CN102459582B - 用于增强纤维素材料降解或转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料。

Description

用于增强纤维素材料降解或转化的方法
关于对在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明是在能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府对本发明具有一定权利。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及用酶组合物增强纤维素材料降解或转化的方法。
相关领域描述
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
在本领域中，改善转化纤维素原料的能力会是有利的。
Nierman等，2005，Nature 438：1151-1156公开了烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的基因组序列。
本发明涉及用于降解或转化纤维素材料的改善的酶组合物。
发明概述
本发明涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：
(A)在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；
(B)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料；
(C)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
本发明还涉及酶组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的多肽和一种或多种(几种)纤维素分解酶，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
附图简述
图1显示编码具有纤维素分解增强活性的GH61B多肽的烟曲霉基因的基因组序列DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。
图2显示pAG43的限制图谱。
图3显示在经洗涤经预处理的玉米秸秆(PCS)的水解中水解对添加至里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶组合物的具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽浓度。空心圈：3日程度的水解；实心圈：7日程度的水解。数据未就PCS液中存在的糖进行校正。数据是用修饰的非合作的饱和结合模型(non-cooperative saturation-binding model)拟合的。
定义
纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”意指增强具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的由GH61催化的生物学活性。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/gPCS中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用相等的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。
具有纤维素分解增强活性的多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％的SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽的纤维素分解增强活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat B.，和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases，Biochem.J.316：695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlook for cellulase improvement：Screening and selectionstrategies，2006，Biotechnology Advances 24：452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose，1987，Measurement of cellulase activities，Pure Appl.Chem.59：257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50-65℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1，4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等，2006，Biotechnology Advances 24：452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法，在pH 5，40℃，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulosedegradation：New insight into the function of cellobiohydrolases，Trends inBiotechnology 15：160-167；Teeri等，1998，Trichoderma reesei cellobiohydrolases：why so efficient on crystalline cellulose？，Biochem.Soc.Trans.26：173-178)。就本发明而言，根据Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279；van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters，149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBSLetters，187：283-288；以及Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170：575-581描述的方法测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可采用Lever等的方法来评价玉米秸秆中的纤维素分解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对荧光二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)的纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum：production，purification and some biochemical properties，J.BasicMicrobiol.42：55-66描述的基本方法确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在25℃，pH 4.8，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)分解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom，D.和Shoham，Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology，2003，6(3)：219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂基团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将它们交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素酶亦共价地附接于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基酯键的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可分类为以数字标记的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和更新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria，1987，Pure & AppI.Chem.59：1739-1752测量。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard，Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes，2006，Journal of theScience of Food and Agriculture 86(11)：1636-1647；Spanikova和Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllumcommune，FEBS Letters 580(19)：4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely和Kubicek，1997，The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunctional beta-D-xylan xylohydrolase，Biochemical Journal321：375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity，Journal of Biotechnology 23(3)：257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0.01％Triton X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中在37℃确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，MO，USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever，1972，A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内水解的1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0.01％Triton X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中在37℃进行确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0.01％TWEENTM 20的50mM乙酸钠pH 5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase activity)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries，1998，J.Bacteriol.180：243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放出1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘性小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland，Ltd.，Bray，Co.Wicklow，Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
纤维素材料：纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，PP.105-118，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，，1999，RecentProgress in Bioconversion of Lignocellulosics，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，T.Scheper主编，Volume 65，pp.23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是木素纤维素的形式，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
