ES2267200T3 - Celulasa producida por actinomycetes y metodo para producirla. - Google Patents

Abstract

Una celulasa que comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ. ID NO: 1 o su derivado que tiene actividad celulolítica y una identidad de secuencia de al menos el 70% respecto a la SEQ. ID NO: 1.

Description

Celulasa producida por Actinomycetes y método para producirla.

Antecedentes de la invención A. Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones de celulasa producidas por Actinomycete, métodos para producir tales celulasas y el uso de tales celulasas. La presente invención se refiere además al uso de la nueva celulasa en composiciones que se reconocen en la técnica que tienen celulasa añadida de forma ventajosa en éstas, incluyéndola, como un aditivo en una composición detergente, en el tratamiento de tejidos tales como telas que contienen celulosa y fibras útiles de éstas, como un aditivo de pienso animal, como una ayuda del procesamiento en la cocción, en el tratamiento de pulpa y papel y en el tratamiento de almidón para la producción de jarabe de maíz de fructosa superior o etanol.

B. Estado de la técnica

Las celulasas son enzimas que son capaces de la hidrólisis de los enlaces \beta-D-glucosídicos en celulosas. Las enzimas celulolíticas han sido divididas tradicionalmente en tres clases principales: endoglucanasas, exoglucanasas o celobiohidrolasas y \beta-glucosidasas (Knowles, J. et al. (1987), TIBTECH, 5, 255-261); y se sabe que son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos.

Principalmente, entre las aplicaciones que han sido desarrolladas para el uso de enzimas celulolíticas están las que implican degradar la pulpa de celulosa (madera) en azúcares para la producción de (bio)etanol, tratamientos textiles como el "lavado a la piedra" y el "biopulido", y en composiciones detergentes. Así, se sabe que las celulasas son útiles en composiciones detergentes para eliminar la suciedad, es decir, para la limpieza. Por ejemplo, las solicitudes de Gran Bretaña N^{os}. 2.075.028, 2.095.275 y 2.094.826 ilustran un comportamiento de limpieza mejorado cuando los detergentes incorporan celulasa. Además, la solicitud de Gran Bretaña 1.358.599 ilustra el uso de celulasa en detergentes para reducir la dureza de telas que contienen algodón.

Otra propiedad útil de las celulasas en el tratamiento de los tejidos es su capacidad de reacondicionar telas usadas haciendo sus colores más vivos. Por ejemplo, el lavado repetido de telas que contienen algodón causa un aspecto grisáceo a la tela que, según se cree, es debido a la rotura y el desorden de las fibrillas, a veces llamadas "bolitas", causadas por la acción mecánica. Este aspecto grisáceo es particularmente apreciable en telas coloreadas. Como consecuencia, tiene valor la capacidad de la celulasa de eliminar la capa superior desordenada de la fibra y mejorar así el aspecto global de la tela.

Como los detergentes, que son una aplicación primaria de la celulasa, funcionan generalmente en condiciones alcalinas hay una fuerte demanda de celulasas que tengan una actividad excelente a pH 7-10. Las celulasas micóticas bien caracterizadas, tales como las de Humicola insolens y Trichoderma reesei, funcionan de forma adecuada a un pH de neutro a bajo alcalino. Además, un número de enzimas que muestran actividad de celulasa a un pH alcalino alto han sido aisladas a partir de Bacillus y otros procariotas, véase por ejemplo, los números de publicación PCT WO 96/34092 y WO 96/34108. Así, tanto las celulasas micóticas como las bacterianas han sido investigadas a fondo. Sin embargo, un tercer grupo de celulasas, las que han sido aisladas a partir de Actinomycetes, han atraído sólo alguna atención. Wilson et al., Critical Reviews in Biotechnology, vol. 12, págs. 45-63 (1992), han estudiado las celulasas producidas por Thermomonospora fusca, Thermonomospora curvata y Microbispora bispora y han ilustrado que muchas de estas celulasas muestran amplios perfiles de pH y una buena estabilidad respecto a las temperaturas. Asimismo, Nakai et al. Agric. Biol. Chem., vol. 51, págs. 3061-3065 (1987) y Nakai et al. Gene, vol. 65, págs. 229-238 (1988) han ilustrado la celulasa alcalina-tolerante casA de la cepa KSM-p de Streptomycetes que también posee una estabilidad a pH alcalino óptima y excelente a diversas temperaturas.

A pesar del conocimiento en la técnica relacionada de muchas composiciones de celulasa que tienen propiedades deseables, incluyendo las de Actinomycetes, hay una continua necesidad de nuevas celulasas que tengan un espectro variable de características que sean útiles, por ejemplo, en el tratamiento de tejidos, como un componente de composiciones detergentes, en el tratamiento de pulpa y papel, como un suplemento del pienso animal, como una ayuda para el procesamiento por cocción y la conversión de la biomasa. Los solicitantes han descubierto ciertas celulasas que tienen tales características complementarias y que son útiles en tales aplicaciones conocidas de la celulasa.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de Actinomycete que tengan perfiles de pH y temperatura útiles para su uso en detergentes.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de Actinomycete que tengan características útiles para el tratamiento de tejidos para producir calidades deseables en hilos textiles, telas y prendas.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de Actinomycete que tengan características útiles para su uso como un aditivo del pienso animal, como una ayuda en la cocción, en el tratamiento de pulpa y papel y en la reducción de la biomasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar un método para producir composiciones de celulasa derivadas a partir de tal nueva Actinomycetes.

Es aún un objeto más de la presente invención proporcionar un ADN y la secuencia de aminoácidos que facilitan la producción industrial de las nuevas composiciones de celulasa de la invención.

Es todavía un objeto más de la presente invención proporcionar una nueva celulasa que tenga propiedades excelentes para su uso en detergentes, tratamiento de tejidos, como un suplemento alimenticio y en la fabricación de la pulpa y del papel.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva celulasa que es obtenible a partir de Actinomycete o un derivado de dicha celulasa. Preferiblemente, la celulasa de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), o su derivado que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia, preferiblemente más del 75% de identidad de secuencia y más preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta.

De acuerdo con otra realización, se proporciona una composición que comprenda ADN que codifique la celulasa de la invención. Preferiblemente, el ADN codifica para una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), o su derivado que tiene más del 72% de identidad de secuencia, preferiblemente más del 80% de identidad de secuencia y más preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta y las celulasas producidas así. La presente invención además incorpora ADN que se hibrida a una sonda de ADN tomada a partir del ADN representado en la Figura 2 en condiciones apropiadas y las celulasas así producidas.

De acuerdo con aún otra realización de la invención, se proporciona un método para transformar un microorganismo adecuado con ADN que codifica para una celulasa de acuerdo con la invención y un método para producir la celulasa de acuerdo con la invención a partir de aquel microorganismo transformado como se establece en las reivindicaciones.

En una realización especialmente preferida de la presente invención, la celulasa madura se deriva a partir de Actinomycete y tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kD según se mide con SDS-PAGE (denominada en este documento de aquí en adelante como la celulasa de 35 kD). La celulasa de aproximadamente 35 kD madura tiene un punto isoeléctrico calculado de aproximadamente 4,5 y un grado óptimo de pH en CMC de aproximadamente 6 a 40ºC y de 6 o menos a 60ºC. La celulasa de la presente invención mostró una actividad más alta a 60ºC que a 40ºC con amplios rangos de actividad desde al menos pH 5 a pH 10.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con la invención mostrándose la secuencia líder en negrita. Las letras en códigos son las correspondientes a la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (como se describe en el GenBank Patentln User Manual, Versión PC-DOS/MS-DOS, Noviembre de 1990) (SEQ. ID NO: 1).

La figura 2 muestra la secuencia de ADN que codifica para una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con la invención (SEQ. ID NO: 2).

La figura 3 muestra el perfil de pH/actividad de una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con la invención a 40ºC y 60ºC.

La figura 4 muestra el vector pHPLT.

La figura 5 muestra el vector pHP11AG3.

La figura 6 muestra la secuencia 16s ARN de Actinomycete a partir de la cual puede ser obtenida la celulasa de la invención (SEQ. ID NO: 3).

