CN1930294A

CN1930294A - 纤维素酶融合蛋白和编码该纤维素酶融合蛋白的异源纤维素酶融合构建物

Info

Publication number: CN1930294A
Application number: CN 200580008190
Authority: CN
Inventors: B·S·鲍尔; E·A·拉雷纳斯; C·米奇森
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2007-03-14
Also published as: WO2005093050A2; WO2005093050A3; BRPI0509212A; EP2354222A1; EP1735447A2; CA2560588A1; JP5114194B2; JP2007530054A

Abstract

本发明涉及异源纤维素酶融合构建物，其编码具有纤维素分解活性的融合蛋白，所述融合蛋白包括衍生自真菌外切纤维二糖水解酶的第一催化结构域和衍生自纤维素酶的第二催化结构域。本发明也涉及含有异源纤维素酶融合构建物的载体和真菌宿主细胞，以及产生所述纤维素酶融合蛋白的方法和酶促纤维素酶组合物。

Description

纤维素酶融合蛋白和编码该纤维素酶融合蛋白的异源纤维素酶融合构建物资助的研究和开发

[0001]本工作的一部分由与美国国家再生能源实验室(National Renewable EnergyLaboratory)签定的分包合同ZCO-0-30017-01资助进行，而该分包合同隶属于与美国能源部(United States Department of Energy)签定的主合同DE-AC36-99G010337。因此，美国政府可以拥有本发明的某些权利。

相关申请

[0002]本申请要求2004年3月25日提交的美国临时申请60/556,711的优先权，该临时申请题为“纤维素酶融合蛋白和编码该纤维素酶融合蛋白的异源融合构建物(Cellulase Fusion Protein and Heterologous Fusion Construct Encoding the Same)”。

发明领域

[0003]本发明涉及异源纤维素酶融合构建物，其编码具有纤维素分解活性的融合蛋白，所述融合蛋白包括衍生自真菌外切纤维二糖水解酶的第一催化结构域和衍生自纤维素酶的第二催化结构域。本发明也涉及包含异源纤维素酶融合构建物的载体和真菌宿主细胞，以及产生所述纤维素酶融合蛋白的方法和酶促纤维素酶组合物。

发明背景

[0004]纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最为丰富的植物材料。它们可以被包括细菌、酵母和真菌在内的众多微生物降解并用作能源，这些微生物产生能够将聚合底物水解成单体糖的胞外酶(Aro et al.，2001)。考虑到利用不可再生能源的局限性，纤维素成为主要的可再生能源的潜力是巨大的(Krishna et al.，2001)。通过生物学方法对纤维素进行有效的利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya et al.，1997)。

[0005]纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或β-D-糖苷键)，从而形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖和类似物的酶。纤维素酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡萄糖苷酶([β]-D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21)(″BG″)(Knowles et al.，1987和Schulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，而纤维二糖水解酶也能够降解晶体态纤维素。

[0006]已知，纤维素酶由大量的细菌、酵母和真菌产生。某些真菌产生能够降解晶体形式的纤维素的完整的纤维素酶体系，这样通过发酵容易地大量产生纤维素酶。

[0007]为了有效地将晶体态纤维素转化为葡萄糖，需要包括来自每一CBH、EG和BG类别的成分的完整纤维素酶体系，分离的成分在水解晶体态纤维素中是低效的(Filho et al.，1996)。特别地，EG类型纤维素酶和CBH类型纤维素酶组合起来相互作用，比单独使用任何其中一种酶更有效地降解纤维素(Wood，1985；Baker et al.，1994；和Nieves et al.，1995)。

[0008]此外，本领域已知，纤维素酶可用于处理织物以增强洗涤剂组合物的清洗能力，用作柔软剂，用于改善棉织品的触摸感和外观，和类似情况(Kumar et al.，1997)。具有改善的清洗性能的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利4,435,307；英国申请号2,095,275和2,094,826)和用于处理织品以改善织物的触摸感和外观的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利5,648,263、5,691,178和5,776,757和英国申请1,358,599)，已经描述于文献中。

[0009]因此，真菌和细菌中产生的纤维素酶已经受到高度关注。特别地，已经显示，木霉属某些种(Trichoderma spp.)(例如长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)或里氏木霉(Trichoderma reesei))发酵产生了能够降解晶体形式的纤维素的全纤维素酶体系。多年来，经典的诱变、筛选、选择和高度精确的大规模廉价发酵条件的发展改进了木霉属纤维素酶的生产。尽管木霉属某些种的多成分纤维素酶体系能够将纤维素水解为葡萄糖，仍有来自其他微生物，特别是细菌菌株的纤维素酶，这些纤维素酶对于有效的纤维素水解具有不同的特性，在丝状真菌中表达这些蛋白对于进行工业规模的纤维素酶生产将是有利的。然而，许多研究的结果表明，在丝状真菌中生产细菌来源的酶的产量不高(Jeeves et al.，1991)。

[0010]在本发明中，异源纤维素酶融合构建物，其包括融合到纤维素酶催化结构域编码区域的真菌外切纤维二糖水解酶(CBH)催化结构域编码区域，已被导入丝状真菌宿主细胞中并在该细胞中表达，从而增加纤维素酶的产量和效率。

发明概述

[0011]在第一个方面，本发明包括异源纤维素酶融合构建物，从所述构建物的5′端起以可操作的连接的方式，包括：(a)编码信号序列的DNA分子；(b)编码第一催化结构域的DNA分子，其中所述第一催化结构域衍生自真菌外切纤维二糖水解酶，和(c)编码第二催化结构域的DNA分子，其中所述第二催化结构域是纤维素酶的催化结构域。

[0012]在该方面的第一个实施方案中，异源纤维素酶融合构建物还包括位于第一催化结构域的3′端和第二催化结构域的5′端的接头(linker)序列。在第二个实施方案中，异源纤维素酶融合构建物缺少外切纤维二糖水解酶的纤维素结合结构域(CBD)。在第三个实施方案中，异源纤维素酶融合构建物还包括位于接头序列之后和第二催化结构域之前的kexin位点。在第四个实施方案中，异源融合构建物将包括丝状真菌可分泌蛋白的启动子，所述启动子以可操作连接的方式位于第一催化结构域的5′端。在第五个实施方案中，启动子是cbh启动子，优选衍生自里氏木霉的cbh1启动子。在第六个实施方案中，第一催化结构域衍生自CBH1外切纤维二糖水解酶，特别是具有与SEQ ID NO.：6中阐述的序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列的CBH1。在第七个实施方案中，第二催化结构域是内切葡聚糖酶催化结构域。在第八个实施方案中，第二催化结构域是外切纤维二糖水解酶催化结构域。在第九个实施方案中，第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。在第十个实施方案中，第二催化结构域选自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)GH5A内切葡聚糖酶I(E1)催化结构域；解纤维热酸菌GH48(GH48)纤维素酶催化结构域；解纤维热酸菌GH74内切葡聚糖酶(GH74-EG)催化结构域：褐色高温双岐菌(Thermobifidafusca)E3(Tf-E3)纤维素酶催化结构域；和褐色高温双岐菌E5内切葡聚糖酶(Tf-E5)催化结构域。在第十一个实施方案中，异源纤维素酶融合构建物缺少，第一催化结构域的外切纤维二糖水解酶的纤维素结合结构域和第二催化结构域的纤维素酶的纤维素结合结构域。在第十二个实施方案中，第二催化结构域是解纤维热酸菌GH5A E1催化结构域，特别是具有与SEQ ID NO.：8中阐述的序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列的解纤维热酸菌GH5A E1催化结构域。在第十三个实施方案中，异源纤维素酶融合构建物包括位于第二催化结构域的3′端的终止子序列。在第十四个实施方案中，异源融合构建物包括选择标记。

[0013]在第二个方面，本发明包括载体，该载体从5′端起以可操作的连接的方式包括：丝状真菌可分泌蛋白的启动子、编码信号序列的DNA分子、编码第一催化结构域的DNA分子、编码第二催化结构域的DNA分子以及终止子，其中所述第一催化结构域衍生自真菌外切纤维二糖水解酶，所述第二催化结构域是纤维素酶的催化结构域。在一个实施方案中，载体还包括选择标记。在第二个实施方案中，载体将包括位于第一催化结构域的3′端和第二催化结构域的5′端的接头。在第三个实施方案中，载体将缺少编码第一催化结构域的纤维素结合结构域的DNA序列。在第四个实施方案中，载体将包括kexin位点。在第五个实施方案中，第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。在第六个实施方案中，载体缺少编码第二催化结构域的纤维素酶纤维素结合结构域的DNA序列。

[0014]在第三个方面，本发明包括用异源纤维素酶融合构建物转化的真菌宿主细胞，或用包含本文所述的异源纤维素酶融合构建物的载体转化的真菌宿主细胞。

[0015]在第四个方面，本发明包括含有异源纤维素酶融合构建物的重组真菌细胞，或含有携带该构建物的载体的重组真菌细胞。

[0016]在第三和第四个方面特别优选的实施方案中，真菌宿主细胞是木霉属宿主细胞，更特别地是里氏木霉的菌株。在这些方面的另一实施方案中，天然纤维素酶基因诸如chh1、cbh2、egl1和egl2已从真菌细胞中剔除。在第三个实施方案中，天然的纤维素结合结构域已从真菌细胞中剔除。

[0017]在第五个方面，本发明包括具有纤维素分解活性的分离的纤维素酶融合蛋白，其包括第一催化结构域和第二催化结构域，其中所述第一催化结构域是外切纤维二糖水解酶催化结构域，所述第二催化结构域衍生自纤维素酶。在该方面的一个实施方案中，外切纤维二糖水解酶是CBH1。在第二个实施方案中，第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。在第三个实施方案中，细菌纤维素酶是内切葡聚糖酶，在另一实施方案中，细菌纤维素酶是外切纤维二糖水解酶。在第四个实施方案中，细菌纤维素酶衍生自解纤维热酸菌的菌株。在第五个实施方案中，本发明涉及包含分离的纤维素酶融合蛋白的纤维素分解组合物。

[0018]在第六个方面，本发明包括产生具有纤维素分解活性的酶的方法，该方法包括：(a)用在上面第一和第二方面中描述的异源纤维素酶融合构建物或者载体稳定转化丝状真菌宿主细胞；(b)在适合于所述真菌宿主细胞产生具有纤维素分解活性的酶的条件下，培养转化的真菌宿主细胞；和(c)回收所述酶。

[0019]在该方面的一个实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞，特别是里氏木霉宿主细胞。在第二个实施方案中，外切纤维二糖水解酶是CBH1，纤维素酶是解纤维热酸菌纤维素酶或褐色高温双岐菌纤维素酶。在第三个实施方案中，回收的酶是纤维素酶融合蛋白，该纤维素酶融合蛋白的组成成分，或纤维素酶融合蛋白和其组成成分的组合。在第四个实施方案中，纯化回收的(一种或多种)酶。

[0020]在第七个方面，本发明包括表达纤维素酶融合蛋白的木霉属宿主细胞，其中所述融合蛋白包括第一催化结构域和第二催化结构域，其中所述第一催化结构域衍生自外切纤维二糖水解酶，所述第二催化结构域衍生自纤维素酶。在一个实施方案中，木霉属宿主细胞是里氏木霉细胞。在第二个实施方案中，外切纤维二糖水解酶是CBH1，纤维素酶是细菌纤维素酶。在第三个实施方案中，细菌纤维素酶来自解纤维热酸菌纤维素酶，特别是解纤维热酸菌E1、GH48或GH74纤维素酶。在第四个实施方案中，融合蛋白将缺少纤维素酶的CBD，在其他实施方案中，融合蛋白将包括纤维素酶的CBD。在第五个实施方案中，里氏木霉宿主细胞包含缺失的天然纤维素酶基因。

