CN109312380A - 用于大规模酶生产的种子训练 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及大规模酶生产方法的框架中经优化的种子训练扩增方法。

Description

用于大规模酶生产的种子训练
技术领域
本发明涉及生产发酵产物(例如酶或酶组合物)的方法，所述方法包括经优化的种子训练(train)过程。
背景技术
从生物质生产乙醇的总成本的主要贡献者之一是生物质水解中使用的纤维素分解酶。酶的成本在总生产成本中占很大比例，因此纤维素分解微生物的改进、纤维素分解酶的水解能力的提高以及酶生产技术的优化现今对于进一步降低生物质到生物乙醇工艺中的酶成本是重要的。
纤维素分解酶的现场生产(on-site production)是开发从木质纤维素生物质的可持续乙醇生产方法的重要策略。
纤维素分解酶的现场生产包括种子训练过程，其被用于生成足量的微生物生物质以接种大型生产生物反应器。常规种子训练过程开始于冷冻保存的细胞库小瓶的解冻，然后在逐渐变大的培养容器(例如摇瓶、旋转器(spinners)、波袋(wave bags)和搅拌式生物反应器)中多次连续增殖。当培养体积和细胞密度满足预定标准时，将培养物转移到生产生物反应器中，细胞在生产生物反应器中继续生长并分裂并产生产物。
这种常规种子训练方法存在一些挑战。在每个步骤中均需要多次手动操作，这使得整个种子训练过程易受污染和操作员错误的影响。另外，由于培养步骤的数目，并且由于冷冻保存的细胞库小瓶中的细胞数目低，常规种子训练过程是耗时的。此外，大规模生产生物反应器通常以低细胞密度(例如少于0.5x106个活细胞/ml)开始。这是非常低效的，因为其需要5-10天的生长期以达到生产细胞密度。
由于种子训练可在生产率、盈利率和过程控制方面对过程性能具有实质性影响，因此需要进一步改进种子训练过程以进一步降低从生物质生产乙醇的成本。
发明内容
本发明的一个目标是提供经改进的生产发酵产物(例如多肽，例如酶)的方法。特别地，本发明的目标是提供经改进的通过真菌生产酶的方法。优化和改进在于提供经改进的种子训练过程。
发明详述
在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”及其变体应被解释为包含性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可包括未明确指出的其它要素或成分。本文中不使用数量词修饰表示一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)。例如，“要素”可表示一个/种要素或多于一个/种要素。
本发明的一个方面是生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的真菌接种物，
b)将所述接种物转移到两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种，
c)在所述第一生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述发酵产物，
d)排空所述两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第二生产生物反应器用于新的生产发酵，
e)在步骤(b)之后，但在步骤(d)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物，
f)将所述第二接种物转移到所述两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种，
g)在所述第二生产生物反应器中培养真菌细胞以生产所述发酵产物，
h)排空所述两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第一生产生物反应器用于新的生产发酵，
i)在步骤(f)之后，但在步骤(h)完成之前，重复至少步骤(a)-(e)。
本发明的另一方面是生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的真菌接种物，
b)将所述接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种，
c)在所述第一生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述发酵产物，
d)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第二生产生物反应器用于新的生产发酵，
e)在步骤(b)之后，但在步骤(d)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物，
f)将所述第二接种物转移到所述三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种，
g)在所述第二生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述发酵产物，
h)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第三生产生物反应器用于新的生产发酵，
i)在步骤(f)之后，但在步骤(h)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物，
j)将所述第三接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已准备好用于接种，
k)在所述第三生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述发酵产物，
l)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第一生产生物反应器用于新的生产发酵，
m)在步骤(j)之后，但在步骤(1)完成之前，重复至少步骤(a)-(e)。
上述方法描述了单个接种物生物反应器可用于接种两个或更多个生产生物反应器或三个或更多个生产生物反应器的系统排列(constellation)。本发明还包括这样的方法，其中单个接种物生物反应器可用于接种四个或更多个生产生物反应器、五个或更多个生产生物反应器或甚至多于五个或更多个生产生物反应器。本领域技术人员有能力将上述方法调整为这样的系统排列，其中接种物生物反应器用于接种四个或更多个生产生物反应器、五个或更多个生产生物反应器或甚至多于五个或更多个生产生物反应器。
本发明还包括这样的方法，其中两个或更多个接种物生物反应器用于接种两个或更多个生产生物反应器、三个或更多个生产生物反应器、四个或更多个生产生物反应器、五个或更多个生产生物反应器或甚至多于五个或更多个生产生物反应器。两个或更多个接种物生物反应器可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。本领域技术人员有能力将上述方法调整为这样的系统排列，其中两个或更多个接种物生物反应器用于接种两个或更多个生产生物反应器、三个或更多个生产生物反应器、四个或更多个生产生物反应器、五个或更多个生产生物反应器或甚至多于五个或更多个生产生物反应器。
用于接种生产生物反应器的足量微生物生物质的产生是时间和成本密集的。种子训练通常从一个或多个小瓶或安瓿开始，所述小瓶或安瓿包含冷冻或冻干的微生物细胞。然后在若干个(即两个、三个、四个、五个、六个或甚至更多个)细胞扩增步骤中培养细胞。在细胞扩增步骤中，生物质的量增加，同时传代进入更大的培养系统中。可以使用的培养系统的实例有T-烧瓶、摇瓶、旋转瓶、滚瓶、波袋、滚动管、旋转管和生物反应器(例如搅拌式生物反应器)。这些培养系统的体积可以从毫升到立方米不等。培养系统可以由任何合适的材料(例如不锈钢)制成。
在一种实施方式中，微生物是真菌。在一种实施方式中，真菌是丝状真菌，因此真菌细胞是丝状真菌细胞。在一个优选的实施方式中，真菌属于Rasamsonia属或Aspergillus属，其中Rasamsonia emersonii和Aspergillus niger是最优选的。“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢绝对好氧。可用于本发明中的丝状真菌菌株包括但不限于，Acremonium,Agaricus,Aspergillus,Aureobasidium,Beauvaria,Cephalosporium,Ceriporiopsis,Chaetomium paecilomyces,Chrysosporium,Claviceps,Cochiobolus,Coprinus,Cryptococcus,Cyathus,Emericella,Endothia,Endothia mucor,Filibasidium,Fusarium,Geosmithia,Gilocladium,Humicola,Magnaporthe,Mucor,Myceliophthora,Myrothecium,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Piromyces,Panerochaete,Pleurotus,Podospora,Pyricularia,Rasamsonia,Rhizomucor,Rhizopus,Scylatidium,Schizophyllum,Stagonospora,Talaromyces,Thermoascus,Thermomyces,Thielavia,Tolypocladium,Trametes,Trichoderma和Trichophyton的菌株。
丝状真菌的若干菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。此类菌株的实例是本领域技术人员已知的。
在一种实施方式中，真菌是包含一种或多种基因的重组真菌，所述基因可与真菌同源或异源。在本文中使用时，“异源”是指非天然存在于真菌中的基因或多核苷酸。例如，Rasamsonia的基因或多核苷酸当存在于Aspergillus中时被认为是异源的。Rasamsoniaemersonii的基因或多核苷酸当存在于Rasamsonia byssochlamydoides中时也被认为是异源的。然而，特定Rasamsonia emersonii菌株的基因或多核苷酸当存在于另一Rasamsoniaemersonii菌株中时被认为是同源的。当合成的基因或多核苷酸被引入真菌中时，合成的基因或多核苷酸也被认为是异源的。在一种实施方式中，真菌是包含一种或多种基因的重组真菌，所述基因可以与真菌同源或异源，其中一种或多种基因编码可以降解纤维素底物的酶。在一种实施方式中，真菌是非重组真菌，其包含与真菌同源的一种或多种基因。在一种实施方式中，真菌是非重组真菌，其包含与真菌同源的一种或多种基因，其中所述一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。
从冷冻小瓶到生产生物反应器的种子训练包括若干个步骤。首先将冷冻或冷冻干燥的细胞接种在一个或多个第一培养系统中并培养以制备第一预培养物。在一种实施方式中，以分批模式制备第一预培养物。第一培养系统可具有相同的体积或不同的体积。第一培养系统的毛容器体积(gross vessel volume)可以为5毫升至10升。在一种实施方式中，第一培养系统可以是T-烧瓶、摇瓶、旋转瓶、滚瓶、波袋、滚动管、旋转管和生物反应器。用于制备第一预培养物的培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在搅拌下进行。在一种实施方式中，培养时间可以在10小时至120小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。
在一种实施方式中，将第一预培养物转移到第二培养系统。转移可以通过任何合适的方式进行。如果需要，也可以用第一预培养物接种两个或更多个第二培养系统。在一种实施方式中，在一个或多个第二培养系统中制备第二预培养物。在一种实施方式中，制备以分批模式进行。第二培养系统的毛容器体积可以为50升至2000升。用于制备第二预培养物的培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，搅拌第二培养系统。在一种实施方式中，培养时间可以在5小时至100小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。
