CN102482680B - 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。

Description

具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
涉及生物材料的保藏
本申请包含对于生物材料保藏的引用，所述保藏通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有木聚糖酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。
相关领域描述
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶顺序地从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。
在本领域中，有通过补充其他酶以增加效力而改善纤维素分解蛋白质组合物，和提供划算的供降解木素纤维素的酶溶液的需要。
本发明提供了具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。
发明概述
本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：
(a)多肽，与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列中所含有的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；和
(f)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有木聚糖酶活性的片段。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞；和产生和使用所述多肽的方法。
本发明还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至23，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至23组成，其可操作地连接于编码蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。
附图简述
图1A和1B显示青霉属菌种(Penicillium sp.)木聚糖酶基因的基因组DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。
图2显示pMMar31的限制图谱。
图3显示pMMar26的限制图谱。
图4显示pMMai180的限制图谱。
图5显示pMMai182的限制图谱。
图6显示了嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)Cel6A纤维二糖水解酶(重组的和天然的)和青霉属菌种木聚糖酶的作用，即通过表达融合物的里氏木霉的发酵液对PCS(5％w/v)进行72小时水解，其中所述融合物是具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽和米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶的融合物。制备下述混合物，即用每种酶替代里氏木霉纤维素分解酶制备物的20％(以蛋白质计)。虚线显示通过每g纤维素2mg里氏木霉纤维素分解酶制备物所得的百分比转化率。在等同的蛋白质加载量下，达到超过虚线的百分比转化率的混合物表明水解的增强。显示了来自三次重复测量的误差棒。
图7显示了表达融合物的里氏木霉发酵液对PCS(5％w/v)的72小时水解的协同性增强，其中所述融合物是具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉β-葡糖苷酶的融合物，其中该增强是通过嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(重组的和天然的)和青霉属菌种木聚糖酶的混合物进行的。制备下述混合物，即用嗜热毁丝霉Cel6A和青霉属菌种木聚糖酶的50∶50混合物替代里氏木霉纤维素分解酶制备物的20％(以蛋白质计)。虚线显示通过每g纤维素2mg里氏木霉纤维素分解酶制备物所得的百分比转化率。在等同的蛋白质加载量下，达到超过虚线的百分比转化率的混合物表明水解的增强。显示了来自三次重复测量的误差棒。
定义
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷连接的内水解的1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme，Wicklow，Ireland)和0.2％AZCL-木聚糖(Megazyme，Wicklow，Ireland)作为底物在50℃在0.01％Triton X-100和50mM乙酸钠缓冲液pH 5中进行确定的。反应是通过将木聚糖酶(0.01mg/ml终浓度)添加至0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖或0.2％AZCL-木聚糖并在50℃温育10分钟来起始的。在温育之后，将反应物以1900 x g离心。使用SPECTRAMAXMicroplate Reader(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测量上清在590nm处的吸光度。在590nm处吸光度的增加表明木聚糖酶活性的存在。
本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的木聚糖酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％。
纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性”意指水解纤维素材料的生物学活性。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlook for cellulase improvement：Screening and selection strategies，2006，Biotechnology Advances 24：452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose，1987，Measurement ofcellulase activities，Pure Appl.Chem.59：257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较的增加来确定：1-20mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中纤维素在50-65℃进行3-7日。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50-65℃，72小时，通过AMINEXHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1，4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等，2006，Biotechnology Advances 24：452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法，在pH 5，40℃，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulosedegradation：New insight into the function of cellobiohydrolases，Trends inBiotechnology 15：160-167；Teeri等，1998，Trichoderma reesei cellobiohydrolases：why so efficient on crystalline cellulose？，Biochem.Soc.Trans.26：173-178)。就本发明而言，根据van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156和van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288描述的方法在pH 5，40℃使用荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷来测定纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum：production，purification and some biochemical properties，J.BasicMicrobiol.42：55-66描述的基本方法确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在40℃，pH 5，在含有0.01％TWEEN20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”意指由GH61多肽催化的增强具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的生物学活性。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50-65℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的CELLUCLAST1.5L(Novozymes A/S，Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解程度所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat B.，和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases，Biochem.J.316：695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。
家族10糖苷水解酶：术语“家族10糖苷水解酶”或“家族GH10”或“GH10”在本文中定义为根据Henrissat B.，1991(见上)和Bairoch A.，1996(见上)属于糖苷水解酶家族10的多肽。
木聚糖降解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。木聚糖分解酶测定法中的最近进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard，Recent progress in theassays of xylanolytic enzymes，2006，Journal of the Science of Food andAgriculture 86(11)：1636-1647；Spanikova和Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune，FEBS Letters580(19)：4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely和Kubicek，1997，The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctionalbeta-D-xylan xylohydrolase，Biochemical Journal 321：375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity，Journal ofBiotechnology 23(3)：257-270中所述。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，MO，USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever，1972，A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01％TWEEN20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0.01％TWEENTM 20的50mM乙酸钠pH 5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶活性等于能够在pH 5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase activity)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries，1998，J.Bacteriol.180：243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘性小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland，Ltd.，Bray，Co.Wicklow，Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过AMINEXHPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
纤维素材料：纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，pp.105-118，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics，于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，T.Scheper主编，Volume 65，pp.23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接木糖残基骨架的植物细胞壁多肽的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖骨架、具有短糖链分支的杂聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多种寡糖，包括D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖。木聚糖类型的多糖可分为同木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖(complex heteroxylan)。参见例如Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186：1-67。
在本发明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
分离的多肽：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然联系的至少一种组分移去的多肽或多核苷酸。举例而言，多肽如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1％纯，例如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯，和至少90％纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1％纯，例如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯，至少90％纯，和至少95％纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO：2的氨基酸1至23是信号肽的SignalP软件(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，成熟多肽是SEQ IDNO：2的氨基酸24至403。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO：1的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP软件(Nielsen等，1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸70至1384。在另一个方面，所述成熟多肽编码序列是包含于SEQ ID NO：1的核苷酸70至1384中的cDNA序列。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends Genet.16：276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有木聚糖酶活性。在一个方面，片段含有至少340个氨基酸残基，例如至少360个氨基酸残基和至少380个氨基酸残基。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有木聚糖酶活性的片段。在一个方面，亚序列含有至少1020个核苷酸，例如至少1080个核苷酸和至少1140个核苷酸。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(几种)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段的的单链或双链的核酸分子。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。
变体：术语“变体”抑制具有木聚糖酶活性的多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置的取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用另一个氨基酸取代占据位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
发明详述
具有木聚糖酶活性的多肽
本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：
(a)多肽，与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多肽具有木聚糖酶活性的片段。
本发明涉及分离的多肽，所述分离的多肽具有与SEQ ID NO：2的成熟多肽至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性程度，所述多肽具有木聚糖酶活性。在一个优选的方面，所述多肽与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸，相差四个氨基酸，相差三个氨基酸，相差两个氨基酸，和相差一个氨基酸。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体组成；或为其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽，或由SEQ IDNO：2的成熟多肽组成。在另一个优选方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸24至403，或由SEQ ID NO：2的氨基酸24至403组成。
本发明还涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。
SEQ ID NO：1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有木聚糖酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸70至1384。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸，或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO：1或其cDNA序列。在另一个方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50266中的质粒pMMar26中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一个方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50266中的质粒pMMar26中含有的成熟多肽编码区。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS至少在45℃(非常低严格性)，至少在50℃(低严格性)，至少在55℃(中严格性)，至少在60℃(中-高严格性)，至少在65℃(高严格性)，至少在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
本发明还涉及由多核苷酸编码的具有木聚糖酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如选至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。
本发明还涉及SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质：使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的木聚糖酶活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochemistry 30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9。
所述多肽可为杂合多肽，其中一种多肽的一部分融合于另一种多肽的一部分的N端或C端。
