KR20160145817A - 리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법 - Google Patents

리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리그노셀룰로스 물질로부터 발효 생성물을 제조하는 방법에 관한 것으로,
(a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질을 전처리하는 단계;
(b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 세척하는 단계;
(c) 2종 이상의 셀룰라제를 포함하고 적어도 LPMO를 포함하는 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하고, 임의적으로, 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 정제하는 단계;
(d) 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및
(e) 임의적으로, 발효 생성물을 회수하는 단계
를 포함하되, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 적당량의 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 가수분해된 산화 생성물, 바람직하게는 글루콘산, 알돈산 및/또는 같은자리 다이올, 더욱 바람직하게는 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지한다.

Description

리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법{PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC MATERIAL AND FERMENTATION OF SUGARS}
본 발명은 리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법에 관한 것이다.
본원에서 공급원료로서도 지칭되는 리그노셀룰로스 식물 물질은 귀중한 생성물, 예를 들면, 당 또는 생체연료, 예컨대, 생체에탄올로 전환될 수 있는 당 형태의 재생가능한 에너지 공급원이다. 이 공정 동안 공급원료, 예컨대, 밀짚, 옥수수대, 왕겨 등에 존재하는 (리그노 또는 헤미)셀룰로스는 (헤미)셀룰로스분해 효소에 의해 환원 당으로 전환되고, 그 후 상기 환원 당은 미생물, 예컨대, 효모, 세균 및 진균에 의해 귀중한 생성물, 예컨대, 에탄올로 임의적으로 전환된다.
(헤미)셀룰로스가 결정질이고 리그닌의 네트워크 내에 포획되기 때문에, 환원 당으로의 전환은 일반적으로 느리고 불완전하다. 전형적으로, 비처리된 공급원료의 효소적 가수분해는 20% 미만의 이론적 양의 당을 생성한다. 화학적 및 열물리학적 전처리를 적용함으로써 (헤미)셀룰로스분해 효소는 (헤미)셀룰로스에 더 잘 접근할 수 있으므로, 더 빨리 더 높은 수율로 전환된다.
전처리된 옥수수대로부터 유래된 글루코스로부터의 전형적인 에탄올 수율은 건조 옥수수대 1000 kg 당 40 갤런의 에탄올(문헌[Badger, P, Ethanol from 셀룰로스: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick and A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA]) 또는 공급원료 g 당 0.3 g의 에탄올이다. 셀룰로스를 기준으로 에탄올의 최대 수율은 약 90%이다.
셀룰로스분해 효소(이들 중 대다수는 트리코데마(Trichoderma), 후미콜라(Humicola) 및 아스퍼길러스(Aspergillus)와 같은 종에 의해 생성됨)는 전처리된 공급원료를, 불용성 (헤미)셀룰로스, 이로부터 제조된 환원 당, 및 리그닌을 함유하는 매쉬(mash)로 전환시키는 데에 상업적으로 사용된다. 라삼소니아(Rasamsonia)로부터 유래된 열안정성 셀룰로스분해 효소는 리그노셀룰로스 공급원료를 분해하는 데에 사용되고 있고, 이 효소는 그의 열안정성에 대해 공지되어 있다(WO 2007/091231 참조). 생성된 매쉬는 환원 당이 효소 생체물질(biomass)(세포), 이산화탄소 및 에탄올로 전환되는 발효에서 사용된다. 이 방식으로 생성된 에탄올은 생체에탄올로서 지칭된다.
전처리된 리그노셀룰로스 공급원료로부터 당을 제조하는 통상의 방법인 가수분해(액화, 예비당화 또는 당화로서도 지칭됨)는 45℃ 내지 50℃의 고온 및 비-멸균 조건 하에서 전형적으로 6 시간 내지 168 시간 동안 지속되는 공정 동안 일어난다(문헌[Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526]). 이 가수분해 동안, 존재하는 셀룰로스는 환원 당으로 부분적으로(효소 활성 및 가수분해 조건에 따라 전형적으로 30% 내지 95%) 전환된다. 전처리된 공급원료에 존재하는 화합물 및 방출된 당에 의한 효소 억제의 경우, 열적 불활성화를 최소화하기 위해, 이 고온 기간은 가능한 한 최소화된다.
가수분해 후 발효는 미생물 생체물질, 통상적으로 효모에 의한 생장 및 에탄올 생성을 수용하기 위해 온도가 30℃ 내지 33℃(중온성 공정)로 조절된, 동일한 또는 상이한 용기에서 바람직하게는 별도의 혐기성 공정 단계에서 일어난다. 이 발효 공정 동안, 남은 (헤미)셀룰로스 물질은 가수분해 단계로부터 이미 존재하는 효소에 의해 환원 당으로 전환되는 반면, 미생물 생체물질 및 에탄올이 생성된다. 일단 (헤미)셀룰로스 물질이 발효가능한 당으로 전환되고 모든 발효가능한 당이 에탄올, 이산화탄소 및 미생물 세포로 전환되면 발효가 종결된다. 이것은 최대 6일이 소요될 수 있다. 일반적으로, 가수분해 및 발효의 전체 공정 시간은 최대 13일일 수 있다.
이로써 수득된 발효된 매쉬는 발효불가능한 당, 가수분해불가능한 (헤미)셀룰로스 물질, 리그닌, 미생물 세포(가장 흔하게는 효모 세포), 물, 에탄올, 용해된 이산화탄소로 구성된다. 연속적인 단계 동안, 에탄올은 매쉬로부터 증류되고 더 정제된다. 남은 고체 현탁액은 건조되고, 예를 들면, 연소 연료, 비료 또는 소 사료로서 사용된다.
WO 2010/080407은 셀룰로스 물질을 혐기성 조건 하에서 셀룰라제 조성물로 처리하는 것을 제안한다. 반응성 산소 종의 제거 또는 배제는 셀룰로스 가수분해 효소 시스템의 성능을 개선할 수 있다. 효소 조성물에 의한 셀룰로스 물질, 예를 들면, 리그노셀룰로스의 가수분해는 효소 조성물의 성분에 대한 산화적 손상 및/또는 예를 들면, 분자 산소에 의한 셀룰로스 물질의 산화에 의해 감소될 수 있다.
WO 2009/046538은 진공 하에서 수행되는 리그노셀룰로스 공급원료 식물 물질의 처리 및 감소된 양의 휘발성 당/발효 억제 화합물, 예컨대, 푸르푸랄(furfural) 및 아세트산을 포함하는 당 풍부 공정 스트림의 생성을 위해 효소적 가수분해 공정을 이용하여 리그노셀룰로스 공급원료 식물 물질을 처리함으로써 발효가능한 당을 방출시키는 방법을 개시한다. 휘발성 억제 화합물의 제거 이외에, 마찬가지로 제거되는 다른 화합물 및/또는 분자는 질소, 산소, 아르곤 및 이산화탄소를 포함한다.
공급원료의 각각의 회분과 함께, 효소를 첨가하여 주어진 공정 시간 동안 전처리된 리그노셀룰로스 공급원료로부터 방출된 발효가능한 당의 수율 및 속도를 최대화한다. 일반적으로, 효소 제조를 위한 비용, 에탄올로의 공급원료의 전환 수율 및 투자자본이 전체 제조 비용에서 주요 비용 인자이다(문헌[Kumar, S. Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526]). 따라서, 효소 사용 비용의 감소는 보다 낮은 효소 필요성, 보다 빠른 전환 속도 및/또는 보다 높은 전환 수율, 및 이로써 보다 낮은 전체 생체에탄올 제조 비용을 목적으로 사용되는, 보다 넓고/넓거나 보다 높은 (특이적) 가수분해 활성을 갖는, 단일 또는 다수의 미생물 공급원으로부터의 효소 생성물(WO 2008/008793)을 적용함으로써 달성된다. 이것은 이 효소 생성물의 연구 및 개발에서 많은 투자자본을 요구한다. 다수의 미생물 공급원들로부터의 효소들로 구성된 효소 생성물의 경우, 각각의 단일 효소 화합물의 제조를 위해 큰 투자자본이 필요하다.
따라서, 가수분해 및 발효를 포함하는 상기 공정을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 가수분해 단계가 개선된 조건에서 수행되는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 감소된 공정 시간을 갖는 가수분해를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 효소의 용량이 감소될 수 있고 동시에 유용한 가수분해 생성물이라는 결과물이 동일한 수준으로 유지되거나 심지어 증가되는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 가수분해의 공정 조건이 최적화되어 있는 가수분해를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 동일한 효소 용량을 사용하여 유용한 가수분해 생성물의 결과물이 증가되는 가수분해를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 이들 목적들 중 하나 이상이 본 발명에 따라 달성된다.
본 발명은,
a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질을 전처리하는 단계;
b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 세척하는 단계;
c) 2종 이상의 셀룰라제를 포함하고 적어도 LPMO(용해성 폴리사카라이드 모노옥시게나제)를 포함하는 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하는 단계; 및
d) 임의적으로, 글루코스-함유 조성물을 회수하는 단계
를 포함하되, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 리그노셀룰로스 물질에 적당량의 산소를 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 클루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지하는, 리그노셀룰로스 물질로부터 당 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은,
a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질을 전처리하는 단계;
b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 세척하는 단계;
c) 2종 이상의 셀룰라제를 포함하고 적어도 LPMO를 포함하는 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하고, 임의적으로, 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 정제하는 단계;
d) 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및
e) 임의적으로, 발효 생성물을 회수하는 단계
를 포함하되, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 리그노셀룰로스 물질에 적당량의 산소를 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지하는, 리그노셀룰로스 물질로부터 발효 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
가수분해 동안 산화된 폴리사카라이드를 야기하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화는 특히 다른 글루코스 및 산화된 글루코스 단위, 예컨대 글루코스 산 또는 다이올로 가수분해된다. 일반적으로, 1 분자의 산소(O2)는 1 몰의 산화 생성물을 제공한다. 산소는 또한 공급원료(예를 들면, 기르닌)에 의해 흡수될 수 있다.
바람직하게는, 산소는 효소적 가수분해 단계 (c) 동안 첨가된다.
바람직한 실시양태에서, 산소는 (기체) 기포 형태로 첨가된다.
놀랍게도, 본 발명에 따르면, 산소를 첨가함으로써 비용을 감소시키는, 최적 온도 조건, 감소된 공정 시간, 감소된 효소 용량, 효소의 재사용, 보다 높은 수율 및 다른 공정 최적화를 포함하는 많은 공정 장점을 달성할 수 있다.
이 방법의 일 실시양태에서, 발효 시간은 5 시간 내지 120 시간이다. 일 실시양태에서, 사용되는 안정한 효소 조성물은 30 시간 이상 동안 활성을 보유한다. 추가 실시양태에 따르면, 가수분해는 바람직하게는 45℃ 이상의 온도, 보다 바람직하게는 50℃ 이상의 온도, 더욱 더 바람직하게는 55℃ 이상의 온도에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 효소 조성물은 진균, 바람직하게는 라삼소니아 속의 미생물로부터 유래되거나, 효소 조성물은 진균 효소, 바람직하게는 라삼소니아 효소를 포함한다. 본 발명의 방법은 이하에서 더 상세히 예시될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전체에서, 용어 "포함하다", "포괄하다", 및 어미 변화, 예컨대, "포함하고", "포함하는", "포괄하고" 및 "포괄하는"은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 용어는 문맥이 허용하는 경우 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 가능한 포함을 전달하기 위한 것이다. 단수형 용어는 하나 또는 하나 초과(즉, 하나 또는 하나 이상의) 요소를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미할 수 있다.
본 발명과 관련하여, "개선된", "증가된" 또는 "감소된"은 본 발명이 여분의 산소를 첨가하지 않는다는 점을 제외하고 동일한 상황, 공정 또는 공정 조건에 비해 장점을 보인다는 것을 표시하기 위해 사용된다. 본 발명과 관련하여, "동일한 조건 하에서 측정된" 또는 "동일한 조건 하에서 분석된"은 본 발명의 방법 및 산소가 첨가되지 않는 동일한 방법이 (산소 첨가를 제외한) 동일한 조건 하에서 수행되고 산소가 첨가되지 않는 방법과 비교되는 경우 본 방법의 결과가 동일한 조건을 이용함으로써, 바람직하게는 동일한 분석 및/또는 방법을 이용함으로써, 보다 바람직하게는 동일한 또는 병행 실험에서 측정된다는 것을 의미한다. 가수분해의 조건은 이러한 조건의 일례이다.
종래기술에서, 효소적 가수분해 동안 혐기성(WO 2010/080407) 또는 진공(WO 2009/046538) 조건을 이용함으로써 셀룰로스분해 물질의 가수분해를 개선하는 것이 제안되었다. 상기 두 특허출원들의 방법에서, 산소 수준은 감소되었다. 놀랍게도, 본 발명의 가수분해는 산소가 첨가되지 않는 방법과 비교될 때 가수분해 후 발효에서 보다 많은 양의 (환원된) 당 생성물 및/또는 원하는 발효 생성물을 제공하는 개선된 반응 생성물을 생성한다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 5 내지 15 중량/중량%의 글루코스 전환 증가가 관찰된다.
산소는 여러 방식으로 첨가될 수 있다. 예를 들면, 산소는 산소 기체, 산소 풍부 기체, 예컨대, 산소 풍부 공기 또는 공기로서 첨가될 수 있다. 산소는 연속적으로 또는 불연속적으로 첨가될 수 있다. 산소가 "첨가되는"은 산소가 가수분해 반응기 내의 (리그노셀룰로스 물질을 포함하는) 액체상에 첨가된다는 것을 의미하고, 산소가 액체상 위의 반응기 상부공간에 존재하므로 산소가 상기 상부공간으로부터 액체상으로 확산되어야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 바람직하게는, 산소는 가수분해 반응기 내의 (리그노셀룰로스 물질을 포함하는) 액체 상에 첨가되거나 이에 생성된다. 따라서, 바람직하게는, 산소는 기포, 가장 바람직하게는 작은 기포로서 첨가된다. 일 실시양태에서, 기포는 0.5 mm 이상, 1 mm 이상, 1.5 mm 이상, 2 mm 이상, 2.5 mm 이상, 3 mm 이상, 3.5 mm 이상, 4 mm 이상, 4.5 mm 이상, 5 mm 이상의 지름을 갖는다. 일 실시양태에서, 기포는 0.5 mm 내지 500 mm, 바람직하게는 0.5 mm 내지 400 mm, 0.5 mm 내지 300 mm, 0.5 mm 내지 200 mm, 0.5 mm 내지 100 mm의 지름을 갖는다.
본 발명자들은, (효소적) 가수분해 (단계)에서 무정형 및 결정질 폴리사카라이드 또는 셀룰로스가 글루코스와 같은 당으로 가수분해된다는 가설을 제기하였다. 무정형 폴리사카라이드는 예를 들면, 엔도-글루카나제에 의해 올리고사카라이드로 전환된 후 상기 올리고사카라이드는 셀로바이오하이드롤라제(CBH) 및 β-글루코시다제(BG)에 의해 글루코스로 전환될 수 있다. 결정질 폴리사카라이드의 전환은 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있고 대부분의 무정형 폴리사카라이드가 가수분해될 때까지 계속된다. 본 가설에 따라, 특히 LPMO와 결합한 산소의 첨가는 결정질 폴리사카라이드의 가수분해 동안, 예를 들면 폴리사카라이드의 올리고사카라이드로의 분해에서 유리하다. 따라서, 산소의 첨가는 특히 결정질 폴리사카라이드가 효소에 의해 전환되는 단계에서 매우 유용하다. 이 단계 이외에, 산소를 첨가하지 않거나 적은 산소의 첨가는 더욱 효율적일 수 있다. 이러한 가설은 본 발명자들에 의해 주목된 효과의 가능한 설명으로만 주어지고, 본 발명은 이러한 이론의 단정에 속하거나 일치하지 않는다.
결정질 글루칸 구조는 용해성 폴리사카라이드 모노옥시게나제(LPMO)에 의해 개방될 수 있다. 이러한 유형의 효소는 글리코시드 결합을 산화하고 이는 올리고사카라이드를 글루코스로 추가로 가수분해하기 위한 다른 셀룰로스 분해 효소에 접근하기 쉽게 만들어 구조를 개방한다.
가장 알려진 LPMO는 알돈산(즉, 절단 부위에서 말단 당의 C1 위치에서 산화된 생성물)을 형성한다. 이 산화된 글루코스 단위는 가수분해 동안 글루콘산으로서 방출된다. 게다가, 절단 부위에서 비-환원성 글루코스 단위의 C4 및 C6의 산화가 보고되어 있다. 예를 들면, 이삭센(T. Isaksen) 등의 문헌(상기 참조)은 수용액 중에 C4 같은자리 다이올과 평형 상태에 있는 비-환원성 말단 잔기인 C4 위치를 산화시켜 C4 위치에서 케토-당을 생성함을 보고하고 있다. 본 발명자들은 가수분해된 산화 생성물, 예를 들면 글루콘산이 리그노셀룰로스 가수분해에 적용된 LPMO의 성능에 대한 측정값임을 제기한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 최적의 리그노셀룰로스 가수분해(70% 초과의 글루칸 전환)가 상기 언급된 산화 생성물, 예를 들면 글루콘산의 최적의 형성과 병행됨을 밝혔다. 최적의 리그노셀룰로스 가수분해는 (결정질) 셀룰로스 및 셀로-올리고사카라이드가 최적으로 가수분해될 때 단지 달성될 수 있음 알 수 있을 것이다. LPMO의 작용에 의한 이러한 최적의 가수분해는 글루콘산과 같은 산화 생성물의 형성을 야기할 것이다. 산화 생성물은 (결정질) 글루칸의 덜 효율적인 가수분해를 의미하지 않는다. 그러나, 너무 높은 수준의 산화 생성물, 예컨대 글루콘산은 글루코스의 비용을 필요로 하고 따라서 (출발) 글루칸에서 수득된 글루코스는 내려갈 것이다. 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 적당량의 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드의 LPMO의 산화에 의해 형성된 가수분해된 산화 생성물의 양은 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 110 g으로 유리하게 유지된다. 바람직하게는, 산화 생성물은 알돈산 및/또는 같은자리 다이올이고, 더욱 바람직하게는 가수분해해된 산화 생성물은 글루콘산이다. 바람직하게는, 셀롤로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드의 산화에 의해 형성된 가수분해된 산화 생성물의 양은 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 4 내지 80 g, 더욱 바람직하게는 5 내지 60 g, 더욱더 바람직하게는 6 내지 40 g, 더욱더 바람직하게는 7 내지 30 g, 가장 바람직하게는 8 내지 25 g으로 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드의 산화에 의해 형성된 글루콘산의 양은 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 110 g, 바람직하게는 3 내지 80 g, 바람직하게는 3 내지 75 g, 바람직하게는 3 내지 70 g, 바람직하게는 3 내지 65 g, 바람직하게는 3 내지 60 g, 바람직하게는 3 내지 50 g, 바람직하게는 4 내지 50 g, 더욱 바람직하게는 4 내지 30 g, 더욱더 바람직하게는 4 내지 20 g, 가장 바람직하게는 5 내지 10 g으로 유지된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 유리하게 높은 수율의 글루코스가 수득된다. 더 많은 양의 산소의 첨가는 글루코스 대신에 생성된 더 많은 글루콘산을 야기하는 반면, 산소 양이 적은 경우, LPMO는 최적으로 작용할 수 없다. 더욱이, 클루콘산과 같은 너무 많은 양의 산화 생성물은 셀룰라제 또는 헤미셀룰라제를 억제할 수 있거나, 이후 가수분해물이 발효되는 경우, 글루콘산은 발효에 사용된 미생물, 예컨대 효모를 억제하여 발효에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다. 상기 양은 가수분해 완료시의 양이다.
