BR112012006978B1 - célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, para degradar ou converter um material celulósico ou um material contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico ou um material contendo xilano, construção contendo ácido nucleico, e, vetor de expressão. - Google Patents

Abstract

polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material, para produzir um produto de fermentação e para fermentar um material, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna inibitória de filmamento duplo. a presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolados tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. a invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendo polinucleotídeos bem como os métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

(54) Título: CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE XILANASE, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO OU UM MATERIAL CONTENDO XILANO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO OU UM MATERIAL CONTENDO XILANO, CONSTRUÇÃO CONTENDO ÁCIDO NUCLEICO, E, VETOR DE EXPRESSÃO.

(51) Int.CI.: C12N 9/24; C07K 14/385.

(30) Prioridade Unionista: 29/09/2009 US 61/246887.

(73) Titular(es): NOVOZYMES, INC.; NOVOZYMES A/S.

(72) Inventores): LAN TANG; YE LIU; JUNXIN DUAN; HANSHU DING.

(86) Pedido PCT: PCT US2010050709 de 29/09/2010 (87) Publicação PCT: WO 2011/041405 de 07/04/2011 (85) Data do Início da Fase Nacional: 28/03/2012 (57) Resumo: POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA PRECURSORA, PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO E PARA FERMENTAR UM MATERIAL, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, E, MOLÉCULA DE RNA INIBITÓRIA DE FILMAMENTO DUPLO. A presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolados tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendo polinucleotídeos bem como os métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

“CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE XILANASE, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO OU UM MATERIAL CONTENDO XILANO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO OU MATERIAL CONTENDO XILANO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, E, VETOR DE EXPRESSÃO.”

Declarações com Relação aos Direitos das Invenções Feitas Sob Pesquisa e Desenvolvimento Federalmente Patrocinado

Esta invenção foi feita em parte com Suporte governamental sob o Acordo de Cooperativa DE-FC36-08GO18080 concedido pelo Department of Energy. O governo tem certos direitos nesta invenção.

Referência a uma listagem de sequência

Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível por computador. A forma legível por computador está incorporada aqui por referência.

Referência a um depósito de material biológico

Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é incorporado aqui por referência.

Fundamentos da invenção

Campo da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendo polinucleotídeos bem como os métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da técnica relacionada

Petição 870180061048, de 16/07/2018, pág. 18/24

A celulose é um polímero da glicose de açúcar simples ligado por ligações beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam glicanos beta-ligados. Estas enzimas incluem endoglicanases, celobioidrolases e beta-glicosidases. As endoglicanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, que o abrem para o ataque por celobioidrolases. As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado por beta-1,4 solúvel em água de glicose. As beta-glicosidases hidrolizam celobiose a glicose.

A conversão de estoques de alimentação lignocelulósicos em etanol tem as vantagens da disponibilidade rápida de grandes quantidades de estoques de alimentação, a desejabilidade de evitar a queima ou enchimento dos materiais com terra e a limpeza do combustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, lavouras herbáceas e resíduos sólidos municipais foram considerados como estoques de alimentação para a produção de etanol. Estes materiais consistem primariamente de celulose, hemicelulose e lignina. Uma vez que a celulose é convertida a glicose, a glicose é facilmente fermentada por levedura em etanol.

Existe uma necessidade na técnica de melhorar as composições de proteína celulósica através da suplementação com enzimas adicionais para aumentar a eficiência e para melhorar as soluções de enzima eficazes em custo para a degradação de lignocelulose.

A presente invenção fornece polipeptídeos tendo atividade de xilanase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase selecionado do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro da

SEQ ID NO: 2;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ü);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 e (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codifica polipeptídeos tendo atividade de xilanase, selecionado do grupo que consiste de:

(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2;

(b) um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii);

(c) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 e (d) um polinucleotídeo que codifica uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras recombinantes que compreendem o polinucleotídeos e métodos de produzir o polipeptídeos tendo atividade de xilanase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula, uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. O presente também diz respeito a uma tal molécula inibidora de filamento duplo (dsRNA), em que opcionalmente o dsRNA é uma molécula de siRNA ou uma de miRNA.

A presente invenção também diz respeito um métodos de usar os polipeptídeos tendo atividade de xilanase para a degradação ou conversão de material celulósico ou contendo xilano.

A presente invenção também diz respeito a plantas que compreendem um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividade de xilanase sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção ainda diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2; a construções de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem o polinucleotídeo e a métodos de produzir uma proteína.

Breve descrição das figuras

A Figura 1 mostra um mapa de restrição de pPpin3.

As Figuras 2A e 2B mostram a sequência de DNA genômico e a sequência de aminoácido deduzida de um gene de xilanase de Penicillium pinophilum NN046877 GH10 (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).

Definições

Xilanase: O termo “xilanase” é definido aqui como um 1,4beta-D-xilan-xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilano. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de xilano é determinada usando-se xilano de madeira de bétula como substrato. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 pmol de açúcar de redução (medido em equivalentes de glicose como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279) produzido por minuto durante o período inicial de hidrólise em 50° C, pH 5 de 2 g de xilano de madeira de bétula por litro como substrato em 50 mM de acetato de sódio pH 5 contendo TWEEN® 20 a 0,01 %.

Atividade de degradação de xilano: Os termos “atividade de degradação de xilano” OU “atividade xilanolítica” são definidos aqui como uma atividade biológica que hidroliza o material contendo xilano. Os dois métodos básicos para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetil xiluma esterases, ácido ferúlico esterases e alfa-glucuronil esterases). Progressos recentes em ensaios de enzimas xilanolíticas são resumidos em diversas publicações incluindo Biely and Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and

Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601 e Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, and Kubicek, 1997, The beta-D-xilosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xiloidrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

A atividade de degradação de xilano total pode ser medida pela determinação da redução de açúcares formados a partir de vários tipos de xilano, incluindo xilanos de aveia, espelta, faia e lariço ou pela determinação polimérica de fragmentos de xilano pigmentados liberados a partir de vários xilanos covalentemente pigmentados. O ensaio de atividade xilanolítica total mais comum está fundamentado na produção de açúcares de redução de 4-Ometil glucuronoxilano polimérico como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of atividade de xilanase, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270.

Para os propósitos da presente invenção, a atividade de degradação de xilano é determinada pela medição do aumento na hidrólise de xilano de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzimas de degradação de xilano sob as seguintes condições típicas: reações de 1 ml, 5 mg/ml de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 50° C, 24 horas, análise de açúcar usando-se um ensaio de hidrazida do ácido phidroxibenzóico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem ΑΊ'. 273-279.

Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” é definido aqui como um beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exohidrólise de (1—>4)-xilooligossacarídeos beta curtos, para a remoção dos resíduos de D-xilose sucessivos a partir dos terminais não redutores. Para os propósitos da presente invenção, uma unidade de atividade de beta-xilosidase é definida como 1,0 pmol de p-nitrofenol produzido por minuto a 40° C, pH 5 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo como substrato em 100 mM de citrato de sódio pH 5 contendo TWEEN® 20 a 0,01 %.

Acetilxiluma esterase: O termo “acetilxiluma esterase” é definido aqui como um carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxiluma esterase é determinada usando-se 0,5 mM de pnitrofenilacetato como substrato em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 contendo 0,01 % TWEEN™ 20. Uma unidade de atividade de acetilxiluma esterase foi definida como uma quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ânion de pnitrofenolato por minuto em pH 5,25° C.

Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa um 4hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloíla) de um açúcar esterificado, que é usualmente arabinose em substratos “naturais”, para a produção de ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). Feruloil esterase também é conhecido como esterase de ácido ferúlico, hidroxicinnamoil esterase, FAEIII, hidrolase de éster cinamoílico, FAEA, cinnAE, FAE-I, or FAE-II. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinado usando-se 0,5 mM de p-nitrofenilferulato como o substrato em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase iguala-se à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ânion de p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25° C.

Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa um alfa-D-glicosiduronate glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glucuranosídeo a D-glucuronato e um álcool. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ácido glucurônico ou 48

O-metilglucurônico por minuto em pH 5,40° C.

Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-Larabinofuranosidase” significa um alfa-L-arabinofuranosida arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1,55) que catalisa a hidrólise de terminal resíduos de alfa-L-arabinofuranosida não redutores em alfa-L-arabinosidas. A enzima atua em alfa-L-arabinofuranosidas, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Alfa-Larabinofuranosidase também é conhecido como arabinosidase, alfaarabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosida hidrolase, Larabinosidase ou alfa-L-arabinanase. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando-se 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme Intemational Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Ireland) por ml de 100 mM de acetato de sódio pH 5 em um volume total de 200 μΐ por 30 minutos a 40° C seguido pela análise de arabinose por cromatografia de coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (diversas) enzimas que hidrolizam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglicanase(s), celobioidrolase(s), beta-glicosidase(s), ou combinações destes. Os dois métodos básicos para medir a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglicanases, celobioidrolases e beta-glicosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for celulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando-se substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman NM, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio de filtro de papel usando-se papel de filtro N° 1 Whatman como o substrato. O ensaio foi estabelecido pelo Intemational Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, PureAppl. Chem. 59: 257-68).

Para os propósitos da presente invenção, a atividade de enzima celulolítica é determinada pela medição do aumento na hidrólise de um material celulósico pelas enzimas celulolíticas sob as seguintes condições: 1 a 20 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em PCS por 3 a 7 dias a 50° C em comparação com uma hidrólise de controle sem a adição de proteína de enzima celulolítica. As condições típicas são reações de 1 ml, PCS lavado ou não lavado, sólidos insolúveis a 5 %, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 1 mM de MnSO₄, 50° C, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Endoglucanase: O termo “endoglucanase” é definida aqui como uma sequência de endo-1,4-(1,3 ;l,4)-beta-D-glican 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tal como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglicanase pode ser determinada pela medição da redução na viscosidade de substrato ou aumento nas extremidades de redução determinadas por em ensaio de açúcar de redução (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de endoglicanase é determinada usando-se a hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure andAppl. Chem. 59: 257-268.

Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa um 1,4beta-D-glican celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celooligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glicose ligada por beta-1,4, liberação de celobiose de extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohidrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohidrolases: why so efficient on crystalline celulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEES Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEESLetters, 187: 283-288.

Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma betaD-glicosídeo glicoidrolase (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glicose. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 pmol de ânion de pnitrofenolato produzido por minuto a 25° C, pH 4,8 de 1 mM de p-nitrofenil-betaD-glicopiranosida como o substrato em 50 mM de citrato de sódio contendo TWEEN®20 a 0,01 %.

Polipeptídeo tendo atividade intensifícadora celulolítica: O termo “polipeptídeo tendo atividade intensifícadora celulolítica” significa um polipeptídio GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico pela enzima tendo atividade celulolítica. Para os propósitos da presente invenção, atividade intensifícadora celulolítica é determinada pela medição do aumento nos açúcares redutores ou o aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50 a 99,5 % p/p de proteína de enzima celulolítica e 0,5 a 50 % p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica por 1 a 7 dias a 50° C em comparação com uma hidrólise de controle com carregamento de proteína total igual sem atividade intensificadora celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1,5L (Novozymes A/S, Bagsvrd, Denmark) na presença de 2 a3 % de peso de proteína total Aspergillus oryzae betaglicosidase (recombinantemente produzido em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2 a 3 % de peso de proteína total Aspergillus fumigatus beta-glicosidase (recombinantemente produzido em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carregamento de proteína de celulase é usado como a fonte da atividade celulolítica.

Os polipeptídeos tendo atividade intensificadora celulolítica intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisado por proteínas tendo atividade celulolítica pela redução da quantidade de enzima celulítica requerida para atingir o mesmo grau de hidrólise preferivelmente pelo menos 1,01 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vez, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes e mais preferivelmente pelo menos 20 vezes.

Glicosídeo hidrolase família 61: O termo “Glicosídeo hidrolase família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que está no glicosídeo hidrolase Família 61 de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glicosyl hydrolases based on aminoacid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glicosyl hidrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquer material contendo de celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula ter parado de se desenvolver, também contém polissacarídeos é fortalecido pela lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um hompolímero de anidrocelobiose e, desta maneira, um beta(l-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananos nas estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora, em geral, a celulose polimorfa é encontrada em tecido vegetal, primariamente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. As hemiceluloses, usualmente, ligação de hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz de parede celular.

A celulose é, em geral, encontrada, por exemplo, nos galhos, folhas, cascas e espigas de plantas ou folhas, ramificações e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não é limitado a, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido municipal, papel residual e resíduo da trituração de polpa e de papel (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocelulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.2340, Springer-Verlag, New York). É entendido que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemicelulose e uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose.

Em um aspecto, o material celulósico é material herbáceo. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo florestal. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel residual. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de trituração de polpa e de papel.

Em um outro aspecto, o material celulósico é forragem de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo. Em um outro aspecto, o material celulósico é gramínea. Em um outro aspecto, o material celulósico é miscanthus. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de alga. Em um outro aspecto, o material celulósico é fiapo de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico amorfo. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.

O material celulósico pode ser usado como é ou pode ser submetido ao pré-tratamento, usando-se métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito aqui. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.

Forragem de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “Forragem de milho pré-tratada” significa um material celulósico derivado de forragem de milho pelo tratamento com calor e ácido sulfurico diluído.

Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” é definido aqui como uma sequência, qualquer material que compreende polissacarídeo de parede celular vegetal contendo uma cadeia principal de resíduos de xilose ligados por beta-(l-4). Os xilanos de plantas terrestres são homopolímeros que possuem uma cadeia principal de beta-(l-4)-Dxilopiranose, que é ramificada por cadeias de carboidrato curtas. As cadeias compreendem ácido D-glucurônico ou seu éter 4-O-metílico, L-arabinose e/ou vários oligossacarídeos, compostos de D-xilose, L-arabinose, D- ou Lgalactose e D-glicose. Os polissacarídeos tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos ou heteroxilanos, que incluem glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sei. 186: 1—67.

Nos métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

Polipeptídeo isolado: O termo “polipeptídeo isolado” como usado aqui refere-se a um polipeptídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro e mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” indica aqui uma preparação de polipeptídeo que contém, na maioria 10 %, preferivelmente, na maioria 8 %, mais preferivelmente, na maioria 6 %, mais preferivelmente, na maioria 5 %, mais preferivelmente, na maioria 4 %, mais preferivelmente, na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente, na maioria 2 %, mais preferivelmente, na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente, na maioria 0,5 % em peso de outro material de polipeptídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Portanto, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92 % puro, preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro e ainda mais preferivelmente 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação de polipeptídeo é essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Isto pode ser realizado, por exemplo, pela preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” é definido aqui como uma sequência um polipeptídeo em sua forma final seguindo a tradução e quaisquer modificações pós-tradução, tais como Processamento de terminal N, Truncação de terminal C, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são aminoácidos de 20 a 407 da SEQ ID NO: 2 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) programa que prediz aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal.

Sequência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificadora de polipeptídeo maduro” é definida aqui como uma sequência uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de polipeptídeo maduro são nucleotídeos 58 a 1439 da SEQ ID NO: 1 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, que prediz os nucleotídeo de 1 a da SEQ ID NO: 1 codifica um peptídeo de sinal.

Identidade: A relação entre as duas sequências de aminoácido ou entre as duas sequência está descrito pelo parâmetro “identidade”.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácido é determinado usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e o Matriz de substituição EBLOSUM62 (Versão EMBOSS de BLOSUM62). A saída da “identidade mais longa” rotulada por agulha (obtido usando-se a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue:

(Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de alinhamento Número total de fendas no alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinado usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (Versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída da “identidade mais longa” rotulada por agulha (obtido usando-se a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue:

(Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento de alinhamento - Número total de fendas no alinhamento)

Sequência homóloga: O termo “sequência homóloga” é definido aqui como uma proteína predita tendo um valor E (ou registro de expectativa) menor do que 0,001 em uma pesquisa tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) with the Penicillium pinophilum xilanase da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro deste.

Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” é definido aqui como uma sequência um polipeptídeo tendo um ou mais (diversos) aminoácidos anulados do terminal amino e/ou carboxila do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga destes; em que o fragmento tem atividade de xilanase. Em um aspecto preferido, um fragmento contém pelo menos 320 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 340 resíduos de aminoácido e mais preferivelmente pelo menos 360 resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou a sequência homóloga destes.

