RS65254B1 - Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na postupak za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO, i (d) izborno, izolacija kompozicije koja sadrži glukozu, pri čemu se formirana količina glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celooligosaharide održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom koraka enzimske hidrolize (c) u lignocelulozni materijal. Pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO, i izborno prečišćavanje hidrolizovanog lignoceluloznog materijala, (d) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog materijala za proizvodnju proizvoda fermentacije, i (e) izborno, izolacija proizvoda fermentacije, pri čemu količina formirane glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celooligosaharide se održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom koraka enzimske hidrolize (c) u lignocelulozni materijal.

Stanje tehnike

[0002] Lignocelulozni biljni materijal, koji se ovde naziva i sirovina, je obnovljiv izvor energije u obliku šećera koji se može pretvoriti u vredne proizvode npr. šećer ili biogorivo, kao što je bioetanol. Tokom ovog postupka, (ligno- ili hemi)celuloza prisutna u sirovini, kao što je pšenična slama, kukuruzni stover, pirinčana ljuska, itd., se pretvara u redukcione šećere pomoću (hemi)celulolitičkih enzima, koji se zatim izborno pretvaraju u vredne proizvode kao što je etanol pomoću mikroorganizama kao što su kvasac, bakterije i gljive.

[0003] Pošto je (hemi)celuloza kristalna i zarobljena u mreži lignina, konverzija u redukujuće šećere je generalno spora i nepotpuna. Tipično, enzimska hidroliza netretirane sirovine daje šećere <20% od teorijske količine. Primenom hemijskog i termo-fizičkog prethodnog tretmana, (hemi)celuloza je pristupačnija za (hemi)celulolitičke enzime i samim tim konverzije idu brže i sa većim prinosima.

[0004] Tipičan prinos etanola iz glukoze, dobijen iz prethodno tretiranog kukuruza, je 40 galona etanola na 1000 kg suvog kukuruza (Badger P., Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick and A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA) ili 0.3 g etanola po g sirovine. Maksimalni prinos etanola na bazi celuloze je približno 90%.

[0005] Celulolitički enzimi - većinu njih proizvode vrste poput Trichoderma, Humicola i Aspergillus - komercijalno se koriste za pretvaranje prethodno tretiranih sirovina u kašu koja sadrži nerastvorljivu (hemi)celulozu, redukcione šećere napravljene od njih i lignin. Termostabilni celulolitički enzimi izvedeni iz Rasamsonia, korišćeni su za razgradnju lignoceluloznih sirovina i ovi enzimi su poznati po svojoj termostabilnosti, videti WO 2007/091231. Proizvedena kaša se koristi u fermentaciji tokom koje se redukcioni šećeri pretvaraju u biomasu kvasca (ćelije), ugljen-dioksid i etanol. Etanol proizveden na ovaj način naziva se bioetanol.

[0006] Uobičajena proizvodnja šećera iz prethodno tretirane lignocelulozne sirovine, hidroliza koja se takođe naziva likvifikacija, presaharifikacija ili saharifikacija, obično se izvodi tokom postupka koji traje od 6 do 168 sati (Kumar S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526) na povišenim temperaturama od 45 do 50°C i nesterilnim uslovima. Tokom ove hidrolize, prisutna celuloza se delimično (obično 30 do 95%, u zavisnosti od aktivnosti enzima i uslova hidrolize) pretvara u redukcione šećere. U slučaju inhibicije enzima jedinjenjima prisutnim u prethodno tretiranoj sirovini i oslobođenim šećerima i da bi se termička inaktivacija svela na minimum, ovaj period povišene temperature se minimizira što je više moguće.

[0007] Fermentacija nakon hidrolize izvodi se u posebnom, poželjno anaerobnom koraku postupka, bilo u istoj ili u drugoj posudi, u kojoj se temperatura podešava na 30 do 33°C (mezofilni postupak) da bi se prilagodio rast i proizvodnja etanola pomoću mikrobne biomase, obično kvasaca. Tokom ovog postupka fermentacije, preostali (hemi)celulozni materijal se pretvara u redukcione šećere pomoću enzima koji su već prisutni u koraku hidrolize, dok se stvaraju mikrobna biomasa i etanol. Fermentacija je završena kada se (hemi)celulozni materijal pretvori u fermentabilne šećere i svi fermentabilni šećeri se pretvore u etanol, ugljen-dioksid i mikrobne ćelije. Ovo može potrajati do 6 dana. Generalno, ukupno vreme postupka hidrolize i fermentacije može iznositi do 13 dana.

[0008] Tako dobijenu fermentisanu kašu čine šećeri koji se ne mogu fermentisati, nehidrolizujući (hemi)celulozni materijal, lignin, mikrobne ćelije (najčešće ćelije kvasca), voda, etanol, rastvoreni ugljen-dioksid. Tokom uzastopnih koraka, etanol se destiluje iz kaše i dalje prečišćava. Preostala čvrsta suspenzija se suši i koristi kao, na primer, gorivo za sagorevanje, đubrivo ili hrana za stoku.

[0009] WO 2010/080407 predlaže tretiranje celuloznog materijala kompozicijom celulaze u anaerobnim uslovima. Uklanjanje ili isključivanje reaktivnih vrsta kiseonika može poboljšati performanse sistema enzima koji hidrolizuju celulozu. Hidroliza celuloznog materijala, npr. lignoceluloza, enzimskom kompozicijom može biti redukovana oksidativnim oštećenjem komponenti enzimske kompozicije i/ili oksidacijom celuloznog materijala pomoću, na primer, molekularnog kiseonika.

[0010] WO 2009/046538 otkriva postupak za tretiranje biljnih materijala lignoceluloznih sirovina za oslobađanje fermentabilnih šećera korišćenjem postupka enzimske hidrolize za tretman materijala koji se izvodi pod vakuumom i koji proizvodi struju postupka bogatu u šećeru koja sadrži smanjene količine isparljivih jedinjenja koja inhibiraju šećer/fermentaciju kao što su furfural i sirćetna kiselina. Osim uklanjanja isparljivih inhibitornih jedinjenja, druga jedinjenja i/ili molekuli koji se takođe uklanjaju uključuju azot, kiseonik, argon i ugljendioksid.

[0011] Canella et al. (2013) opisuju uticaj pripreme izabranog enzima i strategiju tretmana na finalni prinos etanola i ukupni učinak, dok WO 2011/000949 opisuje razne sojeve Talaromyces i enzimske kompozicije proizvedene od navedenih sojeva.

[0012] Uz svaku seriju sirovine, enzimi se dodaju kako bi se maksimizirao prinos i brzina fermentabilnih šećera oslobođenih iz prethodno tretirane lignocelulozne sirovine tokom datog vremena postupka. Generalno, troškovi za proizvodnju enzima, sirovine za prinose etanola i investicije su glavni faktori troškova u ukupnim troškovima proizvodnje (Kumar S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009) 517-526). Do sada se troškovi smanjenja upotrebe enzima postižu primenom enzimskih proizvoda iz jednog ili iz više mikrobnih izvora (WO 2008/008793) sa širom i/ili većom (specifičnom) hidrolitičkom aktivnošću čija upotreba ima za cilj nižu potrebu za enzimima, brže stope konverzije i/ili veće prinose konverzije, a time i sveukupno niže troškove proizvodnje bioetanola. Ovo zahteva velika ulaganja u istraživanje i razvoj ovih enzimskih proizvoda. U slučaju enzimskog proizvoda sastavljenog od enzima iz više mikrobnih izvora, potrebna su velika kapitalna ulaganja za proizvodnju svakog pojedinačnog enzimskog jedinjenja.

[0013] Zbog toga je poželjno poboljšati gornji postupak koji uključuje hidrolizu i fermentaciju.

Suština pronalaska

[0014] Cilj pronalaska je stoga da obezbedi postupak u kome se korak hidrolize sprovodi u poboljšanim uslovima. Sledeći cilj pronalaska je da obezbedi postupak koji uključuje hidrolizu sa skraćenim vremenom postupka. Dodatni cilj pronalaska je da obezbedi postupak, u kome se doza enzima može smanjiti, a da se u isto vreme izlaz korisnog proizvoda hidrolize održava na istom nivou ili čak povećava. Sledeći cilj je da se obezbedi postupak koji uključuje hidrolizu, pri čemu su uslovi postupka hidrolize optimizovani. Dodatni cilj pronalaska je da obezbedi postupak koji uključuje hidrolizu, pri čemu se izlaz korisnog proizvoda hidrolize povećava korišćenjem iste doze enzima. Jedan ili više ovih ciljeva se postižu prema pronalasku.

[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu proizvoda od šećera od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO, i (d) izborno, izolacija kompozicije koja sadrži glukozu, pri čemu se formirana količina glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celo-oligosaharida održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom korak enzimske hidrolize (c) u lignocelulozni materijal.

[0016] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO, i izborno prečišćavanje hidrolizovanog lignoceluloznog materijala, (d) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog materijala za proizvodnju proizvoda fermentacije, i (e) izborno, izolacija proizvoda fermentacije, pri čemu količina formirane glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celooligosaharide se održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom koraka enzimske hidrolize (c) u lignocelulozni materijal.

[0017] Oksidacija lignoceluloznog materijala pomoću LPMO dovodi do oksidovanih polisaharida koji se tokom hidrolize hidrolizuju, između ostalog, u glukozu i oksidovane jedinice glukoze kao što su glukonska kiselina ili diol. Generalno, 1 molekul kiseonika (O2) daje jedan mol proizvoda oksidacije. Kiseonik se takođe može uzeti u sirovinu (npr. lignin).

[0018] Kiseonik se dodaje tokom koraka enzimske hidrolize c).

[0019] U poželjnom primeru izvođenja kiseonik se dodaje u obliku (gasovitih) mehurića.

[0020] Iznenađujuće, prema pronalasku dodavanjem kiseonika moguće je postići mnoge prednosti postupka, uključujući optimalne temperaturne uslove, skraćeno vreme postupka, smanjenu dozu enzima, ponovnu upotrebu enzima, veće prinose i druge optimizacije postupka, što rezultira smanjenjem troškova.

[0021] U jednom primeru izvođenja ovog postupka vreme fermentacije je 5 do 120 sati. U jednom primeru izvođenja korišćena stabilna enzimska kompozicija zadržava aktivnost 30 sati ili više. Prema sledećem primeru izvođenja, hidroliza se poželjno izvodi na temperaturi od 45°C ili više, poželjnije na temperaturi od 50°C ili više i još poželjnije na temperaturi od 55°C ili više. U poželjnom primeru izvođenja enzimska kompozicija je izvedena iz gljive, poželjno mikroorganizma iz roda Rasamsonia ili enzimska kompozicija sadrži enzim gljive, poželjno Rasamsonia enzim. Postupak pronalaska će biti detaljnije ilustrovan u nastavku.

Detaljan opis pronalaska

[0022] U ovoj specifikaciji i pratećim zahtevima, reči "sadrže" i "uključuju" i varijacije kao što su "sadrži", "koji sadrži", "uključuje" i "uključujući" treba da se tumače inkluzivno. Odnosno, ove reči imaju za cilj da prenesu moguće uključivanje drugih elemenata ili celih brojeva koji nisu posebno navedeni, gde to kontekst dozvoljava. Članovi "a" i "an" se ovde koriste da upućuju na jedan ili više od jednog (tj. na jedan ili najmanje jedan) gramatički objekat člana. Na primer, "element" može značiti jedan element ili više od jednog elementa.

[0023] U kontekstu ovog pronalaska, "poboljšano", "povećano", "smanjeno" se koristi da ukaže da ovaj pronalazak pokazuje prednost u poređenju sa istom situacijom, postupkom ili uslovima postupka osim što se ne dodaje dodatni kiseonik. U kontekstu ovog pronalaska "mereno pod istim uslovima" ili "analizirano pod istim uslovima" itd. znači da se postupak pronalaska i isti postupak bez dodavanja kiseonika izvode pod istim uslovima (osim dodavanja kiseonika) i da se rezultati ovog postupka, ako se uporede sa postupkom bez dodavanja kiseonika, mere korišćenjem istih uslova, poželjno korišćenjem istog testa i/ili metodologije, poželjnije u okviru istog ili paralelnog eksperimenta. Uslovi hidrolize su primer takvih uslova.

[0024] U prethodnom stanju tehnike predloženo je da se poboljša hidroliza celulolitičkog materijala korišćenjem anaerobnih (WO 2010/080407) ili vakuumskih (WO 2009/046538) uslova tokom enzimske hidrolize. U postupcima oba dokumenta nivo kiseonika je smanjen. Sada je iznenađujuće otkriveno da hidroliza ovog pronalaska pokazuje rezultate u poboljšanom reakcionom proizvodu koji daje veće količine (smanjenih) proizvoda šećera i/ili željenih proizvoda fermentacije u fermentaciji nakon hidrolize u poređenju sa postupkom u kojem nije dodat kiseonik. Generalno, primećeno je povećanje konverzije glukoze od 5 do 15 tež./tež.%.

[0025] Kiseonik se može dodati na nekoliko načina. Na primer, kiseonik se može dodati kao gas kiseonik, gas obogaćen kiseonikom kao što je vazduh obogaćen kiseonikom ili vazduh. Kiseonik se može dodavati kontinuirano ili diskontinuirano. Pod "dodatim" kiseonikom se podrazumeva da se kiseonik dodaje u tečnu fazu (koja sadrži lignocelulozni materijal) u reaktoru za hidrolizu, a ne da je kiseonik prisutan u gornjem prostoru u reaktoru iznad tečne faze, pri čemu kiseonik mora da difunduje iz odvodnog prostora u tečnu fazu. Poželjno, kiseonik se dodaje ili stvara u tečnoj fazi (koja sadrži lignocelulozni materijal) u reaktoru za hidrolizu. Dakle, poželjno je da se kiseonik dodaje kao mehurići, najpoželjnije kao mali mehurići. U jednom primeru izvođenja, mehurići imaju prečnik od najmanje 0.5 mm, najmanje 1 mm, najmanje 1.5 mm, najmanje 2 mm, najmanje 2.5 mm, najmanje 3 mm, najmanje 3.5 mm, najmanje 4 mm, na najmanje 4.5 mm, najmanje 5 mm. U jednom primeru izvođenja, mehurići imaju prečnik između 0.5 mm i 500 mm, poželjno između 0.5 mm i 400 mm, između 0.5 mm i 300 mm, između 0.5 mm i 200 mm, između 0.5 mm i 100 mm.

[0026] Pronalazači postavljaju hipotezu da se u (enzimskoj) hidrolizi (korak) amorfni i kristalni polisaharidi ili celuloza hidrolizuju u šećere kao što je glukoza. Amorfni polisaharidi se, na primer, pretvaraju u oligosaharide pomoću endoglukonaza, nakon čega se oligosaharidi mogu konvertovati celobiohidrolazom (CBH) i beta-glukozidazom (BG) u glukozu. Konverzija kristalnih polisaharida može se izvoditi paralelno ili uzastopno i nastaviti čak i kada je većina amorfnih polisaharida hidrolizovana. Prema ovoj hipotezi, posebno dodavanje kiseonika u kombinaciji sa LPMO je korisno tokom hidrolize kristalnih polisaharida, na primer u razgradnji polisaharida u oligosaharide. Zbog toga je dodavanje kiseonika veoma korisno, posebno u fazi u kojoj se kristalni polisaharidi pretvaraju pomoću enzima. Izvan ove faze, nikakvo dodavanje kiseonika ili dodavanje manje kiseonika ne može biti efikasnije. Ova hipoteza je data samo kao moguće objašnjenje efekta koji su primetili pronalazači i ovaj pronalazak ne potpada ili ne stoji sa ispravnošću ove teorije.

[0027] Kristalna struktura glukana može se otvoriti pomoću litičke polisaharid monooksigenaze (LPMO). Ovaj tip enzima otvara strukturu oksidacijom glikozidnih veza i čini je pristupačnom za druge celulolitičke enzime za dalju hidrolizu oligosaharida u glukozu.

[0028] Najpoznatiji LPMO formiraju aldonske kiseline, tj. proizvode oksidovane na C1 poziciji terminalnog šećera na mestu cepanja. Ova oksidovana jedinica glukoze se oslobađa kao glukonska kiselina tokom hidrolize. Pored toga, prijavljena je oksidacija C4 i C6 ne-redukcione jedinice glukoze na mestu cepanja. Na primer, T. Isaksen et. al. (vide supra) objavili su oksidaciju C4 pozicije, neredukcionog krajnjeg dela, što rezultira keto-šećerom na poziciji C4, koji je u ravnoteži sa C4 geminalnim diolom u vodenom rastvoru. Pronalazači ovog pronalaska predstavljaju da su hidrolizovani oksidacioni proizvodi kao na primer glukonska kiselina, mera za učinke primenjenog LPMO u hidrolizi lignoceluloze.

[0029] Iznenađujuće, ovi pronalazači su otkrili da optimalna hidroliza lignoceluloze (više od 70% konverzije glukana) ide ruku pod ruku sa optimalnim formiranjem oksidacionih proizvoda pomenutih gore, kao što je na primer glukonska kiselina. Biće očigledno da se optimalna hidroliza lignoceluloze može postići samo kada se (kristalna) celuloza i celulo-oligosaharidi optimalno hidrolizuju. Ova optimalna hidroliza delovanjem LPMO će rezultirati stvaranjem oksidacionog proizvoda, poput glukonske kiseline. Nema proizvoda oksidacije znači manje efikasnu hidrolizu (kristalnog) glukana. Međutim, previsoki nivoi oksidacionih proizvoda poput glukonske kiseline biće na štetu glukoze i stoga će prinos glukoze na (početnom) glukanu opasti. Količina formirane glukonske kiseline oksidacijom LPMO celuloze i/ili celuloznih oligosaharida povoljno se održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom enzimske hidrolize u lignocelulozni materijal. Količina formirane glukonske kiseline oksidacijom celuloze i/ili celooligosaharida je najpoželjnije 5 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu.

[0030] Postupkom u skladu sa ovim pronalaskom, povoljno se dobijaju veći prinosi glukoze. Dodavanje većih količina kiseonika će dovesti do toga da se umesto glukoze proizvodi više glukonske kiseline, a sa druge strane u slučaju manjih količina kiseonika LPMO nije u stanju da funkcioniše optimalno. Pored toga, primećeno je da previsoke količine oksidacionih proizvoda poput glukonske kiseline mogu inhibirati celulaze ili hemicelulaze ili u slučaju da se hidrolizat naknadno fermentiše, glukonska kiselina može imati negativan efekat na fermentaciju inhibiranjem mikroorganizama, kao što je kvasac, koristi se u fermentaciji. Gore navedene količine su količine na kraju hidrolize

[0031] Generalno, količina kiseonika koja se dodaje tokom enzimske hidrolize lignoceluloznom materijalu može se kontrolisati ili menjati na nekoliko načina. Ograničenje isporučenog kiseonika je moguće dodavanjem samo kiseonika tokom dela vremena hidrolize. Druga opcija je dodavanje kiseonika u niskoj koncentraciji, na primer korišćenjem mešavine vazduha i recikliranog vazduha (vazduh koji izlazi iz reaktora za hidrolizu) ili „razblaživanjem“ vazduha inertnim gasom. Povećanje količine dodatog kiseonika može se postići dodavanjem kiseonika tokom dužih perioda hidrolize, dodavanjem kiseonika u višoj koncentraciji ili dodavanjem više vazduha. Druga opcija za promenu unosa kiseonika je variranje temperature hidrolize, viša temperatura će uzrokovati nižu maksimalnu koncentraciju zasićenja kiseonika u sadržaju reaktora. Drugi način upravljanja koncentracijom kiseonika je dodavanje potrošača kiseonika ili generatora kiseonika. U slučaju da enzim može biti oštećen prisustvom ili dodavanjem kiseonika, može se koristiti blaži dovod kiseonika. U tom slučaju se može naći ravnoteža između poboljšane proizvodnje glukoze i učinka enzima. Dodavanje kiseonika celulolitičkom materijalu vrši se tokom enzimske hidrolize. U slučaju da se kiseonik dodaje u gasovitom obliku, gas koji sadrži kiseonik može da se uvede, na primer, duva, u tečni sadržaj reaktora za hidrolizu celulolitičkog materijala. U sledećem primeru izvođenja pronalaska gas koji sadrži kiseonik se uvodi u tok tečnog celulolitičkog materijala koji će ući u reaktor za hidrolizu. U sledećem primeru izvođenja pronalaska gas koji sadrži kiseonik se uvodi zajedno sa celulolitičkim materijalom koji ulazi u reaktor za hidrolizu ili sa delom tečnog sadržaja reaktora koji prolazi kroz spoljnu petlju reaktora. U većini slučajeva dodavanje kiseonika pre ulaska u reaktor hidrolize nije dovoljno i dodavanje kiseonika se vrši i tokom hidrolize. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, gasovita faza prisutna u gornjem delu reaktora (glavni prostor) se kontinuirano ili diskontinualno osvežava gasom koji sadrži kiseonik. U poslednjem slučaju (snažno) miksanje ili mešanje je potrebno da se kiseonik dobije u obliku mehurića i/ili difuzijom u tečni sadržaj reaktora, poželjno u kombinaciji sa nadpritiskom u reaktoru. Uopšteno govoreći, ispiranje gornjeg prostora vazduhom u kombinaciji sa (snažnim) mešanjem ili mešanjem može uvesti dovoljno kiseonika u celulozni materijal u reaktoru za hidrolizu za reaktore veličine do 100 litara do 1 m<3>. U većim razmerama, na primer u reaktoru od 50 m<3>ili više, na primer 100 m<3>, toliko energije je potrebno za snažno mešanje da se sa ekonomske tačke gledišta ovo neće primeniti u komercijalnom operativnom postupku.