分离的或纯化的：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然结合的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。例如，多肽如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1％纯，例如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯，或至少90％纯，或至少95％纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1％纯，例如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯，至少90％纯，或至少95％纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C-端和/或N-端氨基酸)。在一个方面，根据预测SEQ ID NO：2的氨基酸1至21是信号肽的SignalP软件(Nielsen等，1997，ProteinEngineering 10：1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸22至250。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，根据预测SEQ ID NO：1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP软件(Nielsen等，1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸64至859。在另一个方面，所述成熟多肽编码序列是包含于SEQ ID NO：1的核苷酸64至859中的cDNA序列。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends Genet.16：276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
多肽片段：术语“多肽片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有生物活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO：2的成熟多肽的至少200个氨基酸残基，例如至少210个氨基酸残基或至少220个氨基酸残基。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的至少600个核苷酸，例如至少630个核苷酸或至少660个核苷酸。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(几种)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可替换的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明多肽的多核苷酸的表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制中发生的突变与亲本细胞不完全相同。
变体：术语“变体”意指具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置的取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用不同的氨基酸取代占据位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据位置的氨基酸添加一个或多个(几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。
发明详述
本发明涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
在一个方面，上述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。可使用本领域公知技术例如离心、过滤和重力沉降来将纤维素材料降解或转化的可溶产物与不可溶的纤维素材料分离。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(A)在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；(B)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料；和(C)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。在一个优选的方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选的方面，所述方法还包括从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及酶组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的多肽和一种或多种(几种)纤维素分解酶，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同-性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
酶组合物
在本发明的方法中，酶组合物可包含任何可用于降解或转化纤维素材料的蛋白。
在一个方面，酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另一个方面，酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶和/或一种或多种(几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，酶组合物包含选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(几种)酶。
在另一个方面，酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：半纤维素酶，棒曲霉素(expansin)，酯酶，木质素分解酶(ligninolytic enzyme)，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶和膨胀素(swollenin)。半纤维素酶优选为一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，酶组合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶为家族10木聚糖酶。在另一个方面，酶组合物包含木糖苷酶。
在另一个方面，酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，酶组合物包含酯酶。在另一个方面，酶组合物包含木质素分解酶。在一个优选的方面，所述木质素分解酶为漆酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是H2O2产生酶。在另一个方面，酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，酶组合物包含膨胀素(swollenin)。
在本发明的方法中，酶可在发酵之前或过程中添加，例如在糖化过程中或在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。
所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适于使用的形式，例如去除或未去除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brews)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有酶活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)或Trichophaea saccata多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)而产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解酶还可以通过从发酵液中纯化这样的蛋白质来制备。
在一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含商业的纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLICTM Ctec(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM 188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，ROHAMENTTM 7069W(GmbH)，LDI(Dyadic International，Inc.)、LBR(Dyadic International，Inc.)或150L(Dyadic International，Inc.)。纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt.％，更优选固体的0.025到约4.0wt.％，且最优选固体的约0.005到约2.0wt.％的有效量添加。纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt％，更优选固体的约0.025至约4.0wt％，且最优选固体的约0.005至约2.0wt％的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665；SEQ ID NO：4)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene 63：11-22；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II；GENBANKTM登录号M19373；SEQ ID NO：6)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANKTM登录号AB003694；SEQ ID NO：8)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249：584-591；GENBANKTM登录号Y11113；SEQ ID NO：10)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，Molecular Microbiology 13：219-228；GENBANKTM登录号Z33381；SEQ ID NO：12)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research18：5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO：14)；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：18)；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：20)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：22)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：24)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶(SEQ IDNO：26)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：28)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：30)；Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：32)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：34；GENBANKTM登录号M15665)。上述SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34的内切葡聚糖酶分别由SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33的成熟多肽编码序列所编码。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：36)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：38)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：40)、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：44)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)(SEQ ID NO：46)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：48)以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：50)。上述SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：50的纤维二糖水解酶分别由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49的成熟多肽编码序列所编码。