Subsequência: O termo “subsequência” é definido aqui como uma sequência uma sequência de nucleotídeo tendo um ou mais (diversos) nucleotídeos anulados da extremidade 5’ e/ou 3’ de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga destes; em que a subsequência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de xilanase. Em um aspecto preferido, a subsequência contém pelo menos 960 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 1020 nucleotídeos e mais preferivelmente pelo menos 1080 nucleotídeos de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou a sequência homóloga destes.

Variante alélica: O termo “variante alélica” indica aqui quaisquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente através da mutação e pode resultar no polimorfismo dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo “polinucleotídeo isolado” como usado aqui refere-se a um polinucleotídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro e mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado por eletroforese em agarose.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” como usado aqui refere-se a uma preparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e na forma adequada para o uso dentro dos sistemas de produção de proteína projetados. Desta maneira, um polinucleotídeo substancialmente puro contém, na maioria 10 %, preferivelmente, na maioria 8 %, mais preferivelmente, na maioria 6 %, mais preferivelmente, na maioria 5 %, mais preferivelmente, na maioria 4 %, mais preferivelmente, na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente, na maioria 2 %, mais preferivelmente, na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente, na maioria 0,5 % em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado, um polinucleotídeo substancialmente puro pode, entretanto, incluir regiões não traduzidas 5’ e 3’ de ocorrência natural, tais como promotores e terminadores. E preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro é pelo menos 90 % puro, preferivelmente pelo menos 92 % puro, mais preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99 % puro e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro em peso. O polinucleotídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação de polinucleotídeo é essencialmente livre de outro material de polinucleotídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semisintética, sintética ou qualquer combinação destes.

Sequência codificadora: O termo “sequência codificadora” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácido de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificadora são, em geral, determinadas por uma estrutura de leitura aberta, que usualmente começa com códon de início de ATG ou códons de partida alternativas tal como GTG e TTG e extremidades dom um códon de interrupção tal como TAA, TAG e TGA. A sequência codificadora pode ser um polinucleotídeo de DNA, cDNA, sintético ou recombinante.

cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA unida madura obtida a partir de uma célula eucariótica. O cDNA perde sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. A transcrição de RNA primário é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como mRNA unido maduro. Estas etapas incluem a remoção de sequências de íntron por um processo denominado união. O cDNA derivado de mRNA perde, portanto, quaisquer sequências de íntron.

Construção de ácido nucleico: O termo “construção de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de filamento simples ou duplo, que é isolado a partir de um gene de ocorrência natural ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que, de outra maneira, não deve existir em estado natural ou que é sintético. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo de termo “cassete de expressão” quando a construção de aminoácido contém as sequências de controle requerido para a expressão da sequência codificadora da presente invenção.

Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser natural ou estranha ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou natural ou estranha uma à outra. Tais sequências de controle incluem, mas não limitam-se a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo de sinala e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de interrupção de transcrição e de tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores para os propósitos de introduzir os locais de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operacionalmente ligada: O termo “operacionalmente ligada” significa um configuração em que uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada com relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo, tal como a sequência de controle direcionada à expressão da sequência codificadora.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção e está operacionalmente ligada a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira”, como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo “modificação” significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo que compreende ou que consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga destes; bem como manipulação genética do DNA que codifica um tal polipeptídeo. A modificação pode ser uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos bem como substituições de uma ou mais (diversas) cadeias secundárias de aminoácido.

Variante artificial: Quando usado aqui, o termo “variante artificial” signfica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase produzido por um organismo que expressa uma sequência de polinucleotídeo modificada de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga destes. A sequência de nucleotídeo modificada é obtida através da intervenção humana pela modificação de uma sequência de polinucleotídeo divulgada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga destes.

Descrição detalhada da invenção

Polipeptídeos tendo atividade de xilanase

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado que compreende sequências de aminoácido tendo um grau de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que têm atividade de xilanase (a seguir polipeptídeos homólogos). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos compreendem sequências de aminoácido que diferem por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por três aminoácidos, mais preferivelmente por dois aminoácidos e ainda mais preferivelmente por um aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento destes tendo atividade de xilanase. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreendo polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos 20 a 407 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento destes tendo atividade de xilanase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos 20 a 407 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento destes tendo atividade de xilanase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos 20 a 407 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento destes tendo atividade de xilanase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos 20 a 407 da SEQ ID NO: 2.

Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam-se sob condições de estringência preferivelmente muito baixas, mais preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência média altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas e, mais preferivelmente, condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Çloning, A Laboratory Manual, 2^o edição, Cold Spring Harbor, New York). Em um aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência altas. Em um outro aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência muito altas.

A sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta; bem como uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2ou um fragmento destes; podem ser usados para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos tendo atividade de xilanase de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo os procedimentos de Southem blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35 e mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Entretanto, é preferido que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que são preferivelmente de pelo menos 600 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Tanto sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para a detecção do gene correspondente (por exemplo, com ³²P, ³H, ³⁵S, biotina ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA ou de cDNA genômica preparada a partir de tais outras cepas podem ser, portanto, avaliadas quanto ao DNA que hibridiza-se com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase. DNA genômico ou outro de tais outras cepas podem ser separados por agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida ou outras técnica de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado podem ser transferidos a e imobilizados em nitrocelulose ou outro material carregador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência destes, o material carregador é preferivelmente usado em um Southem blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indica que a sequência de nucleotídeo hibridiza-se a uma sonda de ácido nucleico rotulada que corresponde a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; seu filamento complementar de comprimento total ou uma subsequência desta; sob condições de estringência muito baixas a muito altas. As moléculas cuja sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando-se, por exemplo, película de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é nucleotídeos 58 a 1439 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou uma subsequência destes. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a sequência de polinucleotídeo contida no plasmídeo pGEM-T-Ppin3 que está contido no E. coli DSM 22922, em que a sequência de polinucleotídeo deste codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a região codificadora de polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pGEM-T-Ppin3 que está contido no E. coli DSM 22922.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão dividido e desnaturado e 25 % de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35 % de formamida para estringências média e média-alta ou 50 % de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southem blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando-se 2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente a 45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente a 55° C (estringência média), mais preferivelmente a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente a 70° C (estringência muito alta).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização de cerca de

5^o C a cerca de 10° C abaixo da Tm calculada usando-se o cálculo de acordo com Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX Solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southem blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material carregador é lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1 % de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando-se 6X SSC a 5^o C a 10° C abaixo da T_m calculada.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase codificado pelos nucleotídeos que compreende ou consiste de sequências de nucleotídeo que tem um grau de identidade quanto a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase. Ver a seção de polinucleotídeo aqui.

Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito a variantes artificiais que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (ou diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga destes. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, que são substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou a atividade da proteína; anulações pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tal como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligador de até a cerca de 20 a 25 resíduos ou uma extensão pequena que facilita a purificação mudando-se a carga da rede ou uma outra função, tal como um trato de polihistidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que, em geral, não alteram a atividade específica são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças de ocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tais como, 4-hidroxiprolina, 6-2V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e alfa-metil serina) pode ser substituído no lugar de resíduos de aminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugar de resíduos de aminoácido. “Aminoácidos não naturais” foram modificados após a síntese de proteína e/ou têm uma estrutura química em suas cadeias secundárias diferentes daquela dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados e, preferivelmente, estão comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Altemativamente, as mudanças de aminoácido são de uma tal natureza que as propriedades fisico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica posterior, as mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas para a atividade biológica (isto é, atividade de xilanase) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado pela análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ou rotulação de fotoafinidade, em conjunção com a mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionadas a um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições, anulações e/ou inserções de aminoácido simples ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando-se métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou mistura, seguido por um procedimento de avaliação relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso ao erro, apresentação de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente U. S. N° 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/mistura podem ser combinados com métodos de avaliação automatizados de rendimento alto para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados clonados expressados por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando-se métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

O número total de substituições, anulações e/ou inserções de aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente, na maioria 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, mais preferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.

Fontes de Polipeptídeos tendo atividade de xilanase

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido de” como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que a sequência de nucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretada de maneira extracelular.

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano de gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillus tendo atividade de xilanase ou um polipeptídeo bacteriano de Gram negativo tal como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria ou Ureaplasma tendo atividade de xilanase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de xilanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de xilanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans tendo atividade de xilanase.

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tendo atividade de xilanase ou mais preferivelmente um polipeptídeo fungico filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium,

Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania,

Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Sehizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria tendo atividade de xilanase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis tendo atividade de xilanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola,

Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride tendo atividade de xilanase.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Penicillium pinophilum tendo atividade de xilanase. Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipepUdieo Penicillium pinophilum NN046877 tendo atividade de xilanase, por exemplo, o polipeptídeo que compreendo polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

Será entendido que para as espécies já mencionadas a invenção abrange tanto estados perfeitos quanto imperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, com respeito ao nome da espécie pelos quais estes são conhecidos. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão facilmente a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em diversas coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northem Regional Research Center (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando-se as sondas mencionadas acima. Aas técnicas para o isolamento de microrganismos de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser então obtido por uma avaliação similar a uma biblioteca de genômica ou de cDNA de um tal microrganismo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com as sondas, o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se as técnicas que são bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo ou fragmento destes. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção destes) que codifica um outro polipeptídeo a uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção destes) da presente invenção. As técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica e incluem ligar as sequências codificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que estes estejam na estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido está sob o controle dos mesmos promotores e terminador.

Um polipeptídeo de fusão ainda pode compreender um local de clivagem. Na secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando o polipeptídeo tendo atividade de xilanase da proteína de fusão. Os exemplos de locais de clivagem incluem, mas não limitam-se a um local Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378381), um local Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado por uma protease de Fator Xa após o resíduo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505512); um local Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enterocinase após a lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um local His-Tyr-Glu ou local His-Tyr-Asp, que é clivado por Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248); um local Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado por trombina após o Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); um local Glu-Asn-Leu-TyrPhe-Gln-Gly, que é clivado por TEV protease após o Gin (Stevens, 2003, supra) e um local Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma forma geneticamente projetada de rinovírus humano 3C protease após o Gin (Stevens, 2003, supra).

Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou consistem de sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos tendo atividade de xilanase da presente invenção.

Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da sequência contida no plasmídeo pGEM-T-Ppin3 que está contido no E. coli DSM 22922. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste de nucleotídeos 58 a 1439 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste do polipeptídeo maduro que codifica a sequência contida no plasmídeo pGEM-T-Ppin3 que está contido no E. coli DSM 22922. A presente invenção também abrange sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que compreende ou consiste da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro deste, que difere da SEQ ID NO: 1 ou o polipeptídeo maduro que codifica a sua sequência em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção também diz respeito a subsequências da SEQ ID NO: 1 que codifica fragmentos da SEQ ID NO: 2 tendo atividade de xilanase.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos mutantes que compreende ou consiste de pelo menos uma mutação em uma sequência codifícadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem isolamento do DNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando-se a reação de cadeia de polimerase conhecida (PCR) ou avaliação de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar os fragmentos de DNA clonados com características estruturais divididas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como reação de cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base em sequência de nucleotídeo (NASBA) pode ser usada, os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Penicillium ou um outro organismo relacionado e, desta maneira, por exemplo, pode ser uma espécie alélica ou variante do polipeptídeo que codifica a região da sequência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou consistem de sequências de nucleotídeo que tem um grau de identidade quanto a uma sequência codifícadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase.

A modificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similares” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir de alguma maneira projetado do polipeptídeo isolado de sua fonte natural, por exemplo, variantes artificiais que diferem de atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo ou semelhante. A sequência variante pode ser construída na base de uma sequência de nucleotídeo apresentada como uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma subsequência destes e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado por a sequência de nucleotídeo, mas que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que pode dar origem a uma sequência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral da substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Estará evidente para aqueles habilitados na técnica tal que as substituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função da molécula e ainda resulta em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção e, portanto, preferivelmente não submetido à substituição, podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local ou mutagênse de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham and Wells, 1989, supra). Na técnica posterior, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de xilanase para identificar resíduos de aminoácido que são críticas para a atividade da molécula. Os locais de interação de substrato-enzima também podem ser determinados pela análise da estrutura tri-dimensional como determinado por tais técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação por fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra; Smith etal., 1992, supra; Wlodaver et al., 1992, supra).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codifica polipeptídeos da presente invenção, que hibridiza-se sob condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência média altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas e, mais preferivelmente, condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii) ou variantes alélicas e subsequências destes (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui. Em um aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência altas. Em um outro aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência muito altas.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência muito baixas, baixas, médias, médias-altas, altas ou muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii) e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase. Em um aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência altas. Em um outro aspecto preferido, as condições de estringência são condições de estringência muito altas.

Construções de ácido nucleico

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo isolado da presente invenção operacionalmente ligados a uma ou mais (diversas) sequências de controle que direciona a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer expressão do polipeptídeo. A manipulação da sequência de polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar sequências de polinucleotídeo utilizando-se métodos de DNA recombinantes são bem conhecidos na técnica.

A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor apropriada, uma sequência de nucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle de transcrição que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeo que mostra atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e podem ser obtidos de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do E. coli lac operon, Streptomyces coelicolor gene de agarase (dagA), Bacillus subtilis gene de levansucrase (sacB), Bacillus licheniformis gene de alfa-amilase (amyL), Bacillus stearothermophilus gene de amilase maltogênica (amyM), Bacillus amiloliquefacíens gene de alfa-amilase (amyQ), Bacillus licheniformis gene de penicilinase (penP), Bacillus subtilis xylA and xylB genes e gene de beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 37273731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bactéria in Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, Aspergillus niger alfa-amilase neutra, Aspergillus niger alfa-amilase estável em ácido, Aspergillus niger ou Aspergillus awamori glicoamilase (glaA), Rhizomucor miehei lipase, Aspergillus oryzae protease alcalina, Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase, Aspergillus nidulans acetamidase, Fusarium venenatum amiloglicosidase (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), Fusarium oxysporum protease semelhante a tripsina (WO 96/00787), Trichoderma reesei beta-glicosidase, Trichoderma reesei celobioidrolase I, Trichoderma reesei celobioidrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase I, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase IV, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xilanase I, Trichoderma reesei xilanase II, Trichoderma reesei betaxilosidase, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado do gene que codifica alfa-amilase neutra em Aspergillus niger em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido da gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactocinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP), Saccharomyces cerevisiae triose fosfato isomerase (TPI), Saccharomyces cerevisiae metalotioneína (CUP1) e Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinase. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488.

A sequência de controle também pode ser uma sequência de terminador de transcrição adequadas, um sistema reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está operacionalmente ligada ao terminal 3 ’ de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os terminadores preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glicoamilase, Aspergillus nidulans antranilato sintase, Aspergillus niger alfa-glicosidase e Fusarium oxysporum protease semelhante a tripsina.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae citocromo C (CYC1) e Saccharomyces cerevisiae gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Outros terminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5’ de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os líderes preferidos para células fóngicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase e Aspergillus nidulans triose fosfato isomerase.

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinase, Saccharomyces cerevisiae fator alfa e Saccharomyces cerevisiae álcool desidrogenase/gliceraldeído-3fosfato desidrogenase (ADH2/GAP).

A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3 ’ de uma sequência de nucleotídeo e quando descrita, é reconhecido pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fóngicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glicoamilase, Aspergillus nidulans antranilato sintase, Fusarium oxysporum protease semelhante a tripsina e Aspergillus niger alfa-glicosidase.

As sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

A sequência de controle também pode ser uma sequência codificadora de peptídeo de sinal que codifica um peptídeo de sinal ligado ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo codificado no caminho secretor celular. A extremidade 5’ da sequência codificadora de uma sequência de nucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligado na estrutura de leitura de tradução com o segmento da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5’ da sequência codificadora pode conter uma sequência codificadora de peptídeo de sinal que é estranho à sequência codificadora. A sequência codificadora de peptídeo de sinal estranho pode ser requerido quando a sequência codificadora não contém naturalmente uma sequência codificadora de peptídeo de sinal. Altemativamente, a sequência codificadora de peptídeo de sinal estranho pode substituir simplesmente a sequência codificadora de peptídeo de sinal natural a fim de intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência codificadora de peptídeo que direciona o polipeptídeo expressado no caminho secretor de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretada em um meio de cultura, pode ser usada na presente invenção.

