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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit Xylanaseaktivität, ein Verfahren
zur Herstellung des Enzyms, eine das Enzym enthaltende Enzymzubereitung
und die Verwendung des Enzyms für
verschiedene industrielle Zwecke.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Xylan,
ein Hauptbestandteil von Pflanzen-Hemizellulose ist ein Polymer
von D-Xylose, das durch Beta-1,4-xylosidbindungen verbunden ist.
Xylan kann durch Säure
oder enzymatische Hydrolyse in Xylose und Xylo-Oligomere zersetzt
werden. Eine enzymatische Hydrolyse von Xylan erzeugt freie Zucker
ohne die mit Säure
gebildeten Nebenprodukte (z. B. Furane).
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Enzyme,
die Xylan und andere Pflanzenzellwand-Polysaccharide zersetzen können, sind
für die
Nahrungsmittelindustrie, insbesondere zum Backen und bei der Frucht-
oder Gemüseverarbeitung
wie bei der Fruchtsaft- oder Weinherstellung, wo deren Fähigkeit
zur Katalyse der Zersetzung des Gerüsts oder der Seitenketten der
Pflanzenzellwand-Polysaccharide verwendet wird, wichtig (Visser
et al., Xylane und Xylanases, 1991).
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Andere
Anwendungen für
Xylanasen sind enzymatischer Aufschluß von landwirtschaftlichen
Abfallprodukten zur Herstellung von Alkoholtreibstoffen, enzymatische
Behandlung von Tierfutter zur Hydrolyse von Pentosanen, Herstellung
von Textilzellstoffen unter Erhalt von Zellulose und Biobleichen
von Holzzellstoffen [Detroym R. W. in: Organic Chemicals from Biomass,
(CRC Press, Boca Raton, FL, 1981) 19–41, Paice, M. G. und L. Jurasek.
J. Wood Chem. Technol. 4: 187–198;
Pommier, J. C., J. L. Fuentes, G. Goma., Tappi Journal (1989): 187–191; Senior,
D. J. et al., Biotechnol. Letters 10 (1988): 907–912].
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WO
92/17573 offenbart eine im Wesentlichen reine Xylanase, die von
der Pilzspezies H. insolens abgeleitet ist, und die Xylanase kodierende
rekombinante DNA. Es ist beschrieben, dass die Xylanase als Backmittel,
Futterzusatz und bei der Herstellung von Papier und Zellstoff nützlich ist.
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WO
92/01793 offenbart eine Xylanase, die von der Pilzspezies Aspergillus
tubigensis abgeleitet ist. Es ist erwähnt, jedoch nicht dargestellt,
dass verwandte Xylanasen von anderen Fadenpilzen abgeleitet werden können, wobei
Beispiele dafür
Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium und
Trichoderma sind. Es ist beschrieben, dass die Xylanasen bei der
Herstellung von Brot oder Tierfutter, beim Brauen und beim Reduzieren
von Viskosität
oder Verbessern der Filtrierbarkeit von Getreidestärke nützlich ist.
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Shei
et al., 1985, und Fournier et al., 1985, beschreiben die Reinigung
und Charakterisierung von von A. niger isolierten Endoxylanasen.
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WO
91/19782 und
EP 463 706 offenbaren
ursprünglich
von Aspergillus niger abgeleitete Xylanasen und die rekombinante
Herstellung davon. Es ist beschrieben, dass die Xylanase zum Backen,
Brauen, in der Papierherstellungsindustrie und bei der Behandlung
von landwirtschaftlichen Abfallprodukten usw. nützlich ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Einkomponenten-Xylanasen
herzustellen.
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Das
Xylanaseaktivität
zeigende Enzym der Erfindung ist durch eine DNA-Sequenz kodiert,
die
- a) die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte DNA-Sequenz
oder
- b) eine Sequenz, die ein Polypeptid mit Xylanaseaktivität kodiert
und zu mindestens 70% über
die gesamte Länge
mit einer durch SEQ ID Nr. 2 kodierten Xylanase identisch ist, umfasst
oder in dieser enthalten ist.
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In
einer Ausführungsform
betrifft die Erfindung das Xylanaseaktivität zeigende Enzym, das durch
eine DNA-Sequenz kodiert ist, welche die folgende Teilsequenz
SEQ
ID Nr. 5 oder eine Sequenz, die zu 70% über die gesamte Länge dazu
identisch ist und ein Polypeptid mit Xylanaseaktivität kodiert,
umfasst.
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Der
Begriff "homolog" soll eine Polypeptid
anzeigen, das durch eine DNA kodiert ist, die zu derselben Sonde
wie die DNA hybridisiert, die das Xylanase-Enzym unter spezifischen
Bedingungen (wie Vortauchen in 5 × SSC und Vorhybridisieren
für ein
Dauer von 1 Std. bei –40°C in einer
Lösung
von 5 × SSC,
% × Denhardt-Lösung, 50
mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter beschallter
Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in derselben Lösung, ergänzt mit
50 Ci 32-P-dCTP-markierter Sonde für eine Dauer von 18 Std. bei –40°C, gefolgt
von dreimaligem Waschen in 2 × SSC,
0,2% SDS bei 40°C
für eine
Dauer von 30 Min.) kodiert. Spezieller soll der Begriff eine DNA-Sequenz
bedeuten, die zu mindestens 70% über
die gesamte Länge
mit einer durch SEQ ID Nr. 2 kodierten Xylanase wie mindestens 75%,
mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens
95% über
die gesamte Länge
mit einer durch SEQ ID Nr. 2 kodierten Xylanase identisch ist. Der
Begriff soll Modifikationen von beliebigen der vorstehend dargestellten
DNA-Sequenzen, wie Nukleotidsubstitutionen, die keine Erweiterung
zu einer anderen Aminosäuresequenz
der Xylanase bereitstellen, jedoch der Kodon-Verwendung des Wirtsorganismus,
in welchen das DNA-Konstrukt eingebracht werden soll, entsprechen,
oder Nukleotidsubstitutionen, die keine Erweiterung zu einer anderen
Aminosäuresequenz
bereitstellen und deshalb möglicherweise
eine andere Proteinstruktur, die eine Erweiterung zu einem Xylanase-Mutanten
mit anderen Eigenschaften als das ursprüngliche Enzym bereitstellen
könnten, einschließen. Andere
Beispiele für
mögliche
Modifikationen sind die Einfügung
von einem oder mehreren Nukleotiden in die Sequenz, Zugabe von einem
oder mehreren Nukleotiden an ein jeweiliges Ende der Sequenz, oder
Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden an einem jeweiligen
Ende oder in der Sequenz.
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In
einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzubereitung,
die zur Zersetzung von Pflanzenzellwandbestandteilen nützlich sind,
wobei die Zubereitung mit einem wie vorstehend beschriebenen Xylanaseaktivität zeigenden
Enzym angereichert ist.
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In
abschließenden
Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung eines Enzyms oder
einer Enzymzubereitung der Erfindung für verschiedene industrielle
Anwendungen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Enzym der Erfindung die aus SEQ ID Nr. 4 ersichtliche
Aminosäuresequenz
oder eine analoge Sequenz davon oder ist darin enthalten. Die in
SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz
wurde von der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten DNA-Sequenz abgeleitet,
welche die wie vorstehend definierte Xylanase II kodiert.
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Im
vorliegenden Kontext soll der Begriff "analoge Sequenz" eine Aminosäuresequenz anzeigen, die sich
von derjenigen von SEQ ID Nr. 4 in einem oder mehreren Aminosäureresten
unterscheidet. Die analoge Sequenz kann eine sein, die durch Modifikation
einer in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz z. B. unter Beteiligung
von Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren
verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, Deletion von einem
oder mehreren Aminosäureresten
an einem oder beiden Enden des Enzyms oder an einer oder mehreren
Stellen in der Aminosäuresequenz
oder Einfügen
von einem oder mehreren Aminosäureresten
an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäure-Sequenz erhalten wird.
Die Modifikation der Aminosäuresequenz
kann geeigneterweise durch Modifizieren der das Enzym kodierenden
DNA-Sequenz, z. B. durch Stellengerichtete oder durch statistische
Mutagenese oder eine Kombination dieser Techniken gemäß weithin
bekannten Verfahren durchgeführt
werden. In einer anderen Ausführungsform
kann die analoge Sequenz eine eines Enzyms sein, das von einem anderen
Ursprung als die SEQ ID Nr. 4 entsprechende Xylanase abgeleitet
ist. Die analoge Sequenz zeigt gewöhnlich einen Homologiegrad
(in Bezug auf die Identität)
von mindestens 70%, wie mindestens 75%, 80%, 85%, 90% oder sogar
95% mit der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz.
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Es
wurde überraschend
gefunden, dass die Xylanase II der vorliegenden Erfindung zusätzlich zur
Xylanaseaktivität α- Arabinopyranosidaseaktivität zeigt.
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Das
Enzym der Erfindung kann durch allgemeine Verfahren isoliert werden,
die folgendes beinhalten:
- – Klonen einer DNA-Genbank
von Aspergillus aculeatus in geeigneten Vektoren,
- – Transformieren
von geeigneten Hefe-Wirtszellen mit den Vektoren,
- – Züchten der
Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zum Exprimieren eines beliebigen
Enzyms von Interesse, das durch einen Klon in der DNA-Genbank kodiert
ist, und
- – Screenen
auf positive Klone durch Bestimmen von jeglicher Xylanaseaktivität des durch
solche Klone hergestellten Enzyms.
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Eine
detailliertere Beschreibung dieses Screening-Verfahrens ist nachstehend
in Beispiel 1 angegeben.
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(???
hier fehlt etwas) exprimierend die entsprechende Enzymaktivität (d. h.
Xylanaseaktivität
wie durch die Fähigkeit
des Enzyms zur Hydrolyse von Glykosid-Bindungen in Xylan definiert).
Die entsprechende DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon durch Standardverfahren
z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert werden. Es wird erwartet,
dass eine ein homologes Enzym kodierende DNA-Sequenz durch ähnliches
Sreenen einer cDNA-Genbank von anderen Mikroorganismen, insbesondere
eines Pilzes wie eines Stamms von einem anderen Aspergillus sp.,
insbesondere eines Stamms von A. acruleatus oder A. niger, eines
Stamms eines Trichoderma sp., insbesondere eines Stamms von T. harzianum
oder T. reesie, eines Stamms eines Fusarium sp., insbesondere eines
Stamms von F. oxysporum, oder eines Stamms eines Humicola sp. oder
eines Stamms von Scytallidium sp. abgeleitet werden kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die Xylanase-kodierende DNA der Erfindung gemäß weithin bekannten
Verfahren günstigerweise
aus DNA von einem der vorstehend erwähnten Organismen unter Verwendung
von synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf der Basis einer
hier offenbarten DNA- oder Aminosäuresequenz hergestellt sind,
isoliert werden.
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Die
DNA-Sequenz kann günstigerweise
in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Dies kann ein beliebiger
Vektor sein, der günstigerweise
rekombinanten DNA-Verfahren
unterzogen werden kann, wobei die Vektorwahl häufig von der Wirtszelle abhängt, in
welche er eingebracht werden soll. Folglich kann der Vektor ein
autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale
Einheit vorliegt, wobei die Replikation davon von der chromosomalen
Replikation unabhängig
ist, z. B. ein Plasmid sein. In einer anderen Ausführungsform
kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle
im Wirtszellen-Genom integriert ist und zusammen mit dem (den) Chromosom(en),
in welche er integriert wurde, repliziert ist.
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Im
Vektor sollte die Xylanase-kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig an einen
geeigneten Promoter und Terminator gebunden sein, der zusammen mit
dem (den) Chromosomen) in welche er integriert wurde, repliziert
wird.
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Im
Vektor sollte die Xylanase-kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig an eine
geeignete Promoter- und Terminatorsequenz gebunden sein. Der Promoter
kann eine beliebige DNA-Sequenz
sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl
zeigt, und kann von Genen abgeleitet werden, die Proteine entweder homolog
oder heterolog zu der Wirtszelle kodieren. Die zum Binden der die
Xylanase kodierenden DNA-Sequenzen, des Promoters beziehungsweise
des Terminators und zu deren Einfügen in geeignete Vektoren verwendeten
Verfahren sind dem Fachmann weithin bekannt (vergleiche z. B. Sambrook
et al., Molecular Cloning – A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, 1989).
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Die
Wirtszelle, mit der das Enzym der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz
transformiert wird, ist vorzugsweise eine eukaryiotische Zelle,
insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefe- oder Fadenpilzzelle. Insbesondere kann
die Zelle zu einer Spezies von Aspergillus, besonders bevorzugt
Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen können durch
ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastbildung und Transformation
der Protoplaste, gefolgt von der Regenerierung der Zellwand in einer
an sich bekannten Weise beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus
in einem Wirtsorganismus ist in
EP
238 023 (von Novo Nordisk A/S) beschrieben, wobei die Inhalte
davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind. Die Wirtszelle kann
auch eine Hefezelle, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere
Saccharomyces cerevisiae sein.
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In
einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, wobei eine geeignete
Wirtszelle mit einer das Enzym kodierenden DNA-Sequenz unter die
Herstellung des Enzyms gewährenden
Bedingungen transformiert wird, und das erhaltene Enzym aus der
Kultur gewonnen wird.