可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：52)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：54)；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：56)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ IDNO：58)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：60)。上述SEQ ID NO：52、SEQID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：60的β-葡糖苷酶分别由SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57和SEQID NO：59的成熟多肽编码序列所编码。
具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获得。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获得。
其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities，Biochem.J.280：309-316和Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。
在一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶III。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶IV。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶V。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含纤维二糖水解酶I。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶I。所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I和β-葡糖苷酶。
在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：52)。在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：54)。在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是巴西青霉IBT 20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：56)。在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：58)。在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：60)。在另一个方面，所述β-葡糖苷酶是SEQ ID NO：62的米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白或SEQ ID NO：64的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一个方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白是由SEQ ID NO：61的多核苷酸编码的，或所述米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白是由SEQ ID NO：63的多核苷酸编码的。
在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含β-葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含米曲霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含黑曲霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含烟曲霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含巴西青霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个方面，所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。
在另一个方面，上述一种或多种(几种)纤维素分解酶进一步包含一种或多种(几种)选自下组的酶：里氏木霉内切葡聚糖酶II(CEL5A)，里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。
在一个方面，所述一种或多种(几种)半纤维素分解酶包含商业的半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、CELLICTM Htec(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000Xylanase(DSM)、DEPOLTM333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOLTM 740L.(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOLTM 762P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)，埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉(Aspergillus niger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组成制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
具有纤维素分解增强活性的多肽及其多核苷酸
在第一个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽与SEQ ID NO：2具有纤维素分解增强活性的成熟多肽具有至少75％，例如至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个方面，所述多肽与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸，相差四个氨基酸，相差三个氨基酸，两个氨基酸，和一个氨基酸。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段，或者由上述这些组成。在另一个方面，多肽包含SEQ ID NO：2，或由SEQ ID NO：2组成。在另一个方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸22至250，或由SEQ ID NO：2的氨基酸22至250组成。
在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。
SEQ ID NO：1的多核苷酸或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，例如至少25个，至少35个，或至少70个核苷酸。优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记用于检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维素分解增强活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列；它们的全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸64至859或其cDNA序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽或其成熟多肽或其片段的多核苷酸序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1或其cDNA序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、03％SDS、200μg/ml已剪切且变性的鲑精DNA中，并对于非常低和低严格性为25％甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：1390)计算得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09MTris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和最佳12至24小时。将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算出的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第三个方面，所述具有纤维素分解增强活性的分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或cDNA序列具有至少75％，例如至少80，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在第四个方面，所述具有纤维素分解增强活性的分离的多肽是SEQ IDNO：2的成熟多肽或其同源序列中包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或数个)氨基酸的变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可选地，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与相关于亲本多肽的多肽的同一性分析来推断。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO：2的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10，例如，1，2，3，4，5，6，7，8或9。
具有纤维素分解增强活性的多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的一部分融合于另一个多肽的一部分的N端或C端。
具有纤维素分解增强活性的多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于多肽的N端或C端。融合多肽是通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域中是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列从而使得它们符合读框，且融合多肽的表达是在相同启动子和终止子的调控之下的。亦可使用内蛋白技术构建融合蛋白，其中融合物是翻译后构建的(Cooper等，1993，EMBO J.12：2575-2583；Dawson et al.，1994，Science266：776-779)。
融合多肽可进一步在两个多肽之间包含切割位点。在融合蛋白分泌之后，切割该位点释放两个多肽。切割位点的实例包括但不限于，Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-576；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381；Eaton等，1986，Biochemistry 25：505-512；Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987；Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248；和Stevens，2003，Drug Discovery World4：35-48中公开的位点。
具有纤维素分解增强活性的多肽可获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，应意指核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。
所述多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纤维素分解增强活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)属多肽。
在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
所述多肽也可以是真菌多肽。例如，所述多肽可为酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcelluloyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicllium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、THielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的烟曲霉多肽，例如包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员容易地识别适合的等同物的同一性。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