일반적으로, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 리그노셀룰로스 물질에 첨가된 산소의 양은 여러 가지 방법으로 제어되거나 변할 수 있다. 공급된 산소의 제한은 가수분해 시간의 일부 동안 산소만을 첨가함으로써 가능하다. 또 다른 선택은, 예를 들면 공기 및 순환된 공기(가수분해 반응기에 남겨진 공기)의 혼합물을 사용하거나, 공기를 불활성 기체로 "희석함"으로써 낮은 농도에서 산소를 첨가하는 것이다. 첨가된 산소의 양을 증가시킴은, 높은 농도에서 산소를 첨가하거나, 더 많은 공기를 첨가함으로써 가수분해 시간의 오랜 기간 동안 산소의 첨가에 의해 수득될 수 있다. 산소 흡수를 변화시키는 또 다른 선택은 가수분해 온도를 변화시키는 것이고, 더 높은 온도는 반응기 내용물 중 산소의 낮은 최대 포화 농도를 야기할 것이다. 산소 농도를 관리하기 위한 또 다른 방식은 산소 소모기 또는 산소 발전기를 첨가하는 것이다. 효소가 산소의 존재 또는 첨가에 의해 손상될 수 있는 경우, 보다 약한 산소 공급이 이용될 수 있다. 이 경우, 개선된 당 생성과 효소 성능 사이의 균형이 발견될 수 있다. 산소는 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 셀룰로스분해 물질에 첨가될 수 있다. 산소가 기체 형태로 첨가되는 경우, 산소 함유 기체는 셀룰로스분해 물질의 액체 가수분해 반응기 내용물 내로 도입될, 예를 들면, 불어 넣어질 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 산소 함유 기체는 가수분해 반응기로 들어갈 액체 셀룰로스분해 물질 스트림 내로 도입된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 산소 함유 기체는 가수분해 반응기로 들어가는 셀룰로스분해 물질, 또는 반응기의 외부 루프를 통과하는 액체 반응기 내용물의 일부와 함께 도입된다. 대다수의 경우, 가수분해 반응기로 들어가기 전 산소의 첨가는 충분하지 않고 산소 첨가는 가수분해 동안에도 수행될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 반응기의 상부(상부공간)에 존재하는 기체상은 산소 함유 기체로 연속적으로 또는 불연속적으로 재충전된다. 후자의 경우, 산소가 액체 반응기 내용물 내로 기포로서 및/또는 확산에 의해 도입되기 위해 바람직하게는 반응기 내의 과도한 압력과 함께 (격렬한) 혼합 또는 교반이 필요하다. 일반적으로, (격렬한) 혼합 또는 교반과 함께 상부공간을 공기로 채우는 것은 100 ℓ 내지 1 m3 크기의 반응기의 경우 충분한 산소를 가수분해 반응기 내의 셀룰로스 물질 내로 도입할 수 있다. 보다 큰 규모에서, 예를 들면, 50 m3 이상, 예를 들면, 100 m3의 반응기에서 더욱 더 많은 에너지가 격렬한 교반을 위해 필요하고, 이것은 경제적 관점에 비추어 볼 때 상업적 작동 공정에서 적용되지 않을 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 적당량의 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의해 효소적 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양은 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지된다. 일 실시양태에서, "적당량의 산소"는 글루칸 kg 당 20 내지 10,000 mmol, 바람직하게는 30 내지 5,000 mmol, 더욱 바람직하게는 40 내지 4,000 mmol, 가장 바람직하게는 50 내지 3,500 mmol의 산소이다. 산소의 양은 효소적 가수분해 동안 첨가된 산소의 전체 양이다.
본 발명에 따르면, 산소는 가수분해 단계 전, 가수분해 단계의 일부 동안, 전체 가수분해 단계 동안, 또는 가수분해 단계의 전 및 가수분해 단계 동안 첨가될 수 있다. 유리하게는, 산소는 가수분해 단계의 처음 절반 동안 첨가된다. 가수분해 단계의 일부 동안에만 산소를 첨가하는 것은 예를 들면, 효소의 산화적 손상이 일어난 경우 수행될 수 있다. 가수분해 반응기 내용물, 또는 가수분해 단계에서 형성된 당 생성물 또는 가수분해물에 존재하는 산소가 후속 발효 단계에 영향을 미치거나 후속 발효 단계를 방해할 경우, 가수분해의 마지막 일부를 제외하고 산소 첨가가 수행될 수 있으므로, (대부분의) 산소는 가수분해된 생체물질이 발효 반응기로 들어가기 전에 소비된다.
효소적 가수분해 공정 동안 통기의 일부 예가 본 발명의 유리한 효과를 보여주기 위해 실시예에 제공되어 있다. 이 유리한 효과는 여러 기질들 또는 공급원료들의 경우 발견되므로, 모든 종류의 기질들 또는 공급원료들의 가수분해의 경우에도 존재할 것으로 생각된다.
효소적 가수분해 공정을 위한 효소 조성물의 여러 예가 본 발명의 유리한 효과를 보여주기 위해 실시예에 제공되어 있다. 이 유리한 효과는 여러 효소 조성물들의 경우 발견되므로, 모든 종류의 가수분해 효소 조성물의 경우 존재할 것으로 생각된다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에 따르면, 효소적 가수분해 동안 존재하는 리그노셀룰로스 물질의 액체상 중의 산소 농도(DO)는 0.001 mol/m3 이상, 바람직하게는 0.002 mol/m3 이상, 가장 바람직하게는 0.003 mol/m3 이상, 더욱 더 바람직하게는 0.01 mol/m3 초과, 예를 들면, 0.02 mol/m3 또는 0.03 mol/m 3 초과의 농도이다. 1 m3 미만의 반응기에서, 0.01 mol/m3 또는 0.02 mol/m3 미만의 DO 값이 느린 교반에 의해 수득될 것이다. 이러한 규모에서 격렬한 혼합 또는 교반은 상부공간의 기체상의 일부를 반응 액체 내로 도입한다. 예를 들면, 혼합 또는 교반은 산소를 액체 내로 끌어들이는 소용돌이를 생성할 수 있다. 일반적으로, (격렬한) 혼합 또는 교반과 함께 상부공간을 공기로 채우는 것은 100 ℓ 내지 1 m3 크기의 반응기의 경우 가수분해 반응기에서 충분한 산소를 셀룰로스 물질 내로 도입할 것이다. 보다 큰 규모에서, 예를 들면, 50 m3 이상, 예를 들면, 100 m3의 반응기에서 더욱 더 많은 에너지가 격렬한 교반을 위해 필요하고, 이것은 경제적 관점에 비추어 볼 때 상업적 작동 공정에서 적용되지 않을 것이다. 일반적으로, 큰 반응기에서 공기 또는 산소를 도입하지 않는 교반 또는 혼합은 0.01 mol/m3 미만의 DO 값을 초래할 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 산소 발생 또는 생성 동안 액체상 중의 산소 농도(통기 또는 산소의 첨가), 즉 효소적 가수분해 동안 존재하는 리그노셀룰로스 물질의 액체상 중의 산소 농도는 바람직하게는 가수분해 반응 조건 하에서의 포화 산소 농도의 80% 이하, 보다 바람직하게는 0.12 mol/m3 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.09 mol/m3 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.06 mol/m3 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.045 mol/m3 이하, 가장 바람직하게는 는 0.03 mol/m3 이하이다. 상기는 리그노셀룰로스 물질의 산소 수송률이 리그노셀룰로스 물질의 산소 흡수율(OUR)보다 더 클 때 상황에 대하여 간주된다. 산소 소비(OUR)가 산소 수송률보다 더 클 때, 산소 농도는 0 mol/m3이다. 온도 및 압력은 DO에 영향을 미칠 것이다. 상기 제시된 바람직한 예시적 mol/m3 값은 정상 공기압 및 약 62℃의 온도에서 측정된 값이다. 당업자는 본 교시내용에 근거하여 유리한 DO 값을 인식할 것이다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에 따라, 산소는 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 20 내지 500 mmol의 분자 산소에 상응하는 양으로 소비된다. 바람직하게는, 산소는 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 22 내지 4500 mmol, 24 내지 4000 mmol, 26 내지 3500 mmol, 28 내지 3400 mmol의 분자 산소에 상응하는 양으로 소비된다. 리그노셀룰로스 물질의 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안, 산소는 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 바람직하게는 30 mmol 이상, 더욱 바람직하게는 40 mmol 이상, 가장 바람직하게는 50 mmol 이상의 분자 산소에 상응하는 양으로 첨가된다. 상기 시스템에 첨가되는 모든 산소는 액체로 수송되거나 가수분해 동안 사용된다. 이러한 양은 시스템으로 불어 넣은 공기의 양을 측정하고 제어함으로써 제어될 수 있다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에 따라, 산소는 시간 당 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 0.17 내지 41.7 mmol의 분자 산소에 상응하는 양으로 소비된다. 바람직하게는, 산소는 시간 당 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 0.18 내지 37.5 mmol, 0.20 내지 33.3 mmol, 0.22 내지 29.2 mmol, 0.23 내지 28.3 mmol의 분자 산소에 상응하는 양으로 소비된다. 더욱 바람직하게는, 산소는 시간 당 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 0.36 내지 27.8 mmol의 분자 산소에 상응하는 양으로 소비된다. 상기 시스템에 첨가되는 모든 산소는 액체로 수송되고 가수분해 동안 사용된다. 이러한 양은 시스템으로 불어 넣은 공기의 양을 측정하고 제어함으로써 제어될 수 있다. 본원에 사용된 "시간 당"은 가수분해의 시간 당을 의미한다.
본 발명에 따른 공기 또는 다른 산소 함유 기체 형태의 산소 첨가는 가수분해 반응기 내용물을 적어도 부분적으로 교반하거나 혼합하는 데에 이용될 수도 있다. 산소를 첨가하는 다른 방식은 동일반응계 산소 생성을 포함한다. 예를 들면, 산소는 전기분해에 의해 생성되거나, 바람직하게는 과산화물을 첨가하여 효소적으로 생성되거나, 예를 들면 산소 생성 시스템, 예컨대 KHSO5에 의해 화학적으로 생성된다. 예를 들면, 산소는 카탈라제에 의해 과산화물로부터 생성된다. 과산화물은 용해된 과산화물 형태로 첨가될 수 있거나 효소적 또는 화학적 반응에 의해 생성될 수 있다. 카탈라제의 증가는 산소를 생성하기 위해 효소로서 사용되고, 가수분해를 위한 효소 조성물에 존재하는 카탈라제가 사용될 수 있거나, 카탈라제는 이 목적을 위해 첨가될 수 있다.
본 발명의 본 방법은 특히 파일럿 플랜트 및 산업적 규모에서 장점을 보인다. 본 발명의 실시양태에 따라, 효소적 가수분해를 위한 반응기는 1 m3 이상의 부피를 갖는다. 바람직하게는, 반응기는 1 m3 이상, 2 m3 이상, 3 m3 이상, 4 m3 이상, 5 m3 이상, 6 m3 이상, 7 m3 이상, 8 m3 이상, 9 m3 이상, 10 m3 이상, 15 m3 이상, 20 m3 이상, 25 m3 이상, 30 m3 이상, 35 m3 이상, 40 m3 이상, 45 m3 이상, 50 m3 이상, 60 m3 이상, 70 m3 이상, 75 m3 이상, 80 m3 이상, 90 m3 이상, 100 m3 이상, 200 m3 이상, 300 m3 이상, 400 m3 이상, 500 m3 이상, 600 m3 이상, 700 m3 이상, 800 m3 이상, 900 m3 이상, 1000 m3 이상, 1500 m3 이상, 2000 m3 이상, 2500 m3 이상의 부피를 갖는다. 일반적으로, 반응기는 3000 또는 5000 m3 보다 더 작을 것이다. 여러 반응기가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 반응기는 동일한 부피를 가질 수 있을 뿐만 아니라 상이한 부피를 가질 수 있다.
본 발명자들은 특히 대규모에서 불충분한 산소가 가수분해를 위해 사용가능하고, 이것은 반응기, 예를 들면, 셀룰로스분해 생체물질에서의 산소 수송 한계에 기인할 것이라는 이론을 주장한다. 실험실 규모 실험에서 이 산소 불충분은 보다 덜 중요한 역할을 수행할 수 있다. 표면적(또는 반응기 내용물의 산소 접촉 면적) 대 반응기 부피 비는 대규모 실험보다 소규모 실험에 더 유리할 수 있다. 더욱이, 소규모 실험에서의 혼합은 대규모에서의 혼합보다 상대적으로 더 용이하다. 또한, 소규모 실험 동안 가수분해 반응기의 상부공간으로부터의 산소 수송은 대규모 실험에서의 상황에 비해 더 빠르다. 이 이론은 본 발명자들에 의해 인지된 효과의 가능한 설명으로서만 제공되고, 본 발명은 이 이론과 정확히 맞아 떨어지거나 일치하지는 않는다. 본 발명의 추가 실시양태에 따르면, 산소 첨가는 적어도 부분적으로 가수분해 공정을 제어하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 열안정성 효소의 사용과 함께 유리하게 적용된다.
"열안정성" 효소는 이 효소가 60℃ 이상, 예를 들면, 70℃ 이상, 예컨대, 75℃ 이상, 예를 들면, 80℃ 이상, 예컨대, 85℃ 이상의 온도 최적치를 갖는다는 것을 의미한다. 상기 효소는 예를 들면, 호열성 미생물로부터 단리될 수 있거나, 당업자에 의해 디자인될 수 있고 인공적으로 합성될 수 있다. 일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 호열성 또는 열내성 사상 진균으로부터 단리될 또는 수득될 수 있거나, 비-호열성 또는 비-열내성 진균으로부터 단리될 수 있으나, 열안정성을 갖는 것으로 발견된다.
"호열성 진균"은 50℃ 이상의 온도에서 생장하는 진균을 의미한다. "열내성" 진균은 50℃ 근처에서 최대치를 갖는 45℃ 이상의 온도에서 생장하는 진균을 의미한다.
호열성 진균 균주의 예는 라삼소니아 에머소니이(Rasamsonia emersonii)[이전에 탈라로마이세스 에머소니이(Talaromyces emersonii)로서 공지됨; 탈라로마이세스 에머소니이, 페니실륨 게오스미씨아 에머소니이(Penicillium geosmithia emersonii) 및 라삼소니아 에머소니이는 본원에서 상호교환적으로 사용됨]이다.
적합한 호열성 또는 열내성 진균 세포는 후미콜라, 리조무코르(Rhizomucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 라삼소니아, 탈로마이세스, 써모마이세스(Thermomyces), 써모아스커스(Thermoascus) 또는 티엘라비아(Thielavia) 세포, 바람직하게는 라삼소니아 에머소니이 세포일 수 있다. 바람직한 호열성 또는 열내성 진균은 후미콜라 그리세아 변종 써모이데아(Humicola grisea var . thermoidea), 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophilia), 파풀라스포라 써모필리아(Papulaspora thermophilia), 라삼소니아 바이소클라마이도이데스(Rasamsonia byssochlamydoides), 라삼소니아 에머소니이, 라삼소니아 아르길라세아(Rasamsonia argillacea), 라삼소니아 에부르네안(Rasamsonia eburnean), 라삼소니아 브레비스티피타타(Rasamsonia brevistipitata), 라삼소니아 실린드로 스포라(Rasamsonia cylindrospora), 리조무코르 푸실러스(Rhizomucor pusillus), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 탈라로마이세스 바실리스포러스(Talaromyces bacillisporus), 탈라로마이세스 레이세타너스(Talaromyces leycettanus), 탈라로마이세스 써모필러스(Talaromyces thermophilus), 써모마이세스 레누기노서스(Thermomyces lenuginosus), 써모아스커스 크루스타세우스(Thermoascus crustaceus), 써모아스커스 써모필러스(Thermoascus thermophilus), 써모아스커스 아우란티아커스(Thermoascus aurantiacus) 및 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris)이다.
호열성 진균은 분류학상 특정 목으로 한정되지 않고 진균 생명나무 전체에 걸쳐 존재한다. 예는 뮤코랄레스(Mucorales)에서의 리조무코르(Rhizomucor), 소르다리알레스(Sordariales)에서의 마이셀리오프토라, 및 유로티알레스(Eurotiales)에서의 탈라로마이세스, 써모마이세스 및 써모아스커스이다(문헌[Mouchacca 1997]). 대다수의 탈로마이세스 종들은 중온균이지만, 예외는 에머소니이(Emersonii) 및 써모필라(Thermophila) 절 내의 종이다. 에머소니이 절은 탈라로마이세스 에머소니이, 탈라로마이세스 바이소클라마이도이데스, 탈라로마이세스 바실리스포러스 및 탈라로마이세스 레이세타너스를 포함하고, 이들 모두가 40℃에서 잘 생장한다. 탈라로마이세스 바실리스포러스는 열내성을 갖고, 탈라로마이세스 레이세타너스는 열내성 내지 호열성을 갖고, 탈라로마이세스 에머소니이 및 탈라로마이세스 바이소클라마이도이데스는 엄밀히 호열성을 갖는다(문헌[Stolk and Samson 1972]). 탈라로마이세스 절 써모필라의 유일한 구성원인 탈라로마이세스 써모필러스는 50℃에서 신속히 생장한다(문헌[Evans and Stolk 1971]; [Evans 1971]; [Stolk and Samson 1972]). 이들 호열성 탈라로마이세스 종들의 현행 분류는 주로 표현형적 및 생리학적 특성, 예컨대, 40℃ 초과의 온도에서 생장하는 그들의 능력, 자낭포자 색채, 아스코르나탈 덮개의 구조 및 특정 종류의 무성생식(anamorph)의 형성에 근거한다. 스토크 및 샘슨(Stolk and Samson, 1972)은 에머소니이 절의 구성원이 패실로마이세스(Paecilomyces)(탈라로마이세스 바이소클 라마이도이데스 및 탈라로마이세스 레이세타너스) 또는 페니실륨 실린드로스포룸(Penicillium cylindros porum) 종(탈라로마이세스 에머소니이 및 탈라로마이세스 바실리스포러스)의 무성생식을 갖는다고 주장하였다. 그 후, 피트(Pitt, 1979)는 다양한 특성, 예컨대, 콜루라(collula)(목)(페니실륨 및 패실로마이세스의 특성) 대신에 말단 공극으로부터의 분생자(conidia)의 형성에 근거하여 페니실륨 실린드로스포룸 패밀리에 속하는 종을 게오스미씨아 속으로 옮겼다. 게오스미씨아 속 내에서 게오스미씨아 아르길라세아만이 열내성을 갖고, 스토크(Stolk, 1969) 등 및 에반스(Evans, 1971)는 탈라로마이세스 절 에머소니이의 구성원과의 연결을 제안하였다. 탈라로마이세스 및 트라이코코마세아(Trichocomaceae) 내의 호열성 탈라로마이세스 종들의 계통학적 관계는 공지되어 있지 않다. 문헌[J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek 2012 F eb; 101(2): 403-21]을 참조한다.
라삼소니아는 열내성 및 호열성 탈라로마이세스 및 게오스미씨아 종을 포함하는 새로운 속이다(상기 문헌[J. Houbraken et al.]). 상기 문헌[J. Houbraken et al.]은 표현형적, 생리학적 및 분자적 데이터에 근거하여 탈라로마이세스 에머소니이, 탈라로마이세스 바이소클라마이도이데스, 탈라로마이세스 에부르네우스(Talaromyces eburneus), 게오스미씨아 아르길라세아(Geosmicia argillacea) 및 게오스미씨아 실린드로스포라(Geosmicia cylindrospora) 종을 신규 라삼소니아 속으로 옮길 것을 제안하였다. 탈라로마이세스 에머소니이, 페니실륨 게오스미씨아 에머소니이 및 라삼소니아 에머 소니이는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 호열성 진균은 라삼소니아 바이소 클라마이도이데스, 라삼소니아 에머소니이, 써모마이세스 레누기노서스, 탈라로마이세스 써모필러스, 써모아스커스 크루스타세우스, 써모아스커스 써모필러스 및 써모아스커스 아우란티아커스이다.
"사상 진균"은 유마이코타(Eumycota) 및 오오마이코타(Oomycota) 아문의 모든 사상 형태 들을 포함한다(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 의해 정의됨). 사상 진균은 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 다른 복합체 폴리사카라이드로 구성된 균사벽을 특징으로 한다. 영양 생장은 균사 신장에 의한 것이고, 탄소 이화작용은 절대적으로 호기성이다. 사상 진균 균주는 아크레모늄(Acre monium), 아가리커스(Agaricus), 아스퍼길러스(아스퍼길러스), 아우레오바시듐(Aureob asidium), 베아우바리아(Beauvaria), 세팔로스포륨(Cephalosporium), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 카에토뮴 패실로마이세스(Chaetomium paecilomyces), 크라이소스포륨(Chrysosporium), 클라비세프스(Claviceps), 코키오볼루스(Cochiobolus), 코프리너스(Coprinus), 크립토코커스(Cryptococcus), 클라비세프스(Claviceps), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사륨(Fusarium), 게오스미씨아, 길로클라듐(Gilocladium), 후미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 뮤코르, 마이셀리오프토라, 마이로테슘(Myrothecium), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 네우로스포라(Neurospora), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실륨(Penicillum), 피로마이세스(Piromyces), 파네로캐테(Panerochaete), 플레우로터스(Pleurotus), 포도스포라(Podospora), 피리쿨라리아(Pyricularia), 라삼소니아, 리조무코르(Rhizomucor), 리조푸스(Rhizopus), 쉴라티듐(Scylatidium), 쉬조필룸(Schizophyllum), 스타고노스포라(Stagonospora), 탈라로마이세스, 써모아스커스, 써모마이세스, 티엘라비아, 톨리포클라듐(Tolypocladium), 트라메테스 플레우로투스(Trametes pleurotus), 트리코데마, 및 트라이코피톤(Trichophyton)의 균주들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
사상 진균의 여러 균주들은 다수의 배양물 보존기관, 예컨대, 미국 배양물 보존기관(ATCC), 독일 생물자원센터(DSM), 네덜란드 생물자원센터(CBS) 및 농업 연구 서비스 특허 배양물 보존기관 북부 지역 연구 센터(NRRL)로부터 공개적으로 용이하게 입수될 수 있다. 이러한 균주들의 예에는 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) CBS 513.88, 아스퍼길러스 오리자(Aspergillus oryzae) ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC 12892, 페니실륨 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum) CBS 455.95, 페니실륨 시트리눔(Penicillium citrinum) ATCC 38065, 페니실륨 크라이소게눔 P2, 탈라로마이세스 에머소니이 CBS 393.64, 아크레모늄 크라이소게눔(Acremonium chrysogenum) ATCC 36225 또는 ATCC 48272, 트리코데마 리세이(Trichodema reesei) ATCC 26921 또는 ATCC 56 765 또는 ATCC 26921, 아스퍼길러스 소자(Aspergillus sojae) ATCC 11906, 크라이소스포륨 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense) C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC 44006 및 이들의 유도체들이 포함된다.
적합한 미생물에서의 효소(예를 들면, 2종, 3종 또는 4종 이상의 상이한 셀룰라제)의 발현 및 생성의 장점은 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 높은 효소 조성물 수율일 수 있다.
