JPH04503757A - 新規超熱安定性α―アミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規超然安定性α−アミラーゼ 技術分野 本発明は、熱安定性α−アミラーゼの分野に関する。更に詳しくは、本発明は超 然安定性α−アミラーゼ、該酵素の製法および工業的デンプン液化プロセスにお けるα−アミラーゼの使用に関する。

背景技術 例えば、燃料アルコールもしくはハイフルクトースシロップ（ＨＦＳ）を製造す るため、デンプンの糖への酵素的変換用のα−アミラーゼが広（実際的に用いら れている。工業的デンプン液化プロセスの内で、ジェットクツキング法はデンプ ン液化に関し殆ど全世界で好まれている形式であるが、このプロセスの実施に当 っては、熱安定性α−アミラーゼが必要とされる。

ＨＦＳはハイＤＸシロップから製造される。ここで語句ＤＸはシロップの乾燥物 質（ＤＳ）を基準にして計算したデキストロース（Ｄ−グルコース）の重量％を 意味する。デンプンを高ＤＸシロップに変換するために一般に適用される全体的 酵素液化プロセスは、二工程プロセスである。第一の工程は、液化、いわゆるデ ンプンを加水分解してオリゴサツカリドいわゆるマルトデキストリン混合物に変 換することである。

このプロセスは、α−アミラーゼによって触媒化され、次いで典型的ジェットク ツキングプロセスにおいて、デンプンスラリーを、通常単一用量のα−アミラー ゼと共に１０５〜１１０℃に少なくとも数分間加熱し、次いで約９０°Ｃで少な くとも１時間保持する。全体的液化の第一工程において、デンプンスラリーのゲ ル化および機械化薄化が行われる。更に分解（デキストリン化）がプロセスの第 二工程でおこる。ジェットクツキングプロセスに関し、米国特許３，９１２，５ ９０を参照のこと。

工業的液化プロセスに対し、今日まで最も好ましい熱安定性α−アミラーゼは細 菌起源のものでありかつ、り〉盆と不−０頃ｃｉｌｌｕｓ）属由来のものである 。従って、ジェットクツキングプロセスにおいて、使用するために良好に適合さ れたα−アミラーゼは、ノボノルディスクＡ／Ｓ　（デンマーク国）から来のα −アミラーゼは、米国特許２，６９５，６８３および４．２８４，７２２に記載 されている。バシース　スーアロサーモフイースＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒ ｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｌｕｓ）　α−アミラーゼ（ターマミル（登録商標）） は、エンザイムデベロップメント　コーポレイション（ＮＹ、ＵＳＡ）から入手 可能である。

今日まで入手可能なα−アミラーゼの性質のため、液化プロセスは典型的には約 ６．０〜６．５のｐＨで行われ、更に６゜５を超えるｐＨでは、例えばマルツロ ース（ａ＋ａｌｔｕｌｏｓｅ）又はマルツロース「前駆体」の如き未所望副生成 物が形成し、面倒である。例えば、バシラス　リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　１ｉｅｈｅｎｉｆｏｒｏ＋ｉｓ　）は、６．０未満のｐＨで急速に失活する 。更に、工業的デンプン液化に対して用いられる場合、安定化に対し少なくとも ５０ｐｐ−のカルシウムが必要とされ、更に１２０°Ｃでこれは完全に失活する 。バ之立入−ス孟ヱ旦土二ｉス土りも幾つかのより秀れた活性を有し、顕著には より低い至適ｐＨを有する。しかし、これらの酵素は、５未満のＩ）Ｈ値ではデ ンプン液化に適していない。

アルトデキストンをデキストリンに変換する、連続糖化は、グルコアミラーゼ酵 素により最も触媒化される。通常、アスペルギルス　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ） 又はリゾプス　Ｒｈ１ｚＯｕＳ）種から由来する商業的グルコアミラーゼ調製品 は、種々の製業者から、例えばＡＭＣ（登録商標）２０ＯＬ、アスペルギルスＡ ｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ由来でありかつノボノルディスクＡ／Ｓ（デ ンマーク国）により製造された製品として入手可能である。これらのグルコアミ ラーゼ酵素はｐＨ４，０〜４．５に最適に機能する。

今や、超高温性アルカニバクテリア（ａｒｃｈａｅｂｃｔｅｒｉａ）は、ソルフ ァタラのかつ海低の熱水作用システムから単離された（ソイアラ。ジー、アンド 　ステラ、　Ｋ、　Ｏ，；　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｃｒｏｂｉａｌ、、　１４５　（ ５６〜６１）（１９８６）アンドケレー、Ｒ，Ｍ、アンドブーミング、　Ｊ、　 Ｗ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、　４Ｌ４７−６２　（１９８８ ））。

今日まで知られている最高の高熱性細菌は、？ｏユニ左ス匹■五群は、熱安定性 プロテアーゼおよびアミラーゼを含むことが推定された（ステーター、　Ｋ、　 Ｏ，、Ｊ、　ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　４２　（４）　；　３１５〜３１７（１９８Ｂ）） 。ｅｏ：ｙ−ｈ入−ベセイ　Ｐ　ｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｅｓｅｉ）に対する増 殖条件が調べられた（シーリング学；　５ｙｓｔ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ ｉａｌ、、　９．６２−７０（１９８７））。