As sequências codificadoras de peptídeo de sinal eficaz para as células bacterianas são as sequências codificadoras de peptídeo de sinal obtido dos genes para Bacillus NCIB 11837 amilase maltogênica, Bacillus stearothermophilus alfa-amilase, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacillus licheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophilus proteases neutras (nprT, nprS, nprM) e Bacillus subtilis prsA. Os peptídeos de sinal adicionais são descritos por Simonen and Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109137.

As sequências codificadoras de peptídeo de sinal eficaz para células hospedeiras fungicas filamentosas são as sequências codificadoras de peptídeo de sinal obtido dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger amilase neutra, Aspergillus niger glicoamilase, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, Humicola insolens celulase, Humicola insolens endoglucanase V e Humicola lanuginosa lipase.

Os peptídeos de sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae fator alfa e Saccharomyces cerevisiae invertase. Outras sequências que codificam peptídeos de sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, a sequência que codifica o peptídeo de sinal compreende ou consiste de nucleotídeos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1.

A sequência de controle também pode ser uma sequência codificadora de polipeptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como um pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Em geral um pró-peptídeo é inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo ativo maduro pela divagem catalítica ou auto-catalítica do própeptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificadora de propeptídeo pode ser obtida dos genes para Bacillus subtilis protease alcalina (aprE), Bacillus subtilis protease neutra (nprT), Saccharomyces cerevisiae fator alfa, Rhizomucor miehei proteinase aspártica e Myceliophthora thermophila lacase (WO 95/33836).

Quando tanto as sequências de peptídeo quanto de própeptídeo de sinalas estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a sequência de pró-peptídeo está posicionada próximo ao terminal amino de um polipepetídeo e da sequência sinalizadora do peptídeo está posicionada próxima ao terminal amino da sequência de pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao desenvolvimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operadores lac, tac e trp. Na levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode podem ser usados. Nos fungos filamentosos, o promotor e TAKA alfa-amilase, Aspergillus niger promotor de glicoamilase e Aspergillus oryzae promotor de glicoamilase podem ser usados como sequências reguladoras. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação genética. Nos sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene de di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo deve ser operacionalmente ligado com a sequência reguladora.

Vetores de expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinante que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de interrupção de transcrição e de tradução. As várias sequências de nucleotídeo e de controle podem ser unidas para a produção de um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (diversos) locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais locais. Altemativamente, o polinucleotídeo pode ser expressado pela inserção do polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de modo que a sequência codificadora está operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetidos a procedimentos de DNA recombinantes e pode realizar a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor coma célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo circular linear ou fechado.

O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para garantir a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com os cromossomos em que este foi integrado. Além disso, um vetor simples ou plasmídeo u dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contém o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon pode ser usado.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém um ou mais (diversos) marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene do produto que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e outros.

Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tais como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célula fungica filamentosa inclui, mas não limitam-se a, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidino-5'fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. São preferidos para o uso em célula de Aspergillus os genes de amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém um elemento que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local parecido nos cromossomos. Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de base, 400 a 10.000 pares de base e 800 a 10.000 pares de base, que têm um alto grau de identidade de sequência à sequência alo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser nucleotídeos não codificadores ou codificadores. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor ainda pode compreender uma origem de replicação que permita ao vetor replicar-se de maneira autônoma na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que realiza a mediação da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permita ao plasmídeo ou vetor replicar-se in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação estão nas origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitam a replicação em E. coli e pUBllO, pE194, ρΤΑ1060 e pAMRl que permita a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícrons de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fungica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos divulgados no WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um gene marcador selecionável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, desse modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, pode ser selecionado pelo cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para a ligação dos elementos descritos acima para a construção dos vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras recombinantes, que compreende um polinucleotídeo isolado da presente invenção, que são vantajosamente usadas na produção recombinante do polipeptídeos tendo atividade de xilanase. Um vetor que compreende um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira, até certo ponto, dependerá no gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

A célula hospedeira eucariótica pode ser qualquer bactéria de Gram positivo ou uma bactéria de Gram negativo. As bactéria de Gram negativo incluem, mas não limitam-se a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus e Oceanobacillus. As bactéria de Gram negativo incluem, mas não limitam-se a, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus. células de Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula Bacillus amiloliquefaciens. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula Bacillus clausii. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus licheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus. As células de Streptococcus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e células de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus pyogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces. As células de Streptomyces úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces achromogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser realizada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usandose as células competentes (ver, por exemplo, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou pela conjugação (ver, por exemplo, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E coli pode, por exemplo, ser realizada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode, por exemplo, ser realizada pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 35833585), ou pela transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode, por exemplo, ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser realizada pela competência natural (ver, por exemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt and Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-207, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para a introdução de DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fúngica.

A célula hospedeira pode ser uma célula fungica. Os “fungos” como usados neste incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB Intemational, University Press, Cambridge, UK) bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

A célula hospedeira fungica pode ser uma célula de levedura. A “levedura” como usada neste inclui levedura ascosporogenous (Endomycetales), levedura basidiosporogenous e levedura que pertence aos fungos Imperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. e Davenport, R.R. eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N° 9, 1980).

Ainda, em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula Yarrowia lipolytica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são, em geral, caracterizado por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glicano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. O desenvolvimento vegetativo ocorre pelo alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o desenvolvimento vegetativo por leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae ocorre pelo brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentador.

Ainda, em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger or Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta,

Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritas em EP 238 023 and Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para transformar espécies Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. a levedura pode ser transformada usando-se os procedimentos descritos por Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de produção

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultiva uma célula, que em sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob as condições condutivas para a produção de polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Penicillium. Em um aspecto mais preferido, a célula é Penicillium pinophilum. Em um aspecto mais preferido, a célula é Penicillium pinophilum NN046877.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante, como descrito neste, sob as condições condutivas para a produção de polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante sob as condições condutivas para a produção de polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação em uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequada para a produção de polipeptídeo usando os métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo de frasco de agitação e fermentação de ampla escala ou escala menor (incluindo fermentações de estado contínuo, batelada, alimentação-batelada ou sólido) nos fermentadores industriais e laboratoriais realizado em um meio adequado e sob condições que permitem o polipeptídeo a ser expressado e/ou isolado. O cultivo acontece em um meio de nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparado de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos de American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não é secretado no meio, pode ser recuperado a partir dos lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando os métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso dos anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito neste.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbico, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

Plantas

A presente invenção também diz respeito as plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta, que compreende um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção de modo como para expressar e produzir o polipeptídeo nas quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado a partir da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usado como tal para o melhoramento da qualidade de um alimento ou alimentação, por exemplo, melhoramento do valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator anti-nutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot são gramas, tal como grama de prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tal como troço, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tal como girassol, semente de colza e organismo modelo rigorosamente relatado Arabidopsis thaliana.

Os exemplos de partes vegetais são haste, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parenquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos da célula de planta específico, tal como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomos e citoplasma também são considerados ser uma parte de planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerado ser uma parte de planta. Igualmente, partes vegetais tal como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes vegetais, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de sementes.

Também incluído dentro do escopo da presente invenção é a progênie de tais plantas, partes vegetais e células vegetais.

A planta transgênica ou célula de planta que expressa um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por uma ou mais (diversas) construções de expressão codificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeira vegetal ou genoma de cloroplasto e propagação da planta modificada resultante ou célula de planta em uma célula de planta ou planta transgênica.

A construção da expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado com sequências reguladoras apropriadas requeridas para a expressão da sequência de nucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção da expressão pode compreender um marcador selecionável útil para a identificação das células hospedeiras em que uma construção da expressão foi integrada e as sequências de DNA necessária para a introdução da construção na planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha das sequências reguladoras, tal como promotor e sequências terminadoras e opcionalmente sequências de trânsito ou sinal, é determinado, por exemplo, na base de quando, onde e como o polipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutivo ou indutível, ou pode ser relativo ao desenvolvimento, estágio ou tecido específico e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte de planta tal como sementes ou folhas. As sequências reguladoras são, por exemplo, descrito por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina de milho 1 e o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 67558

689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos aos órgãos podem ser, por exemplo, um promotor a partir dos tecidos imersos de armazenagem tal como sementes, tubérculos de batata e frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou a partir dos tecidos imersos metabólicos tal como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico por semente tal como a glutelina, prolamina, globulina, ou promotor de albumina a partir de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor Vicia fabum a partir de legumina B4 e o gene de proteína de semente não conhecida de partir de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708711), um promotor a partir da proteína corporal de óleo de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA de proteína de armazenagem a partir dos Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito no WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico por folha tal como o promotor rbcs a partir de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do gene de metiltransferase de adenina do vírus clorella (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP a partir de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível por ferimento tal como o promotor de batata pin2 (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Igualmente, o promotor pode induzir pelos tratamentos abióticos tal como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade ou induzido pelas substâncias exogeneamente aplicado que ativa o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais tal como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

Um elemento intensificador promotor também pode ser usado para atingir a expressão maior de um polipeptídeo da presente invenção na planta. Por exemplo, o elemento intensificador promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e a sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulga o uso do primeiro íntron do gene de actiba 1 de arroz para intensificar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção da expressão podem ser escolhidos a partir daquele disponível na técnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com as técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência do gene mediado por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para a geração de dicots transgênicos (para uma revisão, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usados para a transformação de monocots, embora os métodos de transformação são frequentemente usados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para a geração das monocots trangênicas é o bombardeamento de partícula (partículas de tungstênio e ouro microscópio revestido com a transformação de DNA) do calo embriônico ou desenvolvimento de embriões (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocots é baseada na transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Seguindo a transformação, os transformantes tendo incorporados a construção da expressão são selecionados e regeneradas em plantas totais de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente o procedimento de transformação é indicado para a eliminação seletiva da seleção dos genes durante a regeneração ou nas gerações seguintes para uso, por exemplo, co-transformação com duas construções de T-DNA separadas ou excisão específica no local da seleção do gene por uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção sob as condições condutivas para a produção de polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nas formas de realizações, além da transformação direta de um genotipo de planta particular com uma construção preparado de acordo com a presente invenção, as plantas transgênicas podem ser feitas podem ser feitas pelo cruzamento de uma planta tendo uma construção da presente invenção a uma segunda planta que precisa da construção. Por exemplo, uma construção codifica um polipeptídeo tendo atividade xilanase ou uma porção deste pode ser introduzida em uma variedade de planta particular pelo cruzamento, sem a necessidade para sempre da transformação direta de uma planta daquela dada variedade. Portanto, a presente invenção não apenas abrange uma planta diretamente regenerada a partir das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Como usado neste, progênie refere-se a descendência de qualquer geração de uma planta precursora preparada de acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção, ou uma porção de uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção. Nas formas de realizações, os resultados do cruzamento em um transgene da presente invenção sendo introduzido em uma linha vegetal pelo cruzamento de polinização de uma linha de partida com uma linha vegetal doadora que inclui um transgene da presente invenção. Exemplos não limitantes de tais etapas ainda são articulados na Patente U.S. NO: 7.151.204.

E previsto que as plantas incluindo um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção inclui plantas geradas através de um processo de conversão cruzada. Por exemplos, as plantas da presente invenção incluem plantas referidas como um genotipo convertido cruzado, linha, inato ou híbrido.

Nas formas de realizações, marcadores genéticos podem ser usados para assistir a introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um fundamento genético em outro. A seleção assistida pelo marcador oferece as vantagens relativas à criação convencional em que pode ser usado para evitar os erros causados pelas variações fenotípicas. Ainda, marcadores genéticos podem fornecer os dados com relação ao grau relativo do plasma germinativo de elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outra maneira têm um fundamento genético não desejado agroquimicamente é cruzado em um precursor elite, marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que não apenas possui o traço de interesse, mas também tem uma proporção relativamente ampla do plasma germinativo desejado. Nesta maneira, o número de gerações requerido para introgredir um ou mais traços em um fundamento genético é minimizado.

Remoção ou redução da atividade de xilanase

A presente invenção também diz respeito aos métodos da produção de um mutante de uma célula precursora, que compreende o rompimento ou deleção de um polinucleotídeo, ou uma porção deste, codificando um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula precursora quando cultivado sob as mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída pela redução ou eliminação da expressão de uma sequência de nucleotídeo codificando um 5 polipeptídeo da presente invenção usando os métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições ou anulações. Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo é inativada. A sequência de nucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificadora ou parte deste essencial para a atividade, ou um elemento 10 regulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo de uma tal sequência controle ou reguladora pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional deste, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão de uma sequência de nucleotídeo. Outras sequências de controle para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, um líder, uma 15 sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, sequência de peptídeo de sinal, terminador de transcrição e ativador transcripcional.

A modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo podem ser realizadas por submeter a célula precursora à mutagênese e seleção das células mutantes em que a expressão da sequência de nucleotídeo foi 20 reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específico ou aleatório, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente de mutagênese químico ou físico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou por submeter a sequência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes 25 agentes de mutagênese.

Os exemplos de um agente de mutagênese física ou química adequado para o presente propósito incluem a irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etil metano (EMS), bissulfeto de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeos.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizado pela incubação da célula precursora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagênese de escolha sob as condições adequadas e avaliação e/ou seleção das células mutantes exibindo redução ou nenhuma expressão do gene.

A modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo podem ser acompanhadas pela introdução, substituição ou remoção de um ou mais (diversos) nucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido pela transcrição ou tradução deste. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo para resultar na introdução de um códon de interrupção, a remoção do códon de partida, ou uma mudança na estrutura de abertura de leitura. Tal modificação ou inativação podem ser acompanhadas pela mutagênese direcionada ao local ou mutagênese direcionada ao PCR de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Embora, em princípio, a modificação pode ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa a sequência de nucleotídeo a ser modificado, é preferido que a modificação seja realizada in vitro como exemplificado abaixo.

Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeo por uma célula é baseada nas técnicas da substituição do gene, deleção do gene ou rompimento do gene. Por exemplo, no método de rompimento do gene, uma sequência de ácido nucleico correspondente à sequência de nucleotídeo endógeno é mutagenizado in vitro para produzir uma sequência de ácido nucleico defeituoso que é então transformado pela célula precursora para produzir um gene defeituoso. Pela recombinação homóloga, a sequência de ácido nucleico defeituoso substitui a sequência de nucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeo defeituosa também codifica um marcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que a sequência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspecto particularmente preferido, a sequência de nucleotídeo é interrompida com um marcador selecionável tal como aquele descrito neste.

Altemativamente, a modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo pode ser realizada pelas técnicas RNAi ou anti-sentido estabelecidas usando uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeo. Mais especificamente, expressão da sequência de nucleotídeo por uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeo do gene que pode ser transcrito na célula e é capaz de hibridizar ao mRNA produzido na célula. Sob as condições que permitem a sequência de nucleotídeo anti-sentido complementar para hibridizar ao mRNA, a quantidade da proteína traduzida é deste modo reduzida ou eliminada.

A presente invenção ainda diz respeito a uma célula mutante de uma célula precursora que compreende uma interrupção ou deleção de uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo ou uma sequência controle deste, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparado à célula precursora.

As células mutantes deficientes de polipeptídeo de modo criadas são particularmente úteis como as células hospedeiras para a expressão dos polipeptídeos heterólogos e/ou naturais. Portanto, a presente invenção ainda diz respeito aos métodos de produção de um polipeptídeo heterólogo ou natural, que compreende: (a) cultivar uma célula mutante sob as condições condutivas para a produção de polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo polipeptídeos heterólogos é definido neste como polipeptídeos que não são naturais as células hospedeiras, uma proteína natural em que as modificações foram feitas para alterar a sequência natural, ou uma proteína natural cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado da manipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinantes.

Ainda em um aspecto, a presente invenção diz respeito ao método de produzir um produto de proteína essencialmente livre da atividade de xilanase pela fermentação de uma célula que produz ambos de um polipeptídeo da presente invenção bem como o produto de proteína de interesse adicionando uma quantidade efetiva de um agente capaz de inibir a atividade de xilanase ao caldo de fermentação antes, durante ou após a fermentação ser completa, recuperando o produto de interesse a partir do caldo de fermentação e opcionalmente submetendo o produto recuperado a purificação adicional.

Ainda em um aspecto, a presente invenção diz respeito ao método de produzir um produto de proteína essencialmente livre da atividade de xilanase pelo cultivo da célula sob condições permitindo a expressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante a um pH combinado e tratamento de temperatura deste modo para reduzir a atividade de xilanase substancialmente e recuperando o produto a partir do caldo de cultura. Altemativamente, o pH combinado e tratamento de temperatura pode ser realizado em uma preparação de enzima recuperada a partir do caldo de cultura. O pH combinado e tratamento de temperatura pode ser opcionalmente usado na combinação com um tratamento com um inibidor de xilanase.