[0032] Kao što je ovde opisano, količina formirane glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celooligosaharide održava se između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu pomoću dodavanja odgovarajuće količine kiseonika tokom enzimske hidrolize u lignocelulozni materijal. U jednom primeru izvođenja "prikladna količina kiseonika" je 20 - 10000 mmol kiseonika po kg glukana, poželjno 30 - 5000 mmol kiseonika po kg glukana, poželjnije 40 – 4 000 mmol kiseonika po kg glukana i najpoželjnije 50 - 3500 mmol kiseonika po kg glukana. Količina kiseonika je celokupna količina kiseonika dodata tokom enzimske hidrolize.

[0033] Prema ovom pronalasku kiseonik se dodaje tokom dela koraka hidrolize, tokom celog koraka hidrolize ili kombinacije pre ili tokom koraka hidrolize. Povoljno je da se kiseonik dodaje tokom prve polovine koraka hidrolize. Dodavanje kiseonika tokom samo dela hidrolize može da se uradi na primer u slučaju da dođe do oksidacionog oštećenja enzima (jednog ili više). U slučaju da kiseonik prisutan u sadržaju reaktora za hidrolizu ili proizvod šećera ili hidrolizat koji se formira u koraku hidrolize može uticati ili poremetiti sledeći korak fermentacije, dodavanje kiseonika se može izvršiti osim u poslednjem delu hidrolize i na taj način (većina) kiseonik se troši pre nego što hidrolizovana biomasa uđe u reaktor za fermentaciju.

[0034] Nekoliko primera aeracije tokom postupka enzimske hidrolize dato je u Primerima da bi se pokazalo blagotvorno dejstvo ovog pronalaska. Ovaj blagotvorni efekat je pronađen za nekoliko supstrata ili sirovina i stoga se veruje da je prisutan za hidrolizu svih vrsta supstrata ili sirovina.

[0035] Nekoliko primera enzimskih kompozicija za postupak enzimske hidrolize dato je u Primerima da bi se pokazalo blagotvorno dejstvo ovog pronalaska. Ovaj blagotvorni efekat je pronađen za nekoliko enzimskih kompozicija i stoga se veruje da je prisutan za sve vrste hidrolizujućih enzimskih kompozicija.

[0036] Koncentracija kiseonika u tečnoj fazi (DO), u kojoj je lignocelulozni materijal prisutan tokom enzimske hidrolize, iznosi najmanje 0.001 mol/m<3>, poželjno najmanje 0.002 mol/m<3>, poželjnije najmanje 0.003 mol/m<3>i još poželjnije više od 0.01 mol/m<3>, na primer više od 0.02 mol/m<3>ili 0.03 mol/m<3>. U reaktorima manjim od 1 m<3>vrednosti DO ispod 0.01 mol/m<3>ili 0.02 mol/m<3>dobiće se sporim mešanjem. Snažno miksanje ili mešanje na takvoj skali uvodi deo gasne faze nadprostora u reakcionu tečnost. Na primer, miksanje ili mešanje može stvoriti vrtlog koji uvlači kiseonik u tečnost. Uopšteno govoreći, ispiranje gornjeg prostora vazduhom u kombinaciji sa (snažnim) miksanjem ili mešanjem će uvesti dovoljno kiseonika u celulozni materijal u reaktoru za hidrolizu za reaktore veličine do 100 litara do 1 m.<3>. U većim razmerama, na primer u reaktoru od 50 m<3>ili više, na primer 100 m<3>, toliko energije je potrebno za snažno mešanje da se sa ekonomske tačke gledišta ovo neće primeniti u komercijalno operativnom postupku. Generalno, u velikim reaktorima miksanje ili mešanje bez uvođenja vazduha ili kiseonika će dovesti do vrednosti DO manjih od 0.01 mol/m<3>.

[0037] Tokom stvaranja ili proizvodnje kiseonika, koncentracija kiseonika u tečnoj fazi (aeracija ili dodavanje kiseonika), koncentracija kiseonika u tečnoj fazi u kojoj je lignocelulozni materijal prisutan tokom enzimske hidrolize, poželjno je najviše 80% koncentracije zasićenja kiseonik pod uslovima reakcije hidrolize, poželjnije najviše 0.12 mol/m<3>, još poželjnije najviše 0.09 mol/m<3>, još poželjnije najviše 0.06 mol/m<3>, još poželjnije najviše 0.045 mol/m<3>i najpoželjnije najviše 0.03 mol/m<3>. Gore navedeno objašnjava situaciju kada je brzina prenosa kiseonika lignoceluloznog materijala veća od brzine uzimanja kiseonika (OUR) lignoceluloznog materijala. Kada je potrošnja kiseonika (OUR) veća od brzine prenosa kiseonika, koncentracija kiseonika je 0 mol/m<3>. Temperatura i pritisak će uticati na DO. Poželjni i primeri mol/m<3>gore navedene vrednosti se odnose na normalan atmosferski pritisak i temperaturu od oko 62°C. Stručnjaku u ovoj oblasti tehnike će biti jasne povoljne vrednosti DO na osnovu predmetnih učenja.

[0038] Kiseonik se troši u količini koja odgovara između 20 i 5000 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu. Poželjno, kiseonik se troši u količini koja odgovara između 22 i 4500 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu, između 24 i 4000 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu, između 26 i 3500 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu, između 28 i 3400 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu. Kiseonik se dodaje posle prethodnog tretmana i pre i/ili tokom enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala, poželjno u količini koja odgovara najmanje 30 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu, poželjnije u količini koja odgovara na najmanje 40 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu, a najpoželjnije u količini koja odgovara najmanje 50 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu. Sav kiseonik koji je dodat sistemu biće prebačen u tečnost i korišćen za hidrolizu. Ova količina se može kontrolisati merenjem i kontrolom količine vazduha unešenog u sistem.

[0039] Dalje, kiseonik se troši u količini koja odgovara između 0.17 i 41.7 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat. Poželjno, kiseonik se troši u količini koja odgovara između 0.18 i 37.5 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat, između 0.20 i 33.3 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat, između 0.22 i 29 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat, između 0.22 i 29 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat, između 0.23 i 28.3 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat. Poželjnije, kiseonik se troši u količini koja odgovara između 0.36 i 27.8 mmol molekulskog kiseonika po kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu na sat. Sav kiseonik koji je dodat sistemu biće prebačen u tečnost i korišćen za hidrolizu. Ova količina se može kontrolisati merenjem i kontrolom količine vazduha unešenog u sistem. "Na sat" kako se ovde koristi znači na sat hidrolize.

[0040] Dodatak kiseonika u obliku vazduha ili drugog gasa koji sadrži kiseonik prema pronalasku se takođe može koristiti za bar delimično miksanje ili mešanje sadržaja reaktora za hidrolizu. Drugi načini dodavanja kiseonika uključuju in situ stvaranje kiseonika. Na primer, kiseonik se generiše elektrolizom, kiseonik se proizvodi enzimatski, poželjno dodavanjem peroksida, ili se kiseonik proizvodi hemijski pomoću sistema za generisanje kiseonika kao što je KHSO. Na primer, kiseonik se proizvodi iz peroksida pomoću katalaze. Peroksid se može dodati u obliku rastvorenog peroksida ili generisati enzimskom ili hemijskom reakcijom. U slučaju da se katalaza koristi kao enzim za proizvodnju kiseonika, može se koristiti katalaza prisutna u enzimskoj kompoziciji za hidrolizu ili se u tu svrhu može dodati katalaza.

[0041] Predmetni postupak pronalaska pokazuje prednosti posebno na pilot postrojenju i industrijskom nivou. Prema jednom primeru izvođenja pronalaska, reaktor za enzimsku hidrolizu ima zapreminu od 1 m<3>ili više. Poželjno, reaktor ima zapreminu od najmanje 1 m<3>, najmanje 2 m<3>, najmanje 3 m<3>, najmanje 4 m<3>, najmanje 5 m<3>, najmanje 6 m<3>, najmanje 7 m<3>, najmanje 8 m<3>, najmanje 9 m<3>, najmanje 10 m<3>, najmanje 15 m<3>, najmanje 20 m<3>, najmanje 25 m<3>, najmanje 30 m<3>, najmanje 35 m<3>, najmanje 40 m<3>, najmanje 45 m<3>, najmanje 50 m<3>, najmanje 60 m<3>, najmanje 70 m<3>, najmanje 75 m<3>, najmanje 80 m<3>, najmanje 90 m<3>, najmanje 100 m<3>, najmanje 200 m<3>, najmanje 300 m<3>, najmanje 400 m<3>, najmanje 500 m<3>, najmanje 600 m<3>, najmanje 700 m<3>, najmanje 800 m<3>, najmanje 900 m<3>, najmanje 1000 m<3>, najmanje 1500 m<3>, najmanje 2000 m<3>, najmanje 2500 m<3>. Generalno, reaktor će biti manji od 3000 m<3>ili 5000 m<3>. Može se koristiti nekoliko reaktora. Reaktori koji se koriste u postupcima ovog pronalaska mogu imati istu zapreminu, ali takođe mogu imati različitu zapreminu.

[0042] Pronalazač postavlja teoriju da je posebno u velikim razmerama nedovoljno kiseonika dostupno za hidrolizu, što može biti posledica ograničenja prenosa kiseonika u reaktoru, na primer u celulolitičkoj biomasi. U laboratorijskim eksperimentima ova insuficijencija kiseonika može igrati manje važnu ulogu. Odnos površine (ili kontaktne površine kiseonika sadržaja reaktora) i zapremine reaktora je povoljniji za eksperimente malih razmera nego u eksperimentima velikih razmera. Pored toga, mešanje u eksperimentima malih razmera je relativno lakše nego u velikim. Tokom ovih eksperimenata malih razmera, transport kiseonika iz glavnog prostora reaktora za hidrolizu je brži nego u poređenju sa situacijom u eksperimentima velikih razmera. Ova teorija je data samo kao moguće objašnjenje efekta koji su primetili pronalazači i ovaj pronalazak ne potpada ili ne stoji sa ispravnošću ove teorije. Prema sledećem primeru izvođenja pronalaska, dodavanje kiseonika se može koristiti za kontrolu bar delimično postupka hidrolize.

[0043] Postupak pronalaska se povoljno primenjuje u kombinaciji sa upotrebom termostabilnih enzima.

[0044] "Termostabilni" enzim znači da enzim ima optimalnu temperaturu od 60°C ili više, na primer 70°C ili više, kao što je 75°C ili više, na primer 80°C ili više, kao što je 85°C ili više. Oni na primer mogu biti izolovani od termofilnih mikroorganizama, ili mogu biti dizajnirani od strane stručnjaka i veštački sintetisani. U jednom primeru izvođenja polinukleotidi mogu biti izolovani ili dobijeni iz termofilnih ili termotolerantnih filamentoznih gljiva ili izolovani iz netermofilnih ili netermotolerantnih gljiva, ali je utvrđeno da su termostabilni.

[0045] Pod "termofilnom gljivom" se podrazumeva gljiva koja raste na temperaturi od 50°C ili više. Pod "temotolerantnom" gljivom se podrazumeva gljiva koja raste na temperaturi od 45°C ili više, sa maksimumom blizu 50°C.

[0046] Primeri termofilnih sojeva gljiva su Rasamsonia emersonii (ranije poznata kao Talaromyces emersoni). Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii i Rasamsonia emersonii se ovde koriste naizmenično.

[0047] Pogodne termofilne ili termotolerantne gljivične ćelije mogu biti ćelija Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ili Thielavia, poželjno ćelija Rasamsonia emersonii. Poželjne su termofilne ili termotolerantne gljive Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus i Thielavia terrestris.

[0048] Termofilne gljive nisu ograničene na određeni taksonomski red i javljaju se po celom gljivičnom drvetu života. Primeri su Rhizomucor u Mucorales, Myceliophthora u Sordariales i Talaromyces, Thermomyces i Thermoascus u Eurotiales (Mouchacca 1997). Većina Talaromyces vrsta su rnezofili, ali izuzeci su vrste unutar sekcija Emersonii i Thermophila. Sekcija Emersonii uključuje Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus i Talaromyces leycettanus, svi oni dobro rastu na 40°C. Talaromyces bacillisporus je termotolerantna, Talaromyces leicettanus je termotolerantna do termofilna, i Talaroyices emersonii i Talaromyces byssochlamydoides su zaista termofilni (Stolk and Samson, 1972). Jedini član Talaromyces sekcije Thermophila, T. thermophilus, brzo raste na 50°C (Evans and Stolk, 1971; Evans, 1971; Stolk and Samson, 1972). Trenutna klasifikacija ovih termofilnih Talaromyces vrsta se uglavnom zasniva na fenotipskim i fiziološkim karakteristikama, kao što su njihova sposobnost rasta iznad 40°C, boja askospora, struktura askornatalnog pokrivača i formiranje određenog tipa anamorfa. Stolk i Samson (1972) su naveli da članovi sekcije Emersonii imaju anamorfe bilo kojeg Paecilomyces (T. byssochlamydoides i T. leycettanus) ili Penicillium cilyndrosporum serija (T. emersonii i T. bacillisporus). Kasnije je Pitt (1979) preneo vrstu koja pripada Penicillium cylindrosporum serije u rod Geosmithia, na osnovu različitih karaktera kao što je formiranje konidija iz terminalnih pora umesto na koluli (vratovima), karakter Penicillium i Paecilomyces. U okviru roda Geosmithia, samo G. argilacea je termotolerantna, a Stolk et al. (1969) i Evans (1971) predložili su vezu sa članovima Talaromyces sect. Emersonii. Filogenetski odnos temofilnog Talaromyces vrste unutar Talaromyces i Trichocomaceae je nepoznat (videti J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek, 2012 Feb;101(2):403-21).

[0049] Rasamsonia je novi rod koji sadrži termotolerantne i termofilne Talaromyces i Geosmithia vrste (J. Houbraken et al., vida supra). Na osnovu fenotipskih, fizioloških i molekularnih podataka, Houbraken et al. je predložio prenos vrste T. emersonii, T. byssochlamydoides, T. eburneus, G. argilacea i G. cylindrospora u Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii i Rasamsonia emersonii se ovde koriste naizmenično.

[0050] Poželjne termofilne gljive su Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus i Thermoascus aurantiacus.

[0051] "Filamentozne gljive" obuhvataju sve filamentozne oblike podreda Eumycota i Oomycota (kako je definisano od Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Filamentozne gljive karakteriše micelijski zid građen od hitina, celuloze, glukana, hitosana, manana i drugih složenih polisaharida. Vegetativni rast je izduženjem hifa, a katabolizam ugljenika je obavezno aeroban. Filamentozni gljivični sojevi uključuju, ali nisu ograničeni na, sojeve Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma i Trichophyton.

[0052] Nekoliko sojeva filamentoznih gljiva lako je dostupno javnosti u brojnim zbirkama kultura, kao što su American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), i Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Primeri takvih sojeva uključuju Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ili ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ili ATCC 56765 ili ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknovense C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 i njihove derivate.

[0053] Prednost ekspresije i proizvodnje enzima (na primer, najmanje dve, tri ili četiri različite celulaze) u pogodnom mikroorganizmu može biti visok prinos enzimske kompozicije koji se može koristiti u postupku ovog pronalaska.

[0054] Prema pronalasku, dodavanjem kiseonika moguće je postići mnoge prednosti postupka, uključujući optimalne temperaturne uslove, skraćeno vreme postupka, smanjenu dozu enzima, ponovnu upotrebu enzima i druge optimizacije postupka, što rezultira smanjenim troškovima. Prednost pronalaska obezbeđuje postupak u kome se korak hidrolize izvodi u poboljšanim uslovima. Pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji uključuje hidrolizu sa skraćenim vremenom postupka. Pored toga, pronalazak obezbeđuje postupak u kome se doza enzima može smanjiti, a da se u isto vreme izlaz korisnog proizvoda hidrolize održava na istom nivou. Još jedna prednost pronalaska je da predmetni postupak koji uključuje hidrolizu može rezultirati uslovima postupka koji su optimizovani. Dodatna prednost pronalaska je da se izlaz korisnog proizvoda hidrolize postupka koji uključuje hidrolizu povećava korišćenjem iste doze enzima.

Stabilna kompozicija enzima

[0055] Stabilna kompozicija enzima ovde znači da kompozicija enzima zadržava aktivnost nakon 30 sati reakcionog vremena hidrolize, poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% njegove početne aktivnosti nakon 30 sati reakcije hidrolize. Poželjno, enzimska kompozicija zadržava aktivnost nakon 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 sati vremena reakcije hidrolize.

[0056] U jednom primeru izvođenja, kompozicija enzima koja se koristi u postupcima ovog pronalaska je izvedena iz gljive ili kompozicija enzima koja se koristi u postupcima ovog pronalaska sadrži enzim gljive. U jednom primeru izvođenja, kompozicija enzima je izvedena iz filamentozne gljive ili kompozicija enzima sadrži enzim filamentoznih gljiva. Postupci prema pronalasku se povoljno primenjuju u kombinaciji sa kompozicijama enzima dobijenim od mikroorganizama iz roda Rasamsonia, ili kompozicija enzima sadrži Rasamsonia enzim.

[0057] Kompozicija enzima se može pripremiti fermentacijom pogodnog supstrata sa odgovarajućim mikroorganizmom, npr. Rasamsonia emersonii ili Aspergillus niger pri čemu enzimsku kompoziciju proizvodi mikroorganizam. Mikroorganizam može biti izmenjen da bi se poboljšao ili napravio kompoziciju celulaze. Na primer, mikroorganizam može biti mutiran klasičnim postupcima poboljšanja soja ili tehnikama rekombinantne DNK. Zbog toga se mikroorganizmi koji se ovde pominju mogu koristiti kao takvi za proizvodnju kompozicije celulaze ili mogu biti izmenjeni da bi se povećala proizvodnja ili da bi se proizvela izmenjena kompozicija celulaze koja može uključivati heterologne celulaze, dakle enzime koje taj mikroorganizam prvobitno ne proizvodi. Poželjno je da se gljiva, poželjnije filamentozna gljiva, koristi za proizvodnju kompozicije celulaze. Poželjno je da se koristi termofilni ili termotolerantni mikroorganizam. Izborno, koristi se supstrat koji indukuje ekspresiju enzima u enzimskoj kompoziciji tokom proizvodnje kompozicije enzima.