所述多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等，1993，EMBO J.12：2575-2583；Dawson等，1994，Science 266：776-779)。
融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381；Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987；Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48中的位点。
具有木聚糖酶活性的多肽的来源
本发明的具有木聚糖酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。
所述多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有木聚糖酶活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)属多肽。
在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
所述多肽也可以是真菌多肽。例如，所述多肽可为酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Penicillium ulaiense、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在一个更优选的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的青霉属菌种多肽，例如包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从青霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
本发明还涉及包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性程度，其编码具有木聚糖酶活性的多肽。
修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO：1的多肽编码序列或其cDNA序列存在的多核苷酸，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expressionand Purification 2：95-107。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常高的严格条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。
在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或大肠杆菌NRRL B-50266中所含的质粒PMMar26中包含的序列，或编码SEQ ID NO：2具有木聚糖酶活性的片段的SEQ ID NO：1亚序列，如SEQ ID NO：1核苷酸70至1384的多核苷酸，或者由SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，或大肠杆菌NRRL B-50266中所含的质粒PMMar26中包含的序列，或编码SEQ ID NO：2具有木聚糖酶活性的片段的SEQ ID NO：1亚序列，如SEQ ID NO：1核苷酸70至1384的多核苷酸组成。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins fromrecombinant bacteria″于Gilbert等，1980，Scientific American，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.15：5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶、启动子TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或 毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Res.15：9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳酸菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上文)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，AcademicPress，Inc.，New York；Ito等，1983，J.Bacteriol.153：163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1920。
产生方法
本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是青霉属的细胞。
本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。
多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和LarsRyden编，VCH Publishers，New York，1989)。
在一个可选的方面，不回收多肽，而将表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有所述多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。
表达多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant Cell Physiol.39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，J.of Plant Physiol.152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant Cell Physiol.39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Mol.Biol.26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Mol.Gen.genet.248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Mol.Biol.22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽的多核苷酸之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Mol.Biol.19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant J.2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opin.Biotech.5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Mol.Biol.21：415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括那些描述于美国专利6,395,966和7,151,204的那些(两者均通过全文提述并入本文)。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了直接用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码的多肽的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后裔(progeny)。如用于本文，后裔可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后代(offspring)。此种后裔可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。
植物可通过回交转化方法生成。举例而言，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后裔中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后裔。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
去除或减少木聚糖酶活性
本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。
可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除多核苷酸的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述多核苷酸是失活的。待修饰或失活的多核苷酸可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响多核苷酸表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。
通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件可以实现所述多核苷酸的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少多核苷酸表达的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标记，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。
本发明还涉及在细胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽的表达的方法，包括施于细胞或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
所述dsRNA优选为小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是供抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面，所述dsRNA是供抑制翻译的微RNA(miRNA)。
本发明还涉及这样的双链RNA(dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不限于任何具体的作用机制，但dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称作RNA干扰(RNAi)的过程被选择性降解。
本发明的dsRNA可用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA的方法。该过程可在体外、离体或体内实施。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能缺失(loss-of-function)的突变。用于制备和使用dsRNA分子以选择性降解RNA的方法在本领域是公知的；参见，例如美国专利Nos.6,489,127、6,506,559、6,511,824和6,515,109号。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的多核苷酸或其调控序列的破坏或缺失，或沉默的编码该多肽的基因，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。
多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”意指对宿主细胞不是天然的多肽，例如天然蛋白质变体。宿主细胞可包含多于一个拷贝的编码天然或异源多肽的多核苷酸。
用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
本发明用于产生基本上无木聚糖酶活性的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。木聚糖酶-缺陷细胞也可以用于表达在制药上感兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。
在一个另外的方面，本发明涉及基本上无木聚糖酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。
组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的木聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。
所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
可以依照本领域内已知的方法制备组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法使多肽稳定化。
用途
本发明还涉及使用具有木聚糖酶活性的多肽或其组合物的方法。本发明的多肽可用于降解或转化植物细胞壁或任何含木聚糖材料，例如木素纤维素，其来源于植物细胞壁(参见，例如WO2002/18561)。多种用途的实例如下所述。本发明的多肽的剂量和使用所述多肽的其他条件可基于本领域已知方法来确定。
完全或部分去除侧链(side branch)促进含木聚糖材料的酶法降解。本发明的多肽优选与其他木聚糖降解酶如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其组合在其中待降解含木聚糖材料的工艺中一同使用。举例而言，可通过乙酰木聚糖酯酶去除乙酰基团；通过α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基团；通过阿魏酸酯酶去除阿魏酰基团和通过α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基团。由木聚糖酶，或由木聚糖酶和侧链水解酶的组合释放的寡聚物可由β-木糖苷酶进一步降解为游离的木糖。
本发明还涉及降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：在存在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的情况下，用酶组合物处理纤维素材料或含木聚糖材料。在一个优选方面，所述方法还包括回收已降解或转化的纤维素材料或含木聚糖材料。
本发明还涉及供产生发酵产物的方法，其包括：(a)在存在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的条件下，用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料或含木聚糖材料，其中在存在具有木聚糖酶活性的多肽的条件下，用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料。在一个优选的方面，纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选的方面，方法进一步包括从发酵回收发酵产物。
本发明的方法可以用于将纤维素材料或含木聚糖材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料或含木聚糖材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料或含木聚糖材料的处理可以使用本领域的常规过程完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质处理设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料或含木聚糖材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料或含木聚糖材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversiontechnology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素或含木聚糖材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology25：33-38；Gusakov，A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.7：346-352)、研磨反应器(Ryu，S.K.，和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料和/或含木聚糖材料组分(Chandra等，2007，Substrate pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis oflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass，BioresourceTechnol.100：10-18；Mosier等，2005，Features of promising technologies forpretreatment of lignocellulosic biomass，Bioresource Technol.96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatment of lignocellulosic wastes to improveethanol and biogas production ：A review，Int.J.of Mol.Sci.9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，Pretreatment：the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol，Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2：26-40)。
纤维素材料或含木聚糖材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调节。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料或含木聚糖材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料或含木聚糖材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料或含木聚糖材料传入或经过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料或含木聚糖材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化纤维素部分水解成为单糖和寡糖。去除木质素至有限的程度。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至3％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等.，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。
在稀酸预处理中，将纤维素材料或含木聚糖材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，Bioresource Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优性5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料或含木聚糖材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料或含木聚糖材料去木质素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围内。酸与纤维素材料或含木聚糖材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1秒-60分钟的时间。
在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料或含木聚糖材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt％，并且最优性30-60wt％，如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料或含木聚糖材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料或含木聚糖材料分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。
物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB，Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。