본 발명에 따르면, 산소를 첨가하여 비용을 감소시키는 많은 공정 장점, 예컨대 최적 온도 조건, 감소된 공정 시간, 감소된 효소 용량, 효소의 재사용 및 다른 공정 최적화를 달성할 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 가수분해 단계가 개선된 조건에서 수행되는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 감소된 공정 시간을 갖는 가수분해를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 효소의 용량이 감소될 수 있고 동시에 유용한 가수분해 생성물이라는 결과물이 동일한 수준에서 유지되는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 장점은 가수분해를 포함하는 본 방법이 최적화된 공정 조건을 발생시킬 수 있다는 점이다. 본 발명의 추가 장점은 가수분해를 포함하는 상기 방법의 유용한 가수분해 생성물이라는 결과물이 동일한 효소 용량을 사용함으로써 증가된다는 점이다.
안정한 효소 조성물
본원의 안정한 효소 조성물은, 이 효소 조성물이 30 시간의 가수분해 반응 시간 후 활성, 바람직하게는 30 시간의 가수 분해 반응 시간 후 그의 초기 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상을 보유함을 의미한다. 바람직하게는, 효소 조성물은 40 시간, 50 시간, 60 시간, 70 시간, 80 시간, 90 시간, 100 시간, 150 시간, 200 시간, 250 시간, 300 시간, 350 시간, 400 시간, 450 시간 또는 500 시간의 가수분해 반응 시간 후 활성을 보유한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 효소 조성물은 진균으로부터 유래되거나, 본 발명의 방법에 사용된 효소 조성물은 진균 효소를 포함한다. 일 실시양태에서, 효소 조성물은 사상 진균으로부터 유래되거나, 효소 조성물은 사상 진균 효소를 포함한다. 본 발명의 방법은 라삼소니아 속의 미생물로부터 유래된 효소 조성물과 함께 유리하게 적용되거나, 효소 조성물은 라삼소니아 효소를 포함한다.
효소 조성물은 적합한 미생물, 예를 들면, 라삼소니아 에머소니이 또는 아스퍼길러스 니거를 사용한 적합한 기질의 발효에 의해 제조될 수 있고, 이때 상기 효소 조성물은 상기 미생물에 의해 생성된다. 상기 미생물은 셀룰라제 조성물을 개선하거나 만들도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 미생물은 고전적 균주 개선 절차 또는 재조합 DNA 기법에 의해 돌연변이될 수 있다. 따라서, 본원에서 언급된 미생물은 셀룰라제 조성물을 생성하는 데에 그 자체로서 사용될 수 있거나, 생성을 증가시키도록 또는 상기 미생물에 의해 원래 생성되지 않는 효소인 이종 셀룰라제를 포함할 변형된 셀룰라제 조성물을 생성하도록 변형될 수 있다. 바람직하게는, 진균, 보다 바람직하게는 사상 진균이 셀룰라제 조성물을 생성하는 데에 사용된다. 유리하게는, 호열성 또는 열내성 미생물이 사용된다. 임의적으로, 효소 조성물의 생성 동안 효소 조성물에서 효소의 발현을 유도하는 기질이 사용된다.
효소 조성물은 폴리사카라이드를 포함하는 당을 리그노셀룰로스로부터 방출시키는 데에 사용된다. 주요 폴리사카라이드는 셀룰로스(글루칸) 및 헤미셀룰로스(자일란, 헤테로자일란 및 자일로글루칸)이다. 추가로, 일부 헤미셀룰로스는 예를 들면, 목재로부터 유래된 공급원료에서 글루코만난으로서 존재할 수 있다. 단량체 및 다량체, 예를 들면, 글루코스, 셀로바이오스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 람노스, 리보스, 갈락투론산, 글루코론산 및 다른 헥소스 및 펜토스를 포함하는 가용성 당으로의 이들 폴리사카라이드들의 효소적 가수분해는 협동하여 작용하는 상이한 효소들의 작용 하에서 일어난다. 당 생성물은 공급원료 또는 리그노셀룰로스 물질의 효소적 가수분해 생성물을 의미한다. 당 생성물은 단량체 및 다량체 둘 다를 포함하는 가용성 당을 포함할 것이고, 바람직하게는 글루코스를 포함할 것이다. 다른 당의 예는 셀로바이오스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 람노스, 리보스, 갈락투론산, 글루코론산 및 다른 헥소스 및 펜토스이다. 당 생성물은 그 자체로서 사용될 수 있거나 더 가공, 예를 들면, 정제될 수 있다.
추가로, 펙틴 및 다른 펙틴성 물질, 예컨대, 아라비난은 전형적으로 비-목재 식물 조직으로부터의 세포벽의 건조 질량의 상당한 비율을 차지할 수 있다(건조 질량의 약 25% 내지 50%가 펙틴일 수 있음).
셀룰로스는 β-1,4 결합에 의해 연결된 글루코스 잔기들로 구성된 선형 폴리사카라이드이다. 셀룰로스 섬유의 선형 성질뿐만 아니라 (α에 비해 상대적으로) β-연결된 글루코스의 화학양론은 전분의 고도로 분지된 α-연결된 구조보다 쇄간 수소결합에 더 민감한 구조를 발생시킨다. 따라서, 셀룰로스 중합체는 일반적으로 보다 낮은 가용성을 갖고, 전분에서 발견된 섬유보다 더 단단하게 결합된 섬유를 형성한다.
본 발명에서 사용된 안정한 효소 조성물에 포함될 수 있는 효소가 지금부터 보다 상세히 기재된다.
GH61, 엔도-글루카나제(EG) 및 엑소-셀로바이오하이드롤라제(CBH)는 셀로올리고사카라이드(주요 생성물로서 셀로바이오스)와 같은 생성물로의 불용성 셀룰로스의 가수분해를 촉진하는 반면, β-글루코시다제(BG)는 올리고사카라이드, 주로 셀로바이오스 및 셀로트라이오스를 글루코스로 전환한다.
헤미셀룰로스는 복잡한 중합체이고, 그의 조성은 종종 유기체마다 및 조직 종류마다 광범위하게 달라진다. 일반적으로, 헤미셀룰로스의 주요 성분은 오탄당인 β-1,4-연결된 자일로스이다. 그러나, 이 자일로스는 종종 자일로스의 0 내지 3개 및/ 또는 0 내지 2개 원자에서 분지되고, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 글루쿠론산 또는 갈락투론산과의 연결, 또는 아세트산으로의 에스터화(및 아라비노스로의 페룰산의 에스터화)로 치환될 수 있다. 헤미셀룰로스는 β-연결된 육탄당(예컨대, β-(1,3)(1,4) 글루칸 및 앞서 언급된 이종글루칸) 및 추가로 글루코만난(이때, 글루코스 및 만노스 둘 다가 β-연결에 의해 서로 연결된 선형 골격에 존재함)에 대한 일반 용어인 글루칸도 함유할 수 있다.
다른 보조 효소(예를 들면, α-L-아라비노푸라노시다제, 페룰로일 및 아세틸자일란 에스터라제, 글루쿠로니다제 및 β-자일로시다제)와 함께 자일라나제는 헤미셀룰로스의 가수분해를 촉진한다.
펙틴성 물질은 펙틴, 아라비난, 갈락탄 및 아라비노갈락탄을 포함한다. 펙틴은 식물 세포벽에서 가장 복잡한 폴리사카라이드이다. 펙틴은 어느 정도까지 L-람노스에 의해 산재된 α(1,4)-연결된 D-갈락투론산 단위로 구성된 코어 쇄 주변에서 구축된다. 어느 한 세포벽에서 이 설명에 잘 부합되는 다수의 구조적 단위가 존재하고, 일반적으로 단일 펙틴성 분자에서 상이한 구조적 단위로 구성된 코어 쇄들이 서로 연속적으로 존재하는 것으로 생각되었다.
구조적 단위의 주요 종류는 다음과 같다: 카복실기 상에서 메탄올로 치환될 수 있고 O-2 및 O-3 상에서 아세테이트로 치환될 수 있는 갈락투로난(동종갈락투로난); 및 갈락투론산 단위가 (1,4)-연결된 갈락탄 및 (1,5)-연결된 아라비난 측쇄를 보유하는 람노스 단위와 교대로 존재하는 람노갈락투로난 I(RGI). 아라비난 측쇄는 직접적으로 람노스에 부착될 수 있거나, 갈락탄 쇄; 갈락투론산의 O-3 상에서 단일 자일로실 단위를 갖는 자일로갈락투로난(RGI와 밀접하게 관련되어 있음); 및 드문 당, 예를 들면, 아피오스를 함유하는 특히 복잡한 소수의 단위인 람노갈 락투로난 II(RGII)를 통해 간접적으로 람노스에 부착될 수 있다. RGII 단위는 적합한 이온성 조건 하에서 보레이트와 에스터를 가역적으로 형성할 수 있는 2개의 아피오실 잔기를 함유할 수 있다.
전형적으로, 조성물이 2종 초과, 예를 들면, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종 또는 9종 이상의 활성을 포함할 것이지만, 본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 바람직하게는 2종 이상의 활성을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 조성물은 2종 이상의 상이한 셀룰라제 또는 2종의 셀룰라제 및 1종 이상의 헤미셀룰라제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 셀룰라제를 포함할 수 있으나 자일라나제를 포함하지 않는다. 추가로, 본 발명의 조성물은 직접적으로 또는 간접적으로 리그노셀룰로스 분해를 유발하는 보조 효소 활성, 즉 추가 활성을 포함할 수 있다. 이러한 보조 활성의 예는 본원에 언급되어 있다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 조성물은 GH61 활성, 엔도-글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성 및/또는 β-글루코시다제 활성을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 조성물은 이들 부류들 중 1종 이상의 부류 내의 1종 초과의 효소 활성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 조성물은 2종의 엔도-글루카나제 활성, 예를 들면, 엔도-1,3(1,4)-β 글루카나제 활성 및 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 1종 이상의 자일라나제 활성도 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 보조 효소 활성을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 조성물은 진균, 예컨대 사상 진균, 예컨대 라삼소니아, 예컨대 라삼소니아 에머소니이로부터 유래될 수 있다. 일 실시양태에서, (리그노셀룰로스 분해) 효소 활성의 코어 세트가 라삼소니아 에머소니이로부터 유래될 수 있다는 것이 예상된다. 라삼소니아 에머소니이는 리그노셀룰로스 물질의 가수분해에 대해 본원에서 입증된 매우 효과적인 활성 세트를 제공할 수 있다. 필요한 경우, 활성 세트는 다른 공급원으로부터의 추가 효소 활성으로 보충될 수 있다. 이러한 추가 활성은 고전적인 공급원으로부터 유래될 수 있고/있거나 유전적으로 변형된 유기체에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 조성물에서의 활성은 열안정성일 수 있다. 여기서, 활성은 약 60℃ 이상, 예를 들면, 약 70℃ 이상, 예컨대, 약 75℃ 이상, 예를 들면, 약 80℃ 이상, 예컨대, 85℃ 이상의 온도 최적치를 갖는다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 조성물에서의 활성은 전형적으로 동일한 온도 최적치를 갖지 않을 것이지만, 그럼에도 불구하고 바람직하게는 열안정성일 것이다.
추가로, 본 발명에서 사용되는 조성물에서의 효소 활성은 낮은 pH에서 작용할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 낮은 pH는 약 5.5 이하, 약 5 이하, 약 4.9 이하, 약 4.8 이하, 약 4.7 이하, 약 4.6 이하, 약 4.5 이하, 약 4.4 이하, 약 4.3 이하, 약 4.2 이하, 약 4.1 이하, 약 4.0 이하, 약 3.9 이하, 약 3.8 이하, 약 3.7 이하, 약 3.6 이하 또는 약 3.5 이하를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 조성물에서의 활성은 상기 온도 최적치 및 pH 값 중 임의의 온도 최적치와 pH 값의 조합에 의해 정의될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 라삼소니아로부터 유래된 활성 이외에 셀룰라제(예를 들면, 라삼소니아 이외의 공급원으로부터 유래된 셀룰라제) 및/또는 헤미셀룰라제(예를 들면, 라삼소니아 이외의 공급원으로부터 유래된 헤미셀룰라제) 및/또는 펙티나제를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소 조성물은 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제 및/또는 라삼소니아 이외의 공급원으로부터의 펙티나제를 포함할 수 있다. 이들은 하나 이상의 라삼소니아 효소와 함께 사용될 수 있거나, 존재하는 추가 라삼소니아 효소 없이 사용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소는 아스퍼길러스(Aspergillus), 예컨대 아스퍼길러스 오리재, 예컨대 WO 02/095014에 개시된 β-글루코시다제(BG) 또는 WO 2008/057637에 개시된 β-글루코시다제 활성을 갖는 융합 단백질, 또는 아스퍼길러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 예컨대 WO 2005/047499에서 서열번호 2 또는 WO 2014/130812에서 서열번호 5로서 개시된 것, 또는 아스퍼길러스 푸미가투스 β-글루코시다제 변이체, 예컨대 WO 2012/044915에 개시된 것, 예컨대 F100D, S283G, N456E, F512Y(넘버링을 위해 WO 2014/130812에서 서열번호 5를 사용) 중 하나, 또는 아스퍼길러스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼길러스 니게로르(Aspergillus nigeror), 아스퍼길러스 카와치(Aspergillus kawachi)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, β-글루코시다제는 페니실륨, 예컨대 WO 2007/019442에서 서열번호 2로서 개시된 페니실륨 브라실리아눔(Penicillium brasilianum), 또는 트리코데마, 예컨대 트리코데마 리세이, 예컨대 US 6,022,725, US 6,982,159, US 7,045,332, US 7,005,289, US 2006/0258554, US 2004/0102619에 개시된 것으로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 심지어 세균성 β-글루코시다제가 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, β-글루코시다제는 티에라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris)(WO 2011/035029) 또는 트리코파에아 사카타(Trichophaea saccata)(WO 2007/019442)로부터 유래된다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소는 트리코데마, 예컨대 트리코데마 리세이; 후미콜라, 예컨대 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)의 균주; 아스퍼길러스, 예컨대 아스퍼길러스 아쿨레아투스 또는 아스퍼길러스 카와치; 에르비니아, 예컨대 에르비니아 카로토바라(Erwinia carotovara); 푸사리움, 예컨대 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum); 티에라비아, 예컨대 티에라비아 테레스트리스; 후미콜라, 예컨대 후미콜라 그리세아 바르 써모이데아(Humicola grisea var. thermoidea); 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 예컨대 멜라노카르푸스 알보마이세스(Melanocarpus albomyces ); 네우로스포라, 예컨대 네우로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 예컨대 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila); 클라도르히눔(Cladorrhinum), 예컨대 클라도르히눔 포에쿤디시뭄(Cladorrhinum foecundissimum) 및/또는 크리소스포리움(Chrysosporium), 예컨대 크리소스포리움 루크노벤세(Chrysosporium lucknowense)의 균주로부터의 엔도글루카나제(EG)를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 심지어 비제한적으로 아시도테르무스 셀룰로스 분해성 엔도글루카나제(WO 91/05039; WO 93/15186; US 5,275,944; WO 96/02551; US 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050 참조); 써모비피다 푸스카 엔도글루카나제 III(WO 05/093050 참조); 및 써모비피다 푸스카 엔도글루카나제 V(WO 05/093050 참조)를 포함하는 세균성 엔도글루카나제가 사용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소는 아스퍼길러스, 예컨대 아스퍼길러스 푸미가투스로부터, 또는 트리코데마, 예컨대 트리코데마 리세이로부터 셀로바이오하이드롤라제 I, 예컨대 WO 2011/057140에서 서열번호 6 또는 WO 2014/130812에서 서열번호 6으로 개시된 Cel7A CBH I을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소는 아스퍼길러스, 예컨대 WO 2014/130812에서 서열번호 7 중 하나인, 예컨대 아스퍼길러스 푸미가투스로부터, 또는 트리코데마, 예컨대 트리코데마 리세이로부터, 또는 티에라비아, 예컨대 티에라비아 테레스트리스로부터의 셀로바이오하이드롤라제 II, 예컨대 티에라비아 테레스트리스로부터의 셀로바이오하이드롤라제 II CEL6A를 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 효소는 써모아스커스(Thermoascus), 예컨대 써모아스커스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus), 예컨대 WO 2005/074656에서 서열번호 2, 및 WO 2014/130812 및 WO 2010/065830에서 서열번호 1로서 기재된 것; 또는 티에라비아, 예컨대 티에라비아 테레스트리스, 예컨대 WO 2005/074647에서 서열번호 8 또는 WO2014/130812, WO 2008/148131 및 WO 2011/035027에서 서열번호 4로서 기재된 것; 또는 아스퍼길러스, 예컨대 아스퍼길러스 푸미가투스, 예컨대 WO 2010/138754에서 서열번호 2 또는 WO 2014/130812에서 서열번호 3으로서 기재된 것; 또는 페니실륨, 예컨대 페니실륨 에메르소니, 예컨대 WO 2011/041397에서 서열번호 2 또는 WO 2014/130812에서 서열번호 2로서 기재된 것으로부터의 GH61 폴리펩티드(용해성 폴리사카라이드 모노옥시게나제)를 포함할 수 있다. 다른 적합한 GH61 폴리펩티드는 비제한적으로, 트리코데마 리세이(WO 2007/089290 참조), 마이셀리오프토라 써모필라(WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868 참조), 페니실륨 피노필룸(Penicillium pinophilum)(WO 2011/005867 참조), 써모아스커스 종(WO 2011/039319 참조), 및 써모아스커스 크루스타세우스(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504 참조)를 포함한다. 일 양상에서, GH61 폴리펩티드는 WO 2008/151043에 따라 용해성 활성화 2가 금속 양이온, 예를 들면 망간 설페이트의 존재 하에서 사용된다. 일 양상에서, GH61 폴리펩티드는 다이옥시 화합물, 다이사이클릭 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 질소-함유 화합물, 퀴논 화합물, 황-함유 화합물 또는 전처리된 셀룰로스 물질로부터 수득된 리큐어, 예컨대 전처리된 옥수수대의 존재 하에서 사용된다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 셀룰로스 분해 효소는 WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5,457,046, US 5,648,263 및 US 5,686,593에 몇가지 이름으로 기재되어 있다.
게다가, 본 발명의 방법에 유용한 자일라나제의 예는, 비제한적으로, 아스퍼길러스 아쿨레아투스(WO 94/21785 참조), 아스퍼길러스 푸미가투스(WO 2006/078256 참조), 페니실륨 피노필리움(WO 2011/041405 참조), 페니실륨 종(WO 2010/126772 참조), 티에라비아 테레스트리스 NRRL 8126(WO 2009/079210 참조), 및 트리코파에아 사카타 GH10(WO 2011/057083 참조)으로부터의 자일라나제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 β-자일로시다제의 예는 비제한적으로, 네우로스포라 크라싸 및 트리코데마 리세이로부터의 β-자일로시다제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 아세틸자일란 에스테라제의 예는 비제한적으로, 아스퍼길러스 아쿨레아투스(WO 2010/108918 참조), 카에토미움 글로보숨(Chaetomium globosum ), 카에토미움 그라실(Chaetomium gracile), 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800(WO 2009/073709 참조), 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)(WO 2005/001036 참조), 마이셀리오프테라 써모필라(WO 2010/014880 참조), 네우로스포라 크라싸, 파에오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum) 및 티에라비아 테레스트리스 NRRL 8126(WO 2009/042846 참조)으로부터의 아세틸자일란 에스테라제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 페루로일 에스테라제(페룰산 에스테라제)의 예는 비제한적으로, 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800(WO 2009/076122 참조), 네오사르토리아 피쉐리(Neosartorya fischeri), 네우로스포라 크라싸, 페니실륨 아우란티오글리세움(Penicillium aurantiogriseum)(WO 2009/127729 참조), 및 티에라비아 테레스트리스(WO 2010/053838 및 WO 2010/065448 참조)로부터의 페루로일 에스테라제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 아라비노푸라노시다제의 예는 비제한적으로, 아스퍼길러스 니게르, 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800(WO 2006/114094 및 WO 2009/073383 참조) 및 마카이로두스 기간테우스(Machairodus giganteus)(WO 2006/114094 참조)로부터의 아라비노푸라노시다제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 α-글루쿠로니다제의 예는 비제한적으로, 아스퍼길러스 클라바투스, 아스퍼길러스 푸미가투스, 아스퍼길러스 니게르, 아스퍼길러스 테레우스, 후미콜라 인솔렌스(WO 2010/014706 참조), 페니실륨 아우란티오글리세움(WO 2009/068565 참조) 및 트리코데마 리세이로부터의 α-글루쿠로니다제를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 조성물은 1종, 2종, 3종 또는 4종 이상의 부류의 셀룰라제, 예를 들면, GH61, 엔도-글루카나제(EG), 1종 또는 2종의 엑소-셀로바이오하이드롤라제(CBH) 및 β-글루코시다제(BG) 중 1종, 2종, 3종, 4종 또는 전부를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 조성물은 이들 부류들의 셀룰라제 중 2종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 방법에서 사용되는 조성물에 의해 제공된 활성과 상이한 종류의 셀룰라제 활성, 헤미셀룰라제 활성 및/또는 펙티나제 활성을 갖는 활성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 조성물에 의해 제공된 1종의 셀룰라제 활성, 헤미셀룰라제 활성 및/또는 펙티나제 활성, 및 추가 셀룰라제 /헤미셀룰라제/펙티나제에 의해 제공된 2종의 셀룰라제 활성, 헤미셀룰라제 활성 및/또는 펙티나제 활성을 포함할 수 있다.
