JP2001523464A - 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法 - Google Patents

放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法

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Abstract

(57)【要約】 放線菌類によって産生される新しいセルラーゼ組成物が提供される。該セルラーゼは約３５kDの分子量を有し、４０℃で６および６０℃で６未満の最適pHを有する。前記セルラーゼをコードするDNA、該セルラーゼを産生する方法、およびそれについての用途も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 A.技術分野 本発明は、放線菌類により産生し得るセルラーゼ組成物、そのようなセルラー
ゼの産生方法およびそのようなセルラーゼの使用に関するものである。本発明は
さらに、例えば、洗剤組成物の添加物として、セルロース含有織物および繊維の
ようなテキスタイルの処理において、動物用飼料の添加物として、ベーキング(b
aking)の加工助剤として、パルプおよび紙の処理において、および高フルクトー
スのコーンシロップまたはエタノールの産生のためのでんぷんの処理において、
セルラーゼを加えると利点があると従来技術において知られている組成物中の新
しいセルラーゼの使用に関するものである。
【０００２】 B.技術の背景 セルラーゼは、セルロース中のβ―D―グルコシド結合を加水分解できる酵素 である。セルロース分解酵素は従来、３つの主要種：エンドグルカナーゼ、エキ
ソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ―グルコシダーゼ（Know
les,J.et al.,(1987),TIBTECH5,255-261）；に分類され、多数の細菌、酵母およ
び真菌によって産生されることが知られている。
【０００３】 セルロース分解酵素の使用に関して発達してきた方法の中で重要なものは、（
生物）エタノール産生のための（木）セルロースパルプの糖への分解、‘ストー
ンウォッシング’および‘バイオポリッシング’のようなテキスタイルの処理、
および洗剤組成物におけるものを含む方法である。従ってセルラーゼは、汚れの
除去、すなわちクリーニングのための洗剤組成物に有用であることが知られてい
る。例えば、英国特許出願第２０７５０２８号、同第２０９５２７５号および同
第２０９４８２６号は、洗剤がセルラーゼを含むとクリーニング効果が改善され
ることを示している。さらに、英国特許出願第１３５８５９９号は、綿含有織物
の手触りの粗さを減じるために洗剤中にセルラーゼを使用することを説明してい
る。
【０００４】 テキスタイルの処理におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、色をより鮮やか
にすることによって使用した織物を回復させる能力である。例えば、綿含有織物
を繰返し洗うと織物が灰色の色合いになるが、これは機械的作用によって引き起
こされる、時に“ピル（pills）”と称される分断されて乱雑になった小繊維に よるものと考えられている。この灰色の色合いは、特に色のついた織物で目立つ
。したがって、繊維の乱雑な一番上の層を取り除き、ゆえに織物の全体的な外観
を改善できるというセルラーゼの能力は、有用である。
【０００５】 セルラーゼの主な用途である洗剤は、一般にアルカリ性条件下で作用するので
、セルラーゼはpH７からpH１０までで優れた活性を有することが強く必要とされ
る。フミコラインソレン(Humicola insolens)およびトリコデルマリーセイ(Tric
hoderma reesei)からのような特徴のある真菌類のセルラーゼは、中性から低い アルカリ性のpHまでで十分に作用する。さらに、高アルカリ性pHでセルラーゼ活
性を示す多くの酵素は、例えば国際特許出願公開第WO９６/３４０９２号および 同第WO９６/３４１０８号に示されているように、バチルス属(Bacillus)および 他の原核生物から単離されている。従って、真菌性および細菌性セルラーゼのど
ちらも、徹底的に研究されてきた。しかしながら、放線菌類から単離される、セ
ルラーゼの第３グループは、少し注意を引いただけである。Wilson et al.,Crit
ical Reviews in Biotechnology,Vol.12,pp.45-63(1992)は、サーモモノスポラ フスカ(Thermomonospora fusca)、サーモモノスポラカーバタ(Thermomonospora
curvata)、およびミクロビスポラビスポラ(Microbispora bispora)から産生した
セルラーゼを研究し、これらのセルラーゼの多くが広い範囲のpH特性およびすぐ
れた温度安定性を示すことを説明した。同様に、Nakai et al.,Agric.Biol.Chem
.,Vol.51,pp.3061-3065(1987)およびNakai et al.,Gene,Vol.65,pp.229-238(198
8)は、アルカリ性の最適pHおよび優れた温度安定性を有するストレプトミセス(S
treptomyces)菌株のKSM−９から、アルカリ耐性セルラーゼのcasAを例示してい る。
【０００６】 放線菌類からのものを含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関
する従来技術における知識にもかかわらず、例えばテキスタイルの処理において
、洗剤組成物の成分として、パルプおよび紙の処理において、動物用飼料の補給
物として、ベーキングの加工助剤として、およびバイオマスの変換において有用
な、様々の範囲の特性を有する新しいセルラーゼが、引き続き必要とされている
。本出願人は、そのような特性を補足し、セルラーゼのそのような既知の方法に
おいて有用な、特定のセルラーゼを発見した。
【０００７】 発明の概要 本発明の目的は、洗剤に使用するために有用な温度およびpH特性を有する新し
い放線菌類由来のセルラーゼ組成物を提供することにある。
【０００８】 本発明の別の目的は、織糸、織物、および衣服において所望の質を作り出すよ
うにテキスタイルの処理に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼ
組成物を提供することにある。
【０００９】 本発明のもう１つの目的は、動物用飼料の添加物として、ベーキングの助剤と
して、パルプおよび紙の処理において、およびバイオマスの低減においての使用
に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼを提供することにある。
【００１０】 本発明のさらなる目的は、そのような新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物
を産生する方法を提供することにある。
【００１１】 本発明のさらに別の目的は、本発明の新しいセルラーゼ組成物の工業的な産生
を容易にするDNAおよびアミノ酸配列を提供することにある。
【００１２】 本発明のさらに別の目的は、洗剤において、テキスタイルの処理において、飼
料の補給物として、およびパルプおよび紙の処理においての使用に優れた特性を
有する新しいセルラーゼを提供することにある。
【００１３】 本発明によると、放線菌類または前記セルラーゼの誘導体から得られる新しい
セルラーゼが提供される。好ましくは本発明のセルラーゼは、図１（配列番号１
）によるアミノ酸配列、またはそれに対して６２％以上の配列同一性、好ましく
は７５％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する
誘導体を含む。
【００１４】 別の実施の形態によると、本発明のセルラーゼをコードするDNAを有する組成 物が提供される。好ましくは該DNAは、図２（配列番号２）によるアミノ酸配列 、またはそれに対して７２％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同
一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体およびそれによ
り産生されたセルラーゼをコードする。本発明はさらに、適切な条件下で、図２
に示されるDNAから得られるDNAプローブにハイブリッド形成するDNA、およびそ れにより産生されるセルラーゼを実施の形態とする。
【００１５】 本発明のさらに別の実施の形態によると、本発明によるセルラーゼをコードす
るDNAで適切な微生物を形質転換する方法、および該形質転換された微生物から 本発明によるセルラーゼを産生する方法が提供される。
【００１６】 本発明の特に好ましい実施の形態においては、成熟したセルラーゼは放線菌類
に由来し、SDS-PAGE上で測定すると約３５kDの分子量を有する（以下で３５kDの
セルラーゼと称する）。成熟した約３５kDのセルラーゼは、約４．５の計算され
た等電点、およびCMC上で４０℃で約６、６０℃で６未満の最適pHを有する。本 発明のセルラーゼは、少なくともpH５からpH１０までの広い活性範囲を有し、４
０℃よりも６０℃において高い活性を示す。
【００１７】 発明の詳細な説明 “誘導体”とは、天然タンパク質のCおよびN末端の一方または両方への１つ以