组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料或含木聚糖材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料或含木聚糖材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料或含木聚糖材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment ofbiomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemicaland biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction，Himmel，M.E.，Baker，J.O.，和Overend，R.P.，编，ACS Symposium Series566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.，编，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料或含木聚糖材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明具有木聚糖酶活性的多肽的存在下进行。组合物的酶还可以顺序加入。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的工艺进行，其中将纤维素材料或含木聚糖材料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且最优选约40℃至约60℃，特别是约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，特别是约pH 5。干燥固体含量优选约5至约50wt％，更优选约10至约40wt％，并且最优选约20至约30wt％。
所述酶组合物优选包含具有纤维素分解活性和/或木聚糖降解活性。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)木聚糖降解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)木聚糖降解酶和一种或多种(几种)纤维素分解酶。
所述一种或多种(几种)木聚糖降解酶优选选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。所述一种或多种(几种)纤维素分解酶优选选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
在另一个优选的方面，所述酶组合物另外或甚至还包含具有纤维素分解增强活性的多肽(参见，例如WO 2005/074647、WO 2005/074656和WO 2007/089290)。在另一个方面，所述酶组合物可进一步或甚至进一步包含一种或多种(几种)其他酶活性以改善含纤维素材料的降解。其他优选的酶为半纤维素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、内切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶(glucuronoylesterases))，果胶酶，蛋白酶，木质素水解酶(ligninolytic enzyme)(例如漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、H2O2产生酶、氧化还原酶)，棒曲霉素(expansin)、膨胀素(swollenin)或其组合。在本发明的方法中，其他酶可在发酵之前或过程中添加，例如在糖化之中或在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。
所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达一种或多种(几种)酶组合物的其他组分。酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适用于本文中所述工艺的形式，如例如去除或未去除细胞的粗发酵液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
具有木聚糖酶活性的酶和多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶的混合物、含纤维素或木聚糖材料、含纤维素或木聚糖材料的浓度、含纤维素或木聚糖材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，用于同步糖化和发酵的酵母)。
在一个优选的方面，纤维素分解酶和/或木聚糖降解酶对于纤维素材料和/或含木聚糖材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料或含木聚糖材料。
在另一个优选的方面，具有木聚糖酶活性的多肽对于纤维素材料或含木聚糖材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料或含木聚糖材料。
在另一个优选的方面，具有木聚糖酶活性的多肽对于纤维素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.5g，并且最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶。
酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。
具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、Chaetomidium、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽，其具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或Trichophaea saccata多肽。
还可以使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
所述纤维素分解酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。
适用于本发明的商业的纤维素分解蛋白制备物的实例包括，例如，CELLICTMCtec(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM 188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(NovozymesA/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，ROHAMENTTM7069W( GmbH)，FIBREZYMELDI(Dyadic International，Inc.)、FIBREZYME LBR(Dyadic International，Inc.)或VISCOSTAR 150L(DyadicInternational，Inc.)。所述纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt.％，更优选固体的0.025到约4.0wt.％，且最优选固体的约0.005到约2.0wt.％的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263；GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene 63：11-22；GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249：584-591；GENBANKTM登录号Y11113)；以及里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，Molecular Microbiology 13：219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research 18：5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene 90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的示例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。
可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获取。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获取。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获取。
所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是根据WO 2008/057637获得的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。
其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities，Biochem.J.280：309-316和Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。
在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的多肽。
在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中X为任意氨基酸，X(4，5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置的任意氨基酸。
具有上述所示的基序的多肽可进一步包含：
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，
其中X为任意氨基酸，X(1，2)为在1个位置或2个连续位置的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在一个优选的方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，
其中x为任意氨基酸，x(4，5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而x(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
可用于本发明的具有纤维素分解增强活性的多肽的实例但不限于来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2005/074647)；来自桔橙热子囊菌的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2005/074656)；来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2007/089290)；和来自嗜热毁丝霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2009/085935；WO 2009/085859；WO 2009/085864；WO 2009/085868)。
适用于本发明的商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、CELLICTM Htec(Novozymes A/S)、VISCOZYME(Novozymes A/S)、ULTRAFLO(Novozymes A/S)、PULPZYMEHC(Novozymes A/S)、MULTIFECT Xylanase(Genencor Int.)、ECOPULP TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000 Xylanase(DSM)、DEPOLTM333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOLTM 740L(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOLTM 762P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉(Aspergillus niger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More GeneManipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)的营养培养基上发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料或含木聚糖材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料或含木聚糖材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料或含木聚糖材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C6和/或C5发酵生物体，或它们的组合。C6和C5发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。
可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642所述。
能发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。
能发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。
其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大肠杆菌的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。
在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production andUtilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上文)。
在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母(可从Red Star/Lesaffre，USA获得)、FALITM(可从Fleischmann’s Yeast，BurnsPhilp Food Inc.，USA的部门获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERMTM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERTSTRANDTM(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSMSpecialties获得)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation：a proof of principle，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugarsby recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolicpathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470；WO 2003/062430，xylose isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母菌种。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，如约pH 4-5、6或7。
在一个优选的方面，对降解的纤维素材料或含木聚糖材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，优选约pH 4-7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2 x 108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversity Press，United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding straegy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-VerlagBerlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.，和Jonas，R.，2002，Thebiotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-asugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journal ofMicrobiology and Biotechnology 19(6)：595-603。
在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”涵盖含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empirical modelingof batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbialbiopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，WaterScience and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass formethane production：A review。
回收 可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料或含木聚糖材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
其他用途
本发明的多肽还可与其他木聚糖水解酶的有限活性一同使用以降解木聚糖以供产生寡糖。所述寡糖可用作填料(bulking agent)，如从谷物细胞壁材料释放的阿拉伯木聚糖寡糖，或来自谷物的或多或少(more or less)经纯化的阿拉伯木聚糖。
本发明的多肽还可用于与其他木聚糖水解酶组合以将木聚糖降解为木糖和其他单糖(美国专利5,658,765号)。释放出的木糖可转化为其他化合物。
本发明的多肽可与其他酶如葡聚糖酶一同使用以促进从富油植物材料提取油，如从玉米胚提取玉米油。
本发明的多肽还可用于烘烤以改善生面团的成熟(development)、弹性和/或稳定性，和/或烘烤产品的体积、瓤结构(crumb structure)和/或防腐性(anti-staling property)(参见美国专利5,693,518号)。所述多肽还可用于制备从任何类型的面粉或粉(例如基于小麦、黑麦、大麦、燕麦或玉米的)制备的生面团或烘烤产品。用本发明的多肽产生的烘烤产品包括面包、小白面包(roll)、法国棍状面包(baquette)等。就烘烤目的，本发明的多肽可用作仅有的或主要的酶活性，或可与其他酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如葡糖氧化酶、过氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶组合使用。
本发明的多肽亦可用于修饰动物饲料并可在体外(通过修饰饲料的组分)或在体内施加其作用以改善饲料的可消化性并增加其利用效率(美国专利6,245,546号)。可将所述多肽添加至包含高量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的饲料组合物中，例如包含谷物如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米的饲料。当添加至饲料时，多肽会改善植物细胞壁材料的体内降解，这部分是由于肠粘度(intestinal viscosity)的减少(Bedford等，1993，Proceedings of the 1stSymposium on Enzymes in Animal Nutrition，pp.73-77)，由此实现动物对植物营养利用的改善。由此，改善了动物的生长速率和/或饲料转化率(即摄入的饲料的重量相对于增加的体重的比例)。
本发明的多肽还可用于造纸和纸浆工业，用于漂白工艺以增强经漂白的纸浆的亮度由此减少在漂白阶段使用的氯的量，和用于在回收纸工艺中增加纸浆的自由度(freeness)(Eriksson，1990，Wood Science and Technology 24：79-101；Paice等，1988，Biotechnol.and Bioeng.32：235-239，和Pommier等，1989，Tappi Journal 187-191)，但不限于此。对木素纤维素纸浆的处理可例如如美国专利5,658,765号、WO 93/08275、WO 91/02839和WO 92/03608中所述进行。
本发明的多肽还可用于啤酒酿造，特别是用于改善包含例如大麦和/或高粱麦芽的麦芽汁的可滤过性(filterability)(WO 2002/24926)。所述多肽可以以相同方式用作常规用于酿造的戊聚糖酶，例如，如等，1993，J.Inst.Brew.99：243-248和EP 227159所述。此外，所述多肽可用于处理酿酒干酒糟(brewersspent grain)，即包含大麦或发芽大麦或其他谷物的啤酒麦芽汁产生的残余物，从而改善所述残余物的利用，例如，用于动物饲料。
本发明的多肽还可用于分离植物细胞材料的组分，特别是谷物组分如小麦组分。最令人感兴趣的是将小麦分离为麸质(gluten)和淀粉，即有很大商业利益的组分。该分离工艺可通过本领域已知方法进行，如作为水力旋流器或倾析器工艺进行的所谓挂糊(batter)工艺(或湿法磨制工艺)。在该挂糊工艺中，起始材料是待进行分离的植物材料如小麦的稀而可泵的分散物。在小麦分离工艺中，通常从小麦粉和水制备所述分散物。
