残し
はなく大部分がG5またはG2とG3に変換する。こ
の際、プルラナーゼ等の枝切り酵素を共存させれ
ば、G5の収率を向上させることができる。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性 反応液組成を 基質(2%の還元した可溶性デンプン液)
0.5ml 各種のPHの緩衝液(100mM) 0.4ml 酵素液(8IU/ml) 0.1ml とし、45℃で15分間反応させて還元力を測定し、
最高値を100として表わしたときの結果を第6図
に示す。図から明らかなように、本酵素の至適PH
は6〜7である。 また、PH安定性については、本酵素液1mlに各
種PHの10mM緩衝液(PH4〜6:酢酸緩衝液,PH
6〜8:リン酸緩衝液,PH8〜9:トリス―塩酸
緩衝液、PH9〜10:炭酸ソーダ緩衝液)0.1mlを
加え、45℃で60分間静置した後、各0.1mlずつを
採り100mMリン酸緩衝液(PH6.5)0.4mlおよび2
%基質液0.5mlを加えて45℃にて30分間反応さ
せ、残存酵素活性を測定した。結果は第7図に示
す。第7図に示したように、本酵素はPH6.5〜9.0
の範囲で安定である。 (3) 酵素力価の測定法 酵素の活性は、可溶性デンプン(メルク社製,
分析用)を還元して基質として用い、ソモジー・
ネルソン法により還元力を測定し、45℃で1分間
に1マイクロモル等量のグルコシド結合を切断す
る酵素量を1IU(国際単位)とした。 (4) 作用至適温度と温度安定性 反応液組成を 基質(2%の還元した可溶性デンプン液)
0.5ml 100mMリン酸緩衝液(PH6.5) 0.4ml 酵素液(8IU/ml) 0.1ml とし、各種の温度で15分間反応させて還元力を測
定し、最高値を100として表わしたときの結果を
第8図に示す。図から明らかなように、本酵素の
作用至適温度は50〜55℃である。 またPH6.5で各種温度に15分間静置した後、45
℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結果を
第9図に示す。第9図から明らかなように、55℃
以上では急激に失活する。 (5) 阻害,活性化および安定化 本酵素は0.4mMパララクロロ安息香酸第二水
銀および1mMモノヨードアセトアミド溶液中で
は阻害を受けるが、阻害率は40〜50%であり、高
くはない。 次に、各種金属イオン(1mM濃度)の影響は
水銀,亜鉛,銅および銀による阻害率が80%以上
という高い値を示し、鉄で50%である。また、カ
ルシウムイオンは本酵素の耐熱性を5℃高める。 (6) 分子量 デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本酵
素の分子量は72500±25000である。 (7) 等電点 アンフオライン電気泳動法によつて求められた
等電気点はPH6.5である。 (8) 結晶構造および元素分析 本酵素については未だ結晶標品が得られていな
いが、電気泳動で単一バンドを示す精製標品を得
ている。 以上に示した性質を有する本酵素は従来の酵素
と全く異なる作用を示し、マルトペンタオースを
大量に生成する新規な酵素である。本発明者ら
は、本酵素を1,4―α―D―グルカンマルトペ
ンタオハイドロラーゼと命名した。 前述したように、本酵素はアミロース,可溶性
澱粉,各種澱粉に作用してマルトペンタオースを
生成する。したがつて、澱粉,澱粉の組成画分お
よび澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも1
種の物質に本酵素を作用させることにより、マル
トペンタオースが生成・蓄積する。反応を行なう
にあたり、本酵素の性質を考慮してマルトペンタ
オースの生成量が最大となるような条件を選定す
べきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴
薯,甘藷,トウモロコシ,モチトウモロコシ,大
麦,小麦,米,タピオカ,サゴなどの任意の原料
から得られるものを使用することができる。ま
た、澱粉の組成画分としては、たとえばアミロー
ス,アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応