Descripción detallada de la invención

Con "derivado" se pretende indicar una proteína que se deriva a partir de la proteína nativa por la adición de uno o varios aminoácidos en uno o ambos extremos C y N de la proteína nativa, la sustitución de uno o varios aminoácidos en uno o un número de sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos nativos, la deleción de uno o varios aminoácidos en uno o ambos extremos de la proteína nativa o en uno o varios sitios en la secuencia de aminoácido o la inserción de uno o varios aminoácidos en uno o varios sitios en la secuencia de aminoácidos nativa. La preparación de un derivado de enzima preferiblemente se logra modificando una secuencia de ADN que codifica para la proteína nativa, la transformación de aquella secuencia de ADN en un huésped adecuado, y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar la enzima derivada. El derivado de la invención incluye péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos modificadas en comparación con una secuencia de aminoácidos de enzima precursora (por ejemplo, una enzima tipo nativa o en estado natural de acuerdo con la presente invención) y cuyos péptidos conservan una naturaleza enzimática característica de la enzima precursora, pero que tiene propiedades modificadas en algún aspecto específico. Por ejemplo, una celulasa modificada puede tener un mayor pH óptimo o mayor resistencia a las temperaturas, pero conservará su actividad celulolítica característica.

"Célula huésped" significa una célula que tiene la capacidad de actuar como huésped y vehículo de expresión para un vector de ADN recombinante de acuerdo con la presente invención. En una realización preferida de acuerdo con la presente invención, "célula huésped" significa las células de Bacillus.

"Constructo de ADN" o "vector de ADN" significa una secuencia de nucleótidos que comprende uno o varios fragmentos de ADN que codifican para cualquiera de las nuevas celulasas o los derivados de celulasa descritos anteriormente.

En una realización preferida, la celulasa de la invención es una celulasa de aproximadamente 35 kD (calculada sobre la base de la secuencia de aminoácidos de la proteína madura) derivada a partir de Actinomycete (denominada en este documento como la "celulasa de 35 kD"). La celulasa de 35 kD tiene un pl calculado para la proteína madura de aproximadamente 4,5 y un grado óptimo de pH en carboximetilcelulosa (CMC) a 40ºC de aproximadamente 6 y a 60ºC de 5 o menos.

El gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la celulasa de 35 kD fue analizado por comparación con los datos de secuencia accesibles en varias genotecas (GenBank, Swiss-Prot, EMBL y PIR). Una búsqueda de bases de datos para una comparación de la celulasa codificada por la secuencia de ADN de la presente invención con celulasas codificadas por secuencias génicas de celulasa publicadas o conocidas fue realizada para determinar a los compañeros filogenéticos cercanos. La cantidad más alta de homología encontrada fue con la celulasa E5 derivada de Thermomonospora fusca y la CeIA de Streptomyces lividans. Se mostró que la celulasa de aproximadamente 35 kD era 61,2% idéntica a la secuencia de aminoácidos de E5 en un traslapo de 268 residuos y 54,9% idéntica a la secuencia de CeIA en un traslapo de 244 pares de bases usando el programa TFastA como se describe en Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 85, págs. 2444-2448 (1988). El Programa de Busca de Datos TFastA está disponible en la Versión 6.0 del Paquete de Software de Análisis de Secuencias (Grupo de Bioinformática, Centro de Biotecnología de la Univ. de Wisconsin, Madison, Wisconsin 53705). Una comparación de las secuencias de ADN que codifican para la celulasa de 35 kD con el ADN que codifica para E5 y CeIA utilizando el programa TFastA mostró una identidad de nucleótidos del 71,3% de identidad respecto al ADN que codifica E5 en un traslapo de 1134 pares de bases y una identidad del 62,8% respecto al ADN que codifica CeIA con un traslapo de 1306 pares de bases.

Así, la presente invención abarca una celulasa que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o su derivado que tiene al menos una identidad de secuencia del 70%, preferiblemente una identidad de secuencia mayor del 75% y lo más preferiblemente una identidad de secuencia mayor del 90% en ésta. Asimismo, la presente invención además abarca un ADN de acuerdo con la Figura 2 ID NO: 2) o su derivado que tiene más del 72% de identidad de secuencia, preferiblemente más del 80% de identidad de secuencia y lo más preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta.

La hibridación se usa en este documento para analizar si un fragmento dado o un gen corresponden a la celulasa descrita en este documento y si cae en la amplitud de la presente invención. El ensayo de hibridación es esencialmente como sigue: El ADN genómico de una fuente objetivo particular se fragmenta por digestión con una(varias) enzima(s) de restricción, por ejemplo, EcoR I, Hind III, Bam HI, Cla I, Kpn I, Mlu I, Spe I, Bgl II, Nco I, Xba I, Xho I y Xma I (suministradas por Biolabs de Nueva Inglaterra, Inc., Beverly, MA y Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras entonces se someten a electroforesis a través de un gel de agarosa (tal como, por ejemplo, agarosa del 0,8%) de modo que la separación de los fragmentos de ADN pueda ser visualizada por tamaños. El gel puede ser aclarado brevemente en H_{2}O destilada y posteriormente puede ser despurinado en una solución apropiada (tal como, por ejemplo, HCl 0,25 M) con agitación suave seguido de la desnaturación durante 30 minutos con agitación suave seguido de la desnaturación durante 30 minutos (en, por ejemplo, NaOH 0,4 M) con agitación suave. Una etapa de renaturación puede ser incluida en la que el gel se coloca en NaCl 1,5 M, Tris 1 M, pH 7,0 con agitación suave durante 30 minutos. El ADN entonces debe ser transferido a una membrana apropiada cargada positivamente, por ejemplo, una membrana Maximum Strength Nytran Plus (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), utilizando una solución de transferencia (tal como, por ejemplo, 6XSSC (NaCl 900 mM, citrato de trisodio 90 mM). Después de que la transferencia sea completa, generalmente a aproximadamente 2 horas o más, la membrana se aclara y se seca al aire a temperatura ambiente después de utilizar una solución de aclarado (tal como, por ejemplo, 2X SSC [2X SSC = NaCl 300 mM, citrato de trisodio 30 mM]). La membrana entonces se prehibrida, (durante aproximadamente 2 horas o más) en una solución de prehibridación adecuada (tal como, por ejemplo, una solución acuosa que contiene por cada 100 ml: 20-50 ml de formamida, 25 ml de 20X SSPE (1X SSPE = NaCl 0,18 M, EDTA 1 mM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,7), 2,5 ml de SDS del 20%, 1 ml de ADN de esperma de arenque fraccionado de 10 mg/ml). Como sabe cualquier experto en la técnica, la cantidad de formamida en la solución de prehibridación puede ser variada dependiendo de la naturaleza de la reacción obtenida de acuerdo con métodos rutinarios. Así, una cantidad inferior de formamida puede causar un gel más completo en términos de moléculas de hibridación identificantes que el mismo procedimiento usando una cantidad más grande de formamida. Por otra parte, una banda de hibridación fuerte puede ser identificada más fácilmente visualmente usando más formamida.

Una sonda de ADN tomada a partir de la secuencia en la Figura 2 se aisla por electrofóresis en un gel de agarosa, el fragmento se excinde del gel y se recupera de la agarosa excindida. Entonces se marca este fragmento purificado de ADN (utilizando, por ejemplo, el sistema de marcaje Megaprime de acuerdo con las instrucciones del fabricante para incorporar P^{32} en el ADN (Amersham International pIc, Buckinghamshire, Inglaterra)). La sonda marcada se desnaturaliza calentándose a 95ºC durante 5 minutos e inmediatamente se añade a la solución de prehibridación que contiene la membrana anterior. La reacción de hibridación debe proceder durante un tiempo adecuado y bajo las condiciones apropiadas, por ejemplo, durante 18 horas a 37ºC con agitación suave. La membrana se aclara (por ejemplo, en 2X SSC/SDS del 0,3%) y luego se lava con una solución de lavado apropiada y con agitación suave. La severidad deseada será una reflexión de las condiciones en las cuales la membrana (el filtro) se lava.

