JPS6225037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、澱粉を糖類に酵素変換する酵素の分
野に属する。詳述すれば、本発明はアミロペクチ
ン及びプルランにおけるアルフア−１，６−グリ
コシド結合を加水分解しうる新規枝切り酵素に関
する。この新規酵素はプルラナーゼ型の枝切り酵
素として分類することができる。本発明は更に新
規枝切り酵素の製造方法及び澱粉をデキストロー
ス及び／またはマルトースを含む澱粉加水分解生
成物、例えばデキストロース及びマルトースシロ
ツプに変換するための該酵素の用途に関する。 過去10年の間に、澱粉をシロツプに変える全酵
素加水分解は澱粉処理工業に広く、常に増加して
受容されてきた。世界的には、澱粉からデキスト
ロースシロツプの酵素による生産は、10年前の約
40万トンに比べて現在では１年当り300万トン
（乾物として計算）を越えると思われる。 澱粉の酵素−酵素加水分解に一般に採用される
方法は、液化工程及びそれに続く糖化工程を含
み、液化工程はアルフア−アミラーゼ、例えば熱
安定性バチルス・リヘニフオルミス（B.
licheniformis）アルフア−アミラーゼ、例えばデ
ンマークのノヴオ・インダストリイ社（NOVO
Industri Ａ／Ｓ）によつて供給されたターマミ
ル（TERMAMYL）によつて接触され、デキ
ストロース（Ｄ−グルコース）への糖化は前記の
会社からも得られるAMG−150Lのような、通
常、菌に由来するグルコアミラーゼの存在で行な
われる。デキストロースシロツプ製造者が、酵素
及びエネルギーの消費量をできるだけ少なくしな
がら出来るだけ高いデキストロース収率を得るこ
とを目指していることは明らかである。 30〜40％（重量）の澱粉懸濁液を用いて出発
し、30％の乾物（D.S）で糖化する従来法により
得られる最高のデキストロースレベルは約96％
（重量）のデキストロース（96DX）である。従来
の澱粉変換法がその限度をほとんど越えない理由
は本質的に２つある。 第一に、アミロペクチン（トウモロコシ澱粉を
含めて、多くの工業的に重要な澱粉の約80％を構
成する）は、相当数のアルフア−１，６−グリコ
シド結合を含む点で分枝鎖構造を示す。アルフア
−アミラーゼは実際にアルフア−１，６−グルコ
シダーゼ活性を有しないので、アミロペクチンは
アルフア−アミラーゼによつて部分的にしか分解
されないので、アルフア−１，６−グルコシド結
合を加水分解するグルコアミラーゼによつて触媒
されるその後の糖化工程において、アルフア−制
限デキストリンを含めて分枝オリゴ糖の実質的加
水分解が起る。しかしながら、アルフア−１，６
−結合の加水分解はアルフア−１，４−結合の対
応する加水分解より著しく低い速度で進行し、こ
れにより完全な糖化が妨げられる。それにより多
くのグルコアミラーゼを添加することによつて状
況を解決する試みは第二の障害（より高い酵素費
を要することを別として）、即ちデキストロース
重合（いわゆる逆反応）を触媒するグルコアミラ
ーゼの能力と衝突する。 ちなみに、澱粉の変換を約96DXから約98DXに
増加すると（これはデキストロースのある用途に
は著しい改良とみなされる）、非デキストロース
狭雑物の含有率が約50％だけ減少するが、このよ
うな澱粉の変換は、基質を約15％Ｄ・Ｓ・に希釈
すると共に、比較的高レベルのグルコアミラーゼ
を使用することによつて達成することができる
（米国特許第4017363号明細書参照）。しかしこの
ようなデキストロース溶液を後に一層高い常用の
乾物レベルに濃縮するには、エネルギーを消費す
る。 先行文献は、デキストロースレベルを著しく増
加するためグルコアミラーゼ及び枝切り酵素を同
時に使用することを示唆しており、枝切り酵素が