[0021]在第八个方面，本发明包括真菌纤维素酶组合物，该组合物包含纤维素酶融合蛋白或其组成成分，其中所述融合蛋白或其组成成分是重组木霉属某些种的产物。

附图简述

[0022]图1示出了本发明包含的异源纤维素酶融合构建物，其包括里氏木霉cbh1启动子、cbh1核心(cbh1信号序列和cbh1催化结构域)、cbh1接头序列、kexin位点、E1核心(解纤维热酸菌E1内切葡聚糖酶催化结构域)、cbh1终止子和构巢曲霉amdS选择标记。

[0023]图2是里氏木霉cbh1信号序列(SEQ ID NO：2)、里氏木霉cbh1催化结构域(SEQ ID NO：3)和里氏木霉cbh1接头(SEQ ID NO：4)的DNA序列(SEQ ID NO：1)。信号序列用下划线表示，催化结构域用粗体表示，接头序列用斜体表示。

[0024]图3显示的是基于图2中提供的核苷酸序列而预测的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)，其中所述信号肽用下划线表示，催化结构域，由(SEQ ID NO：6)阐述，用粗体表示，接头序列用斜体表示。

[0025]图4图示了编码解纤维热酸菌GH5A内切葡聚糖酶I(E1)催化结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。

[0026]图5是基于图4中提供的核苷酸序列而预测的解纤维热酸菌GH5A E1催化结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

[0027]图6图示了编码解纤维热酸菌GH48纤维素酶催化结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

[0028]图7是基于图6中提供的核苷酸序列而预测的解纤维热酸菌GH48催化结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

[0029]图8A-8B示出了编码解纤维热酸菌GH74-内切葡聚糖酶(EG)催化结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。

[0030]图9是基于图8A和8B中提供的核苷酸序列而预测的解纤维热酸菌GH74-EG氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

[0031]图10示出了编码褐色高温双岐菌E-3(TfE-3)纤维素酶的CBD、接头和催化结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。

[0032]图11是基于图10中提供的核苷酸序列而预测的TfE-3CBD、接头和催化结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

[0033]图12示出了编码褐色高温双岐菌内切葡聚糖酶5(TfE5)的CBD、接头和催化结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。

[0034]图13是基于图12中提供的核苷酸序列而预测的TfE5 CBD、接头和催化结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。

[0035]图14是实施例1中描述的异源纤维素酶融合构建物的核苷酸序列(2656个碱基)(SEQ ID NO：17)，包括：里氏木霉CBH1信号序列；里氏木霉CBH1的催化结构域；里氏木霉CBH1接头序列；kexin切割位点，其包括氨基酸SKR的密码子，以及编码解纤维热酸菌GH5A-E1催化结构域的序列。

[0036]图15是基于图14中的核酸序列而预测的纤维素酶融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。

[0037]图16提供了pTrex4质粒的示意图，该质粒用于表达实施例中描述的异源融合纤维素酶构建物(CBH1-内切葡聚糖酶)，包含里氏木霉cbh1启动子、里氏木霉CBH1信号序列、催化结构域、接头序列、kexin切割位点和插入在SpeI和AscI位点之间的感兴趣的纤维素酶基因(在该实施例中是内切葡聚糖酶)，cbhI里氏木霉终止子和amdS构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶标记基因。

[0038]图17A-E提供了图16中的pTrex4质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)(10239bp)，除了包含纤维素催化结构域的感兴趣的纤维素酶基因。

[0039]图18示出了里氏木霉菌株克隆的摇瓶生长物上清液样品的SDS-PAGE凝胶结果，该里氏木霉菌株剔除了纤维素酶，cbh1、cbh2、egl1和egl2，并用CBH1-E1融合构建物转化。泳道1和10代表MARK 12 Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA)。泳道2-8代表各种转化子，泳道9代表未转化的里氏木霉菌株。上面的箭头指出纤维素酶融合蛋白，下面的箭头指出切割的E1催化结构域。

[0040]图19示出了里氏木霉菌株克隆的摇瓶生长物上清液样品的SDS-PAGE凝胶结果，该里氏木霉菌株剔除了纤维素酶，cbh1、cbh2、egl1和egl2，并用CBH1-GH48融合构建物转化。泳道1代表未转化的对照。泳道2代表MARK12Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA)。泳道3-12代表了各种转化子。箭头表示CBH1-GH48融合蛋白。

[0041]图20示出了里氏木霉菌株克隆的摇瓶生长物上清液样品的SDS-PAGE凝胶结果，该里氏木霉菌株剔除了纤维素酶，cbh1、cbh2、egl1和egl2，并用CBH1-GH74融合构建物转化。泳道1代表未转化的对照。泳道3代表MARK12Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA)。泳道2和4-12代表了各种转化子。上面的箭头大概示出CBH1-GH74融合蛋白，下面的箭头表示切割的GH74催化结构域。

[0042]图21示出了里氏木霉菌株克隆的摇瓶生长物上清液样品的SDS-PAGE凝胶结果，该里氏木霉菌株剔除了纤维素酶，cbh1、cbh2、egl1和egl2，并用CBH1-TfE3融合构建物转化。泳道1代表MARK12 Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA)。泳道2-12代表各种转化子。箭头表示在表达CBH1-TfE-3融合物的转化子中观察到的新的条带。

[0043]图22示出了里氏木霉菌株克隆的摇瓶生长物上清液样品的SDS-PAGE凝胶结果，该里氏木霉菌株剔除了纤维素酶，cbh1、cbh2、egl1和egl2，并用CBH1-TfE5融合构建物转化。泳道1代表MARK12 Protein Standard(Invitrogen)。泳道2代表未转化的菌株，泳道3-12代表各种转化子。箭头表示在表达CBH1-TfE5融合物的转化子中观察到的新的条带。

[0044]图23示出了含有天然纤维素酶基因的里氏木霉亲代菌株和表达CBH1-E1融合蛋白的相应的里氏木霉菌株在一定的时间里将纤维素转化为可溶性糖的百分比，参见实施例3。

发明详述

[0045]现在，将通过使用下面的定义和实施例，仅仅以参考的方式来详细描述本发明。此处提及的所有的专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，都特意地以引用方式并入。

[0046]除非本文另有定义，此处应用的所有技术术语和科学术语，皆具有与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，JohnWiley and Sons，New York(1994)和Hale & Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向技术人员提供了本发明中应用的许多术语的一般性诠释。关于本领域的定义和术语，实践者可以特别地参考Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第二和第三版)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989和2001，和Ausubel FM etal.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，1993。

[0047]应该理解，本发明不限于所描述的具体的方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管与此处描述的方法和材料相似或者等价的任意方法和材料可以被用于本发明的实践或者试验中，但仍描述了优选的方法和材料。

[0048]数字范围包括用于限定该范围的端值。除非另有指明，分别地，核酸以5’到3’的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基末端向羧基末端的方向从左至右书写。

[0049]通过下面的详细描述，本发明的其他目标、特征和优点将变得显而易见。然而应该理解，尽管详细描述和具体实施例说明了本发明的优选实施方案，它们仅仅以举例说明的方式给出，这是因为通过该详细描述，在本发明范围和精神之内进行的各种变化和修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。

1.定义

[0050]术语“异源纤维素酶融合构建物(heterologous cellulase fusion construct)”指由不同基因的各个部分以可操作性连接的方式组成的核酸构建物。成分从5′端起包括编码第一催化结构域的DNA分子和编码第二催化结构域的DNA分子，其中所述第一催化结构域是真菌外切纤维二糖水解酶催化结构域，所述第二催化结构域是纤维素酶催化结构域。

[0051]术语“纤维素酶融合蛋白(cellulase fusion protein)”或“具有纤维素分解活性的融合蛋白(fusion protein having cellulolytic activity)”指这样的酶，其显示出纤维素分解活性，并具有真菌外切纤维二糖水解酶催化结构域和纤维素酶催化结构域。

[0052]术语“纤维素酶融合蛋白的成分(components of a cellulase fusion protein)”指纤维素酶融合蛋白各个(切割的)片段，其中每一片段具有纤维素分解活性，包括融合蛋白的第一催化结构域或第二催化结构。

[0053]术语“纤维素酶(cellulase)”指将纤维素(β-1，4-葡聚糖或β-D-糖苷键)聚合物水解成较短的纤维-寡糖寡聚体、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。

[0054]术语“外切纤维二糖水解酶(exo-cellobiohydrolase)”(CBH)指归为EC3.2.1.91的一组纤维素酶。这些酶也称为外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶。CBH酶从纤维素的还原端或非还原端水解纤维二糖。一般而言，CBH1类酶优选从纤维素的还原端水解纤维二糖，CBH2类酶优选水解纤维素的非还原端。

[0055]术语“内切葡聚糖酶(endoglucanase)”(EG)指归为EC 3.2.1.4的一组纤维素酶。EG酶水解纤维素的内部β-1，4糖苷键。

[0056]术语“β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidases)”指归为EC 3.2.1.21的一组纤维素酶。

[0057]“纤维素分解活性(cellulolytic activity)”包括外切葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性或两类酶活性。

[0058]术语“催化结构域(catalytic domain)”指纤维素酶氨基酸序列中具有纤维素酶催化活性的结构部分或区域。催化结构域是纤维素酶三级结构中不同于纤维素结合位点的结构元件，而纤维素结合位点是将纤维素酶与底物诸如纤维素结合的结构元件。

[0059]如本文中所使用，术语“纤维素结合结构域(cellulose binding domain)(CBD)”指纤维素酶中参与纤维素酶的纤维素结合活性的氨基酸序列部分或纤维素酶区域。纤维素结合结构域通常通过非共价地将纤维素酶结合到纤维素、纤维素衍生物或其他多糖等价物而发挥功能。CBD一般独立于催化结构域而发挥功能。

[0060]术语“第一催化结构域(first catalytic domain)”指真菌外切纤维二糖水解酶的催化结构域。

[0061]术语“第二催化结构域(second catalytic domain)”或“纤维素酶催化结构域(cellulase catalytic domain)”指纤维素酶的催化结构域，其中所述纤维素酶可以是外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，其中该催化结构域可操作性地连接到第一催化结构域的3′端。

[0062]当被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸便被“可操作性地连接(operably linked)”。例如，如果编码信号肽的DNA作为参与多肽分泌的蛋白前体表达，则它是被可操作性地连接到编码多肽的DNA；如果启动子影响序列的转录，则该启动子被可操作性地连接到编码序列。一般而言，“可操作性地连接”指被连接的DNA序列是邻接的，并且在异源纤维素酶融合构建物的情况中，是邻接的且处于同一阅读框中。

[0063]如在此所使用地，术语“基因(gene)”指参与产生多肽链的DNA片段，它们可以包括或可以不包括在编码区之前和之后的区域，例如5′非翻译区(5′UTR)或“前导”序列和3′UTR或“尾随(trailer)”序列，以及在各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

[0064]如在此所使用地，术语“多肽(polypeptide)”指由通过肽键相连的单链氨基酸残基构成的化合物。如在此所使用，术语“蛋白质(protein)”可以与术语“多肽”同义，或还可以指两个或更多个多肽的复合体。

[0065]术语“核酸分子(nucleic acid molecule)”、“核酸(nucleic acid)”或“多核苷酸(polynucleotide)”包括RNA、DNA和cDNA分子。应该理解，由于遗传密码子简并性的缘故，可以产生多个编码给定的蛋白质诸如纤维素酶融合蛋白的核苷酸序列。

