JPS62201577A - β−アミラ−ゼ酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なβ−アミラーゼ酵素製品、その調製方法
、該β−アミラーゼ並びに他の酵素を含有する組成物、
並びにハイマルトースシロップの製造におけるβ−アミ
ラーゼ又は該組成物の使用に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕β−
アミラーゼは、アミロース、アミロペクチン及び関連グ
ルコースポリマーにおける１、４−α−グルコシド結合
の加水分解を触媒するエキソ作用マルトース産生アミラ
ーゼに対し伝統的に与えられている名称である。マルト
ース単位は、分子が分解するまで、あるいはアミロペク
チンの場合には分枝点に達するまで、段階的に非還元末
端から連続的に分解される。分解されたマルトースは、
βアノマー配置を有し従ってβ−アミラーゼの名称を有
する。

β形のマルトースは、水溶液中自然発生的に異性化しα
−もしくはβ−形の混合物となるであろう。アミロペク
チン又は部分分解アミロペクチンとβ−アミラーゼとの
長時間反応により、β−リミットデキシトリンが形成し
、このβ−デキシトリンは、β−アミラーゼにより更に
加水分解を受けにくい物質である。

β−アミラーゼは、製菓、製パン及び醸造工業において
用いるシロップ含有のマルトースを生産する為に用いる
ことが出来る。

ハイマルトースシロップの製造において、β−アミラー
ゼは、β−リミットデキシトリン内の１．６−α−グル
コシド結合を加水分解することによる生成物中のマルト
ース含量を増加する為枝切り酵素と共に通常用いられる
。

β−アミラーゼは、種々の植物及び微生物から単離され
てきている（Ｗ、Ｍ、フォーゲルティ及びＣ，Ｔ、ケレ
イ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＶ、１５巻、１１２〜１１５頁、
１９７９）。

これ等のβ−アミラーゼは、最適温度を４０℃〜６５℃
の範囲内に更に最適ｐ）Ｉを４．５〜７の範囲内に有す
る。

枝切り酵素は、大抵最適ｐＨを３．５〜６の範囲内に有
し、従って酸性溶液中でより活性である。β−アミラー
ゼを枝切り酵素と組み合わせて用いる場合、選択される
酵素又は連続的に用いられている酵素の各々の最適ｐＨ
０間にあるのが通常である。

水溶液中の澱粉をβ−アミラーゼにより加水分解するマ
ルトースの製造におけるプロセスにおいて、老化を抑制
しかつ微生物感染を避ける為６０℃で又はそれ以上の温
度を用いるのが好都合である。

植物源β−アミラーゼは更に以下の欠点を有する。即ち
それ等の製造には多量の原料物質並びに抽出及び処理に
対し多大なエネルギーを必要とする。一方微生物源β−
アミラーゼは比較的低コストで大規模スケールで製造さ
れ得る。

マルトース酸性アミラーゼが、１９８４年３月３日に出
願された米国特許出１１１１５９１，４６０に開示され
ており、こ＼におけるアミラーゼは６０〜６５℃の範囲
内の温度で用いるのに十分熱安定性である。しかし、こ
の酵素は最適ｐＨをｐＨ４，５〜５．５に有する。

更に、該米国特許出願による酵素は、マルトトリオース
を加水分解し、これはグルコースの生産をもたらす。

ハイマルトースシロップにおいて、グルコースの存在は
避けねばならないことであり、更に該マルトース酸性ア
ミラーゼを使用すると、相当のレベルで製造されたグル
コースをその後除去する必要がある。

従って、次に述べる如く有効な微生物源β−アミラーゼ
調製品に対する要求が存在する；即ち該アミラーゼ調製
品は、経済的方法で澱粉を加水分解する為に必要な長期
間に亘って６０〜７０℃で用いる為に十分に熱安定性で
あり、更に最適条件のもとでβ−アミラーゼ及び枝切り
酵素により澱粉を同時に加水分解する為にｐＨ５以下の
値で十分に安定であり、更にハイマルトースシロップの
製造ニおいては、時としてその後シロップから分離しな
ければならない過剰量のグルコースを生産しないような
ものである。

〔問題点を解決する為の手段、作用及び発明の効果〕

本発明の目的は、高温安定性、５未満のｐＨでの最適ｐ
ｌ（値を有し更に最少量のグルコースを生産する新規な
微生物源β−アミラーゼを提供することにある。

本発明は、このような特性を有する新規な微生物源細胞
外β−アミラーゼ（２１−５１β−アミラーゼ）が新規
に単離されたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株ＮＣＩ
Ｂ　１１６０８から生産されるという知見に基づいてい
る。

