BRPI1015197A2 - polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula percursora, uma proteina, e um produto de fermentação, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, molécula de rna, método para inibir a expressão de um polipeptídeo, e, métodos para degradar ou converter, e para fermentar um material celulósico ou contendo xilano - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, UM MUTANTE DE UMA CÉLULA PRECURSORA, UMA PROTEÍNA, E UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, MOLÉCULA DE RNA, MÉTODOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER, E PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO OU CONTENDO XILANO A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de xilanase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como aos métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Description

de 1 É “POLIPEPTÍDEO — ISOLADO, “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, UM MUTANTE DE UMA CÉLULA PRECURSORA, UMA PROTEÍNA, E UM PRODUTO DE S — FERMENTAÇÃO, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, MOLÉCULA DE RNA, MÉTODO PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, E, MÉTODOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER, E PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO OU CONTENDO XILANO”

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência. i REFERÊNCIA A UM DEPÓSTIDO DE MATERIAL BIOLÓGICO Este pedido contém uma referência a um depósito de material 15º biológico, cujo depósito é aqui incorporado pela referência. , FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a polipeptídeos com atividade de xilanase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA A celulose é um polímero do açúcar simples glicose por -— 25 ligação do tipo beta-l4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam beta-glicanas ligadas. Estas enzimas incluem endoglicanases, | celobioidrolases e beta-glicosidases. As endoglicanases digerem o polímero . de celulose em locais aleatórios, abrindo-o para ataque por celobioidrolases. | As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir

: % 2 É das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado a 1,4-beta de glicose solúvel em água. As Dbeta-glicosidases hidrolisam celobiose em glicose.

A conversão de matérias primas lignocelulíticas em etanol — apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias primas para a produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em — celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a celulose é convertida em glicose, a glicose é facilmente fermentada por levedura em etanol.

Existe uma necessidade na técnica de melhorar as composições de proteína celulósica por meio da suplementação com enzimas adicionais para aumentar a eficiência e fornecer soluções de enzima —econômicas para a degradação de lignocelulose. - A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade de xilanase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. i SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados com — atividade de xilanase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 95 % de identidade de . sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada (i) na sequência que —codificao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) na sequência de DNAc | contido na sequência de DNA genômico que compreende a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) na fita p complementar de comprimento total de (1) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com

- ' 3 É pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste; (d) um variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQIDNO:2;e (£) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de xilanase. A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras . recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir e usar os polipeptídeos. i A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste em aminoácidos 1 a 23 de SEQ ID NO: 2, que é operavelmente ligado a um gene - que codifica uma proteína; construtos de ácido nucleico, expressão vetores e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir uma proteína.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS As figuras 1A e 1B mostram a sequência de DNA genômico e i a sequência de aminoácidos deduzida de um gene xilanase de Penicillium sp. . (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente). A figura 2 mostra um mapa de restrição de pMMar31. A figura 3 mostra um mapa de restrição de PMMar26. “25 A figura 4 mostra um mapa de restrição de PSMai180. A figura 5 mostra um mapa de restrição de pPSMai182. A figura 6 mostra o efeito de celobioidrolase Cel6A de . Myceliophthora thermophila (tanto recombinante quanto nativa) e xilanase de Penicillium sp. por hidrólise de 72 horas de PCS (5 % p/v) por um caldo de

- ' 4 É fermentação de Trichoderma reesei que expressa o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus com atividade celulósica intensificada e fusão de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae. As misturas foram realizadas como substituições a 20 % (por proteína) da preparação da enzima celulósica de — Trichoderma reesei com cada enzima. A linha pontilhada mostra a conversão percentual em 2 mg da preparação de enzima celulósica de Trichoderma reesei por g de celulose. A melhoria da hidrólise foi demonstrada com misturas que atingem a conversão percentual acima da linha pontilhada em um carregamento proteico equivalente. As barras de erro das medições em —triplicata são mostradas.

A figura 7 mostra a melhora sinergística de uma hidrólise de 72 horas de PCS (5 % p/v) em um caldo de fermentação de Trichoderma reesei que expressa o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus com atividade celulósica intensificada e fusão de beta-glicosidase Aspergillus oryzae em misturas de celobioidrolase Cel6A de Myceliophthora thermophila - (recombinante e nativa) e xilanase de Penicillium sp.. As misturas foram realizadas como substituições a 20 % (em proteína) da preparação de enzima | celulósica de Trichoderma reesei com uma mistura 50:50 de Cel6A de Myceliophthora thermophila e xilanase de Penicillium sp.. A linha pontilhada mostra a conversão percentual em 2 mg da preparação da enzima celulósica de Trichoderma reesei por g de celulose. A melhoria da hidrólise foi . demonstrada com misturas que atingem conversão percentual acima da linha pontilhada em um carregamento de proteína equivalente. As barras de erro das medidas em triplicata são mostradas. = 25 Definições Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- E D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada usando AZCL-arabinoxilano a 0,2 % (Megazyme,

ASIA MIRA DESSA MR SESSENTA AAA o EE AO ALA SALA LAR - ' 5 * Wicklow, Irlanda) e AZCL-xilano a 0,2 % (Megazyme, Wicklow, Irlanda) como substratos em Triton X-100 a 0,01 % e tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5 a 50ºC.

As reações são iniciadas pela adição de xilanase (concentração final a 0,01 mg/mL) tanto para AZCL-arabinoxilano a 0,2 % — quanto para AZCL-xilano a 0,2 % e incubando a 50ºC por 10 minutos.

Após incubação, as reações são centrifugadas a 1.900 x g.

A absorbância do sobrenadante a 590 nm é medida usando um leitor de microplacas SPECTRAMAXO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Um aumento na absorbância a 590 nm indica a presença de atividade de xilanase.

Os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos : 20 %, preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, acima de tudo preferivelmente pelo menos 15º 95%,e ainda acima de tudo preferivelmente pelo menos 100 % da atividade - de xilanase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Atividade celulósica: O termo “atividade celulósica” significa | uma atividade biológica que hidrolisa um material celulósico.

As duas abordagens básicas para medir atividade celulósica incluem: (1) medir a atividade celulósica total, e (2) medir as atividades celulósicas individuais | (endoglicanases, celobioidrolases, e beta-glicosidases) da maneira revisada , em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulósica ' total é medida em geral usando substratos insolúveis, incluindo filtro de papel * 25 —Whatman Nel, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, | algodão, lignocelulose pré-tratada, etc.

O ensaio de atividade celulósica total mais comum é o ensaio de filtro de papel usando filtro de papel Whatman Nel . como o substrato.

O ensaio foi estabelecido pelo International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase n |

FEB EEB LEARN ta ANS É 6 E activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

Com propósitos da presente invenção, a atividade celulósica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulósico pela(s) enzima(s) celulósica(s) nas condições a seguir: 1-20 mg de proteína — celulósica/g de celulose em PCS por 3-7 dias a 50-65ºC comparada a uma hidrólise controle sem a adição de proteína celulósica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado ou não lavado, 5 % de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM em pH 5, MnSO, | mM, 50-65ºC, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

- Endoglicanase: O termo “endoglicanase” significa uma endo- 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D-glicanos ou - xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglicanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato ou o aumento na redução das extremidades determinado por um ensaio de redução de açúcar (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente l invenção, a atividade de endoglicanase é determinada usando carboximetil : celulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40ºC. Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- * 25 —beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de : ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligada a beta-1,4, que libera celobiose a - partir das extremidades reduzidas ou não reduzidas da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of

Í ms 7 ú cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem.

Soc.

Trans. 26: 173-178). Com propósitos da presente invenção, a atividade de celobioidrolase é determinada usando um derivado —de dissacarídeo fluorescente, 4-metilumbeliferil-B-D-lactosídeo, de acordo com os procedimentos descritos por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156 e van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283- 288, em pH 5, 40ºC.

Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma —beta-D-glicosídeo glicoidrolase (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise de : resíduos de beta-D-glicose não reduzida terminais com a liberação de beta-D- glicose.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi ef al., 2002, Extracellular beta-D-glicosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J.