在一种实施方式中，将第二预培养物转移到接种物生物反应器。转移可以通过任何合适的方式进行。如果需要，也可以用第二种预培养物接种两个或更多个接种物生物反应器。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(a)包括在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的真菌接种物。在一种实施方式中，在步骤(a)中以分批模式制备包含真菌细胞的真菌接种物。接种物生物反应器的毛容器体积可以为300升至15000升。用于制备包含真菌细胞的真菌接种物的培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，搅拌接种物生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在1小时至60小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(b)包括将接种物转移到两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种，或将接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种。这意味着存在至少两个或至少三个生产生物反应器，并将接种物转移到其中之一。接种物被转移到的生物反应器(第一生物反应器)已准备好用于接种。在本文中使用时，“已准备好用于接种”是指生物反应器已在先前发酵后排空，清洁，灭菌，然后填充无菌培养基或生物反应器已在先前发酵后排空，清洁，填充培养基，然后灭菌。转移可以通过任何合适的方式进行。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(c)包括在第一生产生物反应器中培养真菌细胞以生产发酵产物。在一种实施方式中，在第一生产生物反应器中以补料分批模式、分批模式、重复分批模式、重复补料分批模式或连续模式培养真菌细胞。优选地，以补料分批模式培养真菌细胞。培养真菌细胞的步骤可以是在生产过程开始时的分批阶段。在该步骤中，主要产生真菌生物质，任选地还产生一定量的目标发酵产物。进料可以在固定的时间段后或满足某些标准时开始。可以使用任何合适的进料曲线。在进料阶段期间，主要产生发酵产物，并且较低程度地产生真菌生物质。第一生产生物反应器的毛容器体积可以为20000升至300000升。用于培养第一生产生物反应器中的真菌细胞的分批培养基、补料培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，第一生产生物反应器是泡罩塔生物反应器。在另一种实施方式中，第一生产生物反应器是搅拌式生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在10小时至300小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。在步骤(c)或至少其部分期间，真菌产生发酵产物。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(d)包括排空两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器或三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备第二生产生物反应器用于新的生产发酵。对于补料分批发酵，通常在生物反应器完全充满(充气的)发酵液时达到发酵结束。在生产发酵结束时，生物反应器含有一定量的发酵液，所述发酵液含有最终量的所产生的目标产物。将发酵液从生物反应器泵送到发酵液储存容器或第一下游处理单元。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(e)包括在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物。该制备步骤在本发明方法的步骤(b)之后，但在步骤(d)完成之前进行。换句话说，在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物与在第一生产生物反应器中培养真菌细胞以产生发酵产物同时进行。在本文中使用时，“同时”并不意味着包含真菌细胞的第二真菌接种物的制备需要耗费的时间与第一生产生物反应器中真菌细胞的完整培养时间一样长，其可仅耗费第一生产生物反应器中真菌细胞的培养时间的一部分。例如，“同时”是指：当在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物耗费20小时并且在第一生产生物反应器中培养真菌细胞耗费100小时时，在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物应至少部分地在第一生产生物反应器中培养真菌细胞所需的100小时内进行。为了能够在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物，可以将如上所述获得的第二预培养物转移到接种物生物反应器中。在一种实施方式中，以分批模式制备包含真菌细胞的第二真菌接种物。上文已经描述了接种物生物反应器的体积。用于制备包含真菌细胞的第二真菌接种物的培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，搅拌接种物生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在1小时至60小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(f)包括将第二接种物转移到两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种，或将第二接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种。这意味着存在至少两个或至少三个生产生物反应器，并且第二接种物被转移到的生产生物反应器不同于第一接种物被转移到的生产生物反应器。之前已经限定了“已准备好用于接种”这一术语。转移可以通过任何合适的方式进行。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(g)包括在第二生产生物反应器中培养真菌细胞以生产发酵产物。在一种实施方式中，在所述方法的步骤(c)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(g)中产生的发酵产物是相同的。在另一实施方式中，在所述方法的步骤(c)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(g)中产生的发酵产物是不同的。在一种实施方式中，在第二生产生物反应器中以补料分批模式、分批模式、重复分批模式，重复补料分批模式或连续模式培养真菌细胞。优选地，以补料分批模式培养真菌细胞。培养真菌细胞的步骤可以是在生产过程开始时的分批阶段。在该步骤中，主要产生真菌生物质，任选地还产生一定量的目标发酵产物。进料可以在固定的时间段后或满足某些标准时开始。可以使用任何合适的进料曲线。在进料阶段期间，主要产生发酵产物，并且较低程度地产生真菌生物质。第二生产生物反应器的毛容器体积可以为20000升至300000升。在一种实施方式中，第一生产生物反应器和第二生产生物反应器具有相同的毛容器体积。用于培养第二生产生物反应器中的真菌细胞的分批培养基、补料培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，第二生产生物反应器是泡罩塔生物反应器。在另一种实施方式中，生产生物反应器是搅拌式生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在10小时至300小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。在步骤(g)或至少其部分期间，真菌产生发酵产物。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(h)包括排空两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备第一生产生物反应器用于新的生产发酵。在另一种实施方式中，本发明方法的步骤(h)包括排空三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已达到发酵结束，并准备第三生产生物反应器用于新的生产发酵。对于补料分批发酵，通常在生物反应器完全充满(充气的)发酵液时达到发酵结束。在生产发酵结束时，生物反应器含有一定量的发酵液，所述发酵液含有最终量的所产生的目标产物。将发酵液从生物反应器泵送到发酵液储存容器或第一下游处理单元。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(i)包括在步骤(f)之后但在步骤(h)完成之前重复至少步骤(a)-(e)。在一种实施方式中，在重复步骤(a)-(e)之后，可以重复本发明方法的步骤(f)-(i)。在一种实施方式中，连续进行本发明方法的步骤(a)-(i)至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、至少十次、或甚至更多次。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(i)包括在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物。该制备步骤在本发明方法的步骤(f)之后，但在步骤(h)完成之前进行。换句话说，在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物与在第二生产生物反应器中培养真菌细胞以产生发酵产物同时进行。在本文中使用时，“同时”并不意味着包含真菌细胞的第三真菌接种物的制备需要耗费的时间与第二生产生物反应器中真菌细胞的完整培养时间一样长，其可仅耗费第二生产生物反应器中真菌细胞的培养时间的一部分。例如，“同时”是指：当在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物耗费20小时并且在第二生产生物反应器中培养真菌细胞耗费100小时时，在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物应至少部分地在第二生产生物反应器中培养真菌细胞所需的100小时内进行。为了能够在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物，可以将如上所述获得的第二预培养物转移到接种物生物反应器中。在一种实施方式中，以分批模式制备包含真菌细胞的第三真菌接种物。上文已经描述了接种物生物反应器的体积。用于制备包含真菌细胞的第三真菌接种物的培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，搅拌接种物生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在1小时至60小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(j)包括将第三接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已准备好用于接种。这意味着存在至少三个生产生物反应器，并且第三接种物被转移到的生产生物反应器不同于第一接种物或第二接种物被转移到的的生产生物反应器。之前已经限定了“已准备好用于接种”这一术语。转移可以通过任何合适的方式进行。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(k)包括在第三生产生物反应器中培养真菌细胞以生产发酵产物。在一种实施方式中，在所述方法的步骤(c)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(g)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(k)中产生的发酵产物是相同的。在另一实施方式中，在所述方法的步骤(c)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(g)中产生的发酵产物和在所述方法的步骤(k)中产生的发酵产物是不同的。在一种实施方式中，在第三生产生物反应器中以补料分批模式、分批模式、重复分批模式，重复补料分批模式或连续模式培养真菌细胞。优选地，以补料分批模式培养真菌细胞。培养真菌细胞的步骤可以是在生产过程开始时的分批阶段。在该步骤中，主要产生真菌生物质，任选地还产生一定量的目标发酵产物。进料可以在固定的时间段后或满足某些标准时开始。可以使用任何合适的进料曲线。在进料阶段期间，主要产生发酵产物，并且较低程度地产生真菌生物质。第三生产生物反应器的毛容器体积可以为20000升至300000升。在一种实施方式中，第一、第二和/或第三生产生物反应器具有相同的毛容器体积。用于培养第三生产生物反应器中的真菌细胞的分批培养基、补料培养基、培养时间、培养温度和培养pH取决于待培养的真菌等。培养基可包含组分例如一种或多种碳源、一种或多种氮源、缓冲剂、一种或多种矿物质。培养基可在使用前灭菌。在一种实施方式中，培养在通气下进行。在一种实施方式中，第二生产生物反应器是泡罩塔生物反应器。在另一种实施方式中，第二生产生物反应器是搅拌式生物反应器。在一种实施方式中，培养时间可以在10小时至300小时之间变化。在一种实施方式中，培养pH为3至7。在一种实施方式中，培养温度为30℃至70℃。在步骤(k)或至少其部分期间，真菌产生发酵产物。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(1)包括排空三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备第一生产生物反应器用于新的生产发酵。在另一种实施方式中，本发明方法的步骤(1)包括排空三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备第二生产生物反应器用于新的生产发酵。对于补料分批发酵，通常在生物反应器完全充满(充气的)发酵液时达到发酵结束。在生产发酵结束时，生物反应器含有一定量的发酵液，所述发酵液含有最终量的所产生的目标产物。将发酵液从生物反应器泵送到发酵液储存容器或第一下游处理单元。
在一种实施方式中，本发明方法的步骤(m)包括在步骤(j)之后但在步骤(1)完成之前重复至少步骤(a)-(e)。在一种实施方式中，在重复步骤(a)-(e)之后，可以重复本发明方法的步骤(f)-(m)。在一种实施方式中，连续进行本发明方法的步骤(a)-(m)至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、至少十次、或甚至更多次。
在一种实施方式中，接种物生物反应器的毛容器体积与第一生产生物反应器的毛容器体积的比率为1％至15％、优选2％至8％、更优选2％至6％、甚至更优选2％至5％、最优选2％至4.5％，和/或接种物生物反应器的毛容器体积与第二生产生物反应器的毛容器体积的比率为1％至15％、优选2％至8％、更优选2％至6％、甚至更优选2％至5％、最优选2％至4.5％，和/或接种物生物反应器的毛容器体积与第三生产生物反应器的毛容器体积的比率为1％至15％、优选2％至8％、更优选2％至6％、甚至更优选2％至5％、最优选2％至4.5％。上述比率提供了酶生产率与生产设施的估计CAPEX(资本支出)的最高比率。较低的比率导致较低的CAPEX，但较长的生产发酵的分批阶段，这降低了生产率。较高的比率导致较高的CAPEX，但较短的生产发酵的分批阶段，这提高了生产率。