生成物としては、たとえば白色デキストリン,黄
色デキストリン,プリテイツシユガムなどの焙焼
デキストリン;酸化澱粉,低粘性変性(酵素,
酸,機械高速撹拌等の処理による)澱粉などの化
工澱粉;リン酸澱粉,酢酸澱粉などで代表される
澱粉エーテル,澱粉エステルなどの澱粉誘導体;
放射線や中性子線を照射したり高周波処理あるい
は湿熱処理した澱粉などの物理的処理澱粉;α―
澱粉などを挙げることがでる。これらの澱粉類は
単独もしくは2種以上を組合せて用いる。 反応終了後、加熱して酵素を失活させて反応を
停止し、反応液から常法によつてマルトペンタオ
ースを得ることができる。 マルトペンタオースは現在、α―アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬,試薬などへの用途が
あり、本酵素が本発明によつて安価に生産されれ
ば、食品をはじめ各種用途も拓けるものと期待さ
れる。マルトペンタオースは溶解性に優れ、甘味
がなく、ボデイ感があるので製菓用材料として有
用であり、また消化・吸収性が良いので、幼児,
老人,患者用の滋養食としての利用も可能であ
る。 次に、本発明の微生物によるマルトペンタオー
ル生成酵素の製造例を示す。 製造例 1 シユードモナスKO―8940(FERM P―
7456)を肉エキス0.8%,硫酸アンモニウム1
%,マルトース0.8%の斜面寒天培地に接種し、
40℃で2日間培養した後、その1白金耳をとり、
同じ組成の液体培地(100ml培地/500ml三角フラ
スコ)に移し、45℃で3日間通気振とう培養を行
なつた。 培養終了後、抵温で培養物中の菌体および不溶
物を遠沈除去して上澄を得、これを粗酵素とし
た。この粗酵素液の活性は3.8IU/mlであつた。 製造例 2 シユードモナスKO―8940(FERM P―
7456)の培養液を少量とり、常法によりRI,
UV,ニトロソグアニンで処理した後、平板培養
を行ないアミラーゼ活性の高いコロニーをとつ
た。これを肉エキス0.8%,硫酸アンモニウム1
%,マルトース0.8%の培地で45℃にて3日間培
養し、その後の操作は製造例1と同様にした。本
粗酵素液の活性は8.0IU/mlであつた。 参考例 1 馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素(BLA)により
液化し、ヨウ素―澱粉反応が青色で失活処理し、
基質濃度10%,マルトペンタオース生成酵素(製
造例2の粗酵素液)1IU/g基質,PH6.0,45℃で
6時間撹拌しながら反応せしめてマルトペンタオ
ースを30%含む反応液を得た。
【図面の簡単な説明】
第1図はシユードモナスKO―8940のネガテイ
ブ染色による電子顕微鏡写真、第2図は精製酵素
のデイスクゲル電気泳動写真、第3図は培養日数
による活性変化とPH変化を示すグラフ、第4図は
マルトペンタオース生成酵素の反応経過(1
IU/g基質)を示すグラフ、第5図は本酵素の
反応経過(1 IU/10mg基質)を示すグラフ、
第6図は本酵素の至適PHを示すグラフ、第7図は
本酵素のPH安定性を示すグラフ、第8図は本酵素
の至適温度を示すグラフ、第9図は本酵素の温度
安定性を示すグラフである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 色素を生成せず、デンプンの加水分解が陽性
    であり、その分解生成物がマルトペンタオースで
    あり、アラビノース,キシロース,グルコース,
    マンノース,フラクトース,ガラクトース,麦芽
    糖,シヨ糖,乳糖,トレハロース,ソルビツト,
    マンニツト,イノシツト,グリセリンおよびデン
    プンからの酸およびガスの生成が陰性であるシユ
    ードモナスKO―8940。
JP59044070A 1984-03-09 1984-03-09 シユ−ドモナスko−8940 Granted JPS60188061A (ja)

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JPS62202764U (ja) * 1986-06-17 1987-12-24

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