Basic Microbiol. 42: 55-66. Um unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 umol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40ºC, pH5, ! a partir de p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEENQ 20 a 0,01 %. Atividade celulósica intensificada: O termo “Atividade | celulósica intensificada” significa uma atividade biológica catalisada por um : polipeptídeo GH61 que melhora a hidrólise de um material celulósico por enzima com atividade celulósica.

Com propósitos da presente invenção, Atividade celulósica intensificada é determinada medindo o aumento na > 25 redução de açúcares ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da K hidrólise de um material celulósico por enzima celulósica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que proteína total - é compreendida de 50-99,5 % p/p de proteína celulósica e 0.5-50 % p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 com atividade celulósica intensificada por i i

". 8 É 1-7 dias a 50-65ºC, comparada a uma hidrólise controle com igual carregamento total proteico sem Atividade celulósica intensificada (1-50 mg de proteína celulósica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLASTO 1,5L (Novozymes A/S, Bagsveerd, Dinamarca) —na presença de 3% de peso proteico total de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, de acordo com WO 02/095014) ou 3 % de peso proteico total de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2002/095014) de carregamento de — proteina celulase é usada como a fonte da atividade celulósica.

Os polipeptídeos GH61 com atividade celulósica intensificada melhoram a hidrólise de um material celulósico catalisado por enzima com atividade celulósica, reduzindo a quantidade de enzima celulósica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, 15º mais preferivelmente pelo menos 1,05 vez, mais preferivelmente pelo menos : 1,10 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vez, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente — pelomenos 10 vezes, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 20 vezes. | Família do glicosídeo hidrolase 61: O termo “família do ' glicosídeo hidrolase 61” ou “família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que está na família 61 de glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino- * 25 acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e i Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

: Família 10 do glicosídeo hidrolase: O termo “Família 10 do glicosídeo hidrolase” ou “Família GHIO0” ou “GHI0” significa um e 9 É polipeptídeo que está na família 10 de glicosídeo hidrolase, de acordo com Henrissat B., 1991, supra, e Bairoch A., 1996, supra. Atividade que degrada xilano: Os termos “atividade que degrada xilano” ou “atividade xilanolítica” significam uma atividade S — biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, beta- xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glicuronidases, acetil-xilano esterases, -— feruloil esterases, e alfa-glicuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios de enzimas xilanolíticas foram sumarizados em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoy] esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; 15º Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D- - xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xilan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381. A atividade total que degrada xilano pode ser medida determinando a redução de açúcares formada a partir de vários tipos de xilano — incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira | de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado : liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares reduzidos de 4-O-metil glicuronoxilano polimérico, da maneira descrita em Bailey, Biely, > 25 —Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase ' activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada i xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro : (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzima(s) que :

Í ' í i

” 10 - degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50ºC, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, À new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal.

Biochem 47: 273-279. Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta- D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta —(4)-xilo-oligosacarídeos curtas para remover sucessivos resíduos de D- —xilose a partir das terminações não reduzidas.

Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 umol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40ºC, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEENQ 20 0,01 %. Acetil-xilano esterase: O termo “acetil-xilano esterase” : significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, | acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetil-xilano esterase é determinada usando Pp —nitrofenilacetato 0,5 MM como substrato em acetato de sódio 50 mM, PH 5,0, | contendo TWEENTY 20 0,01 %. Uma unidade de acetil-xilano esterase é í definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ânion p- nitrofenolato por minuto em pH 5, 25ºC.

Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- “25 hidróxi3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73), que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir um açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos "naturais", para produzir - ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ésteres de ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterase, FAE-II,

"e 1 BR * cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, ou FAE-II. Com propósitos da presente invenção, a atividade da feruloil esterase é determinada usando p- nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 MM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase é igual a quantidade de enzima capaz de — liberar] umol de p-nitrofenolato anion por minuto em pH 5, 25ºC. Alfa-glicuronidase: O termo “alfa-glicuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glicuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo em D-glicuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glicuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma : unidade de alfa-glicuronidase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40ºC.

Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- —arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo . arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não reduzidos terminais em alfa-L-arabinosídeos. Ê A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- —arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo : de alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de * 25 arabinoxilanode trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, . Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 uL por 30 minutos a 40ºC, seguido por análise de arabinose por cromatografia de coluna AMINEXO HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Na 12 ã Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose.

O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose e o terceiro é a pectina.

A parede celular secundária, produzida apósa célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose.

A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, assim, um beta-(1-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturas —ramificadas complexas com um espectro de substituintes.

Embora em geral polimórfica, a celulose é encontrada no tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano.

As ' hemiceluloses em geral ligam hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

A celulose é encontrada em geral, por exemplo, nos caules, - folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores.

O material celulósico pode ser, mas sem limitação, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido municipal, resíduo de papel, e resíduo de polpa e papel moído (ver, por exemplo, Wiselogel er —al,1995,em Handbook on Bioethanol (Charles E.

Wyman, editor), pp.105- 118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource : Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. —Scheper, managing editor, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova ! Jorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular de planta contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista.

Em um aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose.

sa 13 a Em um aspecto, o material celulósico é material herbáceo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo florestal.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal.

Em um outro aspecto, o —material celulósico é resíduo de papel.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de polpa e papel moído.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo. i Em um outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus.

Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose : microcristalina.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de alga.

Em um outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose amorfa tratada com ácido fosfórico. —Emum outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.

À O material celulósico pode ser usado como é, ou pode ser '" submetido a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira descrita aqui.

Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado. - 25 Palha de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “palha de milho pré-tratada” significa um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído.

Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material que compreende um polissacarídeo de ue 14 " parede celular de planta contendo uma parte principal de resíduos de xilose ligados a beta-(1-4). Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma parte principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias curtas de carboidrato.

Compreendem ácido D-glucurônico ou seu —Áéterde 4-O-metila, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos compostos de D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose e D-glicose.

Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glicuronoxilanos, — (arabino)glicuronoxilanos, — (glicurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos.

Ver, por exemplo, Ebringerova ef al,2005, Adv.

Polym.

Sci. 186: 1-67. Nos métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado.

Em um aspecto preferido, o material | contendo xilano é lignocelulose.

Polipeptídeo isolado: Os termos “isolado” e “purificado” significam um polipeptídeo ou polinucleotídeo que é removido de pelo menos um componente com o qual é naturalmente associado.

Por exemplo, um polipeptídeo pode ser pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % i puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, e pelo menos 90 % puro, da maneira determinada por SDS-PAGE e um polinucleotídeo pode ser pelo | menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, : pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, e pelo menos 95 % puro, da maneira determinada por eletroforese em agarose. “25 Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptideo maduro” W significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são os aminoácidos 24 a 403 de SEQ ID NO: 2 baseados mm 15 . no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que aminoácidos 1 a 23 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal.

Sequência que codifica polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro são os nucleotídeos 70 a 1.384 de SEQ ID NO: 1 baseados no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 69 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em um outro aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro é a sequência de DNAc contida em nucleotídeos 70 a

1.384 de SEQ ID NO: 1.

Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de . sequência entre as duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

| 48: 443-453) da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice er al, 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente a versão

3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura ' de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUMO62). O rendimento da “maior identidade” marcado em Needle (obtido usando a opção não “— 25 resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a : seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número total de intervalos em alinhamento) Com propósitos da presente invenção, o grau de identidade de

= 16 "l sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al,2000, supra), preferivelmente a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUCA4.4). O rendimento da “maior identidade” marcada por Needle (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Desoxirribinucleotídecos — idênticos — x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número total de intervalos em alinhamento) Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (vários) aminoácidos deletados da terminação amino e/ou carboxil de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade . de xilanase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 340 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 360 resíduos de aminoácido e pelo À menos 380 resíduos de aminoácido.

Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotíideo com um ou mais (vários) nucleotídeos deletados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica polipeptídeo maduro; * 20 emquea subsequência codifica um fragmento com atividade de xilanase. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1.020 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1.080 nucleotídeos e pelo menos 1.140 nucleotídeos.

Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer . de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus —cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado)

' 17 * —ou podem codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácidos. | Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

Sequência codificante: O termo “sequência codificante” —signifia um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As extremidades da sequência codificante são em geral determinadas por um quadro aberto de leitura, que em geral começa com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos, tais como GTG e TTG, e termina com um códon de parada, tais como TAA, TAG e TGA. A sequência codificante pode ser um DNA, DNArc, sintética, ou polinucleotídeo recombinante.

DNAc: O termo "DNAc" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula RNAm madura, unida obtida de uma célula eucariótica. O DNAc precisa de sequências intron — que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de : RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm ' unido maduro.

Construto de ácido nucleico: O termo "construto de ácido —nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é , modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não pode existir de outra forma na natureza ou que é sintética. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” — quando o construto de ácido nucleico contém as sequências controle exigidas para a expressão de uma sequência codificante da presente invenção. | Sequências controle: O termo “sequências controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência controle pode

" 18 . Í ser natural ou estrangeira ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou natural ou estrangeira uma a outra. Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada trasncricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição adequada com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida ma produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacionais e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma moléculade DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligada a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, —transdução, e similares a um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

a Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade de xilanase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou deleção de um ou mais (vários) resíduos de aminoácido em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma alteração de um aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção de um aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar 1-3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido que ocupa uma posição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos Com Atividade de xilanase A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados com atividade de xilanase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada (i) na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) na sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) na fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste; (d) um variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQIDNO:2;e (£ um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d) ou (e) que apresenta atividade de xilanase.

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados com uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de

E 20 “pelomenos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que apresentam atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em não mais que dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Um polipeptideo da presente invenção compreende preferivelmente ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste com atividade de —xilanase. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 24 a 403 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a polipeptídeos isolados com atividade de xilanase que são codificados por polinucleotídeos que hidrolisam em condições de severidade muito elevada com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) a fita complementar de comprimento total de (1) ou (ii) (J.

—Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência deste, bem como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento desta, pode ser usado para determinar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos com atividade de xilanase a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou DNAc do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos padrões de Southern, a fim de mm 21 e identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas pode ser consideravelmente menores que a sequência completa, mas podem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em tamanho. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico tem pelomenos 100 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em tamanho. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com *?p, ?H, *S, biotina ou avidina). Tais sondas são incluídas na presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc preparada a partir de tais outras cepas pode ser selecionada para o DNA que hibridiza com —assondas descritas anteriormente e codifica um polipeptídeo com atividade de xilanase. O DNA genômico ou outro, a partir de tais outras cepas, pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo à SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, o material carreador é preferivelmente usado em um Southern blot. Com propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda de ácido nucleico marcada que — corresponde à sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; sua fita complementar de tamanho total; ou uma subsequência desta; em condições de severidade muito baixa a muito elevada. As moléculas nas quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições

RA NOSSA A ea ARS SANA = 22 . À podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X.

Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico são nucleotídeos 70 a

1.384 de SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é o polinucleotídeo contido no plasmídeo pMMar26 que está contido em E. coli NRRL B-50266, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo com atividade de xilanase. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é o polipeptídeo maduro que codifica a região contida no plasmídeo pMMar26 que está contido em E. coli NKRL B-50266. Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em tamanho, as condições de severidade muito baixa a muito elevada são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA cisalhado e desnaturado de esperma de salmão, e tanto formamida a 25 % para severidades muito baixas e baixas, formamida a 35 % para severidades médias a médias-altas, quanto formamida a 50% para severidades elevadas e muito elevadas, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas, de maneira ideal. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS 0,2 % a 45ºC (severidade muito baixa), a 50ºC (severidade baixa), a 55ºC (severidade média), a 60ºC (severidade média-alta), a 65ºC (severidade —alta))ea70ºC (severidade muito elevada).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em tamanho, as condições de severidade são definidas como pré- hibridização e hibridização em cerca de 5ºC a cerca de 10ºC abaixo da Tr calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc.

E 23 — Natl. Acad. Sci USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCI 0,09 M, pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 0,5 %, solução de Denhardt 1X, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato monobásico de sódio 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL, seguindo os procedimentos padrões de Southern blotting —porl2a24horasde maneira ideal. O material carreador é finalmente lavado uma vez em SCC 6X e SDS 0,1 % por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando SSC 6X a 5ºC a 10ºC abaixo da T,, calculada.

A presente invenção também diz respeito a polipeptídeos isolados com atividade de xilanase codificada por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: | ou a sequência de DNAc deste de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos

15. 97%, pelomenos 98%, pelo menos 99 %, ou 100 %.

A presente invenção também diz respeito a variantes que compreendem uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência homóloga deste. Preferivelmente, as alterações de aminoácido são de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 — resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mudando a carga líquida ou uma outra função, tal como uma região de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão no grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido a 24 - glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de — aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades fisico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudamopH ideal e similares.

Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo pai podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade de xilanase para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton er al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode — ser determinada por análise física da estrutura, da maneira determinada por tais técnica como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos er al., 1992, Science 255: 306-312; Smith er al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al.,

. 25 si 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com o polipeptídeo pai.

As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido S — simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese região-direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner er al., 1988, DNA 7: 127). Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness er al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893- 896). As moléculas de DNA mutagenizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente —sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 não é mais que 10, por exemplo, 1,2,3,4,5,6,7,8ou9.

O polipeptídeo pode ser polipeptídeo híbrido, no qual uma porção de um polipeptídeo é fundida na terminação N ou na terminação C de uma porção de um outro polipeptídeo.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fundido, ou ns 26 Rn polipeptídeo de fusão clivável, em que um outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção.

Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção.

As técnicas — para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na tecnologia, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira tal que eles estejam em alinhamento e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e terminador(s). As proteínas de fusão também podem ser construídas usando tecnologia de —inteína na qual as fusões são criadas pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779). Um polipeptídeo de fusão podem compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos.

Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos.

Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas sem limitação, o sítios revelados em Martin er al., 2003, J.

Ind.

Microbiol.

Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J.

Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson er al., 1997, Appl.

Environ.

Microbiol. 63: 3488-3493; Ward er al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. Fontes de polipeptídeos com atividade de xilanase Um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero.

Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, da maneira aqui usada junto com uma dada fonte, pode significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido.

Em um aspecto, o polipeptídeo obtido

FERA A tr a O AA ADA badalada sato, = 27 — —deuma dada fonte é secretado extracelularmente.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram-positiva, tal como um polipeptídeo com atividade de xilanase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococceus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como um polipeptídeo de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um outro aspecto, o polipeptideo é um polipeptídeo de Streptomyces — achromogenes, Streptomyces —avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

O polipeptídeo também pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptidco de Candida, Klwyveromyces, Pichia,y Saccharomyces, Scehizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou um polipeptíideo de fungo —filamentoso, tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula,

= 28 : " Leptospaeria, — Magnaporthe, — Melanocarpus, — Meripilus, — Múucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, — Saccharomyces — douglasil, — Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium

15. inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium “merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, — Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridiovides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium JSuniculosum, — Penicillium — purpurogenum, Penicillium ulaiense, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa,

a. 29 - Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptíideo é um — polipeptídeo de Penicillium sp. com atividade de xilanase, por exemplo, o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Será entendido que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção inclui tanto os estágios perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em consideração o nome da espécie pelo qual são conhecidas. Os versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes adequados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tais como o American Type Culture

15. Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, soli, compostos, água, etc.), usando as sondas anteriormente mencionadas. As técnicas para isolar microrganismos de habitats naturais são bem conhecidas na tecnologia. O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode então ser obtido selecionando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou —DNAc de um outro microrganismo ou amostra mista de DNA. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são bem conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

E ' 30 | Polinucleotídeos A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidas na tecnologia e incluem o isolamento do DNA genômico, preparação do DNAc, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da —polimerase (PCR) ou seleção de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturas compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova lorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, tais como reação de ligação daligase(LCR), transcrição ativada de ligação (LAT) e amplificação a base de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Penicillium, ou um outro organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser um alélico ou espécie variante do polipeptídeo que codifica a região do polinucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem em polinucleotídeos com um grau de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste de pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99%, oul00%, que codifica um polipeptídeo com atividade de xilanase.

A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos — substancialmente — similar ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência

- 31 É não natural do polipeptídeo.