[0058] Kompozicija enzima se koristi za oslobađanje šećera iz lignoceluloze koja sadrži polisaharide. Glavni polisaharidi su celuloza (glukani) i hemiceluloze (ksilani, heteroksilani i ksiloglukani). Pored toga, neke hemiceluloze mogu biti prisutne kao glukomanani, na primer u sirovinama dobijenim od drveta. Enzimska hidroliza ovih polisaharida do rastvorljivih šećera, uključujući i monomere i multimere, na primer glukozu, celobiozu, ksilozu, arabinozu, galaktozu, fruktozu, manozu, ramnozu, ribozu, galakturonsku kiselinu, glukoronsku kiselinu i druge pentoheksoze, nastaje pod dejstvom pentoheksoza. različitih enzima koji deluju zajedno. Pod šećernim proizvodom podrazumeva se proizvod enzimske hidrolize sirovine ili lignoceluloznog materijala. Šećerni proizvod će sadržati rastvorljive šećere, uključujući i monomere i multimere, poželjno će sadržati glukozu. Primeri drugih šećera su celobioza, ksiloza, arabinoza, galaktoza, fruktoza, manoza, ramnoza, riboza, galakturonska kiselina, glukoronska kiselina i druge heksoze i pentoze. Šećerni proizvod se može koristiti kao što je ili može biti dalje tretiran, na primer, prečišćen.

[0059] Pored toga, pektini i druge pektinske supstance kao što su arabinani mogu činiti značajan deo suve mase tipičnih ćelijskih zidova iz nedrvenastog biljnog tkiva (otprilike četvrtina do polovina suve mase mogu biti pektini).

[0060] Celuloza je linearni polisaharid sastavljen od ostataka glukoze povezanih β-1,4 vezama. Linearna priroda celuloznih vlakana, kao i stehiometrija β-povezane glukoze (u odnosu na α) stvaraju strukture sklonije vezivanju vodonika između lanaca nego visoko razgranate αpovezane strukture skroba. Dakle, celulozni polimeri su generalno manje rastvorljivi i formiraju čvršće vezana vlakna od vlakana koja se nalaze u skrobu.

[0061] Enzimi koji mogu biti uključeni u stabilnu kompoziciju enzima korišćenu u pronalasku sada su detaljnije opisani:

GH61, endoglukanaze (EG) i egzo-celobiohidrolaze (CBH) katalizuju hidrolizu nerastvorljive celuloze do proizvoda kao što su celooligosaharidi (celobioza kao glavni proizvod), dok betaglukozidaze (BG) pretvaraju oligosaharide i uglavnom u glukocelotriobilozu.

[0062] Hemiceluloza je složen polimer i njen sastav često varira od organizma do organizma i od jednog tipa tkiva do drugog. Generalno, glavna komponenta hemiceluloze je β-1,4-vezana ksiloza, šećer sa pet ugljenika. Međutim, ova ksiloza je često razgranata na 0 do 3 i/ili 0 do 2 atoma ksiloze, i može biti zamenjena vezama sa arabinozom, galaktozom, manozom, glukuronskom kiselinom, galakturonskom kiselinom ili esterifikacijom u sirćetnu kiselinu (i esterifikacijom ferulne kiseline u arabinozu). Hemiceluloza takođe može da sadrži glukan, što je opšti termin za β-vezanih šest ugljeničnih šećera (kao što su β-(1,3)(1,4) glukani i heteroglukani koji su prethodno pomenuti) i dodatno glukomanane (u kojima su i glukoza i manoza prisutni u linearnoj kičmi, međusobno povezani β-vezama).

[0063] Ksilanaze zajedno sa drugim pomoćnim enzimima, na primer α-L-arabinofuranozidazama, feruloil i acetilksilan esterazama, glukuronidazama i β-ksilozidazama) katalizuju hidrolizu hemiceluloza.

[0064] Pektinske supstance uključuju pektine, arabinane, galaktane i arabinogalaktane. Pektini su najsloženiji polisaharidi u ćelijskom zidu biljaka. Oni su izgrađeni oko jezgra lanca α(1,4)-povezanih jedinica D-galakturonske kiseline ispresecanih do izvesnog stepena sa L-ramnozom. U bilo kom ćelijskom zidu postoji niz strukturnih jedinica koje odgovaraju ovom opisu i generalno se smatra da su u jednom pektinskom molekulu lanci jezgra različitih strukturnih jedinica kontinuirani jedan sa drugim.

[0065] Glavni tipovi strukturnih jedinica su: galakturonan (homogalakturonan) koji može biti supstituisan metanolom na karboksilnoj grupi i acetatom na O-2 i O-3; ramnogalakturonan I (RGI), u kome se jedinice galakturonske kiseline smenjuju sa jedinicama ramnoze koje nose (1,4)-vezane galaktan i (1,5)-povezane arabinanske bočne lance. Bočni lanci arabina mogu biti vezani direktno za ramnozu ili indirektno preko galaktanskih lanaca; ksilogalakturonan, sa pojedinačnim ksilozil jedinicama na O-3 galakturonske kiseline (usko povezano sa RGI); i ramnogalakturonan II (RGII), posebno složenu sporednu jedinicu koja sadrži neobične šećere, na primer apiozu. RGII jedinica može da sadrži dva apiozilna ostatka koji, pod pogodnim jonskim uslovima, mogu reverzibilno da formiraju estre sa boratom.

[0066] Kompozicija za upotrebu u postupku prema pronalasku poželjno sadrži najmanje dve aktivnosti, iako će tipično kompozicija sadržati više od dve aktivnosti, na primer, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili više. Tipično, kompozicija pronalaska može da sadrži najmanje dve različite celulaze ili dve celulaze i najmanje jednu hemicelulazu. Kompozicija pronalaska može da sadrži celulaze, ali ne i ksilanaze. Pored toga, kompozicija pronalaska može da sadrži pomoćnu aktivnost enzima, tj. dodatnu aktivnost koja direktno ili indirektno dovodi do razgradnje lignoceluloze. Ovde su pomenuti primeri takvih pomoćnih aktivnosti.

[0067] Prema tome, kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži GH61, aktivnost endoglukanaze i/ili aktivnost celobiohidrolaze i/ili aktivnost beta-glukozidaze. Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži više od jedne enzimske aktivnosti u jednoj ili više od tih klasa. Na primer, kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži dve aktivnosti endoglukanaze, na primer, aktivnost endo-1,3(1,4)-β glukanaze i aktivnost endo-β-1,4-glukanaze. Takva kompozicija može takođe da sadrži jednu ili više aktivnosti ksilanaze. Takva kompozicija može da sadrži pomoćnu aktivnost enzima.

[0068] Kompozicija za upotrebu u ovom pronalasku može biti izvedena iz gljive, kao što je filamentozna gljiva kao npr. Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii. U jednom primeru izvođenja, osnovni skup enzima (razgradnje lignoceluloze) može biti izveden iz Rasamsonia emersonii. Rasamsonia emersonii može da obezbedi veoma efikasan skup aktivnosti kao što je ovde prikazano za hidrolizu lignoceluloznog materijala. Ako je potrebno, skup aktivnosti se može dopuniti dodatnim aktivnostima enzima iz drugih izvora. Takve dodatne aktivnosti mogu biti izvedene iz klasičnih izvora i/ili proizvedene od strane genetski modifikovanih organizama.

[0069] Aktivnosti u kompoziciji za upotrebu u pronalasku mogu biti termostabilne. Ovde, ovo znači da aktivnost ima temperaturni optimum od oko 60°C ili više, na primer oko 70°C ili više, kao što je oko 75°C ili više, na primer oko 80°C ili više, kao što je 85°C ili više. Aktivnosti u kompoziciji za upotrebu u pronalasku tipično neće imati iste temperaturne optimume, ali poželjno će, ipak, biti termostabilne.

[0070] Pored toga, aktivnosti enzima u kompoziciji za upotrebu u pronalasku mogu da deluju pri niskom pH. Za potrebe ovog pronalaska, nizak pH označava pH od oko 5.5 ili niži, oko 5 ili niži, oko 4.9 ili niži, oko 4.8 ili niži, oko 4.7 ili niži, oko 4.6 ili niži, oko 4.5 ili niži, oko 4.4 ili niži, oko 4.3 ili niži, oko 4.2 ili niži, oko 4.1 ili niži, oko 4.0 ili nižioko 3.9 ili niži, ili oko 3.8 ili niži, oko 3.7 ili niži, oko 3.6 ili niži, ili oko 3.5 ili niži.

[0071] Aktivnosti u kompoziciji za upotrebu u pronalasku mogu se definisati kombinacijom bilo kog od gore navedenih temperaturnih optimuma i pH vrednosti.

[0072] Kompozicija koja se koristi u postupku pronalaska može da sadrži, pored aktivnosti koje su izvedene iz Rasamsonia, celulaza (na primer ona dobijena iz izvora koji nije Rasamsonia) i/ili hemicelulaza (na primer ona dobijena iz izvora koji nije Rasamsonia) i/ili pektinaza.

[0073] Kompozicija enzima za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska može da sadrži celulazu i/ili hemicelulazu i/ili pektinazu iz izvora koji nije Rasamsonia. Mogu se koristiti zajedno sa jednim ili više Rasamsonia enzima ili se mogu koristiti bez dodatnih prisutnih Rasamsonia enzima.

[0074] Na primer, enzimi za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska mogu sadržati betaglukozidazu (BG) iz Aspergillus, kao što je Aspergillus orizae, kao što je ona otkrivena u WO 02/095014 ili fuzioni protein koji ima aktivnost beta-glukozidaze otkriven u WO 2008/057637, ili Aspergillus fumigatus, kao što je onaj koji je otkriven kao SEQ ID NO:2 u WO 2005/047499 ili SEQ ID NO:5 u WO 2014/130812 ili Aspergillus fumigatus varijanta beta-glukozidaze, kao što je ona otkrivena u WO 2012/044915, kao što je ona sa sledećim supstitucijama: F100D, S283G, N456E, F512Y (upotrebom SEQ ID NO: 5 u WO 2014/130812 za numerisanje), ili Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ili Aspergillus kawachi. U sledećem primeru izvođenja beta-glukozidaza je izvedena iz Penicillium, kao što je Penicillium brasilianum otkriven kao SEQ ID NO:2 u WO 2007/019442, ili od Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei, kao što su opisani u US 6,022,725, US 6,982,159, US 7,045,332, US 7,005,289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. U jednom primeru izvođenja može se koristiti čak i bakterijska betaglukozidaza. U sledećem primeru izvođenja beta-glukozidaza je izvedena iz Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ili Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[0075] Na primer, enzimi za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska mogu sadržati endoglukanazu (EG) iz Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei; iz Humicola, kao što je soj Humicola insolens; od Aspergillus, kao što je Aspergillus aculeatus ili Aspergillus kawachii; iz Erwinia, kao što je Erwinia carotovara; iz Fusarium, kao što je Fusarium oxysporum; iz Thielavia, kao što je Thielavia terrestris; iz Humicola, kao što je Humicola grisea var. thermoidea ili Humicola insolens; iz Melanocarpus, kao što je Melanocarpus albomices; iz Neurospora, kao što je Neurospora crassa; iz Myceliophthora, kao što je Myceliophthora thermophila; iz Cladorrhinum, kao što je Cladorrhinum foecundissimum i/ili od Chrysosporium, kao što je soj Chrysosporium lucknowense. U jednom primeru izvođenja čak i bakterijska endoglukanaza može da se koristi uključujući, ali bez ograničenja na, endoglukanazu Acidothermus cellulolyticus (videti WO 91/05039; WO 93/15186; US 5,275,944; WO 96/02551; US 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); Thermobifida fusca endoglukanaza III (videti WO 05/093050); i Thermobifida fusca endoglukanaza V (videti WO 05/093050).

[0076] Na primer, enzimi za upotrebu u postupcima ovog pronalaska mogu sadržati celobiohidrolazu I iz Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je Cel7A CBH I otkrivena u SEQ ID NO: 6 u WO 2011/057140 ili SEQ ID NO:6 u WO 2014/130812, ili od Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei.

[0077] Na primer, enzimi za upotrebu u postupcima ovog pronalaska mogu sadržati celobiohidrolazu II iz Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je ona u SEQ ID NO:7 u WO 2014/130812 ili od Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei, ili od Thielavia, kao što je Thielavia terrestris, kao što je celobiohidrolaza II CEL6A iz Thielavia terrestris.

[0078] Na primer, enzimi za upotrebu u postupcima ovog pronalaska mogu sadržati polipeptid GH61 (litička polisaharid monooksigenaza) iz Thermoascus, kao što je Thermoascus aurantiacus, kao što je opisano u WO 2005/074656 kao SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:1 u WO2014/130812 i u WO 2010/065830; ili od Thielavia, kao što je Thielavia terrestris, kao što je opisano u WO 2005/074647 kao SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 4 u WO2014/130812 i u WO 2008/148131, i WO 2011/035027; ili od Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je opisano u WO 2010/138754 kao SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO: 3 u WO2014/130812; ili od Penicillium, kao što je Penicillium emersonii, kao što je onaj koji je otkriven kao SEQ ID NO:2 u WO 2011/041397 ili SEQ ID NO:2 u WO2014/130812. Drugi pogodni polipeptidi GH61 uključuju, ali nisu ograničeni na, Trichoderma reesei (videti WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (videti WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (videti WO 2011/005867), Thermoascus sp. (videti WO 2011/039319), i Thermoascus crustaceous (videti WO 2011/041504). U jednom aspektu, polipeptid GH61 se koristi u prisustvu rastvorljivog aktivirajućeg katjona dvovalentnog metala prema WO 2008/151043, npr. mangan sulfata. U jednom aspektu, polipeptid GH61 se koristi u prisustvu dioksi jedinjenja, bicikličnog jedinjenja, heterocikličnog jedinjenja, jedinjenja koje sadrži azot, jedinjenja kinona, jedinjenja koje sadrži sumpor ili tečnosti dobijene od prethodno tretiranog celuloznog materijala kao što je prethodno tretirana kukuruzni stover.

[0079] Drugi celulolitički enzimi koji se mogu koristiti u postupcima ovog pronalaska su opisani u WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5,457,046, US 5,648,263, i US 5,686,593, da spomenemo samo neke.

[0080] Pored toga, primeri ksilanaza korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, ksilanaze iz Aspergillus aculeatus (videti WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (videti WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (videti WO 2011/041405), Penicillium sp. (videti WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (videti WO 2009/079210), i Trichophaea saccata GH10 (videti WO 2011/057083). Primeri beta-ksilozidaza korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, beta-ksilozidaze iz Neurospora crassa i Trichoderma reesei. Primeri acetilksilan esteraza korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, acetilksilan esteraze iz Aspergillus aculeatus (videti WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (videti WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (videti WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum i Thielavia terrestris NRRL 8126 (videti WO 2009/042846). Primeri feruloil esteraza (esteraze ferulne kiseline) korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, forme feruloil esteraze Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (videti WO 2009/127729), i Thielavia terrestris (videti WO 2010/053838 i WO 2010/065448). Primeri arabinofuranozidaza korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, arabinofuranozidaze iz Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2006/114094 i WO 2009/073383) i M. giganteus (videti WO 2006/114094). Primeri alfaglukuronidaza korisnih u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alfaglukuronidaze iz Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (videti WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (videti WO 2009/068565) i Trichoderma reesei.

[0081] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži jednu, dve, tri, četiri klase ili više celulaze, na primer jednu, dve tri ili četiri ili sve GH61, endoglukanazu (EG), jednu ili dve egzo-celobiohidrolaze (CBH ) i beta-glukozidazu (BG). Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži dve ili više bilo koje od ovih klasa celulaze.

[0082] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži aktivnost koja ima drugačiji tip celulazne aktivnosti i/ili aktivnosti hemicelulaze i/ili aktivnosti pektinaze od one koju obezbeđuje kompozicija za upotrebu u postupku prema pronalasku. Na primer, kompozicija prema pronalasku može da sadrži jedan tip celulazne i/ili hemicelulazne aktivnosti i/ili aktivnosti pektinaze obezbeđene kompozicijom kako je ovde opisano i drugi tip aktivnosti celulaze i/ili hemicelulaze i/ili aktivnosti pektinaze obezbeđene pomoću dodatne celuloze/hemicelulaze/pektinaze.

[0083] Ovde je celulaza bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje celulozu. Polipeptid koji je sposoban da razgradi celulozu je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja celuloze na manje jedinice, bilo delimično, na primer u celodekstrine, ili potpuno u monomere glukoze. Celulaza prema pronalasku može dovesti do mešovite populacije celodekstrina i monomera glukoze kada dođe u kontakt sa celulazom. Takva degradacija će se obično izvoditi reakcijom hidrolize.

[0084] LPMO (litičke polisaharidne monooksigenaze) je CAZy nedavno klasifikovao u familiju AA9 (familija pomoćnih aktivnosti 9) ili familiju AA10 (familija pomoćnih aktivnosti 10). Kao što je gore pomenuto, LPMO je u stanju da otvori kristalnu strukturu glukana. LPMO takođe može uticati na celulo-oligosaharide. PMO i LPMO se ovde koriste naizmenično. GH61 (familija glikozid hidrolaze 61 ili se ponekad naziva EGIV) proteini su (litičke) polisaharidne monooksigenaze zavisne od kiseonika (PMO/LPMO) prema najnovijoj literaturi (Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). Često se u literaturi ovi proteini pominju da pojačavaju dejstvo celulaza na supstrate lignoceluloze. GH61 je prvobitno klasifikovan kao endoglukanaza na osnovu merenja veoma slabe aktivnosti endo-1,4-β-dglukanaze kod jednog člana porodice. Termin "GH61" kako se ovde koristi, treba shvatiti kao porodicu enzima, koji dele zajedničke očuvane delove sekvence i preklapanja da bi se klasifikovali u familiju 61 dobro uspostavljenog CAZy GH sistema klasifikacije (http://www.cazy.org/GH61.html). Familija glikozid hidrolaza 61 je član porodice glikozid hidrolaza EC 3.2.1. CAZy je nedavno reklasifikovao GH61 u porodicu AA9 (Porodica pomoćnih aktivnosti 9). GH61 se ovde koristi kao deo celulaza. CBM33 (porodica 33 modul za vezivanje ugljenih hidrata) je LPMO (Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol.

289, no. 5, pp. 2632-2642), CAZy je nedavno reklasifikovao CBM33 u AA10 (Porodica pomoćnih aktivnosti 10).

[0085] Ovde je hemicelulaza bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje hemicelulozu. To znači da hemicelulaza može biti sposobna da razgradi ili modifikuje jedan ili više od ksilana, glukuronoksilana, arabinoksilana, glukomanana i ksiloglukana. Polipeptid koji je sposoban da razgradi hemicelulozu je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja hemiceluloze na manje polisaharide, bilo delimično, na primer na oligosaharide, ili potpuno u monomere šećera, na primer heksozu ili monomere šećera pentoze. Hemicelulaza prema pronalasku može dovesti do mešovite populacije oligosaharida i monomera šećera kada dođe u kontakt sa hemicelulazom. Takva razgradnja će se obično izvoditi reakcijom hidrolize.

[0086] Ovde je pektinaza bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje pektin. Polipeptid koji je sposoban da razgradi pektin je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja pektina na manje jedinice, bilo delimično, na primer u oligosaharide, ili potpuno u monomere šećera. Pektinaza prema pronalasku može dovesti do mešovite populacije oligosahardija i monomera šećera kada dođe u kontakt sa pektinazom. Takva razgradnja će se obično izvioditi reakcijom hidrolize.

[0087] Shodno tome, kompozicija pronalaska može da sadrži bilo koju celulazu, na primer, GH61, celobiohidrolazu, endo-β-1,4-glukanazu, beta-glukozidazu ili β-(1,3)(1,4)-glukanazu.

[0088] Ovde je celobiohidrolaza (EC 3.2.1.91) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u celulozi ili celotetraozi, oslobađajući celobiozu sa krajeva lanaca. Ovaj enzim se takođe može nazvati celulaza 1,4-β-celobiozidaza, 1,4-βcelobiohidrolaza, 1,4-β-D-glukan celobiohidrolaza, avicelaza, egzo-1,4-β-D-glukanaza, egzocelobiohidrolaza ili egzoglukanaza.