在一种实施方式中，第二培养系统的毛容器体积与接种物生物反应器的毛容器体积的比率为0.5％至20％、优选1％至10％、更优选1％至8％、甚至更优选1％至5％。
在一种实施方式中，第一培养系统的毛容器体积与第二培养系统的毛容器体积的比率为0.1％至20％、优选为0.5％至10％、更优选为0.5％至6％、甚至更优选0.5％至3％。
在一种实施方式中，一个或多个生产生物反应器中产生的发酵产物可以是源自发酵的任何物质，它们包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；蛋白质、多肽、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶或酶组合物。在一种优选的实施方式中，生产生物反应器中产生的发酵产物是酶或酶组合物。
在一种实施方式中，回收生产生物反应器中产生的发酵产物。回收可以在生产期间和/或之后进行。从真菌、培养基或两者中回收发酵产物的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于生物质去除、离心、(超)过滤和色谱法。
在另一种实施方式中，不回收发酵产物，发酵产物是完整发酵液的一部分。可以通过培养非重组真菌和/或重组真菌来制备完整发酵液。在一种实施方式中，真菌是包含一种或多种基因的重组真菌，所述基因可与真菌同源或异源。在一种实施方式中，真菌是包含一种或多种基因的重组真菌，所述基因可与真菌同源或异源，其中一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。
优选地，在完整发酵液中真菌细胞被杀死。完整发酵液可含有一种或多种有机酸(用于杀死细胞)、杀死的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。
发酵产物可通过用合适的真菌(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillusniger)发酵合适的底物来制备，其中发酵产物由真菌产生。可以改变真菌以改进或制备发酵产物。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使真菌突变。因此，本文提及的真菌可被原样使用以产生发酵产物，或可被改变以增加产量或产生改变的发酵产物。在发酵产物是酶的情况下，可以改变真菌以增加产量或产生改变的酶，所述酶可以包括异源酶，例如纤维素酶，即这种真菌原本不产生的酶。优选地，使用真菌、更优选丝状真菌来生产发酵产物。根据本发明的方法由真菌产生的发酵产物优选是酶或酶组合物。有利地，使用嗜热或耐热真菌。
通常，在适于生产目的发酵产物的细胞培养基中培养真菌。在一种优选的实施方式中，发酵产物是酶或酶组合物。酶或酶组合物可以能够降解纤维素底物。酶或酶组合物可以能够水解纤维素底物。培养在合适的营养培养基中进行，所述营养培养基包含碳源和氮源以及无机盐。可以通过下述方法来制备完整发酵液：使真菌生长至稳定期并将真菌保持在限碳条件下持续足以表达发酵产物的时间段。一旦目的发酵产物由真菌产生，例如分泌到发酵培养基中，则可使用完整发酵液。本发明的完整发酵液可包含真菌。在一些实施方式中，完整发酵液包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级内容物。通常，完整发酵液包含真菌生长至饱和、在碳限制性条件下孵育以允许产生发酵产物或防止氧限制之后存在的已用过的培养基和细胞碎片。在一种实施方式中，完整发酵液包含已用过的细胞培养基、细胞外酶和真菌。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法裂解、透化或杀死完整发酵液中存在的真菌，以产生细胞被杀死的完整发酵液。在一种实施方式中，完整发酵液是细胞被杀死的完整发酵液，其中含有真菌细胞的完整发酵液被裂解或杀死。在一些实施方式中，通过用化学和/或pH处理裂解真菌来杀死细胞，以生成真菌发酵的细胞被杀死的完整发酵液。在一些实施方式中，通过用化学和/或pH处理裂解真菌来杀死细胞并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一种实施方式中，完整发酵液包含有机酸和/或其盐，例如乙酸、甲酸、丙酸、苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、任何这些有机酸的盐或其任何组合。
在本文中使用时，术语“完整发酵液”是指通过未进行或进行了最少回收和/或纯化的细胞发酵而产生的制备物。例如，完整发酵液是当微生物培养物生长至饱和时、在碳限制性条件下培养以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌至细胞培养基中而产生的。通常，完整发酵液是未分级的且包括已用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为非存活的细胞。
如果需要的话，完整发酵液可以是分级的且可使用经分级内容物中的一种或多种。例如，可从完整发酵液去除被杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些成分的组合物。
完整发酵液可进一步地包含防腐剂和/或抗微生物剂。这种防腐剂和/或试剂是本领域中是已知的。
通常，如本文所述的完整发酵液为液体，但也可含有不溶性成分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整发酵液。
在一种实施方式中，可以用一种或多种多肽补充完整发酵液。在一种实施方式中，可以用真菌不内源性表达或以相对低的水平表达的一种或多种酶活性补充完整发酵液，以改善纤维素底物降解，例如成为可发酵糖，例如葡萄糖或木糖。补充的多肽或酶可以作为补充物添加到完整发酵液中，并且所述多肽或酶可以是单独的完整发酵液的组分，或者可以被纯化，或最低限度地回收和/或纯化。
在一种实施方式中，完整发酵液可以补充有至少另外的完整发酵液。另外的完整发酵液可源自相同类型的真菌或其它类型的真菌，例如第一完整发酵液可以源自Rasamsonia，而第二完整发酵液可以源自Rasamsonia或Aspergillus。
在一种实施方式中，完整发酵液包含过表达一种或多种酶的重组真菌发酵的完整发酵液。在一种实施方式中，完整发酵液包含过表达一种或多种可降解纤维素底物的酶的重组真菌发酵的完整发酵液。或者，完整发酵液可以包含非重组真菌发酵的完整发酵液和过表达一种或多种酶的重组真菌发酵的完整发酵液的混合物。或者，完整发酵液可以包含非重组真菌发酵的完整发酵液和过表达一种或多种可降解纤维素底物的酶的重组真菌发酵的完整发酵液的混合物。在一种实施方式中，完整发酵液包含过表达纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的真菌发酵的完整发酵液。下文描述了纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶以及可被过表达的其它酶。或者，完整发酵液可包含非重组真菌发酵的完整发酵液和过表达纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的重组真菌发酵的完整发酵液的混合物。或者，完整发酵液可以包含过表达一种或多种降解纤维素底物的酶的重组真菌发酵的完整发酵液以及过表达一种或多种降解纤维素底物的其它酶的重组真菌发酵的完整发酵液的混合物。
在一种实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的发酵产物储存在储罐中。在储罐中的储存可以是1小时至500小时。储罐的容积可为100000升至700000升。
在一种实施方式中，通过本发明方法产生的酶或酶组合物具有纤维素底物降解和/或碳水化合物水解活性。换句话说，由真菌产生的酶或酶组合物具有纤维素底物降解和/或碳水化合物水解活性。酶或酶组合物可以源自真菌，例如丝状真菌。
在一种实施方式中，真菌可以产生两种或更多种，例如，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种酶。一些酶可以是天然的，而其它酶是异源的。在一种实施方式中，真菌产生至少两种纤维素酶。所述至少两种纤维素酶可含有相同或不同的活性。
在一种实施方式中，真菌可以产生溶解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶。
真菌可以产生来自除真菌外的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。在另一种实施方式中，在通过真菌产生后，可将所产生的酶与一种或多种其它酶组合。然后，酶的组合可以例如用于如本文所述的降解纤维素底物的方法中和/或如本文所述的从纤维素底物生产发酵产物的方法中。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含β-葡糖苷酶(BG)，所述BG来自Aspergillus，例如Aspergillus oryzae，例如WO 02/095014中公开的或WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自Aspergillus fumigatus，例如WO 2005/047499中作为SEQ ID NO：2公开的或WO 2014/130812中的SEQ ID NO：5，或者Aspergillusfumigatusβ-葡糖苷酶变体，例如WO 2002/044915中公开的，例如具有以下替换的：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO：5进行编号)，或者Aspergillusaculeatus、Aspergillus niger或Aspergillus kawachi。在另一种实施方式中，产生的β-葡糖苷酶源自Penicillium，例如WO 2007/019442中作为SEQ ID NO：2公开的Penicilliumbrasilianum，或源自Trichoderma，例如Trichoderma reesei，例如US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US2006/0258554、US 2004/0102619中公开的。在一种实施方式中，甚至可以产生细菌β-葡糖苷酶。在另一种实施方式中，β-葡糖苷酶源自Thielavia terrestris(WO 2011/035029)或Trichophaea saccata(WO 2007/019442)。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含来自以下的内切葡聚糖酶(EG)：Trichoderma，例如Trichoderma reesei；Humicola，例如Humicola insolens菌株；Aspergillus，例如Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii；Erwinia，例如Erwinia carotovara；Fusarium，例如Fusarium oxysporum；Thielavia，例如Thielaviaterrestris；Humicola，例如Humicola grisea var.thermoidea或Humicola insolens；Melanocarpus，例如Melanocarpus albomyces；Neurospora，例如Neurospora crassa；Myceliophthora，例如Myceliophthora thermophila；Cladorrhinum，例如Cladorrhinumfoecundissimum和/或Chrysosporium，例如Chrysosporium lucknowense菌株。在一种实施方式中，甚至可以产生细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于Acidothermus cellulolyticus内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO：6或WO 2014/130812中的SEQ ID NO：6中公开的Cel7A CBH I；或来自Trichoderma，例如Trichoderma reesei。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO 2014/130812中的SEQ IDNO：7；或来自Trichoderma，例如Trichoderma reesei；或来自Thielavia，例如Thielaviaterrestris，例如来自Thielavia terrestris的纤维二糖水解酶II CEL6A。
由根据本发明的方法的真菌产生的酶可包含GH61多肽(溶解性多糖单加氧酶)，所述GH61多肽来自Thermoascus，例如Thermoascus aurantiacus，例如WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2以及WO2014/130812和WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的那些；或来自Thielavia，例如Thielavia terrestris，例如WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或WO2014/130812和WO 2008/148131和WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的那些；或来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的那些；或来自Penicillium，例如Penicilliumemersonii，例如WO 2011/041397中描述为SEQ ID NO:2或WO2014/130812中描述为SEQ IDNO:2的那些。另一些合适的GH61多肽包括但不限于Trichoderma reesei(参见WO 2007/089290)、Myceliophthora thermophila(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、Penicillium pinophilum(参见WO 2011/005867)、Thermoascussp.(参见WO 2011/039319)和Thermoascus crustaceous(参见WO 2011/041504)。在一个方面，GH61多肽在根据WO 2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如，硫酸锰)的存在下使用。在一个方面，GH61多肽在二氧化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秆)获得的液体的存在下使用。