分枝鎖オリゴ糖中に存在する特殊なアルフア−
１，６−グリコシド結合及び一定のアルフア−制
限デキストリンを有効に加水分解することが判つ
たことを根拠にしている。この点について、米国
特許第3897305号明細書はグルコアミラーゼ及び
エアロバクター．エアロゲネス（Aerobacter
aerogenes）〔クレブシーラ・ニユーモニアエ
（Klebsiella pneumoniae）〕プルラナーゼを併用
し、それにより少なくとも30％の乾物を含むシロ
ツプに関して２％までのDXの顕著な増加を達成
しうることを開示している。グルコアミラーゼ及
び別の枝切り酵素、即ち英国特許出願第8107287
号明細書に記載されているシユードモナス・アミ
ロデラモーサ（Pseudomonas amyloderamosa）
イソアミラーゼの作用を合せても同様の結果が証
明された。 しかし第一の例では、クレブシーラ・ニユーモ
ニアエのプルラナーゼのPH最適範囲により糖化を
比較的高いPH（5.5〜６）で行なうことを余儀な
くされ、このPHではグルコアミラーゼの活性は急
激に減少するので、グルコアミラーゼは実際には
節約されない。 同じ問題は、グルコアミラーゼの最適PHに著し
く接近した最適PHを有するイソアミラーゼを用い
る場合には起らず、従つてグルコアミラーゼの用
量を実質的に減少（約50％だけ）することがで
き、同時に１〜２％のDX値の増加を達成しう
る。しかしながらイソアミラーゼ法（及び現実に
は公知のプルラナーゼ法にもある）の重大な欠点
は文献に公知の枝切り酵素が熱に不安定なことで
ある。このことは、従来枝切り酵素の存在での糖
化が約55℃以上では工業的に行なわれず、グルコ
アミラーゼ自体が60℃でさえ適切に安定であり、
この温度水準で基質の微生物汚染の危険がそれよ
り低い温度と比べて著しく減少することを意味す
る。 ベーターアミラーゼを用いて澱粉をハイマルト
ースシロツプに変換する際にも前記と同様の障害
に遭隅する。アルフア−アミラーゼと同様に、ベ
ータ−アミラーゼは、１，６−アルフア分枝点に
近づくに従つて加水分解が停止するので、アミロ
ペクチンを部分的にしか分解できない。ベータ−
アミラーゼの作用を枝切り酵素、例えばプルラナ
ーゼまたはイソアミラーゼの作用と組合せること
によつて、英国特許第1144950号及び米国特許第
3617896号明細書に開示されているように、マル
トース含有率の著しい増加を達成することができ
る。しかし55℃以上の糖化温度は枝切り酵素が熱
に不安定であるため適当でなく、これにより細菌
汚染の危険が著しく増加する。 本発明の目的は、グルコアミラーゼの温度安定
性に四適する温度安定性を有し、更にグルコアミ
ラーゼの最適PHに接近したPH最適域を有する新規
枝切り酵素を供給することによつて従来公知の枝
切り酵素の欠点を解消することである。 本発明は、このような性質を有するプルラナー
ゼ型の新規枝切り酵素が日本特許出願番号56−
88319に規定された分類に属するバチルス属の新
しく発見された微生物によつて産生されるという
意外な発見に基づく。 本発明は第一の態様により、下記の特性を有す
る； ａ 菌株バチルスアシドプルリテイクス （Bacillus acidopullulyticus）NCIB 11639 又はその変異株もしくは突然変異株を適当な
栄養培地中で培養することによつて製造された
発酵液から得られ、 ｂ バチルス・アシドプルリテイクス基準株 NCIB 11607から誘導された枝切り酵素と部分
的に同一の酵素化学的性質を示し、 ｃ PH４〜５で酢酸塩緩衝液（0.05M）中で測定
して最適活性が65℃〜70℃にあり、 ｄ 最適PHが、約60℃の酢酸塩緩衝液（0.05M）