しかし、ピロコツカス由来のアミラーゼはこれまで単離されておらずあるいは又 研究されていない。

中間のｐＨ調節の必要性を排除するため、ｐＨ４，０の低いｐＨで液化可能な超 安定性デンプン液化酵素をめて長く研究されてきた。更に、精製コストを軽減す るため、カルシウム塩の添加を避けることが好ましい。従って本発明の目的は、 今日まで知られたα−アミラーゼの欠点を、新規な高熱安定性α〜アミラーゼ（ これは低い至適ｐＨを有しがっ本質的にカルシウムイオンから独立している）を 提供することにより除去することにある。

発明の詳細な説明 本発明によれば、今や以下の事実が見出された。すなわち、ピロコツカス（Ｐｙ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　）菌株はα−アミラーゼを産生じ、これは法外な熱安定性に 加えて、好都合に低いｐＨ値で至適ｐＨを示しかつ本質的にカルシウムイオンか ら独立している。

第一の面によれば、本発明は安定化量の基質の存在下９゜℃で測定して至適ｐＨ ４，０〜６．０、安定化量の基質の存在下ｐＨ５，５で測定して至適温度８０〜 １２０　”Ｃを有し、本質的にカルシウムイオンから独立しており、かつ安定化 量の基質の存在下で測定して９０°Ｃで１時間後１００％、１００　’Ｃで１時 間後少なくとも８０％の残留活性を有するα−アミラーゼを提供する。この面の 他の変形によれば、基質の非存在下９０°Ｃで測定して至適ｐＨ５，２〜５．８ 、基質の非存在下ｐＨ５，５で測定して至適温度９０〜１０５°Ｃを有し、カル シウムイオンから独立しており、がっ基質の非存在下で測定して１１０°Ｃで１ 時間後約７０％の残留活性を有するα−アミラーゼを提供する。

本発明に係るα−アミラーゼは、ビロコ・・カス　Ｐｒ０ｃｏｃｃ旦）菌株を培 養することにより得られる。好ましい菌株は、Ｐ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ　お よびＰ、フリオサス（ｆｏｒｉｏｓｕｓ）、特にＰ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ、 　Ｄ　Ｓ　Ｍ　Ｎｏ、　３７７３および、Ｐ、フＩオサス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ） 　、　Ｄ　ＳＭ　Ｎｏ、　３６３８である。

第二の面によれば、本発明はこれらのα−アミラーゼの調製方法を提供するもの であり、この方法は−〈三≦しム左！ヨυｊｒｏｃｏｃｃｕｓ　）α−アミラー ゼ生産菌株を、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する栄養培地内で培養し次 いで所望の酵素を回収することを含んでなる。このプロセスの好ましい態様にお いて、Ｐ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ　）又はＰ　フ１オサス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ ）の菌株、特にＰ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｆ）　、　ＤＳＭ　Ｎｏ。

３７７３、又はＰ、フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）　、　ＤＳＭ　Ｎｏ。

３６３８を培養する。

第三の面によれば、本発明はデンプン液化プロセスを提供するものであり、この プロセスは本発明に係るα−アミラーゼの存在下、水性デンプンスラリーを酵素 的液化に委ねることを含んでなる。このプロセスの好ましい態様によれば、デン プン液化は本質的にカルシウム塩をデンプンスラリーに添加することなく行われ る。更に好ましい態様によれば、該プロセスは１００〜１４０°Ｃの温度で１２ ０分までジェットクツキングにより行われ、引続き所望により約３０〜１２０分 間９０〜１００°Ｃの保持すべき温度に低下させ、しかる後このように液化した デンプンは、劣化に対して安定であり、プロセス中ｐＨは約４．０〜５．５に保 持される。本発明の別の好ましい態様によれば、液化デンプンをしかる後グルコ アミラーゼの存在下、本質的に中間ｐＨの調整なしで酵素的液化に委ねる。本発 明の別の好ましい態様によれば、液化デンプンを酵母を用いて糖化と同時にエタ ノール発酵に委ねるか又はエタノール発酵後引き続き糖化に委ねる。

本発明の詳細な説明 ピロコツカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　）を用いた増殖実験により以下の内容が 判明した。すなわち、この層の群はこれまで記載されたデンプン氷解酵素の内、 最も熱安定性を存しかつ熱活性デンプン氷解酵素を分泌する。これらのデンプン 分解酵素は、種々のグルコースポリマー、例えばアミロペクチン、グリコーゲン 、マルトデキストリンおよびアミロースにおけるα−１，４−グリコシド結合を ランダムに加水分解することができる。多糖類加水分解のパターンより、これら の酵素はα−アミラーゼとして同定される。

現在２種のピロコ・・カス　Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、すなわち１旦。

兆工立土」籾且虹）およびＰ、フｉオサス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　）が知られてい る。これらの菌によって産生されるα−アミラーゼは明らかに同様の性質を有す るが、しかしそれらは構造の点でわずかに異なる。Ｐ、ボエセイ　ｗｏｅｓｅｉ 　）は、ＤＳＭからＮｏ、３７７３として入手可能である。Ｐ、フリオサス　ｆ ｕｒｉ匹胆）は、ＤＳＭからＮｏ、３６３８として入手可能である。