Específicamente, la severidad de una reacción dada (es decir, el grado de homología necesario para una hibridación acertada) dependerá de las condiciones de lavado a las cuales el filtro del Southern Blot es sometido después de la hibridación. Las condiciones de "severidad baja" como se definen en este documento comprenderán el lavado de un filtro del Southern Blot con una solución de 0,2X SSC/SDS del 0,1% a 20ºC durante 15 minutos. Las condiciones de "severidad estandar" comprenden una etapa de lavado más que comprende el lavado del filtro del Southern Blot una segunda vez con una solución de 0,2X SSC/SDS del 0,1% a 37ºC durante 30 minutos.

La presente invención también describe un procedimiento para la producción de la celulasa. Es posible producir la celulasa rastreando muestras de lago de soda para producir y aislar el organismo que produce la celulasa apropiada. Este organismo entonces puede hacerse crecer de acuerdo con medios aprobados en la técnica para cultivar tal Actinomycetes. Sin embargo, mejor que aislar la cepa que produce la celulasa correcta, es mucho más simple y más eficiente aislar la celulasa de acuerdo con la presente invención utilizando técnicas de ingeniería genética transformando una célula huésped adecuada con el ADN proporcionado en este documento que codifica la celulasa y cultivar el microorganismo recombinante resultante en condiciones apropiadas para el crecimiento de la célula huésped y la expresión de celulasa. Como una primera etapa, puede ser obtenido el ADN cromosómico a partir de la cepa de Actinomycete donante, por ejemplo, por el método de Saito y Miura (Saito y Miura, Biochim. Biophys. Acta., vol. 72, pág. 619 (1963)) o por un método similar. La división de la enzima de restricción del ADN cromosómico así obtenido da fragmentos de ADN que contienen el gen de celulasa alcalino. Por esta razón, puede ser usada cualquier enzima de restricción con la condición de que no rompa la región de dicho gen. En una alternativa, puede ser usada una enzima de restricción que rompa el gen, usando sin embargo, una concentración de enzima reducida o un tiempo de incubación que permita una digestión sólo parcial. Una endonucleasa de restricción preferida es Sau3A. A partir de la mezcla de digestión resultante, pueden ser aislados fragmentos adecuados (4-10 kb) y ser usados para transformar una célula huésped adecuada con un constructo de ADN.

El gen que codifica la celulasa de la presente invención puede ser clonado usando vectores (de expresión) de X-bacteriófago y células huésped de E. coli. (De forma alternativa, puede ser usada la clonación por PCR utilizando iniciadores adecuados diseñados en dominios conservadores). Los solicitantes han descubierto que la transformación del gen que codifica la celulasa de la presente invención y la expresión en E. coli causa una proteína activa. Después de una primera etapa de clonación en E. coli, un gen de celulasa de acuerdo con la presente invención puede ser transferido a un huésped de expresión industrial más preferido tal como de la especie Bacillus o Streptomyces, un hongo filamentoso tal como Aspergillus o Trichoderma, o una levadura tal como Saccharomyces. La expresión a un nivel alto y la secreción obtenible en estos organismos huésped permiten la acumulación de la celulasa en el medio de fermentación a partir del cual posteriormente puede ser recuperada.

La celulasa puede ser recuperada a partir del medio según procedimientos convencionales incluyendo la separación de las células del medio por centrifugación o filtración, si fuera necesario después de la rotura de las células, precipitando los componentes proteicos del sobrenadante o del filtrado mediante una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, seguido de la purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o procedimientos similares reconocidos en la técnica. Para la producción de la celulasa alcalina de acuerdo con la invención, se prefiere cultivar en condiciones alcalinas usando medios que contienen una fuente de energía basada en celulosa.

Preferiblemente, la célula huésped de expresión comprende un Bacillus spp., más preferiblemente Bacillus licheniformis o Bacillus subtils. En una realización especialmente preferida, el huésped de transformación es suprimido para los genes de proteasa para asegurarse de que la celulasa producto no está sometida a proteolisis en el caldo de fermentación o su concentrado. Una transformación general preferida y un protocolo de expresión para cepas de Bacillus suprimida la proteasa se proporciona en Ferrari et al., patente de EE.UU. Nº. 5.264.366. La transformación y la expresión en Aspergillus son descritas, por ejemplo, en Berka et al., patente de EE.UU. Nº. 5.364.770, incorporada en este documento como referencia. Los solicitantes han encontrado que la transformación del presente gen en Bacillus era pobre o ineficaz en términos de expresión resultante cuando se utilizaba la maquinaria reguladora nativa. En consecuencia, cuando se transforma en Bacillus spp., es preferido utilizar el promotor aprE en combinación con las secuencias reguladoras de la señal derivada de Bacillus estándar conocida y otras. Cuando la célula huésped de transformación es Aspergillus el promotor preferido es glaA.

El tratamiento de tejidos de acuerdo con la presente invención contempla el procesamiento o la limpieza de tejidos con una composición que comprende una celulasa. Tal tratamiento incluye, pero no está limitado, al lavado a la piedra, la modificación de la textura, la sensación y/o el aspecto de telas que contienen celulosa u otras técnicas usadas durante la fabricación o limpieza/reacondicionamiento de telas que contienen celulosa. Además, el tratamiento dentro del contexto de esta invención contempla la eliminación de algodón "inmaduro" o "muerto", a partir de la tela celulósica o fibras. El algodón inmaduro es considerablemente más amorfo que el algodón maduro y causa una tela de calidad menor cuando está presente debido, por ejemplo, a un teñido desigual. La composición contemplada en la presente invención incluye además un componente de celulasa potenciada para uso en el lavado de una tela fabricada que contiene celulosa manchada. Por ejemplo, la celulasa potenciada puede ser usada en una composición detergente para lavar la colada. Composiciones detergentes útiles conforme a la presente invención incluyen formulaciones especiales tales como composiciones de prelavado, preempapado y de restauración del color de uso doméstico. Tales composiciones de tratamiento, según se describe en este documento, pueden estar en forma de un concentrado que requiera la dilución o en forma de una solución diluida o en una forma que pueda ser aplicada directamente a la tela que contiene celulosa. Técnicas de tratamiento generales para el tratamiento de celulasa de tejidos son descritas, por ejemplo, en la publicación EP Nº. 220 016 y las solicitudes de GB Nº. 1.368.599 y 2.095.275.

El tratamiento de un material celulósico de acuerdo con la presente invención contempla además el tratamiento de pienso animal, pulpa y/o papel, alimentos y grano para los objetivos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se sabe que la celulasa aumenta el valor del pienso animal, mejora la capacidad de drenaje de la pasta de papel, realza los productos de alimentación y reduce la fibra en el grano durante el procedimiento de molienda del grano en húmedo o el procedimiento de molienda en seco.

El tratamiento de acuerdo con la presente invención comprende la preparación de una solución acuosa que contiene una cantidad eficaz de celulasa junto con otros ingredientes opcionales incluyendo, por ejemplo, un tampón, un tensioactivo, y/o un agente de lavado. Una cantidad eficaz de composición de enzima celulasa es una concentración de enzima celulasa suficiente para su objetivo pretendido. Así, por ejemplo, una "cantidad eficaz" de celulasa en una composición de lavado a la piedra de acuerdo con la presente invención es aquella cantidad que proporcionará el efecto deseado, por ejemplo, para producir un aspecto de usado y descolorido en las costuras y en los paneles de la tela. Asimismo una "cantidad eficaz" de celulasa en una composición pretendida para mejorar la sensación y/o el aspecto de una tela que contiene celulosa es aquella cantidad que producirá mejoras cuantificables en la sensación, por ejemplo, mejorando la suavidad de la tela, o el aspecto, por ejemplo, quitando las bolitas y fibrillas que tienden a reducir la apariencia de nuevo de una tela. La cantidad de celulasa empleada es también dependiente del equipo empleado, los parámetros de procedimiento empleados (la temperatura de la solución de tratamiento de celulasa, el tiempo de exposición a la solución de celulasa, y similares) y la actividad de celulasa (por ejemplo, una solución particular requerirá una concentración inferior de celulasa cuando sea usada una composición de celulasa más activa cuando se compara con una composición de celulasa menos activa). La concentración exacta de celulasa en la solución de tratamiento acuosa que se añade a la tela que se trata puede ser determinada fácilmente por cualquier experto en la técnica basado en los factores anteriores así como en el resultado deseado. En los procedimientos de lavado a la piedra, generalmente era preferido que la celulasa estuviera presente en la solución acuosa de tratamiento en una concentración de aproximadamente 0,5 a 5.000 ppm y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 a 200 ppm de proteína total. En las composiciones para la mejora de la sensación y/o el aspecto de una tela que contiene celulosa, generalmente era preferido que la celulasa estuviera presente en la solución acuosa de tratamiento en una concentración de aproximadamente 0,1 a 2000 ppm y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 200 ppm de proteína total.