[0066]“异源(heterologous)”核酸序列具有在表达该核酸的细胞中为非天然存在的序列部分。例如，就控制序列而言，异源序列指在天然条件下不调控该同样基因的控制序列(即，启动子或增强子)，而该基因的表达现在被它调控。一般而言，异源核酸序列对于它们所存在的细胞或基因组的一部分而言不是内源性的，它们是通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔或类似方法加入到细胞中。“异源”核酸序列可以含有控制序列/DNA编码序列组合，其与在天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同。术语异源核酸序列包含本发明的异源纤维素酶融合构建物。

[0067]如本文中所使用，术语“载体(vector)”指设计用于在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸序列或构建物。“表达载体(expression vector)”指能够将异源DNA序列整合入外来细胞并在其中表达的载体。表达载体可以是重组产生的或合成产生的，携带有允许特定核酸在目标细胞中转录的一系列特定的核酸元件。重组表达盒可以整合入质粒、染色体、线粒体DNA、病毒或核酸片段中。

[0068]如在此所使用，术语“质粒(plasmid)”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建物，其在许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自主复制的遗传成份。

[0069]如此处所使用，术语“选择标记(selectable marker)”指能够在细胞中表达的核苷酸序列，其中该选择标记的表达赋予含有表达的基因的细胞在相应的选择性试剂存在下或在相应的选择性生长条件下生长的能力。

[0070]如在此所使用，术语“启动子(promoter)”指其功能为指导下游基因转录的核酸序列。一般而言，启动子适合于目标基因在其中被表达的宿主细胞。启动子，以及其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定的基因所必需的。一般来说，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子或激动子序列。

[0071]术语“信号序列(signal sequence)”或“信号肽(signal peptide)”指在蛋白质的N-端部分的氨基酸序列，其帮助分泌成熟形式的蛋白质到细胞外。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，该信号序列是在分泌过程中被切除掉。

[0072]术语“宿主细胞(host cell)”指这样的细胞，其含有本发明的异源纤维素酶融合构建物或包含有该异源纤维素酶融合构建物的载体，并支持该异源纤维素酶融合构建物的复制和/或转录或转录和翻译(表达)。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。一般来说，宿主细胞是丝状真菌。

[0073]术语“丝状真菌(filamentous fungi)”包括本领域技术人员认识的所有丝状真菌。优选的真菌选自真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)，特别地选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢菌属(Fusarium)、金孢菌属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或可选的它们的有性形式，诸如裸孢壳属(Emericella)和肉座菌属(Hypocrea)(参见Kuhls et al.，1996)。

[0074]丝状真菌的特征在于营养菌丝，其具有由几丁质、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的细胞壁。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长进行的，并且碳代谢是专性需氧的。

[0075]术语“衍生自(derived)”包括术语源自、获自或可获自和分离自。

[0076]“等同的(equivalent)”氨基酸序列是，不与原始参考氨基酸序列完全相同而是包括一些氨基酸变化的氨基酸序列，所述变化可以是取代、删除、添加或类似情况，其中所述蛋白质基本上显示出与参考蛋白相同性质的生物学活性。等同氨基酸序列可以与原始参考序列具有80％-99％之间的氨基酸同一性。优选地，等同氨基酸序列与参考序列具有至少85％、90％、93％、95％、96％、98％和99％的同一性。

[0077]“取代(substitution)”由一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替换而产生。取代通常依据已知的保守取代进行，其中一类氨基酸用同一类中的氨基酸取代。“非保守氨基酸取代”指一类中的氨基酸用另一类中的氨基酸取代。

[0078]“删除(deletion)”指一个或多个核苷酸或氨基酸缺失的核苷酸或氨基酸序列变化。

[0079]“添加(addition)”指相比原始的参考序列，由插入一个或多个核苷酸或氨基酸而引起的核苷酸或氨基酸序列中的变化。

[0080]如本文中所使用地，“重组子(recombinant)”包括指细胞或载体，其已通过引入异源核酸序列进行修饰，或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中未以相同形式被发现的基因，或者表达的是天然基因，但是该天然基因在另外情况下异常地表达、表达不足或者根本不表达，这是有意的人为干涉的结果。

[0081]如本文中所使用地，术语“转化的(transformed)”、“稳定转化的(stablytransformed)”或“转基因的(transgenic)”当指细胞时，指该细胞具有本发明的异源核酸序列，所述异源核酸序列整合入它的基因组，或作为附加体质粒存在，其保留多代。

[0082]在将异源纤维素酶融合构建物或异源核酸序列插入到细胞的上下文中，术语“引入(introduced)”指“转染(transfection)”、“转化(transformation)”或“转导(transduction)”，包括将异源核酸序列或异源纤维素酶融合构建物整合入真核或原核细胞中，其中所述异源核酸序列或异源纤维素酶核酸构建物可以被整合入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化为自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

[0083]如本文中所使用地，术语“表达(expression)”指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程既包括转录又包括翻译。

[0084]由此得知，术语“纤维素酶融合蛋白表达(cellulase fusion proteinexpression)”或“融合表达(fusion expression)”指含有融合到第二纤维素酶催化结构域的第一催化结构域的“异源纤维素酶融合构建物(heterologous cellulase fusionconstruct)”的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽和其衍生物。

[0085]如本文中所使用，术语“纯化(purifying)”一般指对含有重组核酸或蛋白的细胞进行生物化学纯化和/或柱层析。

[0086]如本文中所使用，术语“活性的(active)”和“生物学活性的(biologicallyactive)”指与特定的蛋白相关的生物学活性，诸如与纤维素酶相关的酶活性。由此得知，给定蛋白的生物学活性指本领域技术人员一般认为该蛋白所具有的任何生物学活性。

[0087]如本文中所使用，术语“富集的(enriched)”指在真菌纤维素酶组合物中发现的纤维素酶的浓度，大于在野生型或天然存在的真菌纤维素酶组合物中发现的浓度。术语富集的、提高的和增强的在本文中可以交换使用。

[0088]“野生型真菌纤维素酶组合物(wild type fungal cellulase composition)”指由天然存在的真菌来源产生的真菌纤维素酶组合物，其含有一种或多种BG、CBH和EG组分，其中这些组分中的每一种以由真菌来源产生的比率被发现。

[0089]因此，举例说明，天然存在的纤维素酶体系可以用文献中充分公开的已知的分离技术纯化成基本上纯的组分，这些分离技术包括在合适的pH进行离子交换层析、亲和层析、尺寸排阻和类似技术。然后，纯化的纤维素酶融合蛋白或其组分可以被加入到酶溶液中，产生富集的纤维素酶溶液。也可能的是，通过表达本发明的纤维素酶融合蛋白，提高由微生物产生的EG或CBH的数量。

[0090]“一(A)”、“一(an)”、“该(the)”包括复数形式，除非上下文中另外说明。

[0091]如本文中所使用地，术语“含有(comprising)”和它的同源词以它们的包含性的含义使用，也就是等同于术语“包括(including)”和它的相应的同源词。

[0092]“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collectionlocated)，位于Manassas VA 20108(ATCC，www/atcc.org)。

[0093]“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Centerfor Agricultural utilization Research(之前称为USDA Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，ILL。

2.优选实施方案

A.异源纤维素酶融合构建物和表达载体的组成成分和构建

[0094]异源纤维素酶融合构建物或包含异源纤维素酶融合构建物的载体可以被引入丝状真菌宿主细胞并在该细胞中复制，以表达并分泌蛋白质。

[0095]异源纤维素酶融合构建物的成分从所述构建物的5′端起，以可操作性连接的方式包括，可选的信号序列、编码第一催化结构域的DNA分子和编码第二催化结构域的DNA分子，其中所述第一催化结构域衍生自真菌外切纤维二糖水解酶(CBH)，所述第二催化结构域衍生自纤维素酶。

[0096]在另一实施方案中，异源纤维素酶融合物从所述构建物的5′端起，以可操作性连接的方式包括，信号序列、编码CBH催化结构域的DNA分子、编码第二纤维素酶催化结构域的CBD的DNA分子，和编码该第二纤维素酶催化结构域的DNA分子，其中所述纤维素酶第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。

[0097]在另一实施方案中，所述构建物从所述构建物的5′端起，以可操作性连接的方式包括，信号序列、编码CBH的催化结构域的DNA分子、可选地编码CBH的CBD的DNA分子、接头、可选地编码第二催化结构域的CBD的DNA分子、和编码第二催化结构域的DNA分子。

[0098]在进一步的实施方案中，异源纤维素酶融合构建物或表达载体从5′端起，以可操作性连接的方式包括，丝状真菌可分泌蛋白的启动子；编码信号序列的DNA分子；编码第一催化结构域的DNA分子；接头；可选择地编码第二催化结构域的CBD的DNA；编码第二催化结构域的DNA，和终止子。

[0099]一个优选的表达载体将从5′端起，以可操作性连接的方式包括，丝状真菌可分泌蛋白的启动子、编码真菌外切纤维二糖水解酶信号序列的DNA分子、编码外切纤维二糖水解酶的催化结构域的DNA分子、接头、编码纤维素酶催化结构域的DNA分子和终止子。

[00100]在一些实施方案中，载体将包括外切纤维二糖水解酶的CBD，在一些实施方案中，载体将包括第二催化结构域的纤维素酶CBD。在优选的实施方案中，纤维素酶催化结构域的编码序列(包括纤维素酶CBD或缺少纤维素酶CBD)不包括纤维素酶信号序列。参见图1、14和16，作为包含本发明的表达载体和异源纤维素酶融合构建物的实施方案的例子。

[00101]示范性的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。例子包括来自黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)cbh1或trp1基因；黑曲霉或Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶编码基因；里氏木霉cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纤维素酶编码基因的启动子；CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、在tet开启和tet关闭系统中含有tet应答元件(TRE)的启动子(ClonTech和BASF)、β肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是待被转化的真菌宿主细胞中天然存在的启动子。

[00102]在一个优选实施方案中，启动子是外切纤维二糖水解酶cbh1或cbh2启动子，特别是cbh1启动子，诸如里氏木霉cbh1动子。里氏木霉cbh1启动子是诱导型启动子，可以参见GenBank登记号D86235。

[00103]编码外切纤维二糖水解酶催化结构域的DNA序列可操作性地连接到编码信号序列的DNA序列。信号序列优选为与要被表达的外切纤维二糖水解酶天然相关的信号序列。优选地，信号序列由编码CBH的木霉属或曲霉属基因编码。更优选地，信号序列由编码CBH1的木霉属基因编码。在进一步的实施方案中，异源纤维素酶融合构建物的启动子和信号序列源自同一来源。在一些实施方案中，信号序列是木霉属cbh1信号序列，其与木霉属cbh1启动子可操作性地连接。在进一步的实施方案中，信号序列具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与之具有至少95％序列同一性的序列。

[00104]大部分的外切纤维二糖水解酶(CBHs)和内切葡聚糖酶(EGs)具有由通过连接肽与纤维素结合结构域(CBD)隔开的催化结构域组成的多结构域结构(Suurnakkiet al.，2000)。催化结构域含有活性位点，而CBD通过将酶与纤维素结合而与纤维素发生相互作用(van Tilbeurgh et al.，1986和Tomme et al.，1988)。

