CN108165542A

CN108165542A - 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

Info

Publication number: CN108165542A
Application number: CN201810010824.5A
Authority: CN
Inventors: 汤岚; 刘晔; 段俊欣; 吴文平; R.克雷默
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2018-06-15
Also published as: EP2483296B1; US20150047075A1; US9765372B2; DK2483296T3; ES2551141T3; US8865446B2; US20110078831A1; WO2011041504A1; CA2775353A1; CN102695720A; US8586827B2; EP2977382A3; EP2483296A1; US20180030490A1; CN102695720B; BR112012007375A2; EP2977382A2; US20140075603A1

Abstract

本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。

Description

具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

本发明是基于申请日为2010年9月30日，申请号为“201080054192.4” (国际申请号为PCT/US2010/050855)，发明名称为“具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸”的专利申请的分案申请。

关于对在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明

本发明部分是在能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

相关领域描述

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β- 连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。

本领域中有利的是改进酶法降解木素纤维素原料的能力。

WO 2005/074647公开了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和它的多核苷酸。WO 2005/074656公开了来自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽和它的多核苷酸。WO 2007/089290公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的多肽和它的多核苷酸。

本发明提供具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：

(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交： (i)SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 5的成熟多肽具有至少80％同一性；和

(d)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及编码具有纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：

(a)多核苷酸，其编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6 的成熟多肽具有至少80％同一性；

(b)多核苷酸，其在至少高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；

(c)多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％同一性，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％同一性；和

(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，和产生具有纤维素分解增强活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制具有纤维素分解增强活性的多肽在细胞中表达的方法，所述方法包括：对细胞施用或在细胞中表达双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在存在本发明具有纤维素分解增强活性的多肽的情况下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个优选的方面，本方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在存在本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的情况下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中在存在本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的情况下，用酶组合物糖化纤维素材料。在一个优选的方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在一个方面，本发明进一步包括从发酵回收发酵产物。

本发明还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

本发明还涉及用于产生具有纤维素分解增强活性的多肽的方法，其包括： (a)在有助于产生该多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码具有纤维素分解增强活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

本发明进一步涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6 的氨基酸1至23，或者由SEQID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。

附图简述

图1显示具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)CBS 181.67 GH61A多肽基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。

图2显示具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61B 多肽基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。

图3显示具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61C 多肽基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:5和6)。

图4显示pGH61a51486的限制图谱。

图5显示pGH61D14YF的限制图谱。

图6显示pGH61D14YH的限制图谱。

图7显示具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61A 多肽对PCS水解的作用。

图8显示具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61B 多肽对PCS水解的作用。

定义

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽” 意指使具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg 总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L (Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维素分解增强活性的优选至少20％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和 BairochA.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β- 葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由 International Union of Pure and AppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987, Measurement of cellulase activities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的 PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO₄，50℃，72小时，通过HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉 (lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006, Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纤维素 (CMC)水解来确定内切葡聚糖酶活性。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends inBiotechnology 15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288描述的方法针对荧光性二糖衍生物 4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷来测定纤维二糖水解酶活性。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等,2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum: production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42: 55-66描述的基本方法，但如本文中所述采用不同的条件来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在40℃,pH 5，在含有0.01％20 的100mM柠檬酸钠pH 5中由作为底物1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

木聚糖降解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定义为水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune, FEBS Letters 580(19):4597-4601；以及Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch, Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichodermareesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木 (larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992, Interlaboratory testing of methods for assay ofxylanase activity,Journal of Biotechnology 23(3):257-270中所述。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates,Anal.Biochem 47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”在本文中定义为1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶 (1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在50℃，pH 5从每升2g桦木木聚糖作为底物在含有0.01％20的50mM乙酸钠pH 5中水解的起始时间过程中每分钟产生1.0μmol还原糖(以葡萄糖当量(glucose equivalents)测定，如 Lever,1972,A new reaction for colorimetricdetermination of carbohydrates,Anal. Biochem 47:273-279所述)。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”在本文中定义为β-D木糖苷木糖水解酶 (β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶活性定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠pH 5 中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚。

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”在本文中定义为羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α- 萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEEN^TM 20的50mM 乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH 5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”在本文中定义为4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰 (阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶活性等于能够在pH 5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”在本文中定义为α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言， α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能够在pH 5，40℃每分钟释放出 1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”在本文中定义为 α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶活性对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow)在40℃进行30分钟，接着通过 HPX-87H柱层析的阿拉伯糖分析来确定的。

纤维素材料：纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995, 于Handbook on Bioethanol(CharlesE.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis, Washington D.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology 50:3-16；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25:695-719；Mosier等,,1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume 65,pp.23-40, Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。

在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。

在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。

在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。

纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的传统方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。

预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆“在本文中定义为通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多 1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，SignalP软件(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至22是信号肽，根据该预测，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸23至251。在另一个方面，SignalP 软件预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至18是信号肽，根据该预测，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸19至349。在另一个方面，SignalP软件预测SEQ ID NO:6的氨基酸1至23是信号肽，根据该预测，成熟多肽是SEQ ID NO:6 的氨基酸24至436。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有纤维素分解增强活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，SignalP软件 (Nielsen等,1997,见上)预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至66编码信号肽，根据该预测，成熟多肽编码序列是SEQID NO:1的核苷酸67至868。在另一个方面，SignalP软件预测SEQ ID NO:3的核苷酸1至54编码信号肽，根据该预测，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099。在另一个方面，SignalP软件预测SEQ ID NO:5的核苷酸1至69编码信号肽，根据该预测，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸70至1483。

同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453) 使用EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics16:276-277)的Needle程序来测定，优选3.0.0版或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度通过 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)使用EMBOSS 软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,见上文)的Needle程序来测定，优选3.0.0版或更高版本。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用 -nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为在用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQID NO:6的具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌多肽或其成熟多肽进行的tfasty搜索(Pearson,W.R.,1999,于Bioinformatics Methods and Protocols中,S.Misener和S.A.Krawetz编,pp.185-219)中E值(或期望分数)小于0.001的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4或SEQID NO:6的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纤维素分解增强活性。在一个优选方面，所述片段含有SEQ IDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，并且最优选至少210个氨基酸残基。在另一个优选的方面，所述片段含有SEQ ID NO:4的成熟多肽或其同源序列的至少270个氨基酸残基，更优选至少290个氨基酸残基，并且最优选至少310 个氨基酸残基。在另一个优选的方面，所述片段含有SEQ ID NO:6的成熟多肽或其同源序列的至少340个氨基酸残基，更优选至少360个氨基酸残基，并且最优选至少380个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个 (几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽片段。在一个优选方面，所述亚序列含有SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，并且最优选至少630个核苷酸。在另一个优选的方面，所述亚序列含有SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少810个核苷酸，更优选至少870 个核苷酸，并且最优选至少930个核苷酸。在一个优选方面，所述亚序列含有SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1020个核苷酸，更优选至少1080个核苷酸，并且最优选至少1140个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA 的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA 没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4或SEQ IDNO:6的成熟多肽的多肽，或者由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 或SEQ ID NO:6的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有纤维素分解增强活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5 的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或它们的同源序列的核苷酸序列来获得。

发明详述

具有纤维素分解增强活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有纤维素分解增强活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

在另一个第一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有纤维素分解增强活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其与 SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

在另一个第一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有纤维素分解增强活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其与 SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸23至251，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸23至251。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:2的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸23至251或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:2的氨基酸23至251组成。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:4的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQ IDNO:4的氨基酸19至349，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸19至349。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:4的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:4的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸19至349或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:4的氨基酸19至349组成。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:6的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQ IDNO:6的氨基酸24至436，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸24至436。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:6的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸24至436或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ IDNO:6的氨基酸19至349组成。

在第二个方面，本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选高严格条件下，并且更优选非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列， (ii)包含于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii) 的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor,New York)。

在另一个第二个方面，本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选高严格条件下，并且更优选非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链。

在另一个第二个方面，本发明涉及具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选高严格条件下，并且更优选非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的 Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA 杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400 个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，例如，长度为优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800 个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选 DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维素分解增强活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5，或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸67至868。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ IDNO:1。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)DSM 22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM 22656中的质粒pGEM-T-GH61a51486中含有的成熟多肽编码区。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ IDNO:3。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)DSM 22654中的质粒pGEM-T-GH61DYF中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM 22654中的质粒pGEM-T-GH61DYF中含有的成熟多肽编码区。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO:5的核苷酸70至1483。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ IDNO:5。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM 22657中的质粒pGEM-T-GH61D14YH中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM 22657中的质粒 pGEM-T-GH61D14YH中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA 中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为 35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的 Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在 55℃(中严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在 65℃(高严格性)，并且最优选至少在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 48:1390)得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HClpH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液， 1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern 印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低 5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述核苷酸序列与 SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。参见本文的多核苷酸部分。

在另一个第三个方面，本发明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。参见本文的多核苷酸部分。

在第三个方面，本发明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，所述核苷酸序列与 SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。参见本文的多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 6的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为 1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位 (antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于TheProteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、 2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法 (Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，纤维素分解增强活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271: 4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992, Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等, 1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或重排(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie 和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991, Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。

诱变/重排方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17: 893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有纤维素分解增强活性的多肽的来源

本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有纤维素分解增强活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属 (Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus) 多肽，所述多肽具有纤维素分解增强活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，其具有纤维素分解增强活性。

在一个优选方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有纤维素分解增强活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有纤维素分解增强活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属 (Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、 Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属 (Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、 Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属 (Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属 (Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有纤维素分解增强活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌 (Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢 (Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉 (Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)、桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielaviafimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉 (Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei) 或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在更优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌CBS181.67多肽，例如包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心 (Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有内切葡聚糖酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等,2003,J.Ind.Microbiol. Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251； Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等, 1995,Biotechnology 13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology 9: 378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过Factor Xa 蛋白酶切割(Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13: 982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter 等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248)； Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens,2003, Drug DiscoveryWorld 4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln 后通过TEV蛋白酶切割(Stevens,2003，见上文)；和 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens,2003,见上文)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列，或由编码本发明具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22656中所含质粒 pGEM-T-GH61a51486中所含的序列，或由大肠杆菌DSM 22656中所含质粒 pGEM-T-GH61a51486中所含的序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含 SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸67至868或由SEQ ID NO:1的核苷酸67至868组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22656中所含质粒pGEM-T-GH61a51486中含有的成熟多肽编码序列或由大肠杆菌DSM 22656中所含质粒pGEM-T-GH61a51486中含有的成熟多肽编码序列组成。本发明还涵盖编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列分别不同于SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQ ID NO:2的片段。