En una realización de tratamiento preferida, el tampón es empleado en la composición de tratamiento tal que la concentración de tampón sea suficiente para mantener el pH de la solución dentro del intervalo en el que la celulasa empleada muestre una actividad que, a su vez, dependa de la naturaleza de la celulasa empleada. La concentración exacta de tampón empleado dependerá de varios factores que cualquier experto en la técnica puede tener en cuenta fácilmente. Por ejemplo, en una realización preferida, el tampón así como la concentración del tampón se seleccionan para mantener el pH de la solución de celulasa final dentro del intervalo de pH requerido para que la actividad de celulasa sea la óptima. La determinación del intervalo del pH óptimo de las celulasas potenciadas de la invención puede ser averiguado de acuerdo con técnicas conocidas. Tampones adecuados al pH dentro del campo de actividad de la celulasa potenciada son conocidos por los expertos en la técnica en el área.

Además de la celulasa y un tampón, la composición de tratamiento puede contener opcionalmente un tensioactivo. Tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo compatible con la celulasa y la tela incluyendo, por ejemplo, tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfibólicos. Tensioactivos aniónicos adecuados para uso en este documento incluyen alquilbencenosulfatos lineales o ramificados; sulfatos de olefin-alquil o alquenil éter que tienen grupos alquilo lineales o ramificados o grupos alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; alcanosulfonatos y otros similares. Contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos incluyen iones de metal alcalino tales como el sodio y el potasio; iones metálicos alcalino-térreos tales como calcio y magnesio; ión de amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol de 2 ó 3 números de carbono. Tensioactivos anfibólicos incluyen sal de sulfonatos de amonio cuaternario, y tensioactivos anfibólicos del tipo de betaína. Tales tensioactivos anfibólicos tienen tanto grupos positivos como negativos cargados en la misma molécula. Los tensioactivos no iónicos comprenden generalmente éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de ácido graso superior o sus aductos de óxido de alquileno, y monoésteres de glicerina de ácido graso. Las mezclas de tensioactivos también pueden ser empleadas en medios conocidos para los expertos en la técnica.

Una composición de celulasa concentrada puede prepararse para uso en los métodos descritos en este documento. Tales concentrados contienen cantidades concentradas de la composición de celulasa descritas anteriormente, tampones y el tensioactivo, preferiblemente en una solución acuosa. Cuando se formulan así, el concentrado de celulasa puede ser diluido fácilmente con agua para preparar preparaciones de celulasa potenciadas rápidamente y con exactitud que tienen la concentración precisa de cada constituyente. Cuando se formulan los concentrados acuosos, estos concentrados pueden ser diluidos para llegar a la concentración precisa de los componentes en la solución de celulasa como se indica anteriormente. Como es fácilmente evidente, tales concentrados de celulasa permitirán la formulación fácil de las soluciones de celulasa así como permitirán el transporte factible de la composición a la posición en la que ésta será usada. El concentrado de tratamiento puede estar en cualquier forma aprobada por la técnica, por ejemplo, líquida, emulsión, gel o pasta. Tales formas son conocidas por los expertos en la técnica.

Cuando se emplea un concentrado de celulasa sólido, la composición de celulasa puede estar en gránulos, polvos, un aglomerado o un disco sólido. Los gránulos pueden ser formulados para que contengan materiales para reducir la velocidad de disolución de los gránulos en el medio de lavado. Tales materiales y gránulos son descritos en la patente de EE.UU. Nº. 5.254.283 que se incorpora en este documento como referencia íntegramente.

También pueden ser usados o colocados otros materiales en la composición de celulasa de la presente invención cuando se desee, incluyendo piedras, piedra pómez, rellenos, disolventes, activadores enzimáticos y agentes de antiredeposición dependiendo del uso eventual de la composición.

De modo ilustrativo, serán descritos detalladamente métodos de lavado a la piedra, sin embargo, los parámetros descritos se modifican fácilmente por cualquier experto en la técnica para otras aplicaciones, es decir, mejorando la sensación y/o el aspecto de una tela. Se ponen en contacto la tela que contiene celulosa con la composición de lavado a la piedra que contiene celulasa que contiene una cantidad eficaz de celulasa entremezclando la composición de tratamiento con la composición de lavado a la piedra, y así se lleva a la enzima celulasa a la proximidad de la tela. Posteriormente, la solución acuosa que contiene la celulasa y la tela se agitan. Si la composición de tratamiento es una solución acuosa, la tela puede ser empapada directamente por la solución. Asimismo, cuando la composición de lavado a la piedra es un concentrado, el concentrado se diluye en un baño maría con la tela que contiene celulosa. Cuando la composición de lavado a la piedra está en una forma sólida, por ejemplo, puede ponerse en contacto un gel de prelavado o una barra sólida con la composición de lavado a la piedra aplicando directamente la composición a la tela o a las aguas de lavado.

La tela que contiene celulosa se incuba con la solución de lavado a la piedra en condiciones eficaces para permitir a la acción enzimática conferir un aspecto de lavado a la piedra a la tela que contiene celulosa. Por ejemplo, durante el lavado a la piedra, el pH, la relación de aguas, la temperatura y el tiempo de reacción pueden ser ajustados para optimizar las condiciones en las cuales la composición de lavado a la piedra actúa. "Condiciones eficaces" se refiere necesariamente al pH, la relación de las aguas, y la temperatura que permite a la enzima celulasa reaccionar de manera eficiente con la tela que contiene celulosa, para producir en este caso el efecto de lavado a la piedra. Generalmente, las celulasas de la presente invención deben ser utilizadas en condiciones operables para el uso de la(s) celulasa(s) relacionada(s). Sin embargo, tales condiciones son fácilmente averiguables por cualquier experto en la técnica. Las condiciones de reacción eficaces para las composiciones de lavado a la piedra de la presente invención son sustancialmente similares a los métodos conocidos usados con las composiciones de celulasa correspondientes de la técnica anterior. En consecuencia, está dentro de la pericia de los expertos en la técnica maximizar las condiciones para usar las composiciones de lavado a la piedra de acuerdo con la presente invención.

Las relaciones de aguas durante el lavado a la piedra, es decir, la relación en peso de la solución de la composición de lavado a la piedra (es decir, las aguas de lavado) respecto al peso de la tela, empleadas en este documento son generalmente una cantidad suficiente para alcanzar el efecto de lavado a la piedra deseado en la tela tejana y son dependientes del procedimiento usado. Preferiblemente, las relaciones de aguas son de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 50:1; más preferiblemente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, y lo más preferiblemente de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1.

Las temperaturas de reacción durante el lavado a la piedra con las presentes composiciones de lavado a la piedra son gobernadas por dos factores competidores. En primer lugar, las temperaturas más altas generalmente corresponden a una cinética de reacción realzada, es decir, reacciones más rápidas, que permiten tiempos de reacción reducidos cuando se compara con los tiempos de reacción requeridos a temperaturas inferiores. En consecuencia, las temperaturas de reacción son generalmente de al menos aproximadamente 10ºC y mayores. En segundo lugar, la celulasa es una proteína que pierde la actividad más allá de una temperatura de reacción dada, cuya temperatura es dependiente de la naturaleza de la celulasa usada. Así, si se permite a la temperatura de reacción ser demasiado alta, la actividad celulolítica se pierde como consecuencia de la desnaturalización de la celulasa. Aunque las temperaturas estándar para el uso de celulasa en la técnica generalmente están en el intervalo de 35ºC a 65ºC, cuyas condiciones también se esperaría que fueran las adecuadas para la celulasa de la invención, las condiciones óptimas de temperatura deben ser averiguadas de acuerdo con las técnicas conocidas en lo que concierne a la celulasa específica usada.