本発明の酵素は、それらの基質、すなわち、多Ｉｉ類例えばデンプン、グルカゴ ン、分校もしくは直鎖グルコースポリマー、アミロース、アミロペクチン、マル トデストリン又はこれらの混合物の存在により安定化され、更にそれらは金属イ オンの非存在下で安定である。基質の安定化作用は、約０゜５重量％以上の多糖 類濃度で生じる。低い多糖類濃度は安定化をもたらさない。

本発明の酵素は、至適温度８０〜１２０°Ｃを示しかつ６０°Ｃ〜１４０°Ｃで 活性であり、特に６０〜１２０°Ｃ２より好ましくは８０〜１１０°Ｃ１最も好 ましくは９０〜１０５°Ｃで活性である。この１００度の広範囲の温度は驚くば かりである。

酵素は、ｐＨ３，５〜８．　０で触媒的に活性である。約６０％の活性がｐＨ３ ，５および７．０で測定される。酵素活性に対する至適ｐＨは、安定化量の多糖 類を含有する培地中で測定してｐＨ４，０〜６．０の範囲内にあり、より好まし くはｐＨ４゜０〜５．５内にあり、更に安定化量の多糖類の非存在下で測定して ｐＨ５，２〜５．８内にある。

本発明酵素の法外な性質は、３バールの圧力でかつ１２０℃で６時間オートクレ ーブ処理後でさえ酵素活性の検出により実証される。殆ど２％のα−アミラーゼ 活性が１２０℃でさえ検出された。６０分後、９０℃で１００％、１００℃で少 な（とも８０％、１１０°Ｃで７０％、更に１２０℃で少なくとも６０％の残留 活性が測定される。α−アミラーゼの完全な失活のためには、３バールの圧力で １２０°Ｃで少なくとも１２時間のオートクレーブ処理が必要であった。酵素は 、例えば２％ＳＤＳの如き洗剤の存在下で煮沸させた後も触媒的に活性であるこ とも注目すべきである。

更に、試験内研究において、金属イオン又は他の細胞内因子は糖製酵素の触媒活 性にとって必要でないことが判明した。

１〜５ｍＭの重金属例えばＣｒ　”、　Ｃｕ　”又はＺｎ”の添加は、酵素抑制 をもたらす。５ａ＋ＭのＥＤＴＡの添加により抑制は増長される。本発明に係る α−アミラーゼの独得の性質は現存の商業的プロセスおよび新規適用においてそ れらの有用性を与える。金属イオンの非存在下、５未満のｐＨ値でかつ１００℃ を超える温度で天然デンプンを多Ｉｉ類混合物に変換できる能力および独得の熱 安定性のため、これらの酵素は工業的デンプン液化のため、例えば燃料アルコー ル又はハイフルクトースシロップ（ＨＦＳ）の製造のために理想的に適している 。

デンプン液化プロセスにおけるこれらの酵素の使用は、法外なプロセス−技術の 利点によって達成される。液化と糖化の２つの工程間でｐ）Ｉレベルを再調整す る必要はない、未所望の副生成物の形成も避けられる。酵素を安定化させるため 、カルシウムを添加することは必要でなく、従ってイオン交換精製のための操作 コストは著るしく減少できる。より高温のため、反応はより速やかに進行する。

α−アミ−−ゼの°　１ 本発明に係るα−アミラーゼは、ビロコ・・カス　２１０００００匹）の菌株を 適当な増殖培地中で培養し次いで産生した酵素を回収することにより得ることが できる。

ピローｘ−カス　Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）は、８０〜１０６℃（上限の温度は約１ １０°Ｃである）で、かつｐＨ４，５〜７．５で最大増殖を示す、生物の酵素合 成は、増殖中いつでも行なわれそして初期の対数期においてすでに開始し更に定 常期中でその最大に達する。検出された多数のタンパク質バンドから、ポリアク リルアミド　グレディエント　ゲル電気透析を用い、１個の主なバンドのみがア ミロース分解活性を有する。この、酵素の分子量は、約７０ＫＤａである。

先に述べた様に、Ｐ　ボエセイ　ｗｏｅｓｅｉ　）に対する増殖条件を調べられ かつ培養方法は記載されている（シラー等、同上）、より良き工業的適用により 発酵方法を得るため、本発明に係るα−アミラーゼの調製方法が開発され、これ は栄養培地に連続的に通気することにより行われる。栄養培地に連続的に通気す ると酵素産生を刺激することが見出された。細胞外酵素レベルが約２倍に増加し ていると思われる。炭素源として多糖類、例えばデンプン、アミロース、アミロ ペクチン、グリカゴン、分校もしくは直鎖オリゴサツカリドおよびマルトデキス トリン又はそれらの混合物、電子受容体としてのイオウ元素および３％ＮａＣ１ を用い、Ｈｔ　／　ＣＯｚ−雰囲気を用い連続的に通気することにより、α−ア ミラーゼが媒地に分泌される。非連続的通気のもとでは、わずか１２０Ｕ／１　 α−アミラーゼが同条件下で検出された。