[0089] Ovde je endo-β-1,4-glukanaza (EC 3.2.1.4) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u β-D-glukanima celuloze, lihenina ili β-D-glukana žitarica. Takav polipeptid takođe može biti sposoban da hidrolizuje 1,4-veze u β-D-glukanima koji takođe sadrže 1,3-veze. Ovaj enzim se takođe može nazvati celulaza, avicelaza, β-1,4-endoglukan hidrolaza, β-1,4-glukanaza, karboksimetil celulaza, celudekstrinaza, endo-1,4-β-D-glukanaza, endo-1, 4-β-D-glukanohidrolaza, endo-1,4-β-glukanaza ili endoglukanaza.

[0090] Ovde je beta-glukozidaza (EC 3.2.1.21) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka β-D-glukoze sa oslobađanjem β-D-glukoze. Takav polipeptid može imati široku specifičnost za β-D-glukozide i takođe može da hidrolizuje jedno ili više od sledećeg: β-D-galaktozid, α-L-arabinozid, β-D-ksilozid ili β-Dfukozid. Ovaj enzim se takođe može nazvati amigdalaza, β-D-glukozid glukohidrolaza, celobiaza ili gentobiaza.

[0091] Ovde je β-(1,3)(1,4)-glukanaza (EC 3.2.1.73) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u β-D-glukanima koji sadrže 1,3- i 1,4-veze. Takav polipeptid može da deluje na lihenin i β-D-glukane žitarica, ali ne i na β-D-glukane koji sadrže samo 1,3- ili 1,4-veze. Ovaj enzim se takođe može nazvati liheninaza, 1,3-1,4-β-D-glukan 4-glukanohidrolaza, β-glukanaza, endo-β-1,3-1,4 glukanaza, lihenaza ili β- glukanaza sa mešanom vezom. Alternativa za ovaj tip enzima je EC 3.2.1.6, koji je opisan kao endo-1,3(4)-beta-glukanaza. Ovaj tip enzima hidrolizuje 1,3- ili 1,4-veze u beta-D-glukanazi kada je ostatak glukoze čija je redukujuća grupa uključena u vezu koja se hidrolizuje sama supstituisana na C-3. Alternativni nazivi uključuju endo-1,3-beta-glukanazu, laminarinazu, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glukan 3 (4) glukanohidrolazu; supstrati uključuju laminarin, lihenin i beta-D-glukane žitarica.

[0092] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži bilo koju hemicelulazu, na primer, endoksilanazu, β-ksilozidazu, α-L-arabionofuranozidazu, α-D-glukuronidazu, acetil ksilan esterazu, feruloil esterazu, kumaroil esterazu, α-galaktozidazu, β-galaktozidazu, βmananazu ili β-manozidazu.

[0093] Ovde je endoksilanaza (EC 3.2.1.8) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,4-β-D-ksilozidnih veza u ksilanima. Ovaj enzim se takođe može nazvati endo-1,4-β-ksilanaza ili 1,4-β-D-ksilan ksilanohidrolaza. Alternativa je EC 3.2.1.136, glukuronoarabinoksilan endoksilanaza, enzim koji je u stanju da hidrolizuje 1,4 ksilozidne veze u glukuronoarabinoksilanima.

[0094] Ovde, β-ksilozidaza (EC 3.2.1.37) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu 1,4-β-D-ksilana, da ukloni uzastopne ostatke D-ksiloze sa neredukcionih krajeva. Takvi enzimi takođe mogu hidrolizovati ksilobiozu. Ovaj enzim se takođe može nazvati ksilan 1,4-β-ksilozidaza, 1,4-β-D-ksilan ksilohidrolaza, egzo-1,4-β-ksilozidaza ili ksilobioza.

[0095] Ovde, α-L-arabinofuranosidaza (EC 3.2.1.55) je svaki polipeptid koji je sposoban da deluje na α-L-arabinofuranozide, α-L-arabinane koji sadrže (1,2) i/ili (1,3)- i/ili (1,5)-veze, arabinoksilane i arabinogalaktane. Ovaj enzim se takođe može nazvati α-N-arabinofuranozidaza, arabinofuranozidaza ili arabinozidaza.

[0096] Ovde, α-D-glukuronidaza (EC 3.2.1.139) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju sledećeg oblika: alfa-D-glukuronozid H(2)O = alkohol D-glukuronat. Ovaj enzim se takođe može nazvati alfa-glukuronidaza ili alfa-glukoziduronaza. Ovi enzimi takođe mogu da hidrolizuju 4-O-metilovanu glukoronsku kiselinu, koja takođe može biti prisutna kao supstituent u ksilanima. Alternativa je EC 3.2.1.131: ksilan alfa-1,2-glukuronozidaza, koja katalizuje hidrolizu alfa-1,2-(4-O-metil)glukuronozil veza.

[0097] Ovde je acetil ksilan esteraza (EC 3.1.1.72) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje deacetilaciju ksilana i ksilo-oligosaharida. Takav polipeptid može katalizovati hidrolizu acetil grupa iz polimernog ksilana, acetilovane ksiloze, acetilovane glukoze, alfanaftil acetata ili p-nitrofenil acetata, ali, tipično, ne iz triacetil glicerola. Takav polipeptid tipično ne deluje na acetilovani manan ili pektin.

[0098] Ovde, feruloil esteraza (EC 3.1.1.73) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju oblika: feruloil-saharid H2O = ferulat saharid. Saharid može biti, na primer, oligosaharid ili polisaharid. Tipično može da katalizuje hidrolizu 4-hidroksi-3-metoksicinamoil (feruloil) grupe iz esterifikovanog šećera, koji je obično arabinoza u 'prirodnim' supstratima. pnitrofenol acetat i metil ferulat su tipično lošiji supstrati. Ovaj enzim se takođe može nazvati hidrolaza cinamoil estra, esteraza ferulne kiseline ili hidroksicinamoil esteraza. Takođe se može nazvati dodatnim enzimom hemicelulaze, jer može pomoći ksilanazama i pektinazama da razlože hemicelulozu i pektin ćelijskog zida biljaka.

[0099] Ovde je kumaroil esteraza (EC 3.1.1.73) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju u obliku: kumaroil-saharid H(2)O = kumarat saharid. Saharid može biti, na primer, oligosaharid ili polisaharid. Ovaj enzim se takođe može nazvati trans-4-kumaroil esteraza, trans-p-kumaroil esteraza, p-kumaroil esteraza ili p-kumaroil esteraza. Ovaj enzim takođe spada u EC 3.1.1.73, pa se takođe može nazvati i kao feruloil esteraza.

[0100] Ovde, α-galaktozidaza (EC 3.2.1.22) je svaki polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka α-D-galaktoze u α-D-galaktozidima, uključujući oligosaharide galaktoze, galaktomanane, galaktane i arabinogalaktane. Takav polipeptid takođe može biti sposoban da hidrolizuje α-D-fukozide. Ovaj enzim se takođe može nazvati melibijazom.

[0101] Ovde je β-galaktozidaza (EC 3.2.1.23) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih neredukcionih ostataka β-D-galaktoze u β-D-galaktozidima. Takav polipeptid takođe može biti sposoban da hidrolizuje α-L-arabinozide. Ovaj enzim se takođe može nazvati egzo-(1->4)-β-D-galaktanaza ili laktaza.

[0102] Ovde, β-mananaza (EC 3.2.1.78) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje slučajnu hidrolizu 1,4-β-D-manozidnih veza u mananima, galaktomananima i glukomananima. Ovaj enzim se takođe može nazvati manan endo-1,4-β-manozidaza ili endo-1,4-mananaza.

[0103] Ovde, β-manozidaza (EC 3.2.1.25) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka β-D-manoze u β-D-manozidima. Ovaj enzim se takođe može nazvati mananaza ili manaza.

[0104] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži bilo koju pektinazu, na primer endo-poligalakturonazu, pektin metil esterazu, endo-galaktanazu, beta-galaktozidazu, pektin acetil esterazu, endo-pektin liazu, pektat liazu, alfa-ramnozidazu, egzo-galakturonazu, ekspoligalakturonatnu liazu, ramnogalakturonan hidrolazu, ramnogalakturonan liazu, ramnogalakturonan acetil esterazu, ramnogalakturonan galakturonohidrolazu, ksilogalakturonazu.

[0105] Ovde je endo-poligalakturonaza (EC 3.2.1.15) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje slučajnu hidrolizu 1,4-α-D-galaktoziduronskih veza u pektatu i drugim galakturonanima. Ovaj enzim se takođe može nazvati poligalakturonaza pektin depolimeraza, pektinaza, endopoligalakturonaza, pektolaza, pektin hidrolaza, pektin poligalakturonaza, poliα-1,4-galakturonid glikanohidrolaza, endogalakturonaza; endo-D-galakturonaza ili poli(1,4-α-D-galakturonid) glikanohidrolaza.

[0106] Ovde je pektin metil esteraza (EC 3.1.1.11) bilo koji enzim koji je sposoban da katalizuje reakciju: pektin n H2O = n metanol pektat. Enzim može biti poznat i kao pektinesteraza, pektin demetoksilaza, pektin metoksilaza, pektin metilesteraza, pektaza, pektinoesteraza ili pektin pektilhidrolaza.

[0107] Ovde je endo-galaktanaza (EC 3.2.1.89) bilo koji enzim sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,4-β-D-galaktozidnih veza u arabinogalaktanima. Enzim može biti poznat i kao arabinogalaktana endo-1,4-β-galaktozidaza, endo-1,4-β-galaktanaza, galaktanaza, arabinogalaktanaza ili arabinogalaktana 4-β-D-galaktanohidrolaza.

[0108] Ovde se pektin acetil esteraza ovde definiše kao bilo koji enzim koji ima aktivnost acetil esteraze koja katalizuje deacetilaciju acetil grupa na hidroksilnim grupama GalUA ostataka pektina

[0109] Ovde je endopektin liaza (EC 4.2.2.10) bilo koji enzim sposoban da katalizuje eliminaciono cepanje (1→4)-α-D-galakturonan metil estra da bi se dobili oligosaharidi sa 4-deoksi-6-O-metil-α-D-galakt-4-enuronozil grupama na njihovim neredukcionim krajevima. Enzim može biti poznat i kao pektin liaza, pektin trans-eliminaza; endo-pektin liaza, polimetilgalakturonska transeliminaza, pektin metiltranseliminaza, pektoliaza, PL, PNL ili PMGL ili (1→4)-6-O-metil-α-D-galakturonan liaza.

[0110] Ovde, pektat liaza (EC 4.2.2.2) je bilo koji enzim sposoban da katalizuje eliminativno cepanje (1→4)-α-D-galakturonana da bi se dobili oligosaharidi sa 4-deoksi-α-D-galakt-4enuronozil grupama na njihovim neredukcionim krajevima. Enzim takođe može biti poznat kao poligalakturonska transeliminaza, transeliminaza pektinske kiseline, poligalakturonat liaza, endopektin metiltranseliminaza, pektat transeliminaza, endogalakturonat transeliminaza, liaza pektinske kiseline, pektinska liaza, liaza α-1,4-D-endopoligalakturonske kiseline, PGA liaza, Ppaza-N, liaza endo-α-1,4-poligalakturonske kiseline, liaza poligalakturonske kiseline, pektin trans-eliminaza, poligalakturonska kiselina trans-eliminaza ili (1→4)-α-D-galakturonan liaza.

[0111] Ovde, alfa-ramnozidaza (EC 3.2.1.40) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih neredukcionih ostataka α-L-ramnoze u α-L-ramnozidima ili alternativno u ramnogalakturonanu. Ovaj enzim može biti poznat i kao α-L-ramnozidaza T, α-L-ramnozidaza N ili α-L-ramnozidaza ramnohidrolaza.

[0112] Ovde je egzo-galakturonaza (EC 3.2.1.82) bilo koji polipeptid sposoban za hidrolizu pektinske kiseline sa neredukcionog kraja, oslobađajući digalakturonat. Enzim može biti poznat i kao egzo-poli-α-galakturonozidaza, egzopoligalakturnozidaza ili egzopoligalakturanozidaza.

[0113] Ovde je egzo-galakturonaza (EC 3.2.1.67) bilo koji polipeptid sposoban da katalizuje: (1,4-α-D-galakturonid)n+ H2O = (1,4-α-D-galakturonid)n-1+ D-galakturonat. Enzim može biti poznat i kao galakturan 1,4-α-galakturonaza, egzopoligalakturonaza, poli(galakturonat) hidrolaza, egzo-D-galakturonaza, egzo-D-galakturonanaza, egzopoli-D-galakturonaza ili poli(1,4-α- D-galakturonid) galakturonohidrolaza.

[0114] Ovde, egzopoligalakturonat liaza (EC 4.2.2.9) je svaki polipeptid sposoban da katalizuje eliminativno cepanje 4-(4-deoksi-α-D-galakt-4-enuronozil)-D-galakturonata sa redukcionog kraja pektata, tj. deesterifikovani pektin. Ovaj enzim može biti poznat kao pektat disaharidliaza, pektat egzo-liaza, transeliminaza egzopektinske kiseline, egzopektat liaza, egzopoligalakturna kiselina-trans-eliminaza, PATE, egzo-PATE, egzo-PGL ili (1→4)-α-D-galakturonan redukujuća-kraj-disaharid-liaza.

[0115] Ovde, ramnogalakturonan hidrolaza je svaki polipeptid koji je sposoban da hidrolizuje vezu između galaktoziluronske kiseline i ramnopiranozila na endo-način u striktno naizmeničnim strukturama ramnogalakturonana, koji se sastoje od disaharida [(1,2-alfa-L-(1,2-ramnoil-L-1-4)-alfa-galaktoziluronske kiseline].

[0116] Ovde, ramnogalakturonan liaza je bilo koji polipeptid koji je bilo koji polipeptid koji je sposoban da cepa α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA veze na endo-način u ramnogalakturonanu beta-eliminacijom.

[0117] Ovde, ramnogalakturonan acetil esteraza je bilo koji polipeptid koji katalizuje deacetilaciju kičme naizmeničnih ostataka ramnoze i galakturonske kiseline u ramnogalakturonu.

[0118] Ovde, ramnogalakturon galakturonohidrolaza je bilo koji polipeptid koji je sposoban da hidrolizuje galakturonsku kiselinu sa neredukcionog kraja striktno naizmeničnih ramnogalakturonanskih struktura na egzo-način.

[0119] Ovde, ksilogalakturonaza je bilo koji polipeptid koji deluje na ksilogalakturonan cepanjem kičme galakturonske kiseline supstituisane β-ksilozom na endo-način. Ovaj enzim može biti poznat i kao ksilogalakturonan hidrolaza.

[0120] Ovde, α-L-arabinofuranosidaza (EC 3.2.1.55) je svaki polipeptid koji je sposoban da deluje na α-L-arabinofuranozide, α-L-arabinane koji sadrže (1,2) i/ili (1,3)- i /ili (1,5)-veze, arabinoksilane i arabinogalaktane. Ovaj enzim se takođe može nazvati α-N-arabinofuranozidaza, arabinofuranozidaza ili arabinozidaza.

[0121] Ovde je endo-arabinanaza (EC 3.2.1.99) bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,5-α-arabinofuranozidnih veza u 1,5-arabinanima. Enzim može biti poznat i kao endo-arabinaza, arabinan endo-1,5-α-L-arabinozidaza, endo-1,5-α-L-arabinaza, endo-α-1,5-arabanaza, endo-arabanaza ili 1,5-α-L-arabinan 1,5-α-L-arabinanohidrolaza.

[0122] Kompozicija za upotrebu u pronalasku će tipično sadržati najmanje dve celulaze i izborno najmanje jednu hemicelulazu i izborno najmanje jednu pektinazu (od kojih je jedna polipeptid prema pronalasku). Kompozicija pronalaska može da sadrži GH61, celobiohidrolazu, endoglukanazu i/ili beta-glukozidazu. Takva kompozicija može takođe da sadrži jednu ili više hemicelulaza i/ili jednu ili više pektinaza.

[0123] Pored toga, jedan ili više (na primer, dva, tri, četiri ili svi) od amilaze, proteaze, lipaze, ligninaze, heksoziltransferaze, glukuronidaze ili ekspanzina ili proteina indukovanog celulozom ili proteina koji integriše celulozu ili sličnog proteina može biti prisutan u kompoziciji za upotrebu u pronalasku (ove se gore pominju kao pomoćne aktivnosti).

[0124] „Proteaza“ obuhvata enzime koji hidrolizuju peptidne veze (peptidaze), kao i enzime koji hidrolizuju veze između peptida i drugih delova, kao što su šećeri (glikopeptidaze). Mnoge proteaze su okarakterisane prema EC 3.4, i pogodne su za upotrebu u pronalasku koji je ovde uključen kao referenca. Neke specifične vrste proteaza uključuju cisteinske proteaze uključujući pepsin, papain i serin proteaze uključujući himotripsine, karboksipeptidaze i metaloendopeptidaze.

[0125] "Lipaza" uključuje enzime koji hidrolizuju lipide, masne kiseline i acilgliceride, uključujući fospogliceride, lipoproteine, diacilglicerole i slično. U biljkama, lipidi se koriste kao strukturne komponente za ograničavanje gubitka vode i infekcije patogenom. Ovi lipidi uključuju voskove dobijene od masnih kiselina, kao i kutin i suberin.

[0126] „Ligninaza“ uključuje enzime koji mogu hidrolizovati ili razbiti strukturu ligninskih polimera. Enzimi koji mogu da razgrađuju lignin uključuju lignin peroksidaze, mangan peroksidaze, lakaze i feruloil esteraze, i druge enzime opisane u stanju tehnike za koje je poznato da depolimerizuju ili na drugi način razlažu polimere lignina. Takođe su uključeni enzimi sposobni da hidrolizuju veze nastale između hemiceluloznih šećera (posebno arabinoze) i lignina. Ligninaze uključuju, ali nisu ograničene na sledeću grupu enzima: lignin peroksidaze (EC 1.11.1.14), mangan peroksidaze (EC 1.11.1.13), lakaze (EC 1.10.3.2) i feruloil esteraze (EC 3.1.1.73).

[0127] „Heksoziltransferaza“ (2.4.1-) obuhvata enzime koji su sposobni da katalizuju reakciju transferaze, ali koji takođe mogu katalizovati reakciju hidrolize, na primer celuloze i/ili proizvoda razgradnje celuloze. Primer heksoziltransferaze koja se može koristiti u pronalasku je β-glukanoziltransferaza. Takav enzim može biti u stanju da katalizuje razgradnju (1,3)(1,4)glukana i/ili celuloze i/ili proizvoda razgradnje celuloze.

[0128] "Glukuronidaza" uključuje enzime koji katalizuju hidrolizu glukoronozida, na primer βglukuronozida da bi se dobio alkohol. Mnoge glukuronidaze su okarakterisane i mogu biti pogodne za upotrebu u pronalasku, na primer β-glukuronidaza (EC 3.2.1.31), hijaluronoglukuronidaza (EC 3.2.1.36), glukuronozil-disulfoglukozamin glukuronidaza (3.2.1.56), glicirizinat β-glukuronidaza (3.2.1.128) ili α-D-glukuronidaza (EC 3.2.1.139).

[0129] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži ekspanzin ili protein sličan ekspanzinu, kao što je svolenin (videti Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) ili protein sličan svoleninu.

[0130] Ekspanzini su uključeni u labavljenje strukture ćelijskog zida tokom rasta biljnih ćelija. Predloženo je da ekspanzini poremete vodoničnu vezu između celuloze i drugih polisaharida ćelijskog zida bez hidrolitičke aktivnosti. Smatra se da na ovaj način omogućavaju klizanje celuloznih vlakana i povećanje ćelijskog zida. Svolenin, protein sličan ekspanzinu, sadrži domen porodice 1 N-terminalnog modula za vezivanje ugljenih hidrata (CBD) i C-terminalni domen sličan ekspanzinu. Za potrebe ovog pronalaska, protein sličan ekspanzinu ili protein sličan svoleninu može da sadrži jedan ili oba takva domena i/ili može da poremeti strukturu ćelijskih zidova (kao što je narušavanje strukture celuloze), izborno bez stvaranja uočljivih količina redukcionih šećera.