中で測定して3.5〜5.5の範囲にあり、 ｅ 60℃、PH５のデキストロース溶液（30重量％
乾物として）中で測定して72時間後少なくとも
50％の残留活性を有する、 プルラナーゼ型の新規枝切り酵素を含む枝切り
酵素製品を提供するものである。 枝切り酵素製品は固体または液体の形であつて
よく、一般に1g当り10〜350000プルラナーゼ単
位（以下に定義する）の範囲に活性を有する。 本発明の好ましい実施態様では、枝切り酵素製
品の活性は１ｇ当り100〜15000プルラナーゼ単位
の範囲にある。 本発明の別の態様によれば、約60℃又はそれ以
上で最適活性、3.5〜5.5のPH範囲で最適PH及び60
℃で良好な熱安定性を示す枝切り酵素を含む枝切
り酵素製品を製造する方法が提供され、該方法は
炭素源、窒素源及び無機塩類を含む適当な栄養培
地中で、全ての実施上の目的に対し、適当な栄養
培地中でバチルス・アシドプルリテイクス
（Bacillus acidopullulyticus）NCIB 11639又は枝
切り酵素産生のその突然変異株を培養し、続いて
常法により枝切り酵素生成物を回収することから
成る。 更に別の態様によれば、本発明はデキストロー
ス及び／またはマルトースを含むシロツプに澱粉
を変換する方法を提供するものであり、該方法は
場合により、しかし好ましくは予め液化工程を行
なつて澱粉加水分解生成物を形成してから、前記
の新規枝切り酵素の有効量並びにグルコアミラー
ゼ及びベータ−アミラーゼから成る群から選択さ
れた糖化酵素から成る酵素系の存在で糖化を行な
うことから成る。 本発明の枝切り酵素を使用する好ましい態様に
おいては、澱粉加水分解生成物の乾燥固形分は少
なくとも30重量％であり、その糖化は55〜65℃の
範囲、好ましくは63℃以下の温度で3.5〜5.5のPH
範囲で実施する。グルコアミラーゼ及びベータ−
アミラーゼの好ましい用量はそれぞれ0.05〜
0.5AG単位及び0.005〜0.3ベータ−アミラーゼ単
位の範囲にあり、枝切り酵素の好ましい用量は澱
粉加水分解生成物中の乾物１ｇ当り0.005〜５プ
ルラナーゼ単位（以下に定義する）の範囲にあ
る。 好ましい付加的態様では、糖化酵素はグルコア
ミラーゼであり、これにより澱粉をハイDXデキ
ストロースシロツプに変える。 微生物 単離；本発明の枝切り酵素を産生する微生物
は、日本特許出願第56−88319号に開示される方
法によつて選択した： 微生物及びその突然変異株を、スコツトラン
ド、アバデイーンのナシヨナル・コレクシヨン・
オブ・インダストリアル・バクテリア、トリイ・
リサーチ・ステイシヨン（National Collection
of Industrial Bacteria，Torry Research
Station）に寄託し、下記の第表に示す受託番
号を得た。

【表】 株
本発明の微生物の微生物学的性質は、日本特許
出願第56−88319号で開示した微生物のそれと適
合し、それらはその基準株がNCIB 11607である
バチルスアシドプルリテイクスとして該出願中に
規定された分類グループに属する。 すなわち、本発明に係る微生物の菌学的特性は
次の通りである。 分 類 新しく発見した本発明の微生物は好気性で、杆
状の内生胞子形成細菌である。従つて本発明の微
生物はバチルス属に属する。 これらの微生物の性質は、バージイーズ・マニ
ユアル（Bergey′s Manual）〔第版、ウイリア
ムス・アンド・ウイルキンス（Williams and
Wilkins）、バルチモア、1974年〕またはゴード
ン（Gordon）、ハイネス（Heynes）及びパン
（Pang）によるモノグラフ；ザ・ジーナス・バチ
ルス（The Genus Bacillus）〔アグリカルチヤ
ー・ハンドブツク（Agriculture Handbook）No.