本发明的多肽还可用于制备水果或蔬菜汁以增加产率。
本发明的多肽还可用于供纺织品的酶法煮炼(scouring)系统。
本发明的多肽还可与其他酶功能性(functionality)组合用于洗衣去污剂应用。
信号肽
本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸1至23，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至23组成。所述多核苷酸还可包含编码蛋白质的基因，其可操作地连接于所述信号肽。所述蛋白质优选对于所述信号肽是外源的。
本发明还涉及包含此种多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞。
本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括：(a)培养包含此种多核苷酸的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。
所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，所述蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报道蛋白(reporter)。例如，所述蛋白质可为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
材料
作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。
菌株
将青霉属菌种NN51602用作编码具有木聚糖酶活性的多肽的家族GH10基因的来源。将黑曲霉菌株MBin120(WO 2004/090155)用于表达编码具有木聚糖酶活性的多肽的青霉属菌种的基因。将嗜热毁丝霉CBS 202.75用作对于具有纤维二糖水解酶活性的家族6多肽的基因的来源。将米曲霉JaL355菌株(WO2002/40694)用于表达编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的嗜热毁丝霉基因。
培养基
PDA平板由39克的马铃薯右旋糖琼脂和去离子水至1升组成。
YP培养基由10g的酵母提取物，20g的细菌蛋白胨，和去离子水至1升组成。
LB培养基由10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，和去离子水至1升组成。
基本培养基平板由6g NaNO3，0.52g的KCl，1.52g的KH2PO4，1ml的COVE痕量元素溶液，20g的Noble琼脂，20ml的50％葡萄糖，2.5ml的MgSO4·7H2O，20ml的0.02％生物素溶液，和去离子水至1升组成。
COVE痕量元素溶液由0.04g的Na2B4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和去离子水至1升组成。
MDU2BP培养基由45g的麦芽糖，1g的MgSO4·7H2O，1g的NaCl，2g的K2SO4，12g的KH2PO4，7g的酵母提取物，2g的尿素，0.5ml的AMG痕量金属溶液，和去离子水至1升组成；pH 5.0。
AMG痕量金属溶液由14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸，和去离子水至1升组成。
YEG培养基由每升20g的右旋糖，5g的酵母提取物，和去离子水至1升组成。
COVEA尿素-乙酰胺+平板由？组成。
实施例1：青霉属菌种的分离
青霉属菌种NN51602是在2007年7月从位于中国云南农村的稻草和牛粪的堆肥样品分离的。该菌株是在45℃温育的PDA平板上分离的。
实施例2：野生型青霉属菌种的生长
将一百ml的摇瓶培养基添加至500ml摇瓶。所述摇瓶培养基由15g的葡萄糖，4g的K2HPO4，1g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，2g的MES游离酸(free acid)，1g的细菌蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl2·2H2O，5g的NH4NO3，1ml的痕量元素溶液，和去离子水至1升组成。所述痕量元素溶液由1.2g的FeSO4·7H2O，10g的ZnSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，0.4g的Na2B4O7·10H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，和去离子水至1升组成。将摇瓶用来自青霉属菌种NN51602固体平板培养物的两个栓(plug)接种，并在45℃在定轨振荡器上以200rpm温育48小时。将五十ml 48小时摇瓶培养液用于接种2升发酵容器。
将总共1.8升发酵分批培养基添加至两升玻璃夹套发酵器(glass jacketedfermentor)(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)。所述发酵分批培养基由5g的酵母提取物，176g纤维素粉末，2g的葡萄糖，1g的NaCl，1g的细菌蛋白胨，4g的K2HPO4，0.2g的CaCl2·2H2O，0.2g的MgSO4.7H2O，2.5g的柠檬酸，5g的NH4NO3，1.8ml的消泡剂，1ml的痕量元素溶液(见上)，和去离子水至1升组成。发酵补料培养基以4g/l/hr的速率剂量添加72小时的时间。所述发酵给料培养基由水和消泡剂组成。发酵容器维持在45℃的温度，并使用Applikon 1030控制系统(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)将pH控制在5.6+/-0.1设定点(set-point)。将空气以1vvm的速率添加至容器，并通过以1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌发酵液。在发酵终止时，从容器收获全发酵液，并以3000 x g离心以去除生物质。
实施例3：从野生型青霉属菌种全发酵液纯化木聚糖酶
将在实施例2中获得的收获的发酵液在500ml瓶中以13,000 x g在4℃离心20分钟，然后使用0.22μ聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌过滤。将经过滤的发酵液浓缩，并使用配有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器(concentrator)(Pall Filtron，North Borough，MA，USA)在大约20psi与20mMTris-HCl pH 8.5缓冲液交换。为了减少色素的量，将浓缩物加载于用20mMTris-HCl pH 8.5平衡的60ml Q SEPHAROSETM Big Bead柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用含有600mM NaCl的平衡缓冲液逐步洗脱。将流过物(flow through)和洗脱物级分在8-16％CRITERIONTM SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上用GELCODEBlue Stain Reagent(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)染色来进行检查。洗脱物级分含有根据SDS-PAGE大约50kDa的蛋白质条带。
将洗脱物级分使用Amicon超滤装置(Millipore，Bedford，MA，USA；10kDa聚醚砜膜，40psi，4℃)浓缩，并脱盐(HIPREPTM 26/10脱盐柱，GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)入20mM Tris-HCl pH 8.5。将经脱盐的材料加载于用20mM Tris-HCl pH 8.5平衡的MONO QTM柱(HR 16/10，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl pH 8.5(20柱体积)中0M NaCl至600mM NaCl的盐梯度洗脱。如上所述通过8-16％SDS-PAGE凝胶检查级分，其揭示青霉属菌种木聚糖酶在大约120mM NaCl处洗脱。
汇集包含木聚糖酶的级分，并与等体积的含有3.4M硫酸铵的20mMTris-HCl pH 7.5混合以得到1.7M硫酸铵的终浓度。在将样品加载于用20mMTris-HCl pH 7.5中的1.7M硫酸铵平衡的PHENYL SUPEROSETM柱(HR 16/10，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)之前，过滤(0.2μM注射器式滤器，聚醚砜膜，Whatman，Maidstone，United Kingdom)样品以去除颗粒状物质。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl pH 7.5(15柱体积)中1.7M硫酸铵至0mM硫酸铵递减的盐梯度洗脱。如上所述通过8-16％SDS-PAGE凝胶电泳分析级分，其揭示所述青霉属菌种木聚糖酶恰好在梯度的末端洗脱(大约50mM硫酸铵)。根据SDS-PAGE判断，所述青霉属菌种木聚糖酶为＞90％纯。蛋白质浓度是使用BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)来确定的，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标样。
木聚糖酶活性是如上文所述使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖和0.2％AZCL-木聚糖作为底物确定的。纯化的青霉属菌种木聚糖酶显示针对AZCL-阿拉伯木聚糖和AZCL-木聚糖的活性。
实施例4：青霉属菌种木聚糖酶的蛋白质鉴定
用于肽测序的多肽的凝胶内消化。将MULTIPROBE II Liquid HandlingRobot(PerkinElmer Life和Analytical Sciences，Boston，MA，USA)用于进行所述凝胶内消化。将所述50kDa蛋白质凝胶条带(实施例3)用50μl的100mM碳酸氢铵，pH8.0中的10mM二硫苏糖醇(DTT)还原30分钟。在还原之后，凝胶块用50μl的100mM碳酸氢铵，pH8.0中的55mM碘乙酰胺烷基化20分钟。允许经干燥的凝胶块在25μl每μl 50mM碳酸氢铵，pH 8.0中含6ng测序级胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)的胰蛋白酶消化溶液中在室温溶胀(swell)30分钟，然后在40℃消化8小时。上述每个反应步骤之后依照生产商的标准实验方案用适当的溶液进行多次洗涤和预洗涤。将五十μl的乙腈用于在反应之间将凝胶块脱水，并在步骤之间将凝胶块风干。将肽用HPLC级水中的1％甲酸/2％乙腈提取两次30分钟。将肽提取溶液转移至96孔带缘的(skirted)PCR型平板(ABGene，Rochester，NY，USA)，所述平板已冷却至10-15℃，并用96孔板盖(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Boston，MA，USA)覆盖以防止蒸发。将平板进一步储藏于4℃直至可进行质谱分析。
蛋白质鉴定。对于通过串联质谱法进行的新形成(de novo)的肽测序，将Q-TOFMICROTM(Waters Micromass MS Technologies，Milford，MA，USA)，一种混合的正交四极飞行时间质谱仪(hybrid orthogonal quadrupole time-of-flightmass spectrometer)，用于LC/MS/MS分析。使用MASSLYNXTM软件版本4.1(Waters Micromass MS Technologies，Milford，MA，USA)完全地对所述Q-TOFMICROTM进行微处理器控制。所述Q-TOF MICROTM配置有NANOACQUITYUPLC(Waters Corp，Milford，MA，USA)以供使样品浓缩并脱盐。将样品加载至配置于注入回路(injection loop)的捕获柱(180μm ID X 20mm，5μmSYMMETRY C18，Waters Corp，Milford，MA，USA)上，并用水中的0.1％甲酸以每分钟15μl使用二元溶剂处理泵(binary solvent manager pump)洗涤1分钟。将肽在100μm ID x 100mm，C18，1.7μm，BEH130TM C18纳米流融合毛细管柱(Waters Corp，Milford，MA，USA)上以400nl每分钟的流速分离。在30分钟期间施以0.1％甲酸中1％至85％乙腈的逐步洗脱梯度。在214nm处监测柱洗脱液，并将其通过配置有纳米喷射界面(nanospray interface)的电喷射离子源导入所述Q-TOF MICROTM。
以测量扫描模式(survey scan mode)从m/z 400至1990的质量范围获取数据，其中从MS至MS/MS切换标准以包括每秒大于10.0计数的离子强度和+2、+3和+4的荷电状态(charge state)。可以以1.9秒的扫描时间和0.1秒的扫描间时间获得多至6个同时洗脱物种的分析谱。通常使用45伏特的锥电压(cone voltage)，并将碰撞能量程序设计为依照洗脱肽的质量和荷电状态变化，并为10至60伏特的范围。以自动方式合并、平滑化并中心化(combined，smoothened，and centered)获得的谱，并生成峰列表。针对选定的数据库使用PROTEINLYNX GLOBAL SERVERTM 2.3软件(Waters Micromass MSTechnologies，Milford，MA，USA)和PEAKS Studio版本4.5(SP1)(Bioinformatic Solutions Inc.，Waterloo，Ontario，Canada)检索峰列表。衡量来自PROTEINLYNX GLOBAL SERVERTM和PEAKS Studio检索的结果，并进一步通过衡量每个目标离子的MS/MS谱来分析未鉴定的蛋白质，并通过鉴定y和b离子系列和将质量差异匹配于适当的氨基酸来确定新形成的序列。
肽序列是从凝胶内消化的50kDa多肽凝胶条带的几个带多电荷的离子获得的。一个403.231m/z带两个电荷的胰蛋白酶肽离子序列确定为Ala-Asn-Gly-Gln-Met(ox)-[Ile/Leu]-Arg(SEQ ID NO：2的氨基酸97至103)。另一个442.592m/z的带两个电荷的胰蛋白酶肽离子序列确定为Asn-His-[Ile/Leu]-Thr-Asn-Val-Val-Thr-His-Tyr-Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸133至142)。另一个447.1993 m/z的带两个电荷的胰蛋白酶肽离子序列确定为[Ile/Leu]-Val-Gln-Ser-Tyr-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO：2的氨基酸215至222)。另一个458.262 m/z的带两个电荷的胰蛋白酶肽离子序列确定为Ala-Thr-Ala-Ala-Gln-Asn-[Ile/Leu]-Val-Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸206至214)。另一个663.380 m/z的带两个电荷的胰蛋白酶肽离子部分序列确定为Ser-Gly-Gly-Asp-Gln-[Ile/Leu]-Ala-Asn-[Ile/Leu]-Ala-Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸86至96)。Met(ox)为氧化的甲硫氨酸。无法区分[Ile/Leu]和[Gln/Lys]，因为其具有相同的质量。
实施例5：青霉属菌种基因组DNA提取
将青霉属菌种在37℃在PDA平板上生长至汇集。将三个4mm2方块从PDA平板上切下，接种于125ml带挡板的摇瓶中的25ml含2％葡萄糖的YP培养基，并在37℃以200rpm振荡温育2日。通过使用MIRACLOTH(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)的过滤收获菌丝体，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎为细粉，并使用DNEASY Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。
实施例6：分离来自青霉属菌种的木聚糖酶基因的部分片段
使用Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer Program(CODEHOP；Rose等，1998，Nucleic Acids Research 26：1628-1635)，基于实施例4中所述鉴定的肽片段对与相关木聚糖酶序列同源的区设计下文所示的简并引物。
引物Penuldeg220F：
5′-CAACGGCCAGATGYTNMGNTGYCAY-3′(SEQ ID NO：3)
简并引物Penuldeg220F的蛋白质翻译：
NGQMXXCH
引物Penul345R128fold：
5′-GCGCCGTASGAYTGNACSARYTT-3′(SEQ ID NO：4)
简并引物Penul345R128fold的蛋白质翻译：
KXVQSYG
为了获取所述青霉属菌种木聚糖酶基因的起始DNA片段，在45℃至65℃范围的6个不同的退火温度进行了梯度PCR(gradient PCR)。扩增反应物(25μl)由100ng的青霉属菌种基因组DNA作为模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，各50pmol的引物Penuldeg220F和primer Penul345R128fold，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer(Clontech Laboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)和1.25单位的ADVANTAGE GC Genomic Polymerase Mix(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)组成。反应使用EPPENDORF MASTERCYCLER5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行，程序如下：95℃预变性1分钟；30个循环，每个在95℃的变性温度进行30分钟；55℃+/-10℃的退火温度进行30秒(6个梯度选项)和在70℃延长1分钟；和在70℃最终延伸5分钟。
将反应产物通过TBE(每升10.8g的Tris碱，5.5g的硼酸和4ml的0.5MEDTA pH 8.0)缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。从凝胶切出来自55.8℃退火温度的大约375bp的PCR产物条带，对其使用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的指示进行纯化，并用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和引物步移来测序。获得了部分序列，其编码包含几种SEQ ID NO：4中鉴定的肽片段的肽。
实施例7：鉴定全长青霉属菌种木聚糖酶基因
使用GENOMEWALKERTM Universal Kit(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)根据生产商的指示鉴定来自青霉属菌种的全长木聚糖酶基因。简言之，将来自青霉属菌种的总基因组DNA用四种不同的产生平端的限制性酶(Dra I、Eco RV、Pvu II和Stu I)分别消化。然后将每批经消化的基因组DNA分别连接至GENOMEWALKERTM Adaptor(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)以构建四个文库。然后使用这四个文库作为模板在使用四种下文所述的基因特异性引物的PCR反应中，其中两种是用于扩增片段上游直至编码木聚糖酶N端的5’端的初级和次级PCR，而两种是用于扩增片段下游直至编码木聚糖酶C端的3’端的初级和次级PCR。下述引物是基于SEQ IDNO：6中所述的来自青霉属菌种的部分木聚糖酶序列而设计的。
N-端：
引物PenulGSP1R(初级)：
5′-GCCCTTGTAATGGGTAACGACGTTGGTGA-3′(SEQ ID NO：5)
引物PenulGSP2R(次级)：
5′-GCAAGCAGCGTCTCGTTGGTCCAGGATC-3′(SEQ ID NO：6)
C-端：
引物PenulGSP1F(初级)：
5′-GGCACCTACCGCAGCAACGTCTTCTACCA-3′(SEQ ID NO：7)
引物PenulGSP2F(次级)：
5′-ACGGCGGCGCAGAACATCGTCAAGCT-3′(SEQ ID NO：8)
初级扩增物由各1μl(大约6ng)的每种文库作为模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的Adaptor Primer 1(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol的引物PenulGSP1R或引物PenulGSP1F，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer和1.25单位的ADVANTAGE GC Genomic Polymerase Mix以最终体积25μl组成。扩增使用EPPENDORF MASTERCYCLER5333进行，程序如下：95℃预变性1分钟；7个循环，每个在95℃的变性温度进行25秒；在72℃退火和延伸5分钟；32个循环，每个在95℃的变性温度进行25秒，在67℃退火和延伸5分钟；和在67℃最终延伸7分钟。
