FI109358B - Menetelmä entsyymin uuttamiseksi - Google Patents

Description

109358

Menetelmä entsyymin uuttamiseksi

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö liittyy entsyymiteknologiaan. Tarkemmin il-5 maistuna keksintö koskee menetelmää beta-amylaasin uuttamiseksi viljasta sekä erään entsyymin käyttöä tässä uutossa.

Tekniikan tausta

Beta-amylaasi on tärkkelystä hajottava entsyymi, joka hydrolysoi alfa-1,4-sidoksia. Sitä esiintyy esimerkiksi bakteereissa ja kasveissa, ja se 10 pilkkoo tärkkelyksen pääasiassa maltoosiksi tärkkelysketjun ei-pelkistävästä päästä. Beta-amylaasia on runsaasti esimerkiksi viljajyvissä, joissa se tarvittaessa muuttaa viljan vararavinnon eli tärkkelyksen sokeriksi. Viljan tärkkelysva-rastot ovat suurimmaksi osaksi amyloosin ja amylopektiinin muodossa. Beta-amylaasi muuttaa amyloosin täydellisesti maltoosiksi, kun taas amylopektii-15 nistä muodostuu noin 60 % maltoosia ja loput dekstriiniä.

Beta-amylaasi on kaupallisesti merkittävä entsyymi, jota käytetään | mm. tärkkelysteollisuudessa esimerkiksi maltoosin valmistuksessa. Runsaasti maltoosia sisältäviä tuotteita käytetään sitten esimerkiksi makeis- ja elintarviketeollisuudessa. Beta-amylaasia on eristetty sekä bakteereista että kasveista.

20 Bakteereista sitä on saatu esimerkiksi Bacillus-bakteereista (US 4 970 158 ja JP 60 126 080) ja termostabiilista Clostridium-bakteerista (US 4 647 538). Bakteeriperäiset beta-amylaasit muodostavat maltoosin lisäksi huomattavia määriä maltotrioosia, kun sen sijaan kasviperäiset beta-amylaasit muodostavat ; l suhteessa enemmän maltoosia. Näin ollen kasviperäiset beta-amylaasit so- 25 veltuvat paremmin prosesseihin, joissa pyritään saamaan mahdollisimman '···' makeita ja/tai käymiskelpoisia tuotteita. Sitäpaitsi beta-amylaasin tuottaminen suuressa mittakaavassa bakteereista on hankalaa. Teollisuudessa käytettävä :...· beta-amylaasi onkin kasviperäistä, jolloin entsyymin lähteenä yleensä käyte tään viljaa, etenkin ohraa tai vehnää, mutta myös soijapapuja.

30 Kasvun aikana beta-amylaasia muodostuu viljajyviin, joissa sitä va- • » rastoidaan. Viljajyvä koostuu alkiosta ja tärkkelystä sisältävästä endospermistä . ·, eli ytimestä, joita erottaa scutellum eli sarveissuomu. Endospermiä ympäröi :;j : aleuronkerros, ja koko jyvää ympäröivät vielä pericarp- ja testakerros sekä varsinainen kuori (husk). Vehnässä ei ole varsinaista kuorta vaan pericarp ja 35 testa muodostavat siinä kovan ulkokuoren. Beta-amylaasia kerääntyy lähinnä • · · I 2 109358 endospermiin ja sarveissuomuun. Eniten sitä on endospermin uloimmilla alueilla aivan aleuronkerroksen alla.

Ohran beta-amylaasi on perusteellisesti tutkittu. Sitä ja sen valmistusta on esitetty esimerkiksi teoksissa: D.E. Briggs ’’Barley”, Chapman & Hall, 5 London, 1978; Cook ’’Barley and Malt”, Academic Press, London, 1962; J.R.A. Pollock ’’Brewing Science”, Academic Press, London, 1979. Entsyymin systemaattinen nimi on 1,4-alfa-D-glukaanimaltohydrolaasi (EC 3.2.1.2). Muinoin viljan beta-amylaasia eristettiin siten, että vilja ensin rouhittiin tai jauhettiin ja sitten beta-amylaasi uutettiin vedellä tai puskurilla. Entsyymin puhdistaminen 10 tällaisesta uutteesta on tietenkin hankalaa ja työlästä, koska se sisältää paljon muitakin jyvän liukoisia aineosia kuin kyseistä entsyymiä. Beta-amylaasin erottamista sitä sisältävästä liuoksesta on mm. pyritty parantamaan adsorboimalla entsyymiä polymeerin avulla ammoniumsulfaatin läsnäollessa (US 5 294 341). Beta-amylaasin irrottamiseksi gluteenista on kokeiltu proteaasia (JP 63 15 079 590).