De acordo com este aspecto da invenção, é possível remover pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 99 % da atividade de xilanase. A remoção completa da atividade de xilanase pode ser obtida pelo uso deste método.

O pH combinado e tratamento de temperatura é preferivelmente realizado em um pH na faixa de 2 a 4 ou 9 a 11 e uma temperatura na faixa de pelo menos 60 a 70° C por um período suficiente de tempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, 30 a 60 minutos é suficiente.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.

Os métodos da presente invenção para produção de um produto livre essencialmente xilanase é de interesse particular na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fúngicas tal como enzimas.

A enzima pode ser selecionada de, por exemplo, uma enzima amilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulolítica, oxiredutase ou enzima de degradação da parede celular vegetal. Os exemplos de tais enzimas incluem um aminopeptidase, amilase, amiloglucosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, 10 ciclodextrin glicosiltransferase, desoxiribonuclease, endoglucanase, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glucosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase, transglutaminase, 15 ou xilanase. As células deficientes de xilanase também podem ser usadas para expressar as proteínas heterólogas de interesse farmacêutico tal como hormônio, fatores de desenvolvimento, receptores e outros.

Será entendido que o termo polipeptídeos eucarióticos incluem não apenas os polipeptídeos naturais, mas também aqueles 20 polipeptídeos, por exemplo, enzimas que não foram identificadas pelas substituições, anulações ou adições, ou tais outras modificações para intensificar atividade, termoestabilidade, tolerância de pH e outros.

Ainda em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um produto de proteína essencialmente livre a partir da atividade de xilanase que 25 é produzido por um método da presente invenção.

Métodos de inibição da expressão de um polipeptídeo tendo atividade xilanase

A presente invenção também diz respeito aos métodos de inibição da expressão de um polipeptídeo tendo atividade xilanase em uma célula, que compreende administrar a célula ou expressar na célula uma molécula de RNA (dsRNA) filamentado duplo, em que um dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em comprimento.

O dsRNA é preferivelmente um RNA interferência menor (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA é RNA de interferência menor (siRNAs) para inibição da transcrição. Em outro aspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibição da tradução.

A presente invenção também diz respeito tal como moléculas de RNA (dsRNA) filamentadas duplas, que compreendem uma porção de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 para a inbição da expressão de um polipeptídeo em uma célula. Enquanto a presente invenção não é limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar na célula e causa a degradação de um RNA filamentado simples (ssRNA) das sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao dsRNA, mRNA a partir do gene homólogo é seletivamente degradado pelo processo denominado interferência de RNA (RNAi).

Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados no silenciamento do gene. Em um aspecto, a invenção fornece os métodos para degradar seletivamente o RNA usando o dsRNAis da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma perda da função da mutação na célula, um órgão ou um animal. Os métodos para fabricação e uso das moléculas de dsRNA para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.506.559; Patente U.S. N°. 6.511.824; Patente U.S. N°. 6.515.109; e Patente U.S. N°. 6.489.127.

Composições

A presente invenção também diz respeito as composições que compreende um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo enriquecido indica que a atividade de xilanase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1.1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como um componente enzimática maior, por exemplo, uma composição de mono-componente. Altemativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tal como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrin glicosiltransferase, desoxiribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. As enzimas adicionais podem ser produzidas, por exemplo, por um microrganismo que pertence ao gênero Aspergillus, preferivelmente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae', Fusarium, preferivelmente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum', Humicola, preferivelmente Humicola insolens ou Humicola lanuginosa', ou Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo pelos usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob qual a composição é usada pode ser determinada com base nos métodos conhecidos na técnica.

Usos

A presente invenção também é direcionada aos métodos de uso dos polipeptídeos tendo atividade xilanase, ou composições destes. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para degradar ou converter as paredes da célula de planta ou qualquer material contendo xilano, por exemplo, lignocelulose, que origina-se de paredes de células vegetais (ver, por exemplo, WO 2002/18561). Os exemplos de vários usos são descritos abaixo. A dosagem dos polipeptídeos da presente invenção e outras condições sob qual o polipeptídeos são usados podem ser determinados com base nos métodos conhecidos na técnica.

A degradação enzimática de um material contendo xilano é facilitado pela remoção parcial ou total das ramificações secundárias. Os polipeptídeos da presente invenção são preferivelmente usados em conjunção com outras enzimas de degradação de xilano tal como xilanases, acetilxilan esterases, arabinofuranosidases, xilosidases, feruloil esterases, glucuronidases e uma combinação deste, nos processos em que o material contendo xilano a ser degradado. Por exemplo, grupos acetila podem ser removidos por acetilxilan esterases; grupos arabinose por alfa-arabinosidases; grupos de feruloila por feruloil esterases e grupos de ácido glucurônico por alfaglucuronidases. Os oligômeros liberados pelas xilanases, ou pela combinação de xilanases e enzimas de hidrolização de ramificação secundária, pode ser ainda degradado a xilose livre por beta-xilosidases.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material contendo xilano ou celulósico, que compreende: tratar o material contendo xilano ou celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o material contendo xilano ou celulósico convertido ou degradado.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para produzir um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar um material contendo xilano ou celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção; (b) fermentar o material contendo xilano ou celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito aos métodos da fermentação de um material contendo xilano ou celulósico, que compreende: fermentar o material contendo xilano ou celulósico com um ou mais microrganismos de fermentação, em que a material contendo xilano ou celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material contendo xilano ou celulósico produz um produto de fermentação. Em outro aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarifícar um material contendo xilano ou celulósico aos açúcares fermentáveis e converter os açúcares fermentáveis em muitas substâncias úteis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produto de fermentação (por exemplo, ácidos, alcoóis, cetonas, gases e outros). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material contendo xilano ou celulósico tipicamente envolve pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processamento do material contendo xilano ou celulósico de acordo com a presente invenção pode ser acompanhado usando os processos convencionais na técnica. Além disso, os métodos da presente invenção pode ser implementado usando qualquer mecanismos de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separado ou simultâneo, inclui, mas não são limitadas a, hidrólise separada e fermentação (SHF); sacarificação simultânea e fermentação (SSF); sacarificação simultânea e co-fermentação (SSCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHF); hidrólise separada e co-fermentação (SHCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHCF); e conversão microbiana direta (DMC). SHF usa as etapas de processo separado ao primeiro material contendo xilano ou celulósico enzimaticamente hidrolisa aos açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, celobiose, celotriose e açúcares de pentose e então fermentar os açúcares fermentáveis ao etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática do material contendo xilano ou celulósico e a fermentação de açúcares ao etanol são combinados em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a cofermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the Departamento U.S. de Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF envolve uma etapa de hidrólise separada e além disso uma sacarificação simulltânea e etapa de hidrólise, que pode ser realizado na mesmo reator. As etapas em um processo HHF podem ser realizadas em temperaturas diferentes, isto é, sacarificação enzimática de temperatura alta seguido por SSF em uma temperatura inferior que a cepa de fermentação pode tolerar. DMC combina todos os três processos (produção de enzima, hidrólise e fermentação) em uma ou mais etapas onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas pela conversão do material contendo xilano ou celulósico aos açúcares 10 fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H. e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). E entendido neste que quaisquer métodos conhecidos na técnica compreendem o pré-tratamento, hidrólise enzimática 15 (sacarificação), fermentação, ou uma combinação deste podem ser usados na prática dos métodos da presente invenção.

Um mecanismo convencional pode incluir um reator agitado de batelada por alimentação, um reator agitado por batelada, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de 20 fluxo-tampão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fedbatch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V. e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzimatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, 25 Enz. Microb. Technol. Ί: 346-352), a attrition reactor (Ryu, S. K. e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, Ο. V., 1996, Enhancement of enzimatic cellulose hydrolysis using a novel type of biorreator com intensive agitation deduced for electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Tipos de reatores adicionais incluem: manta de fluxo ascendente de leite fluidizado, reatores de tipo imobilizado e extrusora para hidrólise e/ou fermentação.

Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecidos na técnica podem ser usados para interromper os componentes da parede celular vegetal de material contendo xilano e/ou celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzimatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of cellulosic lignomaterial for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sei. 9: 16211651; Yang and Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

O material contendo xilano ou celulósico também pode ser submetido a uma redução de tamanho de partícula, pré-saturação, umectação, lavagem, ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica.

Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas não são limitadas a, pré-tratamento de vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento do ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra de amônia, explosão úmida, pré-tratamento organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré-tratamentos adicionais incluem percolação de amônia, ultrassom, eletroporação, microondas, CO₂ supercrítico, H₂O supercrítico, ozônio, prétratamentos de irradiação de gama.

O material contendo xilano ou celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Altemativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com a hidrólise de enzima para liberar os açúcares fermentáveis, tal como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a etapa de pré-tratamento por si só resultam em alguma conversão de biomassa aos açúcares fermentáveis (ainda na ausência das enzimas).

Pré-tratamento. No pré-tratamento de vapor, material contendo xilano ou celulósico é aquecido para romper os componentes da parede celular vegetal, incluindo lignina, hemicelulose e celulose para fabricar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessível as enzimas. O material contendo xilano ou celulósico é passado a ou através de um recipiente de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura a temperatura requerida e pressão e é retido neste para o tempo de reação desejado. O pré-tratamento de vapor é preferivelmente feito a 140 a 230° C, mais preferivelmente 160 a 200° C e mais preferivelmente 170 a 190° C, onde a ótima faixa de temperatura depende de qualquer adição de um catalisador químico. O período de residência para o pré-tratamento de vapor é preferivelmente 1 a 15 minutos, mais preferivelmente 3 a 12 minutos e mais preferivelmente 4 a 10 minutos, onde o ótimo período de residência depende da faixa de temperatura e qualquer adição de um catalisador químico. O prétratamento de vapor permite para os carregamentos de sólidos relativamente altos, de modo que o material contendo xilano ou celulósico apenas é geralmente úmido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento de vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecido como explosão de vapor, isto é, cintilação rápida a pressão atmosférica e fluxo de turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível pela fragmentação (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente U.S. N°. 20020164730). Durante o pré-tratamento do vapor, grupos de hemicelulose de acetila são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose a monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida apenas a extensão limitada.

Um catalisador tal como H₂SO₄ ou SO₂ (tipicamente 0,3 a 3 % p/p) é frequentemente adicionado antes do pré-tratamento de vapor, que diminui o tempo e temperatura, aumenta a recuperação e melhora hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762).

Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” referese a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Exemplos dos processos de prétratamento químico adequado inclui, por exemplo, pré-tratamento do ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de congelamento/fibra de amônia (AFEX), percolação de amônia (APR) e prétratamentos de organosolvente.

No pré-tratamento do ácido diluído, material contendo xilano ou celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H₂SO₄ e água para formar uma pasta, aquecido pelo vapor a temperatura ambiente e após um período de residência cintilado em pressão atmosférica. O pré-tratamento do ácido diluído pode ser realizado com diversos projetos de reatores, por exemplo, reatores de fluxo-tampão, reatores contra-corrente, ou reatores de leito de contração contra-corrente contínua (Duff and Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

Diversos métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas também podem ser usados. Os pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não são limitadas a, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, percolação de amônia (APR) e explosão de congelamento/fíbra de amônia (AFEX).

O pré-tratamento de cal é realizado com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio ou amônia em temperatura baixa de 85 a 150° C e tempo de residência de 1 hora em diversos dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673686). WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 e WO 2006/110901 divulga os métodos de pré-tratamento usando amônia.

A oxidação úmida é um pré-tratamento realizado tipicamente a 180 a 200° C por 5 a 15 minutos com adição de um agente oxidativo tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O prétratamento é realizado a preferivelmente 1 a 40 % de substância seca, mais preferivelmente 2 a 30 % de substância seca e mais preferivelmente 5 a 20 % de substância seca e frequentemente o pH inicial ser aumentado pela adição de álcali tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento de oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão de vapor), pode manusear matéria seca até 30 %. Na explosão úmida, o agente de oxidização é introduzido durante o pré-tratamento após um certo período de residência. O pré-tratamento é então finalizado pela cintilação em pressão atmosférica (WO 2006/032282).

A explosão de fibra de amônia (AFEX) envolve tratar o material contendo xilano ou celulósico com amônia gasosa ou líquida nas temperaturas moderadas tal como 90 a 100° C e pressão alta tal como 17 a 20 bar por 5 a 10 minutos, onde o teor de substância seca pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). O pré-tratamento AFEX resulta na despolimerização de celulose e hidrólise parcial de hemicelulose. Os complexos de carboidrato-lignina são clivados.

O pré-tratamento organosolvente deslignifica material contendo xilano ou celulósico pela extração usando o etanol aquoso (40 a 60 % de etanol) a 160 a 200° C por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Ácido sulfurico é usualmente adicionado como um catalisador. No pré-tratamento organosolvente, a maioria de hemicelulose é removida.

Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105108, p. 69-85 e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686 e Pedido Publicado U.S. 2002/0164730.

Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento ácido e mais preferivelmente como um tratamento de ácido suave e/ou diluído contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfurico, mas outros ácidos também podem ser usados, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou misturas destes. O tratamento do ácido suave é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1 a 5, mais preferivelmente 1 a 4 e mais preferivelmente 1 a 3. Em um aspecto, o concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 20 % em peso do ácido, mais preferivelmente 0,05 a 10 % em peso do ácido, ainda mais preferivelmente 0,1 a 5 % em peso do ácido e mais preferivelmente 0,2 a 2,0 % em peso do ácido. O ácido é contatado com o material contendo xilano ou celulósico e mantido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 160 a 220° C e mais preferivelmente 165 a 195° C, por períodos que variam de segundos a minutos a, por exemplo, 1 segundo a 60 minutos.

Em outro aspecto, pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (etapa de pré-tratamento de AFEX).

Em outro aspecto, pré-tratamento acontece em uma pasta aquosa. Em aspectos preferidos, material contendo xilano ou celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10 a 80 % em peso, mais preferivelmente entre 20 a 70 % em peso e mais preferivelmente entre 30 a 60 % em peso, tal como em tomo de 50 % em peso. O material contendo xilano ou celulósico pré-tratado pode ser lavado ou não lavado usando qualquer método conhecidos na técnica, por exemplo, lavado com água.

Pré-tratamento mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem seca, moagem úmida, ou moagem de esfera vibratória). Em um aspecto preferido, pré-tratamento mecânico é realizado em um processo de batetada, sistema hidrolisador de pistola de vapor que usa pressão alta e temperatura alta como definido acima, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponíveis a partir de Sunds Defibrator AB, Sweden.

Pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento físico” referese a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material contendo xilano ou celulósico. Por exemplo, pré-tratamento físico pode envolver a irradiação (por exemplo, irradiação de microondas), explosão de vapor/vaporização, hidrotermólise e combinações destes.

O pré-tratamento físico pode envolver pressão alta e/ou temperatura alta (explosão de vapor). Em um aspecto, pressão alta significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 300 a cerca de 600 psi, mais preferivelmente cerca de 350 a cerca de 550 psi e mais preferivelmente cerca de 400 a cerca de 500 psi, tal como em tomo de 450 psi. Em outro aspecto, temperatura alta significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300° C, preferivelmente cerca de 140 a cerca de 235° C.

Pré-tratamento químico e físico combinado: Material contendo xilano ou celulósico pode ser pré-tratado tanto fisicamente quanto quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver o tratamento do ácido suave ou diluído e temperatura alta e/ou tratamento de pressão. Os pré-tratamentos químicos e físicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, como desejado. Um pré-tratamento mecânico também pode ser incluído.

Consequentemente, em um aspecto preferido, material contendo xilano ou celulósico é submetido ao pré-tratamento físico, químico ou mecânico, ou qualquer combinação deste, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material contendo xilano ou celulósico. As técnicas de pré-tratamento biológico pode envolver a aplicação de microrganismos de solubilização de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Μ. E., Baker, J. O. e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington,

DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates para a produção de etanol, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 e Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from cellulosic lignomaterial: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarificação. Na etapa de hidrólise, também conhecido como sacarificação, o material contendo xilano ou celulósico, por exemplo, prétratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e hemicelulose aos açúcares fermentáveis, tal como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúvel. A hidrólise é realizado enzimaticamente por uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade xilanase da presente invenção. As enzimas das composições também podem ser adicionadas sequencialmente.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser prontamente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica. Em um aspecto preferido, hidrólise é realizada sob as condições adequadas para a atividade das enzimas, isto é, ótima para as enzimas. A hidrólise pode ser realizada como um processo contínuo ou batelada por alimentação onde o material contendo xilano ou celulósico (substrato) pré-tratado é alimentado gradualmente a, por exemplo, uma enzima contendo a solução de hidrólise.