次级扩增物由各1μl的每种初级PCR产物作为模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的Adaptor Primer 2(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol的引物PenulGSP2R或引物PenulGSP2F，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer和1.25单位的ADVANTAGE GCGenomic Polymerase Mix以最终体积25μl组成。扩增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333进行，程序如下：在95℃预变性1分钟；5个循环，每个在95℃的变性温度进行25秒；在72℃退火和延伸5分钟；20个循环，每个在95℃的变性温度进行25秒；在67℃退火和延伸5分钟；和在67℃最终延伸7分钟。
将反应产物通过TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离。从5’端PCR扩增，分析了4个产物条带：来自Dra I文库的450bp产物条带，来自Eco RV文库的1.6kb产物条带，来自Pvu II文库的1.7kb产物条带，和来自Stu I文库的550bp条带。将这4个产物条带从凝胶切出，使用QIAQUICKGel Extraction Kit依照生产商的指示纯化，并测序。从3’端PCR扩增，分析了3个产物条带：来自Dra I文库的450bp产物条带，和来自Eco RV文库的600bp和800bp产物条带。将这3个产物条带从凝胶切出，使用QIAQUICKGel Extraction Kit依照生产商的指示纯化，并测序。
PCR片段的DNA测序是用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL Automated DNA Sequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略使用供测序的Adaptor Primer 2、引物PenulGSP2R和引物PenulGSP2F进行的。
就品质细查核苷酸序列数据，并将所有序列在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下彼此比较。将PCR片段序列结果与如实施例6中所述获得的来自青霉属菌种的部分木聚糖酶基因序列进行比较和比对。基于此处和实施例6中获得的基因片段构建基因模型，允许用其他同源的木聚糖酶确定该基因的5’和3’端。
实施例8：克隆青霉属菌种木聚糖酶基因和构建黑曲霉表达载体
设计下文所示的两个合成的寡核苷酸以从实施例5中制备的基因组DNA来PCR扩增青霉属菌种木聚糖酶基因。使用IN-FUSIONTM Cloning Kit(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)将所述片段直接克隆入表达载体pBM120a(WO 2006/078256)。
PenulxylNCO1F：
5′-ACACAACTGGCC-3′(SEQID NO：9)
PenulxylPACIR：
5′-CAGTCACCTCTAGTTA-3′(SEQ ID NO：10)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pBM120a的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述各引物用于PCR反应中，所述反应物由105ng的青霉属菌种基因组DNA，1X EXPAND Buffer 2(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，和1单位的EXPAND DNA Polymerase(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)以最终体积50μl组成。扩增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333进行，程序如下：1个循环，在95℃进行1分钟；30个循环，每个在95℃进行30秒，在63.5℃进行30秒和在72℃进行90秒；和在72℃最终延伸7分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切出大约1.4kb的产物条带，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行纯化。
将质粒pBM120a用Nco I和Pac I消化，通过TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTM Cloning Kit连接在一起，得到pMMar31，其中木聚糖酶基因的转录置于来自供黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的启动子的杂合体(NA2-tpi启动子)的调控下。连接反应物(20μl)由1X IN-FUSIONTM Buffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1μl的IN-FUSIONTM酶(1∶10稀释)(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)，132ng的用Nco I和Pac I消化的pBM120a，和104ng经纯化的青霉属菌种PCR产物组成。将反应物在室温温育30分钟。将两μl的反应物用于依照生产商的指示转化大肠杆菌XL10 SOLOPACK GoldUltracompetent细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。将转化体挑至补充100μg每ml氨苄青霉素的LB培养基，并在37℃生长过夜。从每个培养物使用BIOROBOT9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA，并用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略进行DNA测序，使用下述引物以供测序。鉴定出一个大肠杆菌转化体包含所述青霉属菌种木聚糖酶基因。包含所述木聚糖酶基因的质粒命名为pMMar31(图2)。
996271 Na2tpi启动子正向：
5′-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3′(SEQ ID NO：11)
996270 AMG反向：
5′-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3′(SEQ ID NO：12)
Penulxyl367F：
5’-ATGTTGAGGTGCCATAATC-3’(SEQ ID NO：13)
Penulxyl1025R：
5’-TCTGGTAGTCGGTCGCCTG-3’(SEQ ID NO：14)
将同样的1.4kb PCR片段使用TOPO TA CLONING Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)克隆入pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以生成pMMar26(图3)。pMMar26中的青霉属菌种木聚糖酶插入通过DNA测序确证。将大肠杆菌pMMar26于2009年3月13日保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心/农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，Peoria，IL，USA，获得保藏号为NRRL B-50266。
实施例9：表征编码家族10木聚糖酶的青霉属菌种基因组序列
就品质细查核苷酸序列，并将所有序列在PHRED/PHRAP软件(Universityof Washington，Seattle，WA，USA)的协助下彼此比较。
所述青霉属菌种木聚糖酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图1A和1B。该基因组片段编码403个氨基酸的多肽，其由3个65、55和52碱基对的预期的内含子所分隔。全长编码序列和成熟编码序列的％G+C分别为60.2％和60.0％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测出23个残基的信号肽。预期的成熟蛋白质包含380个氨基酸与41.1kDa的预期分子量。氨基酸25至340预示其为家族10糖基水解酶。基于推定的氨基酸序列，根据Coutinho和Henrissat，1999(上文)该木聚糖酶可落入木聚糖酶家族GH10。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵，确定了氨基酸序列的比较性逐对全局比对(comparative pairwise global alignment)。该比对显示所述青霉属菌种家族GH10木聚糖酶基因的成熟多肽的推定氨基酸序列与一种埃默森踝节菌木聚糖酶基因(GeneSeq登录号AAB84358)的推定氨基酸序列具有93％同一性(排除缺口)。
实施例10：在黑曲霉MBin120中转化并表达青霉属菌种家族GH10木聚糖酶基因
将所述青霉属菌种家族GH10木聚糖酶基因在黑曲霉MBin120(WO2004/090155)中表达。依照Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备了黑曲霉MBin120原生质体。使用大约8μg的pMMar31以转化黑曲霉MBin120。
用pMMar31转化黑曲霉MBin120产生了大约20个转化体。将该20个转化体分离至单个COVEA尿素-乙酰胺+平板，并在34℃生长至汇集。将两个3mm见方的琼脂栓从该20个转化体的平板上切出，并分别接种入125ml塑料摇瓶中的25ml的含2％葡萄糖的YP培养基，并在34℃以250rpm振荡温育。在3日温育之后，将来自每个培养物的7.5μl上清在使用CRITERIONTM Cell(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的CRITERIONTM 8-16％ Tris-HClSDS-PAGE凝胶上依照生产商的指示进行分析。将所得的凝胶用BIO-SAFETMCoomassie Stain(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色。这些培养物的SDS-PAGE谱(profile)显示13个转化体具有大约50kDa的条带。
将一个高表达转化体，即黑曲霉MMar246，冻结作为储备，并亦使其生长以供纯化。将黑曲霉MMar246在COVE A尿素-乙酰胺+平板上在34℃生长至汇集。切出五个3mm见方的栓，并接种入2.8升烧瓶中的500ml含2％葡萄糖的YP培养基，并在34℃以250rpm振荡温育，并在4日之后收获。使用EXPRESS Plus 0.22微米滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)对来自烧瓶的培养液样品进行除菌过滤。
将经过滤的培养液浓缩，并使用配有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器(Pall Filtron，North Borough，MA，USA)在大约20psi与20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液交换。将脱盐材料加载于用20mM Tris-HCl pH 8.0平衡的70ml QSEPHAROSETM High Performance柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl pH 8.0中的0M NaCl至320mM NaCl的盐梯度(10个柱体积)洗脱。在8-16％CRITERIONTM SDS-PAGE STAIN FREETM凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)上检查级分，揭示所述青霉属菌种木聚糖酶在大约120mM NaCl洗脱。根据SDS-PAGE判断，该木聚糖酶为＞90％纯。蛋白质浓度使用BCA Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标样。
木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖和0.2％AZCL-木聚糖作为底物如上文所述确定的。纯化的青霉属菌种木聚糖酶针对AZCL-阿拉伯木聚糖和AZCL-木聚糖均显示活性。
实施例11：嗜热毁丝霉CBS 202.75基因组DNA提取
将嗜热毁丝霉CBS 202.75在45℃以200rpm在带挡板的摇瓶中在100mlYEG培养基中生长2日。通过使用MIRACLOTH的过滤收获菌丝体，并将其在去离子水中洗涤两次，在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨制为细粉，并使用DNEASY Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。
实施例12：从嗜热毁丝霉CBS 202.75分离全长家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)
使用GENOMEWALKERTM Universal Kit依照生产商的指示从嗜热毁丝霉CBS 202.75分离全长家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)。简言之，将来自嗜热毁丝霉CBS 202.75的总基因组DNA用四种不同的产生平端的限制性酶(Dra I、Eco RV、Pvu II和Stu I)分别消化。然后将每批经消化的基因组DNA分别连接至GENOMEWALKERTM Adaptor以构建四个文库。然后使用这些文库作为模板在使用两种下文所示的基因特异性引物的PCR反应中，一种用于初级PCR而一种用于次级PCR。下述引物是基于来自嗜热毁丝霉的部分家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)序列(WO 2004/056981)而设计的。
引物MtCel6a-R4：
5′-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3′(SEQ ID NO：15)
引物MtCel6a-R5：
5′-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3′(SEQ ID NO：16)
初级扩增物由各1μl(大约6ng)的每种文库作为模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的Adaptor Primer 1，10pmol的引物MtCel6a-R4，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer和1.25单位的ADVANTAGE GC Genomic Polymerase Mix以最终体积25μl组成。扩增使用EPPENDORF MASTERCYCLER5333进行，程序如下：94℃预变性1分钟；7个循环，每个在94℃的变性温度进行30秒；在72℃退火和延伸5分钟；和32个循环，每个在67℃进行5分钟。
次级扩增物由各1μl的每种初级PCR产物作为模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的Adaptor Primer 2，10pmol的引物MtCel6a-R5，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer和1.25单位的ADVANTAGE GC Genomic Polymerase Mix以最终体积25μl组成。扩增使用EPPENDORF MASTERCYCLER5333进行，程序如下：在94℃预变性1分钟；5个循环，每个在94℃的变性温度进行30秒；在72℃退火和延伸5分钟；20个循环，每个在67℃进行5分钟。
反应产物通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切出来自Eco RV文库的3.5kb产物条带，使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行纯化，并测序。
实施例13：表征编码家族6纤维二糖水解酶II的嗜热毁丝霉CBS 202.75基因组序列
3.5kb PCR片段的DNA测序是用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model377 XL Automated DNA Sequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略进行的。使用下述基因特异性引物以供测序：
MtCel6a-F2：
5’-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3’(SEQ ID NO：17)
MtCel6a-F3：
5’-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3’(SEQ ID NO：18)
MtCel6a-R8：
5’-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3’(SEQ ID NO：19)
就品质细查核苷酸序列数据，并在PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA，USA)的协助下将所有序列彼此比较。将所述3.5kb序列与来自嗜热毁丝霉的部分家族6纤维二糖水解酶基因(cel6a)序列进行比较和比对(WO 2004/056981)。
基于编码蛋白质与来自土生梭孢霉、嗜热毛壳菌、特异腐质霉和里氏木霉的同源糖基水解酶家族6蛋白质的类似性对所述嗜热毁丝霉序列构建了基因模型。所述嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。所述基因组片段编码482个氨基酸的多肽，其由3个96、87和180bp的预期的内含子所分隔。全长编码序列和成熟编码序列的％G+C分别为61.6％和64％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测出17个残基的信号肽。预期的成熟蛋白质包含465个氨基酸与49.3kDa的预期分子量。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，其中缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵，确定了氨基酸序列的比较性逐对全局比对。该比对显示所述编码具有纤维二糖水解酶活性的CEL6A成熟多肽的嗜热毁丝霉基因的推定氨基酸序列与两种来自嗜热毛壳菌和特异腐质霉的糖基水解酶家族6蛋白质(GeneSeqP登录号分别为ADP84824和AAW44853)的推定氨基酸序列分别具有78.6％和77.6％同一性(排除缺口)。
实施例14：克隆所述嗜热毁丝霉CBS 202.75纤维二糖水解酶基因(cel6a)并构建米曲霉表达载体
设计了下示两个合成寡核苷酸引物以从实施例11中制备的基因组DNA来PCR扩增所述嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶基因。使用IN-FUSIONTMCloning Kit将片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO 2004/099228)，而无需限制性消化和连接。
MtCel6a-F4：
5’-ACTGGATTTACC-3’(SEQ ID NO：22)
MtCel6a-R9：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQ ID NO：23)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。
将五十皮摩尔的上述各引物用于PCR反应中，所述反应物由100ng的嗜热毁丝霉基因组DNA，1X ADVANTAGE GC-Melt LA Buffer，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，和1.25单位的ADVANTAGE GC基因组Polymerase Mix以最终体积25μl组成。扩增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333进行，程序如下：1个循环，在94℃进行1分钟；30个循环，每个在94℃进行30秒，在62℃进行30秒和在72℃进行2分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。
将反应产物通过TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中从凝胶切出1842bp的产物条带，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行纯化。
将质粒pAlLo2(WO 2004/099228)用Nco I和Pac I消化，通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。