Beta-amylaasia on myös eristetty vehnätärkkelysvalmistuksen jätevedestä, josta sitä on eristetty lisäämällä natriumalginaattia ja keräämällä koa-guloitunut entsyymi talteen (JP 60 027 383) tai muodostamalla kalsiumfosfaat-tigeeli, johon entsyymi adsorboidaan ja josta se sitten otetaan talteen (JP 63 20 248 389). Tärkkelysvalmistuksen jätevesi ei ole mikään hyvä beta-amylaasin lähde, koska se on hyvin laimea ja sisältää runsaasti muita aineosia, jolloin puhdistaminen ja konsentrointi on hankalaa ja saanto jää alhaiseksi.

. . Puhtaamman raakauutteen saamiseksi ja siten hankalien jälkikä- * < * ; ; sittelyjen välttämiseksi on esitetty, että beta-amylaasia voidaan uuttaa koko- ;'· 25 naisista tai osittain kuorituista viljajyvistä. Kun esimerkiksi ohrajyvät kuoritaan '···’ siten, että niiden endospermi säilyy ehjänä, endosperimin uloimmat kerrokset toimivat eräänlaisena suodattimena estäen liukenemattomien ja rajoittaen liu- »»» koisten aineiden pääsyä liotusveteen. Uutto on edullista suorittaa pelkistävän aineen läsnäollessa, joka vapauttaa beta-amylaasin jyvän muista proteiineista 30 (Fl 61 516 ja US 4 675 296).

* » · "; Nyt on keksitty menetelmä beta-amylaasin uuttamiseksi viljasta, , 1, jolla voidaan sekä lyhentää viljan uuttoaikaa että parantaa entsyymin saantoa.

*' Menetelmä on yksinkertainen suorittaa ja soveltuu erityisesti kuoritun viljan kä- ’···’ sittelyyn, jolloin entsyymin jatkopuhdistus samalla helpottuu.

* » * I t 3 109358

Yhteenveto keksinnöstä

Keksinnön mukaiselle menetelmälle beta-amylaasin uuttamiseksi on tunnusomaista, että vilja uutetaan sellulaasin läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa beta-amylaasia sisältävän uutteen saamiseksi. Keksintö kohdis-5 tuu edelleen sellulaasin käyttöön beta-amylaasin uuttamisessa viljasta.

Sellulaasia käytetään mm. tärkkelyksen valmistuksessa jauhetusta viljasta lietteen viskositeetin alentamiseksi ja tärkkelyksen erottamiseksi proteiinista. Nyt on siis yllättäen keksitty, että sellulaasin lisäys beta-amylaasin uut-toveteen parantaa beta-amylaasin saantoa ja mahdollistaa uuttoajan lyhentä-10 misen. Keksinnön edulliset suoritusmuodot on esitetty epäitsenäisissä vaatimuksissa.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuviossa 1 esitetään lämpötilan vaikutus beta-amylaasin saantoon ajan funktiona.

15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erilaisten beta-amylaasia sisältävien viljalajien uuttamiseen, kuten esimerkiksi vehnän, ohran, rukiin ja soijan käsittelyyn. Edullisesti sillä uutetaan vehnän ja rukiin ja erityisesti ohran beta-amylaasia. Itämättömät jyvät eivät sisällä merkittäviä määriä muita ent-20 syymejä kuin beta-amylaasia, mistä syystä sitä kannattaa uuttaa niistä. Entsyymiä voidaan uuttaa kuorimattomista jyvistä, mutta mieluummin sitä uute-taan kuorituista, jauhetuista, rouhituista tai hiotuista jyvistä. Ruis ja ohra on ,· : syytä kuoria. Parhaimmat tulokset saadaan uuttamalla kuorittuja ohrajyviä.