[0131] Kompozicija za upotrebu u pronalasku može da sadrži protein indukovan celulozom, na primer polipeptidni proizvod cip1 ili cip2 gena ili sličnih gena (videti Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), protein koji integriše celulozu/celulozom, na primer polipeptidni proizvod cipA ili cipC gena, ili skafoldin ili protein sličan skafoldinu. Skafoldini i proteini koji integrišu celulozu su multifunkcionalne integracione podjedinice koje mogu da organizuju celulolitičke podjedinice u multienzimski kompleks. Ovo se postiže interakcijom dve komplementarne klase domena, tj. kohezioni domen na skafoldinu i domen dokerina na svakoj enzimskoj jedinici. Podjedinica skafoldina takođe nosi modul za vezivanje celuloze (CBM) koji posreduje vezivanje celulozoma za njegov supstrat. Skafoldin ili protein koji integriše celulozu za potrebe ovog pronalaska mogu da sadrže jedan ili oba takva domena.

[0132] Kompozicija za upotrebu u ovom pronalasku takođe može da sadrži katalazu. Termin "katalaza" označava vodonik-peroksid: vodonik-peroksid oksidoreduktazu (EC 1.11.1.6 ili EC 1.11.1.21) koja katalizuje konverziju dva vodonik-peroksida u kiseonik i dve vode. Aktivnost katalaze se može odrediti praćenjem razgradnje vodonik peroksida na 240 nm na osnovu sledeće reakcije: 2H2O2→ 2H2O O2. Reakcija je sprovedena u 50 mM fosfata pH 7.0 na 25°C sa 10.3 mM supstrata (H2O2) i približno 100 jedinica enzima po ml. Apsorpcija se prati spektrofotometrijski u roku od 16-24 sekunde, što bi trebalo da odgovara smanjenju apsorpcije sa 0.45 na 0.4. Jedna jedinica aktivnosti katalaze može se izraziti kao jedan mikromol H2O2razložen u minuti na pH 7.0 i 25°C.

[0133] Kompozicija za upotrebu u postupku pronalaska može biti sastavljena od člana svake od klasa enzima pomenutih gore, nekoliko članova jedne klase enzima, ili bilo koje kombinacije ovih klasa enzima ili pomoćnih proteina (tj. one ovde pomenute proteine koji nemaju enzimsku aktivnost per se, ali ipak pomažu u lignoceluloznom razlaganju).

[0134] Kompozicija za upotrebu u postupku pronalaska može biti sastavljena od enzima (1) komercijalnih dobavljača; (2) kloniranih gena koji eksprimiraju enzime; (3) složenog bujona (kao što je onaj koji je rezultat rasta mikrobnog soja u medijumu, pri čemu sojevi luče proteine i enzime u medijum; (4) ćelijskih lizata sojeva uzgajanih kao u (3); i/ili (5) biljnog materijala koji eksprimira enzime. Različiti enzimi u kompoziciji pronalaska mogu se dobiti iz različitih izvora.

[0135] Enzimi se mogu proizvesti bilo egzogeno u mikroorganizmima, kvascima, gljivama, bakterijama ili biljkama, zatim izolovati i dodati, na primer, lignoceluloznoj sirovini. Alternativno, enzimi se proizvode, ali nisu izolovani, a sirovi bujon za fermentaciju ćelijske mase, ili biljni materijal (kao što je kukuruzni stover ili pšenična slama), i slično se mogu dodati, na primer, sirovini. Alternativno, sirova ćelijska masa ili medijum za proizvodnju enzima ili biljni materijal mogu se tretirati da bi se sprečio dalji rast mikroba (na primer, zagrevanjem ili dodavanjem antimikrobnih agenasa), a zatim dodati, na primer, sirovini. Ove sirove mešavine enzima mogu uključivati organizam koji proizvodi enzim. Alternativno, enzim se može proizvesti u fermentaciji koja koristi (prethodno tretiranu) sirovinu (kao što je kukuruzna peć ili pšenična slama) da obezbedi ishranu organizmu koji proizvodi enzim(e). Na ovaj način, biljke koje proizvode enzime mogu same da služe kao lignocelulozna sirovina i da se dodaju u lignoceluloznu sirovinu.

[0136] U ovde opisanim upotrebama i postupcima, komponente gore opisanih kompozicija mogu biti obezbeđene istovremeno (tj. kao jedna kompozicija per se) ili odvojeno ili uzastopno.

[0137] Pronalazak se stoga odnosi na postupke u kojima se koristi gore opisana kompozicija i na upotrebu kompozicije u industrijskim postupcima.

[0138] U jednom primeru izvođenja postupka prema ovom pronalasku, kompozicija enzima je u obliku celog fermentacionog bujona gljive. U jednom primeru izvođenja, kompozicije enzima mogu biti ceo fermentacioni bujon kao što je opisano u nastavku. Ceo fermentacioni bujon se može pripremiti od fermentacije nerekombinantnih i/ili rekombinantnih filamentoznih gljiva. U jednom primeru izvođenja, filamentozna gljiva je rekombinantna filamentozna gljiva koja sadrži jedan ili više gena koji mogu biti homologni ili heterologni filamentoznoj gljivi. U jednom primeru izvođenja, filamentozna gljiva je rekombinantna filamentozna gljiva koja sadrži jedan ili više gena koji mogu biti homologni ili heterologni filamentoznoj gljivi pri čemu jedan ili više gena kodiraju enzime koji mogu razgraditi celulozni supstrat. Ceo fermentacioni bujon može da sadrži bilo koji od polipeptida ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0139] Poželjno, kompozicija enzima je ceo fermentacioni bujon u kojoj su ćelije ubijene. Ceo fermentacioni bujon može da sadrži organsku(e) kiselinu(e) (koje se koriste za ubijanje ćelija), ubijene ćelije i/ili ćelijske ostatke i medijum za kulturu.

[0140] Generalno, filamentozne gljive se kultivišu u medijumu za ćelijsku kulturu pogodnom za proizvodnju enzima sposobnih da hidrolizuju celulozni supstrat. Kultivacija se izvodi u pogodnom hranljivom medijumu koji sadrži izvore ugljenika i azota i neorganske soli, primenom postupaka poznatih u tehnici. Pogodni medijumi za kulturu, temperaturni opseg i drugi uslovi pogodni za rast i proizvodnju celulaze i/ili hemicelulaze i/ili pektinaze su poznati u tehnici. Ceo fermentacioni bujon se može pripremiti uzgajanjem filamentoznih gljiva do stacionarne faze i održavanjem filamentoznih gljiva pod ograničenim uslovima ugljenika tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za ekspresiju jedne ili više celulaza i/ili hemicelulaza i/ili pektinaza. Kada se enzimi, kao što su celulaze i/ili hemicelulaze i/ili pektinaze, luče od strane filamentoznih gljiva u medijum za fermentaciju, može se koristiti ceo fermentacioni bujon. Ceo fermentacioni bujon ovog pronalaska može da sadrži filamentozne gljive. U nekim primerima izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži nefrakcionisani sadržaj fermentacionih materijala dobijenih na kraju fermentacije. Tipično, ceo fermentacioni bujon sadrži istrošeni medijum za kulturu i ostatake ćelija prisutne nakon što se filamentozne gljive uzgajaju do zasićenja, inkubiraju pod uslovima koji ograničavaju ugljenik da bi se omogućila sinteza proteina (posebno, ekspresija celulaza i/ili hemicelulaza i/ili pektinaza). U nekim primerima izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži istrošeni medijum ćelijske kulture, ekstracelularne enzime i filamentozne gljive. U nekim primerima izvođenja, filamentozne gljive prisutne u celom fermentacionom bujonu mogu biti lizirane, permeabilizovane ili ubijene korišćenjem postupaka poznatih u tehnici da bi se proizveo ceo fermentacioni bujon sa uništenenim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon je ceo fermentacioni bujon sa uništenenim ćelijama, pri čemu se ceo fermentacioni bujon koji sadrži ćelije filamentoznih gljiva lizira ili ubija. U nekim primerima izvođenja, ćelije se ubijaju lizom filamentoznih gljiva hemijskim i/ili pH tretmanom da bi se stvorio ceo fermentacioni bujon filamentoznih gljiva sa ubijenim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, ćelije se ubijaju lizom filamentoznih gljiva hemijskim i/ili pH tretmanom i podešavanjem pH fermentacione mešavine sa uništenim ćelijama na odgovarajući pH. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži prvu komponentu organske kiseline koja sadrži najmanje jednu organsku kiselinu od 1-5 ugljenika i/ili njenu so i drugu komponentu organske kiseline koja sadrži najmanje 6 ili više ugljeničnih organskih kiselina i/ili njihovu so. U jednom primeru izvođenja, prva komponenta organske kiseline je sirćetna kiselina, mravlja kiselina, propionska kiselina, njihova so ili bilo koja njihova kombinacija, a druga komponenta organske kiseline je benzojeva kiselina, cikloheksankarboksilna kiselina, 4-metilvalerinska kiselina, fenilsirćetna kiselina, njihova so ili bilo koja njihova kombinacija.

[0141] Termin "ceo fermentacioni bujon" kako se ovde koristi odnosi se na preparat proizveden ćelijskom fermentacijom koji ne podleže nikakvoj izolaciji i/ili prečišćavanju ili je to minimalno. Na primer, celi fermentacioni bujoni se proizvode kada se mikrobne kulture uzgajaju do zasićenja, inkubiraju u uslovima koji ograničavaju ugljenik da bi se omogućila sinteza proteina (npr. ekspresija enzima od strane ćelija domaćina) i izlučivanje u medijum ćelijske kulture. Tipično, ceo fermentacioni bujon je nefrakcionisan i sadrži istrošeni medijum za ćelijsku kulturu, ekstracelularne enzime i mikrobne, poželjno nevijabilne ćelije.

[0142] Ako je potrebno, ceo fermentacioni bujon se može frakcionisati i može se koristiti jedan ili više frakcionisanih sadržaja. Na primer, ubijene ćelije i/ili ćelijski ostaci mogu da se uklone iz celog fermentacionog bujona da bi se dobila kompozicija koja ne sadrži ove komponente.

[0143] Ceo fermentacioni bujon može dalje da sadrži konzervans i/ili antimikrobno sredstvo. Takvi konzervansi i/ili agensi su poznati u tehnici.

[0144] Ceo fermentacioni bujon kao što je ovde opisan je tipično tečnost, ali može da sadrži nerastvorljive komponente, kao što su ubijene ćelije, ćelijski ostaci, komponente medijuma za kulturu i/ili nerastvorljivi enzimi. U nekim primerima izvođenja, nerastvorljive komponente mogu da se uklone da bi se dobio prečišćeni ceo fermentacioni bujon.

[0145] U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon može biti dopunjen sa jednom ili više enzimskih aktivnosti koje nisu eksprimirane endogeno, ili eksprimirane na relativno niskom nivou od strane filamentoznih gljiva, da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata, na primer, do fermentabilnih šećera kao što je kao glukoza ili ksiloza. Dodatni enzim(i) se može dodati kao dodatak celom fermentacionom bujonu i enzimi mogu biti komponenta odvojenog celog fermentacionog bujona, ili mogu biti prečišćeni, ili minimalno izolovani i/ili prečišćeni.

[0146] U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži ceo fermentacioni bujon fermentacije rekombinantnih filamentoznih gljiva koje prekomerno eksprimiraju jedan ili više enzima da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata. Alternativno, ceo fermentacioni bujon može da sadrži mešavinu celog fermentacionog bujona fermentacije nerekombinantne filamentozne gljive i rekombinantne filamentozne gljive koja prekomerno eksprimira jedan ili više enzima da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži ceo fermentacioni bujon fermentacije filamentoznih gljiva koje prekomerno eksprimiraju beta-glukozidazu. Alternativno, ceo fermentacioni bujon za upotrebu u ovim postupcima i reaktivnim kompozicijama može da sadrži mešavinu celog fermentacionog bujona fermentacije nerekombinantne filamentozne gljive i ceo fermentacioni bujon fermentacije rekombinantnih filamentoznih gljiva koje prekomerno eksprimiraju betaglukozidazu.

[0147] U jednom primeru izvođenja, postupak za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala sadrži sledeće korake (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) proizvodnju enzimske kompozicije koji sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO kultivisanjem gljive pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju enzimske kompozicije, (d) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije, i (e) izborno, izolacija kompozicije koja sadrži glukozu, pri čemu se količine formiranih hidrolizovanih oksidacionih proizvoda na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celo-oligosaharide održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom enzimske hidrolize lignoceluloznom materijalu, formirani hidrolizovani oksidacioni proizvod je glukonska kiselina.

[0148] U jednom primeru izvođenja, postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala sadrži sledeće korake (a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala, (b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, (c) proizvodnju enzimske kompozicije koji sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO kultivisanjem gljive pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju enzimske kompozicije, (d) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije, (e) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog materijala da bi se dobio proizvod fermentacije, i (f) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije, pri čemu su količine formiranih hidrolizovanih oksidacionih proizvoda na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celo-oligosaharide održava se između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom enzimske hidrolize lignoceluloznom materijalu, formirani hidrolizovani oksidacioni proizvod je glukonska kiselina.

[0149] Kao što je gore navedeno, u poželjnom primeru izvođenja gljiva je filamentozna gljiva, poželjno gljiva pripada rodu Rasamsonia ili Aspergillus. U jednom primeru izvođenja, kultivisanje gljive se sprovodi u aerobnim uslovima. Stručnjak iz date oblasti tehnike je dobro upoznat sa dizajnom fermentora za aerobnu kultivaciju, kao što su, na primer, rezervoari sa mešanjem i kolone sa mehurićima. Generalno, gljive se kultivišu u medijumu za ćelijsku kulturu pogodnom za proizvodnju enzimske kompozicije od interesa. Kultivacija se izvodi u pogodnom hranljivom medijumu koji sadrži izvore ugljenika i azota i neorganske soli, primenom postupaka poznatih u tehnici. Pogodni medijumi za kulturu, temperaturni opseg i drugi uslovi pogodni za rast i proizvodnju enzima su poznati u tehnici. Ovde su opisani njihovi primeri. Kompozicija enzima se može pripremiti uzgajanjem gljiva u stacionarnoj fazi i održavanjem gljiva pod ograničenim uslovima ugljenika tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da eksprimiraju enzime. Kada gljive luče enzime od interesa u medijum za fermentaciju, može se koristiti enzimska kompozicija. Koraku postupka proizvodnje enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO kultivisanjem gljive pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju enzimske kompozicije kao što je ovde opisano, može prethoditi postupak razmnožavanja gljive. Razmnožavanje može da sadrži nekoliko koraka u posudama za mućkanje, malim kontejnerima i velikim kontejnerima.

Lignocelulozni materijal

[0150] Lignocelulozni materijal ovde uključuje bilo koji lignocelulozni i/ili hemicelulozni materijal. Lignocelulozni materijal pogodan za upotrebu kao sirovina u pronalasku uključuje biomasu, npr. devičansku biomasu i/ili nedevičansku biomasu kao što je poljoprivredna biomasa, komercijalna organska materija, građevinski otpad i otpad od rušenja, komunalni čvrsti otpad, otpadni papir i otpad iz dvorišta. Uobičajeni oblici biomase uključuju drveće, žbunje i travu, pšenicu, pšeničnu slamu, šećernu trsku, slamu od šećerne trske, bagasu od šećerne trske, smeće od šećerne trske, travu, miskantus, energetsku trsku, kukuruz, kukuruzni stover hranu, ljuske kukuruza, klipove, stabljike repice, stabljike soje, slatki sirak, zrno kukuruza uključujući vlakna iz zrna, proizvode i nusproizvode od mlevenja žitarica kao što su kukuruz, pšenica i ječam (uključujući mokro mlevenje i suvo mlevenje) koji se često nazivaju „mekinje ili vlakna“ kao i opštinski čvrsti otpad, otpadni papir i otpad iz dvorišta. Biomasa takođe može biti, ali nije ograničena na, zeljasti materijal, poljoprivredni ostaci, ostaci šumarstva, komunalni čvrsti otpad, otpadni papir i ostaci iz fabrike celuloze i papira. „Poljoprivredna biomasa“ obuhvata granje, žbunje, trske, kukuruz i kukuruzne ljuske, energetske useve, šume, voće, cveće, žitarice, travu, zeljaste useve, lišće, koru, iglice, trupce, korenje, mladice, drvenaste kulture kratke rotacije, žbunje, muhar, drveće, povrće, koru voća, vinovu lozu, pulpu šećerne repe, sredinu pšenice, ljuske ovsa i tvrdo i meko drveće (ne uključujući šume sa štetnim materijalima). Pored toga, poljoprivredna biomasa uključuje organske otpadne materijale koji nastaju u poljoprivrednim postupcima uključujući poljoprivredne i šumarske aktivnosti, posebno uključujući šumski drveni otpad. Poljoprivredna biomasa može biti bilo koja od gore navedenih pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji ili mešavini istih.

[0151] Celuloza je organsko jedinjenje sa formulom (C6H10O5)n, polisaharid koji se sastoji od linearnog lanca od nekoliko stotina do preko deset hiljada β(1→4) povezanih jedinica D-glukoze. Molekul glukana je polisaharid monomera D-glukoze povezanih glikozidnim vezama. Ovde se glukan i celuloza koriste naizmenično za polisaharid monomera D-glukoze povezanih glikozidnim vezama. Postupci za kvantitativnu analizu glukanskih ili polisaharidnih kompozicija su dobro poznati i opisani u tehnici i na primer sumirani su u Carvalho de Souza et al., Carbohydrate Polymers 95 (2013) 657-663. Generalno, 50 do 70% glukana je kristalna celuloza, ostatak je amorfna celuloza.

Prethodni tretman

[0152] Lignocelulozni materijal koji se koristi u ovom pronalasku može se isprati i/ili prethodno tretirati. Sirovina se izborno može prethodno tretirati toplotom, mehaničkom i/ili hemijskom modifikacijom ili bilo kojom kombinacijom takvih postupaka kako bi se poboljšala dostupnost supstrata enzimskoj hidrolizi i/ili hidrolizovala hemiceluloza i/ili rastvorila hemiceluloza i/ili celuloza i/ili lignin, na bilo koji način poznat u tehnici. U jednom primeru izvođenja, prethodni tretman se sprovodi tretiranjem lignoceluloze parnom eksplozijom, tretmanom toplom vodom ili tretmanom sa razblaženom kiselinom ili razblaženom bazom.

[0153] U jednom primeru izvođenja lignocelulozni materijal se prethodno tretira pre i/ili tokom enzimske hidrolize. Postupci prethodnog tretmana su poznati u tehnici i uključuju, ali nisu ograničeni na, toplotnu, mehaničku, hemijsku modifikaciju, biološku modifikaciju i bilo koju njihovu kombinaciju. Prethodni tretman se tipično izvodi da bi se poboljšala dostupnost lignoceluloznog materijala za enzimsku hidrolizu i/ili hidrolizu hemiceluloze i/ili rastvorila hemiceluloza i/ili celuloza i/ili lignin u lignoceluloznom materijalu. U jednom primeru izvođenja, prethodni tretman sadrži tretiranje lignoceluloznog materijala parnom eksplozijom, tretman toplom vodom ili tretman razblaženom kiselinom ili razblaženom bazom. Primeri postupaka prethodnog tretmana uključuju, ali nisu ograničeni na, tretman parom (npr. tretman na 100-260°C, pri pritisku od 7-45 bara, pri neutralnom pH, tokom 1-10 minuta), tretman razblaženom kiselinom (npr. tretman) sa 0.1 - 5% H2SO4i/ili SO2i/ili HNO3i/ili HCl, u prisustvu ili odsustvu pare, na 120-200°C, pri pritisku od 2-15 bara, pri kiseloj pH, tokom 2-30 minuta), tretman organosolvom (npr. tretman sa 1 – 1.5% H2SO4u prisustvu organskog rastvarača i pare, na 160-200°C, pri pritisku od 7-30 bara, pri kiseloj pH, 30-60 minuta), tretman krečom (npr. tretman sa 0.1-2% NaOH/Ca(OH)2u prisustvu vode/pare na 60-160°C, pri pritisku od 1-10 bara, pri alkalnom pH, tokom 60-4800 minuta), ARP tretman (npr. tretman sa 5 - 15% NH3, na 150-180°C, pri pritisku od 9-17 bara, pri alkalnom pH, 10-90 minuta), AFEX tretman (npr. tretman sa > 15% NH3, na 60-140°C, pri pritisku od 8-20 bara, na alkalnom pH, 5-30 minuta).