Estes polipeptídeos podem diferir, de alguma maneira modificada por engenharia, do polipeptídeo isolado de sua fonte natural, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares.

O variante pode ser construído com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou na sequência de DNAc deste, por exemplo, uma subsequência deste, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeo que podem resultar em uma sequência de aminoácidos diferente.

Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam em condições de severidade muito elevada (i) na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) na sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) na fita complementar de comprimento total de (1) ou (11); ou variantes alélicos e subsequências destes (Sambrook er al., 1989, supra), da maneira aqui definida.

Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ D —NO:1,oua sequência contida no plasmídeo pMMar26 que está contido em E. coli NRRL B-50266, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 1 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 2 com atividade de xilanase, tal como o polinucleotídeo de nucleotídeos 70 a 1.384 de SEQ ID NO: 1. Construtos de ácido nucleico

: ' A presente invenção também diz respeito a construtos de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, operavelmente ligado a um ou mais (vários) sequências controle, que direciona a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira — adequada em condições compatíveis com as sequências controle.

Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar —polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia.

A sequência controle pode ser uma sequência promotora, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. À sequência promotora contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos quanto heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, operon lac de E. coli, gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA) e gene beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff er al., 1978, Proc. Natl.

TAS E 33 - Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição do construtos de ácido nucleico da presente invenção em células hospedeiras de fungo filamentoso são promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum 15º (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase Il de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase Il de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase IV de —Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado a partir de um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em Aspergilli, no qual o líder não traduzido é substituído por um líder não — traduzido de um gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergilli; exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir do gene que codifica alfa-amilase neutra em Aspergillus niger, em que o líder não traduzido é substituído por um líder não traduzido a partir do gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus

-. 34 | - oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos deste.

Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinase — de — Saccharomyces cerevisiae — (GAL1), — álcool — desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato — desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADE2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPD, metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUPI1) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para leveduras como células hospedeiras são descritos por Romanos ef al,1992,Yeast 8: 423-488.

A sequência controle também pode ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição. À sequência terminadora é operavelmente ligado à terminação 3º do polinucleotídeo que codifica o

15. polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus nigery/ TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato — desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores usados para levedura como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência controle também pode ser uma sequência líder adequada, quando transcrita é uma região não traduzida de um RNAm que é el 35 - importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada à terminação 5º do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada. Os líderes preferidos para as células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. Os líderes adequados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAFP). A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada à terminação 3º do

15. —polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de * escolha pode ser usada. As sequências de poliadenilação preferidas para as células — hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum € alfa-glicosidase de Aspergillus niger. As sequências de poliadenilação usadas para levedura como células hospedeiras são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990. A sequência controle também pode ser uma região que codifica um peptídeo sinal, que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via de

E 36 - “secreção da célula. A extremidade 5º da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter intrinsecamente uma sequência de peptídeo sinal codificante naturalmente ligada no quadro aberto de leitura, com o segmente da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5º da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. À sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante. Alternativamente, a sequência estrangeira de peptídeo sinal —codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada.

As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para NCIB 11837 amilase maltogênica de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, norM) e prsA de Bacillus —subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras de fungo filamentoso são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, —glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

Os peptídeos sinais usados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para fator alfa de Saccharomyces | i

E 37 - —cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeos sinais codificantes usadas são descritas por Romanos ef al., 1992, supra. A sequência controle também pode ser uma sequência de pro- — peptídeo codificante que codifica um pro-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pro- enzima ou pro-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pro- polipeptídeo é em geral inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pro-peptídeo a partir do pro- polipeptídeo. A sequência de pro-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pro- peptídeos estão presentes na terminação N de um polipeptídeo, a sequência de pro-peptídeo está posicionada próxima à terminação N de um polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal está posicionada próxima à terminação N da sequência de pro-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada e desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um — composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procariotos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem lida ati ANNA AE A A , - 38 | - ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e o genes de metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado com a sequência regulatória. Vetores de expressão A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada trasncricionais e translacionais. Os vários nucleotídeos e sequências controle podem ser reunidos para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o

15. polinucleotideo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um construto de ácido nucleico que compreende a sequência, em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada com as sequências controle adequadas para a expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da — compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado. O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja a Í replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um

Í i e 39 - — plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial.

O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação.

Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado.

Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

O vetor contém preferivelmente um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares.

Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotóficos e similares.

Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina.

Os marcadores adequados para levedura como células hospedeiras são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em células hospedeiras — de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-S'- fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes destes.

São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus osd genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

” 40 | - Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotíideos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a

10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos —integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar —autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYCI177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, prTA1060, e pAMBI que permitem a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura

"ás 41 - —como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 mícron, ARSI1, ARSA, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CENG6. Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al,1987,Nucleic Ácids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883. Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo.

Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células hospedeiras A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção —operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção.

Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor auto replicante extra-

! " 42 | - cromossomal da maneira descrita anteriormente. O termo "célula hospedeira" ! inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. À escolha de uma célula hospedeira dependerá muito do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, — Geobacillus, Lactobacillus, Lactococeus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter,

15. Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces | achromogenes, — Streptomyces — avermitilis, — Streptomyces coelicolor, ! Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

Í |

: ' 43 - A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, por exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol.

Gen.

Genet. 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J.

Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J.

Mol.

Biol. 56: 209- 221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 7T42-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J.

Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli, por exemplo, pode ser realizada por transformação de —protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J.

Mol.

Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Ácids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces, por - exemplo, pode ser realizada por transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J.

Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke er al., 2001, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas, por exemplo, pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi er al., 2006, J.

Microbiol.

Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl.

Environ.

Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode ser realizada competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect.

Immun. 32: 1295-1297), por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, —Microbios 68: 189-207, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl.

Environ.

Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol.

Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

mb 44 " A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo. A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, da maneira aqui usada, incluii os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycotae Zygomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8º edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), bem como o Oomycota (da maneira citada em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth er al., 1995, supra).

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas i (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem - aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, — Saccharomyces — carlsbergensis, — Saccharomyces — cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluwyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth er al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana,

— 45 — — manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o — catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, — Chrysosporium, — Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

. Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus,

15. Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergilluns nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium —heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila,

me 46 ã Neurospora — crassa, — Penicillium — purpurogenum, — Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton er al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para À transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, - —GeneT8&:1l47-156,e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, MJl., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de produção W A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Penicillium.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente

EO SEAEAAIASNANOESAAaAAAAS mo 47 É adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio e condições adequadas que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture | Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo - —pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do —polipeptídeo.

O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, — evaporação ou precipitação.

O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos ul 48 ú eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos — substancialmente puros.

Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira da presente invenção que expressa um polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas A presente invenção também diz respeito a plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, que i compreende um polinucleotídeo isolado da presente invenção de maneira a - expressar e produzir o polipeptideo em quantidades recuperáveis. O polipeptideo pode ser recuperado da planta ou parte da planta.

Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator anti-nutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou —monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho).

Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana.

Exemplos de parte da plantas são caule, calo, folhas, raiz,

= 49 á frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, S — peroxissomos e citoplasma também são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma maneira, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

São também incluídas no escopo da presente invenção são a progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta. : A planta transgênica ou célula de planta que expressa um polipeptídeo pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na

15. tecnologia. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando um ou mais (vários) construtos de expressão que codificam um polipeptídeo no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e que propagam o a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico, que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo operavelmente ligado a sequências regulatórias adequadas exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um — marcador selecionável usado para identificar células hospedeiras, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha das sequências regulatórias, tais como sequências

E 50 promotoras e terminadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em onde, quando e como deseja-se expressar o polipeptídeo. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser para O 5 — desenvolvimento, específica de estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte da planta tal como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina 1 do milho, eo promotor de actina | de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675- ó 689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos - — de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885- 889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de um proteína de corpo oleoso de semente Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1.000), o promotor do gene adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen.

E s1 - Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol.

Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade, ou induzido por — substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um polipeptídeo na planta.

Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, revelam o uso do primeiro intron do gene actina 1 de arroz : para melhorar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do —construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e 20º eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Atualmente, a transferêntia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol.