! . Kuorinta on suoritettava siten, ettei varsinainen elävä jyvä rikkoon- 25 nu, jottei jyvän endospermistä pääse tärkkelystä uutteeseen, mutta varsinai-nen kuoriosa on poistettava mahdollisimman tarkasti. Näin siksi, että kuori on ’ *’ niin tiivis, että se vaikeuttaa beta-amylaasin läpäisyä. Kuoritulla ohralla tarkoi- tetaan näin ollen ohraa, josta jyvän varsinainen kuori on poistettu, mutta en-dospermi säilytetty kokonaisena. Tämä tarkoittaa käytännössä sitä, että kuo-:\\ 30 rittaessa poistetaan korkeintaan noin 20 % kuorimattoman jyvän painosta.

Yleensä kuoriaineksena poistetaan 10-20 %. Tällöin endospermin uloimmat . *. kerrokset (pericarp, testa ja aleuronkerros) toimivat eräänlaisena ultrasuodat- :timena, jolloin liukenemattomien ja oleellisesti myös liuenneiden aineiden pää-» ;·’ sy uuttoveteen estyy. Näin käsitellyistä jyvistä saatu uute on suhteellisen puh- : 35 das, jolloin jatkokäsittely kuten entsyymin puhdistaminen ja konsentrointi on 4 109358 : helppoa. Jatkokäsittelyssä voidaan käyttää entsyymiteollisuudessa yleisesti käytettyjä menetelmiä kuten painesuodatusta ja ultrasuodatusta.

i

Vilja uutetaan vesipitoisessa väliaineessa kuten vedessä tai mahdollisesti puskuriliuoksessa. pH uuton aikana on yleensä 6,0 - 6,5. Uutto suo-5 ritetaan mieluimmin pelkistävissä olosuhteissa. Käytetään niin paljon pelkistävää aktiivisuutta, että myös jyvän rakenneproteiiniin sidottu beta-amylaasi irto aa. Pelkistävät olosuhteet järjestetään sinänsä tunnetulla tavalla, käytännössä usein S02:lla esimerkiksi lisäämällä natriummetabisulfiittia ja/tai natriumsulfiit-tia. Kuorittujen jyvien suhde vesipitoiseen väliaineeseen on edullisesti 5:8 - 2:3 10 (paino/tilavuus). Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu teollismittakaavan prosesseihin, jolloin uutto suoritetaan terässiilossa, johon lisätään esimerkiksi 19 tonnia kuorittua ohraa ja 29 m3 vettä, jossa on 0,5 % natriummetabisulfaat-tia ja 0,5 % natriumsulfiittia.

Uuttamalla ohraa edellä kuvatulla tavalla voidaan ilman jyvän siis sään jääneen veden erotusta saada uuttosaanto, jossa on ohran kokonais-beta-amylaasipitoisuudesta noin 45 - 50 %. Tällöin uuttoaika on noin 72 h. Kun uuttoveteen lisätään sellulaasia saadaan viljan kokonais-beta-amylaasimää-rästä uutettua jopa 65 % uuttoajan lyhentyessä noin 60 h:iin.

Selluloosa on lineaarinen glukoosipolysakkaridi, jonka glukoosiyksi-20 köt on sidottu beta-1,4-glukosidisidoksilla. Sitä on kasvien soluseinämissä, joissa se usein esiintyy ligniinin ja hemiselluloosan kanssa yhdessä. Sellulaa-seiksi lasketaan entsyymit, jotka osallistuvat selluloosan hajoamisreaktioihin. Sellulaaseja käytetään teollisesti esimerkiksi tärkkelyksen valmistuksessa, pa- • ·« · perimassan jalostuksessa, tekstiilien käsittelyssä, panimoissa beta-glukaanin ’· '· 25 hajottamiseen ja leipomoissa jauhon ominaisuuksien parantamiseen. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä sellulaasi pilkkoo mahdollisen :... ’ kuoren alla olevan elävän jyvän pintarakenteita.

:··: Kaupallisesti saatavat sellulaasivalmisteet ovat peräisin joko bak- teereista, kuten Bacillus-suvusta, tai sienistä, kuten hiivoista (esim. Saccharo-30 myces) tai homeista. Etenkin homesienistä on eristetty runsaasti sellulaaseja.