可分离并使用编码具有纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸来如本文中所述实施本发明的方法。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可从曲霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并由此可为例如所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
在本发明的方法中，分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％，例如至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
修饰编码多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO：1的多肽编码序列或其cDNA序列存在的多核苷酸，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurification 2：95-107。
在本发明的方法中，分离的多核苷酸在优选中-高严格条件下，更优选高严格条件下，且最优选非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。
在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或其cDNA序列，或编码SEQ ID NO：2具有纤维素分解增强活性的片段的SEQ ID NO：1的亚序列，如SEQ ID NO：1核苷酸64至859的多核苷酸，或者所述多核苷酸由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或其cDNA序列，或编码SEQ ID NO：2具有纤维素分解增强活性的片段的SEQ IDNO：1的亚序列，如SEQ ID NO：1核苷酸64至859的多核苷酸组成。
核酸构建体
可以以多种方式操作编码多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的分离的多核苷酸，以提供多肽的表达，即构建包含编码多肽的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接于一种或多种(几种)调控序列，所述调控序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与所述调控序列相容的条件下的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins fromrecombinant bacteria″于Gilbert等，1980，Scientific American，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.15：5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、启动子TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸可与调节序列可操作地连接。
表达载体
多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸，例如具有纤维素分解增强活性的多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic AcidsRes.15：9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞
包含编码多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的多核苷酸的重组宿主细胞可有利地用于多肽的重组产生。将包含此种多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上文)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，AcademicPress，Inc.，New York；Ito等，1983，J.Bacteriol.153：163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1920。
产生方法
产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是曲霉属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是烟曲霉。
或者，产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的方法包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
在产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。具有纤维素分解增强活性的多肽是使用本文中所述的方法检测的。
所得的培养液可按原样使用或可以使用本领域已知的方法回收多肽。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收多肽，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和LarsRyden编，VCH Publishers，New York，1989)。
在可选的方面，不回收多肽，而将表达多肽的宿主细胞用作多肽的来源。
处理纤维素材料的方法
本发明的组合物和方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规过程完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质处理设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，将纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook onBioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategic perspective on theU.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度进行，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals andbiotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology25：33-38；Gusakov，A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.7：346-352)、研磨反应器(Ryu，S.K.，和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等，2007，Substrate pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the digestibility oflignocellulosic biomass，Bioresource Technol.100：10-18；Mosier等，2005，Featuresof promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass，BioresourceTechnol.96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatment of lignocellulosicwastes to improve ethanol and biogas production：A review，Int.J.of Mol.Sci.9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，Pretreatment：the key to unlocking low-costcellulosic ethanol，Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2：26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调节。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化纤维素部分水解成单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至3％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等.，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。
在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优性5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在中温如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1秒-60分钟的时间。
在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt％，并且最优性30-60wt％，如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。
物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds DefibratorAB，Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。
组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor &Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosicbiomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.，和Overend，R.P.，编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.，编，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素或者还有半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由本发明的酶组合物以酶法如本文中所述进行。组合物的酶和蛋白组分可顺序加入。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下进行。水解可以作为补料批式或连续的工艺进行，其中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐补加至，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且最优选约40℃至约60℃，特别是约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，特别是约pH 5。干燥固体含量优选约5至约50wt％，更优选约10至约40wt％，并且最优选约20至约30wt％。
具有纤维素分解增强活性的多肽和酶的最优量取决于几种因素，包括但不限于组分纤维素分解酶的混合物，纤维素底物，纤维素底物的浓度，纤维素底物的预处理，温度，时间，pH和发酵生物的包含(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，纤维素分解酶蛋白对纤维素材料的有效量为约0.5至50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素材料的有效量为约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素分解酶蛋白的有效量为约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.5g，且最优选约0.05至0.2g每g纤维素分解酶蛋白。
发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C6和/或C5发酵生物体，或它们的组合。C6和C5发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。
可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642所述。
能发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。
能发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。
其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大肠杆菌的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。
在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production andUtilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上文)。