本発明並びに以下に述べる記載のよりよき理解の為、添
付の図面を参照され度い： 第１図は温度に対するマルトース酸性酵素の相対活性を
プロットしたものであり、更に第２図はｐｌ＋に対する
相対活性をプロットしたものである。

第一の面によれば、本発明は、下記の特性を有する新規
な熱安定性β−アミラーゼを含んでなるβ−アミラーゼ
酵素製品を提供する： ａ）　該β−アミラーゼは、寄託番号ＮＣＩＢ　１１６
０８をもって寄託されたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
菌株を適当な栄養培地中で培養することによって得るこ
とが出来る。

ｂ）　８亥β−アミラーゼは、バシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）菌株ＮＣＩＢ　１１６０８から誘導されたβ−ア
ミラーゼの酵素化学的性質を示し、 ｃ）　　ｐＨ４，５でアセテート緩衝液（０，１Ｍ）中
３０分の反応時間で測定してその最適活性が約７０℃で
あり、 ｄ）　その最適ｐＨがマキールバイネ（Ｍｃｌｌｖａｉ
ｎｅ）　ＩＩ衝液中約６０℃で測定し３０分の反応時間
でｐＨ４〜５の範囲内にある。

第二の面によれば、本発明は上記熱安定性β−アミラー
ゼ酵素製品の製造方法を提供するものであり、この方法
は、上記バシラス■匹ｕ且ｕ菌株ＮＣ４Ｂ　１１６０Ｂ
又は該酵素生産生のその変異株もしくは突然変異株を炭
素源及び窒素源を含有する適当な栄養培地中で培養し、
所望によりβ−アミラーゼ酵素製品を回収することを含
んでなる。

更に本発明の別の面によれば、本発明は澱粉を水性培地
中新規なβ−アミラーゼ酵素製品で処理し、高純度のマ
ルトースシロップを製造する方法を提供する。

試験の結果、新規なβ−アミラーゼ酵素製品はマルトー
ス及びハイマルトースシロップの製造に適していること
が判明した。該製品は、低吸湿性、低粘度、良好な熱安
定性及び軽く、甘すぎない味のマルトースの故に、菓子
等の製造に特に重要である。

マルトースシロップを製造する工業的プロセスは、マル
トース生産酵素及び所望により、アミロペクチンの１，
６−分枝点を分解する酵素、例えばプルラナーゼ又はイ
ソアミラーゼを用いて澱粉を液化し次いで糖化すること
を含んでなる。

更に別の面において、本発明は、新規なβ−アミラーゼ
製品と少なくとも一種の枝切り酵素との組み合わせから
なる活性酵素組成物を提供する。

他の別の面によれば、本発明は高純度マル）−スシロソ
ブの製造方法を提供するものであり、こ＼において澱粉
は本発明の新規な活性酵素組成物で処理される。

新規酵素組成物を用いることにより、最適ｐＨ条件下で
澱粉の上記糖化を行うことが可能であり、これによりマ
ルトースの収率が増加し更に添加される酵素の量を減少
することが出来る。

２１−５１β−アミラーゼは、アミロペクチン、グリコ
ーゲン、及びアミロースを加水分解し、β−マルトース
のみを放出する。

分技多Ｉｉ類、例えばアミロペクチン及び部分氷解アミ
ロペクチンから、２１−５１β−アミラーゼはβ−リミ
ットデキ゛シトリンを生ぜしめ、これはグルコアミラー
ゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ等により加水分解さ
れ得る。

２１−５１マルトース酸性アミラーゼは、次の点におい
て他のハシラスβ−アミラーゼと異なる；１、該アミラ
ーゼは７０℃の緩衝液中で安定であり、 ２、該アミラーゼは４．０〜５．０のｐＨ範囲内で安定
である。このことはイソアミラーゼ及びプルラナーゼの
如き枝切り酵素と共に使用出来ることを意味する。