在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3 组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22654中所含质粒pGEM-T-GH61DYF中所含的序列，或由大肠杆菌DSM 22654中所含质粒 pGEM-T-GH61DYF中所含的序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含 SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099或由SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22654中所含质粒pGEM-T-GH61DYF中含有的成熟多肽编码序列或由大肠杆菌DSM 22654中所含质粒pGEM-T-GH61DYF中含有的成熟多肽编码序列组成。本发明还涵盖编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQID NO:4的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列分别不同于SEQ ID NO: 3或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO:3的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQ ID NO:4的片段。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22657中所含质粒 pGEM-T-GH61D14YH中所含的序列，或由大肠杆菌DSM 22657中所含质粒 pGEM-T-GH61D14YH中所含的序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸70至1483 或由SEQ ID NO:5的核苷酸70至1483组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM 22657中所含质粒pGEM-T-GH61D14YH中含有的成熟多肽编码序列或由大肠杆菌DSM 22657中所含质粒pGEM-T-GH61D14YH中含有的成熟多肽编码序列组成。本发明还涵盖编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列分别不同于 SEQ ID NO:5或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO:5的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQ ID NO:6的片段。

本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由在 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的核苷酸组成，其中所述突变核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis 等,1990,PCR:A Guide to Methods andApplication,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从嗜热子囊菌属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression and Purification 2:95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham 和Wells,1989,见上文)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等,1992,见上文；Smith等,1992,见上文；Wlodaver 等,1992,见上文)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在优选高严格条件，并且更优选非常高的严格条件下，与以下序列杂交：(i) SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列 (Sambrook等,1989,见上文)，如本文所定义的。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得： (a)在高或非常高严格条件下，将DNA群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或 (iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌 xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer 等,1983,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinantbacteria"于Scientific American, 1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉 (Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α- 淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，来自在黑曲霉中编码中性α- 淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α- 葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的 mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995, MolecularCellular Biology 15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α- 淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22，或者由 SEQ ID NO:2的氨基酸1至22组成。在另一个优选方面，信号肽编码序列包含 SEQ ID NO:1的核苷酸1至66，或者由SEQ ID NO:1的核苷酸1至66组成。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或者由SEQ ID NO:4的氨基酸1至18组成。在另一个优选方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸1至54，或者由SEQ ID NO:3的核苷酸1至54组成。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸1至23，或者由 SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成。在另一个优选方面，信号肽编码序列包含 SEQ ID NO:5的核苷酸1至69，或者由SEQ ID NO:5的核苷酸1至69组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac 和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体 (minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段 (means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整 DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、 LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦 (phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子 (replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒 pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4, ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等, 1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175； WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于具有纤维素分解增强活性的多肽的重组生产中。将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化 (参见，例如，Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81: 823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56: 209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751) 或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169: 5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将 DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等, 2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989, J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合 (参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota) 和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press, Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth 等,1995,见上文)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和 Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属 (Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由 Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I. 编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology, Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是嗜热子囊菌属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是甲壳嗜热子囊菌。在一个最优选的方面，所述细胞是甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)如本文所述，在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，该多肽包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽，或由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzymeassay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson 和Lars Ryden,editors,VCHPublishers,New York,1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有纤维素分解增强活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，可以按原样(as such)将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的 (cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体 (chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚 (embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,PlantPhysiology 86:506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18: 675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子 (Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织 (metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24: 863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant and Cell Physiology 39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journalof Plant Physiology 152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant and Cell Physiology 39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA 启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和 Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and general genetics 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射 (microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244: 1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和 Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos) (Christou,1992,Plant Journal 2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opinion Biotechnology 5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993, Plant Molecular Biology 21:415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有纤维素分解增强活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

在实施方案中，除了直接用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有本发明的构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码具有纤维素分解增强活性的多肽的构建体或其部分通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。在实施方案中，杂交导致本发明的转基因通过将起始种系与包含本发明的转基因的供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。

涵盖了包含本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的植物包括通过回交转化方法生成的植物。举例而言，本发明的植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

在实施方案中，可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

去除或减少纤维素分解增强活性

本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。由此在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括： (a)在有助于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵可产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无纤维素分解增强活性的蛋白质产品的方法：在发酵之前、过程中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制纤维素分解增强活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无纤维素分解增强活性的蛋白质产品的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的 pH和温度处理以基本上减少纤维素分解增强活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与用纤维素分解增强抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的纤维素分解增强活性。可使用此方法获得纤维素分解增强活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无纤维素分解增强活性的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纤维素分解增强-缺陷细胞也可以用于表达在制药上感兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

在另外的方面，本发明涉及基本上无纤维素分解增强活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

抑制具有纤维素分解增强活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制具有纤维素分解增强活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链抑制性RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一个优选的方面， dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及用于抑制细胞中具有多肽表达的这些双链抑制性RNA (dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列的部分。本发明不受限于任何特定作用机制，dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源 mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA 干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述过程可以在体外、在活体外(ex vivo) 或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于产生细胞、器官或动物中的功能缺失突变(loss-of-function mutation)。制备或使用选择性降解RNA的dsRNA 分子的方法是本领域中公知的，参见，例如，美国专利No.6,506,559；美国专利No.6,511,824；美国专利No.6,515,109；和美国专利No.6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的纤维素分解增强活性，例如，以至少 1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒 (microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

纤维素材料的加工

本发明还涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在存在本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的情况下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个优选方面，所述方法还包括回收已降解或转化的纤维素材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在存在本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的条件下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中在存在本发明具有纤维素分解增强活性的多肽的条件下，用酶组合物糖化纤维素材料。在一个优选的方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选的方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。

所述具有纤维素分解增强活性的多肽可为去除或未去除细胞的粗发酵液的形式，或半纯化或纯化酶制备物的形式，或所述组合物可包含本发明的宿主细胞作为用生物质的发酵工艺中具有纤维素分解增强活性的多肽的来源。

本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的物质，例如化学品和燃料。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。

根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规工艺完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。

水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将木素纤维素酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，木素纤维素的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合 (Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel, M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on theU.S.Department of Energy’s research and development activities forbioethanol, Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、木素纤维素水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将木素纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W. H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial celluloseutilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。

常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria deMoraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal control in fed-batchreactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology 25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis ofcellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983, Bioconversionof waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol. Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A. V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996, Enhancement of enzymaticcellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirringinduced by electromagnetic field,Appl.Biochem. Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。

预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key to effectiveenzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.Biochem. Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosic materials forefficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin. /Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance the digestibility oflignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18；Mosier 等,2005,Featuresof promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008, Pretreatment oflignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Pretreatment: the key tounlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行预浸泡、润湿或调节。

常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与水解同时进行，如与用本发明的酶组合物处理所述纤维素材料同时进行，以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它部分，例如，半纤维素。将木素纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在 140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosivedischarge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996, Bioresource Technology 855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol. Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化纤维素部分水解成单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。

经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常0.3至3％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol. 113-116:509-523；Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。

化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H₂SO₄)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等, 2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、 WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿法氧化是热预处理，通常在180-220℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151； Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol. Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81: 1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优选 5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。

湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨处理纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％ (Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007, Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol. 121:1133-1141；Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。

有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem. Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。

合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96: 673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。

在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/ 或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt ％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1 秒-60分钟的时间。

在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt％，并且最优性30-60wt％，如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的磨制(grinding)或粉碎 (milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。

物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500 psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140 至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自SundsDefibrator AB,Sweden 的Sunds Hydrolyzer中进行。

组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。

因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于 Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor& Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series 566, AmericanChemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J., 和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosichydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials: State ofthe art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将纤维素材料例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和任选地也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下进行。所述组合物可以进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解酶。组合物的酶还可以顺序加入。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料批式或连续的过程进行，其中将预处理的纤维素材料 (底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约168小时，更优选约24至约120小时，并且最优选约48至约72小时。温度的范围为优选约40℃至约70℃，更优选约45℃至约65℃，并且更优选约50℃至约60℃，特别是约50℃。pH范围为优选约3至约9，更优选约3.5至约8，更优选约 4至约7，并且最优选约4.5至约6，特别是约pH 5。干燥固体含量优选约1 至约50wt％，更优选约5至约40wt％，更优选约10至约30wt％，并且最优选约15至约25wt％。

除了本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽，组合物的纤维素分解酶组分优选为具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性的酶。在一个优选的方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个优选的方面，所述纤维素分解酶制备物进一步或甚至进一步包含一种或多种(几种)其他选自下组的酶活性：半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)，蛋白酶，漆酶，过氧化物酶，或其组合。在本发明的方法中，其他酶可在发酵之前或过程中添加，例如在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。

酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸重排方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，而外来酶的含义中涵盖重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体

用于本发明中的酶可为任何适用于本文中所述方法的形式，如含或不含细胞的粗发酵液，或基本上纯的的酶。所述酶可为干粉或颗粒，液体，稳定化液体或受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。

具有纤维素分解增强活性的酶和多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶的混合物、含纤维素底物、含纤维素底物的浓度、含纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。

在一个优选的方面，纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。

在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约 0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15 至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。

在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约 0.1至约0.5g，并且最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶。

在本发明的方法中，所述酶组合物可包含任何涉及将含纤维素材料加工为葡萄糖，或将半纤维素加工为木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、其聚合物、或如下所述的来源于它们的产物的蛋白。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物进一步或甚至进一步包含一种或多种 (几种)其他酶活性以改善含纤维素材料的降解。优选的其他酶为木聚糖酶，半纤维素酶，酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)，蛋白酶，漆酶，过氧化物酶，及其组合。

所述酶组合物可为单组分制备物例如内切葡聚糖酶，多组分制备物例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶，或多组分和单组分蛋白制备物的组合。所述纤维素分解蛋白可在酸性、中性或碱性pH范围具有活性，即水解纤维素。