A sacarificação é geralmente realizada nos reatores de tanque agitados ou fermentadores sob pH controlado, temperatura e condições de mistura. O tempo do processo adequado, temperatura de condições de pH pode ser prontamente determinado por uma pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode continuar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente cerca de 16 a cerca de 72 horas e mais preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25° C a cerca de 70° C, mais preferivelmente cerca de 30° C a cerca de 65° C e mais preferivelmente cerca de 40° C a 60° C, em particular cerca de 50° C. O pH está na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7 e mais preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O teor de sólido seco está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso e mais preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

A composição de enzima preferivelmente compreende as enzimas tendo a atividade celulolítica e/ou atividade de degradação de xilano. Em um aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas de degradação de xilano. Em outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas celulolíticas. Em outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas de degradação de xilano e uma ou mais enzimas celulolíticas.

Uma ou mais enzimas de degradação de xilano são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, um acetixilan esterase, a feruloil esterase, um arabinofuranosidase, um xilosidase e glucuronidase. Uma ou mais das enzimas celulolíticas são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

Em outro aspecto preferido, a composição de enzima ainda ou ainda compreende um polipeptídeo adicional tendo atividade intensificadora celulolítica (ver, por exemplo, WO 2005/074647, WO 2005/074656 e WO 2007/089290). Em outro aspecto, a composição de enzima ainda pode ou ainda compreende uma ou mais atividades de enzima adicional para melhorar a degradação do material contendo celulose ou material contendo xilano. As enzimas adicionais preferidas são as hemicelulases (por exemplo, alfa-Dglucuronidases, alfa-L-arabinofuranosidases, endo-mananases, betamanosidases, alfa-galactosidases, endo-alfa-L-arabinanases, betagalactosidases), carboidrato-esterases (por exemplo, acetil-xilan esterases, acetil-manan esterases, esterases de ácido ferúlico, esterases de ácido coumárico, glucuronoil esterases), pectinases, proteases, enzimas ligninolíticas (por exemplo, lacases, peroxidases de manganês, peroxidases de lignina, enzimas de produção de H2O2, oxido-redutases), expansinas, swoleninas, ou misturas destes. Nos métodos da presente invenção, as enzimas adicionais pode ser adicionadas antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou após a propagação dos microrganismos de fermentação.

Um ou mais componentes da composição de enzima podem ser proteínas de tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas de tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que é usado como as células hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (diversos) outros componentes da composição de enzima. Um ou mais componentes da composição de enzima podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar uma composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações de proteína monocomponentes e multicomponentes.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem ser em qualquer forma adequada para o uso nos processos descritos neste, tal como, por exemplo, a caldo de fermentação bruto com ou sem células removidas, a preparação de enzima purificada ou semi-purificadas, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado de não polvilhamento, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquidas podem, por exemplo, ser estabilizados pela adição dos estabilizantes tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com o processo estabelecido.

As ótimas quantidades das enzimas e polipeptídeos tendo atividade xilanase dependendo de diversos fatores incluindo, mas não limitado a, a mistura de enzimas componentes, o material contendo xilano ou celulósico, a concentração do material contendo xilano ou celulósico, os prétratamentos do material contendo xilano ou celulósico, temperatura, tempo, pH e inclusão do organismo de fermentação (por exemplo, levedura para sacarificação simultânea e fermentação).

Em um aspecto preferido, uma quantidade efetiva das enzimas celulolíticas e/ou enzimas de degradação de xilano ao material contendo xilano ou celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e mais preferivelmente a cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g do material contendo xilano ou celulósico.

Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva dos polipeptídeos tendo atividade xilanase ao material contendo xilano ou celulósico é de cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg e mais preferivelmente a cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g do material contendo xilano ou celulósico.

Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva dos polipeptídeos tendo atividade xilanase as enzimas celulolíticas e/ou enzimas de degradação de xilano é de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente a cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g e mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g das enzimas celulolíticas.

As enzimas podem ser derivadas ou obtidas a partir de qualquer origem adequada, incluindo, origem de mamífero, bacteriano, fungico, levedura ou vegetal. O termo “obtido” significa neste que uma enzima foi isolada a partir de um organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima natural. O termo “obtido” também significado neste que uma enzima foi recombinantemente produzida em um organismo hospedeiro utilizando métodos descritos neste, em que uma enzima recombinantemente produzida é natural ou estranho ao organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácido modificada, por exemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são anulados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácido natural ou uma enzima produzida pelos processo de mistura de ácido nucleico conhecidos na técnica. Abrangido dentro de um significado de uma enzima natural são as variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha são as variantes recombinantemente obtidas, tal como pela mutagênese direcionada ao local ou mistura.

Um polipeptídeo tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano, ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo tal como um polipeptídeo E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasma o tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

O polipeptídeo tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano também podem ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,

Schizosaccharomyces, ou Yarrowia tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano; ou mais preferivelmente um polipeptídeo fóngico filamentoso tal como um polipeptídeo Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania,

Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylarixwa. tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus,

Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola,

Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thíelavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccata tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano.

Os mutantes projetados por proteína ou quimicamente modificados dos polipeptídeos tendo atividade celulolítica de enzima ou atividade de degradação de xilano também podem ser usados.

Um ou mais componentes da composição de enzima podem ser um componente recombinante, isto é, produzidos pela clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente simples e a célula subsequente transformada com a sequência de DNA e expressada em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (enzima é estranha ao hospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições também ser um hospedeiro homólogo (enzima é natural ao hospedeiro). As proteínas celulolíticas de monocomponentes também podem ser preparadas pela purificação de uma tal proteína a partir de um caldo de fermentação.

Os exemplos de preparações de proteína celulolítica comercial adequadas para o uso na presente invenção inclui, por exemplo, CELLIC™ Ctec (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S) e

NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S). Outras preparações comercialmente disponíveis que compreende celulase que podem ser usadas incluem CELLUZYME™, CEREFLO™ e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), LAMINEX™ e SPEZYME™ CP (Genencor Int.), ROHAMENT™ 7069 W (Rõhm GmbH) e FIBREZYME® LDI, FIBREZYME® LBR, ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic Intemational, Inc.). As enzimas de celulase são adicionadas em quantidades efetivas de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos e mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usados nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitadas a, Acidothermus cellulolyticus endoglucanase (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente U.S. N°. 5.275.944; WO 96/02551; Patente U.S. N°. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); Thermobifida fusca endoglucanase III (WO 05/093050); e Thermobifida fusca endoglucanase V (WO 05/093050).

Os exemplos de endoglucanases fungicas que podem ser usados nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitadas a, Trichoderma reesei endoglucanase I (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; GENBANK™ acessão N°. M15665); Trichoderma reesei endoglucanase II (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; GENBANK™ acessão N°. M19373); Trichoderma reesei endoglucanase III (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; GENBANK™ acessão N°. AB003694); Trichoderma reesei endoglucanase IV (Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591; GENBANK™ acessão N°. Y11II3); e Trichoderma reesei endoglucanase V (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; GENBANK™ acessão N°. Z33381); Aspergillus aculeatus endoglucanase (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); Aspergillus kawachii endoglucanase (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics

27: 435-439); Erwinia carotovara endoglucanase (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); Fusarium oxysporum endoglucanase (GENBANK™ acessão N°. L29381); Humicola grisea var. thermoidea endoglucanase (GENBANK™ acessão N°. AB003107); Melanocarpus albomyces endoglucanase (GENBANK™ acessão N°. MAL515703); Neurospora crassa endoglucanase (GENBANK™ acessão N°. XM 324477); Humicola insolens endoglucanase V; Myceliophthora thermophila CBS 117.65 endoglucanase; basidiomycete CBS 495.95 endoglucanase; basidiomycete CBS 494.95 endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C endoglucanase); Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F endoglucanase; Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A endoglucanase; e cepa Trichoderma reesei N°. VTT-D-80133 endoglucanase (GENBANK™ acessão N°. M15665).

Os exemplos de celulobioidrolases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Trichoderma reesei celobioidrolase I; Trichoderma reesei celobioidrolase II; Humicola insolens celobioidrolase I, Myceliophthora thermophila celobioidrolase II, Thielavia terrestris celobioidrolase II (CEL6A), Chaetomium thermophilum celobioidrolase I e Chaetomium thermophilum celobioidrolase II.

Os exemplos de beta-glucosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Aspergillus oryzae betaglucosidase; Aspergillus fumigatus beta-glucosidase; Penicillium brasilianum IBT 20888 beta-glucosidase; Aspergillus niger beta-glucosidase; e Aspergillus aculeatus beta-glucosidase.

O polipeptídeo Aspergillus oryzae tendo atividade betaglucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. O polipeptídeo Aspergillus fumigatus tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2005/047499. O polipeptídeo Penicillium brasilianum tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2007/019442. O polipeptídeo Aspergillus niger tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. O polipeptídeo Aspergillus aculeatus tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.

A beta-glucosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glucosidase é a proteína de fusão BG da variente de betaglucosidase Aspergillus oryzae ou a proteína de fusão de beta-glucosidase Aspergillus oryzae obtido de acordo com WO 2008/057637.

Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases são divulgados nas numerosas famílias de glicosil hidrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316 e Henrissat B. e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. 7 316: 695-696.

Outras enzimas celulolíticas que podem ser usados na presente invenção são descritas em EP 495,257, EP 531,315, EP 531,372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente U.S. N°. 4.435.307, Patente U.S. N°. 5.457.046, Patente U.S. N°. 5.648.263, Patente

U.S. N°. 5.686.593, Patente U.S. N°. 5.691.178, Patente U.S. N°. 5.763.254 e Patente U.S. N°. 5.776.757.

Nos métodos da presente invenção, qualquer polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica pode ser usado.

No primeiro aspecto, o polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica compreende os seguintes motivos: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] e [FW]-[TF]-K[AIV], em que X é qualquer aminoácido, X(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posições contínuas e X(4) é qualquer aminoácido em 4 posições contínuas.

O polipeptídeo que compreende os motivos notados acima ainda pode compreender:

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV], [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], ou H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN][FILV]-X-[ILV], em que X é qualquer aminoácido, X(l,2) é qualquer aminoácido em 1 posição ou 2 posições contínuas, X(3) é qualquer aminoácido em 3 posições contínuas e X(2) é qualquer aminoácido em 2 posições contínuas. Nos motivos acima, a abreviação de aminoácido de letra simples IUPAC aceitável é utilizada.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica ainda compreende H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW][AILMV], Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica ainda compreende [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN][FILV]-X-[ILV]. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica ainda compreende H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW][AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

Em um segundo aspecto, o polipeptídeo tendo atividade intensifícadora celulolítica compreende o seguinte motivo:

[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que x é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posições contínuas e x(3) é qualquer aminoácido em 3 posições contínuas. No motivo acima, a abreviação de aminoácido de letra simples IUPAC aceitável é utilizada.

Os exemplos de polipeptídeos tendo atividade intensifícadora celulolítica úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, polipeptídeos tendo atividade intensifícadora celulolítica a partir de Thielavia terrestris (WO 2005/074647); polipeptídeos tendo atividade intensifícadora celulolítica a partir de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656); e polipeptídeos tendo atividade intensifícadora celulolítica a partir de Trichoderma reesei (WO 2007/089290).

Os exemplos de preparação de enzima de degradação de xilano comercial adequadas para o uso na presente invenção inclui, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ Htec (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xylanase (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xylanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

Os exemplos de xilanases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Aspergillus aculeatus xilanase (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus xilanases (WO 2006/078256) e Thielavia terrestris NRRL 8126 xilanases (WO 2009/079210).

Os exemplos de beta-xilosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Trichoderma reesei betaxilosidase (UniProtKB/TrEMBL número de acessão Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt número de acessão Q8X212) e Neurospora crassa (SwissProt número de acessão Q7SOW4).

Os exemplos de acetilxilan esterases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Hypocrea jecorina acetilxilan esterase (WO 2005/001036), Neurospora crassa acetilxilan esterase (UniProt número de acessão q7s259), Thielavia terrestris NRRL 8126 acetilxilan esterase (WO 2009/042846), Chaetomium globosum acetilxilan esterase (Uniprot número de acessão Q2GWX4), Chaetomium gracile acetilxilan esterase (GeneSeqP número de acessão AAB82124), Phaeosphaeria nodorum acetilxilan esterase (Uniprot número de acessão Q0UHJ1) e Humicola insolens DSM 1800 acetilxilan esterase (WO 2009/073709).

Os exemplos de esterases de ácido ferúlico úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Humicola insolens DSM 1800 feruloil esterase (WO 2009/076122), Neurospora crassa feruloil esterase (UniProt número de acessão Q9HGR3) e Neosartorya fischeri feruloil esterase (UniProt Número de acessão A1D9T4).

Os exemplos de arabinofuranosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Humicola insolens DSM 1800 arabinofuranosidase (WO 2009/073383) e Aspergillus niger arabinofuranosidase (GeneSeqP número de acessão AAR94170).

Os exemplos de alfa-glucuronidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, Aspergillus clavatus alfaglucuronidase (UniProt número de acessão alccl 2), Trichoderma reesei alfaglucuronidase (Uniprot número de acessão Q99024), Talaromyces emersonii alfa-glucuronidase (UniProt número de acessão Q8X211), Aspergillus niger alfa-glucuronidase (Uniprot número de acessão Q96WX9), Aspergillus terreus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acessão Q0CJP9) e Aspergillus fumigatus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acessão Q4WW45).

As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas pela fermentação das cepas microbianas notadas acima em um meio nutriente contendo fontes de carbono adequados e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. and LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparado de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos de American Type Culture Collection). Faixa de temperaturas e outras condições adequadas para o desenvolvimento e produção de enzima são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E. e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

A fermentação pode ser qualquer método do cultivo de uma célula resultante na expressão ou isolamento de uma enzima. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreende o cultivo de frasco de agitação, ou fermentação de escala ampla ou menor (incluindo fermentações de estado contínuo, batelada, alimentação-batelada ou sólido) nos fermentadores industriais e laboratoriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo a enzima a ser expressada ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos acima podem ser recuperados a partir do meio de fermentação e purificado pelos procedimentos convencionais.

Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos do material contendo xilano ou celulósico hidrolisado e pré-tratado pode ser fermentado por um ou mais microrganismos de fermentação capaz de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto de fermentação desejado, a “fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. O processo de fermentação também incluem os processos de fermentação usados na indústria de álcool consumidos (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínios fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. As condições de fermentação depende do produto de fermentação desejado e organismo de fermentação e pode ser facilmente determinado por uma pessoa habilitada na técnica.

Na etapa de fermentação, açúcares, liberados a partir do material contendo xilano ou celulósico como um resultado do pré-tratamento e etapas de hidrólise enzimática, são fermentados ao produto, por exemplo, etanol, por um organismo de fermentação, tal como levedura. Hidrólise (sacarificação) e fermentação pode ser separado ou simultâneo, como descrito neste.

Qualquer material contendo xilano ou celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida a partir da fermentação e o processo utilizado, como é bem conhecido na técnica.

O termo “meio de fermentação” é entendido neste referir-se a um meio antes dos microrganismos de fermentação são adicionados, tal como, um meio resultante a partir do processo de sacarificação, bem como um meio usado na sacarificação simultânea e processo de fermentação (SSF).

O “microrganismo de fermentação” refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos fúngicos e bacterianos, adequadas para o uso no processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo de fermentação pode ser organismos de fermentação C6 e/ou C5, ou uma combinação deste. Tanto os organismos de fermentação C6 quanto C5 são bem conhecidos na técnica. Microrganismos de fermentação adequados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, tal como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose, ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Os exemplos de organismos de fermentação fungicos e bacterianos produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Os exemplos de microrganismos de fermentação que podem fermentar açúcares C6 incluem organismos fungicos e bacterianos, tal como levedura. A levedura preferida inclui as cepas de Saccharomyces spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

Os exemplos de organismos de fermentação que podem fermentar açúcares C5 incluem organismos fungicos e bacterianos, tal como levedura. Levedura de fermentação C5 preferida incluem as cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.