[00105]大量的纤维素酶已在科学文献得到描述，它们的例子包括：来自里氏木霉：Shoemaker，S.et al.，Bio/Technology，1：691-696，1983，其公开了CBH1；Teeri，T.et al.，Gene，51：43-52，1987，其公开了CBH2；Penttila，M.et al.，Gene，45：253-263，1986，其公开了EG1；Saloheimo，M.et al.，Gene，63：11-22，1988，其公开了EG2；Okada，M.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，64：555-563，1988，其公开了EG3；Saloheimo，M.etal.，Eur.J.Biochem.，249：584-591，1997，其公开了EG4；和Saloheimo，A.et al.，Molecular Microbiology，13：219-228，1994，其公开了EG5。来自木霉属之外的种的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶也已经在下面的文献中被描述，例如Ooi et al.，1990，其公开了编码由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)产生的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T et al.，1996，其公开了编码棘孢曲霉的β-葡糖苷酶1的cDNA的克隆和测序；Sakamoto et al.，1995，其公开了编码Aspergilluskawachii IFO 4308的内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；和Saarilahti et al.，1990，其公开了Erwinia carotovara的内切葡聚糖酶。编码这些酶的序列可以用于本发明的异源纤维素酶融合构建物。

[00106]在一些实施方案中，第一催化结构域衍生自真菌CBH。在其它实施方案中，CBH是CBH1型外切纤维二糖水解酶，在其他实施方案中，催化结构域衍生自CBH2型外切纤维二糖水解酶。在一些实施方案中，CBH1催化结构域衍生自木霉属某些种。

[00107]在一个实施方案中，第一催化结构域由里氏木霉cbh1的核酸序列编码。在一些实施方案中，该核酸是SEQ ID NO：3的序列和与之同源的核苷酸序列。

[00108]在其他实施方案中，第一催化结构域将具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和与之等同的氨基酸序列。编码SEQ ID NO：6的所述氨基酸序列的任何等同氨基酸序列的其他DNA序列可以整合入异源纤维素酶融合构建物，其中所述等同序列具有与SEQ ID NO：6相似性质的生物学活性。

[00109]在一些实施方案中，本发明的异源纤维素酶融合构建物将包括位于编码外切纤维二糖水解酶催化结构域的序列的3′侧以及编码内切葡聚糖酶催化结构域的序列的5′侧的接头。在一些优选实施方案中，接头与外切纤维二糖水解酶的催化结构域来自同一来源。优选地，接头将衍生自木霉属cbh1基因。在图3中示出了一个优选的接头序列。在其他实施方案中，异源纤维素酶融合构建物或表达载体可以包括两个或更多个接头。例如，接头不仅可以位于第一催化结构域的编码序列和第二催化结构域的编码序列之间，而且可以位于第二催化结构域的CBD的编码区域和第二催化结构域的编码区域之间。一般而言，接头可以在约5至60个氨基酸残基之间，约15至50个氨基酸残基之间，约25至45个氨基酸残基之间。有关里氏木霉CBH1的连接肽的论述，参见Srisodsuk M.et al.，1993。

[00110]除了接头序列，异源纤维素酶融合构建物或含有纤维素酶融合构建物的载体可以包括切割位点，诸如蛋白酶切割位点。在一个优选的实施方案中，切割位点是kexin位点，其编码二肽Lys-Arg。

[00111]异源纤维素酶融合构建物包括纤维素酶的第二催化结构域的编码序列。纤维素酶可以来自真菌或细菌。此外，纤维素酶可以是外切纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡聚糖酶(EG)。在一些优选的实施方案中，第二催化结构域来自细菌纤维素酶。CBH和EG纤维素酶的来源都在上文中被提及。此外，使用Coutinho，P.M.et al.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)server atafmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index的分类方法，在超过13个糖基水解酶家族中发现了内切葡聚糖酶。

[00112]编码细菌纤维素酶的第二催化结构域的特别优选的DNA序列包括：

a)SEQ ID NO：7的DNA，编码具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的解纤维热酸菌GH5A内切葡聚糖酶I(E1)催化结构域；

b)SEQ ID NO：9的DNA序列，编码具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的解纤维热酸菌GH48纤维素酶催化结构域；

c)SEQ ID NO：11的DNA，编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的解纤维热酸菌GH74内切葡聚糖酶催化结构域；

d)SEQ ID NO：13的DNA，编码具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的褐色高温双岐菌E3纤维素酶；

e)SEQ ID NO：15的DNA序列，编码具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的褐色高温双岐菌E5内切葡聚糖酶；

f)编码所述SEQ ID NO：8、10、12、14和16的氨基酸序列的任何等价物的DNA序列或同源DNA序列，其中所述等价物与所述序列具有类似性质的生物学活性。

[00113]在一些优选的实施方案中，内切葡聚糖酶是解纤维热酸菌E1，参考在WO9105039；WO 9315186；USP 5,275,944；WO 9602551；USP 5,536,655和WO 0070031中公开的解纤维热酸菌内切葡聚糖酶。也参考GenBank U33212。在一些实施方案中，解纤维热酸菌E1具有与SEQ ID NO：6至少90％、93％、95％和98％序列同一性的氨基酸序列。

[00114]如上所述，与SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13和15中示出的核酸序列同源的核酸序列可以用于本发明的异源纤维素酶融合构建物或载体中。同源序列包括在其他种、天然存在的等位基因变异体和生物学活性功能衍生物中发现的序列。当用序列比对程序比对时，同源序列将与SEQ ID NOs：1、3、7、9、11、13和15的其中一条序列具有至少80％、85％、88％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的同一性。例如，给定序列的同源物在给定序列诸如本文中描述的Tf-E3催化结构域的编码序列的长度范围内，具有80％以上的序列同一性。

[00115]对于给定的异源纤维素酶融合构建物或该构建物的成分，应该理解，由于遗传密码子简并性，可以产生许多编码具有同样的氨基酸序列的蛋白的编码序列。例如，三联CGT编码氨基酸精氨酸。可选择地，精氨酸可以由CGA、CGC、CGG、AGA和AGG编码。因此，应该理解，在编码区域中的这种取代落入本发明所覆盖的核酸序列的范围内。如本文中描述，任何和所有这些序列都可以以同样的方式用作CBH催化结构域或纤维素酶催化结构域。

[00116]可以用于测定两序列之间的同一性的示范性的计算机程序包括但是不限于BLAST程序组，诸如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其可以在因特网上公开获得，网址为www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/。也可参见，Altschul，et al.，1990和Altschul，et al.，1997。

[00117]当评价给定的核酸序列与在GenBank DNA序列数据库和其他公共数据库中的核酸序列的相关性时，通常使用BLASTN程序进行序列搜索。BLASTX程序优选用于搜索这样的核酸序列，其已经按照所有阅读框进行翻译，基于GenBank蛋白序列数据库和其他公共数据库中的氨基酸序列进行搜索。BLASTN和BLASTX都使用默认参数(default parameters)运行：开放空位罚分(open gappenalty)为11.0；延伸空位罚分(extended gap penalty)为1.0，并利用BLOSUM-62矩阵。(参见如Altschul，et al.，1997.)

[00118]为了测定两条和更多条序列之间的“％同一性”，对选择的序列的优选联配，使用例如MacVector version 6.5的CLUSTAL-W程序来实施，用默认参数进行操作，包括开放空位罚分10.0，延伸空位罚分0.1，和BLOSUM 30相似性矩阵。

[00119]在一个示范性的方法中，可以用常规的引物延伸程序如Sambrook et al.，supra中所述的程序，对编码CBH或EG催化结构域的核酸进行序列延伸，以检测CBH或细菌EG前体和可能还未被逆转录成cDNA的mRNA加工中间产物，和/或鉴定编码催化结构域或全长蛋白的ORF。

[00120]在还有另一方面中，里氏木霉chb1或GH5a-E1的核酸序列的全部或部分核苷酸序列可以用作探针。此探针可以被用于从相关生物体鉴定和克隆出同源核酸序列。

[00121]使用标准程序，诸如在Sambrook et al.，(1989)中所述的程序，用选择的探针可以筛选cDNA或基因组文库。在Sambrook et al.，supra中给出了杂交条件，包括中等严紧型和高严紧型条件。

[00122]此外，也优选通过使用“序列比较算法”，确定氨基酸序列的比对，以测定序列之间的同源性或同一性。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过下述方法进行：通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法(localhomology algorithm)；通过Needleman & Wunsch，J.MoI.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法(homology alignment algorithm)；通过Pearson & Lipman，Proc.Nat7Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的搜索相似性的方法；通过这些算法的计算机化处理(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，通过视觉检测或通过Chemical Computing Group，Montreal Canada的MOE。

[00123]适合于测定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其描述于Altschul，etal.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，也可以参考Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。进行BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(<www.ncbi.nlhn.nih.gov>)公开获得。

[00124]本发明的异源纤维素酶融合构建物也可以包括终止子序列。在一些实施方案中，终止子和启动子来自同一来源，例如木霉外切纤维二糖水解酶基因。在其他实施方案中，终止子和启动子来自不同的来源。在优选的实施方案中，终止子来自丝状真菌来源特别是木霉属。特别适合的终止子包括来自木霉属的菌株特别是里氏木霉的cbh1，和来自黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶终止子(Nunberg et al.，1984和Boel et al.，1984)。

[00125]异源融合构建物或包括该融合构建物的载体也可以包括选择性标记。合适的选择性标记的选择将取决于宿主细胞，对不同的宿主细胞合适的标记是本领域熟知的。典型的选择性标记基因包括构巢曲霉或里氏木霉的argB；构巢曲霉的amdS；粗糙脉孢菌或里氏木霉的pyr4；黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。可用于转化木霉属的载体系统的标记描述于Finkelstein，Chap.6，BIOTECHNOLOGY OFFILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein et al eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA1992。来自构巢曲霉的amdS基因编码乙酰胺酶，该乙酰胺酶允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源来生长。(Kelley et al.，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila et al.，Gene61：155-164(1987))。选择性标记(例如pyrG)可以恢复营养缺陷型突变菌株在选择性基本培养基上生长的能力，选择性标记(例如olic31)可以赋予转化子在抑制性药物或抗生素存在下生长的能力。

[00126]图1和14描述了典型的异源纤维素酶融合构建物。用于连接本发明包含的异源纤维素酶核酸构建物和其他异源核酸序列的方法，以及将它们插入合适的载体的方法是本领域熟知的。连接通常在常规的限制性位点进行，如果这样的位点不存在，根据常规的实践使用合成的寡核苷酸接头。此外，载体可以用已知的重组技术构建。

[00127]可以使用任何载体，只要该载体能在引入的细胞中复制并维持存在。在Sambrook et al.，1989；Ausubel FM et al.，1993和Strathem et al.，1981中，描述了大量的合适的克隆和表达载体，每一文献特意并入本文，作为参考。其他合适的真菌表达载体描述于van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)In：Bennett，J.W.andLasure，L.L.(eds.)More Gene Manipulations in Fungi.Academic Press，pp.396-428。可以用各种方法，将合适的DNA序列插入载体中。一般而言，用标准的方法，将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。认为，这样的方法和相关亚克隆方法在本领域技术人员的知识范围内。示范性的有用质粒包括pUC18、pBR322、pUC100、pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)和pFB6。也可以使用其他的通用载体，诸如在曲霉属中，使用pRAX，在木霉属中，也可以使用pTEX(图16和17)。

B.目标宿主细胞

[00128]在本发明的一个实施方案中，丝状真菌亲本细胞或宿主细胞可以是下述种的细胞，这些种是但不限于木霉属某种(Trichoderma sp.)、青霉属某种(Penicilliumsp.)、腐质霉属某种(Humicola sp.)、金孢菌属某种(Chrysosporium sp.)、胶霉属某种(Gliocladium sp.)、曲霉属某种(Aspergillus sp.)、镰孢菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢菌属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericellasp.)。如本文中所使用地，术语“木霉属”或“木霉属某种”指以前已经分类为木霉属或目前分类为木霉属的任何真菌菌株。木霉属真菌亲本细胞的一些优选种包括长梗木霉(reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)细胞。特别优选的宿主细胞包括来自里氏木霉的菌株诸如RL-P37(Sheir-Neiss，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)和功能等价和衍生菌株诸如里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)的细胞。也参考ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56767和NRRL 1509。