所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。

用于本发明中的酶可为任何适用于本文中所述工艺的形式，如含或不含细胞的粗发酵液，干粉或颗粒，液体，稳定化液体或受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/ 或乳酸或其他有机酸来稳定化。

具有纤维素分解酶活性活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纤维素分解酶活性的革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有纤维素分解酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。

具有纤维素分解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选具有纤维素分解活性的酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽；或更优选具有纤维素分解活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、Chaetomidium、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、 Chrysosporium merdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、 Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。

还可以使用纤维素分解蛋白经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。

适用于本发明的商业性的纤维素分解蛋白制备物的实例包括，举例而言，CELLIC^TM CTec(Novozymes A/S)、CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)和 NOVOZYM^TM 188(Novozymes A/S)。其他可用的包含纤维素酶的商业上可获得的制备物包括CELLUZYME^TM、CEREFLO^TM和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，LAMINEX^TM和SPEZYME^TM CP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM 7069 W (GmbH)，以及LDI、LBR或150L(Dyadic International,Inc.,Jupiter,FL,USA)。所述纤维素酶以固体的约0.001％到约5.0％wt.，更优选固体的0.025％到约4.0％wt.，且最优选固体的约0.005％到约2.0％wt.的有效量添加。

可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene 45:253-263；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene 63:11-22； GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988, Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等,1997,Eur.J.Biochem.249:584-591； GENBANK^TM登录号Y11113)；以及里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等, 1994,Molecular Microbiology 13:219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research 18:5884)；川地曲霉 (Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics 27: 435-439)；Erwinia carotovara内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene 90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces 内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶 (GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6B 内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉 NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株 VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的示例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)纤维二糖水解酶I以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。

可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。

具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获取。具有β- 葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获取。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980获取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等,1996,Gene 173:287-288获取。

所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是根据 WO 2008/057637得到的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白。

其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat B.,1991,Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A.,1996, Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J. 316:695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP 531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 96/034108、WO97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO98/028411、WO 99/06574、 WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。

适用于本发明的商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括，例如 SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TM HTec(Novozymes A/S)、 (Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、 HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、 TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM 333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOL^TM 740L.(Biocatalysts Limit, Wales,UK)和DEPOL^TM 762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。

可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris) NRRL8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉 (Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458),埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶 (Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800 阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3) 和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉(Aspergillus niger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉 (Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明方法的纤维素分解酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure, L.(编),MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和纤维素分解酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F., Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。

所述发酵可以是任何其结果为纤维素分解酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述纤维素分解酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的纤维素分解酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。

发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经预处理和水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或 “发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳制品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。此类方法包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、SHCF(分离的水解和共发酵)、HHCF(混合的水解和共发酵)，和直接微生物转化(DMC)。

在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。适用于本发明的方法的底物的实例包括纤维素材料，如木质或植物残余物，或从加工的纤维素材料获得的低分子糖DP1-3，其可由发酵微生物代谢，并通过直接添加至发酵培养基来供应。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C₆和/或C₅发酵生物体，或它们的组合。C₆和C₅发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。

可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。

能发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。

能发酵C₅糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌 (Zymomonasmobilis)；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大肠杆菌的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。

在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversiontechnology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis,1996,见上文)。

在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。

商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOLRED^TM酵母 (可从RedStar/Lesaffre,USA获得)、FALI^TM(可从Fleischmann’s Yeast,Burns Philp Food Inc.,USA的部门获得)、SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)、BIOFERM^TMAFT和XR(可从 NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)、GERT STRAND^TM(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL^TM(可从DSMSpecialties获得)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression of Pichiastipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research 4:655-664； Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58: 204-214；Zhang等,1995,Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science 267:240-243；Deanda等,1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilisstrain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)。

在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96 小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约 32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，如约pH 4-5、6或7。

在一个优选的方面，对降解的木素纤维素或水解物施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃ 至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，优选约 pH 4-7。然而，一些例如细菌发酵生物体，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约10⁵-10¹²，优选约10⁷-10¹⁰，特别是约2x 10⁸活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,NottinghamUniversity Press,United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。

本领域中最广泛使用的方法为同步糖化和发酵(SSF)方法，其中对糖化没有保持阶段，意思是酵母和酶可一起添加。

对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何酶法工艺组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore 等,Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5- 二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、 3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao, N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production fromrenewable resources,于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,The biotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408； Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processes forfermentative production of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry 30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery bygas stripping,World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6):595-603。

在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R., 和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lacticacid production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。

在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如， Qureshi和Blaschek,2003，见上文。

在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering 87(4):501-515。

在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如， Kataoka,N.,A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water Science and Technology 36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and Bioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestion of biomass for methane production:A review。

回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

洗涤剂组合物

本发明具有纤维素分解增强活性的多肽可添加至洗涤剂组合物而成为洗涤剂组合物的组分。

本发明的洗涤剂组合物可配制为例如手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物，其包含适于预处理玷污的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂 (softener)组合物，或可配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或可配制为用于手动或机械洗碗操作。

在一个具体方面，本发明提供了包含本发明多肽的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及所述洗涤剂组合物可包含一种或多种(几种)酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言所选酶的性质应与所选洗涤剂相容(即最适pH，与其他酶或非酶成分的相容性等)，且所述酶应以有效量存在。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757号和WO 89/09259中公开的，由特异腐质酶、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有色彩维护(colour care)益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的例子有EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO98/08940中记载的纤维素酶。其它例子有纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、 WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中记载的那些。

商业性使用的纤维素酶包括CELLUZYME^TM和CAREZYME^TM (Novozymes A/S)、CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(KaoCorporation)。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO 94/25583 中所述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和 WO 98/34946中所述的变体，特别是在下述一个或多个位置有取代的变体： 27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、 222、224、235和274。

优选的商业上可获得的蛋白酶包括ALCALASE^TM、SAVINASE^TM、 PRIMASE^TM、DURALASE^TM、ESPERASE^TM和KANNASE^TM(Novozymes A/S)、 MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、 PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor InternationalInc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如记载于EP 258 068和EP 305 216的来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))或来自记载于 WO 96/13580的特异腐质霉的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,024)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)的脂肪酶，或芽孢杆菌属的脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等,(1993),Biochemica et Biophysica acta 1131,253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例为脂肪酶变体，如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、 EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、 WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中记载的那些。

优选的商业上可获得的脂肪酶包括LIPOLASE^TM和LIPOLASE ULTRA^TM (NovozymesA/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌属例如在 GB 1,296,839中更详细所述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。

有用的淀粉酶的实例为WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和 WO 97/43424中所述的变体，尤其是在一个或多个以下位置具有取代的变体： 15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、 208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶有DURAMYL^TM、TERMAMYL^TM、 FUNGAMYL^TM和BAN^TM(NovozymesA/S)、RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM (来自Genencor International Inc.)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C. cinereus)的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中记载的那些。

商业上可获得的过氧化物酶包括GUARDZYME^TM(Novozymes A/S)。

可以通过添加分开的、含有一种或多种(几种)酶的添加剂或通过添加组合的、包含所有这些酶的添加剂将洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可配制为例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制物是颗粒，特别是无粉尘的颗粒、液体特别是稳定化的液体，或浆料。

无粉尘的颗粒可以例如如US 4,106,991和4,661,452中公开的产生，并且可以任选地通过本技术领域已知的方法进行包覆。蜡质包覆材料的实例是具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。适于通过流化床技术施用的成膜包覆材料的实例在GB 1483591中给出。例如，可以通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来使液体酶制备物稳定。受保护的酶可根据EP 238,216中公开的方法来制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉末、颗粒(granule)、糊剂(paste)或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有多至 70％水和0-30％有机溶剂，或是非水性的。

洗涤剂组合物包含一种或多种(几种)表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的(包括半-极性的)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包含于其中时，洗涤剂通常会含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸酯(linear alkylbenzenesulfonate)、α-链烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcohol ethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂类(soap)。

当包含于其中时，洗涤剂将通常含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 (ethoxylated fatty acidmonoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增效剂(builder)或络合剂例如沸石、二磷酸盐/酯、三磷酸盐/酯、膦酸盐/酯(phosphonate)、碳酸盐/酯、柠檬酸盐/酯、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基 -或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种(几种)聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸盐/酯(polycarboxylate)例如聚丙烯酸盐/酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白体系，所述体系可包含H₂O₂源例如过硼酸盐或过碳酸盐，可将其与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可包含过氧酸，例如酰胺、二酰亚胺或砜型的过氧酸。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的酶稳定化，所述稳定剂例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分例如织物调节剂，包括粘土、泡沫促进剂(foam booster)、抑泡剂(suds suppressor)、抗腐蚀剂、悬污剂(soil-suspendingagent)、防污物再沉积剂(anti-soil redeposition agent)、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。

在洗涤剂组合物中，可以以相当于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选 0.05-5mg酶蛋白每升洗涤液，特别是0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量添加任何酶。

在洗涤剂组合物中，可以以相当于每升洗涤液0.001-100mg蛋白、优选 0.005-50mg蛋白，更优选0.01-25mg蛋白，甚至更优选0.05-10mg蛋白，最优选0.05-5mg蛋白，且甚至最优选0.01-1mg蛋白的量添加本发明具有纤维素分解增强活性的多肽。

还可将本发明具有纤维素分解增强活性的多肽并入WO 97/07202中公开的洗涤剂配制物，将WO 97/07202通过提述并入本文。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23，或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成。本发明还涉及包含编码蛋白的基因的核酸构建体，其中所述基因可操作地连接于此种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1 至18或SEQID NO:6的氨基酸1至23，或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至 22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成的信号肽，其中所述基因对所述多核苷酸是外源的。

在一个优选的方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸1至66、 SEQ ID NO:3的核苷酸1至54或SEQ ID NO:5的1至69，或者由SEQ ID NO: 1的核苷酸1至66、SEQ ID NO:3的核苷酸1至54或SEQ ID NO:5的1至 69组成。

本发明还涉及包含这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，包括：(a)在适于产生所述蛋白质的条件下培养此种重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖经组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一个或多个(几个)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质的天然存在的等位基因变异和工程的变异。

优选蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在一个更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、 α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。