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Das
zum Züchten
der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann ein beliebiges
herkömmliches
Medium sein, das zum Wachsen der fraglichen Wirtszellen geeignet
ist. Die exprimierte Xylanase kann günstigerweise in das Kulturmedium
sekretiert und daraus durch weithin bekannte Verfahren, einschließlich Abtrennen
der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
Selektieren von proteinhaltigen Komponenten des Mediums mittels
eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen
Verfahren wie Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie
oder dergleichen gewonnen werden.
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Die
so gereinigte Xylanase kann zur Immunisierung von Tieren unter Herstellung
von Antikörpern
eingesetzt werden. Spezieller kann Antiserum gegen die Xylanase
der Erfindung durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren)
gemäß den durch
N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone
und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific
Publications, 1982 (spezieller, Seiten 27–31) beschriebenen Verfahren erhoben
werden. Gereinigte Immunglobuline können z. B. durch Salzausfällung ((NH4)2SO4),
gefolgt von Dialyse und Ionenaustausch-Chromatographie, z. B. auf
DEAE-Sephadex aus den Antiseren erhalten werden. Eine immunchemische
Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Ouchterlony-Doppeldiffunsions-Analyse
(O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunolory (D. M. Weir,
Herausgeber), Blackwell Scientific Publications, 1967, Seiten 655–706), durch
Kreuzungs-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., vorstehend, Kapitel
3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al.,
Kapitel 2) durchgeführt werden.
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In
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine
Enzymzubereitung, die zur Zersetzung von Pflanzenzellwandbestandteilen
nützlich
ist, wobei die Zubereitung mit einem wie vorstehend beschriebenen
Xylanaseaktivität
zeigendem Enzym angereichert ist.
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Auf
diese Weise kann eine Verstärkung
der Zellwand-zersetzenden Fähigkeit
der Enzymzubereitung erhalten werden.
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Die
mit einem Enzym der Erfindung angereicherte Enzymzubereitung kann
z. B. eine Enzymzubereitung, die mehrfache enzymatische Aktivitäten umfasst,
insbesondere eine Enzymzubereitung, die mehrfache Pflanzenzellwand-zersetzende
Enzyme wie Pectinex®, Pectinex Ultra SP®,
Celluclast oder Celluzyme (alle erhältlich von Novo Nordisk A/S)
umfasst, sein. Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "angereichert" anzeigen, dass die
Xylanaseaktivität
der Enzymzubereitung günstigerweise
aufgrund der Zugabe eines durch das vorstehend beschriebene Verfahren
hergestellten Enzyms der Erfindung z. B. mit einem Anreicherungsfaktor
von 1,1 erhöht
wurde.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die mit einem Xylanaseaktivität zeigenden Enzym angereicherte
Enzymzubereitung eine, die ein Enzym der Erfindung als enzymatischen
Hauptbestandteil umfasst, z. B. eine Einkomponenten-Enzymzubereitung
sein.
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Die
Enzymzubereitung kann gemäß dem Fachgebiet
bekannten Verfahren hergestellt werden und in Form einer flüssigen oder
trockenen Zubereitung vorliegen. Zum Beispiel kann die Enzymzubereitung
in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats vorliegen. Das
in die Zubereitung einzuschließende
Enzym kann gemäß dem Fachgebiet
bekannten Verfahren stabilisiert werden.
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Die
Enzymzubereitung der Erfindung kann zusätzlich zu einer Xylanase der
Erfindung ein oder mehrere Pflanzenzellwand-zersetzende Enzyme,
z. B. diejenigen mit cellulytischen, xylanolytischen oder pectinolytischen
Aktivitäten
wie α-Arabinosidase, α-Glukoronisidase, β-Xylosidase, Xylanacetylesterase,
Arabinanase, Rhamnogalacturonase, Pektinacetylesterase, Galactanase,
Polygalacturonase, Pektinlyase, Pektaselyase, Glukanase oder Pektinmethylesterase
enthalten. Das (die) zusätzliche(n)
Enzyme) kann (können)
mittels eines Mikroorganismus hergestellt werden, der zu der Gattung
Aspergillus, vorzugsweise Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus,
Aspergillus awamori oder Aspergillus oryzae oder Trichoderma gehört.
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Die
erfindungsgemäße Enzymzubereitung
wird aufgrund der höheren
Pflanzenzellwandzersetzenden Aktivität der Xylanase der Erfindung
vorzugsweise als Mittel zur Zersetzung oder Modifikation von Pflanzenzellwänden oder
als beliebiges von Pflanzenzellwänden
stammendes Xylan-enthaltendes Material verwendet.
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Beispiele
für bevorzugte
Verwendungen der Enzymzubereitung der Erfindung sind nachstehend
angegeben. Die Dosierung der Enzymzubereitung der Erfindung und
andere Bedingungen, unter welchen die Zubereitung verwendet wird,
können
auf der Basis von dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt werden.
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Die
Xylanasen der Erfindung hydrolysieren β-1,4-Bindungen in Xylanen. Xylane
sind Polysaccharide mit einem aus β-1,4-gebundener Xylose zusammengesetzten
Gerüst.
Das Gerüst
kann verschiedene Seitenketten wie Arabinose-, Acetyl-, Glucuronsäure-, 4-Methylglucuronsäure-Seitenketten
aufweisen. Die Zusammensetzung und Anzahl der Seitenketten variieren
gemäß der Quelle
des Xylans. Arabinose-Seitenketten dominieren in Xylanen von Getreideendosperma,
wohingegen Xylane von Hartholz relativ mehr Acetyl- und Glucuronsäure-Substituenten
enthalten (Michael P. Coughlan und Geoffrey P. Hazlewood, Biotechnol.
Appl. Biochem. 17: 259–289
(1993)). Von roten Algen stammendes Xylan enthält im Gerüst ein Gemisch aus β-1,4- und β-1,3-gebundener
Xylose, wobei diese Xylanart aufgrund der 1,4-Bindungen im Gerüst durch Xylanasen mit variierendem
Grad zersetzbar ist.
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Die
Zersetzung von Xylan durch Xylanasen wird durch vollständige oder
teilweise Entfernung der Seitenketten erleichtert. Acetylgruppen
können
durch Alkali- oder durch Xylanacetyl-Esterasen entfernt werden, Arabinose-Seitengruppen
können
durch eine Behandlung mit schwacher Säure oder durch α-Arabinosidasen entfernt
werden und die Glucuron-Seitenketten können durch α-Glucuronisidasen entfernt werden.
Die Oligomere, die durch die Xylanasen oder durch eine Kombination
von Xylanasen und wie vorstehend erwähnten Seitenkettenhydrolisierenden
Enzymen freigesetzt werden, können
weiter durch β-Xylosidasen
zu freier Xylose zersetzt werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
ohne andere xylanolytische Enzyme oder mit beschränkter Aktivität von anderen
xylanolitischen Enzymen zum Zersetzen von Xylanen zur Herstellung
von Oligosacchariden verwendet werden. Die Oligosaccharide wie Arabinoxylan- von Getreide-Zellwandmaterial
freigesetzte Qligosaccharide oder von mehr oder weniger gereinigten
Arabinoxylanen von Getreiden können
als Quellmittel verwendet werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
in Kombination zum Zersetzen von Xylanen in Xylose und andere Monosaccharide
mit anderen xylanolitischen Enzymen verwendet werden. Die freigesetzte
Xylose kann zu anderen Verbindungen wie Furanon-Geschmacksstoffe
umgewandelt werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
zur Verbesserung der Extraktion von Öl aus ölreichem Pflanzenmaterial wie
Maisöl
von Mais-Embryos allein oder zusammen mit anderen Enzymen wie Glucanasen verwendet
werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
beim Backen verwendet werden, um die Entwicklung, Elastizität und/oder
Stabilität
von Teig und/oder das Volumen, die Krümelstruktur und/oder die Antisäuerungseigenschaften
des gebackenen Produkts zu verbessern. Obwohl die Xylanasen zur
Herstellung von Teig oder gebackenen Produkten, der/die aus beliebiger
Mehl- oder Kleieart (z. B. auf der Basis von Roggen, Gerste, Hafer
oder Mais) hergestellt ist/sind, verwendet werden können, wurde
gefunden, dass Xylanasen der Erfindung bei der Herstellung von Teig
oder gebackenen Produkten, der/die aus Weizen hergestellt ist/sind
oder wesentliche Mengen an Weizen umfasst/umfassen, besonders nützlich sind.
Die gebackenen Produkte, die mit einer Xylanase der Erfindung hergestellt
sind, schließen
Brot, Wecken, Baguettes und dergleichen ein. Für Backzwecke kann die Xylanase
der Erfindung als die einzige oder die enzymatische Hauptaktivität oder in Kombination
mit anderen Enzymen wie einer Lipase, einer Amylase, einer Oxidase
(z. B. Glucoseoxidase, Peroxidase), einer Laccase und/oder einer
Protease verwendet werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
zur Modifikation von Tierfutter verwendet werden und deren Wirkung
in vitro (durch Modifizieren der Futterbestandteile) oder in vivo
ausüben.
Die Xylanasen sind besonders zur Zugabe zu Tierfutterzusammensetzungen,
die große
Mengen an Arabinoxylanen und Glucuronoxylanen enthalten, z. B. Futter,
das Getreide wie Gerste, Weizen, Roggen oder Hafer oder Mais enthält, geeignet.
Bei der Zugabe zu Futter verbessert die Xylanase teilweise aufgrund
einer Reduktion der Darmviskosität
deutlich die Aufspaltung in vivo von Pflanzenzellwandmaterial (Bedford
et al., 1993), wodurch eine bes sere Verwertung der Pflanzennährstoffe
durch das Tier erzielt wird. Dadurch werden die Wachstumsgeschwindigkeit
und/oder das Futterumwandlungsverhältnis (d. h. das Gewicht an
verdautem Futter in Bezug auf das Zielgewicht) des Tieres verbessert.
Die Verwendung einer Xylanase der Erfindung bei der Herstellung
von Futter ist in Beispiel 8 veranschaulicht.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
in der Papier- und Zellstoffindustrie unter anderem in Bleichverfahren
zum Verbessern der Helligkeit von gebleichten Zellstoffen, wobei
die verwendete Chlormenge in den Bleichstufen reduziert werden kann,
und zum Erhöhen
der Entwässerungsfähigkeit
von Zellstoffen im Verfahren zum Recyceln von Papier verwendet werden
(Eriksson, K. E. L., Wood Science und Technology 24 (1990): 79–101; Paice,
et al., Biotechnol. und Bioeng. 32 (1988): 235–239 und Pommier et al., Tappi
Journal (1989): 187–191).
Weiterhin können
die Xylanasen zur Behandlung von Lignozellulose-Zellstoff verwendet werden,
um die Bleichfähigkeit
davon zu verbessern. Dadurch kann die zum Erhalt von zufriedenstellendem Bleichen
eines Zellstoffs benötigte
Chlormenge reduziert werden. Die Behandlung von Lignozellulose-Zellstoff kann
z. B. wie in WO 93/08275, WO 91/02839 und WO 92/03608 beschrieben
durchgeführt
werden.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
beim Bierbrauen, insbesondere zum Verbessern der Filtrierfähigkeit
von z. B. Gerste- und/oder Hirsemalz enthaltender Maische verwendet
werden. Die Xylanasen können
in derselben Weise wie her kömmlich
zum Brauen verwendete Pentosanase, z. B. wie von Vietor et al.,
1993 und in
EP 227 159 beschrieben
verwendet werden, verwendet werden. Weiterhin können die Xylanasen zur Behandlung
von Brau-Malztreber, d. h. Gerste oder Malzgerste oder andere Cerealien
enthaltenden Resten aus der Biermaischeherstellung verwendet werden,
um die Verwendungsfähigkeit
der Reste z. B. für Tierfutter
zu verbessern.
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Xylanasen
der vorliegenden Erfindung können
zur Auftrennung von Bestandteilen von Pflanzenzellmaterialien, insbesondere
von Getreidebestandteilen wie Weizenbestandteilen verwendet werden.
Von besonderem Interesse ist die Auftrennung von Weizen in Gluten
und Stärke,
d. h. Bestandteilen von bemerkenswertem kommerziellem Interesse.
Das Auftrennungsverfahren kann unter Verwendung von dem Fachgebiet
bekannten Verfahren, günstigerweise
eines sogenannten als Hydroklon- oder Dekantierverfahren durchgeführten Schlagverfahrens
(oder Nass-Mahlverfahrens) durchgeführt werden. Im Schlagverfahren
ist das Ausgangsmaterial eine verdünnte pumpfähige Dispersion des Pflanzenmaterials
wie Weizen, die der Auftrennung unterzogen wird. In einem Weizen-Auftrennungsverfahren
ist die Dispersion gewöhnlich
aus Weizenmehl und Wasser hergestellt.
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Xylanasen
der Erfindung können
auch bei der Herstellung von Frucht- oder Gemüsesaft zur Verbesserung der
Ausbeute und bei der enzymatischen Hydrolyse von vielen Pflanzenzellwand-abgeleiteten
Materialien oder Abfallmaterialien, z. B. aus der Papierherstellung,
oder landwirtschaftlichen Resten wie Weizen, Stroh, Maiskolben,
ganzen Maispflanzen, Nussschalen, Gras, Gemüseschalen, Bohnenschalen, Malztrebern, Zuckerrübenzellstoff
und dergleichen verwendet werden.