[00129]曲霉属真菌亲本细胞的一些优选的种包括黑曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉和构巢曲霉细胞。在一个实施方案中，菌株包括黑曲霉，例如黑曲霉泡盛变种(A.nigervar awamori)dgr246(Goedegebuur et al，(2002)Curr.Genet 41：89-98)和GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4(Ward，M，et al.，(1993)，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743)。

[00130]在一些例子中，期望获得丝状宿主细胞菌株诸如木霉属宿主细胞菌株，这些菌株在引入本发明的异源纤维素酶融合构建物之前已经剔除了一个或多个纤维素酶基因。这些菌株可以通过美国专利5,246,853、美国专利5,861,271和WO92/06209中公开的方法制备，这些专利并入本文作为参考。通过在缺失了一个或多个纤维素酶基因的宿主微生物中表达具有纤维素分解活性的纤维素酶融合蛋白或其成分，简化了鉴定和随后的纯化程序。可以从木霉属某种剔除已被克隆的任何基因，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因，以及那些编码EG3和/或EG5蛋白的基因(分别参见例如美国专利5,475,101和WO 94/28117)。通过用本领域已知的方法将某一形式的要删除或破坏的期望的基因插入到质粒中来进行基因剔除。

[00131]亲代真菌细胞系通常用培养基在标准条件下培养，培养基含有生理盐和营养物，诸如Pourquie，J.et al.，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert J.P.et al.，Academic Press pp.71-86(1988)和IImen，M.et al.，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306(1997)所述。也考虑普通商业上制备的培养基诸如酵母麦芽提取物(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤和Sabouraud Dextrose(SD)肉汤。

C.将异源纤维素酶融合构建物或载体引入真菌宿主细胞以及培养条件

[00132]宿主真菌细胞可以用本发明的异源纤维素酶融合构建物、包括异源纤维素酶融合构建物的克隆载体或表达载体进行遗传修饰(即，转导、转化或转染)。本发明的转化方法可以将构建物或载体的全部或部分稳定整合入丝状真菌的基因组。然而，也考虑导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。

[00133]许多标准转化方法可以用于产生丝状真菌细胞系，诸如木霉属或曲霉属细胞系，其表达大量的异源蛋白。一些用于将DNA构建物引入木霉属的产纤维素酶菌株的公开的方法包括Lorito，Hayes，DiPietro和Harman(1993)Curr.Genet.24：349-356；Goldman，VanMontagu和Herrera-Estrella(1990)Curr.Genet.17：169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen和Knowles(1987)Gene 61：155-164，EP-A-0244234；以及Hazell B.et al.，2000；对于曲霉属，包括Yelton，Hamer和Timberlake(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474；对于镰孢菌属，包括Bajar，Podila和Kolattukudy，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212；对于链霉菌属，包括Hopwood et al.，(1985)Genetic manipulation of streptomyces：alaboratory manual，The John Innes Foundation，Norwich，UK；对于芽孢杆菌属(Bacillus)，包括Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi和Matteuzzi，(1990)，FEMSMicrobiol.Lett.55：135-138。

[00134]将异源纤维素酶融合构建物或载体引入丝状真菌(例如红褐肉座菌(H.jecorina))的其他方法包括但不限于，使用粒子或基因枪(生物射弹)、在转化程序之前渗透处理丝状真菌细胞壁(例如，通过使用高浓度的碱，例如0.05M至0.4MCaCl₂或醋酸锂)、原生质体融合、电穿孔或农杆菌属介导的转化(美国专利6,255,115)。

[00135]通过用聚乙二醇和CaCl₂处理原生质体或原生质球来转化丝状真菌的示例性方法描述于Campbell，et al.，(1989)Curr.Genet.16：53-56，1989和Penttila，M.et al.，(1988)Gene，63：11-22和Penttila，M.et al.，(1987)Gene，61：155-164。

[00136]可以使用将外来核苷酸序列转化入宿主细胞的任何熟知的方法。唯一必需的是，所用的特定的遗传工程方法能够成功地将至少一个基因引入能够表达该异源基因的宿主细胞。

[00137]本发明包括含有纤维素酶融合蛋白编码序列的丝状真菌尤其是木霉属细胞的转化子。本发明还包括用于生产真菌纤维素酶组合物的丝状真菌转化子，所述组合物包括纤维素酶融合蛋白或其组分。

[00138]包含外切葡聚糖酶催化结构域编码序列和内切葡聚糖酶催化结构域编码序列的异源纤维素酶融合构建物被引入之后，遗传修饰的细胞可以在上述的用于目标宿主细胞生长的并进行适当修改以激活启动子和选择转化子的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如温度、pH和类似条件如前面选择用来表达的宿主细胞所用的条件，并且将是本领域技术人员清楚的。给定的丝状真菌优选的培养条件也可以在科学文献和/或从真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心获得(ATCC；″www.atcc.org/″)找到。

[00139]通常，丝状真菌的稳定转化子可以与不稳定的转化子区分开来，这通过它们在固体培养基上更快的生长速率，以及形成具有平滑的而不是粗糙的轮廓的环状集落来区分。另外，在一些情况下，稳定性的进一步测试可以通过在固体非选择性培养基上培养转化子来进行，从该培养基收获孢子，并且确定随后将发芽并在选择性培养基上生长的这些孢子的百分比。

[00140]通常认为，已经引入异源纤维素酶融合构建物或包含它们的载体的细胞的子代，包含由异源纤维素酶融合构建物中的核酸序列编码的融合蛋白。

[00141]在本文中包含的发明的一个示范性应用中，含有异源纤维素酶融合构建物的丝状真菌例如里氏木霉的重组菌株将不仅产生纤维素酶融合蛋白，而且也将产生纤维素酶融合蛋白的组成成分。在一些实施方案中，相比生长在基本上相同条件下，但是经遗传修饰而包含编码外切纤维二糖水解酶催化结构域和/或纤维素酶催化结构域的独立的异源核酸构建物的相应的重组丝状真菌菌株，包含纤维素酶融合构建物的重组细胞将产生增加量的纤维素分解活性。

[00142]在一些实施方案中，纤维素酶融合蛋白及其成分包括融合到解纤维热酸菌E1催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和切割的CBH1和E1产物。

[00143]在一些实施方案中，纤维素酶融合蛋白及其成分包括融合到解纤维热酸菌GH48纤维素酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和切割的CBH1和解纤维热酸菌GH48产物。

[00144]在其他实施方案中，纤维素酶融合蛋白及其成分包括融合到解纤维热酸菌GH74内切葡聚糖酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和切割的CBH1和GH74产物。

[00145]在其他实施方案中，纤维素酶融合蛋白及其成分包括融合到褐色高温双岐菌E3纤维素酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和切割的CBH1和E3产物。

[00146]在其他实施方案中，纤维素酶融合蛋白及其成分包括融合到褐色高温双岐菌E5内切葡聚糖酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和切割的CBH1和E5产物。

D.蛋白表达的分析

[00147]为了评价用异源纤维素酶融合构建物转化的细胞系表达本发明的纤维素酶融合蛋白，可以在蛋白质水平、RNA水平进行分析，或利用功能性生物分析，特别是对外切纤维二糖水解酶活性或内切葡聚糖酶活性和/或产量进行功能性生物分析。

[00148]一般而言，可以用下述分析方法确定纤维素酶融合蛋白表达构建物和载体序列的整合：Northern印迹、点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)、原位杂交、使用合适标记的探针(基于核酸编码序列)、常规Southern印迹和放射自显影。

[00149]此外，纤维素酶的生产和/或表达可以在样品中直接测量，例如通过分析纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶活性、表达和/或产生。这些分析方法描述于例如Becker et al.，Biochem J.(2001)356：19-30；Mitsuishi et al.，FEBS(1990)275：135-138.Shoemaker et al.1978；和Schulein 1988)，每一篇文献特意并入本文作为参考。CBH1水解分离的可溶性和不溶性底物的能力可以使用Srisodsuk et al.，J.Biotech.(1997)57：49-57以及Nidetzky和Claeyssens Biotech.Bioeng.(1994)44：961-966中描述的分析方法测量。用于分析外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的底物包括晶体纤维素、滤纸、磷酸溶胀纤维素(phosphoric acid swollen cellulose)、纤维寡糖、甲基伞形酯乳糖苷(methylumbelliferyl lactoside)、甲基伞形酯纤维二糖苷(methylumbelliferyl cellobioside)、邻硝基苯基乳糖苷(orthonitrophenyllactoside)、对硝基苯基乳糖苷(paranitrophenyl lactoside)、邻硝基苯基纤维二糖苷(orthonitrophenyl cellobioside)、对硝基苯基纤维二糖苷(paranitrophenylcellobioside)。

[00150]此外，蛋白表达可以用免疫学方法评价，诸如细胞的免疫组织化学染色、组织切片，或组织培养基的免疫测定，例如用Western印迹或ELISA进行。这样的免疫测定可以用于定量和定性评价纤维素酶例如CBH的表达。这些方法的细节是本领域技术人员知道的，用于实践这些方法的许多试剂可通过商业渠道获得。

[00151]在本发明的实施方案中，由重组宿主细胞表达的纤维素酶融合蛋白将占总表达的纤维素酶的约0.1至80％。在其他实施方案中，表达的融合蛋白的数量将在每升培养基约0.1mg至100g；约0.1mg至50g和0.1mg至10g蛋白范围内。

E.纤维素酶融合蛋白和其组成成分的回收和纯化

[00152]一般而言，在细胞培养物中产生的纤维素酶融合蛋白或纤维素酶融合蛋白的成分被分泌到培养基中，可以例如通过从细胞培养基除去不想要的组分，进行回收和可选地进行纯化。然而，在一些情况下，纤维素酶融合蛋白或其成分可以以细胞内形式产生，这就需要从细胞裂解物回收它们。在这些情况中，用本领域技术人员常规使用的技术，从产生蛋白质的细胞中纯化蛋白质。例子包括但是不限于：亲和层析(van Tilbeurgh et al.，FEBS Lett.16：215，1984)、离子交换层析方法(Goyal et al.，Bioresource Technol.36：37-50，1991；Fliess et al.，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314-318，1983；Bhikhabhai et al.，J.Appl.Biochem.6：336-345，1984；Ellouz et al.，J.Chromatography 396：307-317，1987)，包括使用具有高分辨能力材料的离子交换(Medve et al.，J.Chromatography A 808：153-165，1998)、疏水相互作用层析(Tomaz and Queiroz，J.Chromatography A 865：123-128，1999)，和两相分离(Brumbauer，et al.，Bioseparation 7：287-295，1999)。

[00153]一旦给定的纤维素酶融合蛋白或其成分被表达，由此产生的蛋白可以用本领域已知的方法从细胞或细胞培养物中纯化出来，参考：Deutscher，Methods inEnzymology，vol.182，no.57，pp.779，1990；和Scopes，Methods Enzymol.90：479-91，1982。适合用于该纯化的示例性方法包括如下：抗体-亲和柱层析；离子交换层析；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或阳离子交换树脂诸如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和胶凝过滤，使用例如Sephadex G-75。

[00154]纯化形式的纤维素酶融合蛋白或其成分可以用于产生对表达的蛋白具有特异性的单克隆或多克隆抗体，用于各种免疫分析(参见例如Hu et al.，Mol CellBiol，vol.11，no.11，pp.5792-5799，1991)。示例性分析包括ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、Western印迹、间接免疫荧光测定和类似分析。