加えて、ピロコ・・カス　ＰｒｏｃｏＣＣｕｓ）の増殖のためのより明室した栄 養培地が開発された。記載した他の培地と同様に、この培地は濁っておらず、か つこの培地はイオウ元素を含んでいない。この培地中での良好な増殖および酵素 産生は、Ｎ、／Ｃｏ□の連続的通気により達成できる。この栄養培地を用い、酵 素産生は、細胞外酵素的２００Ｕ／ｌから約１゜０００Ｕ／１まで５倍に更に上 昇する。この培地の組成は、例２から明らかである。興味あることに、出願人は 又次の内容を見出した。すなわち、窒素のみを用いて培地を通気すると、増殖と 酸素産生は低下した。この培地は濁っていないので、増殖は光学密度を測定する ことにより容易に監視できる。

微生物は又、相当量の酵素を分泌する。上記培地（イオウと共におよびイオウな しで）が、少量並びに多量のアミラーゼ産生に対して用いられる。

本発明に係るα−アミラーゼは、又組換え体、ＤＮＡ−技術により調製できる。

α−アミ−−ゼの 本発明に係るα−アミラーゼの単離は、常法により達成できる。酵素は細胞のな い上澄みから容易に回収できる。それらは天然のおよび可溶性デンプンに吸着し 、該デンプンは、大規模でこれらの酵素の精製を可能にする。しかし、α−アミ ラーゼを０．５％マルトデキストリンで安定化させることが要求される。これら は、酵素活性を減少しない、エタノールの如き有機溶媒の添加又は冷却により上 澄みから沈殿し得る。

一゛ンブン′　プロセス 本発明の液化プロセスは、例えば燃料アルコール又はハイフルクトースシロップ （ＨＦＳ）の生産のため、デンプンの糖への酵素的変換用に用いることができる 。適当な液化条件は、１００〜１４０°Ｃで１２０分まで、より好ましくは１０ ０〜１２０℃で１〜６０分、最も好ましくは１０５〜１１０°Ｃで１〜３０分で あり、所望により約３０〜１２０分間９０〜１００℃の範囲内に保持すべき温度 を減下させる。水性デンプンスラリーにカルシウムイオンを添加しないことが好 ましい。ｐＨは、３．５〜６．０、より好ましくは４．０〜５゜５、最も好まし くは４．２〜４．８内に保持すべきである。

連続的プロセスが好ましく、加熱はジェットクツキングによるのが最も好ましい 。本発明のα−アミラーゼは、１グラムデンプンＤＳ（乾燥物質）当たり５〜５ ０　ＯＮＵ　（ＮＵの定義に関し下記参照）、好ましくは１０〜５ＯＮＵの用量 レベルでデンプンを液化する。デンプン濃度は、通常１５〜４５％ＤＳ（Ｗ／Ｗ ％乾燥物質）、最も好ましくは２５〜３５％ＤＳの範囲内にある。

液化されたデンプンは、その後グルコアミラーゼの存在下、る。この場合、デン プンは、本発明のα−アミラーゼを用い、ｐＨ３，５〜６．０で、より好ましく はｐＨ４，０〜４．５で、最も好ましくはｐＨ４，２〜４．８で液化される。液 化されたデンプンは、例えばプルラナーゼ（詳細にはヨーロッパ特許６３．９０ ９参照）の如き枝切り酵素および／又は例えばＡ　ニガー注由来の酸安定性α− アミラーゼ（詳細にはヨーロッパ特許１４０．４１０参照）と組合わせたグルコ アミラーゼの存在下、連続的酵素液化に委ねることもできる。

本発明の液化プロセスは又、エタノール製造に対しても使用できる。この場合、 デンプンはｐＨ３，５〜６．０で、より好ましくはｐＨ４，０〜５．５で液化さ れ、次いでグルコアミラーゼで糖化および酵母による同時のもしくはその後の発 酵が行われる。しかる後、アルコールは公知方法で回収できる。

好ましくは、全体のプロセスは中間ｐＨＢＮ節なしで約４．５付近のｐＨで行な われ、更に糖化と発酵が３０〜３５°Ｃで９６時間までに同時に行われる。液化 は低ＤＳレベル（１５〜２０％）で又は高ＤＳレベル（２０〜４０％）のいずれ かで行なわれる。高ＤＳプロセスでは、ＤＳレベルは約１０％容量のアルコール を得るためには発酵前の約２０％に減少されねばならず、これは大抵の酵母が耐 えることのできるほぼ最大である。アルコール製造用の原料物質は、精製デンプ ン、例えば湿潤ミル化コーンスターチ；原料の未処理物質、例えばとうもろこし 、小麦、ライス、モロコシ、カサバおよびトマト（これらのデンプン含量範囲は １５％〜８０％）；および他のデンプン含有物質、例えば産業界からの廃棄物お よび副産物を含有することができる。

図面の簡単な説明 第１図＝９８℃で、デンプン上の連続的通気バッチ培養でＰ−±工土盃（鮫競社 ）の培養（・アシロース活性：Δ残留活性；■ｐＨ；◇５７８ｎｍでの光学密度 ）。

第２図：Ｐ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ）由来のα−アミラーゼに温度およびｐＨ の影響。

第３図二Ｐ、ボエセイ（ｗｏｅｓｅｉ　）由来のα−アミラーゼの熱安定性（ロ ア０〜９０°Ｃ；◆１００″Ｃ；■１１０″Ｃ；０１２０℃；ム１３０°Ｃ）。

第４図：（Ａ）９Ｂ’Ｃブン透で増殖中ヱース１を二困ユバ旦匹旦）によるα− アミラーゼの分泌。

（Ｂ）連続的通気下での増殖。

第５図：Ｐ　フ１オサス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　）由来のα−アミラーゼの活性に 関する温度およびｐＨの影響。