: Eniten käytetyt sellulaaseja tuottavat homeet kuuluvat sukuihin Humicola, .···. Fusarium, Myceliopthora, Aspergillus, Penicillium ja Trichoderma. Osa tuotto- kannoista on geeniteknisesti modifioitu. Esillä olevassa keksinnössä käytetään · mielellään homesienistä ja etenkin Trichoderma-Uomeista peräisin olevaa sel- 35 lulaasia.

• 1 · · 5 109358

Kaupalliset entsyymivalmisteet sisältävät useita entsyymiaktiivisuuksia ja niiden määrät ja suhteet voivat hieman vaihdella valmistajasta toiseen. Keksinnön kannalta on oleellista, että valmisteessa on ainakin sellulaa-si-, hemisellulaasi ja beta-glukanaasiaktiivisuutta. Toisin sanoen sellulaasilla 5 tässä yhteydessä tarkoitetaan entsyymivalmistetta, jossa on ainakin selluloosaa, hemiselluloosaa ja beta-glukaania hajottava vaikutus. Kaikki hakijan kokeilemat kaupalliset sellulaasivalmisteet (valmistajana Genencor International,

Rohm Enzymer Gmbh ja Novo Nordisk) ovat parantaneet beta-amylaasin saantoa. Sellulaasi-, hemisellulaasi- ja beta-glukanaasiaktiivisuudet on kuvattu 10 esimerkiksi teoksessa Novo’s Handbook of Practical Biotechnology, 1986.

Sellulaasit voidaan jakaa esimerkiksi endosellulaaseihin, eksosel-lulaaseihin, eksosellobiohydrolaaseihin ja sellobiaaseihin. Endosellulaasit eli 1,4-beta-D-glukaaniglukanohydrolaasit pilkkovat selluloosan beta-1,4-sidokset molekyylin sisältä umpimähkään muodostaen oligosakkarideja. Eksosellulaasit 15 eli 1,4-beta-D-glukaaniglukohydrolaasit pilkkovat beta-1,4-sidokset molekyylin päästä vapauttaen glukoosia. Niiden vaikutus sellobioosiin on hidas. Eksosel-lobiohydrolaasit eli 1,4-beta-D-glukaanisellobiohydrolaasit pilkkovat mainitut sidokset molekyylin ei-pelkistävästä päästä muodostaen sellobioosia, ja sello-biaasit eli beta-D-glukosidiglukohydrolaasit pilkkovat sellobioosin glukoosiksi.

20 Selluloosan hydrolysoimiseksi glukoosiksi tarvitaan endoglukanaasia (1,4-beta-D-glukaaniglukanohydrolaasia, EC 3.2.1.4), joka pilkkoo molekyylin sisältä ja hajottaa myös substituoituja substraatteja, mutta ei hajota kiteistä selluloosaa, sellobiohydrolaasia (1,4-beta-D-glukaanisellobiohydrolaasia, EC 3.2.1.91), joka pilkkoo kiteistä selluloosaa, ja beta-glukosidaasia (beta-D-'· " 25 glukosidiglukohydrolaasi, EC 3.2.1.21), joka siis on sellobiaasi, joka pilkkoo sellobioosia ja sello-oligosakkarideja glukoosiksi.

Hemisellulaaseiksi kutsutaan entsyymijoukko, joka pilkkoo hemi-selluloosaa eli pentooseja sisältäviä luonnossa esiintyviä polysakkarideja, ku-ten esimerkiksi arabinaaneja, galaktaaneja, mannaaneja, ja ksylaaneja. Beta-30 glukanaasit taas pilkkovat beta-D-glukaaneja eli mahdollisesti haaroittuneita ; glukoosipolymeerejä, joissa voi olla sekä beta-1,3- että beta-1,4-sidoksia. Be- .’·*! ta-glukaania esiintyy esimerkiksi viljajyvien endospermisolujen soluseinässä.

Lichenaasi on endo-beta-glukanaasi (1,3 -1,4-beta-D-glukaani-4-glukanohyd-; rolaasi), joka pilkkoo sekä beta-1,3- että beta-1,4-sidoksia sisältävän beta- 35 glukaanin beta-1,4-sidokset. Laminarinaasi (1,3-beta-D-glukaani-3-glukano- 6 109358 hydrolaasi) pilkkoo vain beta-1,3-sidoksia sisältävän beta-glukaanin, kuten la-minariinityyppisten hiilihydraattien beta-1,3-sidokset, ja eksoglukanaasi (1,3-beta-D-glukaaniglukohydrolaasi) pilkkoo beta-1,3-glukaanien beta-1,3-sidokset muodostaen pääasiassa glukoosia.