在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母(可从Red Star/Lesaffre，USA获得)、FALITM(可从Fleischmann’s Yeast，BurnsPhilp Food Inc.，USA获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERMTM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERT STRANDTM(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSM Specialties获得)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL 1and TAL1 genes encodingthe pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：a proof ofprinciple，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies ofethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria forethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214；Zhang等，1995，Metabolicengineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470；WO 2003/062430，xylose isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，如约pH 4-5、6或7。
在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，优选约pH 4-7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The AlcoholTextbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-barch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可为，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-VerlagBerlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.，和Jonas，R.，2002，Thebiotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-asugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping，World Journal ofMicrobiology and Biotechnology 19(6)：595-603。
在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation Ror lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”涵盖含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empirical modelingof batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbialbiopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，WaterScience and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass formethane production：A review。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
材料
作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。
菌株
使用烟曲霉(NN051616)作为编码具有纤维素分解增强活性的家族61多肽的基因的来源。使用米曲霉JaL355株(WO 2002/40694)表达具有纤维素分解增强活性的烟曲霉家族61多肽。
培养基
PDA平板由39g的马铃薯右旋糖琼脂和去离子水至1升组成。
YPG培养基由10g的酵母提取物，10g的细菌蛋白胨，20g的葡萄糖和去离子水至1升组成。
YPM培养基由10g的酵母提取物，10g的细菌蛋白胨，20g的麦芽糖和去离子水至1升组成。
M410培养基由50g的麦芽糖，50g的葡萄糖，2g的MgSO4-7H2O，2g的KH2PO4，4g的柠檬酸无水粉末，8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的AMG微量金属溶液，0.5g的CaCl2和去离子水至1升(pH 6.0)组成。
AMG微量金属溶液由14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，3g的柠檬酸，和去离子水至1升组成。
实施例1：鉴定烟曲霉基因组序列中的糖基水解酶家族GH61基因
使用几种已知的GH61蛋白包括来自桔橙嗜热子囊菌的GH61A(GeneSeqP登录号AEC05922)作为查询序列(query)进行烟曲霉部分基因组序列(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)的tblastn检索(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。基于与查询序列在氨基酸水平的高度类似性将几种基因鉴定为推定的家族GH61同源物。选择一个大约850bp，与桔橙嗜热子囊菌GH61A序列在氨基酸水平具有大于70％序列同一性的基因组区以供进一步研究。
实施例2：烟曲霉基因组DNA提取
如美国专利7,244,605号中所述培养并收获烟曲霉NN051616。将冻结的菌丝体用杵和研钵磨碎至细粉，并使用Plant Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的指示分离基因组DNA。
实施例3：构建用于烟曲霉家族GH61B基因的米曲霉表达载体
设计了下文所示的两个合成的寡核苷酸引物以从基因组DNA PCR扩增烟曲霉家族GH61B蛋白基因。使用Cloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)将该片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO2005/074647)，无需限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACC-3′(SEQ ID NO：65)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAA-3’(SEQ ID NO：66)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将上述引物各五十皮摩尔用于扩增反应，其包含204ng的烟曲霉基因组DNA(如实施例2中所述制备)，1X Pfx Amplification Buffer(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1.5μl的10mM dATP，dTTP，dGTP和dCTP混合物，2.5单位的Pfx DNA Polymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，和1μl的50mM MgSO4，终体积为50μl。扩增使用 5333epgradient S(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行，程序如下：一个循环94℃进行3分钟；30个循环，每循环在94℃进行30秒，56℃进行30秒和72℃进行1分钟。然后将加热块保持在72℃进行15分钟，接着进行4℃浸泡循环。
通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切出了大约850bp产物条带，并使用Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的指示纯化。
然后将片段使用Cloning Kit克隆入pAlLo2。将载体用Nco I和Pac I消化。如上所述通过凝胶电泳和Gel Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)纯化片段。将基因片段和经消化的载体在反应中合并在一起，得到表达质粒pAG43(图2)，其中家族GH61B蛋白基因的转录在NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)调控之下。重组反应物(20μl)由1XBuffer(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X B SA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1μl的酶(1∶10稀释)(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，166ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和110ng的烟曲霉GH61B蛋白纯化PCR产物。将反应物在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。将反应物用40μl的10mM Tris-0.1M EDTA缓冲液稀释，并使用2.5μl稀释的反应物转化大肠杆菌Gold Competent细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。通过限制性酶消化鉴定了含有pAG43(GH61B蛋白基因)的大肠杆菌转化体，并使用9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备了质粒DNA。
实施例4：编码具有纤维素分解增强活性的家族61多肽的烟曲霉基因组序列的表征
用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL Automated DNASequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略进行862bp PCR片段的DNA测序。使用下述载体特异性引物进行测序：
pAllo2 5序列：5′TGTCCCTTGTCGATGCG 3′(SEQ ID NO：67)
pAllo2 3序列：5′CACATGACTTGGCTTCC 3′(SEQ ID NO：68)
在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下细查核苷酸序列数据的品质并将所有序列彼此比较。
基于编码的蛋白对具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(GeneSeqP登录号AEC05922)的类似性构建了烟曲霉序列的基因模型。烟曲霉GH61B基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，示于图1。基因组片段编码250个氨基酸的多肽，其由53和56bp的两个内含子所分隔。基因和成熟编码序列的％G+C含量分别为53.9％和57％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，见上)，预测出了21个残基的信号肽。预期的成熟蛋白含有229个氨基酸，具有23.39kDa的预期分子量。
使用如实施于EMBOSS的Needle程序的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵，确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对(comparative pairwise global alignment)。该比对显示编码具有纤维素分解增强活性的GH61成熟多肽的烟曲霉基因的推导的氨基酸序列与具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(GeneSeqP登录号AEC05922)的推导的氨基酸序列分享72.6％序列同一性(排除缺口)。
实施例5：在米曲霉JaL355中表达编码具有纤维素分解增强活性的GH61B多肽的烟曲霉基因组DNA
米曲霉JaL355原生质体是根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备的，并用6μg的pAG43转化。将二十六个转化体分离至单个PDA平板。
将24个转化体的汇合的PDA平板分别用5ml的0.01％20洗涤，并分别收集孢子。将八μl的每个孢子储备分别添加至24孔板中的1ml的YPG、YPM和M410培养基，并在34℃温育。在温育3日之后，使用无染色(stain-free)，8-16％梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)依照生产商的指示分析来自四个转化体的7.5μl上清。基于该凝胶，选择M410为最优培养基。在温育五日之后，使用无染色，8-16％梯度SDS-PAGE凝胶分析来自每个M410培养的7.5μl上清。培养物的SDS-PAGE图谱(profile)显示几个转化体具有大约25kDa的新的主条带。