将基因片段和消化的载体使用IN-FUSIONTM Cloning Kit连接在一起，得到pSMai180(图4)，其中纤维二糖水解酶基因的转录置于来自供黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的启动子的杂合体(NA2-tpi启动子)的调控下。连接反应物(50μl)由1X IN-FUSIONTM Buffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(1∶10稀释)，100ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和50ng嗜热毁丝霉cel6a纯化的PCR产物组成。将反应物在室温温育30分钟。将一μl的反应物用于转化大肠杆菌XL10 SOLOPACK Gold Supercompetent细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。包含pSMai180的大肠杆菌转化体通过限制性酶消化检测，并使用BIOROBOT9600制备质粒DNA。pSMai180中的嗜热毁丝霉cel6a插入通过DNA测序确证。
将同样的1842bp PCR片段使用TOPO TA CLONING Kit克隆入pCR2.1-TOPO载体以生成pSMai182(图5)。pSMai182中的嗜热毁丝霉cel6a插入通过DNA测序确证。将大肠杆菌pSMai182于2007年9月6日保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心/农业研究培养物保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northern RegionalResearch Center)，Peoria，IL，USA，获得保藏号为NRRL B-50059。
实施例15：在米曲霉JaL355中表达嗜热毁丝霉CBS 202.75家族6纤维二糖水解酶cel6a基因
米曲霉JaL335(WO 2002/40694)原生质体是依照Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备的。将三μg的pSMai180用于转化米曲霉JaL335。用pSMai180转化米曲霉JaL335产生约50个转化体。将二十个转化体分离至单个基本培养基平板。
将所述20个转化体的汇集的基本培养基平板用5ml的0.01％TWEEN20洗涤，并分别接种入125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基，并在34℃，250rpm温育。在5日温育之后，用CRITERION Cell(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在8-16％CRITERIONTM SDS-PAGE凝胶上依照生产商的指示分析来自每种培养物的5μl上清。将所得的凝胶用BIO-SAFETM Coomassie Stain染色，该培养物的SDS-PAGE概貌显示多数转化体具有大约70-75kDa的主要条带。
一个转化体的汇集平板，命名为转化体14，用10ml的0.01％TWEEN20洗涤，并接种入两个各包含500ml MDU2BP培养基的2升Fernbach烧瓶，以生成发酵液以供表征所述酶。在第5日收获培养液，并使用0.22μmEXPRESSTM Plus Membrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
实施例16：纯化在米曲霉中表达的重组嗜热毁丝霉CBS 202.75家族6纤维二糖水解酶II
使用配置有10kDa聚醚砜膜的Amicon超滤装置(Millipore，Bedford，MA，USA)将实施例15中所述的经过滤的嗜热毁丝霉CBS 202.75培养液在70psi，4℃浓缩20倍至50ml。经浓缩的发酵液使用HiPrepTM26/10脱盐柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)脱盐至20mM Tris-HCl pH 8缓冲液。将脱盐的缓冲液与适当体积的含有3.4M硫酸铵的20mM Tris-HCl pH 7.5混合以得到1.2M硫酸铵的最终浓度。将样品加载于用20mM Tris-HCl pH 7.5中的360mM硫酸铵平衡的PHENYL SUPEROSETM柱(HR 16/10，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。不需要的蛋白质用120mM硫酸铵的梯度洗脱，然后用20mM Tris-HClpH 7.5洗脱嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶。使用8-16％CRITERIONTMSDS-PAGE凝胶分析级分，并用GELCODE Blue Stain Reagent染色。根据SDS-PAGE判断，嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶为＞90％纯。蛋白质浓度使用BCA Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标样。
实施例17：生长野生型嗜热毁丝霉菌株CBS117.65
将一百ml的摇瓶培养基添加至500ml摇瓶，所述摇瓶培养基由15g的葡萄糖，4g的K2HPO4，1g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，2g的MES游离酸，1g的细菌蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl2·2H2O，5g的NH4NO3，1ml的痕量元素溶液和去离子水至1升组成。所述痕量元素溶液由1.2g的FeSO4·7H2O，10g的ZnSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，0.4g的Na2B4O7·10H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O和去离子水至1升组成。将摇瓶用来自嗜热毁丝霉菌株CBS117.65的固体平板培养物的两个栓接种，并在定轨振荡器以200rpm在45℃温育48小时。将五十ml烧瓶培养液用于接种2升发酵容器。
发酵分批培养基由5g的酵母提取物，176g的纤维素粉，2g的葡萄糖，1g的NaCl，1g的Bacto Peptone，4g的K2HPO4，0.2g的CaCl2·2H2O，0.2g的MgSO4.7H2O，2.5g的柠檬酸，5g的NH4NO3，1.8ml的消泡剂，1ml的痕量元素溶液(如上)和去离子水至1升组成。发酵补料培养基由水和消泡剂组成。
将总共1.8升的发酵批次培养基添加至两升玻璃夹套的发酵器(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)。将发酵给料培养基以4g/l/hr的速率剂量添加72小时的时间。在45℃的温度维持发酵容器，并使用Applikon 1030控制系统(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)将pH控制至5.6+/-0.1的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并通过在1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌发酵液。在发酵终止时，从容器收获全发酵液，并以3000 x g离心以去除生物质。
实施例18：从野生型嗜热毁丝霉CBS 117.65全发酵液纯化天然Cel6A纤维二糖水解酶II
将在实施例17中获得的收获的发酵液在500ml瓶中以13,000 x g在4℃离心20分钟，然后使用0.22μ聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌过滤。将经过滤的发酵液浓缩，并使用配有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器(PallFiltron，North Borough，MA，USA)在大约20psi与20mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液交换。为了减少色素的量，将浓缩物加载于用20mM Tris-HCl pH 8.5平衡的60ml Q SEPHAROSETM Big Bead柱，并用含有600mM NaCl的平衡缓冲液逐步洗脱。将流过物和洗脱物级分在8-16％CRITERIONTM SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上用GELCODE Blue Stain Reagent(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)染色来进行检查。如通过由SDS-PAGE得到的对应于蛋白的表观分子量的条带的存在，判断流过物级分包含嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶(Cel6A纤维二糖水解酶：大约70-75kDa)。
将洗脱物级分使用配置有10kDa聚醚砜膜的Amicon超滤装置(Millipore，Bedford，MA，USA)在40psi，4℃进行浓缩，并与等体积的含有3.4M硫酸铵的20mM Tris-HCl pH 7.5混合以得到1.7M硫酸铵的终浓度。在将样品加载于用20mM Tris-HCl pH 7.5中的1.7M硫酸铵平衡的PHENYL SUPEROSETM柱(HR16/10，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)之前，过滤样品(0.2μM注射器式过滤器，聚醚砜膜，Whatman，Maidstone，United Kingdom)以去除颗粒状物质。结合的蛋白质用12柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.5中从1.7M硫酸铵至0M硫酸铵递减的盐梯度来洗脱。如上所述通过8-16％SDS-PAGE凝胶检查级分，其揭示所述Cel6A纤维二糖水解酶在梯度最末端洗脱(大约20mM硫酸铵)。
汇集包含Cel6A纤维二糖水解酶II的级分，并在20mM Tris-HCl pH 9.0中稀释10倍(以降低盐并提高pH)，然后加载于用20mM Tris-HCl pH 9.0平衡的1ml RESOURCETM Q柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。结合的蛋白质用20柱体积的20mM Tris-HCl pH 9.0中从0mM至550mM NaCl的盐梯度来洗脱。嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II作为单峰在梯度早期(大约25mM NaCl)洗脱。根据SDS-PAGE判断，所述青霉属菌种木聚糖酶为＞90％纯。蛋白质浓度使用BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)来确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标样。
实施例19：嗜热毁丝霉CBS 117.65和CBS202.75家族6纤维二糖水解酶II和青霉属菌种家族10木聚糖酶对于PCS水解的作用。
在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy NationalRenewable Energy Laboratory(NREL))使用稀硫酸预处理玉米秸秆。对于预处理使用下述条件：在165℃和107psi用1.4wt％硫酸进行8分钟。根据NREL，在经预处理的玉米秸秆(PCS)中不溶于水的固体包含56.5％纤维素，4.6％半纤维素和28.4％木质素。纤维素和半纤维素是通过两阶段硫酸水解并随后通过使用NREL标准分析方法#002的高效液相色谱法分析糖来确定的。木质素是在用硫酸水解纤维素和半纤维素之后使用NREL标准分析方法#003通过重量分析法确定的。用大量体积的去离子水在玻璃滤器上洗涤PCS。
就其增强根据WO 2008/151079获得的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物(表达具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉发酵液)对经洗涤的PCS的水解的能力来评价嗜热毁丝霉CBS 202.75 CEL6纤维二糖水解酶II(重组)或嗜热毁丝霉CBS117.65 CEL6纤维二糖水解酶(天然)和青霉属菌种家族10木聚糖酶。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)以1.0ml的总反应体积进行。水解用每ml含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH 5.0中的50mg PCS，以及每克纤维素2mg的里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物，或用每种酶(每g纤维素1.6mg里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物和每g纤维素0.4mg每种酶)20％替代(以蛋白质计)所述里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物来进行。水解测定以三次重复在50℃进行72小时。在水解之后，用0.45μmMultiscreen 96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，并如下所述分析滤过物的糖含量。
当不立即使用时，将经过滤的糖等分试样冻结于-20℃。在用含0.05％w/w苯甲酸的0.005M H2SO4以每分钟0.6ml的流速在65℃从4.6 x 250mmAMINEX HPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)洗脱之后，在0.005MH2SO4中稀释的样品的糖浓度通过整合根据纯糖样品校准的从折光率检测(CHEMSTATIONAGILENT1100 HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)获得的葡萄糖和纤维二糖信号进行定量来确定。使用所得的当量计算对于每个反应的纤维素转化百分比。
纤维素转化的程度使用下述公式计算：
％转化＝[葡萄糖浓度+1.053 x(纤维二糖浓度)]/[限制消化中的(葡萄糖浓度+1.053 x(纤维二糖浓度)]。对于纤维二糖的1.053因子考虑了当纤维二糖转化为葡萄糖时质量的增加。将每g纤维素六十mg的里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物用于限制消化。
图6所示结果表明用嗜热毁丝霉CBS 202.75重组Cel6A纤维二糖水解酶II或嗜热毁丝霉CBS 117.65天然CEL6A纤维二糖水解酶II 20％替代(按蛋白质计)里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(以每g纤维素2mg加载)分别改善了72小时水解产率3.1％和6.2％。或者，用嗜热毁丝霉CBS 202.75重组Cel6A纤维二糖水解酶II 20％替代里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(以每g纤维素2mg加载)的转化百分比等于每g纤维素加载2.15mg里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(1.08倍的改善)。对于嗜热毁丝霉天然CBS 117.65 Cel6A纤维二糖水解酶II，20％替代的转化百分比等于每g纤维素加载2.25mg里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(1.13倍的改善)。用青霉属菌种家族10木聚糖酶20％替代里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(以每g纤维素2mg加载)改善水解产率7.7％。用青霉属菌种木聚糖酶20％替代里氏木霉里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(以每g纤维素2mg加载)的转化百分比等于每g纤维素加载2.32mg里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(1.16倍的改善)。
实施例20：嗜热毁丝霉CBS 202.75 Cel6A或嗜热毁丝霉CBS 117.65 Cel6A和青霉属菌种家族10木聚糖酶协同地增强里氏木霉纤维素酶混合物的水解
如实施例19中所述用嗜热毁丝霉CBS 202.75 CEL6纤维二糖水解酶II(重组的)或嗜热毁丝霉CBS 117.65 CEL6纤维二糖水解酶II(天然的)和青霉属菌种家族10木聚糖酶的50∶50混合物(每g纤维素1.6mg的里氏木霉纤维素水解蛋白质组合物；每g纤维素0.2mg的嗜热毁丝霉CBS 202.75纤维二糖水解酶II或嗜热毁丝霉CBS 117.65纤维二糖水解酶II；和每g纤维素0.2mg的青霉属菌种木聚糖酶)20％替代里氏木霉里氏木霉纤维素分解蛋白质制备物(每g纤维素总加载2mg)进行PCS水解测定。
如图7所示，嗜热毁丝霉CBS 202.75 CEL6纤维二糖水解酶II(重组的)或嗜热毁丝霉CBS 117.65 CEL6纤维二糖水解酶II(天然的)和青霉属菌种木聚糖酶的混合物分别显示72小时水解产率改善19.2％和16.6％。这些结果分别对应于等价于2.78mg/g纤维素和2.68mg/g纤维素的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物的百分比转化率(1.39和1.34倍的改善)。
包含用嗜热毁丝霉CBS 202.75 CEL6纤维二糖水解酶II(重组的)或嗜热毁丝霉CBS 117.65(CEL6)纤维二糖水解酶II(天然的)10％替代加上用青霉属菌种木聚糖酶的10％替代的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物(嗜热毁丝霉CBS 202.75重组CEL6纤维二糖水解酶II加上青霉属菌种木聚糖酶：19.2％；嗜热毁丝霉CBS 117.65天然CEL6纤维二糖水解酶II加上青霉属菌种木聚糖酶：16.6％)相对于用每种蛋白质单独的20％替代(嗜热毁丝霉CBS 202.75CEL6纤维二糖水解酶II(重组的)：3.1％；嗜热毁丝霉CBS 117.65 CEL6纤维二糖水解酶II(天然地)：6.2％；青霉属菌种木聚糖酶：8.2％)在百分比转化率方面的显著增强，说明嗜热毁丝霉Cel6A纤维二糖水解酶II(无论是来自嗜热毁丝霉CBS 202.75菌株的重组酶或是来自嗜热毁丝霉CBS 11.65菌株的天然酶)和青霉属菌种木聚糖酶在增强里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物方面显示协同效应。
生物材料的保藏
下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心/农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，1815 University Street，Peoria，IL，USA，并给予下述的登录号：
保藏物               登录号          保藏日期
大肠杆菌(pMMar26)    NRRL B-50266    2009年3月13日
所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
通过下述编号段落进一步描述本发明：
[1]具有木聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：
(a)多肽，与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％同一性，例如至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％的序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少95％序列同一性，例如至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％的序列同一性；(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有木聚糖酶活性的片段。
[2]段1的多肽，与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。
[3]段1或2的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[4]段1-3任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％的序列同一性。
[5]段1-4任一项的多肽，包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成。
[6]段1-4任一项的多肽，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ IDNO：2的成熟多肽组成。
[7]段6的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸24至403。
[8]段1-7任一项的多肽，其为SEQ ID NO：2的片段，其中所述片段具有木聚糖酶活性。
[9]段1的多肽，其为SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。
[10]段1-9任一项的多肽，其由大肠杆菌NRRL B-50266中包含的质粒pMMar26中包含的多核苷酸所编码。
[11]组合物，其包含段1-10任一项的多肽。
[12]分离的多核苷酸，其编码段1-10任一项的多肽。
[13]核酸构建体或表达载体，其包含段12的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导所述多肽在表达宿主中产生的调控序列。