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Das
Pflanzenmaterial kann zersetzt werden, um die verschiedenen Verarbeitungsarten
zu verbessern, Reinigung oder Extraktion von anderen Bestandteilen
als die Xylane wie Reinigung von Beta-Glucan oder Beta-Glucan-Oligomeren
von Getreiden zu erleichtern, den Futterwert zu verbessern, die
Wasserbindungskapazität
zu vermindern, die Zersetzbarkeit in Kläranlagen zu verbessern, die
Umwandlung z. B. von Gras und Mais in Gärfutter usw zu verbessern.
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Schließlich können Xylanasen
der Erfindung beim Modifizieren der Viskosität von Pflanzenzellwand-abgeleitetem
Material verwendet werden. Zum Beispiel können die Xylanasen verwendet
werden, um die Viskosität
von xylanhaltigem Futter zu reduzieren, die Verarbeitung von viskosem
xylanhaltigen Material wie bei der Weizenauftrennung zu verbessern
und die Viskosität
beim Brauereiverfahren zu reduzieren.
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Die
Erfindung wird weiter in den begleitenden Zeichnungen beschrieben,
wobei
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1 eine Restriktionsabbildung
von Plasmid pYHD17 ist,
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2 eine Restriktionsabbildung
von Plasmid pHD 414,
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3 die pH-Optima für Xyl I,
Xyl II und Xyl III ist,
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4 das Temperatur-Optimum
für Xyl
I, Xyl II und Xyl III ist,
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5 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 1% Weizen-Arabinoxylan-zersetztem Xyl
I ist,
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6 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 5% WIP durch Xyl I ist,
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7 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 1% Weizen-Arabinoxylan
durch Xyl II ist,
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8 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 5% WIP durch Xyl II ist,
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9 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 1% Weizen-Arabinoxylan
durch Xyl III ist,
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10 das Gelfiltrationschromatogramm
zur Zersetzung von 5% WIP durch Xyl III ist.
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Die
Erfindung wird in weiterem Detail in den folgenden Beispielen beschrieben,
die den wie beanspruchten Umfang der Erfindung in keinster Weise
beschränken
sollen.
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BEISPIELE
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Materialien
und Verfahren
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Donororganismus:
mRNA wurde aus Aspergrillus aculeatus, CBS 101.43, gewachsen in
einem sojahaltigen Fermentationsmedium unter Rühren zur Sicherstellung von
ausreichender Belüftung
isoliert. Die Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet,
unmittelbar in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
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Hefestämme: Der
verwendete Stamm von Saccharomyces cerevisiae war yNG231 (MAT-alpha, leu2, ura3-52,
his4-539, pep4-delta 1, cir+) oder JG169 (MAT-α; ura3-52; leu2-3, 112; his3-D200;
pep4-113; prc1::HIS3; prb1::LEU2; cir+).
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Aufbau
eines Expressionsplasmids: Das im Handel erhältliche Plasmid pYES II (Invitrogen)
wurde mit Spe1 geschnitten, mit Klenow DNA-Polymerase + dNTP aufgefüllt und
mit ClaI geschnitten. Die DNA wurde auf einem Agarosegel größenfraktioniert,
und ein Fragment mit etwa 2000 Bp wurde durch Elektroelution gereinigt.
Dasselbe Plasmid wurde mit ClaI/PvuII geschnitten, und ein Fragment
mit etwa 3400 Bp wurde durch Elektroelution gereinigt. Die zwei
Fragmente wurden an ein SphI/EcoRI-Fragment mit stumpfem Ende gebunden,
das den Hefe-TPI-Promoter enthielt. Dieses Fragment wurde aus einem
Plasmid isoliert, in welchem der TPI-Promoter von S. cerevisiae
(vgl.. T. Albers und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982,
Seite 419–434) leicht
modifiziert war: eine innere SphI-Stelle wurde durch deletieren
der vier den Kern an dieser Stelle bildenden Bp entfernt. Weiterhin
wurden die überflüssigen Sequenzen
stromaufwärts
des Promoters durch BalI-Exonuklease-Behandlung gefolgt von der Zugabe einer
SphI-Verbindungsgruppe entfernt. Schließlich wurde eine EcoRI-Verbindungsgruppe
an Position 10 zugefügt.
Nach diesen Modifikationen ist der Promoter in einem SphI-EcoRI-Fragment
eingeschlossen. Seine Effizienz verglichen mit dem ursprünglichen
Promoter scheint durch die Modifikationen nicht beeinflusst zu sein.
Das erhaltene Plasmid pYHD17 ist in 1 dargestellt.
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Herstellung
von RNase-freien Glasgeräten,
Spitzen und Lösungen:
Alle bei den RNA-Isolierungen
verwendeten Glasgeräte
wurden für
eine Dauer von mindestens 12 Std. bei +220°C gebacken. Eppendorf-Röhrchen,
Pipettenspitzen und Kunststoffsäulen
wurden für
eine Dauer von 12 Std. in 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in EtOH
behandelt und in einen Autoklaven gegeben. Alle Puffer und das Wasser
(außer
Tris enthaltende Puffer) wurden für eine Dauer von 12 Std. mit
0,1%igem DEPC bei 37°C
behandelt und in einen Autoklaven gegeben.
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Extraktion
von gesamter RNA: Die gesamte RNA wurde durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt
von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen (Chirgwin et
al., 1979) unter Verwendung der folgenden Modifikationen hergestellt.
Das gefrorene Mycelium wurde in flüssigem N2 mit
einem Mörser
und einem Pestil zu einem feinen Pulver vermahlen, gefolgt durch
Mahlen in einer vorgekühlten
Kaffeemühle,
und unmittelbar in 5 Volumen RNA-Extraktionspuffer (4 M GuSCN, 0,5%
Na-Laurylsarcosin, 25 mM Na-citrat, pH 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol)
suspendiert. Das Gemisch wurde für
eine Dauer von 30 Min. bei RT° gerührt und zentrifugiert
(30 Min., 5000 Upm, RT°,
Heraeus Megafuge 1,0 R), um die Zelldebris in Pelletform zu bringen. Der Überstand
wurde aufgefangen, vorsichtig unter Verwendung von 26,5 ml Überstand
pro 12,0 ml CsCl-Kissen auf ein 5,7 M CsCl-Kissen (5,7 M CsCl, 0,1
M EDTA, pH 7,5, 0,1% DEPC, vor der Verwendung in einen Autoklaven
gegeben) vorsichtig aufgetragen und zentrifugiert (Beckman, SW 28-Rotor,
25 000 Upm, RT°,
24 Std.), um die gesamte RNA zu erhalten. Nach Zentrifugation wurde
der Überstand
vorsichtig entfernt und der das RNA-Pellet enthaltende Boden des
Röhrchens
wurde abgeschnitten und mit 70%igem EtOH gespült. Das gesamte RNA-Pellet
wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, in
500 μl TE,
pH 7,6, suspendiert (falls schwierig, für eine Dauer von 5 Min. bei
65°C zeitweise
erwärmt),
Phenol-extrahiert und mit Ethanol für eine Dauer von 12 Std. bei – 200°C ausgefällt (2,5
Vol EtOH, 0,1 Vol 3 M NaAc, pH 5,2). Die RNA wurde durch Zentrifugation
aufgefangen, in 70%igem EtOH gewaschen und in einem kleinen Volumen
an DEPC-DIW resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messen
von OD260/208 bestimmt.
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Isolierung
von Poly(A)+RNA: Die Poly(A)+RNAs
wurden durch Oligo(dT)-Zelluloseaffinitätschromatographie
(Aviv & Leder,
1972) isoliert. Typischerweise wurden 0,2 g Oligo(dT)-Zellulose
(Boehringer Mannheim) in 10 ml 1 × Säulenpackungspuffer [20 mM Tris-Cl,
pH 7,6, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) vorgequellt, auf eine mit
DEPC behandelte, abgeschlossene Kunststoffsäule (Poly-Prep-Chromatographiesäule, Bio
Rad) gepackt und mit 20 ml 1 × Packungspuffer
equilibriert. Die gesamte RNA wurde bei 65°C für eine Dauer von 8 Min. erwärmt, für eine Dauer
von 5 Min. auf Eis abgeschreckt und nach Zugabe von 1 Vol 2 × Säulenpackungspuffer
zu der RNA-Probe in die Säule
gepackt. Das Eluat wurde aufgefangen und 2–3 Mal durch wie vorstehendes
Erwärmen
der Probe und Quenchen auf Eis vor jeder Beladung wieder eingepackt.
Die Olig(dT)-Säule wurde
mit 10 Vol 1 × Packpuffer,
dann mit 3 Vol Mediumsalzpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M NaCl,
1 mM EDTA, 0,1% SDS) gewaschen, gefolgt von Elution der Poly(A)+RNA mit 3 Vol auf +65°C vorgewärmtem Elutionspuffer (10 mM
Tris-Cl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,05% SDS) unter Auffangen von Fraktionen
mit 500 μl.
Der OD260 wurde für jede aufgefangene Fraktion
abgelesen, und von den mRNA-enthaltenden Fraktionen wurden Pools
gebildet und diese bei –20°C für eine Dauer
von 12 Std. Ethanol-gefällt.
Die Poly(A)+RNA wurde durch Zentrifugation
aufgefangen, in DEPC-DIW resuspendiert und in Aliquoten mit 5–10 μl bei –80°C gelagert.
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Northern-Blot-Analyse:
Die Poly(A)+RNAs (5 μg/Probe) von verschiedenen Mycelien
wurden in 1,2-Agarose-2,2 M-Formaldehydgelen elektrophoresiert (Sambrook
et al., 1989) und auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham) with 10 × SSC (Sambrook
et al., 1989) als Transferpuffer geblottet. Drei statistisch primierte
(Feinberg & Vogelstein,
1983) 32P-markierte cDNA-Sonden wurden in einzelnen
Hybridisierungen verwendet: 1) ein NotI-SpeI-Fragment mit 1,3 kb für Polygalacturonase
I von A. aculeatus (beschrieben in der Dänischen Patentanmeldung DK
1545/92), 2) ein NotI-SpeI-Fragment mit 1,3 kb, kodierend Endoglucanase
I von A. aculeatus (beschrieben in DK 0419/92) und 3) ein EagI-Fragment
mit 1,2 kb für
Galactanase I von A. aculeatus (beschrieben in WO 92/13945). Northern-
Hybridisierungen wurden in 5 × SSC
(Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardt-Lösung (Sambrook
et al., 1989), 0,5% SDS (GN) und 100 μ/ml denaturiertem Lachssperma-DNA mit
einer Sondenkonzentration von etwa. 2 ng/ml für eine Dauer von 16 Std. bei
65°C durchgeführt, gefolgt
von Waschungen in 5 × SSC
bei 65°C
(2 × 15
Min.), 2 × SSC,
0,5% SDS (1 × 30
Min.), 0,2 × SSC,
0,5% SDS (1 × 30
Min.), und 5 × SSC
(2 × 15
Min.). Nach Autoradiographie bei –80°C für eine Dauer von 12 Std. wurde
die Sonde #1 von dem Filter gemäß den Anweisungen
des Herstellers entfernt und mit Sonde #2 und eventuell mit Sonde
#3 rehybridisiert. Die RNA-Kette von Bethesda Research Laboratories
wurde als Größenmarkierung verwendet.
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CDNA-Synthese
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Synthese
des ersten Strangs: Doppelstrang-cDNA wurde aus 5 μg Poly(A)+-RNA von A. aculeatus durch das RNase-H-Verfahren
(Gubler & Hoffman
1983, Sambrook et al., 1989) unter Verwendung der Haarnadel-Modifikation
synthetisiert. Die Poly(A)+-RNA (5 μg in 5 μl in mit
DEPC behandeltem Wasser) wurde bei 70°C für eine Dauer von 8 Min. erwärmt und
in einem Endvolumen von 50 μl
mit Umkehr-Transkriptasepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl,
3 mM MgCl2, 10 mM DTT, Bethesda Research
Laboratories), enthaltend 1 mM jedes dNTP (Pharmacia), 40 Einheiten
menschlichen Plazenta-Ribonukleasehemmstoff (RNasin, Promega), 10 μg Oligo(dT)12-18-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten
Superscript-II-RNase-H-Umkehr-Transkriptase
(Bethesda Research Laboratories), kombiniert. Die cDNA mit erstem
Strang wurde durch Inkubieren des Reaktionsgemisches bei 45°C für eine Dauer
von 1 Std. synthetisiert.
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Synthese
des zweiten Strangs: Nach der Synthese wurden 30 μl 10 mM Tris-Cl,
pH 7,5, 1 mM EDTA zugesetzt und die mRNA:cDNA-Hybride für eine Dauer
von 12 Std. bei –20°C durch Zugabe
von 40 μg
Glykogen-Träger
(Boehringer Mannheim), 0,2 Vol 10 M NH4Ac
und 2,5 Vol 96% EtOH Ethanol-gefällt.