上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列の１つまたは多数の異なる部位での１つ
以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一方または両方の末端あるいはアミノ
酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、または天然アミノ酸配
列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、天然タンパク質か
ら誘導されたタンパク質を意味する。酵素誘導体の調製は好ましくは、天然タン
パク質をコードするDNA配列の修飾、適切な宿主への該DNA配列の形質転換、およ
び誘導酵素を形成するために修飾したDNA配列の発現により達成される。本発明 の誘導体は、前駆体酵素のアミノ酸配列（例えば本発明による野生型または天然
状態の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を有するペプチドを有し、該ペプ
チドは前駆体酵素の特有の酵素の性質を保有しているが、いくつかの特定の側面
では特性が変化している。例えば変化したセルラーゼは、最適pHまたは温度耐性
が増加するかもしれないが、特有のセルロース分解活性は保有している。
【００１８】 “宿主細胞”とは、本発明による組換えDNAベクターの宿主および発現媒体と して作用できる細胞を意味する。本発明による好ましい実施の形態においては、
“宿主細胞”はバチルス属の細胞を意味する。
【００１９】 “DNA構成体”または“DNAベクター”とは、上述された新しいセルラーゼまた
はセルラーゼ誘導体のどれでもコードする１つ以上のDNA断片を有するヌクレオ チド配列を意味する。
【００２０】 本発明の実施の形態においては、本発明のセルラーゼは放線菌類に由来する約
３５kDのセルラーゼ（成熟したタンパク質のアミノ酸配列に基づき計算した）で
ある（ここでは“３５kDのセルラーゼ”と称する）。３５kDのセルラーゼは、成
熟したタンパク質に対して約４．５の計算された等電点、およびカルボキシメチ
ルセルロース（CMC）上で４０℃で約６、６０℃で５以下の最適pHを有する。
【００２１】 ３５kDのセルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、様々なライブラリ
(GenBank,Swiss-Prot,EMBL and PIR)の利用可能な配列データと比較することに
よって分析した。本発明のDNA配列によってコードされるセルラーゼを、公表さ れたまたは既知のセルラーゼ遺伝子配列によってコードされるセルラーゼと比較
するためのデータベースの検索が、系統発生の近縁種を決定するために行われた
。発見された最も高い相同性は、サーモモノスポラフスカに由来するセルラーゼ
E5、および放線菌リビダン(lividans)からのCelAに対してであった。Pearson＆L
ipman,Proc.Nat.Acad.Sci.,Vol.85,pp.2444-2448(1988)によって示されているよ
うにTFastAプログラムを使用すると、約３５kDのセルラーゼは、E5に対して２６
８残基の重複中６１．２％の配列が同一、およびCelAに対して２４４塩基対の重
複中５４．９％の配列が同一であることが示された。TFastAデータ検索プログラ
ムは、Sequence Analysis Software Package Version 6.0(Genetic Computer Gr
oup,Univ.Wisconsin Biotechnology Center,Madison,Wisconsin 53705)において
工業的に利用できる。３５kDのセルラーゼをコードするDNA配列を、TfastAプロ グラムを使用してE5およびCelAをコードするDNAと比較することにより、E5をコ ードする遺伝子に対して１１３４塩基対の重複中７１．３％、およびCelAをコー
ドする遺伝子に対して１３０６塩基対の重複中６２．８％のヌクレオチド同一性
が示される。 したがって本発明は、図１(配列番号１)によるアミノ酸配列を有するセルラー
ゼ、またはそれに対して６２％以上の配列同一性、好ましくは７５％以上の配列
同一性、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。同様に
、本発明はさらに、図２(配列番号２)によるDNA、またはそれに対して７２％以 上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、最も好ましくは９０％以
上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００２２】 ここで、所定の断片と遺伝子のどちらがここに記載されるセルラーゼに相当し
、したがって本発明の範囲に含まれるのかを分析するために、ハイブリッド形成
を使用する。ハイブリッド形成アッセイは、実質的に以下のものである：例えば
、製造者の使用説明書によるEcoR,Hind,BamH,Cla,Kpn,Mlu,Spe,B gl,Nco,Xba,XhoおよびXma（New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA a nd Boehringer Mannheimによって提供される）などの制限酵素での切断によって
、特定の標的源からのゲノムDNAを断片化する。次に、DNA断片の分画がサイズに
よって目に見えるように、試料をアガロースゲル（例えば０．８％のアガロース
）を通して電気泳動する。ゲルを蒸留水で簡単に洗浄し、次に適切な溶液（例え
ば０．２５MのHCl）中で穏やかに振盪して脱プリン化し、３０分間穏やかに振盪
して変性し、続いて３０分間（例えば０．４MのNaOH中で）穏やかに振盪して変 性する。ゲルをpH７．０の１．５M NaCl、１M Tris中に置き、３０分間穏やかに
振盪する再生段階を含めてもよい。次にDNAを適切な陽性電荷膜、例えばMaximum
Strength Nytran Plus膜(Schleicher＆Schuell,Keene,N.H.)上に、転移溶液（ 例えば６×SSC(900mM NaCl,90mMクエン酸三ナトリウム）を使用して転移する。 通常約２時間かそれ以上で転移が完了した後、洗浄液（例えば２×SSC[２×SSC=
300mM NaCl,30mM trisodium citrate]）を使用して膜を洗浄した後室温で風乾す
る。次に膜を、（約２時間かそれ以上）適切なプレハイブリッド形成溶液（例え
ば、１００ml中にホルムアミド２０−５０ mls、２０×SSPE(１×SSPE=０．１８
M NaCl,１mM EDTA,１０mM NaH2PO4,pH７．７)２５mls、２０％SDS２．５mls、１
０mg/mlの剪断へリング精子DNA１mlを含有する水溶液） 中でプレハイブリッド 形成する。当業者にとって自明であるように、プレハイブリッド形成溶液中のホ
ルムアミドの量は、従来の方法によって得られる反応の性質によって異なっても
よい。したがってホルムアミドの量を少なくすると、より多くのホルムアミドを
使用する同じ工程よりも、ハイブリッド形成した分子を認識する点で、より完成
したゲルになる。一方で、強いハイブリッド形成バンドは、より多くのホルムア
ミドを使用することにより容易に目で認識できる。
【００２３】 図２の配列から得られるDNAプローブは、アガロースゲルでの電気泳動によっ て分離され、断片はゲルから切り取られ、切り取られたアガロースから取り出さ
れる。次に、この精製されたDNAの断片を、（例えば、DNAにP32を組み込むため に製造者の説明書によって Megaprime labeling system(Amersham Internati
onal plc,Buckinghamshire,England)を使用し）、標識する。標識されたプロー
ブを、５分間９５℃まで加熱して変性させ、上述の膜を含むプレハイブリッド形
成溶液にすばやく加える。ハイブリッド形成反応は、適切な時間および適切な条
件下、例えば穏かに振盪しながら３７℃で１８時間、行わなければならない。膜
を洗浄し（例えば２×SSC/０．３％SDS中で）、次に適切な洗浄溶液および穏か な攪拌で洗浄する。所望のストリンジェンシーは、膜（フィルター）が洗浄され
る条件に依存する。
【００２４】 特に、所定の反応のストリンジェンシー（すなわち、ハイブリッド形成の成功
に必要な相同性の度合い）は、ハイブリッド形成の後にサザンブロットからのフ
ィルタを洗浄する条件に依存するだろう。ここに定義するように、“低ストリン
ジェンシー”条件は、１５分間２０℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用 したサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む。“標準ストリンジェンシー
”条件は、３０分間３７℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用した２度目 のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに有する。
【００２５】 本発明はまた、セルラーゼを産生する方法を明らかにする。ソーダレイク（so
da lake）試料をスクリーニングして、適切なセルラーゼ産生有機体を産生し単 離することによって、セルラーゼを産生することは可能である。前記有機体は、