본원에서, 셀룰라제는 셀룰로스를 분해할 수 있거나 변형시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 셀룰로스를 분해할 수 있는 폴리펩티드는 셀룰로스를 보다 작은 단위, 예를 들면, 셀로덱스트린으로 부분적으로 분해하거나 글루코스 단량체로 완전히 분해하는 과정을 촉진할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 셀룰라제는 셀룰라제와 접촉될 때 셀로덱스트린과 글루코스 단량체의 혼합된 집단을 발생시킬 수 있다. 이러한 분해는 전형적으로 가수분해 반응에 의해 일어날 것이다.
LPMO는 최근에 CAZy에 의해 패밀리 AA9(보조 활성 패밀리 9) 또는 패밀리 AA10(보조 활성 패밀리 10)으로 분류되었다. 상기 언급한 바와 같이, LPMO는 결정질 글루칸 구조를 개방할 수 있다. LPMO는 또한 셀로-올리고사카라이드에 영향을 끼칠 수 있다. PMO 및 LPMO는 상호교환적으로 사용된다. GH61(종종 EGIV로서도 지칭되는 글리코사이드 하이드롤라제 패밀리 61) 단백질은 최신 문헌에 따르면 (용해성) 산소 의존적 폴리사카라이드 모노옥시게나제(PMO/LPMO)이다(문헌[Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642]). 종종 문헌에는 이 단백질이 리그노셀룰로스 기질에 대한 셀룰라제의 작용을 향상시킨다고 언급되고 있다. GH61은 처음에 한 패밀리 구성원에서 매우 약한 엔도-1,4-β-d-글루카나제 활성의 측정에 근거하여 엔도-글루코나제로서 분류되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "GH61"은 잘 확립된 CAZy GH 분류 시스템(http://www.cazy.org/GH61.html)의 패밀리 61에서 분류되는 공통의 보존된 서열 부분 및 폴딩을 공유하는 효소 패밀리로서 이해되어야 한다. 글리코사이드 하이드롤라제 패밀리 61은 글리코사이드 하이드롤라제 EC 3.2.1의 패밀리의 구성원이다. GH61은 최근에 패밀리 AA9(보조 활성 패밀리 9)에 의해 재분류되었다. GH61은 셀룰라제의 일부인 것으로서 본원에서 사용된다. CBM33 (패밀리 33 카보하이드레이트-결합 모듈)은 LPMO이고(문헌[Isaksen et al ., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642]), CAZy는 AA10(보조 활성 패밀리 10)에서 최근에 재분류된 CBM33을 갖는다.
본원에서, 헤미셀룰라제는 헤미셀룰로스를 분해할 수 있거나 변형시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 다시 말해, 헤미셀룰라제는 자일란, 글루쿠로노자일란, 아라비노자일란, 글루코만난 및 자일로글루칸 중 하나 이상을 분해할 수 있거나 변형시킬 수 있다. 헤미셀룰로스를 분해할 수 있는 폴리펩티드는 헤미셀룰로스를 보다 작은 폴리사카라이드, 예를 들면, 올리고사카라이드로 부분적으로 분해하거나 당 단량체, 예를 들면, 헥소스 또는 펜토스 당 단량체로 완전히 분해하는 과정을 촉진할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 헤미셀룰라제는 헤미셀룰라제와 접촉될 때 올리고사카라이드와 당 단량체의 혼합된 집단을 발생시킬 수 있다. 이러한 분해는 전형적으로 가수분해 반응에 의해 일어날 것이다.
본원에서, 펙티나제는 펙틴을 분해할 수 있거나 변형시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 펙틴을 분해할 수 있는 폴리펩티드는 펙틴을 보다 작은 단위, 예를 들면, 올리고사카라이드로 부분적으로 분해하거나 당 단량체로 완전히 분해하는 과정을 촉진할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 펙티나제는 펙티나제와 접촉될 때 올리고사카라이드와 당 단량체의 혼합된 집단을 발생시킬 수 있다. 이 러한 분해는 전형적으로 가수분해 반응에 의해 일어날 것이다.
따라서, 본 발명의 조성물은 임의의 셀룰라제, 예를 들면, GH61, 셀로바이오하이드롤라제, 엔도-β-1,4-글루카나제, β-글루코시다제 또는 β-(1,3)(1,4)-글루카나제를 포함할 수 있다.
본원에서, 셀로바이오하이드롤라제(E C 3.2.1.91)는 셀룰로스 또는 셀로테트라오스에서 1,4-β-D-글루코사이드 연결의 가수분해를 촉진하여 쇄의 말단으로부터 셀로바이오스를 방출시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 셀룰라제 1,4-β-셀로바이오시다제, 1,4-β-셀로바이오하이드롤라제, 1,4-β-D-글루칸 셀로바이오하이드롤라제, 아비셀라제, 엑소-1,4-β-D-글루카나제, 엑소-셀로바이오하이드롤라제 또는 엑소-글루카나제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, 엔도-β-1,4-글루카나제(EC 3.2.1.4)는 셀룰로스, 리케닌 또는 곡물 β-D-글루칸에서 1,4-β-D-글루코사이드 연결의 내부 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 1,3-연결도 함유하는 β-D-글루칸에서 1,4-연결을 가수분해할 수도 있다. 이 효소는 셀룰라제, 아비셀라제, β-1,4-엔도글루칸 하이드롤라제, β-1,4-글루카나제, 카복시메틸 셀룰라제, 셀루덱스트리나제, 엔도-1,4-β-D-글루카나제, 엔도-1,4-β-D-글루카노하이드롤라제, 엔도-1,4-β-글루카나제 또는 엔도-글루카나제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, β-글루코시다제(EC 3.2.1.21)는 β-D-글루코스를 방출시키면서 말단 비-환원 β-D-글루코스 잔기의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 β-D-글루코사이드에 대한 넓은 특이성을 가질 수 있고 하기 물질들 중 하나 이상을 가수분해할 수도 있다: β-D-갈락토사이드, α-L-아라비노사이드, β-D-자일로사이드 또는 β-D-푸코사이드. 이 효소는 아미그달라제, β-D-글루코사이드 글루코하이드롤라제, 셀로비아제 또는 겐토비아제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, β-(1,3)(1,4)-글루카나제(EC 3.2.1.73)는 1,3-결합 및 1,4-결합을 함유하는 β-D-글루칸에서 1,4-β-D-글루코사이드 연결의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 리케닌 및 곡물 β-D-글루칸에 작용할 수 있으나, 1,3-결합 또는 1,4-결합만을 함유하는 β-D-글루칸에는 작용할 수 없다. 이 효소는 리케니나제, 1,3-1,4-β-D-글루칸-4-글루카노하이드롤라제, β-글루카나제, 엔도-β-1,3-1,4-글루카나제, 리케나제 또는 혼합된 연결 β-글루카나제로서 지칭될 수도 있다. 이러한 종류의 효소의 대체물은 엔도-1,3(4)-β-글루카나제로서 기재되어 있는 EC 3.2.1.6이다. 이러한 종류의 효소는 가수분해될 연결에 관여하는 환원 기를 갖는 글루코스 잔기 그 자체가 C-3에서 치환될 때 β-D -글루칸에서 1,3-연결 또는 1,4-연결을 가수분해한다. 대안적 명칭은 엔도-1,3-β-글루카나제, 라미나리나제, 1,3-(1,3;1,4)-β-D-글루칸-3(4)-글루카노하이드롤라제를 포함하고, 기질은 라미나린, 리케닌 및 곡물 β-D-글루칸을 포함한다.
본 발명의 조성물은 임의의 헤미셀룰라제, 예를 들면, 엔도자일라나제, β-자일로시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, α-D-글루쿠로니다제, 아세틸자일란 에스터라제, 페룰로일 에스터라제, 쿠마로일 에스터라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, β-만나나제 또는 β-만노시다제를 포함할 수 있다.
본원에서, 엔도자일라나제(EC 3.2.1.8)는 자일란에서 1,4-β-D-자일로사이드 연결의 내부 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 엔도-1,4-β-자일라나제 또는 1,4-β-D-자일란 자일라노하이드롤라제로서 지칭될 수도 있다. 대체물은 글루쿠로노아라 비노자일란에서 1,4-자일로사이드 연결을 가수분해할 수 있는 효소인 글루쿠로노아라비노자일란 엔도자일라나제(EC 3.2.1.136)이다.
본원에서, β-자일로시다제(EC 3.2.1.37)는 비-환원 말단으로부터 연속적인 D-자일로스 잔기를 제거하기 위해 1,4-β-D-자일란의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 효소는 자일로바이오스를 가수분해할 수도 있다. 이 효소는 자일란 1,4-β-자일로시다제, 1,4-β-D-자일란 자일로하이드롤라제, 엑소-1,4-β-자일로시다제 또는 자일로비아제로서 지칭될 수도 있 다.
본원에서, α-L-아라비노푸라노시다제(EC 3.2.1.55)는 α-L-아라비노푸라노사이드, (1,2)-연결, (1,3)-연결 및/또는 (1,5)-연결을 함유하는 α-L-아라비난, 아라비노자일란 및 아라비노갈락탄에 작용할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 α-N-아라비노푸라노시다제, 아라비노푸라노시다제 또는 아라비노시다제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, α-D-글루쿠로니다제(EC 3.2.1.1 39)는 하기 형태의 반응을 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다: α-D-글루쿠로노사이드 + H(2)O = 알코올 + D-글루쿠로네이트. 이 효소는 α-글루쿠로니다제 또는 α-글루코시두로나제로서 지칭될 수도 있다. 이 효소는 자일란에서 치환기로서 존재할 수도 있는 4-O-메틸화된 글루코론산을 가수분해할 수도 있다. 대체물은 α-1,2-(4-O-메틸)글루쿠로노실 연결의 가수분해를 촉진하는 자일란 α-1,2-글루쿠로노시다제(EC 3. 2.1.131)이다.
본원에서, 아세틸 자일란 에스터라제(EC 3.1.1.72)는 자일란 및 자일로-올 리고사카라이드의 탈아세틸화를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 중합체 자일란, 아세틸화된 자일로스, 아세틸화된 글루코스, α-나프틸 아세테이트 또는 p-니트로페닐 아세테이트로부터의 아세틸 기의 가수분해를 촉진할 수 있으나, 전형적으로 트라이아세틸글리세롤로부터의 아세틸 기의 가수 분해를 촉진하지 않는다. 이러한 폴리펩티드는 전형적으로 아세틸화된 만난 또는 펙틴에 작용하지 않는다.
본원에서, 페룰로일 에스터라제(EC 3.1.1.73)는 하기 형태의 반응을 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다: 페룰로일-사카라이드 + H2O = 페룰레이트 + 사카라이드. 이 사카라이드는 예를 들면, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 상기 사카라이드는 전형적으로 '천연' 기질에서 통상적으로 아라비노스인 에스터화된 당으로부터의 4-하이드록시-3-메톡시신나모일(페룰로일) 기의 가수분해를 촉진할 수 있다. p-니트로페놀 아세테이트 및 메틸 페룰레이트는 전형적으로 보다 약한 기질이다. 이 효소는 신나모일 에스터 하이드롤라제, 페룰산 에스터라제 또는 하이드록시신나모일 에스터라제로서 지칭될 수도 있다. 상기 효소는 자일라나제 및 펙티나제를 도와 식물 세포벽 헤미셀룰로스 및 펙틴을 분해할 수 있기 때문에 헤미셀룰라제 보조 효소로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, 쿠마로일 에스터라제(EC 3 .1.1.73)는 하기 형태의 반응을 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다: 쿠마로일-사카라이드 + H(2)O = 쿠마레이트 + 사카라이드. 이 사카라이드는 예를 들면, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 이 효소는 트랜스-4-쿠마로일 에스터라제, 트랜스-p-쿠마로일 에스터라제, p-쿠마로일 에스터라제 또는 p-쿠마르산 에스터라제로서 지칭될 수도 있다. 이 효소는 EC 3.1.1.73 내에도 속하므로, 페룰로일 에스터라제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, α-갈락토시다제(EC 3.2.1.22)는 갈락토스 올리고사카라이드, 갈락토만난, 갈락탄 및 아라비노갈락탄을 포함하는 α-D-갈락토사이드에서 말단 비-환원 α-D-갈락토스 잔기의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 α-D-푸코사이드를 가수분해할 수도 있다. 이 효소는 멜리비아제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23)는 β-D-갈락토사이드에서 말단 비-환원 β-D-갈락토스 잔기의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 α-L-아라비노사이드를 가수분해할 수도 있다. 이 효소는 엑소-(1->4)-β-D-갈락타나제 또는 락타제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, β-만나나제(EC 3.2.1.78)는 만난, 갈락토만난 및 글루코만난에서 1,4-β-D-만노사이드 연결의 무작위 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 만난 엔도-1,4-β-만노시다제 또는 엔도-1,4-만나나제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, β-만노시다제(EC 3.2.1.25)는 β-D-만노사이드에서 말단 비-환원 β-D-만노스 잔기의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 만나나제 또는 만나제로서 지칭될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 펙티나제, 예를 들면, 엔도-폴리갈락투로나제, 펙틴 메틸 에스터라제, 엔도-갈락타나제, β-갈락토시다제, 펙틴 아세틸 에스터라제, 엔도-펙틴라이아제(lyase), 펙테이트 라이아제, α-람노시다제, 엑소-갈락투로나제, 엑소-폴리갈락투로네이트 라이아제, 람노갈락투로난 하이드롤라제, 람노갈락투로난 라이아제, 람노갈락투로난 아세틸 에스터라제, 람노갈락투로난 갈락투로노하이드롤라제 또는 자일로갈락투로나제를 포함할 수 있다.
본원에서, 엔도-폴리갈락투로나제(EC 3.2.1.15)는 펙테이트 및 다른 갈락투로난에서 1,4-α-D-갈락토시두론 연결의 무작위 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 폴리갈락투로나제, 펙틴 데폴 리머라제, 펙티나제, 엔도-폴리갈락투로나제, 펙톨라제, 펙틴 하이드롤라제, 펙틴 폴리갈락투로나제, 폴리-α-1,4-갈락투로나이드 글리카노하이드롤라제, 엔도-갈락투로나제, 엔도-D-갈락투로나제 또는 폴리(1,4-α-D-갈락투로나이드) 글리카노하이드롤라제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, 펙틴 메틸 에스터라제(EC 3.1.1.11)는 하기 반응을 촉진할 수 있는 임의의 효소이다: 펙틴 + n H2O = n 메탄올 + 펙테이트. 상기 효소는 펙틴 에스터라제, 펙틴 데메톡실라제, 펙틴 메톡실라제, 펙틴 메틸에스터라제, 펙타제, 펙티노에스터라제 또는 펙틴 펙틸하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 엔도-갈락타나제(EC 3.2.1.89)는 아라비노갈락탄에서 1,4-β-D-갈락토사이드 연결의 내부가수 분해를 촉진할 수 있는 임의의 효소이다. 상기 효소는 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-갈락타나제, 갈락타나제, 아라비노갈락타나제 또는 아라비노갈락탄-4-β-D-갈락타노하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 펙틴 아세틸 에스터라제는 펙틴의 GalUA 잔기의 하이드록실 기에서 아세틸 기의 탈아세틸화를 촉진하는 아세틸 에스터라제 활성을 갖는 임의의 효소로서 본원에서 정의된다.
본원에서, 엔도-펙틴 라이아제(EC 4.2.2.10)는 비-환원 말단에서 4-데옥시 -6-O-메틸-α-D-갈락트-4-에누로노실 기를 갖는 올리고사카라이드를 제공하기 위한 (1→4)-α-D-갈락투로난 메틸 에스터의 제거 절단을 촉진할 수 있는 임의의 효소이다. 이 효소는 펙틴 라이아제, 펙틴 트랜스-엘리미나제, 엔도-펙틴 라이아제, 폴리메틸갈락투론산 트랜스엘리미나제, 펙틴 메틸트랜스엘리미나제, 펙토라이아제, PL, PNL 또는 PMGL, 또는 (1→4)-6-O-메틸-α-D-갈락투로난 라이아제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 펙테이트 라이아제(EC 4.2.2.2)는 비-환원 당에서 4-데옥시-α-D-갈락트-4-에누로노실 기를 갖는 올리고사카라이드를 제공하기 위한 (1,4)-α-D-갈락투로난의 제거 절단을 촉진할 수 있는 임의의 효소이다. 상기 효소는 폴리갈락투론산 트랜스엘리미나제, 펙틴산 트랜스엘리미나제, 폴리갈락투로 네이트라이아제, 엔도-펙틴 메틸트랜스엘리미나제, 펙테이트 트랜스엘리미나제, 엔도-갈락투로네이트 트랜스엘리미나제, 펙트산 라이아제, α-1,4-D-엔도-폴리갈락투론산 라이아제, PGA 라이아제, PPase-N, 엔도-α-1,4-폴리갈락투론산 라이아제, 폴리갈락투론산 라이아제, 펙틴 트랜스엘리미나제, 폴리갈락투론산 트랜스엘리미나제 또는 (1→4)-α-D-갈락투로난 라이아제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, α-람노시다제(EC 3.2.1.40)는 α-L-람노사이드 또는 대안적으로 람노갈락투로난에서 말단 비-환원 α-L-람노스 잔기의 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 α-L-람노시다제 T, α-L-람노시다제 N 또는 α-L-람노사이드 람노하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 엑소-갈락투로나제(EC 3.2.1.82)는 비-환원 말단으로부터 펙트산을 가수분해하여 다이갈락투로네이트를 방출시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 엑소-폴리-α-갈락투로노시다제, 엑소-폴리갈 락투로노시다제 또는 엑소-폴리갈락투라노시다제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 엑소-갈락투로나제(EC 3.2.1.67)는 하기 반응을 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다: (1,4-α-D-갈락투로나이드)n + H2O = (1,4-α-D-갈락투로나이드)n-1 + D-갈락투로네이트. 상기 효소는 갈락투란-1,4-α-갈락투로니다제, 엑소-폴리갈락투로나제, 폴리(갈락투로네이트) 하이드롤라제, 엑소-D-갈락투로나제, 엑소-D-갈락투로나나제, 엑소-폴리-D-갈락투로나제 또는 폴리(1,4-α-D-갈락투로나이드) 갈락투로노하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 엑소폴리갈락투로네이트 라이아제(EC 4.2.2.9)는 펙테이트, 즉, 탈에스터화된 펙틴의 환원 말단으로부터의 4-(4-데옥시-α-D-갈락트-4-에누로노실)-D-갈락투로네이트의 제거 절단을 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 펙테이트 다이사카라이드 라이아제, 펙테이트 엑소-라이아제, 엑소펙트산 트랜스엘리미나제, 엑소펙테이트 라이아제, 엑소폴리갈락투론산-트랜스-엘리미나제, PATE, 엑소-PATE, 엑소-PGL 또는 (1→4)-α-D-갈락투로난 환원-말단-다이사카라이드 라이아제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, 람노갈락투로난 하이드롤라제는 다이사카라이드[(1,2-α-L-람노일-(1,4)-α-갈락토실유론산]로 구성된, 엄격히 교대로 존재하는 람노갈락투로난 구조물에서 갈락토실유론산과 람노피라노실 사이의 연결을 엔도 방식으로 가수분해할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다.
본원에서, 람노갈락투로난 라이아제는 람노갈락투로난에서 β-제거를 통해 엔도 방식으로 α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA 연결을 절단할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다.
본원에서, 람노갈락투로난 아세틸 에스터라제는 람노갈락투로난에서 교대로 존재하는 람노스 및 갈락투론산 잔기로 구성된 골격의 탈아세틸화를 촉진하는 임의의 폴리펩티드이다.
본원에서, 람노갈락투로난 갈락투로노하이드롤라제는 엄격히 교대로 존재하는 람노갈락투로난 구조물의 비-환원 말단으로부터 갈락투론산을 엑소 방식으로 가수분해할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다.
본원에서, 자일로갈락투로나제는 엔도 방식으로 β-자일로스 치환된 갈락투론산 골격을 절단함으로써 자일로갈락투로난에 작용하는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 자일로갈락투로난 하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본원에서, α-L-아라비노푸라노시다제(EC 3.2.1.55)는 α-L-아라비노푸라노사이드, (1,2)-연결, (1,3)-연결 및/또는 (1,5)-연결을 함유하는 α-L-아라비난, 아라비노자일란 및 아라비노갈락탄에 작용할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 이 효소는 α-N-아라비노푸라노시다제, 아라비노푸라노시다제 또는 아라비노시다제로서 지칭될 수도 있다.
본원에서, 엔도-아라비나나제(EC 3.2.1.99)는 1,5-아라비난에서 1,5-α-아라비노푸라노사이드 연결의 내부 가수분해를 촉진할 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 상기 효소는 엔도-아라비나제, 아라비난 엔도-1,5-α-L-아라비노시다제, 엔도-1,5-α-L-아라비나나제, 엔도-α-1,5-아라바나제, 엔도-아라바나제 또는 1,5-α-L-아라비난 1,5-α-L-아라비나노하이드롤라제로서도 공지되어 있을 수 있다.