427、USデパートメント・オブ・アグリカルチヤ
ー（US Department of Agriculture）1973年〕
に記載されているバチルス属の認定された種のい
ずれとも一致しない。従つて本発明者らはこれら
を新規分類グループとして分類し、バチルス・ア
シドプルリテイクスという名称を与えた。 この新規分類グループの特性は下記のとおりで
ある。 形 態 栄養細胞：直径0.6〜１ミクロンの杆状体。プ
ロトプラスト性を有する膨潤細胞
がしばしば観察されそして数時間
の深部発酵中安定と思われる。 胞 子：円形〜楕円、中心ないし先端にある
子嚢は膨張しない。位相差顕微鏡
において胞子は原形質内に存する
染色できない球と区別するのが困
難である。これらの球に反して胞
子はマラカイト縁により染色され
る。 生化学反応： グラム反応 ；陽性 カタラーゼ ；陽性 好気性生長 ；陽性 嫌気性生長 ；陰性 50℃での生長 ；陰性 30〜37℃での生長 ；良好 3.5％NaCl中での生長 ；陰性 炭素源としてプルランを含有する基本 培地中でPH4.8〜5.2での生長 ；良好 卵黄反応 ；陰性 グルコースからの酸 ；陽性 マンニツトからの酸 ；陽性 硝酸塩の亜硝酸塩の還元 ；陽性 クエン酸塩の使用 ；陰性 プロピオン酸塩の使用 ；陰性 チロシンの分解 ；陰性 60℃で3.5〜5.5のPH範囲で活性な 澱粉枝切りプルラナーゼの産生 ；陽性 VP反応 ；可変 カゼインの加水分解 ；可変 キシロースからの酸 ；可変 アラビノースからの酸 ；可変 新規枝切り酵素産生菌株の形態は、これらがバ
チルス属の形態学的グループに属することを示
す。 プルラナーゼ活性の測定 １プルラナーゼ単位（PU）は、標準条件（温
度60℃及びPH5.0）下で毎分１μモルのグルコー
スと当量の還元性基の形成に相当する速度でプル
ランを加水分解する酵素の量と定義する。 酢酸塩緩衝液（0.1M，PH５）中のプルラン
〔シグマ・ケミカル社（Sigma、Chemical、Co.
）によつて供給される〕の４重量％溶液（１ml）
を60℃で10分間予め加熱し、続いて１ml当り0.04
〜0.15PUに相当する濃度で脱イオン水に溶かし
た酵素の溶液（１ml）を添加する。カーボネート
緩衝液、PH10（0.5M溶液３ml）を添加すること
により30分後に反応を停止する。次に、遊離した
還元性基の濃度をソモギイ−ネルソン（Somogyi
−Nelson）法（J.Biol.Chem.153（1944）375−
80、同、160（1945），61−68により測定する。 枝切り酵素製品の製造 本発明の枝切り酵素を産生しうる微生物を通
常、適当な発酵培地中で好気性条件下で培養する
前に固体基質上で増殖させる。両方の培地は、コ
ーンステイープ・リカーおよび酵母エキス又はソ
イビーンミール（液体培地）またはトリプトン
（固体基質）のような生長促進栄養素と一緒に、
同化しうる炭素源（例えば液体培地用にグルコー
ル及び固体培地用にアミロペクチン）及び窒素源
として例えば硫酸アンモニウムを含む基礎塩類組
成物（前記参照）を含む。発酵を少し高めた温度
で、一般に30〜35℃の範囲で、６以下、好ましく
は5.0〜6.0の範囲のPHで実施するのが典型的であ
り、自動装置によりほぼ一定に保持するのが好ま
しい。酸素は培地中に分泌される。 生じる、通常約0.1〜50PU／mlを含む発酵液か
ら細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒に例えば
遠心分離により除去することができる。酵素を含
む上澄液を更に例えば過または遠心分離により
清澄にし、次に必要に応じ例えば限外過による
か、または減圧下に蒸発器中で濃縮し、得られた
濃縮液を必要に応じて、例えば凍結乾燥または噴
霧乾燥によつて乾燥することができる。生ずる粗
製酵素製品は、100〜15000PU／ｇの範囲の活性
を示すのが代表的である。 枝切り酵素の精製 本発明の粗枝切り酵素は、例えば下記の例１で
得られる濃縮液から、例えば例３で述べる方法を
用い、電気泳動的均質性まで精製できる。精製酵
素は、ナトリウムドデシルスルフエートポリアク
リルアミドゲル電気泳動〔ブラウン（S.G.