そのような放線菌類を増殖させるために知られている方法により増殖させること
ができる。しかしながら、適切なセルラーゼ産生菌類を単離するよりも、ここに
提供されるセルラーゼをコードするDNAで適切な宿主細胞を形質転換させること による遺伝工学技術を使用して本発明によるセルラーゼを単離し、生じた組換え
微生物を宿主細胞の増殖とセルラーゼの発現に適切な状況下で培養するほうがは
るかに簡単で効果的である。第１段階として、染色体DNAを、例えばサイトウお よびミウラの方法（Saito＆Miura,Biochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619(1963)
）または類似した方法によって供与体の放線菌菌株から得てもよい。このように
して得られる染色体DNAの制限酵素開裂により、アルカリ性セルラーゼ遺伝子を 含有するDNA断片が得られる。この目的のために、前記遺伝子領域を開裂しない なら、どの制限酵素を使用してもよい。あるいは、酵素濃度または培養時間を、
部分的な切断しかできないように低くするなら、前記遺伝子を開列する制限酵素
を使用してもよい。好ましい制限エンドヌクレアーゼはSau3Aである。生じた切 断混合物から適切な断片（４kbから１０kbまで）を単離し、DNA構成体を使用し て適切な宿主細胞を形質転換するのに使用してもよい。
【００２６】 本発明のセルラーゼをコードする遺伝子は、λ―ファージ（発現）ベクターお
よび大腸菌（E.coli）宿主細胞を使用してクローン化できる。（あるいは、保護
領域上で設計されたコンセンサス（consensus）プライマーを使用するポリメラ ーゼ連鎖反応（PCR）クローニングを使用してもよい）。本出願人は、本発明の セルラーゼをコードする遺伝子の形質転換およびE.coliでの発現が活性タンパク
質を生じることを発見した。E.coliでの第１のクローニング工程の後、本発明に
よるセルラーゼ遺伝子は、バチルス属またはストレプトミセス種のような産業上
より好ましい発現宿主、アスペルギルス属(Aspergillus)またはトリコデルマ属 のような糸状真菌、あるいはサッカロミセス属(Saccharomyces)のような酵母に 転移できる。これらの宿主有機体で得られる高レベルの発現および分泌は、後に
セルラーゼをそこから回収できる発酵培地でのセルラーゼの蓄積を可能にする。
【００２７】 セルラーゼは、必要であれば細胞分裂の後に、遠心分離またはろ過により培地
から細胞を分離し、例えば硫酸アンモニウムのような塩によって上澄またはろ液
のタンパク様の成分を沈殿させ、続いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、
アフィニティクロマトグラフィ、または同様の従来技術において知られている方
法のような様々なクロマトグラフィ法によって精製する各工程を含む従来の方法
によって培地から回収してもよい。本発明によるアルカリ性のセルラーゼの産生
のために、セルロース由来のエネルギー源を含有する培地を使用してアルカリ性
の条件下で培養するのが好ましい。
【００２８】 好ましくは、発現宿主細胞はバチルス種を含み、より好ましくはバチルスリケ
ニフォルミス(licheniformis)または枯草菌を含む。特に好ましい実施の形態に おいては、形質転換宿主は、産生物のセルラーゼが発酵液またはその凝縮液中で
タンパク分解を受けないことを確実にするために、プロテアーゼ遺伝子を欠失す
る。プロテアーゼ欠失バチルス属菌株の好ましい一般的な形質転換および発現プ
ロトコルは、ここに引用される、フェラーリ等の米国特許第５２６４３６６号に
提供されている。アスペルギルスにおける形質転換および発現は、ここに引用さ
れる、ベルカ等の米国特許第５３６４７７０号に記載されている。本出願人は、
本発明の遺伝子のバチルス属への形質転換は、天然の調節機構を使用する時に生
じる発現の点から不十分または効果的でないことを発見した。したがって、バチ
ルス種へ形質転換する時、標準の既知バチルス属由来シグナル配列および他の調
節配列と組み合わせてaprEプロモータを使用することが好ましい。形質転換宿主
細胞がアスペルギルスの時、好ましいプロモータはglaAである。
【００２９】 本発明によるテキスタイルの処理は、セルラーゼを有する組成物を使用するテ
キスタイルの処理またはクリーニングを考慮している。そのような処理は、スト
ーンウォッシュ、セルロース含有織物の手触り、感触および/または外観の変更 、またはセルロース含有織物を製造またはクリーニング/修復するときに使用す る他の技術を有するが、それに限定されるものではない。さらに、本発明の範囲
内での処理は、セルロースの織物または繊維からの“未熟な”または“死んだ”
綿の除去を考慮している。未熟な綿は、成熟した綿よりかなり不定形であり、例
えばむらのある染色などより低い質の織物の原因になる。本発明で考慮されてい
る組成物はさらに、汚れた製品のセルロース含有織物の洗浄に使用する増大セル
ラーゼ組成物を有している。例えば、増大セルラーゼは洗濯物のための洗剤組成
物に使用してもよい。本発明による有用な洗剤組成物は、予洗、浸置き、および
家庭用の色回復組成物などの特別な配合物を有している。ここに記載されている
ように、そのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮液の形態、希釈液の形
態、またはセルロース含有織物に直接施せる形態でもよい。テキスタイルのセル
ラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば欧州特許出願公開第２２００１６号お
よび英国特許出願第１３６８５９９号および同第２０９５２７５号に記載されて
いる。
【００３０】 本発明によるセルロース物質の処理はさらに、従来技術において知られている
目的のための動物用飼料、紙および/またはパルプ、食物、および穀物の処理を 考慮に入れている。例えば、セルラーゼは動物用飼料の価値をあげ、木材パルプ
の排水性を改善し、食物生産を高め、湿気のある製粉工程でも乾燥した製粉工程
でも穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００３１】 本発明による処理は、例えば緩衝剤、界面活性剤、および/または洗毛剤を含 む他の任意の成分とともに、効果的な量のセルラーゼを含有する水溶液を調製す
ることを備えている。セルラーゼ酵素組成物の効果的な量は、意図される目的に
十分なセルラーゼ酵素の濃度である。したがって、例えば本発明によるストーン
ウォッシュ組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、所望の効果、例え
ば縫い目および織物の布に使い古したおよび色あせた外観を作製することを提供
する量である。同様に、セルロース含有織物の手触りおよび/または外観を改善 するために意図される組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、手触り
の改善、例えば織物の滑らかさの改善、または外観の改善、例えば織物の外観の
鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維の除去などの適度な改善をする量で
ある。使用されるセルラーゼの量は、使用される装置、使用される工程のパラメ
ータ（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液にさらす時間等）、およびセ
ルラーゼ活性（例えば特定の溶液は、より活性の高いセルラーゼ組成物を使うと
、より活性の低いセルラーゼ組成物を使うときに比べて低いセルラーゼ濃度しか
必要としない）にも依存する。テキスタイルの処理のために加える水性の処理溶
液中のセルラーゼの的確な濃度は、上述の要因並びに所望の結果に基づいて、当
業者によって容易に決定できる。ストーンウォッシュ工程では、セルラーゼは通
常、水性処理溶液中において好ましくは約０．５ppmから約５０００ppmまでの範
囲、最も好ましくは約１０ppmから約２００ppmまでの範囲の全タンパク質の濃度
である。セルロース含有織物の手触りおよび/または外観の改善のための組成物 においては、セルラーゼは通常、水性処理溶液中において約０．１ppmから約２ ０００ppmまでの範囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２００ppmまでの範囲 の全タンパク質の濃度である。
【００３２】 好ましい処理の実施の形態においては、緩衝剤の濃度が、使用されるセルラー
ゼがその性質に依存する活性を示す範囲内で水溶液のpHを維持するのに十分であ
るように、緩衝剤を処理組成物に使用する。使用される緩衝剤の的確な濃度は、
当業者が容易に考慮できるいくつかの要因に依存する。例えば、好ましい実施の
形態においては、緩衝剤並びに緩衝剤の濃度は、最適なセルラーゼ活性のために
必要なpH範囲内に最終的なセルラーゼ溶液のpHを維持するように選択される。本
発明の増大セルラーゼの最適なpHの範囲の測定は、よく知られている技術によっ
て確かめられる。増大セルラーゼの活性範囲内のpHにおける適切な緩衝剤は、こ
の分野の当業者によく知られている。
【００３３】 セルラーゼと緩衝剤に加えて、前記処理組成物は必要に応じて界面活性剤を含
有してもよい。適切な界面活性剤は、例えば陰イオン、非イオン、および両性電
解質の界面活性剤を含む、セルラーゼおよび織物と相溶性のある界面活性剤を含