Outros organismos de fermentação incluem as cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis', Hansenula, tal como Hansenula anômala', Kluyveromyces, tal como K. fragilis·, Schizosaccharomyces, tal como S. pombe-, e E. coli, especialmente cepas E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar a produção de etanol.

Em um aspecto preferido, a levedura é um Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em outro aspecto preferido, a levedura é Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Candida. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Clavispora. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferido, a levedura é Pachysolen. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferido, a levedura é um Pichia. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é um Pichia stipitis. Em outro aspecto preferido, a levedura é um Bretannomyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

A bactéria que pode eficientemente fermentar hexose e pentose ao etanol inclui, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

Em um aspecto preferido, a bactéria é um Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

A levedura comercialmente disponível adequada para a produção de etanol inclui, por exemplo, levedura ETHANOL RED™ (disponíveis a partir de Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (disponíveis a partir de Fleischmann’s Yeast, USA), SUPERSTART™ e levedura fresca THERMOSACC™ (disponíveis a partir de Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM™ AFT e XR (disponíveis a partir de NABC - North American

Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND™ (disponíveis a partir de Gert Strand AB, Sweden) e FERMIOL™ (disponíveis a partir de DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, o microrganismo de fermentação foi geneticamente modificada para fornecer a capacidade para fermentar açúcares de pentose, tal como utilização de xilose, utilização de arabinose e xilose e microrganismos de co-utilização de arabinose.

A clonagem dos genes heterólogos em vários microrganismos de fermentação tem conduzido a construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses ao etanol (co-fermentação) (Chen and Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes que codifica o pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 41844190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bactéria to production of ethanol, Biotechnol. Bioeng. 58: 204214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 446599

4470; WO 2003/062430, xylose isomerase).

Em um aspecto preferido, o microrganismo de fermentação geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferido, o microrganismo de fermentação geneticamente modificado é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, o microrganismo de fermentação geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspecto preferido, o microrganismo de fermentação geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspecto preferido, o microrganismo de fermentação geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

E bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como descrito neste.

O microrganismo de fermentação é tipicamente adicionado a um hidrolisado e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26° C a cerca de 60° C, em particular cerca de 32° C ou 50° C e a cerca de pH 3 a cerca de pH 8, tal como em tomo de pH 4-5, 6, ou 7.

Em um aspecto preferido, a levedura e/ou outro microrganismo é aplicado ao material contendo xilano ou celulósico degradado e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24 a 60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura está preferivelmente entre cerca de 20° C a cerca de 60° C, mais preferivelmente cerca de 25° C a cerca de 50° C e mais preferivelmente cerca de 32° C a cerca de 50° C, em particular cerca de 32° C ou 50° Ceo pH é geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente em tomo de pH 4 a 7. Entretanto, alguns organismos de fermentação, por exemplo, bactéria, tendo ótima temperatura de fermentação maior. A levedura ou outro microrganismo são preferivelmente aplicados em quantidades de aproximadamente 10⁵ a 10¹², preferivelmente de aproximadamente 10⁷ a 10¹⁰, especialmente

100 aproximadamente 2 x 10⁸ contagem de célula viável por ml de caldo de fermentação. Ainda a orientação com relação ao uso de levedura para fermentação pode ser observado em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que é portanto incorporado por referência.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos descritos neste ainda para melhorar o processo de fermentação e em particular, o desempenho do microrganismo de fermentação, tal como, intensificação da taxa e a produção de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para desenvolvimento dos microrganismos de fermentação, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferida para desenvolvimento incluem vitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D é E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é portanto incorporado por referência. Os exemplos de minerais incluem sais minerais e minerais que podem fornecer os nutrientes que compreende P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico e

101 ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H₂), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de valor alto.

Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será entendido que o termo “álcool” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production ffom renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, Μ. M. e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. and Blaschek, Η. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspecto

102 mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em outro aspectomais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em outro aspectomais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspectomais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido láctico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65:435-448.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de cetona. Em outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi and Blaschek, 2003, supra.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é

103 treonina. Ver, por exemplo, Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferido, o gás é H₂. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO₂. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bactéria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

Recuperação. Os produtos de fermentação podem ser opcionalmente recuperados a partir do meio de fermentação usando qualquer método conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado a partir do material contendo xilano ou celulósico fermentado e purificado pelos métodos convencionais de destilação. O etanol com uma preza de até a cerca de 96 % de volume pode ser obtido, que pode ser usado como, por exemplo, combustível etanol, etanol potável, isto é, espíritos neutros potáveis, ou etanol industrial.

Outros usos

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados com atividade limitada de outras enzimas xilanolíticas para degradar ois xilanos para a produção de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser usados como agente de volume, semelhante a arabinoxilan oligossacarídeos liberados a partir do material de parede celular de cereal, ou de mais ou menos arabinoxilanos purificados a partir dos cereais.

104

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados em combinação com outras enzimas xilanolíticas para degradar os xilanos a xilose e outros monossacarídeos (Patente U.S. N°. 5.658.765). A xilose liberada pode ser convertida a outros compostos.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados juntos com outras enzimas semelhantes a glucanase para melhorar a extração do óleo a partir do material vegetal rico em óleo, semelhante ao óleo de milho a partir dos embriões de milho.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados no cozimento para melhorar o desenvolvimento, elasticidade e/ou estabilidade de aridez e/ou o volume, estrutura fracionada e/ou propriedades anti-envelhecimento do produto cozido (ver Patente U.S. N°. 5.693.518). Os polipeptídeos também podem ser usados para a preparação da aridez ou produtos cozidos preparados a partir de qualquer tipo de farinha ou cereal (por exemplo, com base em trigo, centeio, cevada, aveia ou milho). Os produtos cozidos produzidos com um polipeptídeo da presente invenção incluem pães, pão francês, baguetes e outros. Para os propósitos do cozimento um polipeptídeo da presente invenção podem ser usados como apenas ou maior atividade enzimática, ou podem ser usados em combinação com outras enzimas tal como uma xilanase, uma lipase, uma amilase, uma oxidase (por exemplo, glicose oxidase, peroxidase), uma lacase e/ou uma protease.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados para a modificação de alimentação do animal e pode exercer seu efeito in vitro (pela modificação dos componentes do alimento) ou in vivo para melhorar a digestibilidade de alimento e aumentar a eficiência desta utilização (Patente U.S. N°. 6.245.546). Os polipeptídeos podem ser adicionados as composições alimentícias contendo altas quantidades de arabinoxilanos e glucuronoxilanos, por exemplo, alimento contendo cereais tal como cevada, trigo, centeio, aveias ou milho. Quando adicionado ao alimento o polipeptídeo

105 melhorará a quebra in vivo do material de parede celular vegetal parcialmente devido a redução da viscosidade intestinal (Bedford et al., 1993, Proceedings of the lst Symposium on Enzymes in Animal Nutrition, pp. 73-77), em que a utilização melhorada dos nutrientes vegetais pelo animal é atingido. Portanto, a taxa de desenvolvimento e/ou razão de conversão de alimentação (isto é, o peso do alimento ingerido relativo ao ganho de peso) do animal é melhorado.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados na indústria de papel e polpa, inter alia, nos processos de alvejamento para intensificar o brilho das polpas alvejadas em que a quantidade do cloro usado nos estágios de alvejamento é reduzido e para aumentar o freeness of pulps in the recycled paper process (Eriksson, 1990, Wood Science and Technology 24: 79-101; Paice et al., 1988, Biotechnol. and Bioeng. 32: 235239 e Pommier et al., 1989, Tappi Journal 187-191). O tratamento da polpa lignocelulósica pode ser realizado, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N°. 5.658.765, WO 93/08275, WO 91/02839 e WO 92/03608.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados na preparação da cerveja, em particular para melhorar a filtrabilidade de mosto contendo, por exemplo, cevada e/ou malte de sorgo (WO 2002/24926). Os polipeptídeos podem ser usados na mesma maneira como pentosanases convencionalmente usado para a preparação, por exemplo, como descrito por Viêtor et al., 1993, J. Inst. Brew. 99: 243-248; e EP 227159. Além disso, os polipeptídeos podem ser usados para o tratamento de grãos de cervejeiro gastos, isto é, resíduos a partir da produção de mosto de cerveja contendo cevada ou cevada maltada ou outros cereais, de modo como melhorar a utilização dos residuais por, por exemplo, alimentação animal.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para a separação dos componentes dos materiais da célula de planta, em particular dos componentes cereais tal como componentes de trigo. De interesse particular é a separação de trigo e glúten e amido, isto é, componentes de

106 interesse comercial considerável. O processo de separação pode ser realizado pelo uso dos métodos conhecidos na técnica, tal como o denominado processo de massa (ou processo de moagem úmida) realizado como um processo decantador ou hidroclone. No processo de massa, o material de partida é uma dispersão bombeável diluída do material vegetal tal como trigo a ser submetido a separação. Em um processo de separação de trigo a dispersão é feita normalmente a partir de farinha de trigo e água

Os polipeptídeos da invenção também podem ser usados na preparação do fruto e suco vegetal a fim de aumentar a produção (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.228.630).

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados como um componente de um sistema de contagem enzimática por têxteis (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.258.590).

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados nas aplicações do detergente de lavanderia em combinação com outras funcionalidades de enzima (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.696.068).

Peptídeo sinalizador

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2. A presente invenção também diz respeito à construção de ácidos nucleicos que compreende um gene que codifica uma proteína, em que um gene é operavelmente ligado ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal que compreende ou que consiste de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2, em que um gene é estranho ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal.

Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo compreende ou consiste de nucleotídeos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito aos vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes que

107 compreendem tais construções de ácido nucleico.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produção de uma proteína que compreende (a) cultivar uma tal célula hospedeira recombinante sob condições adequadas para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

A proteína pode ser natural ou heteróloga as células hospedeiras. O termo “proteína” não é significado neste referir-se ao comprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange os peptídeos, oligopeptídeos e proteínas. O termo “proteína” também abrange dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de sequências de polipeptídeos parciais ou completos obtidos de pelo menos duas proteínas diferentes em que um ou mais (diversos) podem ser heterólogos ou naturais às células hospedeiras. As proteínas adicionais incluem variações projetadas e alélicas de ocorrência natural das proteínas mencionadas acima e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidoredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Ainda em um aspecto mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrin glicosiltransferase, desoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, outra lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótico, eucariótico ou outra fonte.

108

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitantes no escopo da invenção.

Exemplos

Materiais

Os químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau reagente.

Cepa

Penicillium pinophilum NN046877 foi usado como uma fonte do polipeptídeo da família 10 tendo atividade xilanase. A cepa Aspergillus oryzae HowBlOl (WO 95/35385) foi usada como um hospedeiro para recombinantemente expressar o polipeptídeo da família Penicillium pinophilum NN046877 10 tendo atividade xilanase.

Meio

As placas PDA foram compostas de 39 gramas de ágar de dextrose de batata e água desionizada a litro.

O meio NNCYP-PCS foi composto por litro de 5,0 g de NaNO3, 3,0 g de NH4CI, 2,0 g de MES, 2,5 g de ácido cítrico, 0,2 g de CaCl₂ 2H₂O, 1,0 g de Bacto Peptona, 5,0 g de extrato de levedura, 0,2 g de MgSO₄ 7H₂O, 4,0 g de K₂HPO₄, 1,0 ml de solução de elementos traço CO VE, 2,5 g de glicose, 25,0 g de forragem de milho pré-tratada (PCS) e água desionizada a litro.

A solução de elementos traço COVE foi composta de 0,04 g de Na₂B₄O₇-10H₂O, 0,4 g de CuSO₄-5H₂O, 1,2 g de FeSO₄-7H₂O, 0,7 g de MnSO₄-H₂O, 0,8 g de Na₂MoO₂-2H₂O, 10 g de ZnSO₄-7H₂O e água desionizada a litro.

As placas LB foram compostas de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar e água desionizada a litro.

O meio SOC foi composto de 2 % de triptona, 0,5 % de extrato

109 de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl₂ e 10 mM de MgSO₄; esterilizado pela autoclave e então glicose esterilizada por filtro foi adicionada a 20 mM.

O meio YPM foi composto de 1 % de extrato de levedura, 2 % de Bacto peptona e 2 % de maltose.

As placas médias mínimas foram compostas de 6 g de NaNO₃, 0,52 de KC1, 1,52 g de KH2PO4, 1 ml de solução metálica traço COVE, 20 g de ágar Noble, 20 ml de 50 % de glicose, 2,5 ml de 20 % de MgSO4'7H₂O, 20 ml da solução de estoque de biotina e água desionizada a litro.

A solução de estoque de biotina foi composto por litro de 0,2 g de biotina.

A solução metálica traço COVE foi composta de 0,04 g de Na₂B4O₇-10H₂O, 0,4 g de CuSO₄-5H₂O, 1,2 g de FeSO₄-7H₂O, 0,7 g de MnSO₄-H₂O, 0,8 g de Na₂MoO₂H₂O, 10 g de ZnSO₄-7H₂O e água desionizada a litro.

Exemplo 1: Preparação do micélio da cepa Penicillium pinophilum

As amostras do composto foram coletadas a partir de Yunnan, China on December 12, 2000. Penicillium pinophilum NN046877 foram isoladas usando as técnicas de isolamento de esporo simples nas placas PD As a 45° C. A cepa Penicillium pinophilum NN046877 foi inoculada em uma placa PDA e incubada por 4 dias a 37° C no escuro. Os tampões PDA de diversos micélios foram inoculados em 500 ml de frascos de agitação contendo 100 ml do meio NNCYP-PCS. Os frascos foram incubados por 5 dias a 37° C com agitação a 160 rpm. Os micélios foram coletados no dia 4 e dia 5. Os micélios de cada dia forma congelados no nitrogênio líquido e armazenado em um congelador -80° C até o uso.

Exemplo 2: Isolamento de RNA da cepa Penicillium pinophilum

110

Os micélios congelados foram transferidos em um pilão préesfriado por nitrogênio líquido e triturado em um pó fino. O RNA total foi preparado a partir do micélio em forma de pó de cada dia pela extração com o reagente TRIZOL™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). O RNA enriquecido por poliA foi isolado usando um kit total mTRAP (Active Motif, Carlsbad, CA, USA).

Exemplo 3: Construção de uma biblioteca de cDNA da cepa Penicillium pinophilum

O cDNA filamentado duplo de cada dia foi sintetizado com um kit de construção da biblioteca de cDNA SMART™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA). O cDNA foi clivado com Sfi I e o cDNA foi fracionado por tamanho em 0,8 % de eletroforese em gel de agarose usando 44 mM de Tris base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão EDTA (TBE). A fração de cDNA de 500 bp e maior foi taxado a partir do gel e purificado usando um kit de purificação de grupo em gel e DNA PCR GFX® (GE Healthcare, United Kingdom) de acordo com as instruções do fabricante. Então as quantidades iguais de cDNA a partir do dia 4 e dia 5 foram unidos para a construção da biblioteca.

O cDNA unido foi então direcionalmente clonado pela ligação em Sfi I clivado por pMHas7 (WO 2009/037253) usando T4 ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi eletroporada na célula E. coli ELECTROMAX™ DH10B™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) usando um GENE PULSER® e controlador de pulso (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a 25 pF, 25 mAmp, 1,8 kV com um cadinho de fenda de 1 mm de acordo com o procedimento dos fabricantes.

As células eletroporadas foram colocadas em placas LB suplementadas com 50 mg de canamicina por litro. Uma ferramenta de cDNA foi preparada de 60.000 transformantes totais da ligação de vetor pMHas7

111 original. O DNA de plasmídeo foi preparado diretamente a partir do grupo de colônias usando um kit plasmídeo QIAGEN® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 4: Construção de um transposon SigA4 contendo o gene repórter β-lactamase

Um plasmídeo contendo transposon projetado por pSigA4 foi construído a partir do transposon pSigA2 contendo o plasmídeo descrito no WO 2001/77315 a fim de criar uma versão melhorada do transposon de aprisionamento de sinal pSigA2 com o fundamento de seleção diminuído. O transposon pSigA2 contém uma construção de beta-lactamase de sinal menor codificado no próprio transposon. PCR foi usado para criar uma deleção do gene beta lactamase intacto observado na estrutura do plasmídeo usando uma polimerase Pfu Turbo à prova de piolho PROOFSTART™ (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Germany) e os seguintes iniciadores 5’ fosforilados (TAG Copenhagen, Denmark):

SigA2NotU-P: 5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’ (SEQID NO: 3)

SigA2NotD-P: 5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’ (SEQ ID NO: 4)

A reação de amplificação foi composto de 1 μΐ de pSigA2 (10 ng/ μΐ), 5 μΐ de tampão 10X PROOFSTART™ (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Germany), 2,5 μΐ de mistura dNTP (20 mM), 0,5 μΐ de SigA2NotU-P (10 mM), 0,5 μΐ de SigA2NotD-P (10 mM), 10 μΐ de solução Q (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Germany) e 31,25 μΐ de água desionizada. Um ciclizador térmico DNA ENGINE™ (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) foi usado pela amplificação programada por um ciclo a 95° C por 5 minutos; e 20 ciclos cada um a 94° C por 30 segundos, 62° C por 30 segundos e 72° C por 4 minutos.