Braun）ら、J.Virology、10巻（1972年）221頁〕
で、単一の蛋白質バンドを示した。分子量は約
95000ダルトンすなわち基準株NCIB 11607によつ
て産生される枝切り酵素の分子量よりも約5000ダ
ルトン小さい。 酵素化学的性質 本発明の酵素および日本特許出願第56−8319号
で開示されたNCIB 11607（又はこれらの突然変
異株、例えば株NCIB 11638および基準株NCIB
11647）によつて産生される酵素との差異を実証
するため、次の試験結果を示す。 Ａ 等電点（pI）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸
水銀（PMB）を用いて処理することによる抑
制

【表】 これらの結果は、次の事実を示す。すなわ
ち、本発明の酵素の活性は、基準株からの酵素
に反し、その活性部位付近のスルホヒドリル基
の存在と独立である、ということである。 Ｂ 温度の関数としてのプルナラーゼ活性（他の
反応条件は、プルラナーゼ活性の検査に対する
上述の記載条件である） 活性は60℃の活性のパーセントとして示され
る。

【表】 Ｃ PHおよび温度レベルを変化させた場合のグル
コース溶液（約30％の乾物）中の熱安定性の比
較 酵素製品を、脱イオン水に溶解もしくは脱イ
オン水で希釈し、１mlに対し約3PU含有する溶
液を得た。酵素溶液（１ml）を、選定したPHの
0.1Mミトレート−ホスフエート緩衝液（１
ml）と混合し次いでその溶液中にグルコース
（0.8ｇ）を溶解することにより試料を調製し
た。選定した温度で試料を72時間インキユベー
シヨンした後、残留アミロペクチン枝切り活性
（後記参照）を測定した。残留アミロペクチン
は、４℃で保持された同一の試料の活性度のパ
ーセントとして示される。

【表】 アミロペクチン枝切り活性の分析 アミロペクチンのアルフア−１，６−結合の加
水分解は、青色沃素−アミロペクチン錯体の色強
度（610nmで測定）の増加を起す。この増加は加
水分解したアルフア−１，６−結合の量に左右さ
れる。 枝切り酵素及びイソアミラーゼについてそれぞ
れ１〜2PU／ml及び20〜40IA／mlに相当する濃
度に脱イオン水で希釈した酵素溶液（１ml）を酢
酸塩緩衝液（0.5M、PH4.5、１ml）及びアミロペ
クチン〔CPC、スノウフレイク
（SNOWFLAKE）04201澱粉〕の１％溶液（５
ml）と混合する。混合物を50℃で30分間インキユ
ベーシヨンする。少量（0.5ml）を0.02NH₂SO₄15
ml及び沃素溶液（0.2％沃化カリウム中の0.01M
沃素）0.5mlと混合する。 室温で15分後、610nmでの光学密度を酵素を含
まないブランクのそれと比較する。 D.PHおよび温度が予じめ定められた値に調整
した反応混合物を用い、種々の温度レベルでの
3.5〜5.5の範囲におけるPHに対する本発明の上記
の枝切り酵素の作用の依存性を、上記のプルラナ
ーゼ活性を測定するための方法によつて測定し
た。60℃，65℃、および70℃におけるPHに対しプ
ロツトしたNCIB 11639の枝切り酵素の相対的活
性を示す添付の第１図を参照されたい。 更に第２図には、NCIB 11639産生のプルラナ
ーゼに対する約60℃でのPH安定域を示す。 これらの結果は次の内容を示している。すなわ
ち、本発明の枝切り酵素は日本特許願第56−
88319に従つた基準株およびその突然変異株によ
つて産生される酵素よりも60℃以上の温度でかつ
PH4.5以下でより安定である。 免疫学的性質 本発明の酵素製品を、基準株、すなわちNCIB
11647の突然変異株に対し生じた単因子抗血清を
用い、日本特許出願第56−88319号に開示した免
疫学的試験に委ねた。本発明の酵素のイムノグラ
ムは、基準株のそれに較べ部分的免疫化学的同一