む。ここで使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状のまたは側鎖のある
アルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のあるアルキル基またはア
ルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたは
アルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等を含む。
陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのような
アルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属
イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２または３の、１から３までの
アルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性電解質の界面活性剤は
、第４のアンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性電解質の界面活性剤を
含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内に陽性および陰性の両
方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレン
エーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたはそれにアルキレンオキ
シド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエステルを有する。界面
活性剤の混合物も当業者に知られる方法で使用できる。
【００３４】 濃縮したセルラーゼ組成物は、ここで記載する方法において使用するために調
製することができる。そのような濃縮液は、好ましくは水溶液中に、上述のセル
ラーゼ組成物、緩衝剤および界面活性剤の濃縮量を含有している。そのように配
合されるとセルラーゼ濃縮液は、個々の成分の必要な濃度を有する増大セルラー
ゼ調製物をすばやく正確に調製するように水で容易に希釈することができる。水
性の濃縮液が配合されると、これらの濃縮液は、上述のようなセルラーゼ溶液中
の成分の必要な濃度に達するように希釈することができる。容易に分かるように
、そのようなセルラーゼ濃縮液により、セルラーゼ溶液の容易な配合、並びに使
用される場所への組成物の便利な輸送が可能になる。処理濃縮液は、例えば液体
、乳液、ゲル、またはペーストのような、従来技術において知られている形態に
することができる。そのような形態は、当業者によく知られている。
【００３５】 固体状のセルラーゼ濃縮を使用する場合、セルラーゼ組成物は粒子、粉末、凝
集体、または固体の円板でもよい。粒子は、洗浄液への粒子の溶解速度を下げる
物質を含有するように配合される。そのような物質および粒子は、ここに引用さ
れる米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００３６】 可能性のある組成物の使用に依存して、石、軽石、充填剤、溶媒、酵素活性化
剤、および再付着防止剤を含む他の物質もまた、所望のように、本発明のセルラ
ーゼ組成物とともに、またはその中で使用できる。
【００３７】 実施例としてストーンウォッシュ法を詳細に記述するが、記述されているパラ
メータは、他の用途、すなわち織物の手触りおよび/または外観の改善のために 、当業者によって容易に変更される。処理組成物をストーンウォッシュ組成物と
混合し、それによりセルラーゼ酵素を織物に近接させることにより、セルロース
含有織物を効果的な量のセルラーゼを含有する、セルラーゼ含有ストーンウォッ
シュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼおよび繊維を含有する水溶液を攪
拌する。処理組成物が水溶液なら、織物は溶液に直接浸される。同様に、ストー
ンウォッシュ組成物が濃縮液のときは、濃縮液を希釈してセルロース含有織物と
ともに容器に入れる。ストーンウォッシュ組成物が、例えば予洗ゲルまたは固体
の棒材のように固体形状のときは、ストーンウォッシュ組成物は、組成物を織物
または洗浄液に直接施すことにより接触させてもよい。
【００３８】 セルロース含有織物は、酵素作用がセルロース含有織物にストーンウォッシュ
された外観を与えるのに有効な条件下、ストーンウォッシュ溶液でインキュベー
トする。ストーンウォッシュ中に、例えばpH、溶液の割合、温度、および反応時
間を、ストーンウォッシュ組成物が作用する条件を最適化するために調節しても
よい。“効果的な条件”は、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反
応する、この場合はストーンウォッシュ効果を作り出す事、を可能にするｐＨ、
溶液の割合、および温度に必然的に関係する。通常、本発明のセルラーゼは親セ
ルラーゼに使用可能な条件下で使用しなければならない。しかしながら、そのよ
うな条件は当業者によって容易に確かめられる。本発明のストーンウォッシュ組
成物に効果的な反応条件は、従来技術のセルラーゼ組成物で使用するよく知られ
た方法に実質的に類似している。したがって本発明によるストーンウォッシュ組
成物を使用するために条件を最適にするのは、当業者にとって当然である。
【００３９】 ここで使用されているストーンウォッシュ中の溶液の割合、すなわち織物の重
量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の割合は、
通常デニム織物に所望のストーンウォッシュ効果を達成するのに十分な量であり
、使用される工程に依存する。好ましくは溶液の割合は、約４：１から約５０：
１まで、より好ましくは約５：１から約２０：１まで、最も好ましくは約１０：
１から約１５：１までである。
【００４０】 本発明のストーンウォッシュ組成物によるストーンウォッシュ中の反応温度は
、２つの対抗する要因によって決定される。第１に、温度を上げると通常反応速
度論を高める、すなわち反応を早くし、これは低い温度で必要とされる反応時間
に比べて反応時間を減らすことを可能にする。したがって、反応温度は通常、少
なくとも約１０℃以上である。第２に、セルラーゼは所定の反応温度を越えると
活性を失うタンパク質であり、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存す
る。したがって、反応温度を高くしすぎると、セルロース分解活性はセルラーゼ
の変性の結果として失われる。従来技術におけるセルラーゼの使用に標準的な温
度は通常、３５℃から６５℃までの範囲であり、この条件は本発明のセルラーゼ
にも適切であると思われるが、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼ
に関してよく知られている技術によって確かめるべきである。
【００４１】 反応時間は、ストーンウォッシュが行われる特定の条件に依存する。例えばセ
ルラーゼのpH、温度および濃度の全てにより、最適な反応時間が生み出される。
通常、反応時間は約５分から約５時間まで、好ましくは約１０分から約３時間ま
で、より好ましくは約２０分から約１時間までの範囲である。
【００４２】 本発明のさらに別の好ましい実施の形態によると、本発明のセルラーゼは、洗
剤組成物に使用してもよい。本発明による洗剤組成物は、予洗組成物、浸置き組
成として、または通常の洗浄またはすすぎ中のクリーニングに、有用である。好
ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果的な量のセルラーゼ、界面活性剤を有し
、必要に応じて、以下に示す他の成分を有してもよい。
【００４３】 本発明の洗剤組成物において使用されるセルラーゼの効果的な量は、セルロー
ス含有織物上でセルラーゼによって生じることが知られている所望の効果、例え
ば毛玉取り、やわらか仕上げ、非毛玉加工、表面繊維除去、非汚れ加工およびク
リーニング、などを与えるのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセ
ルラーゼは、洗剤の約１０ppmから約２００００ppmまでの範囲の濃度で使用する
。
【００４４】 洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の濃度は好ましくは、洗浄液へ
の希釈に基づいて、セルラーゼ酵素の濃度が全タンパク質の約０．０１ppmから 約１０００ppmまでの範囲、好ましくは約０．０２ppmから約５００ppmまでの範 囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２５０ppmまでの範囲になるように選択す
る。洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の量は、洗剤が洗浄液を作成
するように水に加えられて希釈される程度に依存する。
【００４５】 本発明の洗剤組成物は、例えば液体、粒子、乳液、ゲル、またはペーストのよ
うな、従来技術において知られている形状でもよい。そのような形状は当業者に
よく知られている。固体の洗剤組成物を使用する時は、セルラーゼは好ましくは
粒子の形状をしている。好ましくは粒子は、セルラーゼ保護物質を付加的に含有