Um produto de reação a 3,9 kb PCR foi isolado por 0,8 % de

112 eletroforese em gel de agarose usando 40 mM de Tris base-20 mM de acetato de sódio -1 mM de tampão de EDTA de sódio (TAE) e 0,1 pg de brometo de etídio por ml. O grupo de DNA foi visualizado com a ajuda de um sistema de imagem EAGLE EYE® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) a 360 nm. O grupo de DNA 3,9 kb foi taxado a partir do gel e purificado usando um DNA PCR GFX® e Kit de purificação de grupo em gel de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento 3,9 kb foi auto-ligado a 16° C durante a noite com 10 unidades de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA), 9 μΐ do fragmento de PCR 3,9 kb e 1 μΐ de tampão de ligação 10 X (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA). A ligação foi inativada por calor em 10 minutos a 65° C e então digerido com Dpn I a 37° C por 2 horas. Após incubação, a digestão foi purificada usando um DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de grupo em gel.

O material purificado foi então transformado em células competentes E. coli TOP 10 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de transformação foi colocada em placas LB suplementadas com 25 pg de cloranfenicol por ml. Os plasmídios minipreps foram preparados a partir de diversos transformantes e digeridos com Bgl II. Um plasmídeo com a construção correta foi escolhido. O plasmídeo foi indicado por pSigA4. O plasmídeo pSigA4 contém o transposon flanqueado por Bgl II SigA2 idêntico aquele divulgado em WO 2001/77315.

Uma amostra de 60 μΐ de plasmídeo pSigA4 DNA (0,3 pg/μΐ) foi digerida com Bgl II e separada por 0,8 % de eletroforese em gel de agarose usando tampão de TBE. Um grupo de DNA de transposon SigA2 de 2 kb foi eluído com 200 μΐ de tampão EB (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Germany) e purificado usando um DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de grupo em gel de acordo com as instruções do fabricante e eluído em 200 μΐ de tampão EB. O SigA2 foi usado pelo aprisionamento de sinal assistido por transposon.

113

Exemplo 5: Aprisionamento de sinal assistido por transposon da cepa Penicillium pinophilum

Uma descrição completa do aprisionamento de sinal assistido por transposon é descrita no WO 2001/77315. O grupo de plasmídeo foi tratado com o transposon SigA2 e HYPERMU™ transposase (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para o aprisionamento de transposon in vitro da biblioteca de cDNA Penicillium pinophilum, 2 μΐ de transposon SigA2 contendo aproximadamente 100 ng de DNA foram misturados com 1 μΐ de DNA do grupo de plasmídeo da biblioteca de cDNA Penicillium pinophilum contendo 1 pg de DNA, 1 μΐ de HYPERMU™ transposase e 2 μΐ de tampão 10X (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA) em um volume total de 20 μΐ e incubado a 30° C por 3 horas seguido pela adição de 2 μΐ de tampão de interrupção (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA) e inativado por calor a 75° C por 10 minutos. O DNA foi precipitado pela adição de 2 μΐ de 3 M acetato de sódio pH 5 e 55 μΐ de 96 % de etanol e centrifugado por 30 minutos a 10.000 x g, 4^o C. O grânulo foi lavado em 70 % de etanol, secado em ar em temperatura ambiente e recolocada em suspensão em 10 μΐ de água desionizada.

Um volume de 2 μΐ do grupo de plasmídeo rotulado por transposon foi submetido a eletroporação em 50 μΐ das células de E. coli ELECTROMAX™ DH10B™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante usando um GENE PULSER® e controlador de pulso a 25 pF, 25 mAmp, 1,8 kV com uma cadinho de fenda 1 mm de acordo com os procedimentos do fabricante.

As células submetidas a eletroporação foram incubadas em meio SOC com agitação a 225 rpm por 1 hora a 37° C antes de ser colocada no seguinte meio seletivo: o meio LB suplementado com 50 pg de canamicina

114 por ml; meio LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml e 15 pg de cloranfenicol por ml; e meio LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml, 15 pg de cloranfenicol por ml e 30 pg de ampicilina por ml.

A partir da colocação da eletroporação no meio LB suplementado com canamicina, cloranfenicol e ampicilina, aproximadamente 200 colônias por 50 pl foram observadas após 3 dias a 30° C. Todas as colônias foram replicadas colocadas no meio LB com canamicina, cloranfenicol e ampicilina descritos acima. Quinhentos colônias foram recuperadas sob esta condição de seleção. O DNA a partir de cada colônia foi sequenciado com o transposon avançado e os iniciadores reversos (iniciadores A e B), mostrados abaixo, de acordo com o procedimento divulgado em WO 2001/77315 (página 28).

Iniciador A:

5’-agcgtttgcggccgcgatcc-3’ (SEQ ID NO: 5)

Iniciador B:

5’-ttattcggtcgaaaaggatcc-3’ (SEQ ID NO: 6)

Exemplo 6: Montagem de anotação de sequência

As sequências de DNA foram obtidas de SinoGenoMax Co., Ltd (Beijing, China). Iniciador A e sequência B iniciadora lidas para cada plasmídeo foram apresentadas para remover o vetor e sequência de transposon. As sequências montadas foram agrupadas em contigs pelo uso do programa PhredPhrap (Ewing et al., 1998, Genome Research 8: 175-185; Ewing and Green, 1998, Genome Research 8: 186-194). Todos os contigs foram subsequentemente comparados as sequências disponíveis no DNA público padrão e banco de dados das sequências de proteína (TrEMBL, SWALL, PDB, EnsemblPep, GeneSeqP) usando o programa BLASTX 2, 0al9MP-WashU [14-Jul-1998] [Build linux-x86 18:51:44 30-Jul-1998] (Gish et al., 1993, Nat. Genet. 3: 266-72). O candidato de xilanase da família GH10 foi identificado diretamente pela análise dos resultados BlastX.

115

Exemplo 7: Preparação do DNA genômico de Penicillium pinophilum NN046877

Penicillium pinophilum NN046877 foi desenvolvido em uma Placa ágar PDA a 37° C por 4 a 5 dias. Os micélios foram diretamente 5 coletados a partir da placa de ágar em um pilão esterilizado e congelado pelo nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram triturados, pelo pilão, a um pó fino e DNA genômico foi isolado usando um kit DNEASY® Plant Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 8: Clonagem do gene de xilanase Penicillium 10 pinophilum a partir do DNA genômico

Com base na informação do gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 obtido como descrito no Exemplo 6, iniciadores de oligonucleotídeos, mostrados abaixo, foram projetados para amplificar o gene de xilanase GH10 a partir do DNA genômico de Penicillium pinophilum 15 NN046877. Um Kit de clonagem IN-FUSION® CF Dry-down (Clontech

Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) foi usado para clonar diretamente o fragmento no vetor de expressão pPFJO355, sem a necessidade para a digestão e ligação de restrição.

Iniciador sentido:

5’ACACAACTGGGGATCCACCATGACTCTAGTAAAGGCTATTCTTTTA GC-3’ (SEQ ID NO: 7)

Iniciador anti-sentido:

5’25 GTCACCCTCTAGATCTTCAC AAACATTGGGAGTAGTATGG-3 ’ (SEQ

IDNO.-8)

As letras em negrito representam a sequência codificadora e a sequência remanescente foi homóloga aos locais de inserção de pPFJO355.

O vetor de expressão pPFJO355 contém o promotor amilase

116

Aspergillus oryzae TAKA-, elementos terminadores glicoamilase Aspergillus niger, sequências derivadas de pUC19 para a seleção e propagação em E. coli e um gene pyrG, que codifica uma orotidina descarboxilase Aspergillus nidulans para a seleção de um transformante da cepa Aspergillus de mutante pyrG.

Vinte picomols de cada um dos iniciadores acima foram usados em uma reação PCR composta de DNA genômico Penicillium pinophilum NN046877, 10 μΐ de tampão 5X GC (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 1,5 μΐ de DMSO, 2,5 mM cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP e 0,6 unidade de PHUSION™ High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), em um volume final de 50 μΐ. A amplificação foi realizada usando um ciclizador térmico Peltier (MJ Research Inc., South San Francisco, CA, USA) programado pela desnaturação a 98° C por 1 minutos; 5 ciclos de desnaturação a 98° C por 15 segundos, submetido a anelação a 56° C por 30 segundos, com um aumento de I^o C por ciclo e alongamento a 72° C por 75 segundos; 25 ciclos cada um a 98° C por 15 segundos, 65 C por 30 segundos e 72° C por 75 segundos; e uma extensão final a 72° C por 10 minutos. O bloco de calor então estava em um ciclo embebido a 4^o C.

Os produtos de reação foram isolados por 1,0 % de eletroforese em gel de agarose usando tampão TBE onde um grupo de produto de aproximadamente 1,4 kb foi taxado a partir do gel e purificado usando um DNA de PCR ILLUSTRA® GFX® e kit de purificação de grupo em gel (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam I e Bgl II, isolado por 1,0 % de eletroforese em gel de agarose usando tampão TBE e purificado usando um DNA de PCR ILLUSTRA® GFX® e kit de purificação de grupo em gel de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados juntos

117 usando um Kit de clonagem PCRIN-FUSION® CF Dry-down resultando em pPpin3 (Figura 1) em que a transcrição do gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 está sob o controle de promotor alfa-amilase Aspergillus oryzae TAKA. Em breve, 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam I e Bgl II e 60 ng do gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 purificado pelo produto PCR foram adicionados por um frasco de reação e recolocado em suspensão em um volume final de 10 μΐ com adição de água desionizada. A reação foi incubada a 37° C por 15 minutos e então 50° C por 15 minutos. Três μΐ da reação foram usadas para transformar células competentes E. coli ΤΘΡ10 (TIANGEN Biotech Co. Ltd., Beijing, China). Um transformantes E. coli contendo pPpin3 foi detectado pela colônia de PCR e DNA de plasmídeo foi preparado usando um kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). A inserção do gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 em pPpin3 foi confirmada pelo sequenciamento de DNA usando um analisador de DNA 3730XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA).

O mesmo fragmento de PCR foi clonado no vetor pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA) usando um sistema de vetor pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA) para gerar pGEM-TPpin3. O gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 contido em pGEMT-Ppin3 foi confirmado pelo sequenciamento de DNA usando um analisador de DNA 3730XL. A cepa E. coli 059157T-Ppin3 (NN059157), contendo pGEM-T-Ppin3, foi depositada com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSM), D-38124 Braunschweig, Germany on September 7, 2009 e indica o número de acessão DSM 22922.

Exemplo 9: Caracterização da sequência genômica Penicillium pinophilum que codifica um polipeptídeo GH10 tendo atividade xilanase

O sequenciamento de DNA do clone genômico Penicillium pinophilum que codifica um polipeptídeo GH10 tendo atividade xilanase foi

118 realizado com um sequenciador de DNA automático modelo Biosystems Model 3700 aplicado usando química terminadora versão 3.1 BIG-DYE™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) e química dGTP (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) e estratégia de walking de iniciador. Os dados de sequência de nucleotídeos foram examinados pela qualidade e todas as sequências foram comparadas em cada outra com assistência de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA).

A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) e sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) do gene Penicillium pinophilum ghlO são mostrados na Figuras 2A e 2B. A sequência codifícadora é 1442 bp incluindo o códon de interrupção e é interrompido por três íntrons de 51 bp (nucleotídeos 199-249), 73 bp (nucleotídeos 383-455) e 94 bp (nucleotídeos 570-663). A proteína predita codificada é 407 aminoácidos. A % G+C da sequência codifícadora do gene (incluindo íntrons) é 47,99 % G+C e a sequência codifícadora de polipeptídeo madura é 49,22 %. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 19 resíduos foi predito. A proteína madura predita contém 388 aminoácidos com uma massa molecular predita de 41,5 kDa e um ponto isoelétrico de 5,03.

Um alinhamento global de formação em pares comparativos das sequências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácido deduzida do gene Penicillium pinophilum que codifica o polipeptídeo GH10 tendo atividade xilanase formando 76 % e 87 % de identidade (excluindo fendas) a sequência de aminoácido deduzida da proteína de família GH10 predita a partir de Talaromyces emersonii (AAU99346) e Penicillium

119 marneffei (B6QN64), respectivamente.

Exemplo 10: Expressão do gene de xilanase Penicillium pinophilum GH10 em Aspergillus oryzae

Os protoplastos Aspergillus oryzae HowBlOl (WO 95/35385 Exemplo 1) foram preparados de acordo como método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 e transformado com 3 pg de pPpin3. a transformação produziu cerca de 50 transformantes. Doze transformantes foram isolados as placas médias mínimas individuais.

Quatro transformantes foram inoculados separadamente em 3 ml do meio YPM em uma placa de 24 reservatórios e incubados a 30° C com agitação a 150 rpm. Após 3 dias de incubação, 20 μΐ de sobrenadante de cada cultura foram analisados por SDS-PAGE usando um NUPAGE® NOVEX® 4-12 % gel Bis-Tris com ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi tingido com INSTANT® Blue (Expedeon Ltd., Babraham Cambridge, UK). Os perfis SDS-PAGE das culturas mostraram a maioria dos transformantes tem um maior grupo de aproximadamente 55 kDa. A cepa de expressão foi indicada Aspergillus oryzae EXP02765.

A inclinação de Aspergillus oryzae EXP02765 foi lavada com 10 ml de YPM e inoculada em um frasco de 2 litros contendo 400 ml do meio YPM para gerar o caldo para a caracterização da enzima. A cultura foi coletada no dia 3 e filtrada usando uma membrana DURAPORE® de 0,45 pm (Millipore, Bedford, MA, USA).

Exemplo 11: Purificação de xilanase Penicillium pinophilum GH10 recombinante a partir de Aspergillus oryzae

Um volume de 1 litro de caldo filtrado da cepa Aspergillus oryzae EXP02765 foi preciptado com sulfato de amônio (80 % de saturação) e dissolvido novamente em 50 ml de acetato de sódio 25 mM pH 4,3 e então

120 dializado contra o mesmo tampão e filtrado através de um filtro de 0,45 mm. A solução foi aplicada a uma coluna de fluxo rápido de 40 ml Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) equilibrado em 25 mM de acetato de sódio pH 4,3. A proteína GH10 recombinante não liga-se a coluna. As frações com atividade de xilanase foram coletadas e avaliadas por SDS-PAGE como descrito no Exemplo 10. As frações contendo um grupo de aproximadamente 55 kDa foram unidas. A solução unida foi concentrada pela ultrafiltração.

Exemplo 12: Avaliação de Penicillium pinophilum GH10 xilanase em hidrólise PCS

A forragem de milho foi pré-tratada no Departamento U.S. de Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido sulfurico diluído. As seguintes condições foram usadas para o pré-tratamento: 0,048 g de ácido sulfurico/ g de biomassa seca a 190° C e 25 % de sólidos secos p/p em tomo de 1 minuto. Os sólidos insolúveis em água na forragem de milho pré-tratado (PCS) contém 52 % de celulose, 3,6 % de hemicelulose e 29,8 % de lignina. A celulose e hemicelulose foram determinados por uma hidrólise de ácido sulfurico de dois estágios com análise subsequente de açúcares pela cromatografia líquida de desempenho alto usando procedimento analítico padrão NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente após a hidrolização das frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfurico usando procedimento analítico padrão NREL #003. Antes da hidrólise enzimática, o PCS foi triturado (Multi Utility Grinder, Inno Concepts Inc., GA, USA) e peneirado através de uma avaliação 450 um (Retsch AS200).