F.包括纤维素酶融合蛋白或其成分的酶组合物的利用

[00155]纤维素酶融合蛋白和含有纤维素酶融合蛋白的催化结构域的成分可用于许多不同的应用中，包括用于洗涤剂组合物、石磨洗组合物、用在将木浆降解为糖的组合物中(例如生物-乙醇生产)、和/或用于饲料组合物。在一些实施方案中，纤维素酶融合蛋白或其成分因此可以用作无细胞提取物。在其他实施方案中，将表达异源纤维素酶融合构建物的真菌细胞在分批或连续发酵条件下培养。典型的分批发酵是封闭的系统，其中培养基的组成在发酵初始时设置，并在发酵期间不进行人工调整。因此，在发酵开始时，培养基用期望的生物体接种。在该方法中，在不将任何组分添加到系统中的情况下进行发酵。典型地，依据碳源的添加，分批发酵可称为“分批”，并常常努力控制各种因素，诸如pH和氧浓度。分批系统的代谢物和生物物质组成持续变化，直到发酵终止的那一时刻。在分批培养物内，细胞由迟缓期进入到高速生长的对数期，最终达到稳定期，在该时期，生长速率减少或停止。如果不处理，在稳定期的细胞最终死亡。一般而言，在对数期的细胞负责大量产生终产物。

[00156]在标准分批系统中的变化是“喂料-分批发酵(fed-batch fermentation)”系统，该系统也可以用于本发明。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进程，底物以一定增量加入。当分解代谢产物抑制作用倾向于抑制产物的产生，以及在期望培养基中具有有限量的底物的时候，喂料-分批系统是有用的。测量喂料-分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此，根据可测量的因素诸如pH、溶解的氧和废气诸如CO₂的分压的变化，进行估计。分批和喂料-分批发酵是本领域常见的并且是为人熟知的。

[00157]连续发酵是一个开放的系统，其中确定成分的发酵培养基被持续加入到生物反应器中，同时移出等量的条件培养基，以继续发酵。连续发酵通常将培养物维持在恒定的高密度状态下，其中细胞主要处于对数生长期。

[00158]连续发酵允许调控影响细胞生长和/或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。因此，在一个实施方案中，限制性营养物诸如碳源或氮源维持在固定的速率，所有其他参数允许调节。在其他系统中，影响生长的许多因素可以持续调整，而细胞浓度——其用培养基浊度测量——保持恒定。连续系统努力维持稳态生长条件。因此，由于培养基的排除导致的细胞损失必须依据发酵中的细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因素以进行连续发酵工艺的方法以及使得产物形成的速度最大化的技术是工业微生物领域熟知的。

[00159]在一些应用中，纤维素酶融合蛋白及其成分可以应用于洗涤剂组合物、石磨洗组合物或用于处理织物以改进它们的触感和外观。洗涤剂组合物指打算在洗涤介质中使用以洗涤弄脏的含纤维素织物的混合物。石磨洗组合物指用于石磨洗含纤维素织物的制剂。石磨洗组合物用于在出售之前，即在制作过程期间，修饰含纤维素的织物。相反，洗涤剂组合物用于清洗弄脏的衣服，并不在制造工艺期间使用。

[00160]在本发明的上下文中，除了纤维素酶之外，这样的组合物也可以包括表面活性剂、另外的水解酶、增洁剂、漂白剂、漂白激活剂、上蓝剂(bluing agents)和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂(masking agents)、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。

[00161]表面活性剂包括阴离子、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，如通常发现于洗涤剂中的那些表面活性剂。阴离子表面活性剂包括线性的或者分支的烷基苯磺酸盐；具有线性或分支烷基基团或者烯基基团的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐和烷烃磺酸盐。兼性表面活性剂包括季铵磺酸盐和甜菜碱型兼性表面活性剂。这样的兼性表面活性剂在同一分子中既有正电荷基团又有负电荷基团。非离子型表面活性剂可以包括聚氧化烯醚，以及更高级的脂肪酸链烷醇酰胺或者其氧化烯加合物、脂肪酸甘油单酯和类似物。

[00162]含纤维素的织物(cellulose containing fabric)可以是指任何缝制或者非缝制的织物、纱或者纤维，由含棉或者不含棉的纤维素制成，或者由含棉或者不含棉的纤维素掺合物制成，包括天然纤维素和人造纤维素(如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和莱赛尔纤维(lyocell))。含棉织物(cotton-containing fabric)指缝制或者非缝制的织物、纱或纤维，其由纯棉或棉掺合物制成，包括棉织物(cotton wovenfabrics)、棉编织物(cotton knits)、斜纹粗棉布(cotton denims)、棉纱(cotton yarns)、原棉和类似物。

[00163]优选地，被使用的包含纤维素酶融合蛋白或其成分的纤维素酶组合物相对于整个洗涤剂组合物的重量百分数为大约0.00005至大约5。更优选地，被使用的纤维素酶组合物相对于整个洗涤剂组合物的重量百分数为大约0.0002至大约2。

[00164]由于纤维素产品的水解速率可以通过使用具有插入到基因组的异源纤维素酶融合构建物的转化子而增加，所以含有纤维素或者杂多糖的产品可以以更快的速度和更大的程度被降解。在垃圾中由纤维素制成的产品如纸、棉、纤维质尿布和类似物可以被更有效的降解。因此，可从多个转化子或者单独的转化子获得的发酵产物可以被用在组合物中，以通过液化的方法来帮助降解在过度拥挤的填埋垃圾中的各种纤维素产品。

[00165]基于纤维素的供给料由农业废物、草和木材和其它低价值的生物材料如城市废物(例如，回收纸、院落修剪物等等)组成。乙醇可以通过对任何这些纤维素质供给料进行发酵而产生。然而，在转变为乙醇之前，纤维素必须首先转变为糖。因此，含有增加量的纤维素分解活性的组合物可以用于乙醇生产，其中纤维素分解活性的增加是因包含有纤维素酶融合蛋白或其成分而引起的。

[00166]利用纤维素质生物材料例如树、草本植物、城市固体废物和农业残留物及林业残留物的糖化和发酵过程可以产生乙醇。然而，由微生物产生的天然发生的纤维素酶混合物中各纤维素酶的比例对于生物材料中的纤维素至葡萄糖的快速转变，可能不是最有效的。已知，内切葡聚糖酶的作用是，生成新的纤维素链末端，而这样的末端本身又是纤维二糖水解酶的作用底物，由此可以改善整个纤维素酶系统的水解效率。因此，应用来自纤维素酶融合蛋白或其成分的增加的和优化的内切葡聚糖酶活性，可以大大提高乙醇和糖的产量，它们可以通过发酵转化为其他化学制品。

[00167]因此，本发明的纤维素酶融合蛋白及其成分可以用于将纤维素水解成它的糖组分。在一种实施方案中，在加入发酵生物体之前，将纤维素酶融合蛋白或成分加入到生物材料(biomass)中。在另一种实施方案中，将纤维素酶融合蛋白或成分与发酵生物同时加入到生物材料中。可选地，在每种实施方案中，可以存在其它的纤维素酶成分。

实验

[00168]下面的实施例进一步详细描述了本发明，这些实施例的意图并不在于以任何方式限制本发明的范围。

[00169]在下面的公开内容和实验部分中，使用下述缩写：CBH1-E1(融合到解纤维热酸菌GH5A内切葡聚糖酶I催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和接头)；CBH1-48E(融合到解纤维热酸菌GH48纤维素酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和接头)；CBH1-74E(融合到解纤维热酸菌GH74内切葡聚糖酶催化结构域的里氏木霉CBH1催化结构域和接头)；CBH1-TfE3(里氏木霉CBH1催化结构域和接头，其融合到CBD，接头和褐色高温双岐菌E3纤维素酶的催化结构域)；和CBH1-TfE5(里氏木霉CBH1催化结构域和接头，其融合到CBD，接头和褐色高温双岐菌E5内切葡聚糖酶的催化结构域)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(每分钟的转数)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔每升)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；邻苯二甲酸盐缓冲液(邻苯二甲酸钠，水中，20mM，pH 5.0)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mMNaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三[羟甲基]氨基甲烷)；w/v(重量与体积之比)；w/w(重量与重量之比)；v/v(体积与体积之比)；和Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)。

实施例1

CBH1-E1融合载体的构建

[00170]CBH1-E1融合构建物包括里氏木霉cbh1启动子；从起始密码子到cbh1接头末端的里氏木霉cbh1基因序列和内切葡聚糖酶编码序列的起始端的5’侧的额外12个碱基的DNA，终止密码子和里氏木霉cbh1终止子(参见图14和15)。额外的12个DNA碱基(ACTAGTAAGCGG)(SEQ ID NO.：20)编码限制性内切核酸酶SpeI位点和氨基酸Ser、Lys和Arg。

[00171]含有E1基因座的开放阅读框的质粒E1-pUC19在PCR反应中用作DNA模板。在USP 5,536,655中描述了等同的质粒，该美国专利也描述了放线菌解纤维热酸菌ATCC 43068的E1基因的克隆，Mohagheghi A.et al.，1986。利用操作质粒DNA和通过PCR扩增DNA的标准程序(Sambrook et al.，1989和2001)。

[00172]使用下面两条引物来扩增E1内切葡聚糖酶的催化结构域的编码区域。

正向引物1＝EL-316(含 SpeI位点)：

GCTTAT ACTAGTAAGCGCGCGGGCGGCGGCTATTGGCACAC(SEQ ID NO：21)

反向引物2＝EL-317(含 AscI位点和终止密码子反向互补物)：

GCTTAT GGCGCGCCTTAGACAGGATCGAAAATCGACGAC(SEQ ID NO：22)。

[00173]反应条件如下，使用PLATINUM Pfx DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的材料：1μl dNTP Master Mix(最终浓度0.2mM)；1μl引物1(最终浓度0.5μM)；1μl引物2(最终浓度0.5μM)；2μl DNA模板(最终浓度50-200ng)；1μl 50mM MgSO₄(最终浓度1mM)；5μl 10×Pfx扩增缓冲液；5μl 10×PCR增强溶液；1μl Platinum Pfx DNA聚合酶(总2.5U)；33μl水，总反应体积为50μl。

[00174]扩增参数为：

步骤1-94℃，2分钟(第一个循环仅使抗体结合的聚合酶变性)；

步骤2-94℃，45秒；

步骤3-60℃，30秒；

步骤4-68℃，2分钟；

步骤5-步骤2重复进行24个循环；和

步骤6-68℃，4分钟。

[00175]将正确大小的PCR产物克隆入Zero Blunt TOPO载体中，并转化入化学感受态Top10大肠杆菌细胞(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，该细胞被涂在合适的选择培养基上(LA，含有50ppm卡那霉素)，并在37℃培养过夜。从培养基板挑取若干菌落，并以5ml培养物于37℃在选择培养基(LB，含有50ppm卡那霉素)中培养，由此制备质粒小量制备物。

[00176]从若干克隆获得的质粒DNA被限制性消化，以确认正确大小的插入物。通过DNA测序确认正确的序列。在测序确认之后，通过用限制性酶SpeI和AscI消化，从TOPO载体切下E1催化结构域。将该片段连接入pTrex4载体，所述载体已用限制性酶SpeI和AscI消化(参见图16和17)。

[00177]将连接混合物转化入MM294感受态大肠杆菌细胞，铺板于合适的选择培养基上(LA，含有50ppm羧苄青霉素)，并于37℃培养过夜。从培养基板挑取若干菌落，并以5ml培养物于37℃在选择培养基(LB，含有50ppm羧苄青霉素)中培养，由此制备质粒小量制备物。通过限制性消化确认正确连接的CBH1-E1融合载体。