するように配合される。粒子は、粒子の洗浄液への溶解速度を減らす物質を含有
するように配合しても差し支えない。そのような物質および粒子は、ここに引用
される米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００４６】 本発明の洗剤組成物は、表面活性物質、すなわち、洗剤組成物における使用で
よく知られている、陰イオン、非イオンおよび両性電解質の界面活性剤を含む界
面活性剤を使用する。
【００４７】 本発明の洗剤組成物において使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状
のまたは側鎖のあるアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のある
アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸
塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；およびアルカ
ンスルホン酸塩を含む。陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウム
およびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムの
ようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２また
は３の、１から３までのアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両
性電解質の界面活性剤は、第４アンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性
電解質の界面活性剤を含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内
に陽性および陰性の両方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、
ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたは
それにアルキレンオキシド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエ
ステル等を有する。本発明における使用に適切な界面活性剤は、ここに引用され
る、英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。そのような界面活性 剤の混合物も使用することができる。界面活性剤または界面活性剤の混合物は通
常、本発明の洗剤組成物において、全洗剤組成物の約１重量％から約９５重量％
までの範囲、好ましくは全洗剤組成の約５重量％から約４５重量％までの範囲の
量で使用される。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組
成物も、必要に応じて以下の成分を１つ以上含有することができる。
【００４８】セルラーゼ以外のヒドロラーゼ 適切なヒドロラーゼとしては、エステル結合に作用するカルボキシレートエス
テルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラー
ゼ、およびリン酸ジエステルヒドロラーゼ；グリコシル化合物に作用するグリコ
シドヒドロラーゼ；N―グリコシル化合物を加水分化する酵素；エーテル結合に 作用するチオエステルヒドロラーゼ；およびペプチド結合に作用するa―アミノ ―アシル―ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル―アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル
―アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチ
ドヒドロラーゼが挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボキシレートエ
ステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチドヒ
ドロラーゼである。適切なヒドロラーゼとしては、（１）ペプシン、ペプシンB 、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、
エンテロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロン ビン、フィブリノリシン、レニン、サブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼ
A、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼB、カリクレイン、ガストリシン
、カテプシンD、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC、ペプシンC、ア スペルギルスペプチダーゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびB 、およびアミノペプチダーゼのようなペプチジル―ペプチドヒドロラーゼに属す
るプロテアーゼ；（２）α―アミラーゼ、β―アミラーゼ、グルコアミラーゼ、
インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナ
ーゼのようなグリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼはこの群から
除かれている）が挙げられる。これらの中で好ましいのは、α―アミラーゼおよ
びβ―アミラーゼである。それらは酸性で、中性の系に作用するが、細菌から得
られるもの；（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラー
ゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼは、
アルカリ性の系で高い活性を示す。それらの中で特に効果的なのは、リパーゼで
ある。
【００４９】 セルラーゼ以外のヒドロラーゼは、目的に必要なだけ洗剤組成物に入れられる
。好ましくは、精製したタンパク質に関して０．００１重量%から５重量％まで の範囲、より好ましくは０．０２重量%から３重量％までの範囲で入れられる。 この酵素は、粗酵素だけからなる粒子の形状で、または洗剤組成物中の他の成分
と組合せて、使用される。粗酵素の粒子は、精製された酵素が粒子の中で０．０
０１重量%から５０重量％までの範囲になる量で使用される。粒子は、０．００ ２重量%から２０重量%までの範囲、好ましくは０．１重量%から１０重量％まで の範囲で使用される。セルラーゼと同様に、これらの粒子は、酵素保護物質およ
び溶解遅延剤を含有するように作成してもよい。
【００５０】陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩 そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂
肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩、α―スルホ脂肪酸塩
またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、３から４
までのアルキル置換基を有する第４アンモニウム塩、および１つまでのフェニル
置換アルキル置換基を有する。好ましい陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸
塩は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。 その組成物は、そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を約１重量
%から約２０重量％まで含有していてもよい。
【００５１】ビルダー A. 二価金属イオン封鎖剤 前記組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸
塩、アミノ酸の塩、アミノポリアセチレート高分子電解質、非解離ポリマ、ジカ
ルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩の、アルカリ金属塩およびアルカノールア
ミン塩からなる群より選択される１つ以上のビルダーの組成物を、約０重量%か ら約５０重量％まで含有してもよい。好ましい二価金属イオン封鎖剤は、ここで
引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。
【００５２】B. アルカリまたは無機電解質 前記組成物は、アルカリまたは無機電解質としての以下の化合物：ケイ酸塩、
炭酸塩、および硫酸塩並びに、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モ
ノエタノールアミン、およびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリ
の１つ以上のアルカリ金属塩の組成物に基づき、約１重量%から約５０重量％ま で、好ましくは約５重量%から約３０重量％までを含有してもよい。