Korak ispiranja

[0154] Izborno, postupak prema pronalasku sadrži korak ispiranja. Izborni korak ispiranja se može koristiti za uklanjanje jedinjenja rastvorljivih u vodi koja mogu delovati kao inhibitori za korak fermentacije. Korak ispiranja se može izvesti na poznati način.

[0155] Lignocelulozni materijal se može isprati. U jednom primeru izvođenja lignocelulozni materijal se može isprati nakon prethodnog tretmana. Korak ispiranja se može koristiti za uklanjanje jedinjenja rastvorljivih u vodi koja mogu delovati kao inhibitori za korak fermentacije i/ili hidrolize. Korak ispiranja može se izvesti na način poznat stručnjaku. Pored ispiranja, postoje i drugi postupci detoksikacije. Prethodno tretirani lignocelulozni materijal se takođe može detoksikovati bilo kojom (ili bilo kojom kombinacijom) ovih postupaka koji uključuju, ali nisu ograničeni na, razdvajanje čvrste/tečne materije, vakuumsko isparavanje, ekstrakciju, adsorpciju, neutralizaciju, preklapanje, dodavanje redukcionih agenasa, dodavanje enzima za detoksikaciju kao što su lakaze ili peroksidaze, dodavanje mikroorganizama sposobnih za detoksikaciju hidrolizata.

Enzimska hidroliza

[0156] Kompozicija enzima koja se koristi u postupku pronalaska može izuzetno efikasno da hidrolizuje lignocelulolitički materijal, na primer kukuruznu slamu, pšeničnu slamu, slamu od trske i/ili bagasu šećerne trske, koja se zatim može dalje pretvoriti u koristan proizvod, kao što je etanol, biogas, butanol, mlečna kiselina, plastika, organska kiselina, rastvarač, dodatak hrani za životinje, farmaceutski proizvod, vitamin, aminokiselina, enzim ili hemijska sirovina. Pored toga, intermedijarni proizvodi iz postupka koji sledi nakon hidrolize, na primer mlečna kiselina kao intermedijer u proizvodnji biogasa, mogu se koristiti kao gradivni blok za druge materijale. Ovaj pronalazak je ilustrovan kao primer proizvodnje etanola, ali ovo je urađeno samo kao primer, a ne kao ograničenje, drugi pomenuti korisni proizvodi se mogu proizvesti jednako dobro.

[0157] Postupak prema pronalasku sadrži korak enzimske hidrolize. Enzimska hidroliza uključuje, ali nije ograničena na, hidrolizu u svrhu likvifikacije sirovine i hidrolizu u svrhu oslobađanja šećera iz sirovine ili oba. U ovom koraku izborno prethodno tretiran i izborno ispran lignocelulozni materijal se dovodi u kontakt sa enzimskom kompozicijom prema pronalasku. U zavisnosti od lignoceluloznog materijala i prethodnog tretmana, različiti reakcioni uslovi, npr. temperatura, doza enzima, vreme reakcije hidrolize i koncentracija suve materije, stručnjak može prilagoditi kako bi se postigla željena konverzija lignoceluloze u šećer. Neke indikacije su date u nastavku.

[0158] U jednom primeru izvođenja, enzimska hidroliza sadrži najmanje korak likvifikacije u kome se lignocelulozni materijal hidrolizuje u najmanje prvom kontejneru, i korak saharifikacije gde se tečni lignocelulozni materijal hidrolizuje u najmanje prvom kontejneru i/ili u najmanje drugom kontejneru. Saharifikacija se može obaviti u istom kontejneru kao i tečnost (tj. najmanje prvi kontejner), može se uraditi i u posebnom kontejneru (tj. najmanje drugi kontejner). Dakle, u enzimskoj hidrolizi postupka prema ovom pronalasku, tečnost i saharifikacija se mogu kombinovati. Alternativno, likvifikacija i saharifikacija mogu biti odvojeni koraci. Likvifikacija i saharifikacija se mogu vršiti na različitim temperaturama, ali se takođe mogu izvoditi na jednoj temperaturi. U jednom primeru izvođenja, temperatura likvifikacije je viša od temperature saharifikacije. Poželjno je da se likvifikacija vrši na temperaturi od 60 - 75°C, a saharifikacija se poželjno izvodi na temperaturi od 50 - 65°C.

[0159] Enzimi koji se koriste u enzimskoj hidrolizi mogu se dodati pre i/ili tokom enzimske hidrolize. U slučaju da enzimska hidroliza sadrži korak likvifikacije i korak saharifikacije, dodatni enzimi se mogu dodati tokom i/ili posle koraka likvifikacije. Dodatni enzimi se mogu dodati pre i/ili tokom koraka saharifikacije. Dodatni enzimi se takođe mogu dodati nakon koraka saharifikacije.

[0160] U jednom aspektu pronalaska, hidroliza se izvodi na temperaturi od 45°C ili više, 50°C ili više, 55°C ili više, 60°C ili više, 65°C ili više, ili 70°C ili više. Visoka temperatura tokom hidrolize ima mnoge prednosti, koje uključuju rad na optimalnoj temperaturi kompozicije enzima, smanjenje rizika od (bakterijske) kontaminacije, smanjeni viskozitet, manju količinu vode za hlađenje, korišćenje rashladne vode sa višom temperaturom, ponovna upotreba enzima i drugo.

[0161] Viskoznost lignoceluloznog materijala u jednom ili više kontejnera koji se koriste za enzimsku hidrolizu održava se između 10 i 4000 cP, između 10 i 2000 cP, poželjno između 10 i 1000 cP.

[0162] U slučaju da postupak sadrži enzimsku hidrolizu koja sadrži korak likvifikacije i korak saharifikacije, viskozitet lignoceluloznog materijala u koraku likvifikacije se održava između 10 i 4000 cP, između 10 i 2000 cP, poželjno između 10 i 1000 cP i/ili viskoznost lignoceluloznog materijala u koraku saharifikacije održava se između 10 i 1000 cP, između 10 i 900 cP, poželjno između 10 i 800 cP.

[0163] Viskoznost se može odrediti pomoću Brookfield DV III reometra na temperaturi koja se koristi za hidrolizu.

[0164] U dodatnom aspektu pronalaska, količina dodate kompozicije enzima (ovde se takođe naziva doza enzima ili opterećenje enzima) je niska. U jednom primeru izvođenja, količina enzima je 6 mg proteina/g težine suve materije ili manje, 5 mg proteina/g suve materije ili manje, 4 mg proteina/g suve materije ili manje, 3 mg proteina/g suve materije ili manje, 2 mg proteina/g suve materije ili manje, ili 1 mg proteina/g suve materije ili manje (izraženo kao protein u mg proteina/g suve materije). U jednom primeru izvođenja, količina enzima je 0.5 mg enzima/g težine suve materije ili manje, 0.4 mg kompozicije enzima/g težine suve materije ili manje, 0.3 mg enzima/g težine suve materije ili manje, 0.25 mg enzima/g težine suve materije ili manje, 0.20 mg enzima / g težine suve materije ili manje, 0.18 mg enzima / g težine suve materije ili manje, 0.15 mg enzima / g težine suve materije ili manje ili 0.10 mg enzima / g težine suve materije ili manje (izraženo kao ukupni enzimi celulaze u mg enzima/g suve materije). Moguća je niska doza enzima, jer je zbog aktivnosti i stabilnosti enzima moguće povećati vreme reakcije hidrolize.

[0165] U dodatnom aspektu pronalaska, vreme reakcije hidrolize je 5 sati ili više, 10 sati ili više, 20 sati ili više, 40 sati ili više, 50 sati ili više, 60 sati ili više, 70 sati ili više, 80 sati ili više, 90 sati ili više, 100 sati ili više, 120 sati ili više, 130 sati ili više. U sledećem aspektu, vreme reakcije hidrolize je 5 do 150 sati, 40 do 130 sati, 50 do 120 sati, 60 do 120 sati, 60 do 110 sati, 60 do 100 sati, 70 do 100 sati, 70 do 90 sati ili 70 sati do 80 sati. Zbog stabilnosti kompozicije enzima moguća su duža vremena reakcije hidrolize uz odgovarajuće veće prinose šećera.

[0166] pH tokom hidrolize može izabrati stručnjak. U dodatnom aspektu pronalaska, pH tokom hidrolize može biti 3.0 do 6.4. Stabilni enzimi pronalaska mogu imati širok pH opseg do 2 pH jedinice, do 3 pH jedinice, do 5 pH jedinica. Optimalni pH može biti u granicama pH od 2.0 do 8.0, 3.0 do 8.0, 3.5 do 7.0, 3.5 do 6.0, 3.5 do 5.0, 3.5 do 4.5, 4.0 do 4.5 ili je oko 4.2.

[0167] U daljem aspektu pronalaska, korak hidrolize se sprovodi sve dok 70% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 92% ili više, 95% ili više dostupnog šećera u lignoceluloznom materijalu ne bude oslobođeno.

[0168] Značajno je da se postupak pronalaska može izvesti korišćenjem visokih nivoa suve materije (lignoceluloznog materijala) u reakciji hidrolize. Dakle, pronalazak se može izvesti sa sadržajem suve materije od oko 5 tež. % ili više, oko 8 tež. % ili više, oko 10 tež. % ili više, oko 11 tež. % ili više, oko 12 tež. % ili više, oko 13 tež. % ili više, oko 14 tež. % ili više, oko 15 tež. % ili više, oko 20 tež. % ili više, oko 25 tež. % ili više, oko 30 tež. % ili više, oko 35 tež. % ili više ili oko 40 tež. % ili više. U dodatnom primeru izvođenja, sadržaj suve materije u koraku hidrolize je 14 tež. %, 15 tež. %, 16 tež. %, 17 tež. %, 18 tež. %, 19 tež. %, 20 tež. %, 21 tež. %, 22 tež. %, 23 tež. %, 24 tež. %, 25 tež. %, 26 tež. %, 27 tež. %, 28 tež. %, 29 tež. %, 30 tež. %, 31 tež. %, 32 tež. %, 33 tež. % ili više ili 14 do 33 tež. %.

[0169] U sledećem primeru izvođenja sadržaj suve materije na kraju hidrolize je 5 tež. % ili više, 6 tež. % ili više, 7 tež. % ili više, 8 tež. % ili više, 9 tež. % ili više, 10 tež. % ili više, 11 tež. % ili više, 12 tež. % ili više, 13 tež. % ili više, 14 tež. % ili više, 15 tež. % ili više, 16 tež. % ili više, 17 tež. % ili više, 18 tež. % ili više, 19 tež. % ili više, 20 tež. % ili više, 21 tež. % ili više, 22 tež. % ili više, 23 tež. % ili više, 24 tež. % ili više, 25 tež. % ili više, 26 tež. % ili više, 27 tež. % ili više više, 28 tež. % ili više, 29 tež. % ili više, 30 tež. % ili više, 31 tež. % ili više, 32 tež. % ili više, 33 tež. % ili više, 34 tež. % ili više, 35 tež. % ili više, 36 tež. % ili više, 37 tež. % ili više, 38 tež. % ili više ili 39 tež. % ili više. U sledećem primeru izvođenja sadržaj suve materije na kraju enzimske hidrolize je između 5 tež. % - 40 tež. %, 6 tež. % - 40 tež. %, 7 tež. % - 40 tež. %, 8 tež. % - 40 tež. %, 9 tež. % - 40 tež. %, 10 tež. % - 40 tež. %, 11 tež. % - 40 tež. %, 12 tež. % - 40 tež. %, 13 tež. % - 40 tež. %, 14 tež. % - 40 tež. %, 15 tež. % - 40 tež. %, 16 tež. % - 40 tež. %, 17 tež. % - 40 tež. %, 18 tež. % - 40 tež. %, 19 tež. % - 40 tež. %, 20 tež. % - 40 tež. %, 21 tež. % - 40 tež. %, 22 tež. % - 40 tež. %, 23 tež. % - 40 tež. %, 24 tež. % - 40 tež. %, 25 tež. % - 40 tež. %, 26 tež. % - 40 tež. %, 27 tež. % - 40 tež. %, 28 tež. % - 40 tež. %, 29 tež. % - 40 tež. %, 30 tež. % - 40 tež. %, 31 tež. % - 40 tež. %, 32 tež. % - 40 tež. %, 33 tež. % - 40 tež. %, 34 tež. % - 40 tež. %, 35 tež. % - 40 tež. %, 36 tež. % - 40 tež. %, 37 tež. % - 40 tež. %, 38 tež. % - 40 tež. %, 39 tež. % - 40 tež. %.

Fermentacija

[0170] Postupak prema pronalasku može da sadrži korak fermentacije. Fermentacija se može vršiti istovremeno sa hidrolizom u jednom reaktoru (SSF). Poželjno je da se fermentacija vrši nakon hidrolize i mogu se izabrati optimalni uslovi za hidrolizu i fermentaciju koji mogu biti različiti za hidrolizu i fermentaciju. U dodatnom aspektu, pronalazak tako uključuje postupke koraka fermentacije u kojima se mikroorganizam koristi za fermentaciju izvora ugljenika koji sadrži šećer(e), npr. glukozu, L-arabinozu i/ili ksilozu. Izvor ugljenika može uključivati bilo koji ugljeni hidrat oligo- ili polimer koji sadrži L-arabinozu, ksilozu ili jedinice glukoze, kao što su npr. lignoceluloza, ksilani, celuloza, skrob, arabinan i slično. Za oslobađanje jedinica ksiloze ili glukoze iz takvih ugljenih hidrata, odgovarajuće karbohidraze (kao što su ksilanaze, glukanaze, amilaze i slično) mogu da se dodaju medijumu za fermentaciju ili mogu biti proizvedene od strane modifikovane ćelije domaćina. U poslednjem slučaju, modifikovana ćelija domaćina može biti genetski modifikovana da proizvodi i izlučuje takve ugljene hidrate. Dodatna prednost korišćenja oligo- ili polimernih izvora glukoze je to što omogućava održavanje niske(niže) koncentracije slobodne glukoze tokom fermentacije, npr. korišćenjem količina karbohidraza koje ograničavaju brzinu. Ovo će zauzvrat sprečiti potiskivanje sistema potrebnih za metabolizam i transport neglukoznih šećera kao što je ksiloza. U poželjnom postupku, modifikovana ćelija domaćina fermentira i L-arabinozu (opciono ksilozu) i glukozu, poželjno istovremeno, u kom slučaju se poželjno koristi modifikovana ćelija domaćina koja je neosetljiva na suzbijanje glukoze da bi se sprečio dijauksički rast. Pored izvora L-arabinoze, izborno ksiloze (i glukoze) kao izvora ugljenika, medijum za fermentaciju će dalje sadržati odgovarajući sastojak potreban za rast modifikovane ćelije domaćina. Kompozicije medijuma za fermentaciju za rast mikroorganizama kao što su kvasci ili filamentozne gljive su dobro poznate u tehnici.

[0171] Vreme fermentacije može biti kraće nego kod konvencionalne fermentacije pri istim uslovima, pri čemu deo enzimske hidrolize i dalje mora da učestvuje tokom fermentacije. U jednom primeru izvođenja, vreme fermentacije je 100 sati ili manje, 90 sati ili manje, 80 sati ili manje, 70 sati ili manje, ili 60 sati ili manje, za kompoziciju šećera od 50 g/l glukoze i odgovarajućih drugih šećera iz lignocelulozne sirovine (npr. 50 g/l ksiloze, 35 g/l L-arabinoze i 10 g/l galaktoze. Za razblaženije kompozicije šećera vreme fermentacije može se shodno tome smanjiti.

[0172] Postupak fermentacije može biti aerobni ili anaerobni postupak fermentacije. Postupak anaerobne fermentacije je ovde definisan kao postupak fermentacije koji se izvodi u odsustvu kiseonika ili u kome se kiseonik praktično ne troši, poželjno manje od 5, 2.5 ili 1 mmol/L/h, poželjnije 0 mmol/L/h. (tj. potrošnja kiseonika se ne može detektovati), a pri čemu organski molekuli služe i kao donori elektrona i kao akceptori elektrona. U nedostatku kiseonika, NADH proizveden u glikolizi i formiranju biomase, ne može se oksidovati oksidativnom fosforilacijom. Da bi rešili ovaj problem, mnogi mikroorganizmi koriste piruvat ili jedan od njegovih derivata kao akceptor elektrona i vodonika i na taj način regenerišu NAD<+>. Dakle, u poželjnom postupku anaerobne fermentacije piruvat se koristi kao elektron (i akceptor vodonika) i redukuje se do proizvoda fermentacije kao što su etanol, mlečna kiselina, 3-hidroksi-propionska kiselina, akrilna kiselina, sirćetna kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, fumarna kiselina, aminokiselina, 1,3-propan-diol, etilen, glicerol, butanol, β-laktamski antibiotici i cefalosporin. U poželjnom primeru izvođenja, postupak fermentacije je anaeroban. Anaerobni postupak je povoljan jer je jeftiniji od aerobnih postupaka: potrebno je manje specijalne opreme. Pored toga, očekuje se da će anaerobni postupci dati veći prinos proizvoda od aerobnih postupaka. U aerobnim uslovima, obično je prinos biomase veći nego u anaerobnim uslovima. Kao posledica toga, obično u aerobnim uslovima, očekivani prinos proizvoda je manji nego u anaerobnim uslovima.

[0173] U sledećem primeru izvođenja, postupak fermentacije je u uslovima ograničenim kiseonikom. Poželjnije, postupak fermentacije je aeroban i pod uslovima ograničenim kiseonikom. Postupak fermentacije ograničen kiseonikom je postupak u kome je potrošnja kiseonika ograničena prenosom kiseonika iz gasa u tečnost. Stepen ograničenja kiseonika je određen količinom i sastavom ulaznog toka gasa, kao i stvarnim svojstvima mešanja/prenosa mase korišćene opreme za fermentaciju. Poželjno, u postupku pod uslovima ograničenim kiseonikom, brzina potrošnje kiseonika je najmanje 5.5, poželjnije najmanje 6 i još poželjnije najmanje 7 mmol/L/h.

[0174] Poželjno je da se postupak fermentacije izvodi na temperaturi koja je optimalna za modifikovanu ćeliju. Dakle, za većinu ćelija kvasca ili gljiva, postupak fermentacije se izvodi na temperaturi koja je niža od 42°C, poželjno niža od 38°C. Za ćelije domaćina kvasca ili filamentoznih gljiva, postupak fermentacije se poželjno izvodi na temperaturi koja je niža od 35, 33, 30 ili 28°C i na temperaturi koja je viša od 20, 22 ili 25°C.

[0175] U jednom primeru izvođenja pronalaska, u koraku se fermentacija izvodi sa mikroorganizmom koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer. U jednom primeru izvođenja, postupak je postupak za proizvodnju etanola pri čemu postupak sadrži korak koji sadrži fermentaciju medijuma koji sadrži šećer(e) sa mikroorganizmom koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer, pri čemu je ćelija domaćin sposobna da fermentiše glukozu, L-arabinozu i ksilozu u etanol. Mikroorganizam može biti prokariotski ili eukariotski organizam. Mikroorganizam koji se koristi u postupku može biti genetski modifikovan mikroorganizam. Primeri pogodnih organizama su kvasci, na primer Saccharomyces, npr. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus ili Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, npr. Issatchenkia orientalis, Pichia, npr. Pichia stipites ili Pichia pastoris, Kluyveromyces, npr. Kluyveromyces fagilis, Candida, npr. Candida pseudotropicalis ili Candida acidothermophilum, Pachysolen, npr. Pachysolen tannophilusili bakterije, na primer Lactobacillus, npr. Lactobacillus, npr. Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, npr. Zymomonas mobilis, Clostridium, npr. Clostridium phytofermentans, Escherichia, npr. E. coli, Klebsiella, npr. Klebsiella oxytoca. U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer je kvasac. U jednom primeru izvođenja, kvasac pripada rodu Saccharomyces, poželjno od vrste Saccharomyces cerevisiae, u kojoj su izvršene genetske modifikacije. Primer takvog mikroorganizma i njegova priprema detaljnije je opisano u WO 2008/041840 i u evropskoj patentnoj prijavi EP10160622.6, podnetoj 21.04.2010. U jednom primeru izvođenja, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je anaeroban. Anaerobno je već ranije definisano. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je aeroban. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je u uslovima ograničenim kiseonikom, poželjnije aerobnim i pod uslovima ograničenim kiseonikom. Uslovi ograničeni kiseonikom su već ranije definisani.