性を示す。 尚、免疫学的同一性部分的に関してはイバン
M.ロイツト（ROITT）著「エツセンシヤル イ
ムノロジー（第４版、ブラツクウエル サイエテ
イクイツク出版社）第６章」、又はアクセルセン
（N.H.Axelsen）らによるア・マニユアル・オ
ブ・クオンテイタテイブ・イムノエレクトロフオ
レシス（Ａ Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis）（オスロ、1973）第11
章を参照のこと。 次に、本発明の例を非制限的に示す。 例 １ 菌株NCIB 11639からの枝切り製品の製造 菌株NCIB 11639の増殖、培養および発酵を、
日本特許出願第56−88319号の例１で開示した如
く行なつた。 発酵培地は次の組成を有した： 大豆ミールエキス〓 2.0％ コーンステイープリカー 0.5％ MgSO₄・7H₂O 0.025％ K₂HPO₄ 0.1％ （NH₄）₂SO₄ 0.05％ アミロース−液化澱粉 0.5％ （デキストロース当量11） プルロニツク（PLURONIC）L61 0.1％ （水道水に溶解） 〓 大豆ミールの抽出はPH4.5および50℃で４時
間で可能である。不溶性物質は遠心分離によつ
て除去さる。 130℃で60分、オートクレーブ処理する前に、
PHを4.0に調整した。 培養の間、水酸化ナトリウム溶液（２％）を添
加してPHを5.6±0.1に保持した。温度は30.0±0.1
℃であり、撹拌速度530〜565rpmのもと通気速度
は320ml／分であつた。 発酵は、0.03〜0.05hr^-1の希釈速度186時間連
続的に行なつたが、その時溢流培養液の採取が始
まつた。培養液（5100ml，0.47PU／ml）を、次
の条件のもと更に97時間ドライアイス上に集め
た： 希釈速度 0.049±0.008hr^-1 OD₄₅₀ 10.6±1.1 細胞密度 2.9±1.5ｇ／ 枝切り酵素活性 0.5±0.1PU／ml 細胞を遠心分離により除去する。上澄み液をワ
ツトマン（Whatman）GFAガラスフイルター
（11cm）で過し、次いでHIP 10膜を有するアミ
コン（Amicon）DC2ホローフアイバーモジユー
ルで200mlに濃縮した。濁りをGFAフイルターで
除去し、そして液を更に202−DDS 600膜
（DDS、コペンハーゲン、デンマーク）を用い、
アミコンモジユールで濃縮し、65PU／mlの活性
を有する最終濃縮物（30ml）を得た。この濃縮物
を急速冷凍して保存した。 例 ２ 菌株NCIB 11777からの枝切り製品の製造 全溶積550のステンレス鋼フアーメンター内
で発酵を行なつた。作業容量340〜435を用い
た。

【表】

【表】 培地のPHを水酸化ナトリウム溶液で5.4〜5.6に
調節した。澱粉をターマミル（TERMAMYL）
Ｌ−60（乾燥澱粉１Kg当たり２ml）で60分間90℃
で液化した。くえん酸（乾燥澱粉１Kg当たり１
ｇ）を添加して液化を終了させ次いで沸点まで加
熱した。 フエルンバツハ（Fernbach）培養フラスコ中
で例１に使用した同じ栄養寒天基質上で２日間生
育した菌株NCIB 11777の培養物を、培地Ａの58
を接種するため使用した。発酵を35℃で実施し
たが、その際撹拌後の速度は107rpmで、通気速
度は0.5バールの圧力で毎分30標準リツトルにし
た。 この接種培養物が108時間のエイジに達した
ら、培地A340を含有する、550のフアーメン
ターを接種するため該接種培養物を用いた。550
のフアーメンター内の温度を29〜31℃に維持し
た。撹拌速度を120r.p.m.に設定した。空気流
を、0.5バールの圧力で毎分150標準リツトルに調
節した。44時間から194時間まで、培地Ａが毎時
14〜19の速度でフアーメンターに供給された。
ブロスの容積が435に達したら、培養液を自動