5 Lupaavia tuloksia beta-amylaasin uutossa on saatu mm. Genencor

Internationalin sellulaasivalmisteilla Spezyme® CE ja GC 440. Viimeksi mainittu on peräisin geeniteknisesti muunnetusta Trichoderma longibrachiatum-kannasta ja se on erityisen tehokas hajottamaan selluloosaa, hemiselluloosaa ja beta-glukaania. Sen aktiivisuus ilmoitetaan vaikutuksena karboksimetyylisel-10 luloosaan (RBB-CMC), jolloin RBB-CMC-aktiivisuudeksi ilmoitetaan vähintään 1400 lU/g. Sellulaasiaktiivisuuden lisäksi GC 440:ssa on beta-glukanaasi-, be-ta-glukosidaasi-, beta-ksylosidaasi-, ksylanaasi ja asetyyliesteraasiaktiivisuut-ta. Tyypillinen erä GC 440 sisältää keskimäärin DNS-CMC noin 7000 - 9000 U/ml, beta-glukanaasia noin 6000 - 8000 U/ml, beta-glukosidaasia noin 80 - 90 15 U/ml, beta-ksylosidaasia noin 500 - 600 nkat/ml, asetyyliesteraasia noin 1700 -2000 nkat/ml, RBB-ksylanaasia noin 700 - 1400 U/ml ja DNS-ksylanaasia noin 1900 - 2100 U/ml. Erittäin hyviä tuloksia on myös saatu Rohm Enzyme GmbH:n sellulaasilla, jota myydään kauppanimellä Rohalase® Sep. Valmiste on peräisin Trichoderma reesei-kannasta ja se sisältää merkittäviä määriä be-20 ta-1,4-endoglukanaasiaktiivisuutta (vähintään 4700 CU/g) sekä ksylanaasia (vähintään 3000 XylH/g), ja pienempiä määriä sellobiohydrolaasiaktiivisuutta.

Lisäksi siinä on beta-1,3-glukanaasi-aktiivisuutta eli laminarinaasia. Sopiva määrä sellulaasia käytettäessä tässä mainittuja entsyymivalmisteita on vähin-·, ; tään 0,015 %, mieluummin vähintään 0,020 %, esimerkiksi 0,018 - 0,040 ja : 25 erityisesti 0,024 - 0,030 paino-% viljasta.

:./ Beta-amylaasia voidaan uuttaa sellulaasin läsnäollessa lämpötilas- ' ··[ sa 20 - 45 °C:ssa. Edullisesti käytetään 25 - 32 °C, esimerkiksi 29 - 31 °C.

Uuttoaika voi olla 30 - 72 h, yleensä vähintään 48 h, esimerkiksi 48 - 66 h ja erityisesti 55 - 62 h. Sopiva uuttoaika 30 °C:ssa on noin 60 h. Kun uutto on 30 suoritettu, viljajyvät, rouhe tai jauhot erotetaan uuttovedestä esimerkiksi sihdil-:/.: lä ja beta-amylaasi otetaan talteen uuttovedestä, josta se haluttaessa puhdis- • ‘ : tetaan ja/tai konsentroidaan.

. “. Näin uutettua ja erotettua viljaa voidaan uuton jälkeen käyttää esi- :;:/ merkiksi tärkkelyksen valmistukseen. Esillä olevan keksinnön mukaan beta- ’·;·* 35 amylaasia siis uutetaan ja uute erotetaan viljasta ennenkuin tärkkelys fraktioi- daan ja erotetaan viljasta. Jos entsyymi on uutettu rikkomattomista viljajyvistä, » » 7 109358 uutetut jyvät ensin jauhetaan, minkä jälkeen tärkkelysvalmistusprosessia suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla eli jauhetut jyvät sekoitetaan veteen ja vilja fraktioidaan seulontaa ja keskipakovoimaa hyväksi käyttäen. Jauhatuksessa lisätään yleensä sellulaasia yhdessä beta-glukanaasin kanssa viskositeetin 5 alentamiseksi ja tärkkelyksen irrottamiseksi proteiinista.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä kuitenkin rajoittamatta sitä niissä esitettyihin suoritusmuotoihin.