第６図：Ｐ、フリオサス（ｆｏｒｉｏｓｕｓ　）由来のα−アミラーゼの熱安定 。

第７図：Ｐ、ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ　）由来の非安定化α−アミラーゼの活性 （基質の非存在下で測定）に関する温度とｐＨの影響。

次の実施例は、更に本発明を説明するものである。

例Ｉ Ｐ　ポエセイ　−ｏｅｓｅｉ　から′　°れたα−アミラーゼＰ、ボエセイ　ｗ ｏｅｓｅｉ　の立　１゛をピロコンカス　ボエセイＣＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗ ｏｅｓｅｉ）を、９８℃でジーリッヒ等（同上）によって記載される如（培地中 で培養する。２０１の培養物にＨ２／ＣＯｚ　（８０対２０）を用いて連続的に 通気し、次いで種々の時間間隔後５０ｎ＋１の試料を取り出した。アミラーゼ活 性を、ベルクマイエルアンドグラセー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔ ４ｃ　ａｎａｌｙｓｊｓ、第３版、第２巻、１５１〜１５２　；　Ｖｅｒｌａｇ 　Ｃｈｅｍｉｅワインヘルム（１９８３））に従い細胞を含有しない上澄み中で 測定した。１％（Ｗ／Ｖ）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ 　ｐＨ５゜５）２５０μｌに、５００μｍまでの酵素溶液を添加し、インキュベ ーションを９５°Ｃで３０分間および６０分間行った。

α−アミラーゼのＩＵ活性は、標準としてマルトースを用い毎分１μｍｏｌの還 元糖を遊離する酵素の量として定義する。

残留デンプン濃度は、第１表に記載する如＜ＨＰＬＣを用いて算定した。

第１表：デンプンに対しピロコツカス　ボエセイ由来のα−アミラーゼの酵素作 用により遊離にされた糖（％）時間ＤＰｎ　ＤＰ７　ＤＰ６　ＤＰ５　ＤＰ４　 ＤＰ３　ＤＰ２　ＤＰＩＯｈｌＯｏｏｏｏｏｏｏｏ ４．５ｈ　８４　３　３　２　２　３　３　０７、Ｏｈ　７１　４　４　２　４ 　７　８　０１２．５ｈ　５７　６　７　３　５　１０　１２　０２３．５ｈ　 ３５　１４　１６　５　６　１１　１３　０３５．５ｈ　２９　１３　１７　５ 　７　１２　１６　１１汰：酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、　ｐｔ１５．　５　） 　１ｍｌ当たり、０゜５Ｕの酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（Ｗ／Ｖ ）であった。インキュベーションを９０°Ｃで行い、試料を種々の時間間隔後取 り出した。次いで各試料をイオン交換樹脂（Ｓｅｒｄｏｌｙｔ　ＭＢ、セルバ、 ハイデルベルク、ＦＲＧ）を用いて精製し、次いでＡｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ−４２ Ａカラム（Ｂｔｏ−Ｒａｄ、リッチモント、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用い、 ＨＰＬＣにより糖を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Ｋａｕｅｒ、バド　ホ ムブルク、ＦＲＧ）により監視した。ＤＰ、重合度、ＤＰＩ、グルコース。

叉ヱバＵ分塁 細胞外タンパク質（２０μｇ、０．２Ｕ）の分離は、１゜５１厚のポリアクリル アミド　グレーディエンド　ゲル（５〜３０％、Ｗ／Ｖ）　において一定電圧４ ００Ｖで２４時間４０°Ｃで行った。アミラーゼ活性を示すタンパク質バンドを 検出するため、ゲルを、１％デンプンを含有する５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ５，５ ）中４℃で浸漬した。ゲルを更に９０℃で３０分間インキュベートをし、最後に 澄明な帯域が可視的になるまで０．１５％（Ｗ／Ｖ）（７）？つ素および１．５ ％（Ｗ／Ｖ）のヨウ化カリウムを含有する溶液中でインキュベートした。

同じゲル中のタンパク質を、ＨｅｕｋｅｓｈｏｕｅｎおよびＢ　ｅ　ｒ　ｎ　ｉ 　ｃ　ｋ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　６＋１０３＋１１２）に従い、 銀色に着色した。公知の分子量体を用い標準タンパク質（各々１０μｇ）をまた 分離した。アミロース分解活性を示すタンパク質の分子量は約７０ＫＤａであっ た。

゛　■および　２ｒＩＰ（第２図を参照）至適温度の測定を酵素を用いて行った が、この酵素はスーパーローズ１２カラムでゲル濾過して部分的に精製（次いで ０．５％マルトデキストリンで安定化したものであった。インキュベーションは 湯浴（４０℃〜１００℃）で更にグリセリン浴（１０５”〜１３０°Ｃ）中、ｐ Ｈ５，５で行った。１００℃超の温度でのインキュベーションは、溶液の沸とう を防止するため封止ヒュンゲート管内で行われた。０．５％（Ｗ／Ｖ）デンプン を含有する酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ。