본 발명의 조성물은 전형적으로 2종 이상의 셀룰라제, 및 임의적으로 1종 이상의 헤미셀룰라제 및 임의적으로 1종 이상의 펙티나제(이들 중 하나는 본 발명에 따른 폴리펩티드임)를 포함할 것이다. 본 발명의 조성물은 GH61, 셀로바이오하이드롤라제, 엔도-글루카나제 및/또는 β-글루코시다제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 1종 이상의 헤미셀룰라제 및/또는 1종 이상의 펙티나제를 포함할 수도 있다.
추가로, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 리그니나제, 헥소실트랜스퍼라제, 글루쿠로니다제, 엑스팬신(expansin), 셀룰로스 유도된 단백질, 셀룰로스 삽입 단백질 및 유사 단백질 중 1종 이상(예를 들면, 2종, 3종, 4종 또는 전부)이 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다(이들은 상기 보조 활성으로서 지칭됨).
"프로테아제"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소(펩티다제)뿐만 아니라 펩티드와 다른 모이어티, 예컨대, 당 사이의 결합을 가수분해하는 효소(글리코펩티다제)도 포함한다. 많은 프로테아제들이 EC 3.4 하에서 특징규명되어 있고, 본원에서 참고로 도입되는 발명에서 사용되기에 적합하다. 일부 특정 종류의 프로테아제들은 시스테인 프로테아제(펩신을 포함함), 파파인 및 세린 프로테아제(카이모트립신, 카복시펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제를 포함함)를 포함한다.
"리파제"는 지질, 지방산 및 아실글리세라이드(포스포글리세라이드, 지단백질 및 다이아실글리세롤 등을 포함함)를 가수분해하는 효소를 포함한다. 식물에서, 지질은 수분 손실 및 병원체 감염을 한정하기 위한 구조적 성분으로서 사용된다. 이 지질은 지방산으로부터 유도된 왁스뿐만 아니라 쿠틴(cutin) 및 수베린(suberin)도 포함한다.
"리그니나제"는 리그닌 중합체의 구조를 가수분해할 수 있거나 분해할 수 있는 효소를 포함한다. 리그닌을 분해할 수 있는 효소는 리그닌 퍼록시다제, 망간 퍼록시다제, 락카제(laccase) 및 페룰로일 에스터라제, 및 리그닌 중합체를 탈중합시키거나 다른 방식으로 분해하는 것으로 당분야에서 공지되어 있는 다른 효소를 포함한다. 헤미셀룰로스 당(특히, 아라비노스)과 리그닌 사이에 형성된 결합을 가수분해할 수 있는 효소도 포함된다. 리그니나제는 하기 효소 군을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 리그닌 퍼록시다제(EC 1.11.1.14), 망간 퍼록시다제(EC 1.11.1.13), 락카제(EC 1.10.3.2) 및 페룰로일 에스터라제(EC 3.1.1.73).
"헥소실트랜스퍼라제"(2.4.1-)는 트랜스퍼라제 반응을 촉진할 수 있으나, 예를 들면, 셀룰로스 및/또는 셀룰로스 분해 생성물의 가수분해 반응도 촉진할 수 있는 효소를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 헥소실트랜스퍼라제의 일례는 β-글루카노실트랜스퍼라제이다. 이러한 효소는 (1,3)(1,4)글루칸, 셀룰로스 및/또는 셀룰로스 분해 생성물의 분해를 촉진할 수 있다.
"글루쿠로니다제"는 알코올을 생성하기 위한 글루코로노사이드, 예를 들면, β-글루쿠로노사이드의 가수분해를 촉진하는 효소를 포함한다. 많은 글루쿠로니다제들, 예를 들면, β-글루쿠로니다제(EC 3.2.1.31), 하이알루로노-글루쿠로니다제(EC 3.2.1.36), 글루쿠로노실-다이설포글루코사민 글루쿠로니다제(3.2.1.56), 글리시리지네이트 β-글루쿠로니다제(3.2.1.128) 또는 α-D-글루쿠로니다제(EC 3.2.1.139)가 특징규명되어 있고 본 발명에서 사용되기에 적합할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 조성물은 엑스팬신 또는 엑스팬신 유사 단백질, 예컨대, 스왈레닌(swollenin)(문헌(Sal heimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) 참조) 또는 스왈레닌 유사 단백질을 포함할 수 있다.
엑스팬신은 식물 세포 생장 동안 세포벽 구조가 느슨해지는 것에 관여한다. 엑스팬신은 가수분해 활성을 갖지 않으면서 셀룰로스와 다른 세포벽 폴리사카라이드 사이의 수소결합을 파괴하는 것으로 제안되어 있다. 이 방식으로, 엑스팬신은 셀룰로스 섬유의 미끄러짐 및 세포벽의 확장을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 엑스팬신 유사 단백질인 스왈레닌은 N-말단 탄수화물 결합 모듈 패밀리 1 도메인(C BD) 및 C-말단 엑스팬신 유사 도메인을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 엑스팬신 유사 단백질 또는 스왈 레닌 유사 단백질은 이러한 도메인들 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있고/있거나, 임의적으로 검출가능한 양의 환원 당을 생성하지 않으면서 세포벽의 구조를 파괴(예컨대, 셀룰로스 구조를 파괴)할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 조성물은 셀룰로스 유도된 단백질, 예를 들면, cip1 또는 cip2 유전자 또는 유사 유전자의 폴리펩티드 생성물(문헌(Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31 988-31997, 2003) 참조), 셀룰로스/셀룰로좀 삽입 단백질, 예를 들면, cipA 또는 cipC 유전자의 폴리펩티드 생성물, 또는 스카폴딘(scaffoldin) 또는 스카폴딘 유사 단백질을 포함할 수 있다. 스카폴딘 및 셀룰로스 삽입 단백질은 셀룰로스분해 하위단위를 다중-효소 복합체로 조직화할 수 있는 다중-기능 삽입 하위 단위이다. 이것은 2개의 상보적인 부류의 도메인, 즉 스카폴딘 상의 점착 도메인과 각각의 효소 단위 상의 독케린(dockerin) 도메인의 상호작용에 의해 달성된다. 스카폴딘 하위단위는 셀룰로좀과 그의 기질의 부착을 매개하는 셀룰로스 결합 모듈(CBM)도 보유한다. 본 발명의 목적을 위한 스카폴딘 또는 셀룰로스 삽입 단백질은 이러한 도메인들 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 조성물은 또한 카탈라제를 포함할 수 있다. 용어 "카탈라제"는 2개의 수소-과산화물을 산소 및 2개의 물로 전환함을 촉진하는 수소-과산화물:수소-과산화물 산화환원효소(EC 1.11.1.6 또는 EC 1.11.1.21)를 의미한다. 카탈라제 활성은 하기 반응식에 기초하여 240 nm에서 수소-과산화물의 분해를 모니터링하여 측정될 수 있다: 2H2O2 → 2H2O + O2. 상기 반응은 25℃에서 10.3 mM 기질(H202) 및 ml 당 대략 100 단위의 효소를 갖는 50 mM 포스페이트(pH 7.0)에서 수행된다. 흡광도는 16 내지 24 초 이내에 분광 측정법을 사용하여 모니터링되고, 이는 0.45로부터 0.4까지 흡광도 감소에 상응하여야 한다. 1개의 카탈라제 활성 단위는 pH 7.0 및 25℃에서 분 당 분해된 H202의 1개 분자로서 표현될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 상기 언급된 효소 부류들 각각의 구성원, 한 효소 부류의 여러 구성원들, 이들 효소 부류들 또는 헬퍼 단백질들의 임의의 조합물(즉, 그 자체로 효소 활성을 갖지 않지만 그럼에도 불구하고 리그노셀룰로스 분해를 보조하는 본원에서 언급된 단백질)로 구성될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 (1) 상업적 공급처; (2) 효소를 발현하는 클로닝된 유전자; (3) 복합 브로쓰, 예컨대, 배지에서 미생물 균주의 생장으로부터 생성된 브로쓰(이때, 상기 균주는 단백질 및 효소를 배지 내로 분비함); (4) 상기 (3)에서와 같이 생장된 균주의 세포 용해물; 및/또는 (5) 효소를 발현하는 식물 물질로부터 유래된 효소로 구성될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 상이한 효소는 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
효소는 미생물, 효모, 진균, 세균 또는 식물에서 외생적으로 생성된 후, 단리되고 예를 들면, 리그노셀룰로스 공급원료에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 효소는 생성되지만 단리되지 않고, 미정제 세포 물질 발효 브로쓰 또는 식물 물질(예컨대, 옥수수대 또는 밀짚) 등이 예를 들면, 공급원료에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 미정제 세포 물질 또는 효소 생성 배지 또는 식물 물질이 추가 미생물 생장을 방해하도록 (예를 들면, 가열 또는 항균제의 첨가에 의해) 처리된 후, 예를 들면, 공급원료에 첨가될 수 있다. 이 미정제 효소 혼합물은 효소를 생성하는 유기체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소는 효소를 생성하는 유기체에게 영양을 공급하기 위해 (전처리된) 공급원료(예컨대, 옥수수대 또는 밀짚)를 사용하는 발효에서 생성될 수 있다. 이 방식으로, 효소를 생성하는 식물은 그 자체가 리그노셀룰로스 공급원료로서 사용될 수 있고 리그노셀룰로스 공급원료 내로 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 용도 및 방법에서, 전술된 조성물의 성분들은 동시에(즉, 그 자체로 단일 조성물로서) 제공될 수 있거나, 별도로 또는 순차적으로 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명은 전술된 조성물이 사용되는 방법, 및 산업적 공정에서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 효소 조성물은 진균의 전체 발효 브로쓰의 형태로 존재한다. 일 실시양태에서, 효소 조성물은 하기 기재된 바와 같이 전체 발효 브로쓰일 수 있다. 전체 발효 브로쓰는 비-재조합 및/또는 재조합 사상 진균의 발효로부터 제조될 수 있다. 일 실시양태에서, 사상 진균은 사상 진균에 동종 또는 이종일 수 있는 유전자를 하나 이상 포함하는 재조합 사상 진균이다. 일 실시양태에서, 사상 진균은 하나 이상의 유전자가 셀룰로스 기질을 분해할 수 있는 효소를 암호화하는 사상 진균에 동종 또는 이종일 수 있는 유전자를 하나 이상 포함하는 재조합 사상 진균이다. 전체 발표 브로쓰는 임의의 폴리펩티드 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 효소 조성물은 세포를 죽이는 전체 발효 브로쓰이다. 전체 발효 브로쓰는 유기 산(세포를 죽이기 위해 사용됨), 죽은 세포 및/또는 세포 잔해, 및 배양 배지를 함유할 수 있다.
일반적으로, 사상 진균은 셀룰로스 기질을 가수분해할 수 있는 효소의 생성에 적합한 세포 배양 배지에서 배양된다. 배양은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 탄소 및 질소 공급원, 및 무기 염을 포함하는 적합한 영향 배지 중에 발생한다. 적합한 배양 배지, 온도 범위 및 생장에 적합한 다른 조건, 및 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제 및/또는 펙티나제 생성은 당해 분야에 공지되어 있다. 전체 발효 브로쓰는 사상 진균을 정지상에 생장시키고 상기 사상 진균을 탄소를 제한하는 조건 하에서 하나 이상의 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제 및/또는 펙티나제를 발현시키기에 충붕한 시간 동안 유지하여 제조할 수 있다. 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제 및/또는 펙티나제와 같은 효소가 사상 진균에 의해 발표 배지로 분비되자마자, 전체 발효 브로쓰를 사용할 수 있다. 본 발명의 전체 발효 브로쓰는 사상 진균을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 발효의 마지막에 유래된 발효 물질의 분별되지 않은 내용물을 포함한다. 전형적으로, 전체 발효 브로쓰는 탄소-제한 조건 하에서 항온처리하여 단백질 합성을 허용하는 포화 상태(특히, 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제 및/또는 펙티나제의 발현)로 생장한 후 존재하는 폐 배양물 및 세포 잔해를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 폐 세포 배양 배지, 세포외 효소 및 사상 진균을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰에 존재하는 사상 진균은, 세포를 죽이는 전체 발효 브로쓰의 생성을 위해 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 용해되거나 침투되거나 죽는다. 일 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 세포를 죽이는 전체 발효 브로쓰이고, 이때 사상 진균을 함유하는 전체 발효 브로쓰는 세포를 용해하거나 죽인다. 일부 실시양태에서, 사상 진균 발효의 세포를 죽이는 전체 브로쓰를 생성하기 위해 화학적 및/또는 pH 처리에 의해 사상 진균을 용해함으로써 세포를 죽인다. 일부 실시양태에서, 사상 진균을 화학적 및/또는 pH 처리에 의해 용해하고 세포를 죽이는 발효 믹스의 pH를 적합한 pH로 조정하여 세포를 죽인다. 일 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 1개 이상(1 내지 5개)의 탄소 유기 산 및 이의 염을 포함하는 제 1 유기 산 성분 및 6개 이상의 탄소 유기 산 및/또는 이의 염을 포함하는 제 2 유기 산 성분을 포함한다. 일 실시양태에서, 제 1 유기 산 성분은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 이의 염, 또는 이의 임의의 조합이고, 제 2 유기 산 성분은 벤조산, 사이클로헥산카복실산, 4-메틸발레르산, 페닐아세트산, 이의 염, 또는 이의 임의의 조합이다.
본원에 사용된 용어 "전체 발효 브로쓰"는 회수 및/또는 정제를 전혀 하지 않거나 최소로 진행하는 세포 발효에 의해 생성된 제제를 지칭한다. 예를 들면, 전체 발효 브로쓰는, 미생물 배양이 포화 상태까지 생장되고, 탄소-제한 조건 하에서 항온처리하여 단백질 합성(예를 들면, 숙주 세포에 의한 효소의 발현) 및 세포 배양 배지로 분비를 허용할 때 생성된다. 전형적으로, 전체 발효 브로쓰는 분별되지 않고 폐 세포 배양 배지, 세포외 효소, 및 미생물의, 바람직하게는 생존할 수 없는 세포를 포함한다.
필요한 경우, 전체 발효 브로쓰는 분별될 수 있고, 분별된 내용물 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 예를 들면, 죽은 세포 및/또는 세포 잔해는 전체 발효 브로쓰로부터 제거되어 이러한 성분이 없는 조성물을 제공할 수 있다.
전체 발효 브로쓰는 추가로 보존제 및/또는 항-미생물제를 포함할 수 있다. 상기 보존제 및/또는 제제는 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 기재된 전체 발효 브로쓰는 전형적으로 액체이지만, 불용성 성분, 예컨대 죽은 세포, 세포 잔해, 배양 배지 성분 및/또는 불용성 효소를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불용성 성분은 제거되어 정화된 전체 발효 브로쓰를 제공할 수 있다.
일 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 내생적으로 발현되지 않거나, 사상 진균에 의해 비교적 적은 수준으로 발현되는 하나 이상의 효소 활성으로 보충되어 셀룰로스 기질, 예를 들면, 발효성 당, 예컨대 글루코스 또는 자일로스의 분해를 개선시킬 수 있다. 보충 효소는 보충물로서 전체 발효 브로쓰에 첨가될 수 있고, 상기 효소는 별도의 전체 발효 브로쓰의 성분일 수 있거나, 정제될 수 있거나, 최소로 회수되고/되거나 정제될 수 있다.
일 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 셀룰로스 기질의 분해를 개선시키기 위해 하나 이상의 효소를 과발현하는 재조합 사상 진균의 발효의 전체 발효 브로쓰를 포함한다. 다르게는, 전체 발효 브로쓰는 비-재조합 사상 진균 및 셀룰로스 기질의 분해를 개선시키기 위해 하나 이상의 효소를 과발현하는 재조합 사상 진균의 발효의 전체 발효 브로쓰의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 전체 발효 브로쓰는 β-글루코시다제를 과발현하는 사상 진균의 발효의 전체 발효 브로쓰를 포함한다. 다르게는, 본 발명의 방법 및 반응성 조성물에 사용하기 위한 전체 발효 브로쓰는 비-재조합 사상 진균의 발효의 전체 발효 브로쓰 및 β-글루코시다제를 과발현하는 재조합 사상 진균의 발효의 전체 발효 브로쓰의 혼합물을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 리그노셀룰로스 물질로부터 당 생성물의 제조 방법은 (a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질의 전처리 단계, (b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질의 세척 단계, (c) 효소 조성물을 발현시키는 조건 하에서 진균을 배양함으로써 적어도 LPMO를 포함하는, 2종 이상의 셀룰라제를 포함하는 효소 조성물을 생성하는 단계, (d) 상기 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하는 단계, 및 (e) 임의적으로, 글루코스-함유 조성물을 회수하는 단계를 포함하고, 이때, 적당량의 산소를 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 가수분해된 산화 생성물인 글루콘산, 알돈산 및/또는 같은자리 다이올, 더욱 바람직하게는 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 110 g으로 유지한다.
일 실시양태에서, 리그노셀룰로스 물질로부터 발효 생성물의 제조하는 방법은 (a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질의 전처리 단계, (b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질의 세척 단계, (c) 효소 조성물을 발현시키는 조건 하에서 균주를 배양함으로써 적어도 LPMO를 포함하는, 2종 이상의 셀룰라제를 포함하는 효소 조성물의 생성 단계, (d) 상기 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질의 효소적 가수분해 단계, (e) 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계, 및 (f) 임의적으로, 발효 생성물을 회수하는 단계를 포함하고, 이때 적당량의 산소를 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 가수분해된 산화 생성물인 글루콘산, 알돈산 및/또는 같은자리 다이올, 더욱 바람직하게는 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 110 g으로 유지한다.
상기 나타낸 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 진균은 사상 진균이고, 바람직하게는 진균은 라삼소니아 또는 아스퍼길러스 속에 속한다. 일 실시양태에서, 진균의 배양은 호기성 조건 하에서 수행된다. 당업자는 예를 들면, 교반 탱크 및 발포 컬럼과 같은 호기성 배양기에 대한 발효기 디자인을 잘 인지할 것이다. 일반적으로, 진균은 관심 효소 조성물의 생성에 적합한 세포 배양 배지에서 배양된다. 배양기는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 발생한다. 적합한 배양 배지, 온도 범위, 및 생장 및 효소 생성에 적합한 다른 조건은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 예는 본원에 기재된다. 효소 조성물은 진균을 정지상에서 생장시키고 효소를 발현시키기에 충분한 시간 동안 탄소를 제한 조건 하에서 진규을 유지함으로써 제조될 수 있다. 관심 효소가 진균에 의해 발효 배지로 분비되자마자, 효소 조성물이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 효소 조성물을 발현시키는 조건 하에서 진균을 배양함으로써 적어도 LPMO를 포함하는, 2종 이상의 셀룰라제를 포함하는 효소 조성물을 생성하는 단계는 진균을 번식시키기 위한 방법에 의해 진행될 수 있다. 번식은 쉐이크 플라스크, 작은 용기 및 큰 용기에서 여러 단계를 포함할 수 있다.
리그노셀룰로스 물질
본원의 리그노셀룰로스 물질은 임의의 리그노셀룰로스 및/또는 헤미셀룰로스 물질을 포함한다. 본 발명에서 공급원료로서 사용되기에 적합한 리그노셀룰로스 물질은 생체물질, 예를 들면, 순수 생체물질 및/또는 비-순수 생체물질, 예컨대, 농업 생체물질, 상업적 유기물, 구축 및 파괴 잔해, 자치도시 고체 폐기물, 폐지 및 구내 폐기물을 포함한다. 흔한 형태의 생체물질은 나무, 관목 및 잔디, 밀, 밀짚, 밀짚 줄기, 사탕수수 찌꺼기, 수수, 억새, 에너지 줄기, 옥수수, 옥수수대, 옥수수 껍질, 옥수수 속대, 캐놀라 줄기, 대두 줄기, 사탕기장, 옥수수 알(알로부터의 섬유를 포함함), 곡물, 예컨대, 옥수수, 밀 및 보리의 제분(습식 제분 및 건식 제분을 포함함)으로부터의 생성물 및 부산물(종종 "겨 또는 섬유"로서 지칭됨)뿐만 아니라, 자치도시 고체 폐기물, 폐지 및 구내 폐기물도 포함한다. 생체물질은 초본 물질, 농업 잔류물, 임업 잔류물, 자치도시 고체 폐기물, 폐지, 및 펄프 및 종이 제분 잔류물일 수도 있으나 이들로 한정되지 않는다. "농업 생체물질"은 가지, 덤불, 줄기, 옥수수 및 옥수수 껍질, 에너지 작물, 숲, 과일, 꽃, 곡물, 잔디, 초본 작물, 잎, 나무껍질, 솔잎, 통나무, 뿌리, 묘목, 짧은 회전 목재 작물, 관목, 수수, 나무, 채소, 과일 껍질, 포도나무, 사탕무 펄프, 밀 분쇄 물, 오트 겉껍질, 및 경질 및 연질 목재(유해한 물질을 갖는 목재를 포함하지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 농업 생체물질은 농사 및 임업 활동을 포함하는 농업 과정으로부터 발생된 유기 폐기 물질(구체적으로, 산림 목재 폐기물을 포함함)을 포함한다. 농업 생체물질은 단독으로 존재하거나 임의의 조합물 또는 혼합물로 존재하는 상기 언급된 물질들 중 임의의 물질일 수 있다.