【００５３】再付着防止剤 前記組成物は、再付着防止剤としての以下の化合物：ポリエチレングリコール
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセル
ロースの１つ以上を約０．１重量%から約５重量％まで含有してもよい。
【００５４】 それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび/またはポリエチレングリ コールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提
供する。
【００５５】漂白剤 過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム/ 過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム/過酸化水素付加物および/またはスル
ホン酸フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような感光性の漂白染料、
のような漂白剤と組み合わせて本発明のセルラーゼを使用すると、さらに洗浄効
果が改善される。同様に、欧州特許第６８４３０４号に記載されている漂白剤お
よび漂白触媒を使用してもよい。
【００５６】青味剤および蛍光染料 必要なら、様々の青味剤および蛍光染料を前記組成物に含んでもよい。好まし
い青味剤および蛍光染料は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A 号に開示されている。
【００５７】ケーキング防止剤 以下のケーキング防止剤：p―トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩 、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく砕いたシリカ、非結晶のシリカ、
土、ケイ酸カルシウム（Micro-Cell of Johns Manville Co.）、炭酸カルシウム
、および酸化マグネシウムを、粉末状の洗剤に混合してもよい。
【００５８】セルラーゼ活性化剤 活性化剤はセルラーゼの種類によって異なる。タンパク質、コバルトおよびそ
の塩、マグネシウムおよびその塩、およびカルシウムおよびその塩、カリウムお
よびその塩、ナトリウムおよびその塩、またはマンノースおよびキシラーゼのよ
うな単糖類の存在化ではセルラーゼは活性化され、その洗浄力は著しく改善され
る。
【００５９】酸化防止剤 酸化防止剤は、例えば第３―ブチル―ヒドロキシトルエン、４，４’―ブチリ
デンビス（６―第３―ブチル―３―メチルフェノール）、２，２’―ブチリデン
ビス（６―第３―ブチル―４―メチルフェノール）、モノスチレンクレゾール、
ジスチレンクレゾール、モノスチレンフェノール、ジスチレンフェノール、およ
び１，１―ビス（４―ヒドロキシ―フェニル）シクロヘキサンを有する。
【００６０】可溶化剤 可溶化剤は、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸
塩、p―トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プ ロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼンスルホン酸塩、アセ
トアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素を有する。
【００６１】 本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性まで広いpH範囲で使用することが
できる。好ましい実施の形態においては、本発明の洗剤組成物は、５以上から約
１２までのpHを有する弱酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤洗浄媒質中で使用
することができる。
【００６２】 上述の成分の他に、所望なら本発明の洗剤組成物とともに、香料、緩衝剤、防
腐剤、染料等を使用できる。そのような成分は、従来技術でこれまで使用されて
きた量で使用される。
【００６３】 本発明で使用される洗剤の主成分が粉末の形状の場合、吹きつけ乾燥法および
造粒法を含むどの既知の調製法によって調製してもよい。特に、吹きつけ乾燥法
、凝集法、乾燥攪拌法、または非塔式経路（non-tower route）法によって得ら れる洗剤の主成分が好ましい。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成分は
、調製条件に関して限定されない。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成
分は、界面活性物質およびビルダーのような耐熱性成分の水性スラリーを熱した
場所に吹き付けることによって得られる中空の粒子である。吹きつけ乾燥の後、
香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルダーを加えてもよい。吹きつけ乾燥造
粒または凝集法によって得られるような高密度の粒状洗剤の主成分とともに、主
成分の調製の後、様々の成分を加えてもよい。
【００６４】 洗剤の主成分が液体の場合、均質の溶液または不均質のコロイド分散のどちら
でもよい。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐ
ために、カルボキシメチルセルロースは組成物に加える前に粒状化するかコーテ
ィングするのが望ましい。
【００６５】 本発明の洗剤組成物は、従来どおり使用される温度、反応時間、および液体の
割合で、産業上のおよび家庭での使用において、セルロース含有織物、例えば汚
れた織物とともにインキュベートしてもよい。インキュベートの条件、すなわち
本発明による洗剤組成物を使用するセルロース含有織物の処理に効果的な条件は
、当業者によって容易に確かめられる。したがって、本発明の洗剤を使用する処
理に効果的な条件は、既知のセルラーゼを含む類似した洗剤組成物を使用する条
件に対応する。
【００６６】 本発明による洗剤は、十分な活性が存在して所望の改善であるやわらか仕上げ
、毛玉取り、非毛玉加工、表面繊維除去、または洗浄を提供する中間pHにおいて
適切な溶液中、予洗として追加で配合してもよい。洗剤組成物が、液体、スプレ
ー、ゲル、またはペーストの浸置き（例えば予洗または前処理）組成物の場合、
増大セルラーゼ酵素は通常、浸置きまたは前処理組成物の総重量に基づいて、約
０．０００１重量％から約１重量％までで使用される。その様な組成物では、界
面活性剤を必要に応じて使用してもよく、使用する場合通常、浸置きの総重量に
基づいて約０．００５重量％から約２０重量％までの濃度で存在する。組成物の
残りは、浸置きで使用される従来の成分、すなわち従来の濃度での希釈液、緩衝
剤、他の酵素（プロテアーゼ）等を含む。
【００６７】 ここに記載されるセルラーゼ酵素を有する組成物は、それだけで色あせた織物
に色を戻すのに適切な組成物（例えばここで引用される米国特許第４７３８６８
２号を参照）として家庭用に、並びに、汚れの除去においておよび毛玉取り、非
毛玉加工のために、使用できると考えられる。
【００６８】 本発明によるセルラーゼの使用は、飼料添加物、およびパルプおよび紙の処理
において特に効果的である。これらの付加的な産業上の方法は、例えば国際特許
出願公開第WO９５/１６３６０号およびフィンランド国特許第８７３７２号にそ れぞれ記載されている。
【００６９】 本発明およびそれについての利点をさらに説明するために、以下の特定の実施
例はそれらが本発明を説明するために提供されたものであり、発明の範囲を限定
するものとして解釈されるべきではないということの理解とともに提供される。
【００７０】 実施例 実施例１ セルラーゼ産生微生物のアルカリ性の土および水の試料からの単離 アルカリ性の泥の試料を４%(w/v)NaCl：１%(w/v)Na２CO３５ml中に懸濁させ、
激しく振盪した。同じ溶液の連続的な希釈液を、リファンピシン５０μg ml−１ を含有するpH１０の土抽出寒天培地上で培養した。
【００７１】 土抽出寒天培地は以下のように調製した：１kgの庭土を１リットルの脱塩水中
に懸濁させる。懸濁液を、１２０℃で２０分間加圧滅菌する。懸濁液をガラス繊
維フィルタ（Whatman,GF/A）上でろ過し、固体を脱塩水（１×２００ml、１×１
００ml）で２度洗浄する。ろ液を水で１リットルにする。 凝固のために加えた ２%(w/v)の寒天を有する８%(w/v)NaCl：２%(w/v)Na２CO３の滅菌溶液と、同体積
の滅菌したろ液を混合する。
【００７２】 プレートを、蒸発を防ぐために密閉した箱の中で数週間、３０℃でインキュベ
ートした。プレートは定期的に実体顕微鏡で検査し、０．３%(w/v)カルボキシメ
チルセルロースを含有するアルカリ性の寒天培地に微小コロニーを移した。プレ
ートの１つを０．１%(w/v)コンゴレッド（Congo Red）に１５分間浸すことによ り、デュプリケート培養を使用してセルラーゼ活性を検出した。プレートは、１
M NaClで３０分間汚れを取り除いた。コロニーの周りに透明な区域を示す菌株を
、微生物を産生する可能性のあるセルラーゼとして選択した。
【００７３】 透明な区域を示す菌株は、国際特許出願公開第WO９６/３４１０８号（８ペー ジ）に記載されているように２５ml中で発酵させ、その後CMCを加えた。