Los tiempos de reacción son dependientes de las condiciones específicas a las cuales el lavado a la piedra ocurre. Por ejemplo, el pH, la temperatura y la concentración de celulasa todas afectarán el tiempo de reacción óptimo. Generalmente, los tiempos de reacción son de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 5 horas, y preferiblemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 3 horas y, más preferiblemente, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1 hora.

De acuerdo con aún otra realización preferida de la presente invención, la celulasa de la invención puede ser empleada en una composición detergente. Las composiciones detergentes de acuerdo con la presente invención son útiles como composiciones de prelavado, composiciones de preempapado, o para limpiar durante el lavado regular o el ciclo de aclarado. Preferiblemente, la composición detergente de la presente invención comprende una cantidad eficaz de celulasa, un tensioactivo, y opcionalmente incluye otros ingredientes descritos debajo.

Una cantidad eficaz de celulasa empleada en las composiciones detergentes de esta invención es una cantidad suficiente para impartir los efectos deseables conocidos por ser producidos por la celulasa en telas que contienen celulosa, por ejemplo, desfrisado, suavizado, anti-frisado, eliminación de fibra superficial, antigrisáceado y limpieza. Preferiblemente, la celulasa en la composición detergente se emplea a una concentración de aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 20.000 ppm de detergente.

La concentración de enzima celulasa empleada en la composición detergente preferiblemente se selecciona de modo que en dilución en un medio de lavado, la concentración de enzima celulasa esté en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 ppm, preferiblemente de aproximadamente 0,02 ppm a aproximadamente 500 ppm, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 ppm a aproximadamente 250 ppm de proteína total. La cantidad de enzima celulasa empleada en la composición detergente dependerá del grado al que el detergente será diluido en la adición al agua para formar una solución de lavado.

Las composiciones detergentes de la presente invención pueden estar en cualquier forma aprobada por la técnica, por ejemplo, como un líquido, en gránulos, en emulsiones, en geles o en pastas. Tales formas son conocidas por el experto en la técnica. Cuando se emplea una composición de detergente sólida, la celulasa preferiblemente se formula como gránulos. Preferiblemente, los gránulos pueden ser formulados para que contengan además un agente protector de la celulasa. El gránulo puede ser formulado para que contenga materiales que reduzcan la velocidad de disolución del gránulo en el medio de lavado. Tales materiales y gránulos son descritos en la patente de EE.UU. Nº. 5.254.283 que se incorpora en este documento como referencia íntegramente.

Las composiciones detergentes de esta invención emplean un agente superficial activo, es decir, un tensioactivo, incluyendo tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfibólicos conocidos por su uso en composiciones detergentes.

Tensioactivos aniónicos adecuados para uso en la composición detergente de esta invención incluyen alquilbencenosulfatos lineales o ramificados; sulfatos de éter de alquilo o alquenilo que tengan grupos alquilo lineales o ramificados o grupos alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; y alcanosulfonatos. Contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos incluyen iones de metal alcalino tales como sodio y potasio; iones de metal alcalino-térreo tales como calcio y magnesio; ión de amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol de 2 ó 3 números de carbono. Tensioactivos anfibólicos incluyen sal de sulfonato de amonio cuaternario, y tensioactivos anfibólicos del tipo betaína. Tales tensioactivos anfibólicos tienen tanto grupos positivos como negativos cargados en la misma molécula. Tensioactivos no iónicos comprenden éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de ácido graso superior o su aducto de óxido de alquileno, monoésteres de glicerina de ácido graso, y otros similares. Tensioactivos adecuados para uso en esta invención son descritos en la solicitud de patente británica Nº. 2094826 A, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. Las mezclas de tales tensioactivos también pueden ser usadas. El tensioactivo o una mezcla de tensioactivos generalmente son empleados en las composiciones detergentes de esta invención en una cantidad de aproximadamente 1 por ciento en peso a aproximadamente 95 por ciento en peso de la composición total detergente y de aproximadamente 5 por ciento en peso a aproximadamente 45 por ciento en peso de la composición total detergente. Además de la composición de celulasa y del(de los) tensioactivo(s), las composiciones detergentes de esta invención opcionalmente pueden contener uno o varios de los componentes siguientes:

Hidrolasas excepto celulasa

Las hidrolasas adecuadas incluyen éster de carboxilato hidrolasa, tioester hidrolasa, monoéster de fosfato hidrolasa, y diester de fosfato hidrolasa que actúan sobre el enlace éster; glicósido hidrolasa que actúa sobre el compuesto glicosilo; una enzima que hidroliza el compuesto N-glicosilo; tioeter hidrolasa que actúa sobre el enlace éter; y a-amino-acil-péptido hidrolasa, peptidil-aminoácido hidrolasa, acil-aminoácido hidrolasa, dipéptido hidrolasa, y peptidil-péptido hidrolasa que actúan sobre el enlace peptídico. Preferible entre ellas están éster de carboxilato hidrolasa, glicósido hidrolasa y peptidil-péptido hidrolasa. Las hidrolasas adecuadas incluyen (1) proteasas que pertenecen a peptidil-péptido hidrolasa tales como pepsina, pepsina B, renina, tripsina, quimotripsina A, quimotripsina B, elastasa, enteroquinasa, catepsina C, papaína, quimopapaína, ficina, trombina, fibrinolisina, renina, subtilisina, aspergilopeptidasa A, colagenasa, clostridiopeptidasa B, calicreína, gastrisina, catepsina D., bromelina, queratinasa, quimotripsina C, pepsina C, aspergilopeptidasa B, uroquinasa, carboxipeptidasa A y B, y aminopeptidasa; (2) glicósido hidrolasas (la celulasa que es un ingrediente esencial está excluida de este grupo) \alpha-amilasa, \beta-amilasa, gluco-amilasa, invertasa, lisozima, pectinasa, quitinasa, y dextranasa. Preferiblemente entre ellas están \alpha-amilasa y \beta-amilasa. Funcionan en sistemas de ácidos a neutros, pero una que sea obtenida a partir de bacterias exhibirá una alta actividad en un sistema alcalino; (3) éster de carboxilato hidrolasa incluyendo carboxilo esterasa lipasa, pectina esterasa y clorofilasa. Especialmente eficaz entre ellas es la lipasa.

Otras hidrolasas distintas a la celulasa se incorporan en la composición detergente tanto como sean requeridas de acuerdo con el objetivo. Preferiblemente debe ser incorporada en una cantidad de 0,001 a 5 por ciento en peso, y más preferiblemente 0,02 a 3 por ciento en peso, en términos de proteína purificada. Esta enzima debe ser usada en forma de gránulos hechos a partir de enzima a granel sola o en combinación con otros componentes en la composición detergente. Los gránulos de enzima a granel son usados en tal cantidad que la enzima purificada esté entre 0,001 y 50 por ciento en peso en los gránulos. Los gránulos son usados en una cantidad de 0,002 a 20 y preferiblemente de 0,1 a 10 por ciento en peso. Como con las celulasas, estos gránulos pueden ser formulados para que contengan un agente protector de la enzima y un material retardante de la disolución.

Tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga

Tales tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga incluyen sales de ácido graso saturadas o insaturadas, sales de éter de ácido carboxílico de alquilo o alquenilo, sales o ésteres de ácido a-sulfograso, tensioactivos del tipo amino ácido, tensioactivos de éster de fosfato, sales de amonio cuaternario incluyendo las que tienen de 3 a 4 sustituyentes de alquilo y hasta 1 sustituyente de alquilo fenilo-sustituido. Tensioactivos catiónicos adecuados y sales de ácido graso de cadena larga son descritos en la solicitud de patente británica 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. La composición puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso de tales tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de cadena larga.