Esimerkki 1

Beta-amylaasin määritys 10 Ennen beta-amylaasin kokonaismäärän määritystä viljasta, mahdol linen kuori poistettiin ja analysoitava vilja jauhettiin kuivana hienoksi jauhoksi ja punnittiin sitä 10 g 100 ml:n erlenmeyerpulloon. Lisättiin 100 ml 0,5 %:sta (paino/tilavuus) natriumsulfiittiliuosta ja sekoitettiin hyvin. Annettiin seoksen olla pullossa 24 tuntia välillä ravistellen. Sitten sekoitettiin huolellisesti ja suoda-15 tettiin harvan suodatinpaperin läpi (MN 640 W). Laimennettiin suodos 1:50 tislatulla vedellä ja määritettiin aktiivisuus alla kuvatulla menetelmällä. Kyseistä entsyymimääritysmenetelmää käytettiin myös suoraan uuttoliuosten beta-amylaasipitoisuuden määrittämiseen alla olevissa esimerkeissä.

Beta-amylaasi määritettiin periaatteessa kuten teoksessa Food 20 Chemical Codex IV. General Test and Apparatus, 485 on esitetty.

DP-yksikkö (Diastatic Power) määritellään tässä yhteydessä sellaiseksi 0,1 ml:ssa 5 %:sta näytelaimennosta olevaksi entsyymimääräksi, joka tuottaa 100 ml:sta substraattia 1 tunnissa 20°C:ssa sellaisen määrän pelkistä-. viä sokereita, joka riittää pelkistämään 5 ml Fehlingin liuosta. (Määritysmene- ; 25 telmä ei vastaa DP:n määritelmää.)

Entsyymin aktiivisuus määritettiin hydrolysoimalla tärkkelystä 20°C:ssa, pH 4,6:ssa, 30 min ajan. Muodostuneet pelkistävät sokerit määritettiin titrimetrisesti emäksisellä ferrisyanidilla. Tärkkelyssubstraatin valmistami-seksi 20 g (kuiva-ainetta) tärkkelystä (Baker 1130) lietettiin noin 50 ml:aan vet-30 tä. Lisättiin noin 500 ml kiehuvaa vettä ja keitettiin tasan 2 min. Jäähtynee-seen tärkkelysliuokseen lisättiin 20 ml asetaattipuskuria (0,5 M, pH 4,6) ja lai-mennettiin tislatulla vedellä litraksi. Pipetoitiin 200 ml 20°C:een temperoitua . tärkkelyssubstraattia 250 ml:n mittapulloon, lisättiin 10 ml laimennettua ent- : syyminäytettä ja sekoitettiin hyvin. Inkuboitiin näytettä tasan 30 min 20°C:n ve- 35 sihauteessa ja lisättiin 20 ml 0,5 N NaOH. Sekoitettiin hyvin ja laimennettiin 250 ml:ksi. O-näytettä varten pipetoitiin 10 ml entsyymilaimennosta ja 20 m! 109358 8 j 0,5 N NaOH 250 ml:n mittapulloon. Sekoitettiin hyvin ja lisättiin 200 ml tärkke- ! lyssubstraattia ja laimennettiin 250 ml:ksi.

Valmistettiin 0,05 N ferrisyanidireagenssi liuottamalla 16,5 g ka-liumferrisyanidia (K3Fe(CN)6) ja 22 g natriumkarbonaattia (Na2C03) veteen ja 5 laimentamalla litraksi. A-P-Z-liuos tehtiin liuottamalla 70 g kaliumkloridia (KCI) ja 20 g sinkkisulfaattia (ZnS04 x 7H20) 700 ml:aan tislattua vettä, lisäämällä 200 ml väkevää etikkahappoa ja laimentamalla litraksi, ja kaliumjodidiliuos valmistettiin liuottamalla 50 g kaliumjodidia (KJ) 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä 2 tippaa 50 % natriumhydroksidia (NaOH). Pipetoitiin 150 ml:n er-10 lenmeyerpulloon 10 ml ferrisyanidireagenssia ja 5 ml näytettä. Sekoitettiin hyvin ja lämmitettiin kiehuvassa vesihauteessa tasan 20 min. Jäähdytettiin ja lisättiin 25 ml A-P-Z-reagenssia ja 1 ml KJ-liuosta. Tiirattiin 0,05 N natrium-tiosulfaattiliuoksella kunnes sininen väri hävisi (tumman sininen ~> valkoinen). Beta-amylaasiaktiivisuus laskettiin kaavasta: 15