【００７４】 上述の方法を使用し、本発明のセルラーゼを産生する菌株を単離し、さらに糸
状バクテリアと認めた。外観および部分的な１６s rRNA遺伝子配列分析（実施例
４）に基づいて、微生物をストレプトミセス属の種類と分類した。
【００７５】 セルラーゼを産生する菌株を形態学的に検査した。pH１０で土抽出寒天培地上
で培養すると、最初小さくて丸い輝く透明のコロニーは、数日後、白色から灰色
がかった白色の気菌糸になった。アルカリ性の寒天培地上では、菌株は成熟する
と、気菌糸を産生する、乾いて堅い、クリーム色の、不透明なコロニーを形成す
る。顕微鏡下では菌株は、断片が不規則な杆状体、分離した胞子、および連鎖し
た胞子になる、広く枝分かれした偽菌糸体を示す。
【００７６】 実施例２ セルラーゼのDNAの単離、形質転換、および発現 実施例１によって単離したアルカリ性の放線菌類菌株を、E.coli.での発現ク ローニングのための供与体菌株として選択した。染色体DNAを、Saito＆Miura,Bi
ochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619-629(1963)に記載されている方法によって 単離した。
【００７７】 単離された染色体DNAを、提供者によって推薦される条件下、反応緩衝剤（Gib
co BRL Life Technologies,Gaithersburg,Md.,USA）を使用して３７℃で１時間 、連続的に希釈した酵素溶液を使用して制限酵素Sau3Aによって部分的に切断し た。切断された DNAをアガロースゲル電気泳動によって分離し、好ましい断片（
２kbから６kbまで）を、供給者（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA,USA）によって記 載されるプロトコルによりQIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルから単 離する。
【００７８】 アルカリ耐性放線菌類菌株のゲノム遺伝子ライブラリは、pUC１９由来のプラ スミド中で作製される（Yanisch-Perron,C.et al.,(1985)Gene 33:103）。組換 え型クローンは、Wood et al.,Meth.Enzym.,Vol.160,pp.59-74(1988)によって記
載されているように、寒天拡散法によってスクリーニングする。コロニーの周り
に透明な区域を示す菌株を単離する。セルラーゼ産生組換え体のプラスミドDNA を、提供者（QIAGEN Inc.）によって記載されたプロトコルによりQIAprep Plasm
id Kitを使用して単離する。４．５kbの断片のヌクレオチド配列は、公開されて
いるデータベースに対するFastA検索によって、既知の保存されたセルラーゼの 配列に類似性を有する配列が同定されるまで、両端から測定する。保存された配
列の測定に基づいて、遺伝子の残りの部分を塩基配列決定する。
【００７９】 単離された遺伝子は、３９のアミノ酸のシグナル配列を含む３７１のアミノ酸
を有する前駆体タンパク質をコードする１０５６塩基対を含有する。成熟したタ
ンパク質は、３４４のアミノ酸、推定３４９０２の分子量、および４．５の等電
点からなる。前記セルラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号
２）および成熟したセルラーゼの推定アミノ酸配列（配列番号１）が図１および
図２に示されている。
【００８０】 上述のように調製された構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のDNA断片 を、ベクターpHPLT（図４参照）でクローン化した。このベクターは、バチルス リケニフォルミスの熱安定アミラーゼ遺伝子のプロモータおよびシグナル配列を
含有し、バチルス属で高い発現を引き起こす（図５参照）。コンピテントバチル
ス宿主細胞の形質転換を、単離された組換えセルラーゼ産生バチルス属のクロー
ンを使用して行い、クローン化されたセルラーゼの産生に好ましい条件下で培養
した。
【００８１】 実施例３ セルラーゼの精製 実施例２からのセルラーゼ産生バチルスリケニフォルミスのクローンを、Tryp
ton Soya Broth(Oxoid CM129)３%、２０μg/mlのネオマイシンを有する複合培地
中で培養した。精製は、以下のようにして行ってもよい：発酵液を、遠心分離（
８０００rpm）により培養液から分離する。上澄中のセルラーゼを、硫酸アンモ ニウム（６５%の飽和度）で沈殿させる。沈殿物を、７mS/cmの導電率が達成され
るまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAに溶解する。この溶液をQ-Seph
arose FF（直径５cm、長さ１０cm）Anion Exchange カラムに入れ、その後カラ ムを、０．２AUの吸光度になるまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAで
洗浄する。pH７の２５mMリン酸塩中で、０Mから０．５Mまでの濃度勾配のNaClを
８０分間カラムに注ぎ、続いて０．５Mから１Mまでの濃度勾配のNaClを１０分間
加える。溶出は、最初の濃度勾配でしてもよい。溶出の後、カラムを１MのNaOH で洗浄し（上向きに）、pH７の２５mMリン酸緩衝剤と５mMのEDTAで再び平衡させ
る。
【００８２】 実施例４ セルラーゼ産生放線菌類からの１６S rDNAの説明 実施例２および実施例３のセルラーゼを産生する、実施例１において単離され
た供与体の有機体の１６S-rDNAの最初の４００bpsのヌクレオチド配列を得た。 これを図６に提供する（配列番号３）。この配列は、公開されているデータベー
ス中の配列との比較を提供するFastA配列分析ソフトウェアパッケージを使用し て分析した。分析の結果は、最も近い近縁種は、４２２塩基対の重複中９７．６
%の１６S rDNA同一性を有するストレプトミセスアルバス（albus）であった。菌
株の部分的な１６S rDNA断片の同一性のパーセンテージは、菌株が放線菌類の未
知の種を表すことを強く示している。得られた１６S rRNA配列の分析に基づいて
（実施例１の外観と組合せて）、微生物をストレプトミセス類の種と分類した。
【００８３】 実施例５ 本発明によるセルラーゼの特性 本発明による約３６kDのセルラーゼのpH/温度の特性を測定するために、セル ラーゼの活性を様々のpHおよび温度値においてCMCで測定した。この工程は、基 質としてカルボキシメチルセルロース（CMC）を使用する、（全）セルラーゼ活 性を測定する比色定量法である。セルラーゼは、高いpHおよび温度で“PAHBAH”
と反応する還元糖を遊離させる。この反応生成物は、分光光度計で測定できる。
活性は、グルコースの検定曲線を使用して測定した。
【００８４】化学物質 ： −低粘度CMC（Sigma C-5678,batch#23HO244） −p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（“PAHBAH”,Sigma H-9882） −D-グルコースモノヒドレート（Boom 8342） −NaH2PO4*１aq（Merck 6346） −H3PO4（85%;Merck 573） −クエン酸*1aq（Merck 244） −4N NaOH −0.5N HClインキュベート緩衝剤A（0.01Mリン酸塩）： 1.38gのNaHPO4*1aqを、800mlの脱塩水(demi water)に溶解する。pHを4NのNaOHで
7に調節し、混合液を脱塩水で1000mlにした。最後にpHをチェックし、必要なら 調節した。この緩衝剤は、酵素試料の溶解および希釈に使用した。
【００８５】インキュベート緩衝剤B（0.1Mクエン酸塩＋0.1Mリン酸塩）： 23.06gのH3PO4を、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。42gのクエン酸を
、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。20mlのクエン酸溶液を20mlのリン
酸と混合し、脱塩水で150mlにした。pHを4NのNaOHで（4から10までの範囲に）調
節し、体積を脱塩水で200mlにした。この緩衝剤は、基質製剤の溶解に使用した 。
【００８６】インキュベート緩衝剤C（0.05Mクエン酸塩＋0.05Mリン酸塩）： インキュベート緩衝剤Bを、脱塩水で1:1に希釈した。pHをチェックし、必要なら
補正した。この溶液は、グルコース検定曲線に使用した。
【００８７】基質製剤（1%）： 強く攪拌しながら1gのCMCを100mlの脱塩水にゆっくりと加えた。激しい攪拌を少
なくとも１時間続け、次にウルトラチュラックス（ultraturrax）で３０秒間処 理した。
【００８８】酵素溶液： 酵素試料を、約0.05U/mlの活性になるまで、インキュベート緩衝剤Aに溶解し希 釈した（グルコース検定曲線）。
【００８９】染料試薬（5%）： 5gのPAHBAHを、0.5NのHCl 80mlに溶解し、溶液を0.5NのHClで100mlにした。使用
前に、PAHBAH溶液１に対し0.5NのNaOHを４の割合で希釈した。
【００９０】検定曲線： 保存溶液#1：1000mgのグルコースを100mlの脱塩水に溶解した（10mg/ml）。保存
溶液#2：0.5mlの保存溶液#1を、当該pHのインキュベート緩衝剤C 9.5mlで希釈し