ｐＨ５，５）２５０μｌに、２００μｍの酵素溶液（１６００Ｕ／１）を添加し 、インキュベーションを１０分間行った。

形成した還元糖をベルクマイエルおよびグラセー（同上）により記載された如く 測定した。酵素の至適ｐＨの測定のため、次の緩衝液を用いた：５０ｍＭのクエ ン酸ナトリウム（ｐ１１３．５〜４．０に対し）、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ ｐＨ４，５〜６．０に対し）およびリン酸カリウム（ｐＨ６，５〜８．０に対し ）。ｐＨ測定は９０℃で行った。

試験した酵素は、４０〜１３０°Ｃの広範囲の温度でかつｐＨ３，５〜８．０で 活性であった。最大活性はｐｕｓ、ｔｏｏ″Ｃで検知された。

愁皮定二（第３図参照） 酵素含有試料を湯浴（７０〜９０°Ｃ）およびグリセリン浴（１００〜１３０° Ｃ）中でインキュベートした。種々の時間間隔後、試料を取り出し更にα−アミ ラーゼ活性をベルクマイエルおよびグラシー（同上）に従って測定した。１％（ Ｗ／Ｖ）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ。

ｐＨ５，５）２００μｌに、５０μｌまでの酵素溶液を添加し次いで９５℃で３ ０分および６０分間インキュベーションを行った（ロア０〜９０″Ｃ；◆１００ ℃；■１００°Ｃｉｏｌ　２０°Ｃ；ム１３０°Ｃ）。

、カチオンおよびＥＤＴＡの≦ Ｐ　ボエセイ　−ｏｅｓｅｉ　）由来のα−アミラーゼの活性に対する金属カチ オンおよびＥＤＴＡの影響を酵素を用いて調べたが、この酵素はスーパーローズ １２カラム（ファルマシア、スウェーデン）でゲル濾過することにより部分的に 精製したものであった。第２表参照。α−アミラーゼを含む分画を集め、４倍に 濃縮した。２５μｌの酵素（４００Ｕ／１）をＬ％（Ｗ／Ｖ）デンプンを含有す る１００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、　ｐＨ５，５）に添加した。

酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ５，５）中に溶解した金属カチオン を種々の濃度で添加した。グリセリン浴（１００°Ｃ）中４０分間インキュベー ションした。最後に還元糖をベルクマイエルおよびグラシー（同上）により記載 した如く検知した。値は、％で測定した酵素活性を表わす。

第２表 ＥＤＴＡ　１００　９５　８５　６０ Ｃａ”　１００　１２０　１２０　８５Ｃｏ”　１００　１２０　１００　８０ Ｃｒ”　１００　６　２　１ Ｃｕ”　１００　６　２　０ Ｆｅ”　１００　８０　５５　１５ Ｍｇ”　１００　９５　８５　ｌ１０ Ｍｏ”　１００　１０５　１００　１２ＯＮｉ”＋　１００　７０　６５　５０ Ｚｎ”　１００　１５　０　０ 例２ Ｐ　フリオサス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　から′　゛れるα−アミ−−ゼＰ　フ１オ サス　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　の立　（第４図参照）以下の組成（１当たり）を有す る複合培地上でＮ、　／ｃｏｚ（８０％／２０％）雰囲気下バッチー培養で増殖 実験を行った。

（ＮＨｎ）ｔ　ＳＯ４１，３００ｇ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　・７Ｈ，００，２５０ｇＮａＣ１３０，０００ｇ ＫＨｚ　ＰＯａ　１．４００ｇ Ｃａ　Ｃ１ｇ　０．　０５０　ｇ ＦｅＳＯ＝　・　７Ｈ２００，０３８ｇＮａｇ　５ｅａｓ　・５Ｈｚ　０　５μ Ｍ微量元素′″”　１０ｍ１ トリプトン　１，０００ｇ 酵母エキス　１．０００ｇ デンプン　１．０００ｇ レサズリン　０．００１ｇ システィン・ＨＣＩ　Ｏ，５００ｇ ｐＨ６，２−６，５ 温度９０−１００℃ ガスＮ２／ｃｏ！　８０／２０　（１韮１薦、）Ｏ微量元素溶液（１１当たり） ： ＭｎＣ１ｚ　−４Ｈｚ　Ｏ０，１０ｇ ＣｏＣ１ｚ　’６Ｈｚ　Ｏ０，２０ｇ Ｎｉ　Ｃｌｚ　・６Ｈｚ　Ｏ０，１０ｇＺｎＣＬ　Ｏ，］００ ｇＣａＣ１ｚ　Ｈ２Ｈ！　０　０．０５ｇＣｕＳＯｓ　・２Ｈｚ　Ｏ０，０５ｇ Ｎａｇ　ＭｏＯ４・２Ｈ２００，０５ｇ連続通気を行うことにより、１，０ＯＯ Ｕ／１以上の酵素活性を検知した。これらの増殖条件は、培養液へ酵素の約８０ ％分泌をもたらした。