将一个转化体(在PDA上生长)的汇合平板用5ml的0.01％20洗涤，并接种至四个含有100ml的M410培养基的500ml的锥形瓶以生成供表征酶的培养液。在第5日收获烧瓶(300ml)，使用0.22μm Stericup吸滤器(suction filter)(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤，并在4℃储存。
实施例6：具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的纯化
使用10kDa MWCOUltra离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA，USA)将含有具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的经过滤的摇瓶培养液(实施例5)浓缩至大约10倍更小的体积。使用在20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Sigma，St.Louis，MO，USA)pH 8.0中预平衡的P-6脱盐柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)依照生产商的指示(但包括下述不同：加载3ml样品并用3ml缓冲液洗脱)对浓缩的滤过物进行缓冲液交换和脱盐。使用将牛血清白蛋白(Pierce，Rockford，IL，USA)用作蛋白浓度标准的BCA测定法(Pierce，Rockford，IL，USA)对经浓缩和脱盐的GH61B蛋白进行定量。定量重复进行三次。使用8-16％梯度SDS-PAGE在200伏进行1小时并用Coomassie Bio-Safe Stain(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色来确证酶纯度。
实施例7：玉米秸秆的预处理
玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory(NREL)使用稀硫酸预处理。下述条件用于预处理：在165℃和107psi以1.4wt％稀硫酸进行8分钟。根据NREL，经预处理的玉米秸秆中的不溶于水的固体含有57.5％纤维素、4.6％半纤维素和28.4％木质素。纤维素和半纤维素是通过两阶段硫酸水解及随后使用NREL Standard Analytical Procedure#002进行的高效液相色谱的糖分析来确定的。木质素是在使用NREL Standard AnalyticalProcedure#003用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后以重量分析法确定的。
在使用前磨制并用水洗涤经预处理的玉米秸秆。经磨制洗涤的经预处理的玉米秸秆(起始干重32.35％)是通过在Cosmos ICMG 40湿式多用途研磨机(wet multi-utility grinder)(EssEmm Corporation，Tamil Nadu，India)中磨制，继以用去离子水反复洗涤，并倾去上清级分来制备的。发现经磨制、水洗的经预处理的玉米秸秆的干重量为7.114％。
实施例8：通过具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽增强经预处理的玉米秸秆的水解
经预处理的玉米秸秆的水解是使用含有1g总反应质量的2.2ml，96-深孔板(Axygen，Union City，CA)进行的。水解是用经洗涤、预处理的玉米秸秆的5％总固体进行的，所述固体相当于在含有1mM硫酸锰和4mg每g纤维素的里氏木霉纤维素酶组合物(补充了可从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark获得的米曲霉β-葡糖苷酶的在本文实施例中该纤维素酶组合物命名为“里氏木霉纤维素酶组合物”)的50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液中每ml 28.75mg纤维素。将烟曲霉GH61B多肽以0至93％(w/w)总蛋白的浓度添加。将板使用ALPS-300TM板热密封器(plate heat sealer)(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封，并在50℃以150rpm振荡温育0至168小时。所有实验重复进行两次或三次。
在温育24至168小时之间的多个时点，移出100μl等分试样，并通过高效液相色谱(HPLC)使用下述实验方案测定水解程度。
对于HPLC分析，用0.45μm96孔过滤板(filter plate)(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，并如下所述就糖含量对滤过物进行分析。使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过用0.5％w/w苯甲酸-5mM H2SO4以0.6ml每分钟的流速在65℃洗脱11分钟，并通过对来自由纯糖样品校准的折射率检测( 1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)的葡萄糖和纤维二糖信号进行积分而进行定量，来测量在0.005MH2SO4中稀释的样品的糖浓度。将所得的当量值用于对于每个反应计算纤维素转化的百分比。每次水解的程度作为转化为纤维二糖+葡萄糖的总纤维素的比率(fraction)来确定，且不对存在于经预处理的玉米秸秆液中的可溶性糖进行校正。
使用Kaleidagraph软件(Synergy software，Reading，PA，USA)进行所有的HPLC数据处理。针对适当的稀释因子调整测得的糖浓度。对葡萄糖和纤维二糖用色谱法分离并进行积分，并独立确定其各自的浓度。然而，为了计算总转化率，将葡萄糖和纤维二糖值合并。水解比率(fraction hydrolysi)报道为转化为[葡萄糖+纤维二糖]的总质量/[总纤维素](overall mass conversion to[glucose+cellobiose]/[total cellulose])。对三次重复的数据点取平均值，并计算标准偏差。
将水解比率作为烟曲霉GH61B蛋白浓度的函数作图，并用修饰的饱和结合模型使用Kaleidagraph(Synergy Software)进行拟合。结果示于图3，显示了在烟曲霉GH61B多肽的存在下通过里氏木霉纤维素酶组合物的水解的增强。
通过下述编号段落进一步描述本发明：
[1]一种降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[2]段1的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[3]段1或2的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[4]段1-3任一项的方法，其中所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)。
[5]段4的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
[6]段1-5任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[7]段6的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[8]段7的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[9]段1-8任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
[10]段9的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[11]段10的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[12]段11的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[13]段12的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[14]段13的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
[15]段1-14任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段，或所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段组成。
[16]段1-8任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[17]段16的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[18]段17的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[19]段1-8任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
[20]段19的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
[21]段20的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
[22]段21的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
[23]段22的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
[24]段23的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。
[25]段1-24任一项的方法，其中具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列，或者所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。
[26]段1-8任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[27]段1-26任一项的方法，其中所述SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸64至859。
[28]段1-27任一项的方法，其中SEQ ID NO：2的成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸22至250。
[29]一种产生发酵产物的方法，包括：
(A)在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；(B)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料；和(C)从发酵回收发酵产物。
[30]段29的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[31]段29或30的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[32]段29-31任一项的方法，其中所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)。
[33]段32的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
[34]段29-33任一项的方法，其中步骤(A)和(B)是在同时糖化和发酵中同时进行。
[35]段29-34任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[36]段29-35任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
[37]段36的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[38]段37的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[39]段38的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[40]段39的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[41]段40的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
[42]段29-41任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段，或所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段组成。
[43]段29-35任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[44]段43的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[45]段44的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[46]段29-35任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