Biol 19:15-38) e também pode ser usado para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados por estas plantas.

Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos ml 52 É embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil etal., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de — protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh ef al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos de transformação adicionais para uso de acordo com a presente revelação incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e

7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra). Após a transformação, os transformantes com o construto de expressão incorporados são selecionados e regenerados nas plantas completas, — de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, o procedimento da transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto após as gerações usando,

15. por exemplo, co-transformação com dois construtos de DNA-T separados ou excisão sítio específica do gene de seleção por uma recombinase específica. Além de direcionar a transformação de um genótipo particular de planta com um construto preparado de acordo com a presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o —construto em uma segunda planta que precisa do construto. Por exemplo, um construto que codifica um polipeptídeo pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta daquela dada variedade. Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Da maneira aqui usada, progênie pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta mãe preparada de acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção, ou uma porção de um ns 53 ' * construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. Os cruzamentos resultam na introdução de um transgene em uma linhagem de planta polinizando de maneira cruzada uma linhagem inicial com uma linhagem de planta doadora. Os exemplos não limitantes de tais etapas são articulados adicionalmente na patente U.S. 7.151.204.

As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão de retrocruzamento. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, inato, híbrido convertido por retrocruzamento.

Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um antecedente i genético em um outro. À seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com . relação à reprodução convencional, na qual ele pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que de outra forma apresenta um antecedente genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma mãe elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que — possuinão apenas a característica de interesse, mas também apresentam uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta maneira, o número de gerações exigidas para ingressar uma ou mais características em um antecedente genético particular é minimizado.

A presente invenção também diz respeito a métodos de — produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta, que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Remoção ou redução da atividade da xilanase

ETERNAS SRA RSRS SRA A RSA SUE NANA ANSA GLENN nm 54 á A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um mutante de uma célula mãe, que compreendem interromper ou deletar um polinucleotídeo, ou uma porção deste, codificar um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante que produz menos do S — polipeptídeo do que a célula mãe quando cultivada nas mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída reduzindo ou eliminando a expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, interrupções, substituições ou deleções.

Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é inativado.

O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificante, ou uma parte desta, essencial para a atividade, ou um elemento regulatório exigido para a expressão da região codificante.

Um exemplo de uma sequência - — regulatória ou controle como esta pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo.

Outras sequências controle para possível modificação incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, sequência de peptídeo sinal, terminador de transcrição e ativador transcricional.

A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada submetendo a célula mãe à mutagênese e selecionando células mutantes nas quais a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada.

A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo a sequência de DNA à —mutagênese gerada por PCR.

Além do mais, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes mutagênicos.

Exemplos de um agente mutagênico físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, — N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina = (MNNG), — O-metil

Ná 55 b ' hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é realizada tipicamente incubando a célula mãe a ser mutagenizada na presença do agente — mutagênico de escolha em condições adequadas, e triando e/ou selecionando células mutantes que exibem expressão reduzida ou nenhuma expressão do gene. A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada por introdução, substituição, ou remoção de um ou mais (vários) — nucleotídeos no gene ou um elemento regulatório exigido para a transcrição ou tradução deste. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou — removidos de maneira a resultar na introdução de um códon de parada, na - — remoção do códon inicial, ou em uma mudança no quadro aberto de leitura. Tal modificação ou inativação pode ser realizada por mutagênese sítio — direcionada ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Embora a princípio a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa o polinucleotídeo a ser modificado, é preferível que a modificação seja realizada in vitro da maneira exemplificada a seguir.

Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo baseia-se nas técnicas de substituição de gene, deleção de gene ou rompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde ao polinucleotídeo endógeno é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácidos nucleicos defeituosa que é então transformada na célula mãe para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de ácidos nucleicos defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso também codifique um marcador que pode ser usado para a seleção

E 56 ; * de transformantes em que o polinucleotídeo foi modificado ou destruído. Em um aspecto particularmente preferido, o polinucleotídeo é interrompido com um marcador selecionável tais como aqueles aqui descritos. A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a S — expressão de um polipeptídeo com atividade de xilanase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de fita dupla (RNAds), em que o RNAds compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o RNAds tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais — nucleotídeos duplex em tamanho.

O RNAds é preferivelmente um RNA de interferência pequeno i (RNAsi) ou um RNA micro (RNAmi). Em um aspecto preferido, o RNAds é - "RNA de interferência pequeno (RNAssi) para inibir a transcrição. Em um outro aspecto preferido, o RNAds é RNA micro (RNAsmi) para inibir a tradução.

A presente invenção também diz respeito a tais moléculas de RNA de fita dupla (RNAds) que compreendem uma porção da sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 para inibir expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por nenhum mecanismo de ação particular, o RNAds pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de fita simples (RNAss) de sequências similares ou idênticas, incluindo RNAms endógenos. Quando uma célula é exposta ao RNAds, o RNAm do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo denominado RNA de interferência (RNAI).

Os RNAsds da presente invenção podem ser usados no silenciamento de gene. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para degradar seletivamente o RNA usando um RNAids da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAds podem ser usadas para gerar uma mutação de perda-de-

ms ST já função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos de preparar e usar moléculas de RNAds para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, patentes U.S. 6.489.127, 6.506.559,

6.511.824 e 6.515.109.

A presente invenção diz respeito adicionalmente a uma célula mutante de uma célula mãe que compreende uma interrupção ou deleção de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou uma sequência controle deste, ou um gene silenciado que codifica o polipeptídeo, que resulta na célula mutante processando menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo, comparada à célula mãe.

As células mutantes deficientes em polipeptídeo são | particularmente usadas nas células hospedeiras para a expressão de - — polipeptídeos naturais e heterólogos. Portanto, a presente invenção diz respeito adicionalmente a métodos de produzir um polipeptídeo heterólogo ou natural que compreende: (a) cultivar a célula mutante em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo "polipeptídeos heterólogos" significa polipeptídeos que não são naturais da célula hospedeira, por exemplo, um variante de uma proteína natural. A célula hospedeira pode compreender mais de uma cópia de um —polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo heterólogo ou natural. Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na técnica. Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente livre de xilanase são de particular interesse na produção de — polipeptídeos de eucariotos, em particular, proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes em xilanase também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico, tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores e similares. O termo "polipeptídeos de eucarioto" inclui não apenas polipeptídeos naturais, mas na s8 ' também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados por substituições, deleções ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para melhorar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e similares.

Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um produto de proteína essencialmente livre de atividade de xilanase que é sintetizado por um método da presente invenção.

Composições A presente invenção também diz respeito a composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um polipeptídeo como este. O termo i "enriquecido" indica que a atividade de xilanase da composição aumentou, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição de mono-componente. Alternativamente, a composição pode compreender "múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa- glicosidase, beta-glicosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(s) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por um microrganismo que pertence ao gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium

E 59 É culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo, Humicola insolens ou Humicola lanuginosa, ou Trichoderma, por exemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As composições podem ser preparadas de acordo com métodos — conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca.

Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado.

O polipeptídeo pode ser estabilizado de acordo com métodos - conhecidos na técnica.

Usos A presente invenção é também diz respeito a métodos de usar os polipeptídeos com atividade de xilanase, ou composições destes.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para degradar ou converter paredes celulares de planta ou qualquer material contendo xilano, por exemplo, lignocelulose, que se origina das paredes celulares vegetais (ver, por exemplo, WO 2002/18561). Exemplos de vários usos são descritos a seguir.

A dosagem dos polipeptídeos da presente invenção e outras condições nas quais os polipeptídeos são usados podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

A degradação enzimática de um material contendo xilano é — facilitada por remoção completa ou parcial das ramificações laterais.

Os polipeptídeos da presente invenção são preferivelmente usados junto com outras enzimas que degradam xilano, tais como xilanases, acetil-xilano esterases, arabinofuranosidases, xilosidases, feruloil esterases, glicuronidases e uma combinação destas, em processos em que o material contendo xilano

"a 60 ' * deveser degradado. Por exemplo, os grupos acetila podem ser removidos por acetil-xilano esterases; os grupos arabinose por alfa-arabinosidases; os grupos feruloila por feruloil esterases e os grupos de ácido glucurônico por alfa- glicuronidases. Os oligômeros liberados pelas xilanases, ou por uma S — combinação de xilanases e enzimas que hidrolisam ramificação lateral, podem ser degradados adicionalmente em xilose livre por beta-xilosidases.