根据本发明的方法由真菌产生的另一些纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593中，仅举几例。
此外，根据本发明的方法由真菌产生的木聚糖酶的实例包括但不限于木聚糖酶，所述木聚糖酶来自Aspergillus aculeatus(参见WO 94/21785)、Aspergillus fumigatus(参见WO 2006/078256)、Penicillium pinophilum(参见WO 2011/041405)、Penicilliumsp.(参见WO2010/126772)、Thielavia terrestris NRRL 8126(参见WO2009/079210)和Trichophaea saccata GH10(参见WO2011/057083)。在本发明的方法中由真菌产生的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自Neurospora crassa和Trichoderma reesei的β-木糖苷酶。在本发明的方法中由真菌产生的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自Aspergillus aculeatus(参见WO 2010/108918)、Chaetomium globosum、Chaetomiumgracile、Humicola insolens DSM 1800(参见WO 2009/073709)、Hypocrea jecorina(参见WO 2005/001036)、Myceliophtera thermophila(参见WO 2010/014880)、Neurosporacrassa、Phaeosphaeria nodorum和Thielavia terrestris NRRL 8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在本发明的方法中由真菌产生的阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)的实例包括但不限于来自Humicola insolens DSM 1800(参见WO 2009/076122)、Neosartorya fischeri、Neurospora crassa、Penicillium aurantiogriseum(参见WO2009/127729)以及Thielavia terrestris(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酰酯酶。在本发明的方法中由真菌产生的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自Aspergillus niger、Humicola insolens DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)以及M.giganteus(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。在本发明的方法中由真菌产生的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自Aspergillus clavatus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Humicola insolens(参见WO 2010/014706)、Penicillium aurantiogriseum(参见WO 2009/068565)和Trichoderma reesei的α-葡糖醛酸糖苷酶。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含一种、两种、三种、四种或更多种种类的纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含由本文所述的酶提供的一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由另外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在本文中使用时，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何酶。能够降解纤维素的酶是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。根据本发明的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
溶解性多糖单加氧酶(LPMO)最近通过CAZy被分类在AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)中。如上面所提及的，溶解性多糖单加氧酶能够打开结晶葡聚糖结构。溶解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等，Journalof Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是(溶解性)氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s/LPMO’s)。PMO和LPMO在本文可互换使用。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性测量值，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。在本文中使用时，术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有将被归类到得到确认的CAZy GH分类系统的家族61(http：//www.cazy.org/GH61.html)中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成员。GH61最近被CAZy重新归类在家族AA9(辅助活性家族9)。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。
CBM33(家族33碳水化合物结合模块)为溶解性多糖单加氧酶(见Isaksen等，第289卷，第5期，第2632-2642页)，CAZy最近已被重新分类为AA10(辅助活性家族10)中的CBM33。
在本文中使用时，半纤维素是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
在本文中使用时，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。根据本发明的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
因此，根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含任何纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
在本文中使用时，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在本文中使用时，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。
在本文中使用时，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在本文中使用时，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
在本文中使用时，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC 3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键。
在本文中使用时，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在本文中使用时，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
在本文中使用时，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。
在本文中使用时，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。
在本文中使用时，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
在本文中使用时，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
在本文中使用时，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
在本文中使用时，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
在本文中使用时，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
在本文中使用时，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本发明方法中使用的酶可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
在本文中使用时，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
在本文中使用时，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
在本文中使用时，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
在本文中使用时，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
在本文中使用时，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在本文中使用时，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在本文中使用时，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
在本文中使用时，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
在本文中使用时，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
在本文中使用时，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
在本文中使用时，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
在本文中使用时，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
在本文中使用时，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
根据本发明的方法由真菌产生的酶一般包含至少两种纤维素酶和任选地至少一种半纤维素酶和任选地至少一种果胶酶。根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这种酶也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。
另外，可以在本发明的方法由真菌产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶或扩展蛋白(expansin)或纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明方法中使用。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
本发明方法中使用的酶可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo等人,Eur.J.Biochem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样蛋白质。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。为了本发明的目的，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包括纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesiondomain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。为了本发明的目的，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。