菌株

使用甲壳嗜热子囊菌菌株NN051486(CBS 181.67或ATCC 16462)作为具有纤维素分解增强活性的GH61A、GH61B和GH61C多肽的来源。使用米曲霉菌株HowB101(WO 95/35385)作为用于重组表达具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌GH61多肽的宿主。

培养基

PDA平板组成为39克的马铃薯右旋糖琼脂和去离子水加至1升。

基本培养基平板组成为6g的NaNO₃，0.52的KCl，1.52g的KH₂PO₄， 1ml的COVE痕量金属溶液，20g的Noble琼脂，20ml的50％葡萄糖，2.5ml 的20％MgSO₄·7H₂O，20ml的0.02％生物素储液，和去离子水加至1升。

COVE痕量元素溶液组成为0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g的 CuSO₄·5H₂O，1.2g的FeSO₄·7H₂O，0.7g的MnSO₄·H₂O，0.8g的 Na₂MoO₂·2H₂O，10g的ZnSO₄·7H₂O，和去离子水加至1升。

YPM培养基组成为1％酵母提取物，2％Bacto peptone，和2％麦芽糖。

NNCYP-PCS培养基组成为每升5.0g的NaNO₃，3.0g的NH₄Cl，2.0g 的MES，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl₂ 2H₂O，1.0g的Bacto Peptone，5.0g 的酵母提取物，0.2g的MgSO₄ 7H₂O，4.0g的K₂HPO₄，1.0ml的COVE痕量元素溶液，2.5g的葡萄糖，25.0g的预处理的玉米秸秆(PCS)，和去离子水加至1升。

生物素储液组成为0.2g的生物素和去离子水加至1升。

COVE痕量金属溶液组成为0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g的 CuSO₄·5H₂O，1.2g的FeSO₄·7H₂O，0.7g的MnSO₄·H₂O，0.8g的 Na₂MoO₂·H₂O，10g的ZnSO₄·7H₂O，和去离子水加至1升。

LB平板组成为10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，10g的氯化钠，15 g的琼脂，和去离子水加至1升。

实施例1：从甲壳嗜热子囊菌菌株CBS 181.67制备基因组DNA和RNA

将甲壳嗜热子囊菌菌株CBS 181.67接种于PDA平板上，并在黑暗中在 45℃温育4日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml摇瓶。将瓶在45℃以160rpm振荡温育6日。在第3日、第4 日、第5日和第6日收集菌丝体。然后将来自每日的菌丝体合并并冻结于液氮中，然后储藏于-80℃冷冻箱直至使用。

实施例2：甲壳嗜热子囊菌菌株CBS 181.67 GH61A多肽基因的克隆

基于已知GH61序列的保守区设计了如下所示的四个简并引物。

GH61A scF1：

5’-GCNACNGAYCTNGGNTTTG-3’(SEQ ID NO:7)

GH61A scF2：

5’-GCNACNGAYCTNGGNTTCG-3’(SEQ ID NO:8)

GH61A scF3：

5’-GCNACNGAYTTRGGNTTYG-3’(SEQ ID NO:9)

GH61A scR1：

5’-CAYTGNGGRTARTTYTGNGC-3’(SEQ ID NO:10)

PCR通过使用正向引物GH61A scF1、GH61scF2和GH61A scF3与反向引物GH61AscR1的组合，以及作为模板的cDNA进行。扩增反应物包含5μl 的10X PCR缓冲液(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)，2μl的25mM MgCl₂，1μl的10mM dNTP，1μl的100μM正向引物，1μl的100μM反向引物，2μl的cDNA，0.5μl的Taq DNA聚合酶High Fidelity(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)，和37.5μl的H₂O。扩增使用PeltierThermal Cycler(Bio-Rad Laboratories,Inc.Hercules,CA,USA)进行，其程序如下：在 94℃变性2分钟；30个循环，每循环在94℃进行40秒，50℃进行40秒和 72℃进行1分钟，和在72℃最终延伸10分钟。

通过使用TBE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳检测出大约500个碱基对的 PCR产物。将PCR片段从凝胶切出，并使用PCR DNA and Gel BandPurification Kit(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)依照生产商的指示进行纯化，直接测序，并通过blast确认为GH61A部分基因。基于该部分序列，使用Genome WalkingKit(Takara Bio Inc.,Otsu,Shiga,Japan)对其5’ 和3’端克隆设计了如下所示的新引物：

61ASPR1：

5'-TGCAAGGAGCAAGGTAGTTGA-3'(SEQ ID NO:11)

61ASPR2：

5'-GAGTCCATTCCAGCTTGACGGT-3'(SEQ ID NO:12)

61ASPF1：

5'-TCAGACAATCTGATAGCGGC-3’(SEQ ID NO:13)

61ASPF2：

5'-ATCCCAACCACAACTGCACCT-3'(SEQ ID NO:14)

对于5’端和3’端克隆，初级扩增反应物包含2μl的作为模板的基因组 DNA，各2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，100pmol的AP2(由Genome Walking Kit提供)和10pmol的用于5’端克隆的引物61ASPR1或100pmol的 AP3(由Genome Walking Kit提供)，和10pmol的用于3’端克隆的引物 61ASPF1，5μl的10X LA PCR Buffer II(由Genome Walking Kit提供)，和2.5 单位的TakaRa LA Taq DNA聚合酶(由Genome Walking Kit提供)，终体积为 50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler进行，其程序为：在94℃预变性1分钟和98℃预变性1分钟；五个循环，每循环在94℃的变性温度进行30秒，在60℃退火1分钟，和在72℃延伸2分钟；1个循环，在94℃变性30秒；在25℃退火3分钟并在72℃延伸2分钟；十五次重复，每次2个循环的94 ℃进行30秒，62℃进行1分钟和72℃进行2分钟，接着1个循环的94℃进行30秒，44℃进行1分钟和72℃进行2分钟；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。

次级扩增反应物包含2μl的作为模板的20X稀释的初级PCR产物，各2.5 mM的dATP，dTTP，dGTP和dCTP，100pmol的AP2，和10pmol用于5’端克隆的引物61ASPR2或100pmol的AP3以及10pmol用于3’端克隆的的引物 61ASPF2，5μl的10X LA PCR Buffer II，和2.5单位的TakaRa LA Taq DNA聚合酶，终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler进行，其程序为十五次重复，每次2个循环的在94℃进行30秒，在62℃进行1分钟，在72℃进行2 分钟；接着1个循环的在94℃进行30秒，在44℃进行1分钟和在72℃进行2 分钟；和在72℃最终延伸10分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。

将来自5’和3’端PCR的PCR产物回收并测序。其鉴定为GH61A多肽基因的5’和3’端。然后汇编了包括所述部分基因，5’端和3’端的三个序列以生成全长GH61A。

获得的全长基因显示序列含有871个核苷酸的编码区，其包含1个内含子和终止密码子，并编码251个氨基酸，具有22个氨基酸的预测的信号肽。

实施例3：从基因组DNA克隆甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61A多肽基因和米曲霉表达载体的构建

基于全长甲壳嗜热子囊菌GH61A基因序列，设计了如下所示的寡核苷酸引物以从甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67的基因组DNA扩增GH61A基因。使用IN-CF DryDown Cloning Kit(Clontech Laboratories,Inc., Mountain View,CA,USA)将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，而无需进行限制性消化和连接。

有义引物：

5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGGCCTTTTCCCAGATAATGGCTA-3’(SEQ ID NO:15)

反义引物：

5'-GTCACCCTCTAGATCTGGATCGCAGGAGCGTTCAGA-3'(SEQ ID NO:16)

粗体字母对于有义引物代表编码序列，而对于反义引物代表终止密码子的下游序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。

表达载体pPFJO355含有米曲霉TAKA-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶终止子元件，用于在大肠杆菌中选择和繁殖的pUC19来源的序列，和pyrG 基因，其编码构巢曲霉乳清酸核苷脱羧酶以供选择pyrG突变体曲霉属菌株的转化体。

将上述引物各二十皮摩尔用于PCR反应，所述反应物包含甲壳嗜热子囊菌基因组DNA，10μl的5X GC Buffer(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，1.5μl的 DMSO，各2μl的2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，和1单位的PHUSION^TM High-Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，最终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler进行，其程序为：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在70℃退火30秒，其中每循环减少1℃，并在72 ℃延伸30秒；25个循环，每循环在98℃进行15秒和在72℃进行90秒；和在 72℃最终延伸10分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。

反应产物通过使用90mM Tris-硼酸和1mM EDTA(TBE)缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出大约1.0kb产物条带，并使用 PCR DNAand Gel Band Purification Kit依照生产商的指示纯化。

将质粒pPFJO355用Bam HI和Bgl II消化，通过使用tBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCR DNA and Gel Band Purification Kit依照生产商的指示进行纯化。

使用IN-CF Dry Down PCR Cloning Kit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pGH61a51486(图4)，其中甲壳嗜热子囊菌GH61A基因的转录处于米曲霉TAKA-α-淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng的用Bam HI和Bgl II消化的pPFJO355和50ng的甲壳嗜热子囊菌GH61A基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并用去离子水重悬至10μl的终体积。将反应在37℃温育15分钟，然后在50℃温育15分钟。使用三μl的反应物依照生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TIANGEN Biotech(Beijing)Co.Ltd.,Beijing,China)。将转化物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的 LB平板，并在37℃温育1日。含有命名为pGH61a51486的质粒的大肠杆菌转化体通过菌落PCR检测，并使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN Inc., Valencia,CA,USA)制备质粒DNA。pGH61a51486中的甲壳嗜热子囊菌 GH61A基因插入通过使用3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc, Foster City,CA,USA)的DNA测序确认。

将相同的PCR片段使用pGEM-T Vector System克隆入pGEM-T载体 (PromegaCorporation,Madison,WI,USA)以生成pGEM-T-GH61a51486。 pGEM-T-GH61a51486中的甲壳嗜热子囊菌GH61A基因插入通过使用 3730XL DNA Analyzer的DNA测序确认。含有pGEM-T-GH61a51486的大肠杆菌菌株T-51486A(命名为大肠杆菌NN059126)于2009年6月10日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,DSM),Mascheroder Braunschweig, Germany，并分配登录号DSM22656。