Estructuradores A. Agentes divalentes secuestrantes

La composición puede contener de aproximadamente 0 a aproximadamente 50 por ciento en peso de uno o varios componentes estructuradores seleccionados a partir del grupo que consiste en sales de metal alcalino y sales de alcanolamina de los compuestos siguientes: fosfatos, fosfonatos, fosfonocarboxilatos, sales de aminoácidos, electrólitos moleculares superiores de aminopoliacetatos, polímeros no disociantes, sales de ácidos dicarboxílicos, y sales de aluminosilicato. Agentes secuestrantes divalentes adecuados son los descritos en la solicitud de patente británica Nº. 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.

B. Álcalis o electrólitos inorgánicos

La composición puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 por ciento en peso, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, basado en la composición de una o varias sales de metal alcalino del compuesto siguiente tales como álcalis o electrólitos inorgánicos: silicatos, carbonatos y sulfatos así como álcalis orgánicos tales como trietanolamina, dietanolamina, monoetanolamina y triisopropanolamina.

Agentes antiredeposición

La composición puede contener de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 por ciento en peso de uno o varios de los compuestos siguientes como agentes antiredeposición: polietilenglicol, poli(alcohol de vinilo), polivinilpirrolidona y carboximetilcelulosa.

Entre ellos, una combinación de carboximetil-celulosa y/o polietilenglicol con la composición de celulasa de la presente invención proporciona una composición que elimina la suciedad especialmente útil.

Agentes blanqueantes

El uso de la celulasa de la presente invención en combinación con un agente de blanqueo tal como monopersulfato de potasio, percarbonato de sodio, perborato de sodio, aducto de peróxido de hidrógeno/sulfato de sodio y aducto de peróxido de hidrógeno/cloruro de sodio o/y un tinte de blanqueo fotosensible tal como sal de cinc o aluminio de ftalocianina sulfonada además mejora los efectos detergentes. Asimismo, pueden ser usados agentes blanqueantes y catalizadores de blanqueo tales como los descritos en el documento EP 684 304.

Agentes colorantes azules y tintes fluorescentes

Varios agentes colorantes azules y tintes fluorescentes pueden ser incorporados a la composición, si fuera necesario. Agentes colorantes azules y tintes fluorescentes adecuados son descritos en la solicitud de patente británica Nº. 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.

Inhibidores de la corrosión

Los inhibidores de la corrosión siguientes pueden ser incorporados al detergente pulverulento: sales del ácido p-toluenosulfónico, sales del ácido xilenosulfónico, sales del ácido acético, sales del ácido sulfosuccínico, talco, sílice fina pulverizada, sílices amorfas, arcilla, silicato de calcio (tales como Micro-Cell de Johns Manville Co.), carbonato de calcio y óxido de magnesio.

Activadores de celulasa

Los activadores varían dependiendo de la variedad de las celulasas. En presencia de proteínas, cobalto y sus sales, magnesio y sus sales, y calcio y sus sales, potasio y sus sales, sodio y sus sales o monosacáridos tales como manosa y xilosa, las celulasas son activadas y sus poderes detergentes son mejorados notablemente.

Antioxidantes

Los antioxidantes incluyen, por ejemplo, terc-butil-hidroxitolueno, 4,4'-butilidenobis(6-terc-butil-3-metilfenol), 2,2'-butilidenobis(6-terc-butil-4-metilfenol), cresol monoestirenado, cresol diestirenado, fenol monoestirenado, fenol diestirenado y 1,1-bis(4-hidroxi-fenil)ciclohexano.

Solubilizadores

Los solubilizadores incluyen, por ejemplo, alcoholes inferiores tales como etanol, sales de bencenosulfonato, sales de alquilbencenosulfato inferiores tales como sales de p-toluenosulfonato, glicoles tales como propilenglicol, sales de acetilbenceno-sulfonato, acetamidas, amidas del ácido piridindicarboxílico, sales de benzoato y urea.

La composición detergente de la presente invención puede ser usada en un amplio intervalo de pH ácido a alcalino. En una realización preferida, la composición detergente de la presente invención puede ser usada en un medio de lavado detergente suavemente ácido, neutro o alcalino que tenga un pH superior a 5 a no más de aproximadamente 12.

Aparte de los ingredientes anteriores, pueden ser usados perfumes, tampones, conservantes, tintes y similares, de ser deseado, con las composiciones detergentes de esta invención. Tales componentes son empleados de manera convencional en las cantidades antes usadas en la técnica.

Cuando una base detergente usada en la presente invención está en forma de un polvo, éste puede prepararse por cualquier método de preparación conocido incluyendo un método de secado por pulverización y un método de granulación. La base detergente obtenida particularmente por el método de secado por pulverización, método de aglomeración, método de mezcla en seco o métodos de mezcla a partir de los ingredientes individuales es preferida. La base detergente obtenida por el método de secado por pulverización no está restringida en lo que concierne a las condiciones de prepeparación. La base detergente obtenida por el método de secado por pulverización son gránulos huecos que son obtenidos pulverizando una mezcla acuosa de ingredientes resistentes al calor, tales como agentes superficiales activos y estructuradores, en un espacio caliente. Después del secado por pulverización, pueden ser añadidos perfumes, enzimas, agentes blanqueantes, estructuradores alcalinos inorgánicos. Con una base altamente densa, a la base del detergente granular obtenido tal como por el método de secado por pulverización, granulación o aglomeración, también pueden ser añadidos varios ingredientes después de la preparación de la base.

Cuando la base del detergente es un líquido, puede ser una solución homogénea o una dispersión no homogénea. Para eliminar la descomposición de carboximetilcelulosa por la celulasa en el detergente, es deseable que la carboximetilcelulosa sea granulada o revestida antes de la incorporación en la composición.

Las composiciones detergentes de esta invención pueden ser incubadas con la tela que contiene celulosa, telas, por ejemplo, manchadas, en usos industriales y domésticos a temperaturas, tiempos de reacción y relaciones de aguas empleadas de manera convencional en estos ambientes. Las condiciones de incubación, es decir, las condiciones eficaces para tratar telas que contienen celulosa con composiciones detergentes de acuerdo con la presente invención, serán fácilmente averiguables por los expertos en la técnica. En consecuencia, las condiciones apropiadas eficaces para el tratamiento con los detergentes presentes corresponderán a las que usan composiciones detergentes similares que incluyen celulasas conocidas.

Detergentes de acuerdo con la presente invención pueden ser formulados además como un prelavado en la solución apropiada a un pH intermedio en el que exista una actividad suficiente para proporcionar las mejoras deseadas de suavidad, desfrisado, prevención de formación de bolitas, eliminación de fibra superficial o limpieza. Cuando la composición detergente sea una composición de preempapado (por ejemplo, prelavado o pretratamiento), tal como una composición líquida, pulverizada, gel o pasta, la enzima celulasa potenciada generalmente se emplea de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 por ciento en peso basado en el peso total de la composición de preempapado o pretratamiento. En tales composiciones, puede ser empleado un tensioactivo opcionalmente y cuando se emplee, estará generalmente presente en una concentración de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 20 por ciento en peso basado en el peso total del preempapado. El resto de la composición comprende componentes convencionales usados en el preempapado, es decir, diluyente, tampones, otras enzimas (proteasas), y similares a sus concentraciones convencionales.

Se contempla que las composiciones que comprenden enzimas de celulasa truncadas descritas en este documento puedan ser usadas en usos domésticos como una composición individual solo adecuada para restaurar el color en telas descoloridas por ejemplo, patente de EE.UU. Nº. 4.738.682, que se incorpora en este documento como referencia íntegramente) así como usarse en un quitamanchas y para desfrisar y antifrisar (prevención de formación de bolitas).

El uso de la celulasa de acuerdo con la invención puede ser particularmente eficaz en aditivos alimenticios y en el tratamiento de pulpa y papel. Estas aplicaciones industriales adicionales son descritas, por ejemplo, en la publicación PCT Nº. 95/16360 y la patente finlandesa concedida Nº. 87372, respectivamente.