３、　グルコースが最少量で僅かに生産される。

本発明に係るβ−アミラーゼ生産能微生物は、以下の如
く調製された寒天基質上で増殖する為のその能力により
選択されるニ ドリプトン（１０ｇ）、アミロペクチン（ＣＰＣスノー
フレーク１０ｇ）、バタトアーガー（４０ｇ　）、及び
脱イオン水（１０００ｍｊ２　）を以下の組成を有する
塩溶液の当世と５５℃で無菌的に混合する＝（ＮＨ４）
ｚｓＯａ　　　：　ｏ、ｏ４ＴｆＬ量％ＭｇＳＯ４１７
ＨｚＯ：　０．１重量％ＣａＣ１ｚ　　　　　：　０．
０５重量％ＫＨ２ＰＯ，７０，６ｆｆｉ景％ 塩溶液のｐＨは、ＩＯＮ硫酸で３．０に調節する。

単離した微生物は、１９８３年３月１５日にナショナル
　コレクション　オブ　インダストリイ　バクテリア（
ＮＣＩＢ）　（）リイリサーチスティション、アバディ
ーン、スコツトランド）に寄託され、寄託番号ＮＧＩＢ
　１１６０８が付与されている。１９７７年ブタペスト
条約のもとて国際寄託当局となったＮＣＩＢは、該条約
の規則９及び１１に従ってそれぞれ寄託の実施及びそれ
に対する報酬に対する分譲の業務を行う。

分類学 形態学 直径０．６〜０．８μｍを有する棒状細菌胞子は卵形な
いし円゛筒形であり、中央から末端に存在し更に胞子嚢
の膨潤を引き起こさない。

生止ヱ反庭 グラム　カラー　　　　　　　　＋ 嫌気性増殖　　　　　　　　　　− カタローゼ　　　　　　　　　　＋ ｖｐ反応　　　　　　　　　　　− 硝酸塩の還元　　　　　　　　　十 しシチナーゼ　　　　　　　　　− ３．５％ＮａＣ１中での増殖　　　　−澱粉の加水分解
　　　　　　　　十 カゼインの加水分解　　　僅かに＋ グルコースからの酸の生産　　　十 アラビノースからの酸の生産　　− キシロースからの酸の生産　　　− マニトールからの酸の生産　　　十 シトレートの利用　　　　　　　　− プロピオナートの利用　　　　　−及び５０℃での増殖
　　　　　　　　−。

バシラスＮＣｌ３１１６０８は、ｐｕｓを超える通常用
いられる培地上増殖しない。この細菌に対する最適増殖
条件は、ｐＨ４，８〜５．８であり３０〜３７℃の温度
である。

細菌の増殖の為の最高温度は４５℃である。

上記試験において、等量の１％トリプトン及びＢＡ−１
塩を有する標準培地が用いられた。

ＢＡ−１塩は次の組成を含んでなる： （ＮＨ＊）　ｚｓＯａ　　　　０．０４％Ｍｇ５Ｏｎ　
　・７ＨｚＯＯ，１％ ＣａＣ１ｚ　　・２８ｚＯＯ，０５％ ＫＨ□ｐｏ４０．６％ オートクレイプ処理する前にｐＨを、ＩＯＮの硫酸で３
．０に調節する。　　′ 予め混合したトリプトン塩基培地のｐＨは４．８〜５．
２である。

全ての上記生化学的反応及び増殖試験は、１％の酵母エ
キスを添加しであるいは添加せず該基質上で行った。

ＮＧＩＢ　１１６０８の増殖の為の標準増殖培地は０．
５％のアミロペクチンを含有し、酵母エキスは含有して
いない。ＮＣｌ３１１６０Ｂの植物細胞は、しばしば気
泡を含有しており、これは接触型顕微鏡において屈折性
の球状として現われ、更にこれは細胞をサフラニン型の
メチレンブルーで僅かに染色した場合着色されない。

形態学的及び生化学的性質は、バシラスメガテリウムμ
迫１土１ｕｓ　ｍ邦立堕二匡り−を特徴づけるその特性
に非常によく似ているが、β−アミラーゼの特性は、Ｂ
、メガテリウムＢ、　ｍｅ　ａｔｅｒｉｕｍ）　β−ア
ミラーゼに対しこれまで記載されていたものとははるか
に異なっている。

酵素活性の決定 １β−アミラーゼ単位（βＵ）を、標準条件（温度６０
℃、ｐＨ４，５及び反応時間３０分）のもとで、毎分１
μｍｏｌのマルトースに対応する還元糖を生産する酵素
の量と定義する。

０．１Ｍのアセテート緩衝液に溶解した０、５ｒｒｌの
２％澱粉を、１ｍ１当り０．５〜２βＵを含有する脱イ
オン水に溶解した酵素１００μｌでインキュベートする
。反応を、０．５Ｎの水酸化ナトリウム０．３ｒｒｌを
添加し３０分後停止し、次いで混合物を脱イオン水でｌ
：１０の割合に希釈する。