[14]重组宿主细胞，其包含段12的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导所述多肽产生的调控序列。
[15]产生段1-10任一项多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养以其野生型形式产生所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。
[16]产生段1-10任一项多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，所述细胞包含编码所述多肽的多核苷酸可操作连接于一个或多个指导所述多肽产生的调控序列；和(b)回收所述多肽。
[17]转基因植物、植物部分或植物细胞，其经编码段1-10任一项的多肽的多核苷酸转化。
[18]产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养段17的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
[19]产生亲本细胞突变体的方法，包括使编码段1-10任一项的多肽的多核苷酸失活，其导致所述突变体产生少于亲本细胞的所述多肽。
[20]突变细胞，其通过段19的方法产生。
[21]段20的突变细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。
[22]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养段20或21的突变细胞；和(b)回收所述蛋白质。
[23]双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段12的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。
[24]段23的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其为长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。
[25]用于抑制具有木聚糖酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子，或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包括段12的多核苷酸的亚序列。
[26]段25的方法，其中dsRNA为长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更长的双链体核苷酸。
[27]细胞，其由段25或26的方法产生。
[28]段27的细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。
[29]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下培养段27或28的细胞；和(b)回收所述蛋白质。
[30]分离的多核苷酸，其编码信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至23或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至23组成。
[31]核酸构建体或表达载体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作地连接于段30的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。
[32]重组宿主细胞，其包含段30的多核苷酸，其可操作地连接于编码蛋白质的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。
[33]用于产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于所述蛋白质产生的条件下培养段32的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。
[34]降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：在段1-10任一项的具有木聚糖酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料或含木聚糖材料。
[35]段34的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料经过预处理。
[36]段34或35的方法，其中酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[37]段37的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[38]段37的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[39]段34-38任一项的方法，进一步包括回收已降解的纤维素材料或含木聚糖材料。
[40]段39的方法，其中已降解的纤维素材料或含木聚糖材料是糖。
[41]段40的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[42]产生发酵产物的方法，包括：(a)在段1-10任一项的具有木聚糖酶的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和(c)从所述发酵回收所述发酵产物。
[43]段42的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料经预处理。
[44]段42或43的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[45]段44的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[46]段44的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[47]段42-46任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
[48]段42-47任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[49]发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料或含木聚糖材料，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料在段1-10任一项的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化。
[50]段49的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生发酵产物。
[51]段50的方法，其进一步包括从所述发酵回收发酵产物。
[52]段49-51任一项的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料在糖化前经过预处理。
[53]段49-52任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[55]段53的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[55]段53的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[56]段49-55任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸，或气体。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims (39)

1.具有木聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：
(a)多肽，由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的氨基酸24至403组成；或(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:1的核苷酸70-1384组成。
2.权利要求1的多肽，由SEQ ID NO:2组成。
3.权利要求1的多肽，由SEQ ID NO:2的氨基酸24至403组成。
4.权利要求1-3任一项的多肽，其由SEQ ID NO:1的核苷酸70-1384所编码。
5.组合物，其包含权利要求1-4任一项的多肽。
6.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4任一项的多肽。
7.编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的核苷酸70-1384组成。
8.权利要求7的多核苷酸，其为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的核苷酸70-1384。
9.权利要求8的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO:1的核苷酸70-1384为包含于SEQ ID NO:1的核苷酸70至1384中的cDNA序列。
10.核酸构建体或表达载体，其包含权利要求6-9任一项的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导所述多肽在表达宿主中产生的调控序列。
11.重组宿主细胞，其包含权利要求6-9任一项的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导所述多肽产生的调控序列。
12.产生权利要求1-4任一项多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，所述细胞包含编码所述多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于一个或多个指导所述多肽产生的调控序列；和(b)回收所述多肽。
13.转基因植物部分，其经编码权利要求1-4任一项的多肽的多核苷酸转化，所述转基因植物部分不属于植物品种。
14.产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养权利要求13的转基因植物部分；和(b)回收所述多肽。
15.降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：在权利要求1-4任一项的具有木聚糖酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料或含木聚糖材料。
16.权利要求15的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料经过预处理。
17.权利要求15的方法，其中酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
18.权利要求17的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
19.权利要求17的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
20.权利要求15-19任一项的方法，进一步包括回收已降解的纤维素材料或含木聚糖材料。
21.权利要求20的方法，其中已降解的纤维素材料或含木聚糖材料是糖。
22.权利要求21的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
23.产生发酵产物的方法，包括：(a)在权利要求1-4任一项的具有木聚糖酶活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和(c)从所述发酵回收所述发酵产物。
24.权利要求23的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料经预处理。
25.权利要求23的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
26.权利要求25的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
27.权利要求25的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
28.权利要求23-27任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
29.权利要求23-27任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、或气体。
30.权利要求29的方法，其中有机酸是氨基酸。
31.发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料或含木聚糖材料，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料在权利要求1-4任一项的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化。
32.权利要求31的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生发酵产物。
33.权利要求32的方法，其进一步包括从所述发酵回收发酵产物。
34.权利要求31-33任一项的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料在糖化前经过预处理。
35.权利要求31-33任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
36.权利要求35的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
37.权利要求35的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
38.权利要求31-33任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、或气体。
39.权利要求38的方法，其中有机酸是氨基酸。
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Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120276585A1 (en) * 2009-12-21 2012-11-01 Cofco Corporation Method for producing fermentation products from lignocellulose-containing material
CN103108951A (zh) 2010-06-30 2013-05-15 诺维信公司 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP3470514A1 (en) 2010-08-30 2019-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8624082B2 (en) 2010-08-30 2014-01-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030858A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having hemicellulolytic activity and polynucleotides encoding same
WO2012030845A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
BR112013007693B1 (pt) 2010-09-30 2021-12-07 Novozymes, Inc Variante, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira microbiana recombinante, métodos para produzir uma variante, para produzir uma variante tendo atividade intensificadora celulolítica, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, e, composição enzimática, formulação do caldo completo ou composição de cultura de células
WO2012044836A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Novozymes, Inc. Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK2622069T3 (en) 2010-10-01 2016-02-22 Novozymes Inc Beta-glucosidasevarianter and polynucleotides encoding them
BR112013009817B1 (pt) 2010-10-26 2020-02-04 Novozymes As métodos de degradar ou converter refugo de cana de açúcar, de produzir um produto de fermentação, e, de fermentar refugo de cana de açúcar
CN103282504A (zh) 2010-11-02 2013-09-04 诺维信股份有限公司 用家族61多肽预处理纤维素材料的方法
EP2635594B1 (en) 2010-11-04 2017-01-11 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
BR112013009026A2 (pt) 2010-11-12 2016-07-12 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína, e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e método para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, molécula de rna inibidora de filamento duplo, polinucleotídeo isolado, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de célula
MX337913B (es) 2011-01-26 2016-03-28 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
WO2012103350A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2668270T3 (en) 2011-01-26 2019-01-07 Novozymes Inc Polypeptides with cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them
DK2668269T3 (en) 2011-01-26 2018-04-09 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH ENDOGLUCANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
CN103384678B (zh) 2011-02-23 2017-01-18 诺维信股份有限公司 具有纤维素水解增强活性的多肽及其编码多核苷酸
US9150842B2 (en) 2011-03-09 2015-10-06 Novozymes A/S Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
US9409958B2 (en) 2011-03-10 2016-08-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
RU2013146245A (ru) * 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ уменьшения вязкости в процессе осахаривания
DK2689011T3 (en) 2011-03-25 2018-01-22 Novozymes As PROCEDURE FOR DEGRADATION OR CONVERSION OF CELLULOSE-SUBSTANCING MATERIAL
WO2012135719A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes, Inc. Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
WO2012149192A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
MX2013011827A (es) 2011-04-29 2014-01-08 Novozymes Inc Metodos para mejorar la degradacion o conversion de material celulosico.