A presente invenção também diz respeito a métodos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano que compreendem: tratar o material celulósico ou contendo xilano com um composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método | compreende recuperar adicionalmente o material celulósico ou contendo - xilano degradado ou convertido.

A presente invenção também diz respeito a métodos para produzir um produto de fermentação que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico ou contendo xilano com uma composição de enzima, na presença de um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico ou contendo xilano sacarificado com um ou mais (vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito a métodos de fermentar um material celulósico ou contendo xilano que compreendem: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais (vários) —microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação. Em um outro aspecto preferido, o método mo 61 1 compreende recuperar adicionalmente o produto de fermentação a partir da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar um material celulósico ou contendo xilano em açúcares —fermentáveis e converter os açúcares fermentáveis em muitas substâncias utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos de fermentação (por exemplo, ácidos, alcoóis, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir de material celulósico ou contendo xilano envolve tipicamente pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processamento de material celulósico ou contendo xilano, de i acordo com a presente invenção, pode ser realizado usando processos - — convencionais na técnica. Além do mais, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas sem limitação, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultânea (SSF); sacarificação e co- fermentação simultânea (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e co-fermentação separadas (SHCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHCF) e conversão microbiana direta(DMC). SHF usa etapas de processo separadas para hidrolisar de maneira enzimática primeiro o material celulósico ou contendo xilano em açúcares fermentáveis, por exemplo, açucares do tipo glicose, celobiose, celotriose e pentose, e então fermentar os — açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico ou contendo xilano e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Ultilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF

VAN AAA ARO lda EA AAA LCA.

má 62 ' envolvea co-fermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF envolve uma etapa separada — de hidrólisee, além disso, um etapa simultânea de sacarificação e hidrólise que pode ser realizada no mesmo reator. As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em alta temperatura seguida por SSF em uma temperatura menor que a cepa da fermentação possa tolerar. DMC combina todos os três processos (produção, hidrólise e fermentação enzimática) em uma ou mais (várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para a conversão do material celulósico ou contendo xilano em açúcares - — fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial —cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes, pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.

Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado com lote alimentado, um reator agitado em lotes, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the — cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:

1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65),

us 63 ' : ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. —Biochem. Biotechnol. 56: 1141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrusor para hidrólise e/ou fermentação. Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas de material celulósico e/ou contendo xilano (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: À The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics? . Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production,

15. Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier er al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. de Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40). O material celulósico ou contendo xilano também pode ser submetido a redução de tamanho de partícula, pré-embebimento, umidificação, lavagem, ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica. Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido nm 64 ” diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação a úmido, explosão a úmido, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré-tratamentos adicionais incluem tratamentos com percolação com amônia, — ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO, supercrítico, HO supercrítica, ozônio e irradiação gama.

O material celulósico ou contendo xilano pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a i etapa de pré-tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa : em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico ou contendo xilano é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico ou contendo xilano passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-230ºC, mais preferivelmente 160-200ºC, e acima de tudo preferivelmente 170-190ºC, onde a faixa de temperatura ideal depende de qualquer adição de um catalisador químico. O tempo de permanência para o — pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-15 minutos, mais preferivelmente 3-12 minutos, e acima de tudo preferivelmente 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e de qualquer adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o

TGDINREAEINRRN MEAN RCA SAS aà suba: e 65 material celulósico ou contendo xilano é úmido em geral apenas durante o pré-tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão — atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, AÁppl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa —ahidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida em apenas uma extensão limitada.

Um catalisador, tal como H2SO, ou SO, (tipicamente 0,3 a 3 % p/p), é em geral adicionado ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 7156-762).

Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Exemplos de processo de pré- tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação a úmido, explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) e pré- tratamentos com organosolv.

No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico ou contendo xilano é misturado com o ácido diluído, tipicamente H,SO,, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica. O pré- tratamento com ácido diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

Vários métodos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com cal, oxidação a úmido, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX).

O pré-tratamento com cal é realizado com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, ou amônia em baixas temperaturas de 85-150ºC e tempo de permanência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource | Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673- - 686). WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900, e WO 2006/110901 revelam métodos de pré-tratamento que usa amônia.

A oxidação a úmido é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200ºC por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou sobrepressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol.

Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40 % de material seco, mais preferivelmente 2-30 % de material seco, e acima de tudo preferivelmente 5-20 % de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação a úmido, conhecido como explosão a úmido (combinação de explosão de oxidação a úmido e vapor), pode manusear material seco até 30 %. Na explosão a úmido, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de permanência. O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282). A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico ou contendo xilano com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas, tal como 90-100ºC, e alta pressão tal como 17-20 S —barpor5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 2219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri er al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). O pré-tratamento com AFEX resulta na —despolimerização de celulose e hidrólise parcial de hemicelulose. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados. Í O pré-tratamento com organosolv delignifica o material - — celulósico ou contendo xilano por extração usando etanol aquoso (40-60 % etanol) a 160-200ºC por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. —90:473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi ef al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalizador. Em pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose é removida. Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são — descritos por Schell er al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechmol. Vol. 105-108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730. Em um aspecto, o pré-tratamento químico é realizado preferivelmente como um tratamento ácido e, mais preferivelmente, como um tratamento com ácido diluído contínuo e/ou fraco. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido suceínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. O tratamento com ácido i fraco é conduzido na faixa de PH de preferivelmente 1-5, mais !

Í í preferivelmente 1-4, e acima de tudo preferivelmente 1-3. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 20 % em peso de ácido, mais preferivelmente 0,05 a 10 % em peso de ácido, ainda mais preferivelmente 0,1 a 5 % em peso de ácido, e acima de tudo preferivelmente 0,2a2,0% em peso de ácido. O ácido é colocado em contato com material celulósico ou contendo xilano e mantido a uma temperatura na faixa de preferivelmente 160-220ºC, e mais preferivelmente 165-195ºC, por períodos que variam de segundos a minutos, por exemplo, 1 segundo a 60 minutos. Em um outro aspecto, pré-tratamento é realizado como uma —etapade explosão de fibra (etapa de pré-tratamento com AF EX). Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama í aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico ou contendo xilano está - — presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, mais preferivelmente entre 20-70 % em peso, e acima de tudo preferivelmente entre 30-60 % em peso, tal como em torno de 50 % em peso. O material celulósico ou contendo xilano pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

Pré-tratamento mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem a úmido, ou moagem com esfera vibratória).

Pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento físico” refere- se a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina do material celulósico ou contendo —xilano. Por exemplo, o pré-tratamento físico pode envolver irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas), explosão — vaporosa/vapor, hidrotermólise e combinações destes.

O pré-tratamento físico pode envolver alta pressão e/ou alta temperatura (explosão por vapor). Em um aspecto, alta pressão significa i i i pressão na faixa de preferivelmente cerca de 300 a cerca de 600 psi (2,1 MPa a cerca de 4,2 MPa), mais preferivelmente cerca de 350 a cerca de 550 psi (2,4 a cerca de 3,8 MPa), e acima de tudo preferivelmente cerca de 400 a cerca de 500 psi (2,8 a cerca de 3,4 MPa), tal como em torno de 450 psi (3,1 —MPa) Emum outro aspecto, alta temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300ºC, preferivelmente cerca de 140 a cerca de 235ºC. Em um aspecto preferido, o pré-tratamento mecânico é realizado em um processo em lotes, sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia. Pré-tratamento químico e físico combinado: O material f celulósico ou contendo xilano pode ser pré-tratado tanto fisica quanto . quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver o tratamento com ácido fraco ou diluído e tratamento com alta temperatura e/ou pressão. Os pré-tratamentos físicos e químicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, da maneira desejada. Um pré- tratamento mecânico também pode ser incluído. Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico ou contendo xilano é submetido aos pré-tratamento mecânico, químico ou físico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material celulósico ou — contendo xilano. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.- A., 1996, Pretreatments of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179- ! 212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for Í

Í 1 enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, 4dv. Áppl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J, Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T,, ed., Springer- Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for — ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, — Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95). . Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico ou contendo xilano, por exemplo, pré- 15º tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção. Os componentes —dacomposição de enzima também podem ser adicionados sequencialmente.