[0176] U takvom postupku, zapreminska produktivnost etanola je poželjno najmanje 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0 ili 10.0 g etanola po litru na sat. Prinos etanola na L-arabinozu i izborno ksilozu i/ili glukozu u postupku poželjno je najmanje 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ili 98%. Prinos etanola je ovde definisan kao procenat teoretskog maksimalnog prinosa, koji za glukozu i L-arabinozu i izborno ksilozu iznosi 0.51 g etanola po g glukoze ili ksiloze.

[0177] U jednom aspektu, postupak fermentacije koji vodi do proizvodnje etanola ima nekoliko prednosti u poređenju sa poznatim postupcima fermentacije etanola:

- mogući su anaerobni postupci;

- takođe su mogući uslovi ograničeni kiseonikom;

- mogu se dobiti veći prinosi etanola i stope proizvodnje etanola;

- korišćeni soj može da koristi L-arabinozu i izborno ksilozu.

[0178] Alternativno gore opisanim postupcima fermentacije, mogu se koristiti najmanje dve različite ćelije, što znači da ovaj postupak je postupak kofermentacije. Svi poželjni primeri izvođenja postupka fermentacije kao što je gore opisano su takođe poželjni primeri izvođenja ovog postupka kofermentacije: identičnost proizvoda fermentacije, identičnost izvora L-arabinoze i izvora ksiloze, uslovi fermentacije (aerobni ili anaerobni uslovi, uslovima sa ograničenim kiseonikom, temperatura na kojoj se postupak izvodi, produktivnost etanola, prinos etanola).

[0179] Postupak fermentacije se može izvesti bez ikakvih zahteva za podešavanje pH tokom postupka. To znači da je postupak onaj koji se može izvesti bez dodavanja kiseline(a) ili baze(a). Međutim, ovo isključuje korak prethodnog tretmana, gde se može dodati kiselina. Poenta je u tome da je kompozicija prema pronalasku sposobna da deluje pri niskom pH i, prema tome, nema potrebe da se podešava pH kiseline prethodno tretirane kiselinom sirovine kako bi se izvršila saharifikacija ili hidroliza. Shodno tome, postupak pronalaska može biti postupak bez otpada koristeći samo organske proizvode bez zahteva za neorganskim hemijskim unosom.

Ukupno vreme reakcije

[0180] Prema pronalasku, ukupno vreme reakcije (ili vreme reakcije koraka hidrolize i koraka fermentacije zajedno) može biti smanjeno. U jednom primeru izvođenja, ukupno vreme reakcije je 300 sati ili manje, 200 sati ili manje, 150 sati ili manje, 140 sati ili manje, 130 ili manje, 120 sati ili manje, 110 sati ili manje, 100 sati ili manje, 90 sati ili manje, 80 sati ili manje, 75 sati ili manje, ili oko 72 sata pri prinosu glukoze od 90%. Shodno tome, niža ukupna vremena mogu se postići pri manjem prinosu glukoze.

Proizvodi fermentacije

[0181] Proizvodi fermentacije koji se mogu proizvesti prema pronalasku uključuju aminokiseline, vitamine, farmaceutske proizvode, dodatke stočnoj hrani, specijalne hemikalije, hemijske sirovine, plastiku, rastvarače, goriva ili druge organske polimere, mlečnu kiselinu i etanol, uključujući etanol za gorivo (pod pojmom "etanol" podrazumeva se etil alkohol ili smeše etil alkohola i vode).

[0182] Specifični proizvodi sa dodatom vrednošću koji se mogu proizvesti postupcima pronalaska uključuju, ali ne ograničavajući se na, biogoriva (uključujući biogas, etanol i butanol); mlečnu kiselinu; 3-hidroksi-propionsku kiselinu; akrilnu kiselinu; sirćetnu kiselinu; 1,3-propan-diol; etilen; glicerol; plastiku; specijalnu hemikaliju; organsku kiselinu, uključujući limunsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu i maleinsku kiselinu; rastvarač; dodatak hrani za životinje; farmaceutski proizvod kao što je β-laktamski antibiotik ili cefalosporin; vitamin; aminokiselinu, kao što je lizin, metionin, triptofan, treonin i asparaginska kiselina; enzim, kao što je proteaza, celulaza, amilaza, glukanaza, laktaza, lipaza, liaza, oksidoreduktaza, transferaza ili ksilanaza; hemijsku sirovinu; ili dodatak hrani za životinje.

[0183] Proizvodi fermentacije koji se mogu proizvesti postupcima pronalaska mogu biti bilo koja supstanca dobijena fermentacijom. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, alkohole (kao što su arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propandiol, sorbitol i ksilitol); organsku kiselinu (kao što su sirćetna kiselina, acetonska kiselina, adipinska kiselina, askorbinska kiselina, akrilna kiselina, limunska kiselina, 2,5-diketo-D-glukonska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, glukarna kiselina, glukonska kiselina, glukuronska kiselina, glutarna kiselina kiselina, 3-hidroksipropionska kiselina, itakonska kiselina, mlečna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, oksalna kiselina, oksalosirćetna kiselina, propionska kiselina, ćilibarna kiselina i ksilonska kiselina); ketone (kao što je aceton); aminokiseline (kao što su asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, glicin, lizin, serin, triptofan i treonin); alkane (kao što su pentan, heksan, heptan, oktan, nonan, dekan, undekan i dodekan), cikloalkane (kao što su ciklopentan, cikloheksan, cikloheptan i ciklooktan), alkene (kao što su penten, heksen, ciklohepten); i gasove (kao što su metan, vodonik (H2), ugljen-dioksid (CO2), i ugljen monoksid (CO)). Proizvod fermentacije takođe može biti protein, vitamin, farmaceutski proizvod, dodatak hrani za životinje, specijalna hemikalija, hemijska sirovina, plastika, rastvarač, etilen, enzim, kao što je proteaza, celulaza, amilaza, glukanaza, laktaza, lipaza, liaza, oksidoreduktaza, transferaza ili ksilanaza.

Odvajanje proizvoda fermentacije

[0184] Postupak prema pronalasku izborno sadrži izolaciju proizvoda fermentacije. Proizvod fermentacije može se odvojiti od fermentacionog bujona na bilo koji poznati način. Za svaki proizvod fermentacije stručnjak će tako moći da izabere odgovarajuću tehniku razdvajanja. Na primer, etanol se može odvojiti od fermentacionog bujona kvasca destilacijom, na primer destilacijom vodenom parom/vakuum destilacijom na konvencionalni način.

[0185] Određeni primeri izvođenja pronalaska će dole biti opisani detaljnije, ali ni na koji način ne ograničavaju obim ovog pronalaska koji je ograničen priloženim patentnim zahtevima.

Upotreba termostabilnih enzima pod optimalnim temperaturnim uslovima

[0186] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na upotrebu termostabilnih enzima kao što su celulolitički enzimi Rasamsonia za proizvodnju redukcionih šećera iz prethodno tretiranih lignoceluloznih sirovina u, ali ne ograničavajući se na, proizvodnji etanola. Celulolitički enzimi Rasamsonia primenjeni na prethodno tretiranu lignoceluloznu sirovinu su pokazali maksimalne stope konverzije na temperaturi u opsegu od 50 do 70°C. Enzim ostaje aktivan pod ovim okolnostima 14 dana i više bez potpunog prestanka aktivnosti.

[0187] Korišćenjem optimalnih temperaturnih uslova, maksimalna količina redukcionih šećera može se osloboditi iz sirovine (totalna hidroliza) u najkraćem mogućem vremenu hidrolize. Na ovaj način se 100% konverzija celuloze u glukozu postiže za manje od 5 dana.

[0188] Teoretski maksimalni prinos (Yps max u g proizvoda po gramu glukoze) proizvoda fermentacije može se izvesti iz udžbenika biohemije. Za etanol, 1 mol glukoze (180 g) daje prema normalnom putu fermentacije glikolizom u kvascu 2 mola etanola (= 2 x 46 = 92 g etanola. Teoretski maksimalni prinos etanola na glukozu je prema tome = 92/1511 g etanola/g glukoze.

[0189] Za butanol (MW 74 g/mol) ili izobutanol, teoretski maksimalni prinos je 1 mol butanola po molu glukoze. Dakle Yps max za (izo-)butanol = 74/180 = 0.411 g (izo-)butanol/g glukoze.

[0190] Za mlečnu kiselinu, prinos fermentacije za homolaktičnu fermentaciju je 2 mola mlečne kiseline (MW = 90 g/mol) po molu glukoze. Prema ovoj stehiometriji, Yps max = 1 g mlečne kiseline/g glukoze.

[0191] Za druge proizvode fermentacije može se napraviti sličan proračun.

[0192] Smanjenje troškova postignuto primenom celulolitičkih enzima Rasamsonia biće rezultat ukupnog smanjenja vremena postupka.

Kompenzacija niže doze enzima sa produženim vremenom hidrolize korišćenjem enzima Rasamsonia

[0193] Zbog visoke stabilnosti stabilnih enzima, aktivnosti ne prestaju na vreme, iako se u toku hidrolize oslobađa manje redukcionih šećera. Moguće je smanjiti dozu enzima i produžiti upotrebu enzima produžavanjem vremena hidrolize kako bi se dobili slični nivoi oslobođenih redukcionih šećera. Na primer, 0.175 mL enzima/g suve materije sirovine rezultiralo je oslobađanjem približno 90% teoretskog maksimuma redukujućih šećera iz prethodno tretirane sirovine u roku od 72 h. Kada se koristi 0.075 mL enzima/g suve materije sirovine, približno 90% konverzije teoretskog maksimuma se postiže u roku od 120 h. Rezultati pokazuju da se zbog stabilnosti aktivnosti enzima smanjenje doze enzima može nadoknaditi produžavanjem vremena hidrolize da bi se dobila ista količina redukcionih šećera. Isto važi i za hidrolizu prethodno tretirane sirovine sa sadržajem suve materije većim od 10% pokazuje da kompenzujući efekat produženog vremena hidrolize kod 15% sirovine suve materije.

[0194] Smanjenje troškova postignuto upotrebom stabilnih celulolitičkih enzima, kao što su od Rasamsonia, rezultat zahteva manje doze enzima, što rezultira sličnim prinosima konverzije hidrolize.

Smanjenje rizika od kontaminacije stabilnim enzimima

[0195] U uobičajenom postupku za pretvaranje lignoceluloznog materijala u etanol, koraci postupka se poželjno obavljaju u septičkim uslovima da bi se smanjili operativni troškovi. Stoga može doći do kontaminacije i rasta kontaminirajućih mikroorganizama i rezultirati neželjenim nuspojavama, kao što su proizvodnja mlečne kiseline, mravlje kiseline i sirćetne kiseline, gubitak etanola na supstratu, proizvodnja toksina i ekstracelularnih polisaharida, što može značajno uticati na troškove proizvodnje. Visoka temperatura postupka i/ili kratko vreme postupka će ograničiti rizik od kontaminacije tokom hidrolize i fermentacije. Termostabilni enzimi, poput onih kod Rasamsonia, su sposobni da hidrolizuju lignoceluloznu sirovinu na temperaturama višim od 60°C. Na ovim temperaturama, rizik da će kontaminirajući mikroorganizam izazvati neželjene nuspojave biće mali do skoro nula.

[0196] Tokom koraka fermentacije, u kojem se proizvodi etanol, temperature su tipično između 30 do 37°C i poželjno je da se ne povećavaju zbog gubitaka u proizvodnji. Primenom što kraćih vremena postupka fermentacije, rizici i efekti kontaminacije i/ili rasta zagađivača biće smanjeni što je više moguće. Sa stabilnim enzimima, poput onih u Rasamsonia, mogu se primeniti što je moguće kraće vreme fermentacije (videti opis iznad), i na taj način će se rizici od kontaminacije i/ili rasta zagađivača smanjiti što je više moguće. Smanjenje troškova postignuto primenom termostabilnih celulolitičkih enzima Rasamsonia na ovaj način će rezultirati manjim rizikom od neuspeha u postupku usled kontaminacije.

Stabilni enzimi smanjuju troškove hlađenja i povećavaju produktivnost postrojenja za etanol

[0197] Prvi korak nakon termičke prethodnog tretmana biće hlađenje prethodno tretirane sirovine do temperature na kojoj su enzimi optimalno aktivni. U velikim razmerama, to se obično radi dodavanjem (ohlađene) vode, koja će, osim što će smanjiti temperaturu, smanjiti i sadržaj suve materije. Korišćenjem termo stabilnih enzima, poput onih od Rasamsonia, smanjenje troškova može se postići činjenicom da (i) je potrebno manje hlađenja prethodno tretirane sirovine pošto su tokom hidrolize dozvoljene više temperature, i (ii) će biti dodato manje vode, što će povećati sadržaj suve materije tokom hidrolize i fermentacije i na taj način povećati kapacitet proizvodnje etanola (proizvedenu količinu po vremenskoj jedinici po zapremini) postrojenja za etanol. Takođe, korišćenjem termostabilnih enzima prema pronalasku, poput onih od Rasamsonia, smanjenje troškova se takođe može postići korišćenjem rashladne vode koja ima višu temperaturu od vode koja se koristi u postupku sa netermostabilnim enzimom.

Recikliranje enzima nakon hidrolize sa stabilnim enzimima

[0198] Na kraju hidrolize, aktivnosti enzima izgledaju niske jer se malo redukujućih šećera oslobađa kada se skoro sva celuloza pretvori. Količina prisutne enzimske aktivnosti se, međutim, samo malo smanjila, pretpostavlja se uglavnom zbog apsorpcije enzima u supstrat. Primenom razdvajanja čvrstog i tečnog posle hidrolize, kao što je centrifugiranje, filtracija, sedikantacija, itd., 60% ili više, npr. 70% aktivnosti enzima u rastvoru može se povratiti i ponovo upotrebiti za hidrolizu nove prethodno tretirane lignocelulozne sirovine tokom sledeće hidrolize.

[0199] Pored toga, nakon razdvajanja čvrstog i tečnog, enzim u rastvoru može da se odvoji od rastvora koji sadrži redukcione šećere i druge proizvode hidrolize iz enzimskog delovanja. Ovo odvajanje se može izvršiti, ali ne ograničavajući se na, (ultra i mikro)filtracijom, centrifugiranjem, sedikantacijom, sedimentacijom, sa ili bez prve adsorpcije enzima na nosač bilo koje vrste.

[0200] Na primer, posle hidrolize prethodno tretirane sirovine sa 0.175 mL/g sirovine sa enzimskim opterećenjem suve materije tokom 20 sati, oslobađa se 50% teorijske maksimalne količine redukujućih šećera i nakon iste hidrolize tokom 72 sata, 90% teorijske maksimalne količine oslobađa se redukcionih šećera. Centrifugiranjem i ultrafiltracijom, 60-70% aktivnosti enzima je obnovljeno u retentatu, dok je filtrat sadržao više od 80% oslobođenih redukujućih šećera. Ponovnom upotrebom retentata, bilo kakav jeste ili nakon daljeg prečišćavanja i/ili koncentracije, doza enzima tokom sledećeg koraka hidrolize može se smanjiti za 60 do 70%. Smanjenje troškova postignuto upotrebom stabilnih celulolitičkih enzima, kao što su od Rasamsonia, na ovaj način proizilazi iz potrebe manje doze enzima.

Recikliranje enzima nakon hidrolize u kombinaciji sa proizvodnjom enzima i reciklažom ćelija kvasca sa stabilnim enzimima

[0201] Postupak koji uključuje reciklažu enzima nakon hidrolize, kao što je gore opisano, može se kombinovati sa reciklažom mikroorganizma koji proizvodi etanol nakon fermentacije i upotrebom redukcionog šećera koji sadrži filtrat kao supstrata (prečišćenog i/ili koncentrovanog ili razblaženog) u fermentaciji proizvodnje enzima i kao supstrat za kultivaciju mikroorganizma koji proizvodi etanol.

Recikliranje enzima nakon vakuumske destilacije sa stabilnim enzimima

[0202] Termo stabilnost enzima, poput onih iz Rasamsonia, izaziva preostalu celulolitičku aktivnost nakon hidrolize, fermentacije i vakuum destilacije u tankom sloju. Ukupna aktivnost enzima se smanjuje tokom tri uzastopna koraka postupka. Tanak ostatak dobijen posle vakuumske destilacije može se tako ponovo koristiti kao izvor enzima za novozapočeti ciklus postupka hidroliza-fermentacija-destilacija za konverziju prethodno tretirane pšenične slame u etanol. Tanak ostatak se može koristiti u koncentrovanom ili (ne)razblaženom obliku i/ili prečišćen i sa ili bez dodatnih enzima.

Recikliranje enzima u kombinaciji sa dodatkom enzima nakon vakuumske destilacije sa termostabilnim enzimima

[0203] U optimalnom postupkom, količina enzima se dodaje u tanki sloj pre njegove ponovne upotrebe u novom ciklusu postupka, jednaka količini aktivnosti izgubljene tokom tri uzastopna koraka postupka prethodnog ciklusa postupka. Na ovaj način se izbegava predoziranje enzima i na taj način se postiže najefikasnija upotreba enzima.

[0204] Pored toga, obezbeđivanjem visoke doze enzima u prvom ciklusu postupka i dopunjavanjem enzima jednakom količini aktivnosti izgubljene tokom tri uzastopna koraka postupka u narednim ciklusima postupka, mogu se postići najveće moguće brzine hidrolize u svakom ciklusu postupka što rezultira u kratkim vremenima hidrolize kraćih od 48h u kombinaciji sa najefikasnijom upotrebom enzima.

Upotreba stabilnih enzima u mešovitim sistemima

[0205] Primenom mešanja tokom hidrolize, enzimi češće dolaze u kontakt sa supstratima, što rezultira efikasnijim korišćenjem katalitičke aktivnosti. Ovo će rezultirati nižim dozama enzima, a time i nižim troškovima, osim ako mešanje ima negativan efekat na enzime. Stabilni enzimi, poput termostabilnih enzima iz Rasamsonia, robusni su i mogu da izdrže okolnosti (lokalno) visokog smicanja i temperatura, što je slučaj tokom intenzivnog mešanja suspenzije. Stoga je njegova upotreba u mešovitim sistemima korisna i dovešće do doziranja, a time i smanjenja troškova.

[0206] Pronalazak je dalje opisan sledećim primerima, koji ne bi trebalo da se tumače kao ograničavajući obim pronalaska.

PRIMERI

Eksperimentalne informacije

Naprezanja

[0207] Pogodni Rasamsonia sojevi koji se mogu koristiti u ovim primerima da pokažu efekat i prednosti pronalaska su na primer TEC-101, TEC-147, TEC-192, TEC-201 ili TEC-210. Sojevi su opisani u WO 2011/000949.

Priprema supstrata za kukuruz koji je prethodno tretiran kiselinom

[0208] Razblaženom kiselinom prethodno tretirana kukuruzni stover (aCS) je dobijena kao što je opisano u Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp 69-85. Korišćen je reaktor za prethodni tretman pilot razmera koji radi u uslovima stabilnog stanja od 190°C, 1 min vremena zadržavanja i efikasne koncentracije H2SO4od 1.45% (tež./tež.) u tečnoj fazi.