根据本发明的方法由真菌产生的酶还可包含过氧化氢酶。术语“过氧化氢酶”是指催化两分子过氧化氢转化为氧和两分子水的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。可以基于以下反应通过在240nm处监测过氧化氢的降解来测定过氧化氢酶活性：2H2O2→2H2O+O2。该反应是在25℃下在pH为7.0的50mM磷酸盐中以10.3mM底物(H202)和每ml约100单位酶而进行的。在16-24秒内通过分光光度法监测吸光度，这应当对应于从0.45至0.4的吸光度降低。一个过氧化氢酶活性单位可被表达为在pH 7.0和25℃下每分钟降解的一微摩尔H202。
根据本发明的方法由真菌产生的酶可包含上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的那些蛋白质)的任何组合。
在如本文所述的降解纤维素底物的方法和本文所述的从纤维素底物生产发酵产物的方法中，上述酶可以同时(即在单一多肽组合物)或分别或顺次提供。
本发明还涉及降解纤维素底物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据本发明的生产发酵产物的方法(参见上文)，和
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入纤维素底物中以降解纤维素底物。
本发明还涉及水解纤维素底物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据本发明的生产发酵产物的方法，和
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入纤维素底物中以水解纤维素底物。
本发明还涉及由纤维素底物生产糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据本发明的生产发酵产物的方法，和
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入纤维素底物中，以从纤维素底物生产糖产物。
通常，在酶水解中使用几种酶，即使用具有不同纤维素分解活性的几种酶。这些酶可以是上述任何酶或其任何组合。它们可以通过本文所述的酶生产方法生产。真菌可以产生这些酶中的仅一种，但也可产生一种，即两种、三种、四种或甚至更多种酶。如果并非酶水解所必需的所有酶都是由真菌产生的，则可以在培养后加入其余的酶。它们也可以在酶水解过程中加入纤维素底物中。术语“纤维素底物的酶水解”和“纤维素底物的降解”在本文中可互换使用。
在一种实施方式中，在酶水解之前，使纤维素底物经受至少一次固/液分离。在一种实施方式中，在酶水解之前，使纤维素底物经受预处理和至少一次固/液分离。因此，在使纤维素底物和/或预处理的纤维素底物经受酶水解之前，可以使其经受至少一次固/液分离。固/液分离的过程和条件取决于所用纤维素底物的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。实例包括但不限于离心、旋风分离、过滤、倾析、筛分和沉降。在固/液分离过程中，可以使用用于改进分离的装置和/或辅助物。
在一种实施方式中，纤维素底物是木质纤维素材料。在本文中使用时，木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用于本发明方法的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virgin biomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗，甘蔗秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米纤维，玉米壳，玉米芯(corncobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，酒糟(distillers dried grains)，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woodycrops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheatmidlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。在一种优选的实施方式中，木质纤维素材料是甘蔗渣或甘蔗秸。
在一种实施方式中，在酶水解之前和/或期间预处理纤维素底物。预处理方法是本领域中已知的，其包括但不限于热、机械、化学修饰、生物修饰及其任意组合。通常，进行预处理以提高纤维素底物对酶水解的可接近性和/或水解木质纤维素材料中的半纤维素和/或使纤维素底物中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理纤维素底物。预处理方法的实例包括但不限于蒸汽处理(例如在100-260℃、7-45bar的压强、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下，在120-200℃、2-15bar的压强、酸性pH下，用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在存在有机溶剂和蒸汽的情况下，在160-200℃、7-30bar的压强、酸性pH下，用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在存在水/蒸汽的情况下，在60-160℃、1-10bar的压强、碱性pH下，用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(例如，在150-180℃、9-17bar的压强、碱性pH下，用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20bar的压强、碱性pH下，用>15％的NH3处理5-30分钟)。
可以洗涤纤维素底物。在一种实施方式中，可以在预处理之前和/或之后洗涤纤维素底物。洗涤步骤可在纤维素底物和/或预处理的纤维素底物的固/液分离之前和/或之后进行。如果在固/液分离后进行，则可以洗涤固/液分离后得到的固体级分。洗涤步骤可用于除去可充当发酵步骤和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按本领域技术人员已知的方式进行洗涤步骤。除了洗涤之外，还存在其它脱毒方法。预处理的纤维素底物也可以通过这些方法的任何(或任何组合)来脱毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、提取、吸附、中和、超施石灰(overliming)、添加还原剂、添加脱毒酶(例如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解物脱毒的微生物。
在一种实施方式中，使酶水解的纤维素底物经受固/液分离以获得固体级分和液体级分。用于固/液分离的方法包括但不限于离心、旋风分离、过滤、倾析、筛分和沉降。在固/液分离过程中，可以使用用于改进分离的装置和/或辅助物。
在一种实施方式中，酶水解的纤维素底物的部分被用于如本文所述的生产发酵产物的方法中。在培养之前和/或培养期间添加到真菌中的酶水解的纤维素底物可以在添加之前浓缩。
在一种实施方式中，在如本文所述的生产发酵产物的方法中使用的酶水解的纤维素底物的部分已经受固/液分离。在一种实施方式中，在酶水解的纤维素底物的固/液分离后获得的液体级分可以用于如本文所述的生产发酵产物的方法中。在一种实施方式中，可以使液体级分经受浓缩步骤，然后用于发酵产物生产方法中。
在一种实施方式中，酶水解的纤维素底物的部分和纤维素底物和/或预处理的纤维素底物的部分被用于如本文所述的生产发酵产物的方法中。这意味着在培养之前和/或期间将酶水解的纤维素底物的部分和/或纤维素底物和/或预处理的纤维素底物的部分添加到真菌中。在一种实施方式中，所使用的纤维素底物和/或预处理的纤维素底物未经历酶水解和/或未经历固/液分离。
可以在添加之前洗涤在培养之前和/或培养期间添加到真菌中的纤维素底物和/或预处理的纤维素底物。
在一种替代性实施方式中，当酶水解包括分开的液化步骤和糖化步骤(如下文更详细描述)时，液化步骤的产物可用于真菌的培养。这可以在添加或不添加酶水解的纤维素底物的情况下进行。当然，酶水解的纤维素底物的部分、预处理的纤维素底物的部分、液化步骤的产物以及外部碳源和营养源中的每一种及其每种组合也可用于真菌的培养。
在一种实施方式中，酶水解至少包括液化步骤，其中纤维素底物和/或预处理的纤维素底物在至少第一容器中水解；和糖化步骤，其中液化的材料在至少第一容器中且/或在至少第二容器中水解。糖化可以在与液化相同的容器(即至少第一容器)中进行，也可以在不同的容器(即至少第二容器)中进行。因此，在酶水解中可以组合液化和糖化。或者，液化和糖化可以是分开的步骤。液化和糖化可以在不同温度下进行，但也可以在一种温度下进行。在一种实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选在60-75℃的温度下进行，糖化优选在50-65℃的温度下进行。
酶存在于酶水解的糖化步骤和液化步骤中。这些酶可以相同或不同。此外，如上所述，在液化步骤和糖化步骤期间添加另外的酶。所添加的酶可以是已存在于液化步骤和糖化步骤中的酶。或者，它们可以是不同的酶。此外，液化步骤期间添加的另外的酶与糖化步骤期间添加的另外的酶可以不同或相同。
酶水解可以在一个或多个水解反应器中进行，也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行。当酶水解包括液化步骤和糖化步骤时，这也适用。液化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行且/或糖化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行。本发明中使用的容器的实例包括但不限于补料分批搅拌式容器、分批搅拌式容器、具有超滤作用的连续流动搅拌式容器和连续活塞流反应器。可以通过一个或多个叶轮、泵和/或静态混合器进行搅拌。
在一种实施方式中，可以将纤维素底物和/或预处理的纤维素底物加入用于酶水解的一个或多个水解反应器中。在一种实施方式中，在加入纤维素底物和/或预处理的纤维素底物之前，酶水解中使用的酶已经存在于一个或多个水解反应器中。在另一种实施方式中，可以将酶水解中使用的酶加入一个或多个水解反应器中。在一种实施方式中，在加入酶水解中使用的酶之前，纤维素底物和/或预处理的纤维素底物已经存在于一个或多个水解反应器中。在一种实施方式中，将纤维素底物和/或预处理的纤维素底物以及酶水解中使用的酶同时加入一个或多个水解反应器中。酶水解中使用的酶可以是水性组合物。当酶水解包括液化步骤和糖化步骤时，该段也适用。
酶水解中使用的酶可以在酶水解之前和/或期间加入。如上所述，当纤维素底物和/或预处理的纤维素底物在酶水解之前经受固/液分离时，可以在固/液分离之前加入酶水解中使用的酶。或者，它们也可以在固/液分离之后或在固/液分离之前和之后加入。也可以在酶水解过程中加入酶。在酶水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，可以在液化步骤期间和/或之后添加另外的酶。可以在糖化步骤之前和/或期间添加另外的酶。也可以在糖化步骤之后加入另外的酶。
值得注意的是，可以在水解反应中使用高水平的干物质(纤维素底物)进行本发明的降解纤维素底物方法。在一种实施方式中，酶水解结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高或者39重量％或更高。在一种实施方式中，酶水解结束时的干物质含量为5重量％-40重量％、6重量％-40重量％、7重量％-40重量％、8重量％-40重量％、9重量％-40重量％、10重量％-40重量％、11重量％-40重量％、12重量％-40重量％、13重量％-40重量％、14重量％-40重量％、15重量％-40重量％、16重量％-40重量％、17重量％-40重量％、18重量％-40重量％、19重量％-40重量％、20重量％-40重量％、21重量％-40重量％、22重量％-40重量％、23重量％-40重量％、24重量％-40重量％、25重量％-40重量％、26重量％-40重量％、27重量％-40重量％、28重量％-40重量％、29重量％-40重量％、30重量％-40重量％、31重量％-40重量％、32重量％-40重量％、33重量％-40重量％、34重量％-40重量％、35重量％-40重量％、36重量％-40重量％、37重量％-40重量％、38重量％-40重量％、39重量％-40重量％。
在一种实施方式中，酶水解液化步骤结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高或者39重量％或更高。在一种实施方式中，酶水解的液化步骤结束时的干物质含量为5重量％-40重量％、6重量％-40重量％、7重量％-40重量％、8重量％-40重量％、9重量％-40重量％、10重量％-40重量％、11重量％-40重量％、12重量％-40重量％、13重量％-40重量％、14重量％-40重量％、15重量％-40重量％、16重量％-40重量％、17重量％-40重量％、18重量％-40重量％、19重量％-40重量％、20重量％-40重量％、21重量％-40重量％、22重量％-40重量％、23重量％-40重量％、24重量％-40重量％、25重量％-40重量％、26重量％-40重量％、27重量％-40重量％、28重量％-40重量％、29重量％-40重量％、30重量％-40重量％、31重量％-40重量％、32重量％-40重量％、33重量％-40重量％、34重量％-40重量％、35重量％-40重量％、36重量％-40重量％、37重量％-40重量％、38重量％-40重量％、39重量％-40重量％。