Die Hybride wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen,
luftgetrocknet und in 250 μl
Puffer für
den zweiten Strang (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 16 μm βNAD+), enthaltend 100 μm jedes dNTP, 44 Einheiten DNA-Polymerase
I von E. coli (Amersham), 6,25 Einheiten RNase-H (Bethesda Research
Laboratories) und 10,5 Einheiten DNA Lipase von E. coli (New England
Biolabs) resuspendiert. Die cDNA-Synthese des zweiten Strangs wurde
durch Inkubieren des Reaktionsröhrchens
bei 16°C für eine Dauer
von 3 Std. durchgeführt,
und die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration
von 20 mM, gefolgt von Phenol-Extraktion gestoppt.
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Mungobohnen-Nuklease-Behandlung:
Die Doppelstrang(ds)-cDNA wurde bei –20°C für eine Dauer von 12 Std. durch
Zugabe von 2 Vol 96%igem EtOH, 0,1 Vol 3 M NaAc, pH 5,2, Ethanol-gefällt, durch
Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet in
(SpeedVac) und in 30 μl
Mungobohnen-Nukleasepuffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM
ZnSO4, 0,35 mM DTT, 2% Glycerin), enthaltend
36 Einheiten Mungobohnen-Nuklease
(Bethesda Research Laboratories) resuspendiert. Die Einzelstrang-Haarnadel-DNA
wurde durch Inkubieren der Reaktion bei 30°C für eine Dauer von 30 Min., gefolgt
von der Zugabe von 70 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ethanol-Ausfällung mit
2 Vol 96%igem EtOH und 0,1 Vol 3 M NaAc, pH 5,2 bei –20°C für eine Dauer
von 12 Std. abgetrennt.
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Versehen
mit stumpfen Enden mit T4-DNA-Polymerase: Die ds-cDNA wurde mit
T4-DNA-Polymerase in
50 μl T4-DNA-Polymerasepuffer
(20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), enthaltend
0,5 mM jedes dNTP und 7,5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (Invitrogen), durch Inkubieren
des Reaktionsgemischs bei +37°C
für eine
Dauer von 15 Min. mit stumpfen Enden versehen. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM, gefolgt
von Phenol-Extraktion und Ethanol-Ausfällung
gestoppt.
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Adaptor-Bindung
und Größenauswahl:
Nach der Ausfällungsreaktion
wurde die cDNA an nicht-palindromische BstX-I-Adaptoren (1 μg/μl, Invitrogen)
in 30 μl
Bindungspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 1
mM ATP, 25 μg/ml
Rinderserum-Albumin),
enthaltend 600 pmol BstX-I-Adaptoren und 5 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen),
durch Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 4–16°C für eine Dauer von 12 Std. gebunden.
Die Reaktion wurde durch Erwärmen
bei +70°C
für eine
Dauer von 5 Min. gestoppt und die adaptierte cDNA durch (0,8%ige
HSB-Agarose, FMC) zum Abtrennen von ungebundenen Adaptoren und kleinen
cDNAs größenfraktioniert.
Die cDNA wurde mit einem Abschnitt von 0,7 kb größenselektiert und die cDNA aus
dem Agarosegel in 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA für eine Dauer
von 1 Std. bei 100 Volt elektroeluiert, Phenol-extrahiert und bei –20°C für eine Dauer
von 12 Std. wie vorstehend Ethanol-gefällt.
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Aufbau
von cDNA-Genbanken: Die adaptierte ds cDNA wurde durch Zentrifugation
gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen und in 25 ml DIW resuspendiert.
Vor der großtechnischen
Genbank-Bindung wurden vier Testbindungen in 10 μl Bindungspuffer (derselbe wie
vorstehend), jede enthaltend 1 μl
ds cDNA (Reaktionsröhrchen
#1–#3),
2 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Röhrchen #1), 100 ng (Röhrchen #2) und
200 ng (Röhrchen
#3 und #4) BstXI-gespaltener Hefe-Expressionsvektor (entweder pYES
2,0 Invitrogen oder yHD13) durchgeführt. Die Bindungsreaktionen
wurden durch Inkubation bei +16°C
für eine
Dauer von 12 Std. durchgeführt,
bei 70°C
für eine
Dauer von 5 Min. erwärmt,
und 1 μl
jeder Bindung (200 Ω,
2,5 kV, 25 μF) zu
40 μl kompetente
Zellen von E. coli 1061 (OD600 = 0,9 in 1 Liter LB-Brühe, zweimal
in kaltem DIW, einmal in 20 ml 10%igem Glycerin gewaschen, in 2
ml 10% Glycerin resuspendiert) elektroporiert. Nach Zugabe von 1
ml SOC zu jedem Transformationsgemisch ließ man die Zellen bei 37°C für eine Dauer
von 1 Std. wachsen, 50 μl
wurden auf LB + Ampicillin-Platten (100 μg/ml) aufgetragen, und man ließ sie bei
37°C für eine Dauer von
12 Std. wachsen.
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Unter
Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine großtechnische
Bindung in 40 μl
Bindungspuffer, enthaltend 9 Einheiten T4-Ligase, aufgebaut und
die Reaktion wurde bei 16°C
für eine
Dauer von 12 Std. inkubiert. Die Bindungsreaktion wurde durch Erwärmen bei
70°C für eine Dauer
von 5 Min. gestoppt, bei –20°C für eine Dauer
von 12 Std. Ethanolgefällt,
durch Zentrifugation gewonnen und in 10 μl DIW resuspendiert. Aliquote
von 1 μl
wurden in elektrokompetente Zellen von E. coli 1061 unter Verwendung
derselben Elektroporationsbedingungen wie vorstehend transformiert,
und die transformierten Zellen wurden titriert und die Genbank auf
LB + Ampicillin-Platten mit 5000–7000 c. f. u./Platte aufgetragen.
Jeder Platte wurden 3 ml Medium zugesetzt. Die Bakterien wurden
abgeschabt, 1 ml Glycerin wurde zugesetzt und dies bei –80°C als Pools gelagert.
Die übrigen
2 ml wurden zur DNA-Isolierung
verwendet. War die Menge an DNA ausreichend, um die erforderliche
Anzahl an Hefe-Transformanten zu erhalten, wurde die großtechnische
DNA aus 500 ml Medium (TB), angeimpft mit 50 μl Bakterienstamm bei –80°C, der über Nacht
vermehrt wurde, hergestellt.
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Aufbau
von Hefe-Genbanken: Zur Sicherstellung, dass alle Bakterienklone
in der Hefe getestet wurden, wurde eine Anzahl an Hefe-Transformanten,
die 5 Mal größer als
die Anzahl an Bakterienklonen in den ursprünlichen Pools war, als die
Grenze eingestellt. Aliquote von 1 μl gereinigter Plasmid-DNA (100
ng/μl) von einzelnen
Pools wurden in 40 μl
kompetente Zellen von S. cerevisiae JG 169 (OD600 = 1,5 in 500 ml
YPD, zweimal in kaltem DIW, einmal in kaltem 1 M Sorbit gewaschen,
in 0,5 ml 1 M Sorbit resuspendiert, Decker & Guarante, 1991) elektroporiert (200 Ω, 1,5 kV,
25 pF). Nach Zugabe von 1 ml 1 M kaltem Sorbit, wurden Aliquote
von 80 μl
auf SC + Glukose-Uracil aufgetragen, um 250–400 c. f. u./Platte zu erhalten,
und bei 30°C
für eine
Dauer von 3–5
Tagen inkubiert.
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Aufbau
eines Expressionsvektors von Aspergillus: Der Vektor pHD414 ist
ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in
EP 238 23 ). Im Gegensatz zu diesem Plasmid
weist pHD 414 eine Folge von einheitlichen Restriktionsstellen zwischen
dem Promoter und dem Terminator auf. Das Plasmid wurde durch Entfernen eines
etwa 200 Bp langen Fragments (enthaltend unerwünschte RE-Stellen) am 3'-Ende des Terminators
und anschließendes
Entfernen eines etwa 250 Bp langen Fragments am 5'-Ende des Promoters,
ebenso enthaltend unerwünschte
Stellen, aufgebaut. Die Region mit 200 Bp wurde durch Abspaltung
mit NarI (positioniert im pUC-Vektor) und XbaI (direkt 3' am Terminator),
anschließendem
Füllen
in die gebildeten Enden Klenow DNA-Polymerase +dNTP, Reinigung des
Vektor-Fragments auf Gel und Wiederbindung des Vektor-Fragments entfernt.
Dieses Plasmid wurde pHD413 genannt. pHD413 wurde mit StuI (positioniert
am 5'-Ende des Promoters)
und PvuII (im pUC-Vektor) geschnitten, auf Gel fraktioniert und
wieder gebunden. Das Plasmid pHD 414 ist in
2 dargestellt.
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Medien
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YPD:
10 g Hefe-Extrakt, 20 g Pepton, H2O auf
810 ml. Im Autoklaven gehalten, 90 ml 20%ige Glukose (steril filtriert)
wurde zugesetzt.
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10 × Basaltsalz:
66,8 g Hefe-Stickstoffbase, 100 g Bernsteinsäure, 60 g NaOH, H2O
auf 1000 ml, steril filtriert.
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SC-URA:
90 ml 10 × Basaltsalz,
22,5 ml 20%ige Casaminosäuren,
9 nl 1%iges Tryptophan, H2O auf 806 ml,
im Autoklaven gehalten, 3,6 ml 5%iges Threonin und 90 ml 20%ige
Glukose oder 20%ige Galactose wurden zugesetzt.
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SC-H-Brühe: 7,5
g/l Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8
g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren
ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan. In einen Autoklaven für eine Dauer
von 20 Min. bei 121°C
gegeben. Nach Halten im Autoklaven wurden 10 ml einer 30%igen Galactose-Lösung, 5
ml einer 30%igen Glucose-Lösung
und 0,4 ml einer 5%igen Threonin-Lösung pro 100 ml Medium zugesetzt.
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SC-H-Agar:
7,5 g/l Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäure, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8
g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren
ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto). In einen
Autoklaven für
eine Dauer von 20 Min. bei 121°C
gegeben. Nach dem Halten im Autoklaven wurden 55 ml einer 22%igen
Galactose-Lösung
und 1,8 ml einer 5%igen Threonin-Lösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
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YNB-1-Agar:
3,3 g/l KH2PO4,
16,7 g/l Agar, pH eingestellt auf 7. In Autoklaven für eine Dauer
von 20 Min. bei 121°C
gegeben. Nach Halten im Autoklaven wurden 25 ml einer 13,6%igen
Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren,
25 ml einer 40%igen Glucose Lösung,
1,5 ml einer 1%igen L-Leucin-Lösung
und 1,5 ml einer 1%igen Histidin-Lösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
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YNB-1-Brühe: Zusammensetzung
wie in YNB-1 Agar, jedoch ohne den Agar.
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AZCL-Xylan:
Birkenholz- oder Haferspelz- Xylan erhältlich von Megazyme, Australien.
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4-Methyl-umbelliferyl-α-arabinopyranosid:
erhältlich
von Sigma
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Transformation
von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger (allgemeines Verfahren)
100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1981) wird mit Sporen von A. oryzae oder A. niger
angeimpft und unter Schütteln
bei 37°C
für eine
Dauer von etwa 2 Tagen inkubiert. Das Mycelium wird durch Filtration
durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO4 gewaschen.
Das Mycelium wird in 15 ml 1,2 M MgSO4,
10 mM NaH2PO4, pH
= 5,8 suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und 1
ml Puffer, enthaltend 120 mg Novozym® 234,
Charge 1687, wird zugesetzt. Nach 5 Min. wird 1 ml 12 mg/ml BSA
(Sigma Typ H25) zugesetzt und es wird weiter unter sanftem Rüh ren für eine Dauer
von 1,5 bis 2,5 Std. bei 37°C
inkubiert, bis eine große
Anzahl an Protoplasten in einer unter einem Mikroskop betrachteten
Probe sichtbar wird.
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Die
Suspension wird durch Miracloth filtriert, das Filtrat in ein stabiles
Röhrchen übertragen
und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0, überschichtet.
Zentrifugation wird für
eine Dauer von 15 Min. bei 100 g durchgeführt, und die Protoplaste werden
vom oberen des MgSO4-Kissens aufgefangen.
2 Volumen STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2) werden der Protoplast-Suspension zugesetzt,
und das Gemisch wird für
eine Dauer von 5 Min. bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplast-Pellet
wird in 3 ml STC resuspendiert und wieder in Pelletform gebracht.
Dies wird wiederholt. Schließlich
werden die Protoplaste in 0,2–1
ml STC resuspendiert.
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100 μl Protoplast-Suspension
wird mit 5- 25 μg
der entsprechenden DNA in 10 μl
STC gemischt. Protoplaste werden mit p3SR2 (ein das amdS-Gen von
A. nidulans tragendes Plasmid) gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur
für eine
Dauer von 25 Min. stehen gelassen. 0,2 ml 60%iges PEG 4000 (BDH 29576),
10 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5
werden zugesetzt und vorsichtig gemischt (zweimal), und schließlich werden
0,85 ml derselben Lösung
zugesetzt und vorsichtig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur
für eine
Dauer von 25 Min. stehen gelassen, bei 2500 g für eine Dauer von 15 Min. gedreht
und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren
Abscheidung werden die Protoplaste auf entsprechende Platten gesprüht. Die
Protoplaste werden zum Hemmen von Hintergrund-Wachstum auf Minimal-Platten
(Cove Biocherm. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend 1,0 M Saccharose,
pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, gesprüht. Nach
Inkubation für
eine Dauer von 4–7
Tagen bei 37°C
werden Sporen aufgesammelt und für
einzelne Kolonien aufgesprüht.