的に除去した。 接種194時間から実験の終了の525時間まで、培
地Ｂを毎時11〜19の速度でフアーメンターに供
給した。容積物を上述のように435に保持し
た。 接種後約38時間に激しい生長をCO₂の発生およ
び顕微鏡により観察した。プルラナーゼ活性は生
成69時間に１ml当たり0.2PUに達しそして培地を
交換するまでこのレベルにあつた。接種後219時
間に、プルラナーゼ活性は１ml当たり1.4PU以上
に達した。活性は、接種後495時間に実験中の最
大の１ml当たり3.2PUに達した。培養物のPHは
5.4〜5.8の範囲で変化した。225時間から312時間
まで、培養液を集めそして氷中で冷却した。 発酵液（１ｇ当たり1.73PUの活性度を有す
る）1450を、塩化カルシウムの15Kg、フイルト
ロツクス（Filtrox）XL01の１Kgおよびナルコ
（Nalco）673の0.25Kgを用いてPH6.0で凝集させ
た。 スラツジを遠心分離で除去し、次いで最後のか
すみ状のものを、過助剤として珪藻土を用いサ
プラ（Supra）100過板で過した。 酢酸を用い液をPH4.8に調整し、次いでGR60
膜を備えたDDS35モジユーレを用いて濃縮し
た。最終濃縮物（15Kg）は乾物10.6％を含有して
いた。 珪藻土を用いて更に加圧過し、１ｇ当たり
95PUの活性度を有する酵素濃縮物（12.8Kg、乾
物9.8％を含有）を得た。 例 ３ NCIB 11777菌株から枝切り酵素製品の製造 出発材料は、上記例２で集められた冷却発酵液
（３）であつた。全ての連続工程は４℃〜８℃
の温度範囲で行なわれた。 次いで、液体を、ベツクマンJ6遠心機内で
3000r.p.m.で遠心分離した。HIP 10膜を備えた
アミコンホローフアイバー濃縮器、型DC4（アミ
コン社、マサツチユーセツト州、米国）を用い
て、上澄み液を2000mlに濃縮した。 次いでDC4の設定を、透析に変え次いで誘導率
を2mSiに低下させそしてPHを酢酸で3.8に調整し
た。 次いで得られた酵素溶液を、酢酸ナトリウム緩
衝液（0.02M，PH3.8）で平衡化したCM−セフア
ロースCL−6B（Pharmacia，Sweden）カラムに
供給し、これにより大部分の酵素が吸収された。
Na₂HPO₂緩衝液（0.02M）を線状に混合した同じ
緩衝液で溶離を実施して、3.8〜7.2のPH勾配を得
た。プルラナーゼ活性について、フラクシヨンを
分析した。活性なフラクシヨンをプールし、次い
でP10ホローフアイバー濃縮器で350mlに濃縮し
た。 濃縮物を同量の96％の冷（40℃）エタノールと
混合した。沈澱物を、ベツクマンJ6遠心器内で
3000rpmで遠心分離した。沈澱物を水（150ml）
中に溶解した。 フアルマシア（Pharmacia）（スウエーデン）
から購入されたクロマトフオーカシイング用キツ
トを、最後の精製工程に対し用いた。150mlの
PBE94を25×400mmカラムK25フアルマシア中に
充填し次いで流速150ml／ｈで25mMイミダゾー
ル緩衝液（PH7.4）で平衡化した。次いで１：８
に希釈したポリバツフアー74を適用し（150ml）、
続いて試料（可容化されるエタノール沈澱物を適
用した。次いで2000mlのポリバツフア74（１：８
に希釈）を適用し勾配法を開始した。 170mlの全量中、酵素をPH5.4付近で溶出し、次
いでDDS 500膜を有するアミコン型202濃縮セル
で20mlに濃縮した。 １ml当たりタンパク10mgを含有する、得られた
溶液は１ml当たり1500PUのプルラナーゼ活性を
有しており、従つてタンパク１ｇ当たり150000の
特異活性を有した。 例 ４ DE7.0を有する、噴霧乾燥したマルトデキスト
リンのバツチを調製した。 このマルトデキストリンの適当量を脱イオン水