[47]段46的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
[48]段47的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
[49]段48的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
[50]段49的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
[51]段50的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。
[52]段29-35任一项的方法，其中具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列，或者所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。
[53]段29-35任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[54]段29-53任一项的方法，其中所述SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸64至859。
[55]段29-54任一项的方法，其中SEQ ID NO：2的成熟多肽是SEQ IDNO：2的氨基酸22至250。
[56]一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[57]段56的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[58]段57的方法，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[59]段56-58任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[60]段56-59任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[61]段56-60任一项的方法，其中所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)。
[62]段61的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
[63]段56-62任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[64]段56-63任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
[65]段64的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[66]段64的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[67]段66的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[68]段67的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[69]段68的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQID NO：2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
[70]段56-69任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段，或所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段组成。
[71]段56-63任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[72]段71的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[73]段72的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[74]段56-63任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
[75]段74的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
[76]段75的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
[77]段76的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
[78]段77的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
[79]段78的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。
[80]段56-79任一项的方法，其中具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列，或者所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。
[81]段56-63任一项的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[82]段56-81任一项的方法，其中所述SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸64至859。
[83]段56-82任一项的方法，其中SEQ ID NO：2的成熟多肽是SEQ IDNO：2的氨基酸22至250。
[84]一种酶组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的多肽和一种或多种(几种)纤维素分解酶，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[85]段84的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
[86]段85的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[87]段86的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[88]段87的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[89]段88的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[90]段89的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
[91]段84-90任一项的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段，或所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它们具有纤维素分解增强活性的片段组成。
[92]段84的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中-高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[93]段92的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[94]段93的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[95]段84的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
[96]段95的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
[97]段96的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
[98]段97的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
[99]段98的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
[100]段99的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。
[101]段84-100任一项的酶组合物，其中具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列，或者所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其成熟多肽编码序列，或它们编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。
[102]段84的酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[103]段84-102任一项的酶组合物，其中所述SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸77至766。
[104]段84-103任一项的酶组合物，其中SEQ ID NO：2的成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸20至249。
[105]段84-104任一项的酶组合物，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[106]段84-105任一项的酶组合物，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶。
[107]段84-106任一项的酶组合物，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含纤维二糖水解酶。
[108]段84-107任一项的酶组合物，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶包含β-葡糖苷酶。
[109]段84-108任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种(几种)选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)。
[110]段109的酶组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种(几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims (91)

1.一种降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用纤维素分解酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸22至250组成；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸为：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸64至859，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸64至859的cDNA序列，或(iii)上述(i)或(ii)的全长互补链。
2.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
3.权利要求2的方法，其中所述预处理选自化学预处理、物理预处理和生物预处理。
4.权利要求2的方法，其中所述预处理为机械预处理。
5.权利要求1的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
6.权利要求5的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
7.权利要求1的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
8.权利要求7的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
9.权利要求1-8任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
10.权利要求9的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
11.权利要求10的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
12.权利要求1的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是曲霉属多肽。
13.权利要求12的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是烟曲霉多肽。
14.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料选自植物的茎、叶、壳、皮和穗轴。
15.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料选自树的叶和枝。