ｌ良１分塁 生理化学的調査を行うため、細胞外アミラーゼをゲル濾過により部分的に精製し た。全ての実験は、金属イオンの非存在下かつ好気性条件下で行った。

゛　Ｈおよび　：Ｐ″　５゛余 図面示すように、ピロコツカス　フｉオサス　Ｐｒ０ｃＯｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓ ｕｓ）由来のアミラーゼは、４０〜１３０’Ｃの広範囲の温度でかつ３．０〜８ ．０のｐＨ域で活性である。最大活性は１００〜１０５°ＣでかつｐＨ４，５で 測定される。約６０％の酵素活性が１３０°Ｃで未だ検出できる。至適ｐＨおよ び至適温度を測定するためのピロコツカス　フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ　）α−アミラーゼの条件は、ピロコツカス　ボエセイ（Ｐｙ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｅｓｅｉ）α−アミラーゼに対するものと同様であった 。

塾互定ユ（第６図参照） 極めて高い至適温度の他に、アミラーゼは顕著な熱安定性を示す。図面に示され るように、沸とう水浴中で６時間インキュベートすると、酵素活性はわずか２０ ％に減少する。１３０°Ｃですら酵素活性は３０分後に未だ検出できる。

金　イオンおよびＥＤＴＡのと ５ｍＭのモリブデン、カルシウムもしくはマグネシウムの各イオンの添加はアミ ラーゼ活性に影響しなかった。活性のわずかな減少が、コバルト、ニッケルおよ び鉄イオンの存在下で検出できそして５ｇｍＭの亜塩もしくは銅イオンを添加し た時完全な粗害が見出された。ＥＤＴＡは何ら影響しなかったので、従って金属 イオンの添加は酵素活性に必要でないと推定できる。

Ｉｌ皆異箪 ビロコ１カス　フリオサス（Ｐ　ｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の 部分精製細胞外アミラーゼは、天然のデンプン、可溶性デンプン、アシロペクチ ン、マルトデキストリンおよびマシロースの加水分解した。デンプン分解の主生 成物は、オリゴサツカリド１ＭえＩｔｉマルトヘキソース、マルトペントース、 マルトペト−ス、マルトリオースおよびマルトース（第３表）であった。ピロコ ツカス　フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のアミラ ーゼは、デンプンおよびアミラーゼ中のα−１゜４−グリコシド結合をランダム に分解するので、これはα−アミラーゼと命名できる。

デンプンＤＰｎ　ＤＰ７　ＤＰ６　ＤＰ５　ＤＰ４　ＤＰ３　ＤＰ２　ＤＰＩＯ ｈｌｏｏｏｏｏｏｏｏｏ ０．５ｈ　９３　１　１　１　１　１　２　０１．５ｈ　４１　４　６　１０　 １１　１１　１２　５３、Ｏｈ　３５　Ｂ　９　１１　１０　１０　１２　５８ 、Ｏｈ　１　４　６　１５　１９　２１　２７　８２４、Ｏｈ　Ｏ２２６１６２ ５３３１６１五二酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、　ｐＨ５，５）　ｌａｌ当たり、 ０゜５Ｕの酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（Ｗ／Ｖ）テアった。イン キュベーションを９０°Ｃで行い、試料を種々の時間間隔後取り出した。次いで 各試料をイオン交換樹脂（Ｓｅｒｄｏｌｙｔ　ＭＢ、セルバ、ハイデルベルク、 ＦＲＧ）を用いて精製し、次いでＡｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ−４２Ａカラム（Ｂｉｏ −Ｒａｄ、リッチモント、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用い、ＨＰＬＣにより糖 を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Ｋａｕｅｒ、バド　ホムブルク、ＦＲＧ ）により監視した。ＤＰ、重合度；ＤＰｌ、グルコース。

例３ 蓬［ジ土２゜ ３０％Ｗ／Ｗコーンスターチスラリーを脱イオン水中で調製し次いでｐＨを４． ５に調節した。次いで、ステンレスチール管（きつくフィツトした蓋を備えてい る）に移し、次いでＩｇデンプン当たり１７ＮＵのＰ、ボエセイ　賀ｏｅｓｅｉ 　）α−アミラーゼを添加した。

管を１０５°Ｃで６０分間加熱し、この間デンプンは完全に液化した。液化後、 ＤＥを測定し、１６であった。

管の内容物を６０°Ｃに冷却し、次いで１ｇのデンプン当たり０．２４ＡＧの、 Ｎ−三葺虻二７）グルコアミラーゼを更にｐＨ調節なしで添加した。７２時間後 、ＨＰＬＣ分析により測定し、試料は次の炭水化物組成を有していた。

％ＤＰ、　９５．５ ＤＰ、　３．０ ＤＰ３　０．　９ ここで、ＤＰは重合度を意味する（ＤＰＩ””モノサツカリド、Ｄ　Ｐ　ｚ　＝ ジサンカリド等）。。

α−アミ−−ゼ２　の 標準活性ＮＯ（これはノボα−アミラーゼ単位の略号である）は、１時間当たり ３７°Ｃ，ｐＨ５，６でかつ０．００４３モルのＣａ”で７〜２０分にわたって 溶解したデンプン５．２６ａ＋ｇを加水分解する酵素の量である。分析的方法を 記載するホルダーＡＦ９は要求に応じノボノルディスクＡ／Ｓ　（デンマーク国 ）から入手可能である。