实施例4：编码纤维素分解增强活性的GH61A多肽的甲壳嗜热子囊菌基因组序列的表征

就其品质审视核苷酸序列数据，并将所有序列以PHRED/PHRAP软件 (Universityof Washington,Seattle,WA,USA)的协助相互比较。

甲壳嗜热子囊菌gh61a基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图1。编码序列为871bp，包含终止密码子，并由 115bp(核苷酸105-219)的一个内含子间隔。编码的预测的蛋白为251个氨基酸。全长编码序列和熟多肽编码序列的％G+C含量分别为50.23％和52.55％。使用SignalP软件程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6)，预测了 22个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有229个氨基酸，具有26.35kDa的预测的分子量。

使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵确定了氨基酸序列的比较性逐对全局比对。比对显示甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽基因的成熟多肽的推导的氨基酸序列与来自桔橙嗜热子囊菌(GeneSeq登录号AEC05922或AUP68836)的 GH61A基因具有86％同一性(排除缺口)。

实施例5：在米曲霉中表达甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 GH61A多肽基因

米曲霉HowB101原生质体根据Christensen等,1988,Bio/Technology 6: 1419-1422的方法制备，并用3μg的pGH61a51486转化。转化产生约50个转化子。将十二个转化体分离至单独的基本培养基平板。

将四个转化体分别接种入24孔板中的3ml的YPM培养基，并在30℃，以150rpm振荡进行温育。在3日温育之后，通过使用含2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)的4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA,USA)上依照生产商的指示分析来自每个培养物的20μl上清。将所得的凝胶用INSTANTBLUE^TM(Expedeon Ltd.,Babraham Cambridge,UK) 染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数转化体具有大约30kDa的主要条带。表达菌株命名为米曲霉EXP03151。

将米曲霉EXP03151的斜面用10ml的YPM培养基洗涤，并接种入含有 400ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于表征该酶的培养液。在第3日收获培养物，并使用0.45μmMembrane(Millipore,Bedford,MA, USA)过滤。

实施例6：用于总RNA提取的甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67菌丝体的制备

将甲壳嗜热子囊菌菌株接种于PDA平板上，并在黑暗中在45℃温育4 日。将几个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP-PCS培养基的500ml 摇瓶中。将烧瓶在45℃以160rpm的振荡温育4日。在第4日、第5日和第 6日收集菌丝体。然后将来自每日的菌丝体合并，并冻结于液氮，然后储藏于-80℃冷冻箱直至使用。

实施例7：甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67 DNA制备

将实施例6中获得的冻结的菌丝体转移至液氮预冷的研钵和杵，并磨碎至细微粉末。通过用试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取并使用Mini Kit依照生产商的实验方案纯化从粉末状菌丝体制备总 RNA。对五十微克总DNA进行实施例8中所述的测序。

实施例8：序列汇编和发掘

使用GA2System(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)对用mRNASeq实验方案富集多聚A序列的总RNA进行测序。用内部汇编器 (in-house assembler)对原始的36碱基对读码进行汇编。使用标准生物信息学方法分析汇编的序列以供基因发现和功能预测。使用ESTscan 2.0进行基因预测。使用NCBI blastall版本2.2.10和HMMER版本2.1.1以基于结构同源性预测功能。通过分析Blast结果直接鉴定出家族GH61候选。

实施例9：从基因组DNA克隆甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因和米曲霉表达载体的构建

基于测序信息，设计了如下所示的寡核苷酸引物以从甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67的基因组DNA扩增GH61B多肽基因。使用 IN-CF Dry-downCloning Kit将片段直接克隆入表达载体 pPFJO355，而无需进行限制性消化和连接。

有义引物：

5'-ACACAACTGGGGATCCACCATGTCATTCTCGAAGATACTTGCTA-3'(SEQ ID NO 17)

反义引物：

5'-GTCACCCTCTAGATCTCATCTCGTCTTTCGTATCAGTGA-3'(SEQ ID NO 18)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pPFJO355的插入位点同源。

将上述引物各十皮摩尔用于PCR反应，所述反应物包含甲壳嗜热子囊菌 CBS181.67基因组DNA，10μl的5X GC Buffer，1.5μl的DMSO，各2μl 的2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，和0.6单位的PHUSION^TM High-Fidelity DNA Polymerase，最终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler进行，其程序为：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性 15秒，在58℃退火30秒，其中每循环增加1℃，并在72℃延伸60秒；25 个循环，每循环在98℃进行15秒，在65℃进行30秒和在72℃进行60秒；和在72℃最终延伸10分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。

反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出大约1.2kb产物条带，并使用PCR DNA and Gel Band PurificationKit依照生产商的指示纯化。

使用IN-CF Dry Down PCR Cloning Kit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pGH61D14YF(图5)，其中甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因的转录处于来自米曲霉α-淀粉酶基因的启动子的调控之下。简言之，将 30ng的用Bam HI和Bgl II消化的pPFJO355和240ng的甲壳嗜热子囊菌 GH61B基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并用去离子水重悬至10μl的终体积。将反应在37℃温育15分钟，然后在50℃温育15分钟。使用三μl的反应物依照生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化物铺板于补充100μg每ml的氨苄青霉素的LB平板，并在37℃温育1日。含有命名为pGH61D14YF的质粒的大肠杆菌转化体通过菌落PCR检测，并使用 QIAprep Spin Miniprep Kit制备质粒DNA。pGH61D14YF中的甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因插入通过使用3730XL DNA Analyzer的DNA测序确认。

将相同的PCR片段使用pGEM-T Vector System克隆入pGEM-T载体以生成pGEM-T-GH61D14YF。插入pGEM-T-GH61D14YF中的甲壳嗜热子囊菌 GH61A基因通过使用3730XL DNAAnalyzer的DNA测序确认。含有 pGEM-T-GH61DYF的大肠杆菌菌株T-51486B(命名为大肠杆菌NN059120) 于2009年6月10日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSM),Braunschweig,Germany，并分配登录号DSM 22654。

实施例10：编码纤维素分解增强活性的GH61B多肽的甲壳嗜热子囊菌基因组序列的表征

甲壳嗜热子囊菌gh61b基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)示于图2。基因组片段编码349个氨基酸的多肽，其由 51bp(核苷酸102-153)的一个内含子间隔。全长编码序列和熟多肽编码序列的％G+C含量分别为52.86％和53.58％。使用SignalP软件程序(Nielsen等,1997, 见上)，预测了18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有229个氨基酸，具有26.35kDa的预测的分子量。

使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman 和Wunsch,1970,见上)，以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和 EBLOSUM62矩阵确定了氨基酸序列的比较性逐对全局比对。比对显示甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因的成熟多肽的推导的氨基酸序列与来自桔橙嗜热子囊菌 (GeneSeq登录号AUP68836)的GH61A基因具有75％同一性(排除缺口)。

实施例11：在米曲霉宿主中表达甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因

米曲霉HowB101原生质体根据Christensen等,1988,见上的方法制备，并用3μg的pGH61D14YF转化。转化产生约50个转化子。将三十个转化体分离至单独的基本培养基平板。

将全部三十个转化体分别接种入24孔板中的3ml的YPM培养基，并在 30℃，150rpm进行温育。在3日温育之后，通过使用含MES的 4-12％Bis-Tris Gel上依照生产商的指示分析来自每个培养物的20μl 上清。将所得的凝胶用INSTANT BLUE^TM染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数转化体具有大约55kDa的主要条带。表达菌株命名为米曲霉EXP03090。

将米曲霉EXP03090的斜面培养用10ml的YPM洗涤，并接种入含有400 ml的YPM培养基的2升烧瓶以生成用于表征的培养液。在第3日收获培养物，并使用0.45μmMembrane过滤。

实施例12：从基因组DNA克隆甲壳嗜热子囊菌GH61C多肽基因和米曲霉表达载体的构建

基于实施例8中的测序信息，设计了如下所示的寡核苷酸引物以从甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67的基因组DNA扩增GH61C多肽基因。使用IN-FUSION^TMCF Dry-down Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体 pPFJO355，而无需进行限制性消化和连接。

有义引物：

5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGTTGTCATTCATTCCCACCAAGTCA-3’(SEQ ID NO:19)

反义引物：

5'-GTCACCCTCTAGATCTACACCCTCATGCACCTCTCCTTCTAA-3'(SEQ ID NO:20)

将上述引物各十皮摩尔用于PCR反应，所述反应物包含甲壳嗜热子囊菌 CBS181.67基因组DNA，10μl的5X GC Buffer，1.5μl的DMSO，各2.5mM 的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，和0.6单位的PHUSION^TM High-Fidelity DNA Polymerase，最终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler进行，其程序为：在98℃变性1分钟；5个循环，每循环在98℃变性15秒，在58℃退火 30秒，其中每循环增加1℃，并在72℃延伸60秒；25个循环，每循环在98℃进行15秒，在65℃进行30秒和在72℃进行60秒；和在72℃最终延伸10 分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。

反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出大约1.5kb产物条带，并使用PCR DNAand Gel Band PurificationKit依照生产商的指示纯化。

将质粒pPFJO355用Bam I和Bgl II消化，通过使用tBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用PCR DNA and Gel Band Purification Kit依照生产商的指示进行纯化。

使用IN-FUSION^TMCF Dry-down PCR Cloning Kit将基因片段和消化的载体连接在一起，得到pGH61D14YH(图6)，其中GH61C多肽基因的转录处于米曲霉TAKA-α-淀粉酶启动子的调控之下。简言之，将30ng的用Bam I和 Bgl II消化的pPFJO355和300ng的甲壳嗜热子囊菌GH61C多肽基因纯化的 PCR产物添加至反应小瓶，并通过添加去离子水重悬至10μl的终体积。将反应在37℃温育15分钟，然后在50℃温育15分钟。使用三μl的反应物依照生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TIANGEN Biotech Co.Ltd., Beijing,China)。含有pGH61D14YH的大肠杆菌转化体通过菌落PCR检测，并使用QIAprep SpinMiniprep Kit制备质粒DNA。pGH61D14YH中的甲壳嗜热子囊菌gh61c基因插入通过使用3730XL DNA Analyzer的DNA测序确认。