に再溶解させ、約30％D.S.にすることにより糖化
用基質を調製した。次にこの基質の少量を60℃に
加熱し、PHを4.8、4.5又は4.0に調節した。
0.113AG単位／ｇDSに相当する、同用量のグル
コアミラーゼについてこのシリーズの平行した糖
化実験を行なつた。第一のシリーズでは、1PU／
ｇDSに対応する。NCIB 11647からの枝切り酵素
の量を添加した。第二のシリーズでは1PU／ｇ
DSに対応する、NCIB 11777からの枝切り酵素の
量を添加した。試料混合物を一定時間間隔で採取
し、各試料中のデキストロース含有率（％）を
HPLCにつて測定した。下記の結果が得られた。

【表】

【表】

【表】 これらの結果は、次の事実を示している。すな
わち、PH約4.4糖化を開始した場合、NCIB 11647
およびNCIB 11777からの枝切り酵素について
は、類似の結果を得ることができる。PH約4.0以
下では、NCIB 11647からの枝切り酵素とは異つ
てNCIB 11777からの枝切り酵素はその活性を保
持している。 例 ５ 例４で記載した少量の基質を、PH4.5に調整し
次いで60℃に加熱した。0.113AG単位／ｇDSに
相当する量およびNCIB 11639から得られた枝切
り酵素の変化量を添加した。反応混合物を採取
し、実施例４におけると同様に分析した。

【表】 これらの結果は次の事実を示している。30％
D.S.マルトデキストリンを60℃でかつPH４〜4.5
で糖化することにより、97の過剰DXが、、グルコ
アミラーゼの１ｇDS当たり0.113AGおよび本発
明の枝切り酵素１ｇDS当たり少なくとも1PUか
らなる酵素系について達成できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々のPHおよび温度における本発明
の酵素のプルラナーゼ活性を示すグラフである。
第２図は、プルラナーゼ安定性に対するPHの効果
を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有する； ａ PH４〜５で酢酸塩緩衝液（0.05M）中、30分
   間インキユベーシヨンすることにより測定して
   最適活性が約65℃〜70℃にあり、 ｂ 最適PHが、約60℃の酢酸塩緩衝液（0.05M）
   中で測定して3.5〜5.5の範囲にあり、 ｃ 60℃のデキストロース溶液（約30％乾物）中
   安定PHが約4.0〜5.5の範囲にあり、 ｄ 60℃、PH５のデキストロース溶液（30重量
   ％・乾物として）中で測定して72時間後少なく
   とも50％の残留活性を有し、 ｅ SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による
   測定で分子量が約95000ダルトンであり、更に ｆ 枝切り酵素活性が1g当たり10〜35000プルラ
   ナーゼ単位の範囲にある、 バチルス菌株由来でありかつアミロペクチン及
   びプルランにおけるα−１，６−グリコシド結合
   を加水分解しうる枝切り酵素。 ２ 活性が1g当り100〜15000プルラナーゼ単位
   の範囲にある特許請求の範囲第１項記載の枝切り
   酵素。 ３ プルラナーゼ型の新規枝切り酵素の製造方法
   であつて、炭素源、窒素源及び無機塩類を含む適
   当な栄養培地中で、菌株バチルス・アシドプルリ
   テイクスNCIB 11639（ブダペスト条約による国
   際寄託）、又はその枝切り酵素産生変異株もしく
   は突然変異株を培養し、続いて枝切り酵素生成物
   を回収することを特徴とする枝切り酵素の製造方
   法。 ４ 前記バチルス・アシドプルリテイクス菌株が
   突然変異株NCIB 11777（ブダペスト条約による
   国際寄託）である特許請求の範囲第３項記載の方
   法。