Para ilustrar además la presente invención y sus ventajas, se proporcionan los ejemplos siguientes específicos para su comprensión que se ofrecen para ilustrar la presente invención y que no deben ser interpretados de ningún modo como una limitación de su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de microorganismos que producen celulasa a partir de muestras de suelo alcalino y acuosas

Muestras de fango alcalino fueron suspendidas en 5 ml de NaCl del 4% (p/v): Na_{2}CO_{3} del 1% (p/v) y fueron agitadas enérgicamente. Diluciones sucesivas en la misma solución fueron puestas en palcas en agar de extracto de suelo, pH 10 que contenía rifampicina de 50 \mug ml^{-1}.

El agar de extracto de suelo fue preparado como sigue: 1 kg de suelo de jardín se suspende en 1 litro de agua desmineralizada. La suspensión se somete a un autoclave durante 20 minutos a 120ºC. La suspensión se filtra en un filtro de fibra de vidrio (Whatman, GF/A) y los sólidos se lavan dos veces con agua desmineralizada (1 x 200 ml, 1 x 100 ml). El filtrado se completa hasta con 1 litro de agua. Un volumen igual de filtrado esterilizado se mezcla con una solución estéril de NaCl del 8% (p/v): Na_{2}CO_{3} del 2% (p/v) con agar del 2% (p/v) añadido para la solidifica-
ción.

Las placas fueron incubadas a 30ºC durante varias semanas en una caja cerrada para prevenir la evaporación. Las placas fueron examinadas periódicamente bajo el microscopio y las microcolonias fueron transferidas a agar alcalino que contenía carboximetilcelulosa del 0,3% (p/v). Los cultivos en duplicados fueron usados para detectar la actividad de celulasa inundando una de las placas con Congo Rojo del 0,1% (p/v) durante 15 minutos. Las placas fueron desteñidas con NaCl 1 M durante 30 minutos. Las cepas que mostraron un área aclarada alrededor de la colonia fueron seleccionadas como potenciales microorganismos que producen celulasa.

Las cepas que mostraron áreas aclarada fueron fermentadas en 25 ml como se describe en la publicación PCT Nº. WO 96/34108 (pág. 8) después de lo cual fue añadida CMC.

Usando el método descrito anteriormente, la cepa que produce la celulasa de la invención fue aislada y después fue caracterizada como una bacteria filamentosa. Basado en el aspecto y el análisis de la secuencia génica de 16s rARN parcial (Ejemplo 4), el microorganismo se clasifica como una especie de Streptomyces.

Fue realizado un examen morfológico de la cepa que producía la celulasa. Cuando se cultiva en agar de extracto de suelo a pH 10; la pequeña colonia inicial transparente brillante redonda se desarrolla después de unos días en un micelio aéreo de blanco a gris-blanco. Sobre el agar alcalino la cepa forma una colonia seca curtida, color crema, opaca que produce un micelio aéreo en la madurez. Al microscopio, la cepa exhibe un pseudomicelio ampliamente ramificado que se fragmenta en barras irregulares, esporas aisladas y esporas en cadenas.

Ejemplo 2 Aislamiento de ADN, transformación y expresión de celulasa

Una cepa de Actinomycete alcalifílica aislada por el Ejemplo 1 fue escogida como una cepa donadora para la expresión clonando en E. coli. El ADN cromosómico fue aislado de acuerdo con el método descrito por Saito y Miura, Biochim. Biophys. Acta., vol. 72, págs. 619-629 (1963).

El ADN cromosómico aislado se digiere parcialmente por la enzima de restricción Sau3A utilizando soluciones de enzima diluidas en serie, durante una hora a 37ºC utilizando Tampones de Reacción (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, Md., EE. UU) en las condiciones recomendadas por el proveedor. El ADN digerido se fracciona por electrofóresis en gel de agarosa y las fracciones adecuadas (2-6 kilobytes) son aisladas a partir del gel usando un Kit de Extracción de Gel QIAquick de acuerdo con el protocolo descrito por el proveedor (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, EE.UU.).

Las genotecas genómicas de genes de las cepas de Actinomycete alcalino-tolerantes son construidas en un plásmido derivado de PUC19 (Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33: 103). Los clones recombinantes son rastreadas por difusión en agar como se describe en Wood et al., Meth. Enzym., vol. 160, págs. 59-74 (1988). Las cepas que muestran áreas aclaradas alrededor de la colonia son aisladas. El ADN del plásmido del recombinante que produce la celulasa se aísla usando un Kit de Plásmido de QAprep de acuerdo con el protocolo descrito por el proveedor (QIAGEN, Inc). La secuencia de nucleótidos de un fragmento de 4,5 kilobytes es determinada a partir de ambos extremos hasta que sea identificada una secuencia que lleve la semejanza en las secuencias de celulasa conservadoras conocidas por una búsqueda en FastA frente a las bases de datos públicas. En la determinación de las secuencias conservadoras, fue secuenciado el resto del gen.

El gen aislado contiene 1056 pares de bases que codifican para una proteína precursora que tiene 371 aminoácidos incluyendo una secuencia señal de 39 aminoácidos. La proteína madura comprende 344 aminoácidos y un peso molecular calculado de 34.902 y un pl de 4,5. La secuencia de nucleótidos del gen (SEQ. ID NO: 2) que codifica para dicha celulasa y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 1) de la celulasa madura son ilustradas en las Figuras 1 y 2.

El fragmento de ADN del gen de celulasa que codifica para el gen estructural preparado como se describe anteriormente fue clonado en el vector pHPLT (véase la Figura 4). Este vector contiene al promotor y a la secuencia señal del gen de amilasa termoestable de Bacillus licheniformis y causa una alta expresión en Bacillus (véase la Figura 5). La transformación de células huésped de Bacillus competentes fue realizada con los clones de Bacillus que producen la celulasa recombinante resultantes aislados y cultivados en condiciones adecuadas para producir la celulasa clonada.

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Ejemplo 3 Purificación de celulasa

Los clones de Bacillus licheniformis que producen la celulasa del Ejemplo 2 fueron cultivados en un medio complejo que comprendía Caldo de Soja Trypton (Oxoid CM129) del 3%, 20 \mug/ml de neomicina. La purificación puede ser lograda como sigue: El caldo de fermentación se separa del líquido de cultivo por centrifugación (8000 rpm). La celulasa en el sobrenadante es precipitada con sulfato de amonio (saturación del 65%). El precipitado se disuelve en tampón de fosfato 25 mM a pH 7 + EDTA 5 mM hasta que sea alcanzada una conductividad de 7 mS/cm. Esta solución es aplicada a una columna de intercambio aniónico FF de Q-Sepharose (diámetro 5 cm, longitud 10 cm), después de lo cual la columna es lavada con tampón fosfato 25 mM a pH 7 + EDTA 5 mM hasta una absorbancia de 0,2 AU. Un gradiente de 0 a 0,5 M de NaCl en fosfato 25 mM a pH 7 es aplicado a la columna en 80 minutos seguido de un gradiente de 0,5 a 1 M de NaCl en 10 minutos. La elución puede ser realizada en el primer gradiente. Después de la elución la columna se limpia (corriente arriba) con NaOH 1 M y se reequilibra con fosfato 25 mM a pH 7 + EDTA 5 mM.

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Ejemplo 4 Caracterización de 16s rADN de Antinomycetes que produce celulasa

La secuencia de nucleótidos de las 400 primeras pares de bases de la secuencia de 16s rADN del organismo donador aislado en el Ejemplo 1 que produce la celulasa de los Ejemplos 2 y 3 fue obtenida y se proporciona en la Figura 6 (SEQ ID NO: 3). Esta secuencia fue analizada con el paquete de software de análisis de secuencia FastA para proporcionar una comparación de las secuencias en las bases de datos públicas. Los resultados del análisis ilustraron que el vecino más cercano era Streptomyces albus que tenía una identidad de 16S rADN del 97,6% en un traslapo de 422 pares de bases. El porcentaje de identidad de la fracción 16S rADN parcial de las cepas es una indicación fuerte de que la cepa representa una especie desconocidade Antinomycetes. Basado en un análisis de la secuencia de 16S rADN obtenida (en combinación con la apariencia, Ejemplo 1), el microorganismo fue clasificado como una especiede Streptomyces.