Dieses Verfahren wird wiederholt und Sporen einer einzelnen Kolonie
nach der zweiten Reisolierung als definierter Transformant gelagert.
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Zufuhr-Chargen-Fermentation
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Zufuhr-Chargen-Fermentation
wurde in einem Medium, umfassend Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff
als Stickstoffquelle und Hefeextrakt, durchgeführt. Die Zufuhr-Chargen-Fermentation
wurde durch Animpfen einer Schüttelkolben-Kultur
von fraglichen Wirtszellen von A. oryzae in einem Medium, umfassend 3,5%
der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle, durchgeführt. Nach
Züchten
für eine
Dauer von 24 Std. bei pH 5,0 und 34°C wurde die kontinuierliche
Zufuhr von zusätzlichen
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen initiiert. Die Kohlenstoffquelle
wurde als beschränkender
Faktor gehalten und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff im Überschuss
vorlag. Die Zufuhr-Chargen-Züchtung
wurde für
eine Dauer von 4 Tagen fortgesetzt, wonach die Enzyme durch Zentrifugation,
Ultrafiltration, Klärungsfiltration
und Germfiltration wiedergewonnen werden konnten. Für Anwendungsversuche
wurde die Amylase-Aktivität
durch dem Fachgebiet bekannte Reinigungsverfahren auf einen unbedeutenden
Grad reduziert. Zur Charakterisierung wurden die Enzyme vollständig durch
dem Fachgebiet bekannte Anionenaustausch-chromatographische Verfahren
bereinigt.
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Charakterisierung eines
Enzyms der Erfindung
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SDS-PAGE-Elektrophorese:
SDS-PAGE-Elektrophorese wurde in einer Mini-Leak-4-Elektrophoreseeinheit
(Kem-En-Tec, Kopenhagen) als modifizierte Version des Laemli-Verfahrens (Laemmli,
1970; Christgau, 1991) durchgeführt.
Kurz gesagt, wurde das Auftrennungsgel mit 12%igem Acrylamid, 0,2%igem
BIS-Acrylamid, 0,1% SDS, 0,375 M Tris, pH 8,8, 0,04% APS (Ammonium-Persulfat) & 0,04% TEMED gegossen.
Nach Polymerisation für
eine Dauer von 6–15
Std. wurde das Stapelgel mit 4,5% G/G Acrylamid, 0,075% BIS-Acrylamid, 0,1% SDS,
66,5 mM Tris, pH 6,8, 0,4% G/G APS (Ammoniumpersulfat) & 0,4% TEMED gegossen.
Die Elektrodenkammern wurden mit Fließpuffer zu 25 mM Tris-Base,
0,192 M Glycin & 0,05%
SDS gefüllt,
wonach die Probenpuffer enthaltenden Proben gepackt werden, und
man lässt
das Gel bei 2–4
mA/Gel für
einen Lauf über
Nacht und 10–30
mA/Gel für
eine schnelleren Lauf fließen.
Das Gel wird anschließend
entfernt und entweder durch Commassie- oder Silberfärbung gefärbt.
-
Isoelektrisches
Fokussieren: Isoelektrisches Fokussieren wird auf Ampholin-PAG-Platten
pH 3,5–9,5 (Pharmacia,
Upsala) auf einer Multiphor-Elektrophoreseeinheit gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wird das Gel entweder Commassie-gefärbt oder
Silber-gefärbt.
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Commassie-
und Silberfärbung:
Das Gel wird vorsichtig von den Glasplatten entfernt und auf einem langsam
drehenden Schütteltisch
in etwa 100 ml der folgenden Lösungen
gedreht:
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Commassiefärbung:
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- 1) 30 Min. in 40% V/V Ethanol, 5% V/V Essigsäure
- 2) 30 Min. in 40% V/V Ethanol, 5% V/V Essigsäure + 0,1% Commassie R250
- 3) Entfärben
innerhalb von 30 Min. in 40% V/V Ethanol, 5% V/V Essigsäure bis
der Hintergrund ausreichend reduziert ist
- 4) Schließlich
wird das Gel in Konservierungslösung
inkubiert: 5% V/V Essigsäure,
10% V/V Ethanol, 5% V/V Glycerin und zwischen zwei Lagen Cellophanmembran
luftgetrocknet.
-
Silberfärbung:
-
- 1) 30 Min. in 40% V/V Ethanol, 5% V/V Essigsäure
- 2) 20 Min. in 10% V/V Ethanol, 5% V/V Essigsäure
- 3) 20 Min. in 0,0057% G/V APS (0,25 mM)
- 4) 60 Min. in 0,1% GN AgNO3
- 5) Zur Entwicklung wird das Gel in einen Entwickler, 0,015%
Formaldehyd, 2% GN Na2CO3 für eine Dauer von
30–60
Sek. getaucht Dann wird das Gel in einer zweiten Entwickler-Runde
inkubiert, bis eine ausreichende Färbung der Proteine erzielt
wurde (5–15
Min.). Schließlich
wird das Gel in Konservierungslösung, 5%
V/V Essigsäure,
10% V/V Ethanol, 5% V/V Glycerin, inkubiert und zwischen zwei Lagen
Cellophanmembran luftgetrocknet.
-
Die
Aktivitäten
des Enzyms werden entweder durch die Freisetzung von reduzierenden
Zuckern aus Birken-Xylan (erhältlich
von Roth, Karlsruhe, Germany) oder durch die Freisetzung von blauer
Farbe aus AZCL-Birken-Xylan von MegaZyme gemessen.
-
0,5
ml 0,4%ige AZCL-Substratsuspension wird mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer
mit optimalem pH gemischt, und 10 μl einer geeignet verdünnten Enzym-Lösung werden
zugesetzt. Inkubationen werden vor der Wärmeinaktivierung in einem Eppendorf-Thermomixer
für eine
Dauer von 15 Min. bei 30°C
(wenn nicht anders angegeben) für
eine Dauer von 20 Min. bei 55°C
durchgeführt.
Enzyminkubationen werden dreifach durchgeführt. Eine Blindprobe, welcher
Enzym zugesetzt ist, das jedoch unmittelbar inaktiviert wurde, wird
hergestellt. Nach Zentrifugation wird die Absorption des Überstands
in Mikrotiter-Platten bei 620 nm gemessen und die Blindprobe abgezogen.
-
0,5%ige
Lösungen
von Birken-Xylan (Roth) werden in 0,1 M Citrate/Phosphat mit optimalem
pH-Wert (wenn nicht anders angegeben) hergestellt, 10 μl geeignet
verdünnte
Enzymlösungen
werden zu 1 ml Substrat zugesetzt, Inkubationen werden vor Wärmeinaktivierung
bei 30°C
für eine
Dauer von 15 Min. wie vorstehend durchgeführt. Reduzierende Zucker werden
durch Reaktion in Mikrotiter-Platten mit einem PHBAH-Reagenz, umfassend
0,15 g Parahydroxybenzoesäurehydrazid
(Sigma H-9882), 0,50 g Kaliumnatriumtartat (Merck 8087) und 2%ige
NaOH-Lösung
auf 10,0 ml, bestimmt. Die Ergebnisse von Blindproben werden abgezogen. Xylose
wird als Standard verwendet.
-
PH-
und Temperatur-Optima werden von den vorstehend erwähnten Substraten
gemessen. 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer mit variierenden pH-Werten
werden zur Bestimmung des pH-Optimums
verwendet. 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer mit optimalem pH-Wert wird
zur Reaktion bei verschiedenen Temperaturen für eine Dauer von 15 Min. verwendet,
um das Temperatur-Optimum zu bestimmen.
-
Km
und die spezifische Aktivität
werden durch Durchführen
von Inkubationen bei Substrat-Konzentrationen
(S) im Bereich von 0,025 bis 1,5% (Birken-Xylan), Messen der Reaktionsgeschwindigkeit
(v), Abbilden von S/v als Funktion von S, Durchführen von linearer Regressionsanalyse,
Finden der Neigung (= 1/Vmax) und des Abschnitts (Km/Vmax) und Berechnen
von Km und der spezifischen Aktivität (= Vmax/E), wobei E die Menge
an zugesetztem Enzym ist, gemessen.
-
Zur
Gelfiltrationschromatographie werden 1%ige Lösungen von Weizen-Arabinoxylan
(Megazyme) bzw. 5% Suspensionen von unlöslichem Pentosan von Weizen
(WIP, hergestellt wie nachstehend beschrieben) in 0,1 M Acetat-Puffer
pH 5,5 hergestellt. Zu 1,5 ml dieser Substrate werden 30 μl der folgenden
Enzymlösungen
(Endkonzentration) zugesetzt: Xylanase I (0,1 mg/ml), Xylanase II
(0,1 mg/ml) und Xylanase III (0,07 mg/ml).
-
Inkubationen
wurden bei 30°C
für eine
Dauer von 0, 10, 30, 60 und 120 Min. vor Wärmeinktivierung bei 95°C für eine Dauer
von 20 Min. durchgeführt.
Zentrifugation wird durchgeführt
und die Überstände durch Injektion
in drei TSK-Säulen
in einer Reihe (PW G4000, PW G3000, PW G2500) analysiert und Saccharide
mit 0,4 M Acetat-Puffer, pH 3,0 bei 0,8 ml/Min. eluiert. Die eluierenden
Saccharide werden durch einen Shimadzu-RI-Detektor bestimmt, und
die Daten werden gesammelt und von einer Dionex-Software verarbeitet.
Dextrane (von Serva) werden als Molekulargewichtsstandards verwendet.
Das Sammeln von Daten wird für
eine Dauer von 15 Min. nach der Injektion eingeleitet.
-
Herstellung von unlöslichem
Pentosan (WIP) von Weizenmehl
-
150
kg übliches
Weizenmehl wurde in 450 kg kaltem Wasser suspendiert. Die Suspension
wurde auf 60°C
erwärmt
und 600 g Termamyl 120 L® wurden zugesetzt. Nach
Erwärmen
auf 95°C,
was zur Gelbildung der Stärkefraktion
führte,
wurde die Suspension auf 60°C
abgekühlt,
und die Hydrolyse für
eine Dauer von 180 Min. fortgesetzt. Nach Einstellen des pH-Werts auf 8,0 unter
Verwendung von NaOH wurden 300 g Alcalase 2,4 L® zugesetzt.
Während
der Hydrolyse von Protein unter konstantem Rühren durch Titrieren mit NaOH
der pH-Wert zwischen
7,5 und 8,0 gehalten. Die Hydrolyse wurde für eine Dauer von 120 Min. fortgesetzt.
Der Niederschlag wurde nach Zentrifugation aufgenommen, mit Wasser
einmal gewaschen und dann weiter auf einem Sieb mit 35 um mit kaltem
Wasser gewaschen, um das gesamte restliche Material zu entfernen.
Dem erhaltenen unlöslichen
Material wurden bis zu 20 1 Wasser zugesetzt, dies auf 60°C erwärmt und
nach Einstellung des pH-Werts auf 8,0 mit NaOH wurden 100 g Alcalase
2,4 L® zugesetzt.
Die Hydrolyse und NaOH-Titration wurden fortgesetzt, bis kein weiterer
Abfall im pH-Wert beobachtet wurde. Das Material wurde dann wieder
auf einem Sieb mit 35 um gewaschen, bis das gesamte lösliche Material
entfernt war und schließlich
gefriergetrocknet.
-
Bestimmung von FXU (Endoxylanaseaktivität)
-
Die
Endoxylanaseaktivität
wird durch einen Versuch bestimmt, in welchem die Xylanase-Probe mit Remazol-Xylan-Substrat
(4-O-Methyl-D-glucurono-D-xylan, gefärbt mit Remazol Brilliant Blue
R, Fluka), pH 6,0, inkubiert wird. Die Inkubation wird bei 50°C für eine Daure
von 30 Min. durchgeführt.
Der Hintergrund von nicht zersetztem, gefärbtem Substrat wird mit Ethanol
gefällt.
Die verbleibende blaue Farbe im Überstand
wird spektrophotometrisch bei 585 nm bestimmt und ist proportional
zu der Endoxylanaseaktivität.
Die Endoxylanaseaktivität
der Probe wird in Bezug auf einen Enzymstandard bestimmt. Der Versuch
ist weiter in der Veröffentlichung
AF 293.6/1-GB, auf Nachfrage von Novo Nordisk A/S, Dänemark erhältlich,
beschrieben.
-
BEISPIEL 1
-
Eine
Genbank von A. aculeatus, bestehend aus etwa 1,5 × 106 einzelnen Klonen in 150 Pools wurde aufgebaut.
-
DNA
wurde aus 20 einzelnen Klonen aus der Genbank isoliert und einer
Analyse auf cDNA-Einfügung unterzogen.
Die Einfügungsfrequenz
wurde als > 90% befunden
und die mittlere Einfügungsgröße betrug
etwa 1400 Bp.