셀룰로스는 D-글루코스 단위에 연결된 수백 개 내지 만 개 이상의 β(1→4)의 직쇄로 이루어진 폴리사카라이드인, 화학식 (C6H10O5)n의 유기 화합물이다. 글루칸 분자는 글리코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코스 단량체의 폴리사카라이드이다. 본원에서 글루칸 및 셀룰로스는 글리코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코스 단량체의 폴리사카라이드에 대하여 상호교환적으로 사용된다. 글루칸 또는 폴리사카라이드 조성물의 정량 분석을 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되고 기재되어 있고 예를 들면 문헌[Carvalho de Souza et al.,Carbohydrate Polymers 95 (2013) 657-663]에 요약되어 있다. 일반적으로, 글루칸의 50 내지 70%는 결정질 셀룰로스이고, 나머지는 무정형 셀룰로스이다.
전처리
본 발명에 사용된 리그노셀룰로스 물질은 세척되고/되거나 전처리될 수 있다. 임의적으로, 공급원료는 효소적 가수분해에의 기질의 접근성을 향상시키고/ 시키거나, 헤미셀룰로스를 가수분해하고/하거나 헤미셀룰로스, 셀룰로스 및/또는 리그닌을 가용화시키기 위해 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방식으로 열, 기계적 및/또는 화학적 변형, 또는 이러한 방법들의 임의의 조합에 의해 전처리될 수 있다. 일 실시양태에서, 전처리는 증기 폭발, 고온수 처리, 또는 묽은 산 또는 묽은 염기를 사용한 처리로 리그노셀룰로스를 처리함으로써 수행된다.
일 실시양태에서, 리그노셀룰로스 물질은 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 전처리된다. 전처리 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 비제한적으로 열 변형, 기계적 변형, 화학적 변형, 생물학적 변형 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 전처리는 전형적으로 효소적 가수분해에 대한 리그노셀룰로스 물질의 접근성을 강화시키기 위해 및/또는 리그노셀룰로스 물질 중에 헤미셀룰로스를 가수분해하고/하거나 헤미셀룰로스 및/또는 셀룰로스 및/또는 리그닌을 용해하기 위해 수행된다. 일 실시양태에서, 전처리는 증기 폭발, 고온수 처리, 또는 묽은 산 또는 묽은 염기를 사용한 처리로 리그노셀룰로스 물질을 처리함을 포함한다. 전처리 방법의 예는 비제한적으로, 증기 처리(예를 들면, 100 내지 260℃에서, 7 내지 45 바의 압력에서, 중성 pH에서, 1 내지 10 분 동안 처리), 묽은 산 처리(예를 들면, 증기의 존재 또는 부재 하에, 120 내지 200℃에서, 2 내지 15 바의 압력에서, 산성 pH에서, 2 내지 30 분 동안 0.1 내지 5% H2SO4 및/또는 SO2 및/또는 HNO3 및/또는 HCl로 처리), 유기용매 처리(예를 들면, 유기 용매 및 증기의 존재 또는 부재 하에, 160 내지 200℃에서, 7 내지 30 바의 압력에서, 산성 pH에서, 30 내지 60 분 동안 1 내지 1.5% H2SO4로 처리), 석회 처리(예를 들면, 물/증기의 존재 하에, 60 내지 160℃에서, 1 내지 10 바의 압력에서, 알칼리 pH에서, 60 내지 4800 분 동안 0.1 내지 2% NaOH/Ca(OH)2로 처리), ARP 처리(예를 들면, 150 내지 180℃에서, 9 내지 17 바의 압력에서, 알칼리 pH에서, 10 내지 90 분 동안 5 내지 15% NH3으로 처리), AFEX 처리(예를 들면, 60 내지 140℃에서, 8 내지 20 바의 압력에서, 알칼리 pH에서, 5 내지 30 분 동안 15% 초과의 NH3으로 처리)를 포함한다.
세척 단계
임의적으로, 본 발명에 따른 방법은 세척 단계를 포함한다. 임의적인 세척 단계는 발효 단계를 위해 억제제로서 작용할 수 있는 수용성 화합물을 제거하기 위해 이용될 수 있다. 세척 단계는 공지 되어 있는 방식으로 수행될 수 있다.
리그노셀룰로스 물질은 세척될 수 있다. 일 실시양태에서, 리그노셀룰로스 물질은 전처리 후 세척될 수 있다. 세척 단계를 발효 및/또는 가수분해 단계에서 억제제로서 작용할 수 있는 수용성 화합물을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 세척 단계는 당업자에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 세척 후, 다른 해독 방법이 존재한다. 전처리된 리그노셀룰로스 물질은 또한 비제한적으로, 고체/액체 분리, 진공 증발, 추출, 흡수, 중성화, 과석회화, 환원제의 첨가, 해독 효소, 예컨대 라카제 또는 퍼옥시다제의 첨가, 가수분해물을 해독할 수 있는 미생물의 첨가를 포함하는 이러한 방법 중 임의의 방법(또는 임의의 조합)에 의해 해독될 수 있다.
효소적 가수분해
본 발명의 방법에서 사용되는 효소 조성물은 유용한 생성물, 예컨대, 에탄올, 생체기체, 부탄올, 젖산, 플라스틱, 유기 산, 용매, 동물 사료 보충제, 약제, 비타민, 아미노산, 효소 또는 화학적 공급원료로 나중에 추가로 전환될 수 있는 리그노셀룰로스분해 물질, 예를 들면, 옥수수대, 밀짚, 밀짚 줄기 및/또는 옥수수 줄기 찌꺼기를 매우 효율적으로 가수분해할 수 있다. 추가로, 가수분해 후 공정으로부터의 중간 생성물, 예를 들면, 생체기체 생성에서의 중간체인 젖산은 다른 물질을 위한 구축 블록으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 에탄올의 생성으로 예시되지만, 이것은 한정으로서 수행되기보다는 오히려 예시만으로서 수행되고, 다른 언급된 유용한 생성물이 동등하게 잘 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 효소적 가수분해 단계를 포함한다. 효소적 가수분해는 공급원료의 액화를 목적으로 하는 가수분해, 및 공급원료로부터 당을 방출시키는 것을 목적으로 하는 가수분해, 또는 이들 둘 다를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이 단계에서, 임의적으로 전처리되고 임의적으로 세척된 리그노셀룰로스 물질은 본 발명에 따른 효소 조성물과 접촉한다. 리그노셀룰로스 물질 및 전처리에 따라, 당으로의 리그노셀룰로스의 원하는 전환을 달성하기 위해 상이한 반응 조건, 예를 들면, 온도, 효소 용량, 가수분해 반응 시간 및 건조 물질 농도가 당업자에 의해 채택될 수 있다. 일부 조건은 이하에 제공되어 있다.
일 실시양태에서, 효소적 가수분해는 리그노셀룰로스 물질이 적어도 제 1 용기에서 가수분해되는 적어도 액화 단계 및 액화된 리그노셀룰로스 물질이 적어도 제 1 용기에서 및/또는 적어도 제 2 용기에서 가수분해되는 당화 단계를 포함한다. 당화는 액화와 같이 동일한 용기에서 수행될 수 있고(즉, 적어도 제 1 용기), 이는 또한 별도의 용기에서 수행될 수 있다(즉, 적어도 제 2 용기). 따라서, 본 발명에 따른 방법의 효소적 가수분해에서, 액화 및 당화는 혼합될 수 있다. 다르게는, 액화 및 당화는 별도의 단계일 수 있다. 액화 및 당화는 상이한 온도에서 수행될 수 있지만, 또한 단일 온도에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 액화 온도는 당화 온도보다 높다. 액화는 바람직하게는 60 내지 75℃의 온도에서 수행되고, 당화는 바람직하게는 50 내지 65℃의 온도에서 수행된다.
효소적 가수분해에 사용된 효소는 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 첨가될 수 있다. 효소적 가수분해가 액화 단계 및 당화 단계를 포함하는 경우, 추가 효소는 액화 단계 동안 및/또는 후 첨가될 수 있다. 추가 효소는 당화 단계 전 및/또는 동안 첨가될 수 있다. 추가 효소는 또한 당화 단계 후 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 가수분해는 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상 또는 70℃ 이상의 온도에서 수행된다. 가수분해 동안 높은 온도는 효소 조성물의 최적 온도에서의 작동, (세균) 오염의 위험 감소, 감소된 점성, 요구된 냉각수의 보다 적은 양, 보다 높은 온도를 갖는 냉각수의 사용, 효소의 재사용 등을 포함하는 많은 장점을 갖는다.
효소적 가수분해에 사용된 하나 이상의 용기에서 리그노셀룰로스 물질의 점도는 10 내지 4000 cP, 10 내지 2000 cP, 바람직하게는 10 내지 1000 cP로 유지된다.
액화 단계 및 당화 단계를 포함하는 효소적 가수분해를 포함하는 방법의 경우, 액화 단계에서 리그노셀룰로스 물질의 점도는 10 내지 4000 cP, 10 내지 2000 cP, 바람직하게는 10 내지 1000 cP로 유지되고/되거나 당화 단계에서 리그노셀룰로스 물질의 점도는 10 내지 1000 cP, 10 내지 900 cP, 바람직하게는 10 내지 800 cP로 유지된다.
점도는 가수분해를 위해 사용된 온도에서 브룩필드(Brookfield) DV III 레오미터(Rheometer)로 측정될 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 첨가되는 효소 조성물의 양(본원에서 효소 용량 또는 효소 적재량으로서도 지칭됨)은 낮다. 일 실시양태에서, 효소의 양은 건조 물질 중량 g 당 6 mg 이하의 단백질, 건조 물질 중량 g 당 5 mg 이하의 단백질, 건조 물질 중량 g 당 4 mg 이하의 단백질, 건조 물질 중량 g 당 3 mg 이하의 단백질, 건조 물질 중량 g 당 2 mg 이하의 단백질, 또는 건조 물질 중량 g 당 1 mg 이하의 단백질이다. 일 실시양태에서, 효소의 양은 건조 물질 중량 g 당 0.5 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.4 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.3 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.25 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.20 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.18 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.15 mg 이하의 총 셀룰라제 효소, 건조 물질 중량 g 당 0.10 mg 이하의 총 셀룰라제 효소이다. 낮은 효소 용량은 효소의 활성 및 안정성 때문에 가능하고 가수분해 반응 시간을 증가시키는 것이 가능하다.
본 발명의 추가 양태에서, 가수분해 반응 시간은 5 시간 이상, 10 시간 이상, 20 시간 이상, 40 시간 이상, 50 시간 이상, 60 시간 이상, 7 0 시간 이상, 80 시간 이상, 90 시간 이상, 100 시간 이상, 120 시간 이상 또는 130 시간 이상이다. 또 다른 양태에서, 가수분해 반응 시간은 5 시간 내지 150 시간, 40 시간 내지 130 시간, 50 시간 내지 120 시간, 60 시간 내지 120 시간, 60 시간 내지 110 시간, 60 시간 내지 100 시간, 70 시간 내지 100 시간, 70 시간 내지 90 시간 또는 70 시간 내지 80 시간이다. 효소 조성물의 안정성으로 인해 보다 긴 가수분해 반응 시간은 상응하는 보다 높은 당 수율로 가능하다.
가수분해 동안 pH는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, 가수분해 동안 pH는 3.0 내지 6.4일 수 있다. 본 발명의 안정한 효소는 2 이하의 pH 단위, 3 이하의 pH 단위 또는 5 이하의 pH 단위의 넓은 pH 범위를 가질 수 있다. 최적 pH는 pH 2.0 내지 8.0, 3.0 내지 8.0, 3.5 내지 7.0, 3.5 내지 6.0, 3.5 내지 5.0, 3.5 내지 4.5, 4.0 내지 4.5의 한계 내에 있을 수 있거나 약 4.2이다.
본 발명의 추가 양태에서, 가수분해 단계는 리그노셀룰로스 물질에서 사용가능한 당의 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상 또는 95% 이상이 방출될 때까지 수행된다.
유의하게는, 본 발명의 방법은 가수분해 반응에서 높은 수준의 건조 물질 (리그노셀룰로스 물질)을 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약 5 중량% 이상, 약 8 중량% 이상, 약 10 중량% 이상, 약 11 중량% 이상, 약 12 중량% 이상, 약 13 중량% 이상, 약 14 중량% 이상, 약 15 중량% 이상, 약 20 중량% 이상, 약 25 중량% 이상, 약 30 중량% 이상, 약 35 중량% 이상 또는 약 40 중량% 이상의 건조 물질 함량을 사용함으로써 수행될 수 있다. 추가 실시양태에서, 가수분해 단계에서 건조 물질 함량은 14 중량%, 15 중량%, 16 중량%, 17 중량%, 18 중량%, 19 중량%, 20 중량%, 21 중량%, 22 중량%, 23 중량%, 24 중량%, 25 중량%, 26 중량%, 27 중량%, 28 중량%, 29 중량%, 30 중량%, 31 중량%, 32 중량% 또는 33 중량% 이상, 또는 14 내지 33 중량%이다.
또 다른 실시양태에서, 가수분해 완료시 건조 물질의 함량은 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 15 중량% 이상, 16 중량% 이상, 17 중량% 이상, 18 중량% 이상, 19 중량% 이상, 20 중량% 이상, 21 중량% 이상, 22 중량% 이상, 23 중량% 이상, 24 중량% 이상, 25 중량% 이상, 26 중량% 이상, 27 중량% 이상, 28 중량% 이상, 29 중량% 이상, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상, 32 중량% 이상, 33 중량% 이상, 34 중량% 이상, 35 중량% 이상, 36 중량% 이상, 37 중량% 이상, 38 중량% 이상 또는 39 중량% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 효소적 가수분해 완료시 건조 물질의 함량은 5 중량% 내지 40 중량%, 6 중량% 내지 40 중량%, 7 중량% 내지 40 중량%, 8 중량% 내지 40 중량%, 9 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 11 중량% 내지 40 중량%, 12 중량% 내지 40 중량%, 13 중량% 내지 40 중량%, 14 중량% 내지 40 중량%, 15 중량% 내지 40 중량%, 16 중량% 내지 40 중량%, 17 중량% 내지 40 중량%, 18 중량% 내지 40 중량%, 19 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 21 중량% 내지 40 중량%, 22 중량% 내지 40 중량%, 23 중량% 내지 40 중량%, 24 중량% 내지 40 중량%, 25 중량% 내지 40 중량%, 26 중량% 내지 40 중량%, 27 중량% 내지 40 중량%, 28 중량% 내지 40 중량%, 29 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 31 중량% 내지 40 중량%, 32 중량% 내지 40 중량%, 33 중량% 내지 40 중량%, 34 중량% 내지 40 중량%, 35 중량% 내지 40 중량%, 36 중량% 내지 40 중량%, 37 중량% 내지 40 중량%, 38 중량% 내지 40 중량%, 또는 39 중량% 내지 40 중량%이다.
발효
본 발명에 따른 방법은 발효 단계를 포함할 수 있다. 발효는 하나의 반응기(SSF)에서 가수분해를 사용하여 동시에 수행될 수 있다. 바람직하게, 발효는 가수분해 후 수행되고, 가수분해 및 발효 둘 다를 위한 최적의 조건은 가수분해 및 발효가 상이할 수 있게 선택될 수 있다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 당, 예를 들면, 글루코스, L-아라비노스 및/또는 자일로스를 함유하는 탄소 공급원의 발효를 위해 미생물이 사용되는 발효 공정 단계를 포함한다. 탄소 공급원은 L-아라비노스, 자일로스 또는 글루코스 단위를 포함하는 임의의 탄수화물 올리고머 또는 중합체, 예를 들면, 리그노셀룰로스, 자일란, 셀룰로스, 전분, 아라비난 등을 포함할 수 있다. 이러한 탄수화물로부터의 자일로스 또는 글루코스 단위의 방출을 위해, 적절한 카보하이드라제(carbohydrase)(예컨대, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 등)가 발효 배지에 첨가될 수 있거나 변형된 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 후자의 경우, 변형된 숙주 세포는 이러한 카보하이드라제를 생성하고 배출하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 글루코스의 올리고머 또는 중합체 공급원을 사용하는 추가 장점은 예를 들면, 속도 한정 양의 카보하이드라제를 사용함으로써 발효 동안 자유 글루코스의 (보다) 낮은 농도를 유지할 수 있다는 점이다. 이것은 비-글루코스 당, 예컨대, 자일로스의 대사 및 수송을 위해 요구된 시스템의 억제를 방지할 것이다. 바람직한 방법에서, 변형된 숙주 세포는 L-아라비노스(임의적으로 자일로스) 및 글루코스 둘 다를 바람직하게는 동시에 발효시키고, 이 경우 바람직하게는 이중영양적 생장을 방지하기 위해 글루코스 억제에 민감하지 않은 변형된 숙주 세포가 사용된다. 탄소 공급원으로서 L-아라비노스, 임의적으로 자일로스(및 글 루코스)의 공급원 이외에, 발효 배지는 변형된 숙주 세포의 생장을 위해 요구되는 적절한 성분을 추가로 포함할 것이다. 미생물, 예컨대, 효모 또는 사상 진균의 생장을 위한 발효 배지의 조성은 당해 분야에 잘 공지 되어 있다.
발효 시간은 동일한 조건에서 통상의 발효에서의 발효 시간보다 더 짧을 수 있고, 이때 효소적 가수분해의 일부는 여전히 발효 동안 참여해야 한다. 일 실시양태에서, 발효 시간은 5 0 g/ℓ의 글루코스 및 리그노셀룰로스 공급원료로부터의 상응하는 다른 당(예를 들면, 50 g/ℓ의 자일로스, 35 g/ℓ의 L-아라비노스 및 10 g/ℓ의 갈락토스)으로 구성된 당 조성물의 경우 100 시간 이하, 90 시간 이하, 80 시간 이하, 70 시간 이하 또는 60 시간 이하이다. 보다 묽은 당 조성물의 경우, 발효 시간은 상응하게 감소될 수 있다.
발효 공정은 호기성 또는 혐기성 발효 공정일 수 있다. 혐기성 발효 공정은 산소의 부재 하에서 수행되는 발효 공정, 또는 실질적으로 산소가 소모되지 않는, 바람직하게는 5, 2.5 또는 1 mmol/ℓ/시간, 보다 바람직하게는 0 mmol/ℓ/시간 미만의 산소가 소모되는(즉, 산소 소모가 검출될 수 없는) 발효 공정으로서 본원에서 정의되고, 이때 유기 분자는 전자 공여자 및 전자 수용자 둘 다로서 작용한다. 산소의 부재 하에서, 당분해 및 생체물질 형성에서 생성된 NADH는 산화적 인산화에 의해 산화되지 않을 수 있다. 이 문제점을 해결하기 위해, 많은 미생물들이 전자 및 수소 수용자로서 피루베이트 또는 이의 유도체들 중 하나를 사용하여 NAD+를 재생시킨다. 따라서, 바람직한 혐기성 발효 공정에서 피루베이트는 전자(및 수소 수용자)로서 사용되고 발효 생성물, 예컨대, 에탄올, 젖산, 3-하이드록시-프로피온 산, 아크릴산, 아세트산, 석신산, 시트르산, 말산, 푸마르산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, 부탄올, β-락탐 항생제 및 세팔로스포린으로 환원된다. 바람직한 실시양태에서, 발효 공정은 혐기성 공정이다. 혐기성 공정은 호기성 공정보다 더 저렴하기 때문에 유리하고; 특수 장치가 보다 덜 필요하다. 더욱이, 혐기성 공정은 호기성 공정보다 더 높은 생성물 수율을 제공할 것으로 예상된다. 호기성 조건 하에서의 생체물질 수율은 통상적으로 혐기성 조건 하에서의 생체물질 수율보다 더 높다. 그 결과, 통상적으로 호기성 조건 하에서 예상된 생성물 수율은 혐기성 조건 하에서 예상된 생성물 수율보다 더 낮다.
또 다른 실시양태에서, 발효 공정은 산소-한정된 조건 하에서 수행된다. 보다 바람직하게는, 발효 공정은 호기성 공정이고 산소-한정된 조건 하에서 수행된다. 산소-한정된 발효 공정은 산소 소모가 기체로부터 액체로의 산소 수송에 의해 한정되는 공정이다. 산소 한정의 정도는 들어오는 기류의 양 및 조성뿐만 아니라 이용된 발효 장치의 실제 혼합/물질 수송 성질에 의해 결정된다. 바람직하게는, 산소-한정된 조건 하에서의 공정에서 산소 소모의 속도는 5.5 mmol/ℓ/시간 이상, 보다 바람직하게는 6 mmol/ℓ/시간 이상, 더욱 더 바람직하게는 7 mmol/ℓ/시간 이상이다.
발효 공정은 바람직하게는 변형된 세포에 대하여 최적인 온도에서 수행된다. 따라서, 대다수의 효모 또는 진균 세포의 경우, 발효 공정은 42℃ 미만, 바람직하게는 38℃ 미만의 온도에서 수행된다. 효모 또는 사상 진균 숙주 세포의 경우, 발효 공정은 바람직하게는 20℃, 22℃ 또는 25℃ 초과의 온도 내지 35℃, 33℃, 30℃ 또는 28℃ 미만의 온도에서 수행된다.