在一种实施方式中，酶水解的糖化步骤结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高或者39重量％或更高。在一种实施方式中，酶水解的糖化步骤结束时的干物质含量为5重量％-40重量％、6重量％-40重量％、7重量％-40重量％、8重量％-40重量％、9重量％-40重量％、10重量％-40重量％、11重量％-40重量％、12重量％-40重量％、13重量％-40重量％、14重量％-40重量％、15重量％-40重量％、16重量％-40重量％、17重量％-40重量％、18重量％-40重量％、19重量％-40重量％、20重量％-40重量％、21重量％-40重量％、22重量％-40重量％、23重量％-40重量％、24重量％-40重量％、25重量％-40重量％、26重量％-40重量％、27重量％-40重量％、28重量％-40重量％、29重量％-40重量％、30重量％-40重量％、31重量％-40重量％、32重量％-40重量％、33重量％-40重量％、34重量％-40重量％、35重量％-40重量％、36重量％-40重量％、37重量％-40重量％、38重量％-40重量％、39重量％-40重量％。
在一种实施方式中，总酶水解时间为10小时或更长、12小时或更长、14小时或更长、16小时或更长、18小时或更长、20小时或更长、30小时或更长、40小时或更长、50小时或更长、60小时或更长、70小时或更长、80小时或更长、90小时或更长、100小时或更长、110小时或更长、120小时或更长、130小时或更长、140小时或更长、150小时或更长、160小时或更长、170小时或更长、180小时或更长、190小时或更长、200小时或更长。
在一种实施方式中，总酶水解时间为10-300小时、16-275小时、优选20-250小时、更优选30-200小时、最优选40-150小时。
用于酶水解的一个或多个水解反应器中纤维素底物的粘度保持在10cP至4000cP之间、10cP至2000cP之间、优选10cP至1000cP之间。可以利用Brookfield DV III流变仪在用于水解的温度下测定粘度。
在一种实施方式中，在酶水解期间添加氧。在一种实施方式中，在酶水解的至少部分期间添加氧。可以在酶水解期间连续或不连续地添加氧。在一种实施方式中，在酶水解期间添加氧一次或多次。在一种实施方式中，可以在酶水解之前、在将纤维素底物添加到用于酶水解的水解反应器期间、在将酶添加到用于酶水解的水解反应器期间、在酶水解的一部分期间、在整个酶水解期间或其任何组合添加氧。将氧添加到酶水解中使用的一个或多个水解反应器中。
氧可以以几种形式添加。例如，氧可以作为氧气、富氧气体例如富氧空气或空气添加。氧也可以通过原位氧生成来添加。
如何添加氧的实例包括但不限于通过喷射、电解添加氧，化学添加氧，从顶部填充酶水解中使用的一个或多个水解反应器(将水解物投入罐中，从而将氧引入到水解物)和向所述一个或多个水解反应器的顶部空间添加氧。将氧添加到水解反应器的顶部空间时，可以供应水解反应所需的充足氧。通常，可以控制和/或改变添加到水解反应器中的氧的量。通过仅在所述水解反应器中的部分水解时间期间添加氧来限制供应的氧是可行的。另一种选择是通过例如使用空气和循环空气(离开水解反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气来添加低浓度的氧。可以通过在更长的水解时间段期间添加氧、通过添加更高浓度的氧或通过添加更多的空气来增加添加的氧的量。控制氧浓度的另一种方法是添加耗氧物和/或产氧物。可以将氧引入例如吹入纤维素底物的液体水解反应器内容物中。也可以将其吹入水解反应器的顶部空间。
在一种实施方式中，在将纤维素底物和/或预处理的纤维素底物添加到酶水解中使用的一个或多个水解反应器之前和/或期间和/或之后，将氧添加到所述一个或多个水解反应器中。氧可以与进入水解反应器的木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料一起引入。氧可被引入将进入水解反应器的材料流中，或者与经过水解反应器外环的部分水解反应器内容物一起被引入。
在一种实施方式中，酶水解中使用的水解反应器的体积为至少1m3。优选地，所述容器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3。通常，水解反应器小于3000m3或5000m3。在酶水解中使用几个水解反应器的情况下，它们可以具有相同的体积，也可以具有不同的体积。在酶水解包括分开的液化步骤和糖化步骤的情况下，用于液化步骤的水解反应器和用于糖化步骤的水解反应器可以具有相同的体积，也可以具有不同的体积。
本发明还涉及由纤维素底物生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据本发明的生产发酵产物的方法(参见上文)，和
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入纤维素底物中以降解纤维素底物，和
c)通过发酵微生物发酵降解的纤维素底物以获得发酵产物。
上文关于生产发酵产物的方法所述的所有特征和实施方式以及上文关于降解纤维素底物的方法所述的所有特征和实施方式也适用于从纤维素底物生产发酵产物的方法。
在一种实施方式中，酶水解和发酵可以是分开的步骤，但也可以组合。实例包括但不限于分步水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(HHF)、分步水解和共发酵(SHCF)、混合水解和共发酵(HHCF)以及直接微生物转化(DMC)(有时也称为联合生物加工(CBP))。
在一种实施方式中，在发酵降解的纤维素底物的步骤中使用的反应器的体积为至少1m3。优选地，反应器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3、至少3000m3、至少3500m3、至少4000m3、至少4500m3。通常，反应器小于5000m3。
在一种实施方式中，发酵步骤在一个或多个反应器中进行。发酵可以在与进行酶水解的反应器相同的反应器中进行。
在一种实施方式中，发酵是这样的步骤，其中发酵微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或其可通过经修饰的宿主细胞对其进行生产。在后者的情况下，经修饰宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一个优选的方法中，经修饰宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxic growth)。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰宿主细胞生长所需的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域众所周知。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此再产生NAD+。因而，在一个优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产出。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。
在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被氧从气体至液体的转化所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选地至少6mmol/L/h，甚至更优选地至少7mmol/L/h。
发酵方法优选地在对经修饰细胞而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃、优选地38℃或更低的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度下并在高于20℃、22℃或25℃的温度下进行。在一种实施方式中，醇发酵步骤和有机酸发酵步骤在25℃至35℃之间进行。
在本发明的一个实施方式中，利用发酵微生物进行发酵。在一种实施方式中，发酵微生物是产醇的微生物。在一种实施方式中，在一个或多个反应器中进行发酵。在一种实施方式中，产醇的微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，其还能够发酵至少一种C6糖。产醇的微生物可以是原核生物或真核生物。所述方法中使用的微生物可以是经遗传改造的微生物。合适的产醇生物体的实例有酵母，例如Saccharomyces例如Saccharomycescerevisiae，Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum，Hansenula，Issatchenkia例如Issatchenkia orientalis，Pichia例如Pichia stipites或Pichiapastoris，Kluyveromyces例如Kluyveromyces fagilis，Candida例如Candidapseudotropicalis或Candida acidothermophilum，Pachysolen例如Pachysolentannophilus；或细菌，例如Lactobacillus例如Lactobacillus lactis，Geobacillus，Zymomonas例如Zymomonas mobilis，Clostridium例如Clostridium phytofermentans，Escherichia例如E.coli，Klebsiella例如Klebsiella oxytoca。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTM AFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSM Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)和SUPERSTARTTM以及THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。在一种实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一种实施方式中，所述酵母属于Saccharomyces属，优选Saccharomyces cerevisiae种。根据本发明的方法中使用的酵母例如Saccharomyces cerevisiae能够转化己糖(C6)和戊糖(C5)。根据本发明的方法中使用的酵母例如Saccharomyces cerevisiae能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除了厌氧发酵葡萄糖之外，酵母能够利用L-阿拉伯糖和木糖。在一种实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化成期望的发酵产物，例如转化成乙醇。能够由L-阿拉伯糖产生乙醇的生物体(例如Saccharomyces cerevisiae菌株)可通过修饰宿主酵母引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖二草酸酯)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。可将这些基因引入宿主细胞中以使所述宿主细胞能够利用阿拉伯糖。WO2003/095627中描述了这种方法。来自Lactobacillusplantarum的araA、araB和araD基因可以使用并公开在WO2008/041840中。来自Bacillussubtilis的araA基因以及来自Escherichia coli的araB和araD基因可以使用并公开在EP1499708中。在另一种实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella属中的至少一种，特别是Clavibacter michiganensis、Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的一种，如WO 2009011591中所公开的那样。在一种实施方式中，酵母还可以包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可以包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例有引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许通过细胞中戊糖磷酸途径的通量增加。遗传工程酵母的实例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适商业酵母的实例有RN1016，其是来自荷兰DSM的发酵木糖和葡萄糖的Saccharomyces cerevisiae菌株。
在一种实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下，更优选地所述方法是需氧的和在限氧条件下。限氧条件已在本文上文定义过。
乙醇体积生产率优选地为至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。方法中基于L-阿拉伯糖和任选的木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任选的木糖，理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
替代上述发酵方法，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产率、乙醇产率)。