次いで還元糖の量を、ソモギイ法（ソモギイ：Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　１５３．３７５〜８０頁（１
９４４））に従って測定する。

酵素の調製 本発明のβ−アミラーゼ生産能を有するバシラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）菌株を、適当な発酵培地中嫌気的条件下
でその培養前に固体基質上で通常増殖させる。

双方の培地は、無機塩の他に炭素及び窒素の同化性源並
びに所望により増殖促進栄養源、例えば酵母エキスを含
有する。発酵は典型的には３０℃〜３７℃でかつｐＨ５
〜６で行われ、更に好ましくは自動的手段によりはソ゛
一定状態に保たれる。酵素が培地中に排出される。

精製した発酵プロスは、例えば濾過法により他の固体と
共に細菌細胞及びそれ等の破片を分離してそれ等を含有
しないものとすることが出来る。

酵素を含有する上澄みは、更に例えば濾過法又は遠心分
離により澄明化出来更に必要により、例えば限外濾過法
によりあるいは又減圧上蒸発器内で濃縮し濃縮物を得る
ことが出来これは所望により例えば凍結乾燥法又はスプ
レィ乾燥法により乾燥乾固出来る。

酵素の精製 本発明のマルトース産生アミラーゼは、以下の如く連続
的発酵培養プロスから精製出来る＝２５０リットルの培
養プロスを、濾過し次いで濾液を限外濾過し、菌類濾過
し、次いで凍結乾燥する。

粉末を１５ｍＭのアセテート緩衝液、ｐＨ５，０に溶解
し次いで伝導率が約１ｍＳとなるまで、１５ｍＭのアセ
テート緩衝液（ρ）１５．０）に対し透析する。次いで
透析物を、同緩衝液で既に平衡化したカチオン交換ＣＭ
−セファロースＣ１−６Ｂに通用する。アミラーゼをカ
ラムに通過させるが、６０％の残存蛋白がイオン交換剤
により保持される。

カラムからの溶出液のｐＨを、酢酸で４．０に調節し次
いで引き続き溶出液を、１５ｍＭのアセテート緩衝液（
ｐｌ＋　４．０　’）で平衡化したＣＭ−セファロース
Ｃ１−６Ｂカラムに適用する。次いで酵素を、イオン強
度を増加させながら９Ｎ４．０のアセテート緩衝液で溶
出させる。溶出液の酵素活性は、対称ピークの蛋白含量
をもたらす。

酵素化学的性質 本発明のβ−アミラーゼの作用に関するｐＨ及び温度依
存性を、ｐＨ及び温度を予め定めた値に調節した反応混
合物を用い上記方法により測定した。

添付図面を参照され度い。

第１図は、温度に対しプロットした相対活性を示すグラ
フである（基質２％可溶性澱粉、ｐｎｉ、ｓ（０，１Ｍ
アセテート）、反応時間３０分）：第２図はｐＨに対し
プロットした相対活性を示すグラフである（温度６０℃
、基質２％可溶性澱粉、反応時間３０分、ミクルヴアイ
ン緩衝液）。

添付図面から示されるように、２１−５１β−アミラー
ゼは、ｐＨ４，５で約７０℃の最適活性を有し更にその
最適ｐＨ値は、４．０〜５．０の範囲内にある。

最大活性の６０％以上が未だ８０℃で見い出される。

〔実施例） 例１ バシラスｓｐ、２１　５１、寄託番号ＮＣＩＢ　１１６
０８由来のβ−アミラーゼの調製 接種物 ２１−５１培養菌を、次の寒天上で２日間３７℃で増殖
させた： 以下の組成（０，０４重景％ｆ７）（ＮＨ４）ｚｓＯａ
　、０．１重量％　ノＭｇＳＯ４４ＨｚＯ，０，０５重
量％のＣａＣ１２及び０．６重量％のＸｌｌ□Ｐ０４）
からなる塩溶液（塩の溶液のｐＨはＩＯＮ　ＩＩＺｓＯ
４で３．０に調整した）の当量と混合した１０ｇのトリ
プトン、１０ｇのアミロペクチン（ＣＰＣスノーフレー
ク）、４０ｇのバクトアーガー及び１０００　ｍ　Ｉｔ
の脱イオン水。