A hidrólise enzimática é realizada preferivelmente em um ambiente aquoso adequado em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto preferido, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo em lote alimentado ou contínuo, onde o material celulósico ou contendo xilano (substrato) é alimentado gradualmente, por exemplo, por uma enzima contendo a solução de hidrólise.

A sacarificação é realizada em geral em reatores de tanque i

Í i agitado ou fermentadores em pH, temperatura e condições de mistura controlados.

O tempo do processo, temperatura e condições de PH adequados podem ser facilmente determinados pelos versados na técnica.

Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada de S — maneira preferivel em cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente cerca de 16 a cerca de 72 horas, e acima de tudo preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas.

A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25ºC a cerca de 70ºC, mais preferivelmente cerca de 30ºC a cerca de 65ºC, e mais preferivelmente cerca de 40ºC to 60ºC, em particular cerca de 50ºC.

O pH está na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7, e acima de tudo preferivelmente | cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O teor dos sólidos secos . está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso, e acima de tudo preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

A composição de enzima compreende preferivelmente enzimas com atividade celulósica e/ou atividade que degrada xilano.

Em um aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas que degradam xilano.

Em um outro aspecto, a composição de enzima — compreende uma ou mais (várias) enzima celulósicas.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas que degradam xilano e uma ou mais (várias) enzima celulósicas.

A uma ou mais (várias) enzimas que degradam xilano são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma —acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

A uma ou mais (várias) enzimas celulósicas ; são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em uma i endoglicanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase. ! Em um outro aspecto preferido, a composição de enzima Í j $ í compreendem mais ou ainda mais um polipeptídeo com atividade celulósica intensificada (ver, por exemplo, WO 2005/074647, WO 2005/074656, e WO 2007/089290). Em um outro aspecto, a composição de enzima pode compreender mais ou ainda mais uma ou mais (várias) atividade adicionais de enzima para melhorar a degradação do material contendo celulose.

As enzimas adicionais preferidas são hemicelulases (por exemplo, alfa-D- glicuronidases, — alfa-L-arabinofuranosidases, — endo-mananases, — beta- manosidases, alfa-galactosidases, endo-alfa-L-arabinanases, beta- galactosidases), carboidrato-esterases (por exemplo, acetil-xilano esterases, —acetil-manano esterases, esterases de ácido ferílico, esterases de ácido coumárico, glicuronoil esterases), pectinases, proteases, — enzimas ligninolíticas (por exemplo, lacases, mangânes peroxidases, lignina - peroxidases, enzimas produtoras de ELO;,, oxidorredutases), expansinas, swoleninas ou misturas destes.

Nos métodos da presente invenção, a(s) 15º enzima(s) adicional(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou após a propagação do(s) microrganismo(s) fermentador(s). Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes.

Por exemplo, um ou mais (vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que é usada as uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (vários) outros componentes da composição de enzima.

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima — podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição de enzima.

A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações proteicas multicomponente e monocomponente.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso nos processos aqui descritos tais

FEAR AA LA aaa oa E ada NASA LAS MNE SA EAN RASA Ad AA a 73 como, por exemplo, um caldo bruto de fermentação com ou sem células removidas, uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte da enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado que não está em pó, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionado estabilizadores tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico, de acordo com os processos estabelecidos. As quantidades ideais das enzimas e polipeptídeos com atividade de xilanase dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, a mistura de enzima celulósicas do componente, o material - celulósico ou contendo xilano, a concentração do material celulósico ou contendo xilano, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico ou contendo xilano, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultânea).

Em um aspecto preferido, uma quantidade eficiente de enzima(s) celulósica(s) e/ou enzima(s) que degrada(m) xilano em material celulósico ou contendo xilano está em cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, — preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico — ou contendo xilano.

Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficiente de polipeptídeo(s) com atividade de xilanase no material celulósico ou contendo xilano é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais

Í preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de O0,la cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de material celulósico ou contendo xilano.

Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficiente de —polipeptídeo(s) com atividade de xilanase nas enzima(s) celulósica(s) e/ou enzima(s) que degrada(m) xilano é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, | preferivelmente em cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente em - cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g& de enzima(s) celulósica(s). As enzimas podem ser derivadas ou obtidas de qualquer origem adequada, incluindo, origem bacteriana, fúngica, levedura, vegetal ou de mamífero.

O termo “obtida” significa aqui que a enzima pode ter sido isolada de um organismo que produz naturalmente a enzima como uma natural.

O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro que emprega métodos aqui descritos, em que a enzima produzida de maneira recombinante —é tanto natural ou estrangeira ao organismo hospedeiro quanto apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (vários) aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima produzida de maneira recombinante que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos ou uma enzima i produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira, os variantes obtidos de maneira recombinante, tal como por mutagênese sítio direcionada ou — embaralhamento.

Um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram-positiva, tal como um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade — que degrada xilano de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococeus, Clostridium, Geobacillus, ou i Oceanobacillus, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como um - polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasma.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtili, ou Bacillus thuringiensis.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptideo é um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada —xilano de Streptococeus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Streptomyces achromogenes, Streptomyces — avermitilis,

PRA EANES AAA ASA NANA AAA MEAAMORADCSE 76 Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans. O polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano também pode ser um polipeptídeo de fungo, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Candida, Klwveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso, tal como um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, “Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococeus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, - Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Seytalidium, T. alaromyces, Thermoascus, Thielavia, T. olypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, — Saccharomyces — douglasii, Saccharomyces — kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus Japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium i

ESSENTIAL GAAANESEAANLSNNSMOONASSS T7 keratinophilum, Chrysosporium Iucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium — queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium eculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, —Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium " funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, - — Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccata.

Mutantes de polipeptídeos com atividade de enzima celulósica ou atividade que degrada xilano quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica também podem ser usados.

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente — célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As proteínas celulósicas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

Exemplos de preparações de proteína celulósica comerciais adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLICTM — Ctec(Novozymes A/S), CELLUCLAST!M (Novozymes A/S), NOVOZ YM'TM 188 (Novozymes A/S), CELLUZYMETY (Novozymes A/S), CEREFLO'!YM (Novozymes A/S), e ULTRAFLOTY (Novozymes A/S), ACCELERASE"Y (Genencor Int.), LAMINEX'YM (Genencor Int.), SPEZYMETY CP (Genencor Tnt.), ROHAMENTTY 7069 W (Róhm GmbH), FIBREZYMEQG LDI (Dyadic International, Inc), FIBREZYMEGS LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTARG 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são Ê adicionadas em quantidades eficiente de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em - peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0% em peso de sólidos.

Exemplos de endoglicanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas sem limitação, uma endoglicanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO — 00/70031, WO 05/093050); endoglicanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050) e endoglicanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

Exemplos de endoglicanases fúngicas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas sem limitação, uma endoglicanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253- 263, GENBANK'Y número de acesso MI15665); endoglicanase Il de Trichoderma reesei (Saloheimo, er al., 1988, Gene 63:11-22; GENBANK'Y número de acesso M19373); endoglicanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; GENBANKY número de acesso AB0O03694); endoglicanase IV de Trichoderma reesei (Saloheimo et |

Í al., 1997, Eur.

J.