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Ejemplo 5 Propiedades de la celulasa de acuerdo con la invención

Para determinar el perfil de pH/temperatura de la celulasa de aproximadamente 36 kD de acuerdo con la invención, la actividad de la celulasa fue medida en CMC a varios valores de pH y temperaturas. Este procedimiento era el método colorimétrico para la determinación de la actividad de celulasa (total), utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato. La celulasa libera azúcares reductores, que reaccionan con "PAHBAH" a un alto pH y temperatura. Este producto de reacción puede ser medido con un espectrofotómetro. La actividad fue determinada usando una curva de calibración de glucosa.

Sustancias químicas

- CMC, viscosidad baja (Sigma C-5678, lote Nº. 23HO244)

- hidrazida del ácido p-hidroxibenzoico ("PAHBAH", Sigma H 9882)

- Monohidrato de D-glucosa (Boom 8342)

- NaH_{2}PO_{4} * 1 ac. (Merck 6346)

- H_{3}PO_{4} (85%; Merck 573)

- Ácido cítrico * 1 ac. (Merck 244)

- NaOH 4 N

- HCl 0,5 N

Tampón de incubación A (fosfato 0,01 M)

1,38 g de NaH_{2}PO_{4} * 1 ac. fueron disueltos en 800 ml de agua demi. El pH fue ajustado a 7 con NaOH 4 N y la mezcla fue rellenada hasta 1000 ml con agua demi. Finalmente el pH se comprueba y se ajusta si es necesario. Este tampón fue usado para disolver y diluir las muestras de la enzima.

Tampón de incubación B (citrato 0,1 M + fosfato 0,1 M)

23,06 g de H_{3}PO_{4} fueron disueltos en agua demi hasta un volumen final de 200 ml (= 1 M). 42 g de ácido cítrico fueron disueltos en agua demi hasta un volumen final de 200 ml (= 1 M). Una solución de 20 ml de ácido cítrico fue combinada con 20 ml de ácido fosfórico, después el volumen fue rellenado hasta 150 ml con agua demi. El pH (intervalo de 4 a 10) fue ajustado con NaOH 4 N y el volumen final se rellenó hasta 200 ml con agua demi. Este tampón fue usado para diluir la preparación de sustrato.

Tampón de incubación C (citrato 0,05 M + fosfato 0,05 M)

El tampón de incubación B fue diluido 1:1 con agua demi. El pH fue comprobado y corregido, si era necesario. Esta solución fue usada para la curva de calibración de glucosa.

Preparación de sustrato (1%)

En agitación fuerte fue añadido despacio 1 g de CMC a 100 ml de agua demi. Enérgicamente la agitación se continuó durante al menos una hora seguido de un tratamiento con un ultraturrax durante 30 segundos.

Solución de la enzima

La muestra de la enzima se disolvió y se diluyó en tampón de incubación A hasta una actividad de aproximadamente 0,05 U/ml (a mitad de camino de la curva de calibración de glucosa).

Reactivo de color (5%)

5 g de PAHBAH fueron disueltos en 80 ml de HCl 0,5 N, después de lo cual la solución fue rellenada hasta 100 ml con HCl 0,5 N. Antes del uso, una parte de la solución de PAHBAH fue diluida con cuatro partes de NaOH 0,5 N.

Curva de calibrado

Solución madre 1: 1000 mg de glucosa se disuelven en 100 ml de agua demi (10 mg/ml).

Solución madre 2: 0,5 ml de solución madre 1 se diluyen con 9,5 ml de tampón de incubación C al pH de {}\hskip2.6cm interés (0,5 mg/ml).

El esquema de titulación siguiente fue usado:

\muMol de glucosa/0,1	solución madre Nº. 2	tampón de incubación C
0	0	1000 \mul
0,05	200 \mul	800 \mul
0,1	400 \mul	600 \mul
0,15	600 \mul	400 \mul
0,2	800 \mul	200 \mul
0,25	1000 \mul	0 \mul

Procedimiento de ensayo

(1) los tubos de ensayo de los estándares de glucosa, controles, muestras y blancos fueron rellenos de 0,5 ml de sustrato (1%) y 0,5 ml de tampón de incubación B del pH deseado y fueron colocados en un baño maría a la temperatura deseada;

(2) las soluciones fueron preincubadas durante 10 minutos;

(3) cada 15 segundos fueron añadidos a los tubos con el sustrato 100 ml de estándar de glucosa, control o muestra;

(4) las soluciones fueron agitadas durante 3 segundos y vueltas a colocar en el baño maría;

(5) cada muestra fue incubada durante 30 minutos;

(6) la reacción enzimática fue parada añadiendo 3 ml del reactivo PAHBAH;

(7) las soluciones resultantes fueron agitadas durante 3 segundos y fueron colocadas en un estante fuera del baño maría;

(8) cuando todos los tubos fueron parados, fueron añadidos 100 ml de muestra a los tubos blanco de interés y fueron agitados 3 segundos;

(9) las muestras fueron colocadas durante 15 minutos en un baño de agua hirviendo;

(10) las muestras resultantes fueron enfriadas en agua del grifo fría durante 5 a 10 minutos y luego fueron agitadas de nuevo durante 3 segundos;

(11) la absorbancia de la mezcla fue medida a 410 nm con agua como referencia.

Los resultados son mostrados en la figura 3. Como se muestra en la figura 3, el grado óptimo de pH de la celulasa de 35 kD es de aproximadamente 6 a 40ºC y de 5 o menos a 60ºC.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTES: Jones, Brian E.

\hskip4.1cm

Van Der Kleij, Wilhelmus A.H.

\hskip4.1cm

Van Solingen, Piet

\hskip4.1cm

Weyler, Walter

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Novel Cellulase Producing Actinomycetes, Cellulase Produced Therefrom"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Genencor Internacional, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 925 Page Mill Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Palo Alto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94304-1013

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: FastSEQ Versión 2.0 de Windows

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 09/102.204

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-JUN-1998

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/974.041

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-NOV-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Stone, Christopher L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35,696

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: GC539

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650-846-7555

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650-845-6504

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 352 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1059 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

3

Claims (17)

1. Una celulasa que comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ. ID NO: 1 o su derivado que tiene actividad celulolítica y una identidad de secuencia de al menos el 70% respecto a la SEQ. ID NO: 1.

2. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho derivado tiene una identidad de secuencia mayor que el 75% respecto a la SEQ. ID NO: 1.

3. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho derivado tiene una identidad de secuencia mayor que el 90% respecto a la SEQ. ID NO: 1.

4. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha celulasa está codificada por una secuencia de ADN que se selecciona a partir del grupo que consiste en ADN que corresponde a la secuencia de SEQ. ID NO: 2 y ADN que tiene una identidad de secuencia de al menos el 76% respecto a la SEQ. ID NO: 2.

5. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha celulasa comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ. ID NO: 1.

6. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha celulasa es obtenible a partir de Actinomycete.

7. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha celulasa es codificada por la secuencia de ADN correspondiente a la SEQ ID NO: 2.

8. La celulasa de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha celulasa es codificada por un ADN que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% respecto a la SEQ ID NO: 2.

9. Un ADN que codifica una celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

10. Un método para producir la celulasa de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, método que comprende las etapas de:

(a)

aislar una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 9;

(b)

transformar el ADN en un organismo adecuado para su expresión;

(c)

hacer crecer dicho organismo transformado en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ADN que codifica dicha celulasa; y

(d)

recuperar de la mezcla resultante acuosa que comprende a la celulasa.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la celulasa además es purificada a partir de la mezcla acuosa.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el organismo esun Bacillus sp.

13. Una composición detergente que comprende la celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. Un aditivo de pienso animal que comprende la celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. El uso de una celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el tratamiento de tejidos.

16. El uso de una celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el tratamiento de pulpa y papel.

17. El uso de una celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como un aditivo para pienso animal.