-
DNA
von einigen der Pools wurde in Hefe transformiert und 50-100-Platten,
enthaltend 200–500
Hefe-Kolonien, wurden von jedem Pool erhalten. Nach 3-5-tägigem Wachstum
wurden die Agar-Platten auf verschieden Sätze von Agar-Platten Replikations-aufgetragen.
Ein Satz an Platten, enthaltend 0,1% AZCL-Xylan (Megazyme, Australien),
wurde dann für
eine Dauer von 3–5
Tagen bei 30°C
inkubiert, um Xylanaseaktivität nachzuweisen.
Positive Kolonien wurden als Kolonien, die von einem blauen Halo
umgeben waren, identifiziert. In einer anderen Ausführungsform
wurde ein Satz an Platten dann für
eine Dauer von 3–5
Tagen bei 30°C vor
dem Überschichten
dessen mit einem Xylan-Überschichtungsgel,
enthaltend 0,1% s AZCL-Xylan und 1% Agarose, in einem Puffer mit
geeignetem pH-Wert inkubiert. Nach der Inkubation für eine Dauer
von 1–2
Tagen bei 30°C
wurden positive Kolonien als von einem blauen Halo umgebene Kolonien
identifiziet. Überraschend wurde
gefunden, dass Xylanase-II-Hefe-Kolonien
4-Methyl-umbelliferyl-α-arabinopyranosid
in einer Überschichtung
mit 0,1 M Citratpuffer, pH 5,0 und 1% Agarose zersetzt, was zu einer
fluoreszenzfreien Zone führte. Dies
ist der erste Bericht einer Xylanase mit α-Arabinopyranosidaseaktivität.
-
Zellen
von Enzym-positiven Kolonien wurden zur Isolierung einer einzelnen
Kolonie auf Agar gesprüht, und
eine Enzym-erzeugende einzelne Kolonie wurde für jede der Xylanaseherstellenden
Kolonie identifiziert.
-
Charakterisierung
von positiven Klonen: Die positiven Klone wurden als einzelne Kolonien
erhalten, die cDNA-Einfügungen
wurden direkt von der Hefe-Kolonien unter Verwendung von biotinyliertem
Poly-Verbindungsgruppen-Primern amplifiziert, durch ein Magnetperlensystem
(Dynabead M-280, Dynal) gereinigt, und einzeln durch Sequenzieren
des 5'- Endes von jedem cDNA-Klon
unter Verwendung des Ketten-Terminierungsverfahrens (Sanger et al,
1977) und des Sequenaee-Systems (United States Biochemical) charakterisiert.
Die DNA-Sequenzen der Enzymgene sind in SEQ ID Nr. 1, 2 beziehungsweise
3 dargestellt.
-
Isolierung
eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus: Zur Vermeidung von
PCR-Fehlern im zu klonenden
Gen wurde die cDNA aus den Hefe-Plasmiden durch Standardverfahren
wie nachstehend beschrieben isoliert.
-
Eine
oder mehrere der Xylanase-herstellenden Kolonien wurden in 20 ml
YNB-1-Brühe
in einem Glasteströhrchen
mit 50 ml angeimpft. Das Röhrchen
wurde für
eine Dauer von 2 Tagen bei 30°C
geschüttelt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation für eine Dauer von 10 Min. bei
3000 Upm geerntet.
-
Die
Zellen wurden in 1 ml 0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, pH 7,5 resuspendiert.
Das Pellet wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und für eine Dauer von 30 Sek. bei
voller Geschwindigkeit gedreht. Die Zellen wurden in 0,4 ml 0,9
M Sorbit, 0,1 M EDTA, 14 mM β-Mercaptoethanol resuspendiert.
100 μl 2
mg/ml Zymolase wurden zugesetzt und die Suspension wurde bei 37°C für eine Dauer
von 30 Min. inkubiert und für
eine Dauer von 30 Sek. gedreht. Das Pellet (Spheroplaste) wurde
in 0,4 ml TE resuspendiert. 90 μl
(1,5 ml 0,5 M EDTA pH 8,0, 0,6 ml 2 M Tris-Cl, pH 8,0, 0,6 ml 10%
SDS) wurden, zugesetzt und die Suspension wurde bei 65°C für eine Dauer
von 30 Min. inkubiert. 80 μl
5 M KOAc wurden zugesetzt, und die Suspension wurde auf Eis für eine Dauer
von mindestens 60 Min. inkubiert und für eine Dauer von 15 Min. bei
voller Geschwindigkeit gedreht. Der Überstand wurde in ein frisches
mit EtOH (Raumtemperatur) gefülltes
Röhrchen überführt, gefolgt von
gründlichem
sanftem Mischen und Drehen für
eine Dauer von 30 Sek.. Das Pellet wurde mit kaltem 70%igem ETOH
gewaschen, für
eine Dauer von 30 Sek. gedreht und bei Raumtemperatur getrocknet.
Das Pellet wurde in 50 μl
TE resuspendiert und für
eine Dauer von 15 Min. gedreht. Der Überstand wurde in ein frisches
Röhrchen überführt. 2,5 μl 10 mg/ml
RNase wurden zugesetzt, gefolgt von Inkubation bei 37°C für eine Dauer
von 30 Min. und Zugabe von 500 μl
Isopropanol unter sanftem Mischen. Das Gemisch wurde für eine Dauer
von 30 Sek. gedreht und der Überstand
entfernt. Das Pellet wurde mit kaltem 96%igen EtOH gespült und bei
Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 50 μl Wasser auf eine Endkonzentration
von etwa 100 μl/ml
gelöst.
-
Die
DNA wurde in E. coli durch Standardverfahren transformiert. Zwei
Kolonien von E. coli wurden aus jeder der Transformationen isoliert
und mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI, welche die DNA-Einfügung exzidierten,
analysiert. DNA von einem dieser Klone wurde in Hefe-Stamm JG169
retransformiert.
-
Die
DNA-Sequenzen von verschiedenen der positiven Klone wurden teilweise
bestimmt. Die DNA-Sequenzen von drei bestimmten Xylanasen (xyl I,
xyl II und xyl III) sind in den SEQ ID Nr. 1, 2 beziehungsweise 3
dargestellt. Die in diesen SEQ ID's dargestellten Sequenzen umfassen einen
Poly-A-Schwanz, die Position der möglichen Stop-Codone ist in
den jeweiligen SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäure-Sequenzen dargestellt.
-
BEISPIEL 2
-
Expression von Xylanase
-
Zur
Expression der Gene in Aspergillus wird cDNA von einem oder mehreren
Repräsentanten
jeder Familie durch Aufschluß mit
HindIII/XbaI oder anderen geeigneten Restriktionsenzymen, Größenfraktionierung
auf einem Gel und Reinigung isoliert und anschließend an
pHD414 gebunden, wodurch die Plasmide pXY-I, pXY-II und pXY-III
erhalten wurden. Nach Amplifikation in E. coli werden die Plasmide
in A. oryzae oder A. niger gemäß dem im
vorstehend beschriebenen allgemeinen Abschnitt Materialien und Verfahren
transformiert.
-
Test von Transformanten
von A. oryzae
-
Jeder
der Transformanten wurden auf FG-4-Agar in der Mitte einer Petrischale
angeimpft. Nach 5-tägiger
Inkubation bei 30°C
wurden Stöpsel
mit einem Durchmesser von 4 mm mittels einem Korkenzieher entfernt.
Die Stöpsel
wurden in einem Xylan-Überschichtungsgel,
enthaltend 0,1% AZCL-Xylan und 1% Agarose in einem Puffer mit geeignetem
pH-Wert eingebettet und über
Nacht bei 40°C
inkubiert. Die Xylanaseaktivität wurde
wie vorstehend beschrieben identifiziert. Einige der Transformanten
wiesen Halos auf, die deutlich größer als der Hintergrund von
Aspergillus oryzae waren. Dies zeigt ausreichende Expression von
Xylanase in Aspergillus oryzae. Die 8 Transformanten mit der höchsten Xylanaseaktivität wurden
selektiert und angeimpft und auf YPG-Agar aufbewahrt.
-
Jeder
der 8 selektierten Transformanten wurde von YPG-Agar-Schrägflächen auf
500 ml Schüttelkolben
mit FG-4 und MDU-2 Medien angeimpft. Nach 3-5-tägiger Fermentation unter ausreichendem
Rühren
zur Sicherstellung von guter Belüftung
wurden die Kulturbrühen
für eine
Dauer von 10 Min. bei 2000 g zentrifugiert und die Überstände analysiert.
-
Ein
Volumen von 15 μl
jedes Überstands
wurde auf Löcher
mit 4 mm, die in einem 0,1%igen AZCL-Xylan-Überschichtungsgel ausgestanzt
waren (25 ml in einer Petrischale mit 13 cm Durchmesser) aufgetragen. Die
Xylanaseaktivität
wurde durch die Bildung eines blauen Halos durch Inkubation identifiziert.
-
Anschließend wurden
Xyl I, Xyl II beziehungsweise Xyl III durch Zufuhr-Chargen-Fermentation von das
Enzym exprimierendem A. oryzae wie vorstehend in Materialien und
Verfahren beschrieben hergestellt.
-
BEISPIEL 3
-
Reinigung von Xylanase
I, II & III
-
Reinigung von Xylanase
I
-
Der
Kultur-Überstand
aus der Fermentation von das rekombinante Enzym exprimierendem Aspergrillus
oryzae wird zentrifugiert und durch einen Filter mit 0,2 um filtriert,
um das Mycelium zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstands
(30–60
mg Xylanase I) werden in einer Filtron-Ultracette- oder Amicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung
mit einer Membran von 10 kDa unter Erzielen von 10-facher Konzentration
ultrafiltriert. Dieses Konzentrat wird in 25 mM Tris, pH 8,0, in
zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsrunden in derselben Vorrichtung
auf das 100-Fache verdünnt.
Diese ultrafiltrierte Probe wird mit 1,5 ml/Min. auf einen in 25
mM Tris, pH 8,0, äquilibrierten
Schnellfluss-Q-Sepharose-Anionenaustauscher des Typs Pharmacia HR16/20
gepackt. Nach Auftragen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumen
25 mM Tris, pH 8,0, gewaschen und die gebundenen Proteine werden
mit linear zunehmendem NaCl-Gradienten von 0,5 M NaCl in 25 mM Tris,
pH 8,0, eluiert. Xylanase I ist nicht an der Säule gebunden und liegt somit
in der Waschfraktion vor. Der Hauptteil aller Verunreinigungen ist
an der Säule
gebunden, und folglich ist Xylanase I aus der Durchlauf-/Waschfraktion zu
mehr als 95% rein.
-
Reinigung von Xylanase
II
-
Der
Kultur-Überstand
aus der Fermentation von das rekombinante Enzym exprimierendem Aspergrillus
oryzae wird zentrifugiert und durch einen Filter mit 0,2 um filtriert,
um das Mycelium zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstands
(30–60
mg Xylanase Π)
werden in einer Filtron-Ultracette- oder Amicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung
mit einer Membran von 10 kDa unter Erzielen von 10-facher Konzentration
ultrafiltriert. Dieses Konzentrat wird in 20 mM Tris, pH 8,0, in
zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsrunden in derselben Vorrichtung
auf das 100-Fache verdünnt.
Diese ultrafiltrierte Probe wird mit 1,5 ml/Min. auf einen in 20
mM Tris, pH 8,0, äquilibrierten
Schnellfluss-Q-Sepharose-Anionenaustauscher des Typs Pharmacia HR16/20
gepackt. Nach Auftragen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumen
20 mM Tris, pH 8,0, gewaschen und die gebundenen Proteine mit einem
linear zunehmenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 20 mM
Tris, pH 8,0, eluiert. Xylanase Π eluiert
mit zwei verschiedenen Peaks mit etwa 0,2 & 0,3 M NaCl. Das Enzym in diesen beiden
Fraktionen weist deutlich verschiedene isoelektrische Punkte (pI
4,65 und pI 4,5 für
den ersten beziehungsweise den letzten eluierten Peak) auf, jedoch
wurde kein Unterschied in den enzymatischen Eigenschaften zwischen
den beiden Fraktionen von Xylanase Π beobachtet.
-
Reinigung von Xylanase
III
-
Der
Kultur-Überstand
aus der Fermentation von das rekombinante Enzym exprimierendem Aspergrillus
oryzae wird zentrifugiert und durch einen Filter mit 0,2 um filtriert,
um das Mycelium zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstands
(30–60
mg Xylanase III) werden in einer Filtron-Ultracette- oder Amicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung
mit einer Membran von 10 kDa unter Erzielen von 10-facher Konzentration
ultrafiltriert. Dieses Konzentrat wird in 25 mM Tris, pH 8,0, in
zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsrunden in derselben Vorrichtung
auf das 100-Fach verdünnt.
Diese ultrafiltrierte Probe wird mit 1,5 ml/Min. auf einen in 25
mM Tris pH 8,0, äquilibrierten
Schnellfluss-Q-Sepharose-Anionenaustauscher des Typs Pharmacia HR16/20
gepackt. Nach Auftragen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumen
25 mM Tris pH 8,0, gewaschen und die gebundenen Proteine mit einem
linear zunehmenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 25 mM
Tris, pH 8,0, eluiert. Xylanase III in dieser Fraktion ist nicht
vollständig
rein. Folglich wurden die Xylanase III enthaltenden Fraktionen durch
Ultrafiltration in einer Amicon-Ultrafiltrations-Vorrichtung mit
einer Membran von 10 kDA zu einem Volumen von 4,5 ml eingeengt und
auf eine Sepharyl-S200-Gelfiltrationssäule des
Typs HR 26/60 in 0,25 M Ammoniumacetat, pH 5,5, mit einem konstanten
Fluss von 1 ml/Min. aufgetragen. Xylanase III wird als ein unterschiedlicher
Peak mit einer Reinheit von mehr als 95% eluiert.