在另一种实施方式中，发酵微生物是产有机酸的微生物。在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行发酵。产有机酸的微生物可以是原核生物或真核生物。所述方法中使用的微生物可以是经遗传改造的微生物。合适的产有机酸的生物体的实例有酵母，例如Saccharomyces，例如Saccharomyces cerevisiae；真菌，例如Aspergillus菌株，例如Aspergillus niger和Aspergillus fumigatus，Byssochlamys nivea，Lentinus degener，Paecilomyces varioti和Penicillium viniferum；和细菌，例如Anaerobiospirillumsucciniciproducens，Actinobacillus succinogenes，Mannhei succiniciproducersMBEL 55E，Escherichia coli，Propionibacterium种，Pectinatus sp.，Bacteroides sp.，例如Bacteroides amylophilus，Ruminococcus flavefaciens，Prevotella ruminicola，Succcinimonas amylolytica，Succinivibrio dextrinisolvens，Wolinellasuccinogenes和Cytophaga succinicans。在一种实施方式中，能够发酵至少一种C6糖的产有机酸的微生物是酵母。在一种实施方式中，所述酵母属于Saccharomyces属，优选Saccharomyces cerevisiae。根据本发明的有机酸的生产方法中使用的酵母例如Saccharomyces cerevisiae能够转化己糖(C6)糖。根据本发明的有机酸的生产方法中使用的酵母例如Saccharomyces cerevisiae能够厌氧发酵至少一种C6糖。
可通过根据本发明的从纤维素底物生产发酵产物的方法生产的发酵产物可以是源自发酵的任何物质。它们包括但不限于醇类(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃类(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃类(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃类(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶。在一种优选的实施方式中，有机酸是琥珀酸且/或醇是乙醇。
根据本发明的方法可以包括回收在该方法期间产生的所有种类的产物，包括发酵产物如乙醇和琥珀酸。可以以本领域技术人员已知的方式将发酵产物与发酵液分离。回收技术的实例包括但不限于色谱法、电泳程序、差异溶解度、蒸馏或提取。因此，对于每种发酵产物，本领域技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。
本发明还涉及一个接种物生物反应器用于向至少两个生产生物反应器供应真菌细胞的用途，优选涉及一个接种物生物反应器用于向两个生产生物反应器供应真菌细胞的用途。如上所述的所有特征和实施方式也适用于一个接种物生物反应器用于向(至少)两个生产生物反应器供应真菌细胞的用途。在一种实施方式中，接种物生物反应器向两个生产生物反应器、三个生产生物反应器、四个生产生物反应器或甚至五个生产生物反应器供应真菌细胞。
本发明还涉及包含一个接种物生物反应器的工厂，所述接种物生物反应器与至少两个生产生物反应器偶联，优选涉及包含一个接种物生物反应器的工厂，所述接种物生物反应器与两个生产生物反应器偶联。如上所述的所有特征和实施方式也适用于包含一个接种物生物反应器的工厂，所述接种物生物反应器与(至少)两个生产生物反应器偶联。在一种实施方式中，接种物生物反应器与两个生产生物反应器、三个生产生物反应器、四个生产生物反应器或甚至五个生产生物反应器偶联。
实施例
实施例1
车间(plant)的酶生产率与CAPEX，其中通过单个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积(gross volume)与生产生物反应器的毛体积的比率为4.2％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。两个生产生物反应器通过单个接种物训练接种。
接种物训练的第一步是0.8kg的预培养物，其在毛体积为2升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种4*1ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种87kg的第二预培养物，其在毛体积为140升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为5m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有3吨培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加为34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间(turn around time)。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从64吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的3吨接种物接种64吨培养基，提供生产培养中0.22g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为21.9小时。这导致生产培养的总持续时间为146小时。
每146小时，接种物训练需要接种两个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间在内的两个接种物培养循环。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/146小时，相当于1.10*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为5m3/120m3*100％＝4.2％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(5m3/120m3)0.5＝0.20*X欧元。因此，组合的接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+0.20*X＝2.20*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.10*106U/h/(2.20*X)欧元＝0.50*106/X U/h/欧元。
实施例2
车间的酶生产率与CAPEX，其中通过单个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为2％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。两个生产生物反应器通过单个接种物训练接种。
接种物训练的第一步是0.4kg的预培养物，其在毛体积为1升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种2*1ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种42kg的第二预培养物，其在毛体积为68升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为2.4m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有1.45吨培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加为34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从65.6吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的1.45吨接种物接种65.6吨培养基，提供生产培养中0.11g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为26.8小时。这导致生产培养的总持续时间为151小时。
每151小时，接种物训练需要接种两个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间在内的两个接种物培养循环。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/151小时，相当于1.06*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为2.4m3/120m3*100％＝2.0％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(2.4m3/120m3)0.5＝0.14*X欧元。因此，组合的接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+0.14*X＝2.14*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.06*106U/h/(2.14*X)欧元＝0.50*106/X U/h/欧元。该比率是实施例1中计算的相同比率的99.6％。
实施例3
车间的酶生产率与CAPEX，其中通过单个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为8％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。两个生产生物反应器通过单个接种物训练接种。
接种物训练的第一步是1.6kg的预培养物，其在毛体积为4升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种8*1ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种167kg的第二预培养物，其在毛体积为268升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为9.6m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有5.75吨培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加到34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从61.3吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的5.75吨接种物接种61.3吨培养基，提供生产培养中0.43g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为17.6小时。这导致生产培养的总持续时间为142小时。
每142小时，接种物训练需要接种两个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间在内的两个接种物培养循环。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/142小时，相当于1.13*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为9.6m3/120m3*100％＝8.0％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(9.6m3/120m3)0.5＝0.28*X欧元。因此，组合的接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+0.28*X＝2.28*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.13*106U/h/(2.28*X)欧元＝0.50*106/X U/h/欧元。该比率是实施例1中计算的相同比率的99.5％。
实施例4
车间的酶生产率与CAPEX，其中通过单个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为0.5％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。两个生产生物反应器通过单个接种物训练接种。
接种物训练的第一步是0.1kg的预培养物，其在毛体积为0.3升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种0.5ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种10kg的第二预培养物，其在毛体积为15升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为0.55m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有330kg培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加为34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从66.7吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的330kg接种物接种66.7吨培养基，提供生产培养中0.025g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为36.6小时。这导致生产培养的总持续时间为161小时。