ピロコツカスα−アミラーゼの活性は６０″で測定されかつ同条件下で分析され たターマミル標準に関係する。

例４ Ｗ　α−アミ−−ゼの 至Ａ」至１豊主ｌ（第７図参照） 至適温度の測定を、スバラース１２カラムでゲル濾過することにより部分的に精 製したが、マルトデキストリンで安定化されていない例１で得られた酵素を用い て行った。インキュベーションを、湯浴（４０℃〜１００℃）中およびグリセリ ン浴（１０５°Ｃ〜１３０℃）中、ｐＨ５，５で行った。１００℃を越える温度 でのインキュベーションを密封ヒュンゲートー管内で行い溶液の沸とうを防止し た。０．５％（Ｗ／Ｖ）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（５０＋＋＋ Ｍ、　ｐｔ１５゜５）２５０μＩに、２０μｌの酵素溶液（１６００Ｕ／ｌ）を 添加し次いで１０分間インキュベーションを行った。次いで形成した還元糖をベ ルクマイエルおよびグラセー（同上）によって記載された如く測定した。酵素の 至適ｐ）ｌの測定に対し、次の緩衝液を用いた：５０ｍＭのクエン酸ナトリウム （ｐＨ３，５〜４．０に対し）、５０＋ｎＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４。

５〜６．０に対し）およびリン酸カリウム（ｐＨ６，５〜７゜５に対し）。測定 は９０″′で行った。

図面で示したように、本発明のα−アミラーゼは又安定量の基質の非存在下で測 定した場合、９０°で測定して至適ｐ）１５．２〜５．８およびｐＨ５，５で測 定して至適温度９０〜１０５°Ｃを有する。最大活性はｐＨ５，５および１００ °Ｃで検出される。

６０分後、１００°Ｃで１００％１１０°Ｃおよび１２０°Ｃで７０％および１ ３０°Ｃで１０％の残留活性を測定する。

時間（時） 温度（°Ｃ） ｐＨ 時間（時） 時間（時） ２０　４０　６０　８０　Ｔｏｏ　１２０　１４０温度（”Ｃ） Ｈ 時間（時） 温度（°Ｃ） Ｈ 国際調査報告 国際調査報告 ρＣＴ／ＤＫ　９０１０００７４

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の要素（ａ）〜（ｅ）： （ａ）安定化量の基質の存在下９０℃で測定して至適ｐＨ４．０〜６．０、 （ｂ）安定化量の基質の存在下ｐＨ５．５で測定して至適温度８０〜１２０℃、 （ｃ）本質的にカルシウムイオンから独立している、（ｄ）安定化量の基質の存 在下で測定して９０℃で１時間後１００％、更に１００℃１時間後少なくとも８ ０％の残留活性、 （ｅ）ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌株の培養によって得ることので きる、 ことを特徴とするａ−アミラーゼ。
2. ２．以下の要素（ａ）〜（ｅ）： （ａ）基質の非存在下９０℃で測定して至適ｐＨ５．２〜５．８、 （ｂ）基質の非存在下ｐＨ５．５で測定して至適温度９０〜１０５℃、 （ｃ）本質的にカルシウムイオンから独立している、（ｄ）安定化量の基質の存 在下で測定して１００℃１時間後約７０％の残留活性、 （ｅ）ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌株の培養によって得ることので きる、 ことを特徴とするａ−アミラーゼ。
3. ３．Ｐ．ポエセイ（ｗｏｅｓｅｉ）又はＰ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）の 菌株を培養することにより得ることのできる、請求の範囲第１項又は第２項記載 のａ−アミラーゼ。
4. ４．Ｐ．ポエセイ（ｗｏｅｓｅｉ），ＤＳＭＮｏ．３７７３、又はＰ．フリオサ ス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ），ＤＳＭＮｏ．３６３８の菌株を培養することによって 得ることのできる請求の範囲第３項に記載のａ−アミラーゼ。
5. ５．ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のａ−アミーゼ生産菌株を、炭素お よび窒素源および無機塩を含有する適当な栄養培地中で培養し、次いで目的酵素 を回収することを含んでなる請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のａ−アミ ラーゼの調製方法。
6. ６．Ｐ．ポエセイ（ｗｏｅｓｅｉ）又はＰ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）を 培養する、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．Ｐ．ポエセイ（ｗｏｅｓｅｉ），ＤＳＭＮｏ．３７７３、又はＰ．フリオサ ス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ），ＤＳＭＮｏ．３６３８を培養する、請求の範囲第５項 に記載の方法。
8. ８．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のａ−アミラーゼの存在下、水性デ ンプンスラリーを酵素的液化に委ねることを含んでなるデンプン液化方法。
9. ９．本質的にカルシウム塩をデンプンスラリーに添加することなくプロセスを行 う、請求の範囲第８項に記載のデンプン液化方法。
10. １０．前記プロセスを、１００〜１４０℃の範囲内の温度で１２０分までジェッ トクッキングにより行い、次いで所望により保持すべき温度を９０〜１００℃の 範囲の温度に約３０〜１２０分減少させ、しかる後このように液化したデンプン は老化に対し安定であり、ｐＨはプロセス中約４．０〜５．５に保持されている 、請求の範囲第８項又は第９項に記載のデンプン液化方法。
11. １１．液化デンプンをしかる後、実質的に中間ｐＨ調節することなくグルコアミ ラーゼの存在下、酵素的糖化に委ねる請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載 のデンプン液化方法。
12. １２．更に酵母を用いたエタノール発酵を糖化と同時に行うか又はその後引続い て行う糖化を行う請求の範囲第１１項記載のデンプン液化方法。