16.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为木材。
17.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为草本材料。
18.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料选自农业残余物、林业残余物和城市固体废物。
19.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为废纸。
20.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为纸浆厂残余物。
21.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为造纸厂残余物。
22.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料选自玉米秸秆、玉米穗轴、橙皮、稻杆、麦杆、柳枝稷、芒草属植物和甘蔗渣。
23.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料为玉米纤维。
24.权利要求1的方法，其中所述纤维素材料选自微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉线头、无定形的磷酸处理的纤维素和滤纸。
25.一种产生发酵产物的方法，包括：
(A)在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸22至250组成；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸为：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸64至859，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸64至859的cDNA序列，或(iii)上述(i)或(ii)的全长互补链；
(B)用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料；和
(C)从发酵回收发酵产物。
26.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
27.权利要求26的方法，其中所述预处理选自化学预处理、物理预处理和生物预处理。
28.权利要求26的方法，其中所述预处理为机械预处理。
29.权利要求25的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
30.权利要求29的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
31.权利要求25的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
32.权利要求31的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
33.权利要求25的方法，其中步骤(A)和(B)是在同时糖化和发酵中进行。
34.权利要求25的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
35.权利要求25的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是曲霉属多肽。
36.权利要求35的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是烟曲霉多肽。
37.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料选自植物的茎、叶、壳、皮和穗轴。
38.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料选自树的叶和枝。
39.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为木材。
40.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为草本材料。
41.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料选自农业残余物、林业残余物和城市固体废物。
42.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为废纸。
43.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为纸浆厂残余物。
44.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为造纸厂残余物。
45.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料选自玉米秸秆、玉米穗轴、橙皮、稻杆、麦杆、柳枝稷、芒草属植物和甘蔗渣。
46.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料为玉米纤维。
47.权利要求25的方法，其中所述纤维素材料选自微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉线头、无定形的磷酸处理的纤维素和滤纸。
48.一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用纤维素分解酶组合物糖化的，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸22至250组成；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸为：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸64至859，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸64至859的cDNA序列，或(iii)上述(i)或(ii)的全长互补链。
49.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
50.权利要求49的方法，进一步包括回收发酵产物。
51.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
52.权利要求51的方法，其中所述预处理选自化学预处理、物理预处理和生物预处理。
53.权利要求51的方法，其中所述预处理为机械预处理。
54.权利要求48-53任一项的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
55.权利要求54的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
56.权利要求48-53任一项的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
57.权利要求56的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
58.权利要求49的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
59.权利要求48的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是曲霉属多肽。
60.权利要求59的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是烟曲霉多肽。
61.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料选自植物的茎、叶、壳、皮和穗轴。
62.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料选自树的叶和枝。
63.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为木材。
64.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为草本材料。
65.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料选自农业残余物、林业残余物和城市固体废物。
66.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为废纸。
67.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为纸浆厂残余物。
68.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为造纸厂残余物。
69.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料选自玉米秸秆、玉米穗轴、橙皮、稻杆、麦杆、柳枝稷、芒草属植物和甘蔗渣。
70.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料为玉米纤维。
71.权利要求48的方法，其中所述纤维素材料选自微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉线头、无定形的磷酸处理的纤维素和滤纸。
72.一种纤维素分解酶组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的多肽和一种或多种纤维素分解酶，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组：(a)多肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸22至250组成；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸为：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸64至859，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸64至859的cDNA序列，或(iii)上述(i)或(ii)的全长互补链。
73.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是曲霉属多肽。
74.权利要求73的纤维素分解酶组合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是烟曲霉多肽。
75.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料选自植物的茎、叶、壳、皮和穗轴。
76.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料选自树的叶和枝。
77.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为木材。
78.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为草本材料。
79.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料选自农业残余物、林业残余物和城市固体废物。
80.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为废纸。
81.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为纸浆厂残余物。
82.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为造纸厂残余物。
83.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料选自玉米秸秆、玉米穗轴、橙皮、稻杆、麦杆、柳枝稷、芒草属植物和甘蔗渣。
84.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料为玉米纤维。
85.权利要求72的纤维素分解酶组合物，其中所述纤维素材料选自微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉线头、无定形的磷酸处理的纤维素和滤纸。
86.权利要求72-85任一项的纤维素分解酶组合物，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
87.权利要求72-85任一项的纤维素分解酶组合物，其中所述一种或多种纤维素分解酶包含内切葡聚糖酶。
88.权利要求72-85任一项的纤维素分解酶组合物，其中所述一种或多种纤维素分解酶包含纤维二糖水解酶。
89.权利要求72-85任一项的纤维素分解酶组合物，其中所述一种或多种纤维素分解酶包含β-葡糖苷酶。
90.权利要求72-85任一项的纤维素分解酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的蛋白：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
91.权利要求90的纤维素分解酶组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
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