た（0.5mg/ml）。
【００９１】 以下の滴定表を使用した：
【表１】 アッセイ工程： （１） 標準グルコース、対照試料、試料、およびブランクの試験管を基質（1% ）０．５mlおよび所望のpHのインキュベート緩衝剤Bで満たし、所望の温度の浴 槽中に置いた； （２） 溶液を１０分間プレインキュベートした； （３） １５秒ごとに１００μlの標準グルコース、対照試料、または試料を基質
とともに試験管に加えた； （４） 溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽に戻した； （５） それぞれの試料を３０分間インキュベートした； （６） ３mlのPAHBAH試薬を加えることにより、酵素反応を停止した； （７） 生じた溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽の外のラックに置いた； （８） 全ての試験管が停止したら、１００μlの試料を当該ブランク試験管に加
え、３秒間ボルテックスした； （９） 試料を、１５分間沸騰した浴槽中に置いた； （１０）生じた試料を５分間から１０分間冷たい水道水で冷却し、３秒間再びボ
ルテックスした； （１１）混合液の吸光度を、水を対照として４１０nmで測定した。
【００９２】 結果が図３に示されている。図３に示されているように３５kDのセルラーゼの
最適pHは４０℃で約６、６０℃で５以下である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による約３５kDのセルラーゼの推定アミノ酸配列を示す図。コードされ
た文字は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comission (GenBank Patentln
User Manual，PC−DOS／MS−DOS Version,November 1990に示されている)によ る(配列番号１)
【図２】 本発明による約３５kDのセルラーゼをコードするDNA配列を示す図(配列番号２
)
【図３】 ４０℃と６０℃における、本発明による約３５kDのセルラーゼのpH/活性を示 すグラフ
【図４】 pHPLTベクターを示す図
【図５】 pHP11AG3ベクターを示す図
【図６】 本発明のセルラーゼが得られる放線菌類の16s RNA配列を示す図(配列番号３)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｄ０６Ｌ 1/12 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ ４Ｌ０３１ Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ２１Ｃ 5/00 ４Ｌ０５５ Ｄ２１Ｃ 5/00 (Ｃ１２Ｎ 9/42 //(Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/42 (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／１０２，２０４ (32)優先日 平成10年６月22日(1998．6．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ファン デル クレェイ，ウィルヘルムス アー ハー オランダ国 ＮＬ−2671 デーヘー ナー ルドウェーク ホーヘ ブールト 26 (72)発明者 ファン ソリンヘン，ピーテル オランダ国 ＮＬ−2671 ヴェーゼット ナールドウェーク ロッシニ 16 (72)発明者 ウェイラー，ウォルター アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94131 サンフランシスコ レイドリー ストリート 23 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA17 BA12 CA01 DA07 EA04 GA11 HA03 4B035 LC03 LC04 LC11 LG51 LP41 4B050 CC03 DD02 FF03E FF11E LL02 LL04 LL10 4B063 QA01 QA18 QQ05 QQ06 QQ42 QR32 QR55 QS34 4H003 BA09 BA12 BA15 BA20 DA01 EC03 FA08 FA22 FA47 4L031 AA02 AB31 BA39 CA17 4L055 AG42 AH50 FA01

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１に提供されるアミノ酸配列を有するセルラーゼ、
    またはセルロース分解活性を有する該セルラーゼの誘導体。
  2. 【請求項２】 前記誘導体が、配列番号１に対して少なくとも５０%の配列 同一性を有することを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
  3. 【請求項３】 前記誘導体が、配列番号１に対して少なくとも７０%の配列 同一性を有することを特徴とする請求項２記載のセルラーゼ。
  4. 【請求項４】 前記セルラーゼが、配列が配列番号２に一致するDNA、配列 番号２に対して少なくとも７６%の配列同一性を有するDNA、および低ストリンジ
    ェンシーの条件下で配列番号２による配列の少なくとも一部を有する第２のDNA 分子にハイブリッド形成するDNA、からなる群より選択されるDNA配列によりコー
    ドされることを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
  5. 【請求項５】 前記セルラーゼが、配列番号１に提供されるアミノ酸配列を
    有することを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
  6. 【請求項６】 前記セルラーゼが、放線菌類から得られることを特徴とする
    請求項１記載のセルラーゼ。
  7. 【請求項７】 請求項１によるセルラーゼをコードするDNA。
  8. 【請求項８】 請求項２によるセルラーゼをコードするDNA。
  9. 【請求項９】 請求項３によるセルラーゼをコードするDNA。
  10. 【請求項１０】 請求項４によるセルラーゼをコードするDNA。
  11. 【請求項１１】 セルラーゼを産生する方法であって、 （a) 請求項７によるDNA分子を単離し、 （b）該DNAを発現させるため適した有機体中に形質転換し、 （c）前記セルラーゼをコードする前記DNAの発現に好ましい条件下で、前記形質
    転換した有機体増殖させ、 （d）前記セルラーゼを含む水性混合物を集める、 各工程を含むことを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 前記セルラーゼがさらに、前記水性混合物から精製される
    ことを特徴とする請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記有機体がバチルス亜種を含むことを特徴とする請求項
    １１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 微生物中のセルラーゼをコードするDNAを同定する方法で あって、 （a）前記DNAが第２のDNAへのハイブリッド形成に基づき検出できるシグナルを 産生できることを特徴とする配列番号２に一致する配列の少なくとも一部を有す
    るDNAプローブを調製し、 （b）前記第２のDNAを前記有機体から単離し、前記第２のDNAを無作為に切断し てDNA断片ライブラリを産生することにより、前記微生物から前記第２のDNAを調
    製し、 （c）低ストリンジェンシーの条件下で前記DNAプローブを前記第２のDNAと反応 させ、 （d）（ｃ）からのハイブリッド形成したDNA断片を検出して単離し、 （e）前記DNAプローブにハイブリッド形成する前記第２のDNAの前記断片に一致 する全長遺伝子を得る、 各工程を含むことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４により単離される遺伝子によってコードされる
    セルラーゼを産生する方法であって、 （a）前記DNAを発現のために適した有機体中に形質転換し、 （b）前記DNAに含まれる遺伝子の発現に適した条件下で前記形質転換された有機
    体を増殖させ、 （c）前記セルラーゼを有する水性混合物を集める、 各工程を含むことを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１によるセルラーゼを有する洗剤組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項４によるセルラーゼを有する洗剤組成物。
  18. 【請求項１８】 請求項１によるセルラーゼの動物用飼料の添加物としての
    使用方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１によるセルラーゼのテキスタイルの処理のための
    使用方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１によるセルラーゼのパルプおよび紙の処理におけ
    る使用方法。
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