-
BEISPIEL 4
-
Charakterisierung von
Xylanasen I, II, III
-
Die
Xylanasen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben charakterisiert,
und die Hauptergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich:
- Mw
- wurde durch SDS-PAGE
bestimmt
-
pH- und Temperatur-Optimum
-
Die
pH-Optima der verschiedenen Enzyme sind aus der 3 beziehungsweise 4 ersichtlich. Es ist ersichtlich,
dass alle Xylanasen ein pH-Optimum im Bereich von pH 4–6 aufweisen,
wobei Xylanase II die sauerste und Xylanase I die alkalischtse ist.
Xylanase Π ist
dadurch gekennzeichnet, dass sie verglichen mit den anderen Enzymen
ein Optimum bei hoher Temperatur (70°C) aufweist.
-
Der
Km und die spezifische Aktivität
für Xylanase
I, II und III wurden wie im vorstehend beschriebenen Abschnitt Materialien
und Verfahren bestimmt. Die aus der linearen Regressionsanalyse
erhaltenen Standard-Abweichungen von 1/Vmax und Km/Vmax wurden zum
Berechnen der Intervalle für
die aus der vorstehenden Tabelle ersichtlilchen Enzyme verwendet.
-
Es
ist ersichtlich, dass die Xylanasen spezifische Aktivitäten im Bereich
von 50–250 μmo1/Min./mg
Enzymprotein aufweisen, wobei Xylanase II die höchste Aktivität aufweist.
-
Gelfiltrationsanalyse
-
Die
Gelfiltrationschromatogramme, die für Xylanase I, II beziehungsweise
III erhalten wurden (unter Verwendung des im vorstehenden Abschnitt
Materialien und Verfahren beschriebenen Verfahrens), sind in den 5–11 dargestellt.
-
Sind
die Zersetzungsprofile nach sinkendem Zersetzungsgrad von löslichem
Arabinoxylan nach 10-minütiger
Inkubation geordnet, wird die folgende Reihenfolge erhalten: Xylanase
II, Xylanase I und Xylanase III.
-
Wird
andererseits die Menge an löslich
gemachtem Arabinoxylan (beurteilt aus der Fläche des Chromatogramms) nach
10 Min. berücksichtigt,
ist die Reihenfolge: Xylanase I, Xylanase III, Xylanase II.
-
Weiterhin
können
die Enzyme in Enzyme, durch welche die Zersetzung von Xylan fortschreitet,
und Enzyme, durch welche die Zersetzung nach einer bestimmten Zeit
gestoppt wird, unterteilt werden. Durch eine lösliche Arabinoxylan-Xylanase
II wird die Zersetzung gestoppt, während die Zersetzung durch
Xylanase II und III fortschreitet (Xylanase I bildet große Mengen
an Monomer und Dimer, und Xylanase III ist in seinem Zersetzungsmuster
beschränkter).
-
Durch
eine lösliche
Arabinoxylan-Xylanase I wird die Zersetzung nicht gestoppt, jedoch
durch Xylanase II und Xylanase III schon. Xylanase II ist sehr spezifisch,
indem sie beim Angriff des unlöslichen
Substrats sehr langsam ist.
-
Aus
den Ergebnissen wird nahegelegt, dass die Enzyme in zwei verschiedene
Klassen unterteilt werden können.
Xy12 wirkt sehr schnell auf lösliches
Arabinoxylan und sehr langsam auf unlösliches Arabinoxylan, und die
Zersetzung wird nach einer Weile gestoppt. Xy13 zersetzt unlösliches
Arabinoxylan sehr schnell, zersetzt jedoch das freigesetzte Material
nicht übermä ßig. XylI
ist durch eine übermäßige Zersetzung
sowohl von löslichem
als auch von Arabinoxylan in Oligomere gekennzeichnet.
-
BEISPIEL 5
-
Viskositätsreduzierung
von Weizenmehl
-
Verschiedene
Xylanasen wurden auf deren viskositätsreduzierende Fähigkeit
in Weizenmehl mit dem Namen Fakta Flour ("Luksus hvedemel", ein herkömmliches Mehl von nicht spezifiziertem
Typ, erhältlich
von Dagligvaregruppen, DK-7100 Vejle, Dänemark), getestet.
-
Das
Mehl wies die folgende Zusammensetzung auf:
-
-
Die
getesteten Xylanasen waren
- – Spezyme CP erhältlich von
Genencor, USA
- – eine
Xylanase von H. insolens (hergestellt wie in BEISPIEL 2 von WO 92/17573
beschrieben)
- – Xylanase
I (hergestellt wie in BEISPIEL 2 und 3 beschrieben)
- – Xylanase
II (hergestellt wie in BEISPIEL 2 und 3 beschrieben)
-
Die
Viskositätsreduzierung
wurde durch das folgende Verfahren gemessen: 100 g Mehl wurden genau gewogen.
Zu 120 ml deionisiertem Wasser, gehalten bei 35°C, wurden die vorstehenden Enzyme
gegeben. Die Enzyme werden wie folgt dosiert:
Spezyme CP: 8,5
FXU (entsprechend 3,4 mg Protein)
Xylanase I: 28,3 FXU (entsprechend
0,236 mg Enzymprotein und 4,2 mg Protein)
Xylanase II: 7,5
FXU (entsprechend 0,19 mg Enzymprotein und 0,25 mg Protein)
Xylanase
von H. insolens: 82,2 FXU (entsprechend 2,2 mg Enzymprotein und
22,3 mg Protein)
-
Eine
Blindprobe wird als Kontrolle verwendet (kein Enzym wird zugesetzt).
Das Mehl und das Wasser werden mit der Hand für eine Dauer von 30 Sek. gerührt und
dann für
eine Dauer von genau 30 Sek. in einem Mischer (Warring, herkömmlicher
Labormischer, Struers, Einstellung von 1–7, Rotor auf dem Boden (4
Blätter)) mit
7 (Maximalgeschwindigkeit) gemischt. Es dauert 30 Sek., um die Flüssigkeit
in das Messrohr am Viskometer (programmierbares Rheometer, Modell
DV-111, Brookfield, Spindel 25, wobei das Messrohr bei 38°C klimatisiert
war) zu gießen.
Die Viskosität
bei 40 UpM wird jede 15. Sekunde für eine Dauer von 4 Min. gemessen. Die
spezifische Viskosität,
ausgedrückt
als mittlere Viskosität
von Probe/mittlere Viskosität
von Blindprobe in Prozent wird als Maß für die Viskositätsreduzierung
verwendet. Die mittlere Viskosität
ist ein Mittelwert des Gehalts, der nach 60 Sek. und bis zum Ende
der Messung erhalten wurde.
-
Die
geringste relative Viskosität
wurde unter Verwendung von Xylanase II gefunden. Es wurde gefunden,
dass die anderen Xylanasen die relative Viskosität (Xylanase I, Spezyme CP)
vermindern, obwohl ein geringerer Gehalt vorliegt. Es wurde gefunden,
dass die Xylanase von H. insolens die Viskosität bei dieser Dosierung erhöht. Zum
Beispiel führten
die vorstehend erwähnten
Dosierungen zu einer spezifischen Viskosität des "Fakta Flour" von 69% für Xylanase II, 78% für Xylanase
I, 87% für
Spezyme CP und 107% für
Xylanase von H. insolens in Viskositätsprozent der Blindprobe.
-
BEISPIEL 6
-
Weizen-Auftrennung
-
Die
Weizen-Auftrennungsfähigkeit
der in Beispiel 5 erwähnten
Enzyme wurde durch einen Zentrifugationstest bewertet. Der Test
wurde von dem in Beispiel 5 erwähnten
Mehl durchgeführt.
-
Das
Mehl und das Wasser wurden gemäß dem in
Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gemischt. Nach dem Mischen wurden
10 ml des Rührteigs
bei 4332 g für
eine Dauer von 5 Min. zentrifugiert (Megafuge 1,0 Heraeus Sepatech).
Die Stärke
war in der Bodenschicht zu finden, gefolgt von Gluten, Schlamm und
der Ausflussserschicht oben. Die Auftrennung ist als Ausfluss-Prozent
ausgedrückt.
Je höher
der Prozentgehalt desto besser die Auftrennung.
-
Es
wurde festgestellt, dass Xylanase II am besten arbeitet. Zum Beispiel
betrug der Ausfluss von „Fakta
Flour" 14% für eine Blindprobe,
21% für
Spezyme CP, 22% für
Xylanase I und 23% für
Xylanase II.
-
BEISPIEL 7
-
Verwendung von Xylanase
II im Komplexierungsschritt einer Bleich-Sequenz auf Ozonbasis,
die zum Bleichen eines Kraft-Zellstoffes zur Papierherstellung verwendet
wird
-
Vor
dem Bleichen mit sauerstoffhaltigen oxidativen Bleichmitteln wie
Ozon und Wasserstoffperoxid wird Kraftzellstoff in einem getrennten
Schritt mit einem Komplexierungsmittel, z. B. EDTA oder DTPA, behandelt.
Ziel ist es, sicherzustellen, dass das anschließende oxidative Bleichen gegen
Zersetzung des Lignins in den Zellstofffasern selektiv ist. Das
Lignin sollte selektiv oxidiert werden, da eine Zersetzung von Zellulose
einen Verlust an Faserstärke
bedeutet.
-
Im
Komplexierungsschritt wird die Konzentration von Manganionen, die
an organische Säuregruppen gebunden
sind, in den Fasern zu einem Grad von etwa 10 ppm entfernt. Höhere Gehalte
an Manganionen würden
zur Bildung von unerwünschten
freien Radikalen mit hoher Reaktivität auf Zellulose und folglich
zur Reduzierung der Selektivität
des Bleichens führen.
-
Es
ist erwünscht,
dass ein anderes im Zellstoff vorliegenden Metall, Magnesium wegen
einer Zellulose-Schutzfunktion in großen Mengen vorliegt. Komplexierungsmittel
entfernen etwas Magnesium, jedoch durch Auswahl eines pH-Werts im
Bereich von 5–7
wird durch den Komplexierungsschritt weniger als die Hälfte der
Menge des anfänglich
vorliegenden Magnesiums entfernt.
-
Die
Temperatur sollte so hoch wie möglich
sein, jedoch stellen Energie-Erwägungen
in der Praxis eine obere Grenze von 60°C dar. Das Optimum für die Xylanase
II von A. aculeatus beim Bleichen von Kraft-Zellstoff wurde als
60°C und
pH 5 bestimmt. Diese Xylanase ist deshalb zur Verwendung in einem
Komplexierungsschritt besonders geeignet.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, wie die Behandlung mit Xylanase von A.
aculeatus erfolgreich in einem Komplexierungsschritt gleichzeitig
mit einem Komplexierungsmittel angewandt werden kann.
-
Eine
Probe von industriell mit Sauerstoff entlignifiziertem Weichholz-Kraftzellstoff
wurde analysiert und es wurde gefunden, dass sie 75 ppm Mangan und
750 ppm Magnesium enthielt. Die Kappa-Nr. wurde gemäß dem TAPPI-Verfahren
T236 als 14,5 bestimmt.
-
Das
Bleichen wurde in den wie nachstehend beschriebenen 4 Schritten
durchgeführt.
-
Schritt 1: EDTA/Xylanase
II von A. aculeatus (Q/Enz)
-
0,8
kg H2SO4 und 2 kg
EDTA pro Tonne ofen-getrocknetem Zellstoff wurden in den Zellstoff
gemischt, was zu einem pH-Wert von 5,0, führte. Wie in den Beispielen
2 und 3 beschrieben hergestellte Xylanase II von A. aculeatus wurde
dann mit einer Dosierung 15,000 FXU pro kg Ofen-getrockneter Zellstoff
zugesetzt, und die Konsistenz wurde mit deionisiertem Wasser auf
10% eingestellt. Der Zellstoff wurde für eine Dauer von 60 Min. bei
60°C inkubiert.
-
Nach
der Behandlung wurde die Konzentration an gelöstem Lignin als die Absorption
bei 280 nm der Wasserphase bestimmt (Dence, L: "Methods in lignin Chemistry", Springer 1992).
Von anfänglich
1,5 Einheiten stieg die Absorption auf 4,6 an. Nach Waschen des
Zellstoffs wurde die Kappa-Nr. als 13,4 bestimmt. Die Erhöhung in
der Absorption und Verminderung in der Kappa-Nr. zeigte, dass das
Lignin von den Zellstofffasern erfolgreich entfernt wurde.
-
Der
behandelte Zellstoff wurde auf Metallionen analysiert, wobei die
Endkonzentrationen 10 ppm Mangan und 450 ppm Magnesium betrugen.