Testovi merenja proteina

1. Ukupni protein

TCA Biuret

[0209] Postupak je bio kombinacija taloženja proteina korišćenjem trihlor sirćetne kiseline (TCA) da bi se uklonile poremećujuće supstance i omogućilo određivanje koncentracije proteina kolorimetrijskom Biuretom reakcijom. U Biuret reakciji, jon bakra (II) se redukuje u bakar (I), koji formira kompleks sa azotom i ugljenikom peptidnih veza u alkalnom rastvoru. Ljubičasta boja ukazuje na prisustvo proteina. Intenzitet boje, a samim tim i apsorpcija na 546 nm, direktno je proporcionalan koncentraciji proteina, prema Beer-Lambertovom zakonu. Standardizacija je izvršena korišćenjem BSA (goveđi serum albumin) i sadržaj proteina je izražen u g proteina kao BSA ekvivalent/L ili mg proteina kao BSA ekvivalent/ml. Sadržaj proteina je izračunat korišćenjem standardnih računskih protokola poznatih u tehnici, crtanjem grafikona OD546u odnosu na koncentraciju uzoraka sa poznatom koncentracijom, nakon čega sledi izračunavanje koncentracije nepoznatih uzoraka korišćenjem jednačine generisane iz kalibracione linije.

2. Pojedinačni proteini koji koriste PAGE

Prethodni tretman uzorka SDS-PAGE

[0210] Na osnovu procenjene koncentracije proteina u uzorcima, izvršena je sledeća priprema uzoraka. U uzorak od 10 µl dodato je 40 µl MilliQ vode i 50 µl TCA (20%) da bi se uzorak razblažio pet puta (~ 1 mg/ml) i istaložio proteine. Posle 1 sata na ledu, uzorak je centrifugiran (10 minuta, 14000 rpm). Talog je ispran sa 500 µl acetona i centrifugiran (10 minuta, 14000 rpm). Talog je tretiran kao što je opisano u nastavku.

SDS-PAGE

[0211] Talog je rastvoren u 65 µl MilliQ vode, 25 µl NuPAGE<™>LDS pufera za uzorke (4x) Invitrogen i 10 µl NuPAGE<™>sredstva za redukciju uzorka (10x) Invitrogen. Pre „deanuarion“ koraka uzorak je razblažen 5 puta korišćenjem mešavine MilliQ; NuPAGE<™>LDS pufera za uzorke i 10 µl NuPAGE<™>Sample Reducing u odnosu 65:25:10. Nakon mešanja, uzorci su inkubirani u termo mikseru 10 minuta na 70°C. Rastvori uzoraka su naneti na 4-12% Bis-Tris gel (NuPAGE<™>BisTris, Invitrogen). Uzorak (10 µl) markera M12 (Invitrogen) je takođe nanet na gel. Gel je korišćen na 200 V tokom 50 minuta, koristeći XCELL Surelock, sa 600 ml 20 x razblaženog SDS pufera u spoljašnjoj komori pufera i 200 ml 20 x razblaženog SDS pufera, koji sadrži 0.5 ml antioksidansa (NuPAGE<™>Invitrogen) u unutrašnjoj pufer komori. Posle upotrebe, gel je dva puta ispran demineralizovanom vodom, gelovi su fiksirani sa 50% metanola/7% rastvora sirćetne kiseline jedan sat i obojeni sa Sypro Ruby (50 ml po gelu) preko noći. Slika je napravljena korišćenjem Typhoon 9200 (610 BP 30, zelena (532 nm), PMT 600V, 100 mikrona) nakon ispiranja gela MilliQ vodom.

Kvantitativna analiza proteina

[0212] Upotrebom Typhoon skenera, odnos između proteinskih traka unutar trake je određen korišćenjem standardnih postupaka poznatih u tehnici. Uzorak je primenjen u tri primerka i vrednosti sive su određene korišćenjem programa Image quant. Vrednosti su izražene kao relativni % proteina prema ukupnom proteinu, izračunato korišćenjem vrednosti sive boje izabrane proteinske trake u odnosu na ukupnu vrednost sive boje svih proteinskih traka.

Izračunavanje konverzije glukana:

[0213]

% konverzije glukana (%) = (glukoza (g/l) x 100 %) / (glukan (frakcija na DM) x dm (g/kg) x 1.1)

pri čemu:

glukoza (g/l) = koncentracija glukoze u supernatantu nakon hidrolize. glukan (frakcija na dm) = sadržaj glukana u supstratu pre prethodnog tretmana. dm (g/kg) = suva materija hidrolize (tj.20% dm = 200 g/kg).

1.1 = povećanje težine usled inkorporacije vode tokom hidrolize.

Primer izračunavanja:

[0214]

glukoza = 60 g/l

frakcija glukana = 0.40 (je 40% na suvu materiju)

dm = 200 g/kg

primer konverzije glukana = (60*100) / (0.4 x 200 x 1.1) = 68% konverzije ;;Po potrebi se vrši korekcija za isparavanje. Koncentracija u supernatantu se zatim konvertuje u koncentraciju po kg hidrolizata. ;;Merenje glukonske kiseline u hidrolizatima biomase pomoću UPLC-MSIMS ;;[0215] Test se zasniva na razdvajanju glukonske kiseline sa UPLC kolonom i detekciji pomoću MS/MS (na osnovu negativne elektrosprej jonizacije). Da bi se isključile greške uzrokovane supresijom jona, isparavanjem i efektima injektiranja, koristi se označeni interni standard, tj. ;<13>C6-glukonska kiselina. ;;Hemikalije i referentna jedinjenja ;;[0216] Voda korišćena za pripremu uzorka i UPLC-MS/MS analizu je filtrirana pomoću Millipore 0.22 µm filtera. HPLC acetonitril je dobijen od Merck (Amsterdam, Holandija).0.1% (v/v) mravlje kiseline u vodi i 0.1% mravlje kiseline u acetonitrilu dobijeno je od Biosolve B.V. (Valkenswaard, Holandija). Referentno jedinjenje glukonske kiseline je dobijeno od Sigma (Zwijndrecht, Holandija). Izotopski obeleženu glukonsku kiselinu (<13>C6, korišćena kao interni standard) po meri je napravio Buchem B.V. (Apeldoorn, Holandija). ;;Interni standardni rastvor ;;[0217] Osnovni rastvor je napravljen merenjem 10 mg<13>C6-glukonske kiseline u volumetrijskoj posudi od 10 mL i rastvaranjem u 10 mL vode (~1 mg/mL). Od ovog osnovnog rastvora pripremljen je radni rastvor pipetiranjem 100 µL osnovnog rastvora internog standarda i dodavanjem 9.99 mL vode (c~10 µg/mL). ;;Standardni rastvori ;;[0218] Osnovni rastvor glukonske kiseline je napravljen merenjem 5 mg glukonske kiseline i dodavanjem 10 mL vode. Osnovni rastvor je dalje razblažen pipetiranjem 20 µL osnovnog rastvora i dodavanjem 980 µL vode (razblaživanje 1, c~10 µg/mL). Dodatno razblaživanje je napravljeno pipetiranjem 100 µL razblaženja 1 i dodavanjem 900 µL vode (razblaživanje 2, c~1 µg/mL). Kalibraciona kriva je napravljena u HPLC bočicama prema tabeli 1 ispod. ;;Priprema uzorka ;;[0219] Hidrolizati biomase su odmrznuti, ako je potrebno, i razblaženi deset puta vodom razblaženjem 150 µL uzorka u Eppendorf bočici sa 1350 µL vode, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 13000 rcf tokom 15 minuta. Dobijeni supernatant je razblažen pedeset puta vodom pipetiranjem 20 µL supernatanta u HPLC bočicu i dodavanjem 100 µL radnog rastvora internog standarda i 880 µL vode. ;;UPLC-MS/MS ;;[0220] Glukonska kiselina je analizirana na Waters UPLC iClass Binary Solvent Manager i Water iClass Sample Manager FTN povezan sa Waters Xevo TQD masenim spektrometrom (Waters, Milford, MA, SAD). Hromatografsko razdvajanje je postignuto sa Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonom (150x2.1 mm, 1.8 µm) upotrebom gradijentnog eluiranja sa A) 0.1% (v/v) mravljom kiselinom u vodi i B) 0.1% mravlje kiseline u acetonitrilu kao pokretne faze. Gradijent od 7 minuta je počeo sa 1 minutom na 99% A, praćen linearnim smanjenjem na 90% A za 2 minuta, zatim ispiranjem sa 20% A tokom 2 minuta i ponovnom ekvilibracijom sa 99% A tokom 2 minuta. Brzina protoka je održavana na 0.35 mL/min, koristeći zapreminu injekcije od 5 µl, a temperatura kolone je podešena na 40°C. ;[0221] Maseni spektrometar je radio u režimu negativne jonizacije. Dobijanje podataka i integracija pika obavljeni su pomoću softvera Masslynx 4.1 (Waters). Detekcija glukonske kiseline i<13>C6-glukonske kiseline je izvršena u režimu praćenja višestrukih reakcija (MRM). Opšta podešavanja su bila sledeća: ESI kapilarni napon je bio 2.0 kV, napon ekstraktora 3.0 V, napon konusa 30 V. Protok desolvatacionog gasa (azota) bio je 800 L/h sa temperaturom podešenom na 350°C, protok konusnog gasa (azot) bio je 50 L/h, a temperatura izvora je bila 150°C. Korišćene su sledeće MRM postavke: glukonska kiselina m/z 195.0 → 129.0, vreme zadržavanja 0.1 s, napon sudara 2 V;<13>C6-glukonska kiselina m/z 201.0 → 134.0, vreme zadržavanja 0.08 s, napon sudara 2 V. ;;Kvantitativno određivanje ;;[0222] Koncentracija glukonske kiseline u g/L izračunata je korišćenjem linearne regresije: ;;; ;;; [0223] Izračunata količina glukonske kiseline u g/l može se konvertovati u glukonsku kiselinu u g/kg glukana u lignoceluloznom materijalu pomoću sledećeg proračuna. ;[0224] Kada se koristi kukuruzni stover prethodno tretirana kiselinom u koncentraciji od 20% (tež./tež.) dm, na kraju hidrolize u trajanju od 120 sati, na pH 4.5 i 62°C postoji zapremina taloga od 6% (zbog nerastvorljivosti) i zapremina supernatanta od 94%. Supernatant ima gustinu od 1.07 kg/l i procenat glukana od 36%. Dakle, kukuruzni stover prethodno tretirana kiselinom u koncentraciji od 20% (tež./tež.) dm ima 72 g glukana/kg hidrolizata. ;[0225] Počevši sa, na primer, 0.5 g/l glukonske kiseline ovo daje 0.5/1.07 = 0.47 g glukonske kiseline/kg supernatanta (1.07 je gustina tečnosti). Ovo odgovara 0.47*0.94 = 0.44 g glukonske kiseline/kg hidrolizata (faktor taloga je 6% zbog nerastvorljivosti). Kada se koristi kukuruzni stover prethodno tretirana kiselinom u koncentraciji od 20% (tež./tež.) dm, to odgovara 0.44/0.072 = 6.1 g glukonske kiseline/kg glukana.

Primer 1

Korišćenje kiseonika tokom hidrolize za kontrolu količine formirane glukonske kiseline

[0226] Optimalna enzimska hidroliza prethodno tretiranog kukuruznog stovera koja sadrži 20% suve materije (sadrži 36% glukana na suvu materiju) na temperaturi reaktora od 60°C i pH od 4.5 postiže se održavanjem koncentracije glukonske kiseline između 0.7 i 1.5 g/l u supernatantu hidrolizata dodatkom kiseonika. Ovo odgovara 9.7 – 20.8 g glukonske kiseline proizvedene po kg glukana tokom hidrolize glukana. Hidroliza se izvodi sa 2.5 mg/g suve materije sirovine TEC-210 kompozicije enzima celulaze (ili koktela). TEC-210 se proizvodi u skladu sa postupcima inokulacije i fermentacije opisanim u WO 2011/000949.

Primer 2

Upotreba kiseonika tokom hidrolize za kontrolu količine formirane glukonske kiseline

[0227] Enzimska hidroliza je izvedena upotrebom kukuruznog stovera prethodno tretirane kiselinom (aCS) u koncentraciji od 20% (tež./tež.) suve materije (dm). Rastvor stočne hrane je pripremljen razblaživanjem koncentrovane suspenzije stoćne hrane sa vodom. pH je podešen na pH 4.5 sa 25% (tež./tež.) NH4OH-rastvorom. Enzimska hidroliza je izvedena na skali od 1 kg korišćenjem reaktora od 1.5 litra. pH je kontrolisan na 4.5 i temperatura je kontrolisana na 62°C. Rastvoreni kiseonik tokom postupka je kontrolisan reciklažom gasa u prostoru i dodatnim svežim vazduhom (koji sadrži 20-21% kiseonika).

[0228] Pre dodavanja enzima, izduvni gas je recikliran pri protoku gasa od 3 l/sat korišćenjem peristaltičke pumpe i prskalice. Zbog činjenice da stočna hrana troši kiseonik kroz hemijsku reakciju, nivo DO je dostigao nivo od 0% DO u roku od jednog sata, što je rezultiralo anaerobnom stoćnom hranom i slobodnim prostorom koji je bio potpuno osiromašen kiseonikom. Dobijeni inertni gas (bez kiseonika) je korišćen tokom cele hidrolize kao gas nosač za uvedeni svež vazduh.

[0229] Zatim je u sirovinu dodat koktel enzima celulaze TEC210 u dozi od 3.75 mg (TCA protein)/g dm. TEC-210 je proizveden u skladu sa postupcima inokulacije i fermentacije opisanim u WO 2011/000949. Ukupno vreme hidrolize je 120 sati.

[0230] Svež vazduh je uveden u reciklažnu petlju inertnog gasa iznad prostora tokom celog postupka hidrolize pri protoku svežeg vazduha od 0 - 3 - 6 - 12 - 24 ili 48 ml po kg reakcione smeše na sat, počevši neposredno nakon dodavanja enzima. DO je meren konstantno u svim eksperimentima. Uzorci su uzeti na početku i na kraju eksperimenta za analizu glukoze pomoću HPLC.

[0231] Paralelni eksperiment je sproveden u posudi za mućkanje da bi se odredio maksimalni nivo hidrolize glukana. Ova maksimalna hidroliza je određena inkubacijom sirovine u veoma visokoj dozi enzima (50 mg (TCA protein)/g dm) pri sličnim uslovima (pH, temperatura i dm) u višku kiseonika koji sadrži vazduh u prostoru. Merenje DO u svakom eksperimentu je konstantno pokazivalo 0% DO. Ovo se može objasniti direktnom potrošnjom kiseonika nakon njegovog transfera iz struje recikliranog gasa koji sadrži kiseonik u tečnu fazu u reaktoru.

[0232] Rezultati su predstavljeni u tabeli 2. Povećanje proizvodnje glukoze se izračunava oduzimanjem koncentracije glukoze (u g/l) na početku hidrolize od koncentracije glukoze (u g/l) na kraju hidrolize za svako stanje (tj. protok svežeg vazduha (ml/kg/h) 0 - 3 - 6 - 12 - 24 -48 - 96) i deljenjem odgovarajućih vrednosti sa vrednošću pronađenom kada je protok svežeg vazduha (ml/kg/h) 0 ( ova vrednost je postavljena na 100%).

[0233] Podaci jasno pokazuju da se veće količine glukoze formiraju kada se količina formirane glukonske kiseline na kraju hidrolize održava iznad 3 g/kg glukana u lignoceluloznom materijalu.

Primer 3

Uticaj glukonske kiseline na enzimsku hidrolizu lignoceluloznih sirovina

[0234] Dvadeset grama prethodno tretiranog kukuruznog stovera je inkubirano u Greiner epruveti od 50 ml tokom 50 sati na nivou suve materije od 6% tež./tež., pH 4.5 na 62°C u prisustvu 5 mg koktela enzima celulaze TEC210 po gramu suve materije i u prisustvu 0, 2, 4, 6 ili 8 g/l glukonske kiseline da bi se odredio inhibitorni efekat glukonske kiseline na hidrolizu glukana u lignoceluloznoj stočnoj hrani. Eksperiment se izvodi pri maksimalnoj zasićenosti kiseonikom.

[0235] Uzorci su uzeti nakon 50 sati inkubacije i uzorci su centrifugirani za dalju analizu u Eppendorf centrifugi tipa 5810 tokom 8 minuta na 4000 rpm. Koncentracija glukoze je merena u supernatantu svakog uzorka pomoću HPLC pomoću Bio-Rad HPX87H kolone. Rezultati su prikazani u tabeli 3. Oslobađanje glukoze kao što je prikazano u tabeli 3 je direktna mera za enzimsku hidrolizu (hidroliza glukana). Nivo glukonske kiseline od 2 g/l u supernatantu odgovara 89 g/kg glukana u lignoceluloznom materijalu. Ovo se može izračunati kao što je gore opisano sa gustinom od 1.02 kg/l, faktorom taloga od 2% i sadržajem glukana od 21.6 g glukana/kg hidrolizata.

[0236] Rezultati jasno ukazuju da veće koncentracije glukonske kiseline negativno utiču na hidrolizu glukana.

Tabela 1: Kalibraciona kriva

Tabela 2. Efekat dodavanja kiseonika u enzimsku hidrolizu lignocelulozne sirovine. Protok Količina kiseonika Glukonska kiselina (u Povećanje

svežeg (uneta preko svežeg g/kg glukana u proizvodnje vazduha (u vazduha u mmol/kg lignoceluloznom glukoze (u %)

Tabela 3. Uticaj glukonske kiseline na enzimsku hidrolizu.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake:

a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala,

b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu kompozicija enzima najmanje sadrži litičku polisaharid monooksigenazu (LPMO), pri čemu se količina formirane glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celo-oligosaharide održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom koraka enzimske hidrolize (c) u lignocelulozni materijal, i

d) izborno, izolacija kompozicije koja sadrži glukozu.

2. Postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake:

a) izborno, prethodni tretman lignoceluloznog materijala,

b) izborno, ispiranje izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala, c) enzimska hidroliza izborno ispranog i/ili izborno prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala korišćenjem enzimske kompozicije koja sadrži najmanje dve celulaze i pri čemu enzimska kompozicija najmanje sadrži LPMO, i izborno prečišćavanje hidrolizovanog lignoceluloznog materijala,

d) fermentacija hidrolizovanog lignoceluloznog materijala da bi se proizveo proizvod fermentacije, pri čemu se količina formirane glukonske kiseline na kraju enzimske hidrolize oksidacijom pomoću LPMO lignoceluloznog materijala koji sadrži celulozu i/ili celo-oligosaharide održava između 3 do 10 g/kg glukana prisutnog u lignoceluloznom materijalu dodavanjem odgovarajuće količine kiseonika tokom koraka (c) enzimske hidrolize u lignocelulozni materijal, i

e) izborno, izolacija proizvoda fermentacije.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što se fermentacija izvodi sa mikroorganizmom koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što je mikroorganizam vrste Saccharomyces cerevisiae, u kome su izvršene genetske modifikacije.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što se kiseonik dodaje u obliku mehurića.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što reaktor za enzimsku hidrolizu ima zapreminu od 1 m<3>ili više.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što je vreme enzimske hidrolize 5 do 150 sati.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što korišćena enzimska kompozicija zadržava aktivnost 30 sati ili više.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što se hidroliza izvodi na temperaturi od 45°C ili više, poželjno 50°C ili više i još poželjnije na temperaturi od 55°C ili više.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što je kompozicija enzima izvedena iz gljive, poželjno mikroorganizma iz roda Rasamsonia ili kompozicija enzima sadrži enzim gljive, poželjno enzim Rasamsonia.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačen time što je sadržaj suve materije u koraku hidrolize (c) 10 tež.% ili više, poželjno je 14 tež.% ili više i poželjnije je 14 do 33 tež.%.

12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačen time što se enzimska hidroliza izvodi u šaržnom, dolivnom šaržnom i/ili reaktoru za kontinualnu kulturu.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačen time što je enzimska kompozicija u obliku celog fermentacionog bujona gljive.

14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, u koji se kiseonik uvodi kao gas koji sadrži kiseonik, kao što je vazduh.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

61