(VO - V1) x 23 x K

aktiivisuus =---------------------------------------- DP°/ml 100 20 jossa kaavassa VO = 0-näytteen titrauskulutus (ml) V1 = näytteen titrauskulutus (ml) K = laimennuskerroin » · ♦« : : 25

Esimerkki 2

Tutkittiin sellulaasin vaikutusta beta-amylaasin uuttoaikaan. Beta-';: amylaasia uutettiin ohrasta ilman sellulaasia ja sellulaasin kanssa. 10 kg kuo- : \· rimakoneella kuorittua ohraa uutettiin 15 litrassa vettä, jossa oli 0,5 % nat- 30 riummetabisulfiittia ja 0,5 % natriumsulfiittia. Toiseen erään lisättiin vielä Ge-. . : nencorin GC440 sellulaasia 0,029 % kuoritun ohran painosta. Uutto suoritettiin . · ’ 30 °C:n lämpötilassa. Uutossa käytetyn viljan aktiivisuus esimerkin 1 mukai- ' ’ sesti määritettynä oli 155 DP°/g. Tulokset on esitetty taulukoissa 1 ja 2.

9 109358 _Taulukko 1. Uutto ilman sellulaasia_

Aika, h_Beta-amylaasiaktiivisuus DP°/ml uuttoliuosta 10_20_ 24_47_ 30_55_ 48_83_ 60_92_ 66_98_ 72_102_ 96 186 _Taulukko 2. Uutto sellulaasin kanssa_

Aika, h Beta-amylaasiaktiivisuus DP°/ml uuttoliuosta 10_23_ 24_55_ 30_70_ 48_92_ 60_104_ 66_J04_ 72_J100_ [96 190 5

Tulokset osoittavat, että sellulaasin lisäys uuttoveteen lyhentää be-ta-amylaasin uuttoajan.

Esimerkki 3 10 Tutkittiin sellulaasin vaikutusta uuttosaantoon. 10 kg kuorittua oh raa, jonka beta-amylaasiaktiivisuus oli 155 DP°/g, uutettiin 15 litrassa vettä, , : jossa oli 0,5 % natriummetabisulfiittia ja 0,5 % natriumsulfiittia. Uutto suoritet- . ’ tiin 30 °C:n lämpötilassa joko ilman sellulaasia tai sellulaasin läsnäollessa.

Uuttoaika ilman sellulaasia oli 72 h. Käytetyn ohramäärän kokonai-: j 15 saktiivisuus oli 1550 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 8175 ml . uutetta, jonka aktiivisuus oli 95 DP°/ml. Saadun uutteen kokonaisaktiivisuus oli siis 776,6 kDP° ja uuttosaanto oli 50,1 %.

10 109358

Vastaava uutto suoritettiin sellulaasin läsnäollessa siten, että lisättiin 0,025 % GC440 kuoritun ohran painosta. Uuttoaika oli 60 h. Käytetyn ohramäärän kokonaisaktiivisuus oli 1550 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 9825 ml uutetta, jonka aktiivisuus oli 102 DP°/ml. Saadun uutteen 5 kokonaisaktiivisuus oli siis 1002,2 kDP° ja uuttosaanto oli 64,7 %.

Tulokset osoittavat, että sellulaasin lisääminen uuttoveteen lisää beta-amylaasin saantoa merkittävästi.

Esimerkki 4

Tutkittiin lämpötilan vaikusta beta-amylaasin uuttumiseen. Kuorittua 10 ohraa uutettiin edellisissä esimerkeissä kuvatulla tavalla sellulaasin läsnäollessa eri lämpötiloissa. Sellulaasin GC440 annostus oli 0,027 % kuoritun ohran painosta ja uuttolämpötila oli 20 °C, 25 °C, 30 °C tai 40 °C. Tulokset on esitetty kuviossa 1. Parhaimmat tulokset saatiin 30 °C:ssa.