将相同的PCR片段使用pGEM-T Vector System克隆入pGEM-T载体 (PromegaCorporation,Madison,WI,USA)以生成pGEM-T-GH61D14YH。 pGEM-T-GH61D14YH中的甲壳嗜热子囊菌GH61C多肽基因插入通过使用 3730XL DNA Analyzer的DNA测序确认。含有pGEM-T-GH61D14YH的大肠杆菌菌株T-51486C(命名为大肠杆菌NN059127)于2009年6月10日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,DSM),Braunschweig,Germany，并分配登录号DSM 22657。

实施例13：甲壳嗜热子囊菌GH61C多肽基因的表征

甲壳嗜热子囊菌gh61c基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)示于图3。基因组片段编码436个氨基酸的多肽，其由 80bp(核苷酸200-279)和95bp(核苷酸1134-1228)的两个内含子间隔。全长编码序列和熟多肽编码序列的％G+C含量分别为53.16％和55.61％。使用 SignalP软件程序(Nielsen等,1997,见上)，预测了23个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有413个氨基酸，具有45.08kDa的预测的分子量。

使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch,1970,见上)，以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为 0.5，和EBLOSUM62矩阵确定了氨基酸序列的比较性逐对全局比对。比对显示甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽基因的成熟多肽的推导的氨基酸序列与来自桔橙嗜热子囊菌(GeneSeq登录号AUP68836)的GH61A基因具有75％同一性 (排除缺口)。

实施例14：用具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌GH61A和 GH61B多肽水解经预处理的玉米秸秆

分别如实施例5和11中所述制备具有纤维素分解增强活性的甲壳嗜热子囊菌GH61A和GH61B多肽的培养液，并使用Amicon超离心装置(Millipore, Bedfored,MA,USA；10kDa聚醚砜膜,40psi,4℃)浓缩约20倍。蛋白浓度通过 SDS-PAGE和考马斯蓝染色之后的密度法来估计。将玉米秸秆如WO 2005/074647中所述作为测定底物预处理并制备以生成经预处理的玉米秸秆 (PCS)。用于测定增强活性的基础纤维素酶混合物是从里氏木霉菌株SMA135 制备的(WO 2008/057637)。

使用1.6ml深孔板(Axygen,Santa Clara,CA.)，使用1.0ml的总反应体积和1mM硫酸镁-50mM乙酸钠,pH 5.0中50mg/ml的PCS浓度，进行PCS 的水解。以基础纤维素酶混合物的蛋白浓度的0至100％范围的浓度向基础纤维素酶混合物分别加入甲壳嗜热子囊菌GH61B。在50℃温育72小时。实验以一式三份进行。离心等分试样，并通过使用板式离心机(RT7, Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)以3000rpm离心 (HV 0.45μm,Millipore,Billerica,MA,USA)10分钟而过滤上清液。不立即使用时，在-20℃冷冻经过滤的水解物等分试样。在65℃，以 0.6ml/分钟的流速从4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Inc.,Hercules,CA,USA)通过包含0.05％w/w苯甲酸的0.005 M H₂SO₄洗脱后，测定在包含0.05％w/w苯甲酸的0.005MH₂SO₄中稀释的样品的糖浓度，通过积分依照折射率检测1100 HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖和纤维二糖信号而定量，所述检测由纯糖样品(Absolute Standards Inc.,Hamden,CT,USA)校准。使用得到的当量计算每个反应的纤维素转化百分比。使用下式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化率，％)：

转化率(％)＝(葡萄糖+纤维二糖x 1.053)(mg/ml)x 100x 162/(纤维素(mg/ml)x 180)＝(葡萄糖+纤维二糖x 1.053)(mg/ml)x 100/(纤维素(mg/ml)x 1.111)

在这个等式中，因数1.111反映将纤维素转化成葡萄糖中的重量增加，而因数1.053反映将纤维二糖转化成葡萄糖中的重量增加。通过有限消化PCS 而释放葡萄糖和纤维二糖，来确定PCS中的纤维素。

向基础纤维素酶混合物添加增加量的甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽的结果示于图7。甲壳嗜热子囊菌GH61A多肽的添加在100％添加水平提供了1.37 的刺激因子。

向基础纤维素酶混合物添加增加量的甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽的结果示于图8。甲壳嗜热子囊菌GH61B多肽的添加在100％添加水平提供了1.29 的刺激因子。

生物材料的保藏

下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM),Mascheroder Weg 1B,D-38124Braunschweig, Germany，并给予下述的登录号：

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对专利权的侵犯。

通过下述编号段落进一步描述本发明：

[1]具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％同一性； (b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下杂交： (i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii) 包含于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；和(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

[2]段1的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2 的氨基酸序列具有至少90％同一性。

[3]段2的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2 的氨基酸序列具有至少95％同一性。

[4]段3的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2 的氨基酸序列具有至少97％同一性。

[5]段1的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4 或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少80％同一性。

[6]段5的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4 或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性。

[7]段6的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4 或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少90％同一性。

[8]段7的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4 或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性。

[9]段8的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4 或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少97％同一性。

[10]段1的多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6 的氨基酸序列或其具有纤维素分解增强活性的片段，或由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。

[11]段10的多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。

[12]段11的多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 6的成熟多肽，或由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽组成。

[13]段1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[14]段13的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[15]段1的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性。

[16]段15的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性。

[17]段16的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％同一性。

[18]段1的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性。

[19]段18的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性。

[20]段19的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性。

[21]段20的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性。

[22]段21的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少97％同一性。

[23]段1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或其编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列；或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或其编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。

[24]段23的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列组成。

[25]段23的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列组成。

[26]段1的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。

[27]段1的多肽，所述多肽由质粒pGEM-T-GH61a51486、 pGEM-T-GH61DYF或pGEM-T-GH61D14YH中含有的多核苷酸编码，所述质粒pGEM-T-GH61a51486、pGEM-T-GH61DYF或pGEM-T-GH61D14YH分别包含在大肠杆菌DSM 22656、DSM 22654或DSM 22657中，。

[28]段1-27中任一项的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸 23至251，SEQ ID NO:4的氨基酸19至349，或SEQ ID NO:6的氨基酸24 至436。

[29]段1-28中任一项的多肽，其中成熟多肽编码序列是，SEQ ID NO:1 的核苷酸67至868，SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099，或SEQ ID NO:5的核苷酸70至1483。

[30]分离的多核苷酸，其包含编码段1-29中任一项的多肽的核苷酸序列。

[31]段30的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽。

[32]核酸构建体，其包含段30或31的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。

[33]重组表达载体，其包含段32的核酸构建体。

[34]重组宿主细胞，其包含段32的核酸构建体。

[35]用于产生段1-29中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b) 回收所述多肽。

[36]用于产生段1-29中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

[37]用于产生亲本细胞的突变体的方法，所述方法包括破坏或缺失编码段1-29中任一项的多肽或其一部分的多核苷酸，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。

[38]由段37的方法产生的突变细胞。

[39]段38的突变细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。

[40]产生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白产生的条件下培养段39的突变细胞；和(b)回收所述蛋白。

[41]段30或31的分离的多核苷酸，其通过下述获得：(a)在高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[42]段41的分离的多核苷酸，其通过下述获得：(a)在非常高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[43]段41或42的分离的多核苷酸，其中成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸67至868，SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099，或SEQ ID NO:5 的核苷酸70至1483。

[44]用于产生包含突变核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突变核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽，所述方法包括：(a)向SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:5的成熟多肽编码序列中引入至少一个突变，其中突变核苷酸序列编码包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQID NO:6的成熟多肽组成的多肽；和(b)回收所述包含突变核苷酸序列的多核苷酸。

[45]由段44的方法产生的突变多核苷酸。

[46]产生多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞包含段45的编码所述多肽的突变多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[47]产生段1-29中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[48]转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码段1-29中任一项的多肽的多核苷酸转化。

[49]双链抑制RNA(dsRNA)分子，其包含段30或31的多核苷酸的亚序列，其中dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。

[50]段49的双链抑制RNA(dsRNA)分子，其为长约15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。

[51]用于抑制具有纤维素分解增强活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链抑制性RNA(dsRNA)分子，或者在细胞中表达双链RNA (dsRNA)分子，其中所述dsRNA包括段30或31的多核苷酸的亚序列。

[52]段51的方法，其中dsRNA为长约15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。

[53]分离的多核苷酸，其编码信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22，SEQ ID NO:4的氨基酸1至18，或SEQ ID NO:6的氨基酸 1至23，或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至22，SEQ ID NO:4的氨基酸1至18，或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成。

[54]核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作地连接于段 53的多核苷酸，其中所述基因对于所述多核苷酸是外源的。

[55]重组表达载体，其包含段54的核酸构建体。

[56]重组宿主细胞，其包含段54的核酸构建体。

[57]用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白质产生的条件下培养段56的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

[58]组合物，其包含段1-29中任一项的多肽。

[59]洗涤剂组合物，其包含段1-29中任一项的多肽和表面活性剂。

[60]降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在段1-29中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。

[61]段60的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。

[62]段60或61的方法，其中酶组合物包含选自下组的一种或多种(几种) 纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[63]段60-62中任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

[64]段60-63中任一项的方法，其进一步包括回收已降解的纤维素材料。

[65]段64的方法，其中已降解的纤维素材料是糖。

[66]段65的方法，其中糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。

[67]产生发酵产物的方法，其包括：(a)在存在段1-29中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从所述发酵回收所述发酵产物。

[68]段67的方法，其中所述纤维素材料经预处理。

[69]段67或68的方法，其中所述酶组合物包含选自下组的一种或多种 (几种)纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[70]段67-69中任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含选自下组的一种或多种(几种)酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

[71]段67-70中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。

[72]段69-71中任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

[73]发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在存在段1-29中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。

[74]段73的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。

[75]段73或74的方法，其进一步包括从所述发酵回收发酵产物。

[76]段73-75中任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化前经过预处理。

[77]段73-76中任一项的方法，其中所述酶组合物包含选自下组的一种或多种(几种)纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[78]段73-77中任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含选自下组的一种或多种(几种)酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

[79]段73-78中任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸，或气体。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

本发明涉及以下技术方案：

1.具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％同一性；

(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交： (i)SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii) 包含于SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由包含核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性，或与SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性；和

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

2.项1的多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽或其具有纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQID NO:6的成熟多肽或其具有纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。