Dies zeigt, dass die Behandlung mit EDTA zu dem gewünschten
Ergebnis führte,
indem das meiste des Mangans entfernt und mehr als die Hälfte des
Magnesiums im Zellstoff zurückgelassen
wurde.
-
Ein
Bezugszellstoff wurde in ähnlicher
Weise, jedoch ohne die Zugabe von Xylanase behandelt. Dieser Bezugszellstoff
wies eine Kappa-Nr. von 14,3 und einen Gehalt von 8 ppm Mangan und
450 ppm Magnesium auf.
-
Ein
anderer Bezugszellstoff wurde mit Xylanase ohne Zugabe von EDTA
behandelt. Von anfänglich 1,4
Absorptionseinheiten stieg die Absorption auf 4,5 an. Nach Waschen
des Zellstoffs wurde die Kappa-Nr. auf 13,5 bestimmt. Diese Ergebnisse
sind im Wesentlichen dieselben wie für den mit sowohl mit EDTA als
auch mit Xylanase behandelten Zellstoff.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, wie die Behandlung mit EDTA und Xylanase II von
A. aculeatus gleichzeitig im selben Schritt ohne Störung durchgeführt werden
kann.
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Schritt 2: Ozon (Z)
-
Der
mit EDTA und Xylanase behandelte Zellstoff wurde auf einen pH-Wert
von 2 eingestellt und in einen Niedrig-Konsistenz-Ozonreaktor bei
25°C unter
Dosierung von Ozon mit langsamer Geschwindigkeit und kräftigem Mischen
bis zum Verbrauch von genau 8 kg/Tonne gebleicht. Der Zellstoff
wurde dann mit Wasser bei 60°C
gewaschen.
-
Schritt 3: Sauerstoff-
und Wasserstoffperoxid-verstärkende
Extraktion (Eon)
-
Nach
dem Waschen wurde der Zellstoff unter Druck in einen alkalischen
Extraktionsschritt überführt, wo
0,5% H2O2 und 2%
NaOH zugesetzt wurden und die Konsistenz auf 10% eingestellt. Der
Zellstoff wurde unter 4 Atmosphären
Sauerstoff für
eine Dauer von 75 Min. in einem Edelstahl-Druckgefäss inkubiert.
Der Zellstoff wurde mit Wasser bei 60°C gewaschen.
-
Nach
dem Waschen wurde die Kappa-Nr., verglichen mit 2,8 für den ohne
Xylanase behandelten Bezugszellstoff, als 1,9 bestimmt. Die geringe
End-Kappa-Nr. nach der Xylanase-Vorbehandlung
zeigt die erhaltene verbesserte Bleichfähigkeit. Die Helligkeit (SCAN
C11) betrug 77% ISO für
den Enzym-behandelten Zellstoff und 69% ISO für den Bezugszellstoff.
-
Schritt 4: Chlordioxid
(D)
-
Zum
Erhalt von voller Helligkeit wurde der Zellstoff schließlich mit
Chlordioxid gebleicht. Nach Einstellen der Konsistenz auf 10% wurde
eine Dosierung von 14,5 kg aktives Chlor (oder 5,5 kg Chlordioxid)
pro Tonne Zellstoff zugesetzt. Der Zellstoff wurde für eine Dauer
von 3 Std. bei 60°C
inkubiert und dann mit Wasser bei 60°C gewaschen.
-
Die
End-Helligkeit wurde, verglichen mit 86,9% ISO, die für den ohne
Enzym behandelten Zellstoff erhalten wurde, als 90,6% ISO bestimmt.
Die Wirkung der Xylanase war somit eine Erhöhung um 3,7% ISO in der End-Helligkeit.
-
Zum
Anzeigen der Zellstoffstärke
wurde die Zellstoffviskosität
des gebleichten Zellstoffs gemäß TAPPI T230
bestimmt. Der Enzym-behandelte Zellstoff wies eine Viskosität von 20,5
cP auf, die ohne Xylanase behandelte Kontrolle wies eine Viskosität von 19,8
cP auf. Folglich arbeitete die EDTA-Behandlung gleich gut oder besser
mit vorliegender Xylanase.
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BEISPIEL 8
-
Verwendung von Xylanase
in Tierfutter
-
Brathähnchen wurden
für eine
Dauer von 6 Wochen mit einer Versuchsnahrung mit und ohne Enzyme gefüttert. Die
Nahrung enthielt 81% Weizen in den ersten 3 Wochen des Versuchs
und 84,5% Weizen in den letzten 3 Wochen. Sie wurden in 3 Behandlungen
unterteilt, wobei für
die ersten 6 Wochen jede Behandlung 12 Wiederholungen mit jeweils
8 Brathühnern,
für die
letzten drei Wochen mit jeweils 5 Hühnern einschloss. Die Behandlungen
schlossen eine Kontrolle ohne Enzyme und die folgenden enzymatischen
Behandlungen ein: 400 FXU/kg Futter Biofeed Plus (BF+) (erhältlich von
Novo Nordisk A/S) und 400 FXU/kg Futter-Xylanase II. Beide Enzyme wurden gemäß WO 92/12645
beschriebenen Verfahren als CT-Granulat
formuliert. Zielgewicht und Futterverbrauch wurden bestimmt und
das Futter verwertungsverhältnis
(FCR) wurde von 0 bis 3 und von 3 bis 6 Wochen berechnet. Weiterhin
wurde die Jejunal- und Ileal-Viskosität vom Überstand des Mageninhalts unter
Verwendung eines Brookfield LVTDV-II Viskosimeters bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind aus den folgenden Tabellen ersichtlich.
-
Tabelle
1. Herstellungsparameter von 0 bis 3 Wochen
-
Tabelle
2. Herstellungsparameter von 3 bis 6 Wochen
-
Tabelle
3. Jejunal-Viskosität
bei 3 und 6 Wochen
-
Tabelle
4. Ileal-Viskosität
3 und 6 Wochen
-
Wie
aus den Tabellen 1 und 2 ersichtlich ist die FCR in den Enzyme erhaltenden
Gruppen sowohl nach 3 als auch 6 Wochen niedriger. In beiden Fällen ist
Xylanase II besser als BF+. Dies ist hauptsächlich aufgrund eines besseren
Wachstums der Tiere in dieser Gruppe so.
-
Im
Hinblick auf die Jejunal-Viskosität liefert Xylanase II verglichen
sowohl mit BF+ als auch Kontrolle eine geringere Viskosität. Dies
ist auch der Fall für
die Ileal-Viskosität.
Sowohl die Kontrolle als auch Xylanase II liefern nach 6 Wochen
eine niedrigere Viskosität
als nach 3 Wochen, während
dies für
BF+ nicht der Fall ist. Es scheint somit, das Xylanase Π während den
letzten 3 Wochen besser arbeitet als BF+, was auch durch die relativ
niedrigere FCR von Xylanase II, verglichen mit BF+ nach 6 Wochen
angezeigt ist.
-
Dieser
Versuch zeigt folglich, dass Xylanase II eine bessere Futter-Verwertung
als BF+ auf derselben FXU-Basis liefert, d. h., dass mehr Nährstoffe
mit Xylanase II verfügbar
gemacht werden. Dies kann teilweise aufgrund einer niedrigeren Ileal-Viskosität in der
Xylanase II-Gruppe
so sein.
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BEISPIEL 9
-
Materialien und Verfahren
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Enzyme
-
Lipase
A: Die Lipase von Humicola lanuginose, beschrieben in
EP 305 216 und hergestellt durch rekombinante
DNA-Techniken in Aspergillus oryzne wie beschrieben in
EP 305 216 . Die Lipase weist eine spezifische
Aktivität
von 4,452,000 LU/g und ein FAU/g von weniger als 0,6 auf.
-
Xylanase
A: Eine Xylanase, hergestellt durch den Stamm von Humicola insolens
DSM 1800, erhältlich von
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
und ferner in
EP 507723 beschrieben.
-
Fungamyl:
Eine herkömmliche
Pilz-alpha-Amylase-Zubereitung, erhältlich von Novo Nordisk A/S/Dänemark.
-
Pentopan:
Eine im Handel erhältliche
Xylanase-Zubereitung, erhältlich
von Novo Nordisk A/S, Dänemark.
-
LU/g
(Lipaseeinheiten/g), FAU/g (Pilz-alpha-Amylaseeinheiten/g) und FXU
(Xylanaseeinheiten/g) wurden durch die folgenden Versuche bestimmt:
-
LU – Lipaseeinheiten
-
Die
Lipaseaktivität
wurde unter Verwendung von Glycerintributyrat als Substrat und Gummiarabicum als
Emulgator untersucht. 1 LU (Lipaseeinheit) ist die Enzymmenge, die
1 μmol tritrierbare
Buttersäure
pro Minute bei 30°C,
pH 7,0, freisetzt. Die Lipaseaktivität wurde durch pH-stat unter
Verwendung eines Radiometer-Titrators VIT90, Radiometer, Kopenhagen,
geprüft.
Weitere Details des Versuchs sind in Novo Analytical Method AF 95/5,
erhältlich
auf Anfrage, bereitgestellt.
-
FAU – Pilz-alpha-Amylaseeinheiten
-
1
FA-Einheit (FAU) ist die Menge eines Enzyms, die bei 37°C und pH
4,7 5260 mg feste Stärke
pro Stunde aufspaltet. Weitere Details des Versuchs sind in Novo
Analytical Method AF, erhältlich
auf Anfrage, bereitgestellt.
-
FXU – Xylanaseaktivität
-
Wurde
wie vorstehend beschrieben bestimmt.
-
Herstellung von Brot
-
Weißbrot wurde
durch das folgende Grundrezept hergestellt: Grundrezept
Mehl
(Manitoba) | 100% |
Salz | 1,5% |
Hefe
(frisch) | 5,0% |
Zucker | 1,5% |
Wasser | 58% |
-
Das
Weizenmehl war von dem Typ mit dem "Manitoba", geliefert von "Valsemolleme", Dänemark,
Oktober 1993.
-
Verfahren
-
- 1. Teig mischen (Spiralmixer)
2 Min. bei
700 UpM
7 Min. bei 1400 UpM
Die Mischzeit wurde bestimmt
und von einem Bäcker
so eingestellt, dass eine optimale Teig-Konsistenz unter den verwendeten Testbedingungen
erhalten wurde.
- 2. Erstes Gären:
30°C–80% RH,
16 Min.
- 3. Abmessen und Formen.
- 4. Endgären:
32°C–80% RH,
35 Min.
- 5. Backen: 225°C,
20 Min. für
Wecken und 30 Min. für
Laib.
-
Bewertung von Teig und
gebackenen Produkten
-
Die
Eigenschaften des Teigs und der gebackenen Produkte wurden wie folgt
bestimmt:
-
Spezifisches
Volumen von Wecken: Das Volumen von 20 Wecken wird unter Verwendung
des traditionellen Rapssamen-Verfahrens gemessen. Das spezifische
Volumen wird als Volumen ml pro g Brot berechnet. Das spezifische
Volumen der Kontrolle (ohne Enzym) ist als 100 definiert. Der relative
spezifische Volumen-Index wird berechnet als:
-
-
Spezifisches
Volumen von Laiben: Der Mittelwert von 4 Laib-Volumen wird unter
Verwendung desselben Verfahrens wie vorstehend beschrieben gemessen.
-
Die
Teigklebrigkeit und Krümelstruktur
werden visuell gemäß der folgenden
Skala bewertet: Teigklebrigkeit
Fast
flüssig | 1 |
Zu
klebrig | 2 |
Leicht
klebrig | 3 |
Etwas
weich | 3,5 |
Normal | 4 |
Trocken | 5 |
Krümelstruktur
Sehr
schlecht | 1 |
Schlecht
2 | 2 |
Ungleichmäßig | 3 |
Gleichmäßig/gut | 4 |
Sehr
gut | 5 |
-
Die
Weichheit von Brotkrümeln
wird durch einen SMS-Textur-Analysator gemessen. Ein Kolben mit
einem Durchmesser von 20 mm wird auf die Mitte einer 20 mm dicken
Brotscheibe gepresst. Die für
den Kolben erforderliche Kraft zum Zusammenpressen der Krümel um 5
mm mit einer Geschwindigkeit von 2,0 mm/s wird aufgezeichnet und
ist als die Krümelfestigkeit
ausgedrückt.
Je niedriger der Wert ist, desto weicher ist der Krümel. Vier
Scheiben von jedem Brot wurden gemessen und der Mittelwert verwendet.
-
BEISPIEL 10
-
In
der selben Weise wie in Beispiel 9 beschrieben wurden Backversuche
mit Xylanase II, einer rekombinanten Xylanase von A. aculeatus,
hergestellt wie in Anhang 1 beschrieben, Xylanase A und Pentopan durchgeführt. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
-
-
Es
ist aus der Tabelle 6 ersichtlich, dass die Verwendung von Xylanase
II das Volumen von Wecken oder/und Laiben deutlich erhöht und die
Wirkung größer als
von Xylanase und Pentosanase des Fachgebiets ist. Bei der optimalen
Dosis von Xylanase II (d. h. etwa 200 FXU 5 pro kg Mehl) wird eine
Volumenerhöhung von
24% ohne Verursachen eines zu klebrigen Teigs erzielt. Weiterhin
werden auch die Krümelstruktur
und Krümelweichheit
nach Lagerung verbessert.
-
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