CN109022518A (zh) 2011-07-22 2018-12-18 诺维信北美公司 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法
DK3382016T3 (da) 2011-08-04 2019-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med xylanaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
EP2739728B1 (en) 2011-08-04 2017-07-12 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2013028915A2 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Novozymes, Inc. Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell
US9493790B2 (en) 2011-08-24 2016-11-15 Novozymes, Inc. Methods for producing multiple recombinant polypeptides in a filamentous fungal host cell
PL2753749T3 (pl) 2011-09-09 2019-10-31 Novozymes As Polepszone właściwości materiałów papierowych
WO2013043910A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2013089889A2 (en) 2011-09-30 2013-06-20 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US10308921B2 (en) 2011-10-31 2019-06-04 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20140234897A1 (en) * 2011-11-04 2014-08-21 Novozymes Inc. Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity and Polynucleotides Encoding Same
CN104039959A (zh) * 2011-11-11 2014-09-10 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP2776561A4 (en) * 2011-11-11 2015-09-02 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
WO2013074956A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US10351834B2 (en) 2011-11-21 2019-07-16 Novozymes, Inc. GH61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
DK2782998T3 (en) 2011-11-22 2018-04-16 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH BETA-XYLOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
DK2785732T3 (en) 2011-12-01 2017-06-19 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH BETA-XYLOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
EP3272862A1 (en) 2011-12-16 2018-01-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
WO2013091547A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having catalase activity and polynucleotides encoding same
US9683225B2 (en) * 2011-12-19 2017-06-20 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2793610A1 (en) 2011-12-19 2014-10-29 Novozymes A/S Processes and compositions for increasing the digestibility of cellulosic materials
EP2794869B1 (en) 2011-12-20 2017-10-04 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US20150017670A1 (en) 2011-12-21 2015-01-15 Novozymes, Inc. Methods For Determining The Degradation Of A Biomass Material
BR112014026625A2 (pt) 2012-04-27 2017-07-18 Novozymes Inc E Novozymes As variante do polipeptídeo, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de uma variante do polipeptídeo e para obtenção de uma variante do polipeptídeo, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação e para fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação ou composição de cultura celular de caldo inteiro
CN109234250A (zh) 2012-05-31 2019-01-18 诺维信公司 具有有机磷水解酶活性的多肽
BR112015005884A2 (pt) 2012-09-19 2017-08-08 Novozymes Inc E Novozymes As processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação, e de fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
WO2014058896A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CA2892031A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Novozymes A/S Milling process
US20150315297A1 (en) 2012-11-27 2015-11-05 Novozymes A/S Milling Process
EP2740840A1 (en) 2012-12-07 2014-06-11 Novozymes A/S Improving drainage of paper pulp
WO2014093835A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150337280A1 (en) 2012-12-19 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN110628749A (zh) 2013-03-08 2019-12-31 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
CN103215836B (zh) * 2013-03-15 2015-09-02 深圳职业技术学院 一种表达糖苷酶的微生物菌种和其用于生物酶法造纸的技术
US9556465B2 (en) 2013-05-10 2017-01-31 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3052620B1 (en) 2013-09-04 2020-07-15 Novozymes A/S Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material
EP3511418B1 (en) 2014-01-07 2020-07-15 Novozymes A/S Corollospora maritima mannanase and its use
EP3186373B1 (en) 2014-08-28 2020-12-16 Renescience A/S Solubilization of msw with blend enzymes
WO2016037096A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same
DK3198001T3 (da) 2014-09-23 2021-11-08 Novozymes As Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol og fermentering af organismer
EP3250697B1 (en) 2015-01-28 2019-12-04 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016120296A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016120298A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10557127B2 (en) 2015-02-24 2020-02-11 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP3067428A1 (en) 2015-03-12 2016-09-14 BETA RENEWABLES S.p.A. A process for producing a hydrolyzed mixture from a pre-treated ligno-cellulosic slurry comprising a slurry liquid and slurry solids
BR112017019331A2 (pt) 2015-03-12 2018-06-05 Beta Renewables Spa processos para sacarificação de múltiplos estágios de um material lignocelulósico e para melhorar um rendimento de glicose ou xilose de sacarificação de um material lignocelulósico em um reator de tanque continuamente agitado
EP3268486A1 (en) 2015-03-12 2018-01-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass employing an oxidoreductase with an aa9 polypeptide
EP3268484B1 (en) 2015-03-12 2020-06-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016188459A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
JP6562735B2 (ja) 2015-06-26 2019-08-21 花王株式会社 新規キシラナーゼ
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
US10577594B2 (en) 2015-07-24 2020-03-03 Novozymes, Inc. Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
CN107949637A (zh) 2015-09-04 2018-04-20 诺维信公司 抑制酶组合物的aa9溶解性多糖单加氧酶催化的失活的方法
CN108350044B (zh) 2015-09-22 2022-05-24 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
CN114054481A (zh) 2015-11-02 2022-02-18 雷内科学有限公司 用混合酶溶解城市固体废物
WO2017107980A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Novozymes A/S Methods for enhancing the dewaterability of sludge with enzyme treatment
AU2017220672B2 (en) * 2016-02-18 2023-06-22 Biopract Gmbh Arabinanase and uses thereof
DK3416740T3 (da) 2016-02-19 2021-02-08 Intercontinental Great Brands Llc Fremgangsmåder til dannelse af multiple værdistrømme ud fra biomassekilder
BR112018067371A2 (pt) 2016-03-02 2019-01-15 Novozymes As variante de celobio-hidrolase, composição de enzimas, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, métodos para produção e para obtenção de uma variante de celobio-hidrolase, planta trangênica, e, processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação e para fermentação de um material celulósico
EP3433358B1 (en) 2016-03-24 2022-07-06 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
MY197083A (en) 2016-06-09 2023-05-24 Dsm Ip Assets Bv Seed train for large scale enzyme production
US10913938B2 (en) 2016-07-29 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018085370A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Novozymes A/S Processes for reducing production of primeverose during enzymatic saccharification of lignocellulosic material
BR112019009796A2 (pt) 2016-11-24 2019-08-06 Dsm Ip Assets Bv composição de enzimas
CA3043966A1 (en) 2016-11-24 2018-05-31 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11319559B2 (en) 2017-10-09 2022-05-03 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA3078156A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2019185680A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112020023198A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. processo para produção de um polipeptídeo
RS64143B1 (sr) 2018-05-30 2023-05-31 Versalis Spa Postupak za proizvodnju šećera iz ugljenohidratnih materijala
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
EP3870715A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
CN113302293A (zh) 2018-12-12 2021-08-24 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸
BR112021017167A2 (pt) 2019-03-12 2021-11-09 Dsm Ip Assets Bv Processo para a produção de um caldo de fermentação
EP4009807A1 (en) 2019-08-05 2022-06-15 Novozymes A/S Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct
US20220340943A1 (en) 2019-09-10 2022-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2022013148A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of biogas
CN117178059A (zh) 2021-04-06 2023-12-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶组合物
BR112023020370A2 (pt) 2021-04-06 2023-11-21 Dsm Ip Assets Bv Composição de enzimas
EP4320258A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
MX2023010968A (es) 2021-04-08 2023-09-27 Versalis Spa Proceso para la preparacion de un producto de azucar y un producto de fermentacion.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001042433A2 (en) * 1999-12-07 2001-06-14 Danisco A/S Talaromyces emersonii xylanase

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0712914A2 (pt) * 2006-02-27 2012-10-09 Edenspace System Corp colheitas de energia para estoques de alimentação de biocombustìvel aperfeiçoados
CN106167796B (zh) * 2009-11-06 2019-06-04 诺维信股份有限公司 用于糖化纤维素材料的组合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001042433A2 (en) * 1999-12-07 2001-06-14 Danisco A/S Talaromyces emersonii xylanase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dietmar Haltrich et al..Production of fungal xylanases.《Bioresource Technology》.1996,第58卷(第2期),137-161.
Production of fungal xylanases;Dietmar Haltrich et al.;《Bioresource Technology》;19961130;第58卷(第2期);137-161 *

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Publication number Publication date
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