본 발명의 실시양태에서, 발효 단계는 1종 이상의 C5 당을 발효시킬 수 있는 미생물을 사용함으로써 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 공정은 에탄올의 제조를 위한 공정이므로, 이 공정은 1종 이상의 C5 당을 발효시킬 수 있는 미생물을 사용하여 당을 함유하는 배지를 발효시키는 단계를 포함하고, 이로써 상기 숙주 세포는 글루코스, L-아라비노스 및 자일로스를 에탄올로 발효시킬 수 있다. 미생물은 진핵 생물 또는 원핵 생물일 수 있다. 상기 공정에 사용된 미생물은 유전적으로 조작된 미생물일 수 있다. 적합한 유기체의 예는 하기이다: 효모, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomuces pastoriaunus) 또는 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 한세누라(Hansenula), 이사켄키아(Issatchenkia), 예를 들면, 이사켄키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 피키아(Pichia), 예를 들면, 피키아 스티피테스(Pichia stipites) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스(Kluyveromeces), 예를 들면, 클루이베로마이세스 파길리스(Kluyveromyces fagilis), 칸디다(Candida), 예를 들면, 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicallis) 또는 칸디다 아시도써모필룸(Candida acidothermophilum), 파키솔렌(Pachysolen), 예를 들면, 파키솔렌 탄노필루소르(Pachysolen tannophilus) 또는 세균, 예를 들면, 락토바실러스(Latobacillus), 예를 들면, 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 게오바실러스(Geobacillus), 자이모모나스(Zymomonas), 예를 들면, 자이모모나스 모빌리스(Xymomonas mobilis), 크로스트리디움(Clostridium), 예를 들면, 크로스트리디움 피토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans), 에스케리키아(Escherichia), 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Eschrichia coli), 클렙시엘라(Klebsiella), 예를 들면, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca). 이러한 일 실시양태에서, 1종 이상의 C5 당을 발효시킬 수 있는 미생물은 효모이다. 일 실시양태에서, 효모는 유전적으로 변형된 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 종에 속한다. 이러한 미생물 및 이의 제조의 예는 WO 2008/041840 및 EU 10160622.6(2010년 4월 21일 출원)에 보다 상세히 기재되어 있다. 일 실시양태에서, 에탄올의 제조를 위한 발효 공정은 혐기성 공정이다. 혐기성은 본원에서 이미 앞서 정의되었다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 에탄올의 제조를 위한 발효 공정은 호기성 공정이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 에탄올의 제조를 위한 발효 공정은 산소-한정된 조건, 보다 바람직하게는 호기성 및 산소-한정된 조건 하에서 수행된다. 산소-한정된 조건은 본원에서 이미 앞서 정의되었다.
이러한 공정에서, 부피측정 에탄올 생산성은 바람직하게는 시간 당 ℓ 당 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0 또는 10.0 g 이상의 에탄올이다. 상기 공정에서 L-아라비노스 및 임의적으로 자일로스 및/또는 글루코스에 대한 에탄올 수율은 바람직하게는 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80, 90%, 95% 또는 98% 이상이다. 에탄올 수율은 이론적 최대 수율(이 수율은 글루코스 및 L-아라비노스 및 임의적으로 자일로스의 경우 글루코스 또는 자일로스 g 당 0.51 g의 에탄올임)의 백분율로서 본원에서 정의된다.
일 양상에서, 에탄올을 생성하는 상기 발효 공정은 공지되어 있는 에탄올 발효 공정에 비해 여러 장점을 갖는다:
- 혐기성 공정이 가능하다는 점;
- 산소-한정된 조건도 가능하다는 점;
- 보다 높은 에탄올 수율 및 에탄올 생성 속도가 수득될 수 있다는 점; 및
- 사용된 균주가 L-아라비노스 및 임의적으로 자일로스를 사용할 수 있다는 점.
전술된 발효 공정에 대한 대안으로서, 2종 이상의 상이한 세포들이 사용될 수 있는데, 이는 이 공정이 공-발효 공정이라는 것을 의미한다. 전술된 발효 공정의 모든 바람직한 실시양태는 이러한 공-발효 공정의 바람직한 실시양태이기도 하다: 발효 생성물의 정체성, L-아라비노스의 공급원 및 자일로스의 공급원의 정체성, 및 발효 조건(호기성 또는 혐기성 조건, 산소-한정된 조건, 공정이 수행되는 온도, 에탄올의 생산성, 에탄올의 수율).
발효 공정은 이 공정 동안 pH를 조절할 필요없이 수행될 수 있다. 다시 말해, 상기 공정은 임의의 산 또는 염기의 첨가 없이 수행될 수 있는 공정이다. 그러나, 이것은 산이 첨가될 수 있는 전처리 단계를 배제한다. 이것은 본 발명의 조성물이 낮은 pH에서 작용할 수 있으므로 당화 또는 가수분해가 일어날 수 있도록 산 전처리된 공급원료의 pH를 조절할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 무기 화학물질을 투입할 필요 없이 유기 생성물만을 사용하는 폐기물 제로 방법일 수 있다.
전체 반응 시간
본 발명에 따라, 전체 반응 시간(또는 가수분해 단계 및 발효 단계의 반응 시간)이 감소될 수 있다. 일 실시양태에서, 전체 반응 시간은 90% 글루코스 수율에서 300 시간 미만, 200 시간 미만, 150 시간 미만, 140 시간 미만, 130 시간 미만, 120 시간 미만, 110 시간 미만, 100 시간 미만, 90 시간 미만, 80 시간 미만, 75 시간 미만 또는 약 72시간 미만이다. 상응하게, 보다 낮은 전체 시간은 보다 낮은 글루코스 수율에서 도달될 수 있다.
발효 생성물
본 발명에 따라 제조될 수 있는 발효 생성물은 아미노산, 비타민, 약제, 동물 사료 보충제, 특수 화학물질, 화학물질 공급원료, 플라스틱, 용매, 연료, 또는 다른 유기 중합체, 젖산, 및 연료 에탄올을 포함하는 에탄올(용어 "에탄올"은 에틸 알코올 또는 에틸 알코올과 물의 혼합물을 포함하는 것으로 이해됨)을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 구체적인 부가-가치 생성물은 생체연료(생체기체, 에탄올 및 부탄올을 포함함); 젖산; 3-하이드록시-프로피온산; 아크릴산; 아세트산; 1,3-프로판-다이올; 에틸렌; 글리세롤; 플라스틱; 특수 화학물질; 시트르산, 석신산 및 말레산을 포함하는 유기 산; 용매; 동물 사료 보충제; 약제, 예컨대, β-락탐 항생제 또는 세팔로스포린; 비타민; 아미노산, 예컨대, 라이신, 메티오닌, 트립토판, 쓰레오닌 및 아스파르트산; 효소, 예컨대, 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제, 글루카나제, 락타제, 리파제, 라이아제, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제 또는 자일라나제; 화학물질 공급 원료; 또는 동물 사료 보충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있는 발효 생성물은 발효로부터 유래된 임의의 물질일 수 있다. 이들은, 비제한적으로, 알코올(예컨대 아라비니톨, 부탄올, 에탄올, 글리세롤, 메탄올, 1,3-프로판다이올, 소르비톨 및 자일리톨); 유기 산(예컨대, 아세트산, 아세톤산, 아디프산, 아스코르브산, 아크릴산, 시트르산, 2,5-다이케토-D-글루콘산, 포름산, 푸마르산, 글루카르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타르산, 3-하이드록시프로피온산, 이타콘산, 락트산, 말레산, 말산, 말론산, 옥살산, 옥살로아세트산, 프로피온산, 숙신산 및 자일론산); 케톤(예컨대 아세톤); 아미노산(예컨대 아스파르트산, 글루탐산, 글라이신, 리신, 세린, 트립토판 및 트레오닌); 알칸(예컨대 펜탄, 헥산, 펩탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸 및 도데칸), 사이클로알칸(예컨대 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 사이클로헵탄 및 사이클로옥탄), 알켄(예컨대 펜텐, 헥센, 헵텐 및 옥텐); 및 기체(예컨대 메탄, 수소(H2), 이산화탄소(C02) 및 일산화탄소(CO))를 포함한다. 또한, 발효 생성물은 단백질, 비타민, 약제, 동물 사료 보충제, 특수 화학물질, 화학적 공급원료, 플라스틱, 용매, 에틸렌, 효소, 예컨대 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제, 글루카나제, 락타제, 리파제, 리아제, 산화환원효소, 전이효소 또는 자일라나제일 수 있다.
발효 생성물의 분리
본 발명에 따른 방법은 임의적으로 발효 생성물을 회수하는 단계를 포함한다. 발효 생성물은 임의의 공지되어 있는 방식으로 발효 브로쓰로부터 분리될 수 있다. 따라서, 당업자는 각각의 발효 생성물에 적합한 분리 기법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 에탄올은 통상의 방식으로 증류, 예를 들면, 증기 증류/진공 증류에 의해 효모 발효 브로쓰로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 이하에 보다 상세히 기재될 것이지만, 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.
최적 온도 조건 하에서 열안정성 효소의 사용
일 실시양태에서, 본 발명은 에탄올 제조(그러나, 이것으로 한정되지 않음)에서 전처리된 리그노셀룰로스 공급원료로부터 환원 당을 제조하기 위한 열안정성 효소, 예컨대, 라삼소니아의 셀룰로스분해 효소의 용도에 관한 것이다. 전처리된 리그노셀룰로스 공급원료에 적용된 라삼소니아의 셀룰로스분해 효소는 50℃ 내지 70℃ 범위 내의 온도에서 최대 전환 속도를 보였다. 상기 효소는 활성의 완전한 중단 없이 14일 이상 동안 이 환경 하에서 활성을 유지한다.
최적 온도 조건을 이용함으로써 가장 짧은 가능한 가수분해 시간 내에서 공급원료로부터 최대량의 환원 당(총 가수분해)을 방출시킬 수 있다. 이 방식으로, 글루코스에서 셀룰로스의 100% 전환은 5일 이내에 달성된다.
발효 생성물의 이론적 최대 수율(글루코스 g 당 g 생성물의 단위로 표현된 Yps 최대치)은 생화학 교재로부터 유도될 수 있다. 예탄올의 경우 1 몰의 글루코스(180 g)는 정상 당분해 발효 경로에 따라 효소에서 2 몰의 에탄올(= 2 x 46 = 92 g의 에탄올)을 제공한다. 따라서, 글루코스에 대한 에탄올의 이론적 최대 수율은 글루코스 g 당 0.511 g(= 92/180)의 에탄올이다.
부탄올(MW 74 g/몰) 또는 이소부탄올의 경우, 이론적 최대 수율은 글루코스 몰 당 1 몰의 부탄올이다. 따라서, (이소)부탄올의 경우 Yps 최대치는 글루코스 g 당 0.411 g(= 74/180)의 (이소)부탄올이다.
젖산의 경우 동종젖산 발효에 대한 발효 수율은 글루코스 몰 당 2 몰의 젖산(MW = 90 g/몰)이다. 이 화학양론에 따라, Yps 최대치는 글루코스 g 당 1 g의 젖산이다.
다른 발효 생성물에 대해서도 유사한 계산을 수행할 수 있다.
라삼소니아의 셀룰로스분해 효소를 적용함으로써 달성된 비용 감소는 전체 공정 시간 감소의 결과일 것이다.
라삼소니아 효소를 사용하여 연장된 가수분해 시간으로 보다 낮은 효소 용량 보상
안정한 효소의 높은 안정성으로 인해, 보다 적은 환원 당이 가수분해 과정에서 유리되지만 활성이 시간 이내에 중단되지 않는다. 가수분해 시간을 연장하여 유사한 수준의 방출된 환원 당을 수득함으로써 효소 용량을 낮추고 효소의 사용을 연장시킬 수 있다. 예를 들면, 공급원료 건조물질 g 당 0.175 ㎖의 효소가 72 시간 이내에 전처리된 공급원료로부터 이론적 최대치의 약 90%의 환원 당을 방출시켰다. 공급원료 건조물질 g 당 0.075 ㎖의 효소를 사용하여, 120 시간 이내에 이론적 최대치의 약 90% 전환이 달성된다. 이 결과는 효소 활성의 안정성 때문에 효소 용량의 감소가 가수분해 시간의 연장에 의해 보상되어 동일한 양의 환원 당을 수득할 수 있다는 것을 보여준다. 15%의 건조 물질 공급원료에서 연장된 가수분해 시간의 보상 효과를 보여주는, 10% 초과의 건조물질 함량에서 전처리된 공급원료의 가수분해에 대해서도 동일한 원리가 적용된다.
안정한 셀룰로스분해 효소, 예컨대, 라삼소니아의 셀룰로스분해 효소를 사용함으로써 달성된 비용 감소는 유사한 가수분해 전환 수율을 발생시키는 보다 적은 효소 용량의 요구로부터 비롯된다.
안정한 효소에 의한 오염 위험의 감소
리그노셀 룰로스 물질을 에탄올로 전환시키는 통상의 공정에서, 공정 단계는 바람직하게는 작업 비용을 낮추기 위해 지저분한 조건 하에서 수행된다. 따라서, 오염 미생물의 오염 및 생장이 일어날 수 있고 제조 비용에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 부작용, 예컨대, 젖산, 포름산 및 아세트산 생성, 기질에 대한 에탄올의 수율 손실, 및 독소 및 세포외 폴리사카라이드의 생성을 초래할 수 있다. 높은 공정 온도 및/또는 짧은 공정 시간은 가수분해 및 발효 동안 오염 위험을 한정할 것이다. 열안정성 효소, 예컨대, 라삼소니아의 열안정성 효소는 60℃ 초과의 온도에서 리그노셀룰로스 공급원료를 가수분해할 수 있다. 이 온도에서, 오염 미생물이 원치않는 부작용을 야기할 위험은 거의 없거나 거의 0일 것이다.
에탄올이 생성되는 발효 단계 동안 온도는 전형적으로 30℃ 내지 37℃이고, 바람직하게는 생산 손실 때문에 상승되지 않을 것이다. 가능한 짧은 발효 공정 시간을 적용함으로써 오염물질의 오염 및/또는 생장의 위험 및 효과가 가능한 많이 감소될 것이다. 안정한 효소, 예컨대, 라삼소니아의 안정한 효소를 사용하여 가능한 짧은 발효 시간이 적용될 수 있으므로(상기 설명 참조), 오염물질의 오염 및/또는 생장 위험은 가능한 많이 감소될 것이다. 이 방식으로 라삼소니아의 열안정성 셀룰로스분해 효소를 적용함으로써 달성된 비용 감소는 오염으로 인한 공정 실패의 보다 낮은 위험으로부터 비롯될 것이다.
냉각 비용을 감소시키고 에탄올 플랜트의 생산성을 증가시키는 안정한 효소
열적 전처리 후 제 1 단계는 전처리된 공급원료를 효소가 최적 활성을 갖는 온도까지 냉각시키는 단계일 것이다. 대규모에서, 이는 전형적으로 온도를 감소시키는 것 이외에 건조 물질 함량을 감소시킬 (냉각된) 물을 첨가함으로써 수행된다. 열안정성 효소, 예컨대, 라삼소니아의 열안정성 효소를 사용하였을 때, (i) 보다 높은 온도가 가수분해 동안 허용되기 때문에 전처리된 공급원료의 냉각이 보다 덜 요구된다는 사실, 및 (ii) 보다 적은 물이 첨가될 것이라는 사실(이것은 가수분해 및 발효 동안 건조물질 함량을 증가시켜 에탄올 플랜트의 에탄올 생성 성능(부피 당 시간 단위 당 생성된 양)을 증가시킬 것임)에 의해 비용 감소가 달성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 열안정성 효소, 예컨대, 라삼소니아의 열안정성 효소를 사용하였을 때, 비-열안정성 효소를 사용한 공정에서 사용된 물보다 더 높은 온도를 갖는 냉각수를 사용함으로써 비용 감소가 달성될 수도 있다.
안정한 효소를 사용한 가수분해 후 효소 재활용
가수분해의 말기에서, 일단 거의 모든 셀룰로스가 전환되면 환원 당이 거의 방출되지 않기 때문에 효소 활성은 낮은 것처럼 보인다. 그러나, 존재하는 효소 활성의 양은 추정컨대 주로 기질에의 효소의 흡착으로 인해 약간만 감소되었다. 가수분해 후 고체-액체 분리, 예컨대, 원심분리, 여과, 침강 등을 적용함으로써, 용액에서 60% 이상, 예를 들면, 70%의 효소 활성이 회수될 수 있고 다음 가수분해 동안 새로운 전처리된 리그노셀룰로스 공급원료의 가수분해를 위해 재사용될 수 있다.
더욱이, 고체-액체 분리 후, 용액 중의 효소는 효소 작용으로부터의 환원 당 및 다른 가수분해 생성물을 함유하는 용액으로부터 분리될 수 있다. 이 분리는 효소를 임의의 종류의 담체에 먼저 흡착시키거나 흡착시키지 않으면서 (한외 및 마이크로) 여과, 원심분리, 침강 또는 침전(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 수행함으로써 달성될 수 있다.
예를 들면, 공급원료 건조 물질 g 당 0.175 ㎖의 효소 적재량을 사용하여 전처리된 공급원료를 20 시간 동안 가수분해 후 환원 당의 이론적 최대량의 50%가 유리되고, 72 시간 동안 동일한 가수분해 후 환원 당의 이론적 최대량의 90%가 유리된다. 원심분리 및 한외여과에 의해, 60% 내지 70%의 효소 활성이 체류물에서 회수된 반면, 여과액은 80% 초과의 유리된 환원 당을 함유하였다. 체류물을 그 자체로서 재사용하거나 추가 정제 및/또는 농축 후 재사용함으로써 다음 가수분해 단계 동안 효소 용량은 60% 내지 70%로 감소될 수 있다. 이 방식으로 안정한 셀룰로스분해 효소, 예컨대, 라삼소니아의 안정한 셀룰로스분해 효소를 사용함으로써 달성된 비용 감소는 보다 적은 효소 용량의 요구로부터 비롯된다.
안정한 효소를 사용하여 효소 생성 및 효모 세포 재활용과 조합되는 가수분해 후 효소 재활용
전술된 바와 같이 가수분해 후 효소 재활용을 포함하는 공정은 발효 후 에탄올 생성 미생물의 재활용; 및 효소 생성 발효에서 (정제된 및/또는 농축된 또는 희석된) 기질로서 및 에탄올 생성 미생물의 배양을 위한 기질로서 환원 당 함유 여과액의 사용과 조합될 수 있다.
안정한 효소를 사용하여 진공 증류 후 효소 재활용
효소, 예컨대, 라삼소니아의 효소의 열안정성은 가수 분해, 발효 및 진공 증류 후 묽은 증류폐액(thin stillage)에서 셀룰로스분해 활성이 잔존하게 한다. 효소의 총 활성은 상기 3개의 연속 공정 단계 동안 감소된다. 따라서, 진공 증류 후 수득된 묽은 증류폐액은 전 처리된 밀짚을 에탄올로 전환시키는 새로 시작된 가수분해-발효-증류 공정을 위한 효소의 공급원으로서 재사용될 수 있다. 추가로 효소를 보충하거나 보충하지 않으면서 묽은 증류폐액을 농축된 또는 (비)희석된 형태 및/또는 정제된 형태로 사용할 수 있다.
열안정성 효소를 사용하여 진공 증류 후 효소 보충과 조합되는 효소 재활용
최적 공정에서, 이전 공정 주기의 3개 연속 공정 단계 동안 손실된 활성의 양과 동등한 양의 효소가 새로운 공정 주기에서 재사용되기 전에 묽은 증류폐액 내로 보충된다. 이 방식으로, 과다용량의 효소가 피해지므로, 효소의 가장 효율적인 사용이 달성된다.
또한, 제 1 공정 주기에서 높은 효소 용량을 제공하고 후속 공정 주기에서 3개의 연속 공정 단계 동안 손실된 활성의 양과 동등한 효소를 보충함으로써, 효소의 가장 효율적인 사용과 함께 48 시간 미만의 짧은 가수분해 시간을 가능하게 하는 가장 높은 가능한 가수분해 속도가 수득될 수 있다.
혼합된 시스템에서 안정한 효소의 사용
가수분해 동안 혼합을 적용함으로써 효소는 기질과 더 자주 접촉하고, 이것은 촉매 활성의 보다 효율적인 사용을 가능하게 한다. 혼합이 효소에 부정적인 효과를 미치지 않는 한, 이것은 효소 용량을 낮춤으로써 비용을 낮출 것이다. 안정한 효소, 예컨대, 라삼소니아의 열안정성 효소는 강력하고 (국소적으로) 높은 전단 및 온도의 환경(슬러리의 강력한 혼합 동안 발생하는 환경)을 견딜 수 있다. 따라서, 혼합된 시스템에서의 효소의 사용은 유리하고 용량 감소를 유발하여 비용 감소를 유발할 것이다.
본 발명은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
실험 정보
균주
본 발명의 효과 및 장점을 보여주기 위해 본 실시예에 사용될 수 있는 적합한 라삼소니아 균주는 예를 들면, TEC-101, TEC-147, TEC-192, TEC-201 또는 TEC-210이다. 상기 균주는 WO 2011/000949에 기재되어 있다.
산 전처리된 옥수수대 기질의 제조
묽은 산 전처리된 옥수수대(aCS)를 문헌[Schell, D.J., Applied B iochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp 69-85]에 기재된 바와 같이 수득하였다. 정상 상태 조건, 즉 190℃, 1 분 체류 시간 및 액체상 중의 1.45% (w/w)의 유효 H2SO4 산 농도에서 작동하는 파일럿 규모 전처리 반응기를 이용하였다.