实施例2

CBH1-E1融合构建物转化入里氏木霉宿主菌株并在其中表达

[00178]用CBH1-E1融合构建物转化各种里氏木霉菌株。宿主菌株包括里氏木霉RL-P37的衍生物，和其中天然纤维素酶基因(cbh1、cbh2、egl1和egl2)已被剔除的里氏木霉衍生物。

[00179]将平板上约二分之一拭样(或1-2cm²)的形成孢子的里氏木霉菌株RL-P37(Sheir-Neiss，et al.，1984)衍生物的菌丝体(在PDA平板上在28℃生长7天)接种到置于250ml的带有4个挡板的摇瓶中的50mM YEG(5g/L酵母提取物加上20g/L葡萄糖)肉汤中，30℃在200rpm培养16-20小时。

[00180]通过将该液体体积转移入50ml锥形管并在2500rpm旋转10min，回收菌丝体。吸走上清液。将菌丝体沉淀物转移入含有40ml B葡聚糖酶溶液的250ml，CACorning瓶中，30℃、200rpm下温育2小时，以产生用于转化的原生质体。通过用无菌滤布(miracloth)进行过滤，原生质体被收获到50ml锥形管中。通过以2000rpm旋转离心5分钟将它们沉淀，并抽吸掉液体。用50ml的1.2M山梨糖醇将原生质体沉淀物洗涤一次，旋转沉淀下来，抽吸掉液体，用25ml的山梨糖醇CaCl₂洗涤。对原生质体计数，然后再以2000rpm沉淀5分钟，吸走上清液，将原生质体沉淀物重悬在足够量的山梨糖醇CaCl₂中，以获得每毫升含1.25×10⁸个原生质体的原生质体浓度，从而产生原生质体溶液。

[00181]将最多20μg的表达载体DNA(体积不超过20μl)的等份物放置到15ml锥形管中，将管子置于冰上。然后在每份转化等份物中加入200μl的原生质体，再加入50μl PEG溶液。轻轻地混合管子，冰上温育20分钟。接下来，将额外的2mlPEG溶液加入到转化等份物管子中，然后温和地颠转，室温下将这些管子温育5分钟。接下来，加入4ml山梨糖醇/CaCl₂溶液至管中(得到的总体积为6.2ml)。将转化混合物分为3个等份，每份含有大约2ml。通过将这三份等份物中的每一份加入到含有10ml融化的乙酰胺/山梨醇顶层琼脂的三个管子中(通过维持在50℃而保持融化状态)，产生表层混合物(overlay mixture)，并将该表层混合物倾倒到乙酰胺/山梨醇琼脂选择平板上。然后将转化平板在30℃温育4至7天。

[00182]实施转化，用amdS进行选择。乙酰胺/山梨醇板和表层(overlays)被用于转化。对于选择平板，使用同样的平板，但是无山梨醇。通过将分离的菌落转移到含有乙酰胺的新鲜选择培养基中来纯化转化子。

[00183]参考实施例，如下制备下述溶液。

1)40ml β-D-葡聚糖酶溶液在1.2M山梨醇中制备，包括600mg β-D-葡聚糖酶和400mg MgSO₄·7H₂O。(Catalog No.0439-1，InterSpex Products Inc.San Mateo，CA)。

2)200ml PEG溶液，含有50g聚乙二醇4000(BDH Laboratory Supplies Poole，England)和1.47g CaCl₂·2H₂O，在dH₂O中制备。

3)山梨醇/CaCl₂，含有1.2M山梨醇和50mM CaCl₂。

4)乙酰胺/山梨醇琼脂：

第I部分——0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升华)、1.68g CsCl、20g葡萄糖、20g KH₂PO₄、0.6g MgSO₄·7H₂O、0.6g CaCl₂·2H₂O、1ml 1000×盐(见下面)，调整到pH 5.5，用dH₂O补足体积(300ml)，过滤并灭菌。

第II部分——20g Noble琼脂和218g山梨醇，用dH₂O补足体积(700ml)，高压灭菌。

将第II部分加入到第I部分，至终体积为1L。

5)1000×盐——将5g FeSO₄·7H₂O，1.6g MnSO₄·H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，1gCoCl₂·6H₂O混合，用dH₂O将体积补足到1L。将溶液过滤并灭菌。

6)如同乙酰胺/山梨醇琼脂，制备乙酰胺/山梨醇顶层琼脂，除了顶层琼脂替代noble琼脂。

[00184]该方法与Penttila et al.，Gene 61：155-164，1987中所描述的类似。将各个真菌转化子培养在摇瓶培养物中，以测定融合蛋白表达水平。该试验基本上按照美国专利5,874,276实施例1中描述的进行，作了下述修改：16g/L α-乳糖替换TSF培养基中的纤维素。预计在摇瓶中由转化子产生的切割的E1蛋白表达的最高水平超过3g/L。

[00185]总的来说，遵照如Foreman等人所描述的发酵方案(Foreman等人(2003)J.Biol.Chem 278：31988-31997)。用1.5ml冷冻的孢子悬液接种含有5％葡萄糖的Vogels基本培养基(Davis等人(1970)Methods in Enzymology 17A，第79-143页；和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORAGNISM，Oxford University Press，(2000))。48小时后，将每一培养物转移到14L Biolafitte发酵罐中的6.2L相同培养基中。发酵罐在25℃、750RPM和每分钟8个标准升的空气流中运行。在初始葡萄糖消耗完毕后1小时，开始供给25％(w/w)乳糖，以碳限制方式供给，以防止乳糖累积。用葡萄糖氧化酶测定试剂盒或者葡萄糖己糖激酶测定试剂盒(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)分别监控葡萄糖和乳糖的浓度，其中β-半乳糖苷酶被加入以裂解乳糖。以规律的时间间隔获得样品，以便监控发酵进程。收集的样品用Internal Equipment Company(Needham Heights，MA)临床离心机在50ml离心管中以3/4速率旋转离心。

[00186]摇瓶生长上清液样品在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉丙烷磺酸)SDS分离缓冲液和LDS样品缓冲液进行。图18中给出了结果。

实施例3

转化的里氏木霉克隆的纤维素分解活性的分析

[00187]下面的分析方法和底物被用于测定CBH1-E1融合蛋白的纤维素分解活性。

[00188]预处理的玉米秸秆(PCS)——如Schell，D.et al.，J.Appl.Biochem.Biotechnol.105：69-86(2003)中所述地，用2％w/w H₂SO₄预处理玉米秸秆，然后用去离子水进行多次洗涤，获得pH为4.5。加入醋酸钠，使得最终浓度为50mM，这被滴定至pH 5.0。

[00189]总蛋白测量——使用双金鸡纳酸方法测量蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准(Smith P.K.et al.，Biochem.150：76-85，1985)。

[00190]通过HPLC，根据Baker et al.，Appl.Biochem.Biotechno1.70-72：395-403(1998)中描述的方法，评价纤维素转化率(可溶性糖测定)。

[00191]在实验中使用标准的纤维素转化分析方法。在该分析方法中，酶和缓冲的底物放置于容器中，并在一定温度下温育一定的时间。用足量的100mM甘氨酸，pH 11.0淬灭反应，使得反应混合物的pH为至少pH 10。一旦反应被淬灭，使反应混合物的等份物过滤通过0.2微米的膜，从而除去固体。然后通过HPLC分析过滤的溶液中的可溶性糖，如上所述。反应混合物中的纤维素浓度大约7％。无论用于何种情况，酶或酶混合物的剂量为每克纤维素1至60mg总蛋白。

[00192]在一组试验中，在55℃，在50mM醋酸盐缓冲液中，使用10毫克酶/克纤维素，评价13.8％PCS(7.06％纤维素)在55℃进行1天的转化百分比。700rpm搅拌样品。比较1)含有天然纤维素酶基因的里氏木霉亲代菌株的生长上清液和2)根据此处的实施例转化的相应的里氏木霉CBH1-E1融合菌株的生长上清液。在多至24小时的各种时间点将样品淬灭。

[00193]在图23中给出了结果，观察到，CBH1-E1融合蛋白的性能超过亲代。CBH1-E1融合蛋白用大约6小时获得了20％的纤维素转化率，而亲代纤维素酶需要10小时取得20％的水解率。

实施例4

CBH1-48E融合构建物转化入里氏木霉并在其中表达

[00194]根据实施例1中描述的方法，设计CBH1-48E融合构建物，但具有下述差异。设计正向引物以维持阅读框翻译，并在cbh1接头序列的末端包含Lys-Arg kexin切割位点(下划线划出)。反向引物在GH48E的末端含有终止密码子。

[00195]被定购的引物具有5’磷酸，以便随后能进行平末端克隆。用下述正向和反向引物扩增GH48催化结构域：

[00196]GH48正向引物bluntF4——

CT AAGAGAAACGACCCGTACATCCAGCGGTTCCTCACGATGTA(SEQ IDNO：23)

GH48反向引物bluntR5——

TTACCCGGATGGGAAGAGCATGCCAAAATCGGCGTTCG(SEQ ID NO：24)。

[00197]用Stratagene′s Herculase高保真聚合酶(Stratagene，La JoIIa，CA)进行扩增。

使用的退火温度为65℃。包含GH48催化结构域的DNA质粒用作PCR的模板(大约0.2ugDNA)。在美国专利申请2003/0096342中描述了用于分离GH48基因的等同的方法。

扩增反应如下设置：

组分	μl
组分	μl	10×Herculase缓冲液	5
10mM dNTPs	1.5	10×Herculase缓冲液	5
10mM dNTPs	1.5	H₂O	39.5
正向引物(10μM)	1	H₂O	39.5
正向引物(10μM)	1	反向引物(10μM)	1
模板	1	反向引物(10μM)	1
模板	1	Herculase聚合酶(5U)	1
反应总体积	50	Herculase聚合酶(5U)	1

循环

阶段	循环次数	温度℃	小时:分钟:秒
阶段	循环次数	温度℃	小时:分钟:秒	1	1	95	00:03:00
2	10	95退火温度72	00:00:4000:00:3030秒/500bp	1	1	95	00:03:00
2	10	95退火温度72	00:00:4000:00:3030秒/500bp	3	20	95退火温度72	00:00:4000:00:3030秒/500bp+10秒/循环
4	1	4	维持	3	20	95退火温度72	00:00:4000:00:3030秒/500bp+10秒/循环

[00198]连接之前，所用PCR产物进行凝胶纯化，用Mung Bean Nuclease处理产生平末端。将扩增的、平末端的片段与pTrex4连接，该pTrex4已用限制性酶SpeI和AscI消化，再进行核酶消化，除去3′突出端，从而产生平末端。然后将新产生的载体转化入大肠杆菌。从转化的大肠杆菌的菌落，分离质粒DNA。因为扩增的GH48片段可以在两个不同的方向插入到pTrex4中，进行限制性消化以辨别含有准确定向的插入物的克隆。通过DNA测序确认推断的克隆。

[00199]根据Hazell，B.W.et al.，Lett.Appl.Microbiol.30：282-286(2000)的教导，使用生物射弹转化方法，转化融合载体。

[00200]如实施例3中对CBH1-E1融合蛋白表达的描述，测定CBH1-48E融合蛋白的表达。估计在摇瓶中由转化子产生的CBH1-GH48蛋白表达的最高水平为大约0.1g/L。

[00201]摇瓶生长上清液样品在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉丙烷磺酸)SDS分离缓冲液和LDS样品缓冲液进行。