Esimerkki 5 15 Tutkittiin sellulaasin vaikutusta beta-amylaasin saantoon vehnästä.

10 kg rouhittua vehnää, jonka beta-amylaasiaktiivisuus oli 128 DP°/g, uutettiin 15 litrassa vettä, jossa oli 0,5 % natriummetabisulfiittia ja 0,5 % natriumsulfiit-tia. Uutto suoritettiin 30 °C:n lämpötilassa joko ilman sellulaasia tai sellulaasin läsnäollessa.

20 Uuttoaika ilman sellulaasia oli 72 h. Käytetyn vehnämäärän koko naisaktiivisuus oli 1280 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 9175 ml uutetta, jonka aktiivisuus oli 55 DP°/ml. Saadun uutteen kokonaisaktiivisuus oli siis 504,6 kDP° ja uuttosaanto oli 39,4 %.

, ’ Vastaava uutto suoritettiin sellulaasin läsnäollessa siten, että rou- • 25 hittuun vehnään lisättiin sellulaasia GC440 0,036 paino-% rouheesta. Uuttoai- ’·: ka oli 60 h. Käytetyn vehnämäärän kokonaisaktiivisuus oli 1280 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 10080 ml uutetta, jonka aktiivisuus oli 72 *: DP°/ml. Saadun uutteen kokonaisaktiivisuus oli siis 725,8 kDP° ja uuttosaanto 011 56,7%.

30 Tulokset osoittavat, että sellulaasin lisääminen uuttoveteen lisää . : beta-amylaasin saantoa merkittävästi.

Esimerkki 6

Tutkittiin sellulaasin vaikutusta beta-amylaasin saantoon hiotusta : : vehnästä. Vehnää hiottiin riisin hiontalaitteella siten, että pinta rikottiin ja uloin 35 osa poistettiin, jolloin siis pericarp pääasiassa poistui ja testa hieman vaurioi-tui. 10 kg hiottua vehnää, jonka beta-amylaasiaktiivisuus oli 128 DP°/g, uutet 11 109358 tiin 15 litrassa vettä, jossa oli 0,5 % natriummetabisulfiittia ja 0,5 % natriumsul-fiittia. Uutto suoritettiin 30 °C:n lämpötilassa joko ilman sellulaasia tai sellulaa-sin läsnäollessa.

Uuttoaika ilman sellulaasia oli 72 h. Käytetyn vehnämäärän koko-5 naisaktiivisuus oli 1280 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 9780 ml uutetta, jonka aktiivisuus oli 15 DP°/ml. Saadun uutteen kokonaisaktiivisuus oli siis 146,7 kDP° ja uuttosaanto oli 11,5 %.

Vastaava uutto suoritettiin sellulaasin läsnäollessa siten, että rouhittuun vehnään lisättiin sellulaasia GC440 0,036 paino-% hiotusta vehnästä.

10 Uuttoaika oli 60 h. Käytetyn vehnämäärän kokonaisaktiivisuus oli 1280 kDP°. Uutosta sihdillä erottamalla saatiin ulos 9250 ml uutetta, jonka aktiivisuus oli 35 DP°/ml. Saadun uutteen kokonaisaktiivisuus oli siis 323,8 kDP° ja uuttosaanto oli 25,3 %.

Tulokset osoittavat, että sellulaasin lisääminen uuttoveteen lisää 15 beta-amylaasin saantoa merkittävästi.

• # -» » t

Claims (10)

109358

1. Menetelmä beta-amylaasin uuttamiseksi viljasta, tunnettu siitä, että vilja uutetaan sellulaasin läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa 5 beta-amylaasia sisältävän uutteen saamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että beta-amylaasia uutetaan ohrasta tai vehnästä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että beta-amylaasia uutetaan kuoritusta ohrasta.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että uutto suoritetaan pelkistävissä olosuhteissa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuorittua ohraa uutetaan S02-pitoisella vedellä suhteessa 5:8-2:3.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että uutto suoritetaan lämpötilassa 25 - 33 °C, edullisesti 29 - 31 °C.

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuttoaika on 48 - 66 h, edullisesti 55 - 62 h.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että käytetään homeen sellulaasia.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Trichoderma-homeen sellulaasia.

. 10. Sellulaasin käyttö beta-amylaasin uuttamisessa viljasta. «* · < » » » ♦ > > 109358