連続発酵 連続発酵を、次の組成を有する基質を用いて行った： ０．２％のディフコ酵母エキス　　０．２％コーンステ
イープリカー　　　　１．０％（ＮＨ＊）　ｚｓＯａ　
　　　　　　　　　　　０．１％Ｍｇ５Ｏａ　　・７　
Ｈ２Ｏ０，０３７５％Ｋｔｎｐｏ、、　　　　　　　　
　　　　　０．０３７５％ＣａＣ１ｚ　　’　２　）１
ｇ８　　　　　　　　　０．０３７５％バクトドリプト
ン　　　　　　　　０．４％プルラン　　　　　　　　
　　　０．５％プルロニック６０１　　　　　　　　０
．０８％水で１００％に調節し、次いで１３０℃で３０
分間オートクレーブした。

発酵を、１リツトルの処理容量を有するビオフェロ（Ｂ
ＩＯＦＬＯ）　（登録商標）にューブルンスヴイック、
カナダ）発酵器中で行った。

発酵を上記接種物１００ｍｊｌ！を用いて開始し、次い
で２４時間後３０℃で基質の添加を開始した。

ｐ）Ｉを、３％硫酸を用い５．５±０．２に調節し次い
で温度を３０℃±０．２で保持した。

通気：０．５リットル／基質１リットル／分希釈速度：
　Ｄ　＝　０．０９０±０．００５時間例２ 糖化用の基質は、脱イオン水中７ＤＢスプレイ乾燥マル
トデキシトリンを再溶解し次いで約３０％ＤＳにするこ
とにより調製した。糖化の実験は、標準のｓｏｏｍｌの
実験用回分式反応器内で行った。

少量の基質を５５℃又は６０℃に加熱し、ｐＨを初３ｔ
１１値５．５に調節し、次いで５βＵ又は２０βＵ／ｇ
ＤＳを添加した。サンプルを４．２４．４８．９６、及
び１６８時間後に回収し次いで沸騰水で１０分間加熱し
酵素を失活せしめた。冷却後サンプルを濾過し次いで混
合床イオン交喚樹脂（バイオ−ラッド（登録商標）　Ａ
Ｇ　５０１Ｘ　８　（Ｄ））で処理し、ＨＰＬＣ及びゲ
ルクロマトグラフィーによる分析の前に灰粉及び可溶性
窒素を除去した。

同じ手順を、本発明に係るβ−アミラーゼ１ｇ、Ｄ　Ｓ
当り５又は２０βＵ及びプルラナーゼ１ｇＤＳ当り１プ
ルラナ一ゼ単位（ＰＮＵ）及び１ｇＤＳ当り１００イソ
アミラーゼ単位（ＩＵ）の混合物を用いて繰り返した。

結果を以下の第１表に示す。

玉±１ 糖化温度：６０℃ 糖化温度：５５℃ 上記表から、以下の内容が明らかにされる。即ちグルコ
ース（ＤＰ、）の僅かな最少量が、本発明のβ−アミラ
ーゼにより生産され、そして該β−アミラーゼと枝切り
酵素例えばプルラナーゼ及びイソアミラーゼを併用して
用いると、ハイマルトース含量（ＤＰ、）のシロップが
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のβ−アミラーゼに関し温度に対しプ
ロットした相対活性のグラフであり、第２図は本発明に
係るβ−アミラーゼに関しｐ）ｌに対しプロットした相
対活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）菌株ＮＣＩＢ　
   １１６０８の適当な栄養培地中で培養することによって
   得ることのできるβ−アミラーゼ酵素。 ２、固体の形態にある特許請求の範囲第１項記載による
   アルトース産生アミラーゼ酵素製品。 ３、特許請求の範囲第１項記載のβ−アミラーゼ酵素の
   製造方法であって、該酵素生産生のバシラス（￥Ｂａｃ
   ｉｌｌｕｓ￥）菌株ＮＣＩＢ　１１６０８又は変異株又
   は突然変異株を炭素源および窒素源を含有する適当な栄
   養培地中で培養し次いで培養ブロスからβ−アミラーゼ
   酵素を回収することを特徴とする、前記方法。 ４、特許請求の範囲第１項記載のβ−アミラーゼ並びに
   １種又はそれ以上の枝切り酵素を含んでなる、酵素組成
   物。 ５、枝切り酵素がイソアミラーゼ又はプルラナーゼであ
   る、特許請求の範囲第４項記載の酵素組成物。