단백질 측정 분석
1. 총 단백질
TCA 뷰렛(Biuret)
이 방법은 방해 물질을 제거하고 단백질 농도의 측정을 가능하게 하기 위해 트라이클로로아세트산(TCA)을 사용하는 단백질 침전과 비색 뷰렛 반응을 조합한 방법이다. 뷰렛 반응에서, 구리(II) 이온은 알칼리성 용액에서 펩티드 결합의 질소 및 탄소와 복합체를 형성하는 구리(I)로 환원된다. 보라색은 단백질의 존재를 표시한다. 색채의 강도 및 이로써 546 nm에서의 흡수는 비어-램버트(Beer-Lambert) 법칙에 따라 단백질 농도와 정비례한다. BSA(소 혈청 알부민)를 사용하여 표준화를 수행하고 단백질 함량을 BSA 당량/ℓ로서 g 단백질, 또는 BSA 당량/㎖로서 mg 단백질로 표현하였다. OD546 대 공지되어 있는 농도를 갖는 샘플의 농도를 작도한 후, 보정 선으로부터 발생된 방정식을 이용하여 공지되어 있지 않은 샘플의 농도를 계산함으로써 당분야에서 공지되어 있는 표준 계산 프로토콜을 이용하여 단백질 함량을 계산하였다.
2. PAGE 를 사용하는 개별 단백질
샘플 전처리 SDS-PAGE
샘플의 추정된 단백질 농도에 근거하여 하기 샘플 제조를 수행하였다. 밀리큐(MilliQ) 물(40 ㎕) 및 TCA(20%, 50 ㎕)를 샘플(10 ㎕)에 첨가하여 샘플을 5배(약 1 mg/㎖) 희석하고 단백질을 침전시켰다. 얼음 상에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 샘플을 원심분리하였다(10 분, 14000 rpm). 펠렛을 아세톤(500 ㎕)으로 세척하고 원심분리하였다(10 분, 14000 rpm). 펠렛을 후술된 바와 같이 처리하였다.
SDS-PAGE
펠렛을 밀리큐 물(65 ㎕), 누페이지(NuPAGE: 상표) LDS 샘플 완충제(4배)(25 ㎕)[인비트로겐(Invitrogen)] 및 누페이지(상표) 샘플 환원제(10배)(10 ㎕)(인비트로겐)에 용해시켰다. 변성 단계 전, 밀리큐, 누페이지(상표) LDS 샘플 완충제 및 누페이지(상표) 샘플 환원제(10 ㎕)의 혼합물(65:25:10의 비)을 사용하여 샘플을 5배 희석하였다. 혼합 후, 샘플을 70℃에서 10 분 동안 열혼합기 내에서 항온처리하였다. 샘플 용액을 4 내지 12% 비스-트라이스 겔(누페이지(상표) 비스-트라이스, 인비트로겐) 상에 적용하였다. 마커 M12(인비트로겐)의 샘플(10 ㎕)도 상기 겔에 적용하였다. 외부 완충제 챔버 내에서 20배 희석된 SDS 완충제(600 ㎖)를 갖고 내부 완충제 챔버 내에서 항산화제(누페이지(상표), 인비트로겐)(0.5 ㎖)를 함유하는 20배 희석된 SDS 완충제(200 ㎖)를 갖는 엑스셀 슈어록(XCELL Surelock)을 이용하여 겔을 50 분 동안 200 V에서 런닝시켰다. 런닝 후, 겔을 광물이 제거된 물로 2회 헹구고, 겔을 50% 메탄올/7% 아세트산 용액으로 1 시간 동안 고정시키고 하룻밤 동안 사이프로 루비(Sypro Ruby)(겔 당 50 ㎖)로 염색하였다. 겔을 밀리큐 물로 세척한 후 타이푼(Typhoon) 9200(610 BP 30, 녹색(532 nm), PMT 600V, 100 ㎛)을 이용하여 영상을 획득하였다.
단백질의 정량 분석
타이푼 스캐너(Typhoon scanner)를 이용하여 당분야에서 공지되어 있는 표준 방법으로 레인 내의 단백질 밴드들 사이의 비를 측정하였다. 샘플을 삼중으로 적용하고 프로그램 이미지 퀀트(Image quant)를 이용하여 회색 값을 측정하였다. 값은 모든 단백질 밴드들의 총 회색 값에 비해 상대적인 선택된 단백질 밴드의 회색 값을 이용함으로써 계산된, 총 단백질에 대한 상대적인 % 단백질로서 표시된다.
글루칸 전환 계산:
글루칸 전환율(%) = (글루코스(g/ℓ) x 100%)/(글루칸(DM을 기준으로 한 분율) x dm(g/kg) x 1.1)
상기 식에서,
글루코스(g/ℓ)는 가수분해 후 상청액 중의 글루코스 농도이고,
글루칸(DM을 기준으로 한 분율)은 전처리 전 기질의 글루칸 함량이고,
dm(g/kg)은 가수분해의 건조 물질(예를 들면, 20% dm = 200 g/kg)이고,
1.1은 가수분해 동안 물 도입으로 인한 중량 증가이다.
예시적 계산:
당 = 60 g/ℓ
글루칸 분율 = 0.40(건조물질을 기준으로 40%)
dm = 200 g/kg
글루칸 전환 예 = (60 x 100)/(0.4 x 200 x 1.1) = 68% 전환
필요한 경우 증발에 대한 교정을 수행하였다. 이후 상청액의 농도를 가수분해 물 kg 당 농도로 전환하였다.
UPLC-MS/MS에 의한 바이오매스 가수분해물에서 글루콘산의 측정
상기 분석은 UPLC 컬럼을 사용하여 글루콘산의 분리 및 MS/MS(음성 전자분무 이온화에 기초함)에 의한 검출에 기초한다. 이온 억제에 의해 야기된 오차를 배제하기 위해, 증발 및 주입 효과, 표지된 내부 표준, 즉, 13C6-글루콘산을 사용하였다.
화학물질 및 기준 화합물
샘플 제조 및 UPLC-MS/MS 분석을 위해 사용된 물은 밀리포어(Millipore) 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. HPLC-등급 아세토니트릴은 머크(Merck, 네덜란드 암스테르담 소재)로부터 수득하였다. 물 중 0.1% 포름산(v/v) 및 아세토니즈릴 중 0.1% 포름산은 바이오솔브 비브이(Biosolve B.V., 네덜란드 팔켄스바아트 소재)로부터 수득하였다. 글루콘산 기준 화합물은 시그마(Sigma, 네더란드 즈빈드레비치 소재)로부터 수득하였다. 동위원소 표지된 글루콘산(13C6, 내부 표준으로서 사용됨)은 부켐 비브이(Buchem B.V., 네덜란드 아펠도른 소재)에 의해 주문 제작하였다.
내부 표준 용액
10 mL 메스 플라스크 중에 13C6-글루콘산(10 mg)을 칭량하고 물(10 mL, 약 1 mg/mL)에 용해하여 스톡 용액을 제조하였다. 이 스톡 용액으로부터, 내부 표준 스톡 용액(100 ㎕)을 피펫팅하고 물(9.99 mL, 약 10 ㎍/mL)을 첨가하여 작동 용액을 제조하였다.
표준 용액
글루콘산(5 mg)을 칭량하고 물(10 mL)을 첨가하여 글루콘산의 스톡 용액을 제조하였다. 스톡 용액(20 ㎕)을 피펫팅하고 물(980 ㎕)을 첨가하여 상기 스톡 용액을 추가로 희석하였다(희석물 1, 약 10 ㎍/mL). 희석물 1(100 ㎕)을 피펫팅하고 물(900 ㎕)을 첨가하여 추가 희석물을 제조하였다(희석물 2, 약 1 ㎍/mL). 보정 곡선은 하기 표 1에 따라 HPLC 바이알에서 제조하였다.
샘플 제조
필요한 경우, 바이오매스 가수분해물을 해동하고, 물(1350 ㎕)을 함유하는 에펜도르프 바이알에 샘플(150 ㎕)을 희석하여 물로 10회 희석한 후 13000 rcf에서 15 분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 HPLC 바이알에서 상청액(20 ㎕)을 피펫팅하고 내부 표준 작동 용액(100 ㎕) 및 물(880 ㎕)을 첨가하여 물로 50회 희석하였다.
UPLC-MS/MS
워터스 아이클래스 바이너리 솔벤트 매니저(Waters iClass Binary Solvent Manager) 및 워터스 쎄보(Xevo) TQD 질량 분광기(워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)에 연결된 워터스 아이클래스 샘플 매니저 FTN으로 이루어진 워터스 UPLC 아이클래스 시스템으로 글루콘산을 분석하였다. 크로마토그래피 분리를, 이동상으로서 (A) 물 중 0.1% 포름산(v/v) 및 (B) 아세토니트릴 중 0.1% 포름산의 구배 용리를 사용하여 워터스 악퀴티(Acquity) UPLC BEH C18 컬럼(150 x 2.1 mm, 1.8 ㎛)으로 달성하였다. 99% A에서 1분 후 90% A로 선형 감소 2분, 이어서 20% A로 2분 동안 세척하고 99% A로 2분 동안 재-평형하는 7분 구배를 시작하였다. 유속은 5 ㎕의 주입 용량을 사용하여 0.35 ㎖/분으로 유지하고, 컬럼 온도는 40℃로 설정하였다.
질량 분광계는 음성 이온화 방식으로 작동하였다. 데이터 취득 및 피크 통합은 매스린스(Masslynx) 4.1 소프트웨어(워터스)로 수행하였다. 글루콘산 및 13C6-글루콘산 검출은 다중 반응 모니터링 방식(MRM)으로 수행하였다. 일반적인 설정 값은 하기와 같다: ESI 모세관 전압 2.0 kV, 추출기 전압 3.0 V, 콘(cone) 전압 30 V. 탈용매 기체(질소) 유속은 350℃에서 온도를 설정하여 800 L/시간이고, 콘 기체(질소) 유속은 50 L/시간이고, 공급원 온도는 150℃였다. 하기 MRM 설정을 사용하였다: 글루콘산 m/z 195.0→129.0, 체류 시간 0.1 초, 충돌 전압 2V; 13C6-글루콘산 m/z 201.0→134.0, 체류 시간 0.08 초, 충돌 전압 2V.
정량화
g/ℓ 화합물 = ((면적 화합물/면적 내부 표준) - 절편) x 1000 (희석인자)/보정 선의 기울기 x 1000
글루콘산의 농도(g/ℓ)를 선형 회귀를 사용하여 계산하였다:
계산된 양의 글루콘산(g/ℓ)은 하기 계산에 의해 리그노셀룰로스 물질 중에 글루콘산(g/kg 글루칸)으로 전환될 수 있다.
20% (w/w) dm의 농도에서, 120 시간 동안 가수분해의 마지막에, pH 4.5 및 62℃에서 산 전처리된 옥수수대를 사용하여, 펠렛 부피는 6%(불용성으로 인해)이고 상청액 부피는 94%이다. 상청액은 1.07 kg/ℓ의 밀도 및 36%의 글루칸을 갖는다. 따라서, 20% (w/w) dm의 농도에서 산 전처리된 옥수수대는 가수분해물 kg 당 72 g의 글루칸을 갖는다.
예를 들면, 0.5 g/ℓ 글루콘산으로 출발하여, 이는 상청액 kg 당 0.47 g(= 0.5/1.07; 1.07은 액체의 밀도이다)의 글루콘산을 수득하다. 이는 가수분해물 kg 당 0.44 g(= 0.47 x 0.94)의 글루콘산에 상응한다(펠렛 인자는 불용성으로 인해 6%임). 20% (w/w) dm의 농도에서 산 전처리된 옥수수대를 사용하여, 이는 글루칸 kg 당 6.1 g(= 0.44/0.072)의 글루콘산에 상응한다.
실시예 1
가수분해 동안 형성된 글루콘산의 양을 조절하는 산소의 사용
60℃의 반응기 온도 및 pH 4.5에서 20% 건조 물질(건조 물질에서 36% 그루칸 함유함)을 갖는 전처리된 옥수수대의 최적의 효소적 가수분해는 산소를 첨가함으로써 가수분해물의 상청액 중 7 내지 1.5 g/ℓ의 글루콘산 농도를 유지하여 수득된다. 이는 글루칸의 가수분해 동안 글루칸 kg 당 생성된 9.7 내지 20.8 g의 글루콘산에 상응한다. 상기 가수분해는 TEC-210 셀룰라제 효소 조성물(또는 칵테일)의 2.5 mg/g의 건조 물질 공급원료로 수행된다. TEC-210은 WO 2011/000949에 기재된 접종 및 발효 방법에 따라 생성된다.
실시예 2
가수분해 동안 형성된 글루콘산의 양을 조절하기 위한 산소의 사용
20% (w/w) 건조 물질(dm)의 농도에서 산 전처리된 옥수수대(aCS) 공급원료를 사용하여 효소적 가수분해를 수행하였다. 농축된 공급원료 슬러리를 물로 희석하여 공급원료 용액을 제조하였다. pH는 25% (w/w) NH4OH-용액으로 pH 4.5로 조정하였다. 1.5 ℓ 반응기를 사용하여 kg 규모로 효소적 가수분해를 수행하였다. pH를 4.5로 제어하고 온도를 62℃로 제어하였다. 상기 과정 동안 용해된 산소를 상부공간 기체 재순환 및 추가의 신선한 공기(20 내지 21% 산소 함유)로 제어하였다.
효소 첨가 전에, 상부공간 기체를 연동 펌프 및 스퍼저(sparger)를 사용하여 3 ℓ/시간의 기체 유동으로 재순환하였다. 공급원료가 화학 반응을 통해 산소를 소비한다는 사실로 인해, DO 수준은 1 시간 이내에 0% DO 수준에 도달하여 혐기성 공급원료 및 산소로부터 완전히 열화된 상부공간을 야기하였다. 생성된 불활성 상부공간 기체(산소-무함유)는 도입된 신선한 공기를 위한 운반 기체로서 전체 가수분해를 통틀어 사용되었다.
이후, 셀룰라제 효소 칵테일 TEC210을 3.75 mg (TCA 단백질)/g dm의 투여량으로 공급원료에 첨가하였다. TEC-210은 WO 2011/000949에 기재된 접종 및 발효 과정에 따라 생성되었다. 총 가수분해 시간은 120 시간이었다.
신선한 공기를 각각 시간 당 반응 혼합물 kg 당 0, 3, 6, 12, 24 또는 48 ㎖의 신선한 공기 유속으로 전체 가수분해 공정 동안 불활성 상부공간 기체의 재순환 루프에 도입하고, 효소 첨가 직후 시작하였다. DO를 모든 실험에서 거듭 측정하였다. 샘플을 HLPC에 의한 글루코스 분석을 위해 실험의 처음 및 마지막에 뽑아냈다.
글루칸 가수분해의 최대 수준을 측정하기 위해 유사한 실험을 셰이크 플라스크에서 수행하였다. 이러한 최대 가수분해는, 상부공간 공기를 함유하는 초과 산소에서 동일한 조건(pH, 온도 및 dm)으로 매우 많은 효소 투여량(50 mg (TCA 단백질)/g dm)으로 공급원료를 항온처리하여 측정하였다. 각각의 실험에서 DO 측정은 변함없이 0% DO를 나타내었다. 이는 반응기에서 재순환 기체 스트림을 함유하는 산소로부터 액체상으로 이의 전달 후 산소의 직접 소모에 의해 설명될 수 있다.
상기 결과를 하기 표 2에 제시하였다. 글루코스 생성 증가는, 각각의 조건(즉, 신선한 공기 유속(㎖/kg/시간) 0, 3, 6, 12, 24, 48 또는 96)에 대하여 가수분해 완료시 글루코스 농도(g/ℓ)로부터 가수분해의 출발시 글루코스 농도(g/ℓ)를 빼고, 각각의 값을 신선한 공기 유속(㎖/kg/시간)이 0일 때 밝혀진 값으로 나눠서 계산된다(이 값은 100%로 설정됨).
데이터는, 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양이 리그노셀룰로스 물질에서 3 g/kg 글루칸 초과로 유지될 때, 더 많은 양의 글루코스가 형성됨을 분명히 입증한다.
실시예 3
리그노셀룰로스 공급원료의 효소적 가수분해에서 글루콘산의 효과
전처리된 옥수수대(20 g)를 50 ml 그라이너(Greiner) 시험관 내에서 50 시간 동안 6% w/w의 건조 물질 수준, pH 4.5 및 62℃에서 건조 물질 g 당 5 mg의 셀룰라제 효소 칵테일 TEC210의 존재 하에서 및 0, 2, 4, 6 또는 8 g/ℓ의 글루콘산의 존재 하에서 항온처리하여 리근셀룰로스 공급원료 중 글루칸의 가수분해시 글루콘산의 억제 효과를 측정하였다.
샘플은 50 시간 항온처리 후 취하고, 추가 분석을 위해 샘플을 에펜도르프 원심분리 유형 5810에서 8 분 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 바이로-라드(Bio-Rad) HPX87H 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 각각의 샘플의 상청액에서 글루코스 농도를 측정하였다. 상기 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에서 제시된 바와 같이 글루코스 방출은 효소적 가수분해(글루칸 가수분해)를 위한 직접 측정이다. 상청액 중 2 g/ℓ의 글루코스 수준은 리그노셀룰로스 물질 중 89 g/kg 글루칸과 상응한다. 이는 1.02 kg/ℓ의 밀도, 2%의 펠렛 인자 및 가수분해물 kg 당 21.6 g의 글루칸 함량으로 상기 기재된 바와 같이 계산될 수 있다.
상기 결과는 높은 농도의 글루콘산이 글루칸 가수분해시 부정적인 효과를 가질 수 있음을 분명히 시사한다.
보정 곡선
표준 최종 농도
(㎍/mL)		 표준 용액 희석물 1(㎕) 표준 용액 희석물 2(㎕) 내부 표준 작동 용액(㎕) 물(㎕)
Std 1 약 0.1 100 100 800
Std 2 약 0.2 200 100 700
Std 3 약 0.5 50 100 850
Std 4 약 1 100 100 800
Std 5 약 2 200 100 700
Std 6 약 5 500 100 400
리그노셀룰로스 공급원료의 효소적 가수분해에서 산소 첨가의 효과
신선한 공기 유속(㎖/kg/h) (신선한 공기를 통해 도입된)산소의 양(mmol/kg 글루칸/시간)* 글루콘산(리그노셀룰로스 물질 중 g/kg 글루칸) 글루코스 생성 증가율(%)
0 0 2.96 -
3 0.36 3.33 12.5
6 0.72 3.82 34
12 1.43 3.82 31
24 2.86 4.93 28
48 5.71 6.40 41
96 11.42 8.99 53
*산소 = 25℃에서 24.5 l/mol 및 글루칸 함량은 72 g/kg 가수분해물임.
효소적 가수분해에서 글루콘산의 효과
첨가된 글루콘산(g/ℓ) 글루콘산(리그노셀룰로스 물질 중 g/kg 글루칸) 글루코스 방출율(%)
0 0 100
2 89 90
4 178 82
6 267 79
8 356 77

Claims (15)

  1. 리그노셀룰로스 물질로부터 당 생성물의 제조 방법으로서,
    (a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질을 전처리하는 단계;
    (b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 세척하는 단계;
    (c) 2종 이상의 셀룰라제를 포함하고 적어도 LPMO를 포함하는 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하는 단계; 및
    (d) 임의적으로, 글루코스-함유 조성물을 회수하는 단계
    를 포함하되, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 적당량의 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지하는, 방법.
  2. 리그노셀룰로스 물질로부터 발효 생성물의 제조 방법으로서,
    (a) 임의적으로, 리그노셀룰로스 물질을 전처리하는 단계;
    (b) 임의적으로, 상기 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 세척하는 단계;
    (c) 2종 이상의 셀룰라제를 포함하고 적어도 LPMO를 포함하는 효소 조성물을 사용하여 임의적으로 세척되고/되거나 임의적으로 전처리된 리그노셀룰로스 물질을 효소적 가수분해하고, 임의적으로, 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 정제하는 단계;
    (d) 가수분해된 리그노셀룰로스 물질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및
    (e) 임의적으로, 발효 생성물을 회수하는 단계
    를 포함하되, 전처리 후 및 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 적당량의 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여, 셀룰로스 및/또는 셀로-올리고사카라이드를 함유하는 리그노셀룰로스 물질의 LPMO에 의한 산화에 의한 효소적 가수분해 완료시 형성된 글루콘산의 양을 리그노셀룰로스 물질에 존재하는 글루칸 kg 당 3 내지 80 g으로 유지하는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    발효를 1종 이상의 C5 당을 발효시킬 수 있는 미생물로 수행하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    미생물이 유전적으로 변형된 사카로마이세스 세레비지애 종인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 가수분해 단계 (c) 동안 산소를 리그노셀룰로스 물질에 첨가하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산소를 기포 형태로 첨가하는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 가수분해를 위한 반응기가 1 m3 이상의 부피를 갖는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 가수분해 시간이 5 시간 내지 150 시간인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용된 효소 조성물이 30 시간 이상 동안 활성을 보유하는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가수분해를 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상의 온도에서 수행하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 조성물이 진균, 바람직하게는 라삼소니아 속의 미생물로부터 유래되거나, 효소 조성물이 진균 효소, 바람직하게는 라삼소니아 효소를 포함하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가수분해 단계 (c)에서 건조 물질 함량이 10 중량% 이상, 바람직하게는 14 중량% 이상, 보다 바람직하게는 14 내지 33 중량%인, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 가수분해를 회분식(batch), 유가식(fed batch) 및/또는 연속식(continuous) 배양 반응기에서 수행하는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 조성물이 진균의 전체 발효 브로쓰의 형태로 존재하는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산소를 공기와 같은 산소 함유 기체로서 도입하는, 방법.


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