3.项1的多肽，所述多肽由下述质粒中所含的多核苷酸编码：分别包含在大肠杆菌DSM 22656、DSM 22654或DSM 22657中的质粒 pGEM-T-GH61a51486、pGEM-T-GH61DYF或pGEM-T-GH61D14YH。

4.分离的多核苷酸，其包含编码项1的多肽的核苷酸序列。

5.用于产生项1的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

6.用于产生具有纤维素分解增强活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含项4的多核苷酸的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

7.用于产生亲本细胞的突变体的方法，所述方法包括破坏或缺失编码项 1的多肽的多核苷酸或其部分，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。

8.用于产生项1的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

9.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码项1的多肽的多核苷酸转化。

10.包含项4的多核苷酸的亚序列的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

11.用于抑制具有纤维素分解增强活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对所述细胞施用项10的抑制性双链RNA(dsRNA)分子，或者在所述细胞中表达项10的抑制性双链RNA(dsRNA)分子。

12.分离的多核苷酸，其编码信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23，或者由SEQ ID NO:2的氨基酸1至22、SEQ ID NO:4的氨基酸1至18或SEQ ID NO:6的氨基酸1至23组成。

13.用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白质产生的条件下培养包含可操作连接于项12的多核苷酸的编码蛋白的基因的重组宿主细胞，其中所述基因对所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白质。

14.洗涤剂组合物，其包含项1的多肽和表面活性剂。

15.用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在项1的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下，用酶组合物处理纤维素材料。

16.项15的方法，进一步包括回收已降解的纤维素材料。

17.产生发酵产物的方法，其包括：

(a)在项1的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和

(c)从所述发酵中回收所述发酵产物。

18.发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在项1的具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。

19.项18的方法，其中纤维素材料的发酵产生发酵产物。

20.项19的方法，进一步包括从所述发酵回收发酵产物。

本发明还进一步涉及以下技术方案：

1.具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：(a)由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸19至349具有至少99％同一性；和(b)由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099具有至少99％同一性；其中所述多肽是来源于甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)的天然多肽。

2.项1的多肽，其是甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67多肽。

3.多肽，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。

4.多肽，其由SEQ ID NO:4的氨基酸19至349组成。

5.项1-4中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成。

6.项1-4中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099组成。

7.项1的多肽，所述多肽由下述质粒中所含的多核苷酸编码，所述质粒为包含在大肠杆菌DSM 22654中的质粒pGEM-T-GH61D14YF。

8.分离的多核苷酸，其包含编码项1-7中任一项的多肽的核苷酸序列。

9.项8的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO:4的氨基酸19至349。

10.核酸构建体，其包含项8或9的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或几个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。

11.重组表达载体，其包含项10的核酸构建体。

12.重组宿主细胞，其包含项10的核酸构建体。

13.用于产生项1-7中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

14.用于产生项1-7中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

15.产生项1-7中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

16.用于降解或转化纤维素材料的组合物，其包含项1-7中任一项的多肽。

17.降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在项1-7中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下，用纤维素分解酶组合物处理所述纤维素材料。

18.项17的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。

19.项17的方法，其中酶组合物包含选自下组的一种或多种(几种)纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

20.项19的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或几种选自下组的酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

21.项17-20中任一项的方法，其进一步包括回收已降解的纤维素材料。

22.项21的方法，其中已降解的纤维素材料是糖。

23.项22的方法，其中糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。

24.产生发酵产物的方法，其包括：(a)在项1-7中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽存在下，用纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或几种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从所述发酵回收所述发酵产物。

25.项24的方法，其中所述纤维素材料经预处理。

26.项24的方法，其中所述酶组合物包含选自下组的一种或几种纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

27.项26的方法，其中所述酶组合物进一步包含选自下组的一种或几种酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

28.项24-27中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。

29.项24-27中任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、或氨基酸。

30.发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或几种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在存在项1-7中任一项的具有纤维素分解增强活性的多肽的存在下用纤维素分解酶组合物糖化的。

31.项30的方法，其中纤维素材料的发酵产生发酵产物。

32.项30或31的方法，其进一步包括从所述发酵回收发酵产物。

33.项30或31的方法，其中所述纤维素材料在糖化前经过预处理。

34.项30或31的方法，其中所述酶组合物包含选自下组的一种或几种纤维素分解酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

35.项30或31的方法，其中所述酶组合物进一步包含选自下组的一种或几种酶：木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

36.项30或31的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、或氨基酸。

序列表

<110> 诺维信股份有限公司(Novozymes, Inc.)

诺维信公司(Novozymes A/S)

Tang, Lan

Liu, Ye

Duan, Junxin

Kramer, Randall

Wu, Wenping

<120> 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

<130> 11667-WO-PCT

<150> US 61/247,250

<151> 2009-09-30

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 871

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 1

atggcctttt cccagataat ggctattacc ggcgtttttc ttgcctctgc ttccctggtg 60

gctggccatg gctttgttca gaatatcgtg attgatggta aaaggtacct aactacctac 120

cttactatct gatgtcattt acaagaaagg gcacagacac aagcggcaaa aaaaagaaag 180

aaagaaagaa agaaagaaag ctgacaaaaa ttcaacaagt tatggcgggt acatcgtgaa 240

ccaatatcca tacatgtcag atcctccgga ggtcgtcggc tggtctacca ccgcaaccga 300

cctcggattc gtggacggta ccggatacca aggacctgat atcatctgcc acaggggcgc 360

caagcctgca gccctgactg cccaagtggc cgccggagga accgtcaagc tggaatggac 420

tccatggcct gattctcacc acggcccggt gatcaactac cttgctcctt gcaacggtga 480

ctgttccacc gtggacaaga cccaattgaa attcttcaag atcgcccagg ccggtctcat 540

cgatgacaac agtcctcctg gtatctgggc ctcagacaat ctgatagcgg ccaacaacag 600

ctggactgtc accatcccaa ccacaactgc acctggaaac tatgttctaa ggcatgagat 660

cattgctctc cactcagctg ggaacaagga tggtgcgcag aactatcccc agtgcatcaa 720

cctgaaggtc actggaaatg gttctggcaa tcctcctgct ggtgctcttg gaacggcact 780

ctacaaggat acagatccgg gaattctgat caatatctac cagaaacttt ccagctatgt 840

tattcctggt cctgctttgt acactggtta g 871

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 2

Met Ala Phe Ser Gln Ile Met Ala Ile Thr Gly Val Phe Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Leu Val Ala Gly His Gly Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp

20 25 30

Gly Lys Ser Tyr Gly Gly Tyr Ile Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser

35 40 45

Asp Pro Pro Glu Val Val Gly Trp Ser Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly

50 55 60

Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile Cys His Arg

65 70 75 80

Gly Ala Lys Pro Ala Ala Leu Thr Ala Gln Val Ala Ala Gly Gly Thr

85 90 95

Val Lys Leu Glu Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val

100 105 110

Ile Asn Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly Asp Cys Ser Thr Val Asp Lys

115 120 125

Thr Gln Leu Lys Phe Phe Lys Ile Ala Gln Ala Gly Leu Ile Asp Asp

130 135 140

Asn Ser Pro Pro Gly Ile Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Ala Asn

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Thr Thr Thr Ala Pro Gly Asn Tyr

165 170 175

Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Lys Asp

180 185 190

Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Lys Val Thr Gly Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Asn Pro Pro Ala Gly Ala Leu Gly Thr Ala Leu Tyr Lys

210 215 220

Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Tyr Gln Lys Leu Ser Ser

225 230 235 240

Tyr Val Ile Pro Gly Pro Ala Leu Tyr Thr Gly

245 250

<210> 3

<211> 1102

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 3

atgtcattct cgaagatact tgctatcgct ggggccatta cctacgcatc ttcagctgcc 60

gctcatggtt atgtccaggg aattgttgtc gatggcagct agtatgtcac tctggatgga 120

accttcagca cgtactgtac taacaatcag cagctacggg ggatatatgg tgacccaata 180

tccctacacc gctcaacctc cggaactcat cgcctggtcc actaaagcaa ccgatcttgg 240

gtttgtggac ggcagtggct atacttctcc tgatatcatc tgccataagg gtgctgagcc 300

tggtgcccag agcgccaaag tggcagctgg agggaccgtt gagctgcagt ggacggcatg 360

gcccgagtct cacaagggcc cagttattga ctacctcgcc gcctgcgacg gggactgctc 420

atctgttgat aagactgcac taaagttctt taagattgac gagagtggtc tgattgacgg 480

caacggtgct ggaacatggg cctctgatac gttgatcaaa aataacaaca gctggactgt 540

caccatccca agcacaattg cttccggaaa ctacgtacta agacacgaaa taattgcgct 600

ccattctgcc ggaaacaaag atggtgctca gaactatccc cagtgtatca acctcgaggt 660

cactggtagt ggcaccgaaa accctgctgg cactctcgga acagcgcttt acacagacac 720

tgatcctggc cttctggtca acatctacca gggtctgtcc aactattcaa tccctggtcc 780

tgctctgtat agcggcaaca gtgataacgc tggttccctc aaccctacca ccacgccgtc 840

aattcagaat gctgctgctg ctccctccac ttccacagca tctgttgtca ctgattcttc 900

gtcagccacc cagactgcta gtgtcgccgc cacgactcca gcctccactt cggctgttac 960

agcctcacca gctcccgata ctggaagcga cgtaaccaaa tatctggatt cgatgagctc 1020

ggatgaggtc ctcaccctgg tgcgcgggac cctgtcttgg ctggtttcta acaagaaaca 1080

tgcgcgggat ctttctcact ga 1102

<210> 4

<211> 349

<212> PRT

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 4

Met Ser Phe Ser Lys Ile Leu Ala Ile Ala Gly Ala Ile Thr Tyr Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ala Ala His Gly Tyr Val Gln Gly Ile Val Val Asp Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Met Val Thr Gln Tyr Pro Tyr Thr Ala Gln

35 40 45

Pro Pro Glu Leu Ile Ala Trp Ser Thr Lys Ala Thr Asp Leu Gly Phe

50 55 60

Val Asp Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Pro Asp Ile Ile Cys His Lys Gly