A xilanase Penicillium pinophilum GH10 foi expressada e purificada como descrito no Exemplos 10 e 11. A concentração de proteína foi determinado por SDS-PAGE usando um gel 8 a 16 % CRITERION® SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) e um sistema

121 de imagem livre de pigmento CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Os efeitos sinergísticos entre xilanase Penicillium pinophilum GH10 e uma preparação de enzima celulolítica Trichoderma reesei SaMeMF268 (WO 2008/151079) foram determinadas usando 1 grama trituraçãopeneirada, ensaio de hidrólise PCS não lavado (GS-PCS) a 50° C, pH 5. Penicillium pinophilum GH10 xilanase (0,6 mg/g de celulose) foi adicionada a preparação de enzima celulolítica Trichoderma reesei SaMe-MF268 (3 mg/g de celulose), dando um carregamento total de 3,6 mg de proteína/g de celulose. Os carregamentos de sólidos insolúveis totais de GS-PCS foi 50 g/L (em 50 mM de tampão acetato de sódio pH 5,0 contendo 1 mM de sulfato manganês). O volume de reação total foi 1,0 ml em placas de 96 reservatórios. Os ensaios foram realizados em duplicatas. Após 72 horas de incubação a 50° C, os sobrenadantes foram removidos e filtrados através de uma placa de filtro de 96 reservatórios 0,45 pm (Millipore, Bedford, MA, USA), diluído 2 vezes em 5 mM de H₂SO₄ e analisado por cromatografia de coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) usando um AGILENT® 1100 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) e detecção do índice refrativo. Os dados de hidrólise são apresentados como % da celulose total convertida a glicose. O grau de conversão de celulose para reduzir o açúcar foi calculado usando a seguinte equação: Conversão ₍o_/o) = RS _(mg/_mi) * 100 * 162 / (Celulose (mg/mi) * 180) = RS _(mg/ml) * 100 / (Celulose (^ΐ) * 1,111)

Nesta equação, RS é uma concentração de redução do açúcar na solução medida nos equivalentes de glicose (mg/ml) e o fator 1,111 reflete o ganho de peso na conversão da celulose a glicose.

A hidrólise PCS pela xilanase Penicillium pinophilum GH10 (0,6 mg/g de celulose) e a preparação de enzima celulolítica Trichoderma reesei SaMe-MF268 (3 mg/g de celulose) produziu uma conversão de

122 celulose de 65,8 % após 72 horas, enquanto a hidrólise PCS pela preparação de enzima celulolítica Trichoderma reesei SaMe-MF268 a 3,6 mg/g de celulose produziu uma conversão de celulose de 61,7 %, indicando que a xilanase Penicillium pinophilum GH10 suplementada tem um efeito sinergístico com a preparação de enzima celulolítica Trichoderma reesei SaMe-MF268 na hidrólise PCS a 50° C, pH 5,0.

Exemplo 13: Caracterização de xilanase Penicillium pinophilum GH10

Atividade específica. A atividade específica da xilanase Penicillium pinophilum GH10 foi submetido ao ensaio no xilano de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Uma solução de xilano de madeira de bétula (2 g/L) foi preparada em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 contendo 0,01 % de TWEEN® 20. Dez microlitros de xilanase Penicillium pinophilum GH10 (nos carregamentos diferentes) foram adicionadas a 190 μΐ da solução de xilano de madeira de bétula. O controle de substrato e controle de enzima foram incluídos. A reação foi incubada a 50° C por 30 minutos seguido por 50 μΐ de 0,5 M de NaOH para interromper a reação.

Os açúcares de redução produzidos foram determinados usando um ensaio de hidrazida de ácido para-hidroxibenzóico (PHBAH, Sigma, St. Louis, MO, USA) adaptado a um formato de microplaca de 96 reservatórios como descrito abaixo. Brevemente, uma alíquota 100 μΐ de uma amostra apropriadamente diluída foi colocada em uma microplaca de parte funda cônica de 96 reservatórios. As reações foram iniciadas pela adição de 50 μΐ de 1,5 % (p/v) PHBAH em 2 % NaOH a cada reservatório. As placas foram aquecidas não revestidas a 95° C por 10 minutos. As placas foram permitadas em temperatura ambiente (RT) e 50 μΐ de água destilada adicionada a cada reservatório. Uma alíquota de 100 μΐ a partir de cada resevatório foi transferida a uma placa de 96 reservatório de fundo plano e a

123 absorbância a 410 nm medida usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Os padrões de glicose (0,1 a 0,0125 mg/ml diluída com 0,4 % de hidróxido de sódio) foram usados para preparar uma curva padrão para traduzir os valores A₄i_0nm obtidos em equivalentes de glicose. O carregamento da enzima versus os açúcares de redução produzidos foi plotado e a faixa linear foi usada para calcular a atividade específica de xilanase Penicillium pinophilum GH10, tão expressado quanto pmole de equivalente de glicose produzido por minuto por mg de enzima, ou IU/mg. A atividade específica de xilanase Penicillium pinophilum GH10 no xilano de madeira de bétula foi medida como enzima 113,5 IU/mg.

Termoestabilidade. A xilanase Penicillium pinophilum GH10 foi diluída em 50 mM de acetato de sódio pH 5 contendo 0,01 % de TWEEN® 20 a 1 g por litro e então incubada a 60° C por 3 horas ou 24 horas. A mesma amostra também foi armazenada a 4^o C para servir como um controle. Após incubação, a atividade das amostras no xilano de madeira de bétula foi medida usando o mesmo protocolo de ensaio descrito acima para a atividade específica, exceto um carregamento de enzima foi usado que dá <5 % de conversão. A atividade da amostra a 4^o C foi normalizada a 100 % e as atividades das amostras em outras condições de incubação foram comparadas a atividade 4^o C. A termoestabilidade de xilanase Penicillium pinophilum GH10 é mostrada abaixo indicando que a enzima retida 100 % desta atividade após incubação a 60° C por 3 horas e 83 % de sua atividade após incubação a 60° C por 24 horas.

Condição da incubação	Atividade residual em xilano de madeira de bétula
4o C	100 %
60° C, 3 horas	100 %
60° C, 24 horas	83 %

Perfil pH. A atividade de pH de xilanase Penicillium pinophilum GH10 foi determinado usando o mesmo protocolo de ensaio

124 descritos acima para a atividade específica, exceto a enzima foi incubada em cinco pHs diferentes de 4, 5, 6, 7 e 8 e um carregamento de enzima foi usado que dá menos do que 5 % de conversão. O tampão Britton Robinson foi usado como o sistema de tampão. Para preparar o tampão Britton Robinson, uma solução de estoque 100 mM foi preparada contendo 0,1 mol de ácido bórico, 0,1 mol de ácido acético e 0,1 mol de ácido fosfórico por litro de água desionizada. A solução de estoque 100 mM foi então titulada a um pH de 4, 5, 6, 7, ou 8 usando 5 M de NaOH e então diluído a 40 mM. O xilano de madeira de bétula foi adicionado a cada tampão em uma concentração de 2 g por litro e a atividade foi medida a 50° C. A atividade maior foi normalizada a 100 % e atividades em outros valores de pH foram comparados a atividade maior e expressada em % de atividade. O perfil de atividade pH da xilanase Penicillium pinophilum GH10 é mostrado abaixo.

Valor pH	Atividade
4,0	100%
5,0	78%
6,0	62%
7,0	19%
8,0	0%

Depósito do material biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob o termos de

Budapest Treaty with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and

Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig,

Germany e dado o seguinte número de acessão:

Depósito	Número de acessão	Data de depósito
E. coli (NN059157)	DSM 22922	7 de Setembro de 2009

A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso a cultura será disponível durante a pendência do Pedido de Patente a uma determinada pelas leis de Patentes estrangeiras a serem entituladas neste. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível como requerido pelas leis de Patentes estrangeiras nos países em que as contrapartes de aplicação individual, ou suas progênies

125 são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção individual em detrimento dos direitos de Patente garantidos por ação governamental.

A presente invenção é descrita pelos seguintes parágrafos numerados:

[1] Um polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 e (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[2] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[3] O polipeptídeo do parágrafo 2, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[4] O polipeptídeo do parágrafo 3, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 97 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[5] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende ou consiste

126 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2ou um fragmento destes tendo atividade de xilanase.

[6] O polipeptídeo do parágrafo 5, que compreende ou consiste da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

[7] O polipeptídeo do parágrafo 5, que compreende ou que consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[8] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii).

[9] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

[10] O polipeptídeo do parágrafo 9, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

[11] O polipeptídeo do parágrafo 10, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade a uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

[12] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta que codifica um fragmento tendo atividade de xilanase.

[13] O polipeptídeo do parágrafo 12, que é codificado por um

127 polinucleotídeo que compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeo daSEQIDNOil.

[14] O polipeptídeo do parágrafo 12, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou consiste de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

[15] O polipeptídeo do parágrafo 1, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[16] O polipeptídeo do parágrafo f que é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pGEM-T-Ppin3 que está contido no E. coli DSM 22922.

[17] O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 16, em que o polipeptídeo maduro são aminoácidos de 20 a 407 da SEQ ID NO: 2.

[18] O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 17, em que a sequência de polipeptídeo maduro são nucleotídeos de 58 a 1439 da SEQ ID NO: 1.

[19] Um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[20] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 19, que compreende pelo menos uma mutação em uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[21] Uma construção de ácido nucleico que compreendo polinucleotídeo do parágrafo 19 ou 20 operacionalmente ligados a uma ou mais (diversas) sequências de controle que direciona a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[22] Um vetor de expressão recombinante que compreende a

128 construção de ácido nucleico do parágrafo 21.

[23] Uma célula hospedeira recombinante que compreende a construção de ácido nucleico do parágrafo 21.

[24] Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

[25] Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

[26] Um método de produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende interromper ou anular um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma porção destes, de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, que resulta na produção de mutante menor do polipeptídeo que não a célula precursora.

[27] Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo 26.

[28] A célula mutante do parágrafo 27, que ainda compreende um gene que codifica uma proteína natural ou homóloga.

[29] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar uma célula mutante do parágrafo 28 sob condições conducentes para a produção da proteína e (b) recuperar a proteína.

[30] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 19 ou 20, obtidos por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida em um sequência codificadora de

129 polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii) e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase.

[31] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 30, em que a sequência de polipeptídeo maduro são nucleotídeos 58 a 1439 da SEQ ID NO: 1.

[32] Um método de produzir um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo mutante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, que compreende: (a) introduzir pelo menos uma mutação em uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que compreende ou que consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 e (b) recuperar o polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo mutante.

[33] Um polinucleotídeo mutante produzido pelo método do parágrafo 32.

[34] Um método de produzir um polipeptídeo, que compreende: (a) cultivar uma célula que compreendo polinucleotídeo mutante do parágrafo 33 que codifica o polipeptídeo sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

[35] Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18, que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

[36] Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[37] Uma molécula inibidora de filamento duplo (dsRNA) que compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 19 ou 20, em

130 que opcionalmente o dsRNA é uma molécula de siRNA ou uma de miRNA.

[38] A molécula de RNA (dsRNA) inibidora de filamento duplo do parágrafo 37, que é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex de comprimento.

[39] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula, uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 19 ou 20.

[40] O método do parágrafo 39, em que o dsRNA é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex de comprimento.

[41] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2.

[42] Uma construção de ácido nucleico que compreende um gene que codifica uma proteína operacionalmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 41, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal.

[43] Um vetor de expressão recombinante que compreende a construção de ácido nucleico do parágrafo 42.

[44] Uma célula hospedeira recombinante que compreende a construção de ácido nucleico do parágrafo 42.

[45] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante do parágrafo 44 sob condições conducentes para a produção da proteína e (b) recuperar a proteína.

[46] Uma composição que compreendo polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[47] Um método para degradar ou converter um material

131 celulósico, que compreende: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[48] O método do parágrafo 47, em que o material celulósico é pré-tratado.

[49] O método do parágrafo 47 or 48, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas celulolíticas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[50] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 47 a 49, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase ou peroxidase.

[51] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 47 a 50, que ainda compreende recuperar o material celulósico degradado.

[52] O método do parágrafo 51, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[53] O método do parágrafo 52, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste de glucose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[54] Um método para produzir um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarifícar um material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos de fermentação para a produção do produto de fermentação e (c) recuperação do produto de fermentação da fermentação.

[55] O método do parágrafo 54, em que o material celulósico é pré-tratado.

[56] O método do parágrafo 54 ou 55, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas celulolíticas selecionadas do grupo

132 que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[57] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 54 a 56, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase ou peroxidase.

[58] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 54 a 57, em que as etapas (a) e (b) são realizadas de maneira simultânea em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

[59] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 54 a 58, em que o produto de fermentação é um álcool, ácido orgânico, cetona, aminoácido ou gás.

[60] Um método de fermentar um material celulósico, que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos de fermentação, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[61] O método do parágrafo 60, em que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

[62] O método do parágrafo 61, que ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[63] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 60 a 62, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[64] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 60 a 63, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas celulolíticas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[65] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 60 a 64, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, esterase,

133 protease, lacase ou peroxidase.

[66] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 60 a 65, em que o produto de fermentação é um álcool, ácido orgânico, cetona, aminoácido ou gás.

[67] Um método para degradar ou converter um material contendo xilano, que compreende: tratar o material hemicelulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[68] O método do parágrafo 67, em que o material contendo xilano é pré-tratado.

[69] O método do parágrafo 67 ou 68, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, uma acetixila esterase, uma feruloila esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, uma glucuronidase e uma combinação destes.

[70] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 67 a 69, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[71] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 67 a 70, que ainda compreende recuperar o material celulósico degradado.

[72] Um método de produzir a produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar um material contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18; (b) fermentar o material contendo xilano sacarificado eom um ou mais microrganismos de fermentação para a produção do produto de fermentação e (c) recuperação do produto de fermentação da fermentação.

[73] O método do parágrafo 72, em que o material contendo

134 xilano é pré-tratado.

[74] O método do parágrafo 72 ou 73, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, uma acetixila esterase, uma feruloila esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, uma glucuronidase e uma combinação destes.

[75] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 72 a 74, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[76] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 72 a 75, em que as etapas (a) e (b) são realizadas de maneira simultânea em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

[77] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 72 a 76, em que o produto de fermentação é um álcool, ácido orgânico, cetona, aminoácido ou gás.

[78] Um método de fermentar um material contendo xilano, que compreende: fermentar o material contendo xilano com um ou mais microrganismos de fermentação, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 18.

[79] O método do parágrafo 78, em que a fermentação do material contendo xilano produz um produto de fermentação.

[80] O método do parágrafo 79, que ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[81] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 78 a 80, em que o material contendo xilano é pré-tratado antes da sacarificação.

[82] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de

135 a 81, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, uma acetixila esterase, uma feruloila esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, uma glucuronidase e uma combinação destes.

[83] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 78 a 82, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, celobioidrolase e beta-glicosidase.

[84] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos de 78 a 83, em que o produto de fermentação é um álcool, ácido orgânico, cetona, aminoácido ou gás.

A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada em escopo pelos aspectos específicos divulgados aqui, visto que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de diversos aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são pretendidos estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui tomar-se-ão evidentes para aqueles habilitados na técnica da descrição precedente. Tais modificações também estão pretendidas estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições controlará.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo

   5 atividade de xilanase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ ID NO: 1.
2. 2. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade de xilanase consiste na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 20 a 407 de SEQ ID

   10 NO: 2.
3. 3. Método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) cultivar uma célula hospedeira microbiana transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-2, ou uma planta 15 transgênica ou uma célula de planta transgênica compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de xilanase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ ID NO: 1, sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e

   20 (b) recuperar o polipeptídeo.
4. 4. Método para degradar ou converter um material celulósico ou um material contendo xilano, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico ou o material contendo xilano com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de

   25 xilanase codificado por um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1, ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ ID NO: 1.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico ou o material contendo xilano degradado.

   Petição 870180061048, de 16/07/2018, pág. 19/24
6. 6. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) sacarificar um material celulósico ou um material contendo xilano com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase codificado por um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ ID NO: 1;

   (b) fermentar o material celulósico ou o material contendo xilano sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.
7. 7. Método para fermentar um material celulósico ou material contendo xilano, caracterizado pelo fato de que compreende: fermentar o material celulósico ou o material contendo xilano com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou o material contendo xilano é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase codificado por um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQIDNO: 1.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico ou do material contendo xilano produz um produto de fermentação.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende recuperar adicionalmente o produto de fermentação a partir da fermentação.
10. 10. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo tendo atividade de xilanase consistindo na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ ID NO: 1

    Petição 870180061048, de 16/07/2018, pág. 20/24 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
11. 11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade 5 de xilanase consistindo na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 58 a 1439 de SEQ

    ID NO: 1 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira microbiana transgênica.

    Petição 870180061048, de 16/07/2018, pág. 21/24

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