每161小时，接种物训练需要接种两个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间在内的两个接种物培养循环。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/161小时，相当于1.00*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为0.55m3/120m3*100％＝0.5％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(0.55m3/120m3)0.5＝0.07*X欧元。因此，组合的接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+0.07*X＝2.07*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.00*106U/h/(2.07*X)欧元＝0.48*106/X U/h/欧元。该比率是实施例1中计算的相同比率的96.8％。
实施例5
车间的酶生产率与CAPEX，其中通过单个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为20％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。两个生产生物反应器通过单个接种物训练接种。
接种物训练的第一步是3.8kg的预培养物，其在毛体积为8升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种19*1ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种418kg的第二预培养物，其在毛体积为672升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为24m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有14.4吨培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加为34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从52.6吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的14.4吨接种物接种52.6吨培养基，提供生产培养中1.07g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为11.5小时。这导致生产培养的总持续时间为135小时。
每135小时，接种物训练需要接种两个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间在内的两个接种物培养循环。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/136小时，相当于1.18*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为24m3/120m3*100％＝20％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(24m3/120m3)0.5＝0.45*X欧元。因此，组合的接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+0.45*X＝2.45*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.18*106U/h/(2.45*X)欧元＝0.48*106/X U/h/欧元。该比率是实施例1中计算的相同比率的97.0％。
实施例6
车间的酶生产率与CAPEX，其中通过2个接种物训练接种两个生产生物反应器，其中接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为4.2％
发酵性酶生产车间具有两个生产生物反应器，所述生产生物反应器以补料分批模式操作并且各自具有120m3的毛体积。生产生物反应器通过两个接种物训练接种。
每个接种物训练的第一步是0.8kg的预培养物，其在毛体积为2升的生物反应器中以分批工艺进行，并接种4*1ml的生产微生物工作细胞库。第一预培养物被用于接种87kg的第二预培养物，其在毛体积为140升的生物反应器中以分批工艺进行。该第二预培养物被用于接种接种物生物反应器。
接种物培养是分批工艺，在毛体积为5m3的接种物生物反应器中进行，在接种第二预培养物后含有3吨培养液。接种物生物反应器中的初始生物质浓度为0.15g/kg干物质。在分批培养的指数生长期间，微生物达到0.15h-1的最大生长速率。在接种物发酵结束时，生物质浓度达到5g/kg的值。这表示在该阶段期间生物质浓度增加为34.5倍。在最大生长速率下，这需要23.6小时。
生产培养的持续时间等于分批阶段的持续时间加上100小时的进料阶段加上发酵结束时24小时的周转时间。在周转时间期间，将发酵罐排空，清洁，用新鲜培养基填充并灭菌。生产培养从64吨分批培养基开始。分批阶段用于将生产生物反应器中的生物质浓度从接种后的初始浓度增加至6g/kg干物质。
在生产培养中用含有5g/kg生物质的3吨接种物接种64吨培养基，提供生产培养中0.22g/kg干物质的初始生物质浓度。将生物质浓度增加至6g/kg所需的分批阶段持续时间为21.9小时。这导致生产培养的总持续时间为146小时。
每146小时，接种物训练需要接种单个生产生物反应器。如前所述，接种物培养需要23.6小时。考虑到接种物生物反应器的24小时周转时间，可以在生产培养的持续时间内容易地完成包括周转时间的一个接种物培养循环。实际上，每个接种物训练大部分时间都处于空闲状态。
在主培养结束时，发酵液的重量达到80吨，最终产品酶的浓度为1U/g(或1*106U/吨)，其中U被定义为任意量的每个时间单位酶转化的酶底物。发酵车间的生产率被定义为单位时间生产的酶产物的量。在该实施例中，车间生产2个发酵罐*80吨*1*106U/吨/146小时，相当于1.10*106U/h。
在该实施例中，接种物生物反应器的毛体积与生产生物反应器的毛体积的比率为5m3/120m3*100％＝4.2％。车间的单一生产生物反应器所需的资本被设定为任意量的X欧元。在建造车间期间，确定生物反应器(包括辅助设备和装置)所需的资本随生物反应器的毛体积以0.5次幂扩增。因此，接种物生物反应器所需的资本可被计算为X*(5m3/120m3)0.5＝0.20*X欧元。因此，组合的2种接种物加上车间的两个生产生物反应器所需的资本等于2*X+2*0.20*X＝2.41*X欧元。
酶生产率与该发酵车间的接种物和生产生物反应器所需的资本之比等于1.10*106U/h/(2.41*X)欧元＝0.46*106/X U/h/欧元。该比率是实施例1中计算的相同比率的91.5％。

Claims (12)

1.一种生产酶或酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的真菌接种物，
b)将所述接种物转移到两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种，
c)在所述第一生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述酶或酶组合物，
d)排空所述两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第二生产生物反应器用于新的生产发酵，
e)在步骤(b)之后，但在步骤(d)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物，
f)将所述第二接种物转移到所述两个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种，
g)在所述第二生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述酶或酶组合物，
h)排空所述两个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第一生产生物反应器用于新的生产发酵，
i)在步骤(f)之后，但在步骤(h)完成之前，重复至少步骤(a)-(e)，
其中所述第一生产生物反应器、第二生产生物反应器和/或第三生产生物反应器的毛容器体积为20000升至300000升，所述接种物生物反应器的毛容器体积为300升至15000升，且所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第一生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％，和/或所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第二生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％，和/或所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第三生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％。
2.一种生产酶或酶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的真菌接种物，
b)将所述接种物转移到三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已准备好用于接种，
c)在所述第一生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述酶或酶组合物，
d)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第二生产生物反应器用于新的生产发酵，
e)在步骤(b)之后，但在步骤(d)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第二真菌接种物，
f)将所述第二接种物转移到所述三个或更多个生产生物反应器中的第二生产生物反应器，所述第二生产生物反应器已准备好用于接种，
g)在所述第二生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述酶或酶组合物，
h)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第三生产生物反应器用于新的生产发酵，
i)在步骤(f)之后，但在步骤(h)完成之前，在所述接种物生物反应器中制备包含真菌细胞的第三真菌接种物，
j)将所述第三接种物转移到所述三个或更多个生产生物反应器中的第三生产生物反应器，所述第三生产生物反应器已准备好用于接种，
k)在所述第三生产生物反应器中培养所述真菌细胞以生产所述酶或酶组合物，
l)排空所述三个或更多个生产生物反应器中的第一生产生物反应器，所述第一生产生物反应器已达到发酵结束，并准备所述第一生产生物反应器用于新的生产发酵，
m)在步骤(j)之后，但在步骤(1)完成之前，重复至少步骤(a)-(e)，
其中所述第一生产生物反应器、第二生产生物反应器和/或第三生产生物反应器的毛容器体积为20000升至300000升，所述接种物生物反应器的毛容器体积为300升至15000升，且所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第一生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％，和/或所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第二生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％，和/或所述接种物生物反应器的毛容器体积与所述第三生产生物反应器的毛容器体积的比率为2％至8％。
3.根据权利要求1或3所述的方法，其中
-步骤(c)和步骤(g)中产生的酶或酶组合物是相同的，和/或
-步骤(c)、步骤(g)和步骤(k)中产生的酶或酶组合物是相同的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述真菌是丝状真菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一生产生物反应器、第二生产生物反应器和/或第三生产生物反应器具有相同的毛容器体积。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中
-步骤(a)和/或步骤(e)和/或步骤(i)以分批模式进行，和/或
-步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)以补料分批模式进行。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物储存在储罐中。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(e)和/或步骤(i)进行1小时至60小时，和/或，其中步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)进行10小时至300小时。
9.一种降解纤维素底物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据权利要求1至8中任一项所述的方法，和
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入所述纤维素底物中以降解所述纤维素底物。
10.一种由纤维素底物生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据权利要求1至8中任一项所述的方法，
b)将步骤(c)和/或步骤(g)和/或步骤(k)中产生的酶或酶组合物加入所述纤维素底物中以降解所述纤维素底物，和
a)通过发酵微生物发酵降解的纤维素底物以获得所述发酵产物。
11.一个接种物生物反应器用于向两个生产生物反应器供应真菌细胞的用途。
12.一种工厂，所述工厂包含一个接种物生物反应器，所述接种物生物反应器为两个生产生物反应器提供接种物。
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