图19中给出了结果。

实施例5

CBH1-74E融合构建物转化入里氏木霉并在其中表达

[00202]根据上面实施例1中描述的方法，设计CBH1-74E融合构建物，但具有下述差异。设计正向引物以维持阅读框翻译，并包含Lys-Arg kexin切割位点(下划线划出)。反向引物编码在催化结构域末端的终止密码子(反向互补物—下划线划出)。

[00203]被定购的引物具有5’磷酸，以便随后能进行平末端克隆。用下述正向和反向引物扩增GH74催化结构域：

GH74正向bluntF4—

CT AAGAGAGCGACGACTCAGCCGTACACCTGGAGCAACGTGGC(SEQ ID NO：25)和

GH74反向bluntR4—

TTACGATCCGGACGGCGCACCACCAATGTCCCCGTATA(SEQ ID NO：26)。

[00204]扩增条件和随后的克隆如实施例4所述，但是退火温度为60℃。

[00205]包含GH474催化结构域的分离的DNA片段用作PCR的模板(大约0.2ugDNA)。美国专利申请2003/0108988描述了GH74的克隆(在公开的专利申请中GH74称为AviIII)。

[00206]扩增之后，扩增的片段与pTrex4载体进行平末端连接，该pTrex4已经用SpeI和AscI消化，再进行核酶消化，除去3′突出端，从而产生平末端。通过测序确认具有融合构建物的载体。

[00207]根据Hazell B.et al.，Lett.Appl.Microbiol.30：282-286(2000)，使用生物射弹转化方法，将融合载体转化入里氏木霉。

[00208]如上面实施例2中对CBH1-E1融合蛋白表达的描述，测定CBH1-74E融合蛋白的表达。估计在摇瓶中由转化子产生的切割GH74蛋白表达的最高水平超过3g/L。

[00209]摇瓶生长上清液样品在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉丙烷磺酸)SDS分离缓冲液和LDS样品缓冲液进行。

图20中给出了结果。

实施例6

CBH1-TfE3融合构建物转化入里氏木霉并在其中表达

[00210]根据上面实施例1中描述的方法，设计CBH1-TfE3融合构建物，但具有下述差异。

[00211]使用下面的引物扩增TfE3纤维素酶，

EL-310正向引物(其含有 SpeI位点)——

GCTTAT ACTAGTAAGCGCGCCGGCTGCTCGGTGGACTACACG(SEQ IDNO：27)，和

EL-311反向引物(其含有 AscI位点)——

GCTTAT GGCGCGCCTTACAGAGGCGGGTAGGCGTTGG(SEQ ID NO：28)。

[00212]含有TfE3基因的质粒被用作DNA模板，用于扩增。Zhang，S.et al.，Biochem.34：3386-3395，1995中描述了等同模板DNA。扩增条件和随后的克隆如实施例1所述。载体构建和里氏木霉的生物射弹转化方法按照上面描述的进行。

[00213]估计在摇瓶中最高表达水平超过0.4g/L。

[00214]摇瓶生长上清液样品在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉丙烷磺酸)SDS分离缓冲液和LDS样品缓冲液进行。

图21中给出了结果。

实施例7

CBH1-TfE5融合构建物转化入里氏木霉并在其中表达

[00215]根据上面实施例1中描述的方法，设计CBH1-TfE5融合构建物，但具有下述差异。与Collmer & Wilson，Bio/Technol.1：594-601(1983)中描述的等同的、携带TfE5基因的质粒用作DNA模板，用于扩增TfE5。

[00216]使用下面的引物扩增TfE5内切葡聚糖酶。

EL-308(其含有SpeI位点)正向引物——

GCTTAT ACTAGTAAGCGCGCCGGTCTCACCGCCACAGTCACC(SEQ ID NO：29)和

EL-309(其含有AscI位点)反向引物——

GCTTAT GGCGCGCCTCAGGACTGGAGCTTGCTCCGC(SEQ ID NO：30)。

[00217]转化方法描述于上。估计在摇瓶中由转化子产生的切割的TfE5蛋白表达的最高水平超过2g/L。

[00218]摇瓶生长上清液样品在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉丙烷磺酸)SDS分离缓冲液和LDS样品缓冲液进行。

图22中给出了结果。

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Claims

1.编码纤维素酶融合蛋白的异源纤维素酶融合构建物，从所述构建物的5′端起以可操作性连接的方式，包括：

(a)编码信号序列的DNA分子；

(b)编码外切纤维二糖水解酶的催化结构域的DNA分子；和

(c)编码第二催化结构域的DNA分子，

其中所述第二催化结构域是纤维素酶的催化结构域。

2.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，还包括位于第一催化结构域的3′端和第二催化结构域的5′端的接头序列。

3.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述外切纤维二糖水解酶缺少纤维素结合结构域(CBD)。

4.权利要求2所述的异源纤维素酶融合构建物，还包括位于所述接头序列之后和所述第二催化结构域之前的kexin位点。

5.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，还包括丝状真菌可分泌蛋白的启动子，所述启动子以可操作的连接位于第一催化结构域的5′端。

6.权利要求5所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述启动子是cbh启动子。

7.权利要求6所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述启动子是衍生自里氏木霉(T.reesei)的cbh1启动子。

8.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，其中第一催化结构域衍生自CBH1外切纤维二糖水解酶。

9.权利要求8所述的异源纤维素酶融合构建物，其中第一催化结构域衍生自CBH1，具有与SEQ ID NO.：6中的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列。

10.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，其中第二催化结构域是内切葡聚糖酶催化结构域。

11.权利要求10所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述第二催化结构域是外切纤维二糖水解酶催化结构域。

12.权利要求10所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。

13.权利要求10所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述第二催化结构域选自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)GH5A内切葡聚糖酶I(E1)催化结构域；解纤维热酸菌GH48(GH48)纤维素酶催化结构域；解纤维热酸菌GH74内切葡聚糖酶(GH74-EG)催化结构域；褐色高温双岐菌(Thermobifida fusca)E3(Tf-E3)纤维素酶催化结构域；和褐色高温双岐菌E5内切葡聚糖酶(Tf-E5)催化结构域。

14.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述异源纤维素酶融合构建物缺少第一催化结构域的外切纤维二糖水解酶的纤维素结合结构域，和第二催化结构域的纤维素酶的纤维素结合结构域。

15.权利要求13所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述第二催化结构域是解纤维热酸菌GH5A E1催化结构域。

16.权利要求15所述的异源纤维素酶融合构建物，其中所述第二催化结构域是解纤维热酸菌GH5A E1催化结构域，具有与SEQ ID NO：8中的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列。

17.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，还包括位于所述第二催化结构域的3′端的终止子序列。

18.权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物，还包括选择标记。

19.载体，从5′端起以可操作性连接的方式包括：

(a)丝状真菌可分泌蛋白的启动子；

(b)编码信号序列的DNA分子；

(c)编码第一催化结构域的DNA分子，其中所述第一催化结构域衍生自真菌的外切纤维二糖水解酶；

(d)编码第二催化结构域的DNA分子，其中所述第二催化结构域是纤维素酶的催化结构域；和

(e)终止子。

20.根据权利要求19所述的载体，还包括选择标记。

21.根据权利要求19所述的载体，还包括位于所述第一催化结构域的3′端和所述第二催化结构域的5′端的接头。

22.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体缺少编码所述第一催化结构域的纤维素结合结构域的DNA序列。

23.根据权利要求19所述的载体，还包括kexin位点。

24.根据权利要求19所述的载体，其中所述第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。

25.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体缺少编码所述第二催化结构域的纤维素酶的纤维素结合结构域的DNA序列。

26.真菌宿主细胞，其用权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物转化。

27.真菌宿主细胞，其用权利要求19所述的包括异源纤维素酶融合构建物的载体转化。

28.重组真菌细胞，包含DNA序列，所述DNA序列选自异源纤维素酶融合构建物和包括所述异源纤维素酶融合构建物的载体。

29.根据权利要求26所述的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞是木霉属(Trichoderma)宿主细胞。

30.根据权利要求29所述的真菌宿主细胞，其中所述木霉属宿主细胞是里氏木霉的菌株。

31.根据权利要求29所述的真菌宿主细胞，其中，一个或多个天然纤维素酶基因已从所述真菌宿主细胞中剔除。

32.根据权利要求31所述的真菌宿主细胞，其中所述天然纤维素酶基因选自cbh1、cbh2、egl1和egl2。

33.具有纤维素分解活性的分离的纤维素酶融合蛋白，所述蛋白包括

(a)第一催化结构域，其中所述第一催化结构域是外切纤维二糖水解酶催化结构域，和

(b)第二催化结构域，其中所述第二催化结构域衍生自纤维素酶。

34.权利要求33所述的分离的纤维素酶融合蛋白，其中所述外切纤维二糖水解酶是CBH1。

35.权利要求33所述的分离的纤维素酶融合蛋白，其中所述第二催化结构域衍生自细菌纤维素酶。

36.权利要求35所述的分离的纤维素酶融合蛋白，其中所述细菌纤维素酶是内切葡聚糖酶。

37.权利要求35所述的分离的纤维素酶融合蛋白，其中所述细菌纤维素酶是外切纤维二糖水解酶。

38.权利要求35所述的分离的纤维素酶融合蛋白，其中所述细菌纤维素酶衍生自解纤维热酸菌的菌株。

39.纤维素分解组合物，包括权利要求33所述的分离的纤维素酶融合蛋白。

40.产生具有纤维素分解活性的酶的方法，包括：

(a)用权利要求1所述的异源纤维素酶融合构建物或者权利要求19所述的载体稳定转化丝状真菌宿主细胞；

(b)在适合于所述真菌宿主细胞产生具有纤维素分解活性的酶的条件下，培养所述转化的真菌宿主细胞；和

(c)回收所述酶。

41.权利要求40所述的产生具有纤维素分解活性的酶的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。

42.权利要求40所述的产生具有纤维素分解活性的酶的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是里氏木霉宿主细胞。

43.权利要求40所述的产生具有纤维素分解活性的酶的方法，其中所述外切纤维二糖水解酶是CBH1，所述纤维素酶选自解纤维热酸菌纤维素酶和褐色高温双岐菌纤维素酶。

44.权利要求40所述的产生具有纤维素分解活性的酶的方法，其中所述回收的酶选自纤维素酶融合蛋白、所述纤维素酶融合蛋白的组成成分、所述纤维素酶融合蛋白和其所述成分的组合。

45.权利要求44所述的产生具有纤维素分解活性的酶的方法，其中所述回收的一种或多种酶被纯化。

46.木霉属宿主细胞，其表达纤维素酶融合蛋白，其中所述融合蛋白包括第一催化结构域以及第二催化结构域，其中所述第一催化结构域衍生自外切纤维二糖水解酶，所述第二催化结构域衍生自纤维素酶。

47.权利要求46所述的木霉属宿主细胞，其中所述木霉属宿主细胞是里氏木霉细胞。

48.权利要求46所述的木霉属宿主细胞，其中所述外切纤维二糖水解酶是CBH1，所述纤维素酶是细菌纤维素酶。

49.权利要求48所述的木霉属宿主细胞，其中所述细菌纤维素酶衍生自解纤维热酸菌纤维素酶。

50.权利要求49所述的木霉属宿主细胞，其中所述细菌纤维素酶选自解纤维热酸菌E1、GH48和GH74纤维素酶。

51.权利要求46所述的木霉属宿主细胞，其中所述融合蛋白缺少所述纤维素酶的CBD。

52.权利要求46所述的木霉属宿主细胞，其中一个或多个天然纤维素酶基因已从所述木霉属宿主细胞中剔除。

53.真菌纤维素酶组合物，包括纤维素酶融合蛋白或其组成成分，其中所述融合蛋白或其组成成分是重组木霉属某些种(Trichoderma spp.)的产物。