65 70 75 80

Ala Glu Pro Gly Ala Gln Ser Ala Lys Val Ala Ala Gly Gly Thr Val

85 90 95

Glu Leu Gln Trp Thr Ala Trp Pro Glu Ser His Lys Gly Pro Val Ile

100 105 110

Asp Tyr Leu Ala Ala Cys Asp Gly Asp Cys Ser Ser Val Asp Lys Thr

115 120 125

Ala Leu Lys Phe Phe Lys Ile Asp Glu Ser Gly Leu Ile Asp Gly Asn

130 135 140

Gly Ala Gly Thr Trp Ala Ser Asp Thr Leu Ile Lys Asn Asn Asn Ser

145 150 155 160

Trp Thr Val Thr Ile Pro Ser Thr Ile Ala Ser Gly Asn Tyr Val Leu

165 170 175

Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Lys Asp Gly Ala

180 185 190

Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Glu Val Thr Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Glu Asn Pro Ala Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Asp

210 215 220

Pro Gly Leu Leu Val Asn Ile Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile

225 230 235 240

Pro Gly Pro Ala Leu Tyr Ser Gly Asn Ser Asp Asn Ala Gly Ser Leu

245 250 255

Asn Pro Thr Thr Thr Pro Ser Ile Gln Asn Ala Ala Ala Ala Pro Ser

260 265 270

Thr Ser Thr Ala Ser Val Val Thr Asp Ser Ser Ser Ala Thr Gln Thr

275 280 285

Ala Ser Val Ala Ala Thr Thr Pro Ala Ser Thr Ser Ala Val Thr Ala

290 295 300

Ser Pro Ala Pro Asp Thr Gly Ser Asp Val Thr Lys Tyr Leu Asp Ser

305 310 315 320

Met Ser Ser Asp Glu Val Leu Thr Leu Val Arg Gly Thr Leu Ser Trp

325 330 335

Leu Val Ser Asn Lys Lys His Ala Arg Asp Leu Ser His

340 345

<210> 5

<211> 1493

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 5

atgttgtcat tcattcccac caagtcagct gcgctgacga ctcttctact tcttggaaca 60

gctcatgctc acactttgat gaccaccatg tttgtggacg gcgtcaacca gggagatggt 120

gtctgcattc gcatgaacaa tgacggcgga actgccaata cctatatcca gcctatcacg 180

agcaaggata tcgcctgcgg taagtaccca gatgtcatca tactctgcca taacatccgt 240

catatctact agaatcggag caatgttaag tatttccagg catccaaggc gaaatcggcg 300

cctcccgagt ctgcccagtc aaggcatctt ccaccctaac cttccaattc cgcgagcaac 360

ccaacaaccc aaactcctcc cctctcgatc catcgcacaa aggccccgcc gcggtgtacc 420

tgaaaaaggt cgactccgcc atcgcgagca acaacgccgc cggagacagc tggttcaaga 480

tctgggagtc cgtctacgac gagtccacgg gcaaatgggg cacgaccaag atgatcgaga 540

acaacgggca catctccgtc aaggtgcccg atgatatcga gggtggttac tatcttgccc 600

ggacggagct gctggcgcta cattctgcgg atcaggggga tccgcagttc tatgttggct 660

gtgcgcagct gtttatcgat tcggatggga cggcgaaacc gcccactgtt tctattggag 720

aggggacgta cgatctgagc atgcctgcca tgacgtataa tatctgggag acaccgttgg 780

ctctgccgta tccgatgtat gggcctcctg tctatacgcc tggctctggt tctggatcag 840

tccgtgcgac gagctcttct gctgtcccta ctgcaaccga atcctctttt gtagaggaaa 900

gagcaaaccc cgtcacggca aacagtgttt attctgcaag gggcaaattc aaaacctgga 960

ttgataaact gtcatggcgc gggaaggtcc gtgagaacgt cagacaagcc gcgggaagaa 1020

gaagcactct cgtccagact gtgggtctaa agccaaaagg ctgcatcttc gtcaatggaa 1080

actggtgcgg cttcgaggtt cccgactaca acgatgcgga gagctgctgg gctgtatgtt 1140

cccctcctta gcctcttaca tccctaagta ctacatttga aaacaacaaa aagaaatgta 1200

tatactaact acgtacgctc tactctaggc ctccgacaac tgctggaaac agtccgacgc 1260

ctgctggaac aagacccaac ccacgggcta caataactgc cagatctggc aggacaagaa 1320

atgcaaggtc atccaggatt cctgtagcgg acccaacccg catggaccac cgaataaggg 1380

caaggatttg actccggagt ggccgccact gaagggctcg atggatacgt tctccaagcg 1440

tactatcggt taccgcgatt ggattgttag aaggagaggt gcatgagggt gta 1493

<210> 6

<211> 436

<212> PRT

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 6

Met Leu Ser Phe Ile Pro Thr Lys Ser Ala Ala Leu Thr Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Thr Ala His Ala His Thr Leu Met Thr Thr Met Phe Val

20 25 30

Asp Gly Val Asn Gln Gly Asp Gly Val Cys Ile Arg Met Asn Asn Asp

35 40 45

Gly Gly Thr Ala Asn Thr Tyr Ile Gln Pro Ile Thr Ser Lys Asp Ile

50 55 60

Ala Cys Gly Ile Gln Gly Glu Ile Gly Ala Ser Arg Val Cys Pro Val

65 70 75 80

Lys Ala Ser Ser Thr Leu Thr Phe Gln Phe Arg Glu Gln Pro Asn Asn

85 90 95

Pro Asn Ser Ser Pro Leu Asp Pro Ser His Lys Gly Pro Ala Ala Val

100 105 110

Tyr Leu Lys Lys Val Asp Ser Ala Ile Ala Ser Asn Asn Ala Ala Gly

115 120 125

Asp Ser Trp Phe Lys Ile Trp Glu Ser Val Tyr Asp Glu Ser Thr Gly

130 135 140

Lys Trp Gly Thr Thr Lys Met Ile Glu Asn Asn Gly His Ile Ser Val

145 150 155 160

Lys Val Pro Asp Asp Ile Glu Gly Gly Tyr Tyr Leu Ala Arg Thr Glu

165 170 175

Leu Leu Ala Leu His Ser Ala Asp Gln Gly Asp Pro Gln Phe Tyr Val

180 185 190

Gly Cys Ala Gln Leu Phe Ile Asp Ser Asp Gly Thr Ala Lys Pro Pro

195 200 205

Thr Val Ser Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Asp Leu Ser Met Pro Ala Met

210 215 220

Thr Tyr Asn Ile Trp Glu Thr Pro Leu Ala Leu Pro Tyr Pro Met Tyr

225 230 235 240

Gly Pro Pro Val Tyr Thr Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Val Arg Ala

245 250 255

Thr Ser Ser Ser Ala Val Pro Thr Ala Thr Glu Ser Ser Phe Val Glu

260 265 270

Glu Arg Ala Asn Pro Val Thr Ala Asn Ser Val Tyr Ser Ala Arg Gly

275 280 285

Lys Phe Lys Thr Trp Ile Asp Lys Leu Ser Trp Arg Gly Lys Val Arg

290 295 300

Glu Asn Val Arg Gln Ala Ala Gly Arg Arg Ser Thr Leu Val Gln Thr

305 310 315 320

Val Gly Leu Lys Pro Lys Gly Cys Ile Phe Val Asn Gly Asn Trp Cys

325 330 335

Gly Phe Glu Val Pro Asp Tyr Asn Asp Ala Glu Ser Cys Trp Ala Ala

340 345 350

Ser Asp Asn Cys Trp Lys Gln Ser Asp Ala Cys Trp Asn Lys Thr Gln

355 360 365

Pro Thr Gly Tyr Asn Asn Cys Gln Ile Trp Gln Asp Lys Lys Cys Lys

370 375 380

Val Ile Gln Asp Ser Cys Ser Gly Pro Asn Pro His Gly Pro Pro Asn

385 390 395 400

Lys Gly Lys Asp Leu Thr Pro Glu Trp Pro Pro Leu Lys Gly Ser Met

405 410 415

Asp Thr Phe Ser Lys Arg Thr Ile Gly Tyr Arg Asp Trp Ile Val Arg

420 425 430

Arg Arg Gly Ala

435

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> N=A,C,G或T

<400> 7

gcnacngayc tnggntttg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> N-A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> N-A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> N-A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> N-A,C,G或T

<400> 8

gcnacngayc tnggnttcg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> N=A,C,G或T

<400> 9

gcnacngayt trggnttyg 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> N=A,C,G或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> N=A,C,G或T

<400> 10

caytgnggrt arttytgngc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 11

tgcaaggagc aaggtagttg a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 12

gagtccattc cagcttgacg gt 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 13

tcagacaatc tgatagcggc 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 14

atcccaacca caactgcacc t 21

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 15

acacaactgg ggatccacca tggccttttc ccagataatg gcta 44

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 16

gtcaccctct agatctggat cgcaggagcg ttcaga 36

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 17

acacaactgg ggatccacca tgtcattctc gaagatactt gcta 44

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 18

gtcaccctct agatctcatc tcgtctttcg tatcagtga 39

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 19

acacaactgg ggatccacca tgttgtcatt cattcccacc aagtca 46

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)

<400> 20

gtcaccctct agatctacac cctcatgcac ctctccttct aa 42

Claims

1.具有纤维素分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：(a)由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸19至349具有至少99％同一性；和(b)由核苷酸序列组成的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099具有至少99％同一性；其中所述多肽是来源于甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的天然多肽。

2.权利要求1的多肽，其是甲壳嗜热子囊菌CBS 181.67多肽。

3.多肽，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。

4.多肽，其由SEQ ID NO:4的氨基酸19至349组成。

5.权利要求1-4中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成。

6.权利要求1-4中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099组成。

7.权利要求1的多肽，所述多肽由下述质粒中所含的多核苷酸编码，所述质粒为包含在大肠杆菌DSM 22654中的质粒pGEM-T-GH61D14YF。

8.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-7中任一项的多肽的核苷酸序列。

9.权利要求8的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO:3的核苷酸55至1099中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO:4的氨基酸19至349。

10.核酸构建体，其包含权利要求8或9的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或几个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。