Biochem. 249: 584-591; GENBANK'Y“ número de acesso Y11113) e endoglicanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; GENBANK'Y número de acesso 7233381); endoglicanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic — AÁcids Research 18: 5884); endoglicanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglicanase de Erwinia carotovara (Saarilahti er al, 1990, Gene 90: 9-14); endoglicanase de Fusarium oxysporum (GENBANK'YX número de acesso 129381); endoglicanase de Humicola grisea var. thermoidea (GENBANK'Y número de acesso ABO03107); endoglicanase de Melanocarpus — albomyces (GENBANK'M número de acesso MALS15703); endoglicanase de Neurospora crassa (GENBANK'Y número de acesso XM 324477); - — endoglicanase V de Humicola insolens; endoglicanase de CBS 117.65 Myceliophthora thermophila; endoglicanasede CBS 495.95 basidiomiceto; —endoglicanase de CBS 494.95 basidiomiceto; endoglicanase de NRRL 8126 CELO6B Thielavia terrestris; endoglicanase de NRRL 8126 CEL6C Thielavia terrestris, endoglicanase de NRRL 8126 CEL7C Thielavia terrestris; endoglicanase de NRRL 8126 CEL7E Thielavia terrestris; endoglicanase de NRRL 8126 CEL7F Thielavia terrestris;, endoglicanase de ATCC 62373 CEL7A Cladorrhinum foecundissimum; e endoglicanase de Trichoderma reesei cepa número VTT-D-80133 (GENBANK'Y número de acesso M15665). Exemplos de celobioidrolases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobicidrolase Il de Trichoderma reesei; celobioidrolase I de Humicola insolens, celobioidrolase 1l de Myceliophthora thermophila, celobioidrolase 1l de Thielavia terrestris (CEL6A), celobioidrolase 1 de Chaetomium —thermophilum e celobioidrolase Il de Chaetomium thermophilum.

Exemplos de beta-glicosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glicosidase de Aspergillus Oryzae; beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus; beta-glicosidase de Penicillium brasilianum IBT 20888; beta-glicosidase de Aspergillus niger e beta- — glicosidase de Aspergillus aculeatus.

O polipeptídeo de Aspergillus oryzae com atividade de beta- glicosidase pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. O polipeptídeo de Aspergillus fumigatus com atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com WO 2005/047499. O polipeptídeo de Penicillium brasilianum com atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com WO 2007/019442. O polipeptídeo de Aspergillus niger com atividade de beta- glicosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. - 275: 4973-4980. O polipeptídeo de Aspergillus aculeatus com atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173:287-288.

A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é a proteína de fusão BG variante de beta- glicosidase de Aspergillus oryzae ou a proteína de fusão beta-glicosidase de Aspergillus oryzae obtida de acordo com WO 2008/057637.

Outras endoglicanases, celobioidrolases e beta-glicosidases são reveladas em várias famílias de glicosil hidrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acido sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification —ofglycosylhydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Outras enzima celulósicas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em EP 495,257, EP 531,315, EP 531,372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465,

WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO —2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 4.435.307, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263, patente U.S. 5.686.593, — patente U.S.5.691.178, patente U.S. 5.763.254 e patente U.S. 5.776.757.

Nos métodos da presente invenção, qualquer polipeptídeo com * atividade celulósica intensificada pode ser usado.

, Em um primeiro aspecto, o polipeptídeo com atividade celulósica intensificada compreende os motivos a seguir: [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] e [EFW]-[TF]-K- [AIV], em que X é qualquer aminoácido, X(4,5) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4 ou 5, e X(4) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4.

O polipeptídeo que compreende os motivos anterriomente observados podem compreender adicionalmente: H-X(1,2)-G-P-X(3)-[Y W]-[AILMV], [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FIL V]-X-[IL V], ou H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]- [FILV]-X-[ILV], em que X é qualquer aminoácido, X(1,2) é qualquer aminoácido na posição 1 ou posições contíguas 2, X(3) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 3, e X(2) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 2. Nos motivos anteriores, a abreviação do aminoácido de única letra IUPAC aceita é empregada.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo com atividade celulósica intensificada compreende adicionalmente H-X(1,2)-G-P-X(3)- [Y W]-[AILMV]. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo isolado com — atividade celulósica intensificada compreende adicionalmente [EQ]-X-Y- X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]. Em um outro aspecto preferido, o polipeptiddo — com atividade celulósica intensificada compreende adicionalmente H-X(1,2)-G-P-X(3)-[Y W]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X- [EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

Em um segundo aspecto, o polipeptídeo com atividade celulósica intensificada compreende o motivo a seguir: IILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)- UM-[HNQ], " em que x é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4 ou 5, e x(3) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 3. No motivo anterior, a abreviação do aminoácido de única letra IUPAC aceita é empregada.

Exemplos de polipeptideos com atividade celulósica intensificada usados nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, polipeptídeos com atividade celulósica intensificada de Thielavia terrestris (WO 2005/074647); polipeptídeos com atividade celulósica intensificada de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656); polipeptídeos com atividade celulósica intensificada de Trichoderma reesei (WO 2007/089290); e polipeptídeos com atividade celulósica intensificada de Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935; WO 2009/085859; WO 2009/085864; WO 2009/085868).

Exemplos de preparações de enzima comerciais que degradam xilano adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYMETY (Novozymes A/S), CELLICTM Htec (Novozymes A/S), VISCOZYMEGS (Novozymes A/S), ULTRAFLOS (Novozymes A/S),

PULPZYMEG& HC (Novozymes A/S), MULTIFECTO Xilanase (Genencor Int), ECOPULP& TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOLTYM 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL'!M 740L (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOLTY 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

Exemplos de xilanases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanase de Aspergillus aculeatus (GeneSegP:AAR63790; WO 94/21785), xilanases de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256) e xilanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210). Exemplos de beta-xilosidases usadas nos métodos da presente — — invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidase de Trichoderma reesei - — (UniProtKB/ITEMBL número de acesso Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt número de acesso Q8X212), e Neurospora crassa (SwissProt número de acesso Q7/SOW4).

Exemplos de acetil-xilano esterases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetil-xilano esterase de Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), acetil-xilano esterase de Neurospora crassa (UniProt número de acesso q7s259), acetil-xilano esterase de Thielavia - terrestrris NRRL 8126 (WO 2009/042846), acetil-xilano esterase de Chaetomium globosum (Uniprot número de acesso Q2GWX4), acetil-xilano esterase de Chaetomium gracile (GeneSeqP número de acesso AAB82124), acetil-xilano esterase de Phaeosphaeria nodorum (Uniprot número de acesso QO0UHII), e acetil-xilano esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709).

Exemplos de esterases de ácido ferílico usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), feruloil esterase de Neurospora crassa (UniProt número de acesso Q9HGR3) e feruloil esterase de

Neosartorya fischeri (UniProt Número de acesso A1ID9TA4).

Exemplos de arabinofuranosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073383) e arabinofuranosidase de Aspergillus niger (GeneSeqP número de acesso AAR94170).

Exemplos de alfa-glicuronidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glicuronidase de Aspergillus clavatus (UniProt número de acesso alcc12), alfa-glicuronidase de Trichoderma reesei (Uniprot número de acesso Q99024), alfa-glicuronidase de Talaromyces emersonii (UniProt número de acesso Q8X211), alfa- glicuronidase de Aspergillus niger (Uniprot número de acesso Q96WX9), É alfa-glicuronidase de Aspergillus terreus (SwissProt número de acesso - QO0CJP9) e alfa-glicuronidase de Aspergillus fumigatus (SwissProt número de acesso Q4WWA45).

As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas por fermentação das cepas mocrobianas observadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para o crescimento e produção de enzima são — conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bailey, JE. e Ollis, DF, Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima. A fermentação,

portanto, pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou de estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriais, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada.

As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

Fermentação.

Os açúcares fermentáveis obtidos do material — celulósico ou contendo xilano hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar o açúcares í direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. , “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação.

Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco.

As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico ou contendo xilano como um resultado das etapas de pré- tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura.

A — hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

Qualquer material celulósico ou contendo xilano hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção.

O material é em geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), —talcomoum meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF).

“Microrganismo — fermentador” — refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de Cs e/ou Cs, ou uma combinação destes. Tanto os organismos : fermentadores C; quanto C; são bem conhecidos na técnica. Os - microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, convertes, açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, —manose, galactose, ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin er al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar açúcares C6 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces Spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar — açúcares C5 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras que fermentam CS preferidas incluem cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.

FRAGA SOLTAR EEE ERAS ass 87 Outros “organismos fermentadores incluem cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Kluyveromyces, tal como K. fragilis, Schizosaccharomyces, tal como S&S. pombe; e E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram — geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol.

Em um aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp.

Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

Em um outro aspecto mais preferido; a levedura é Saccharomyces distaticus.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Kluyveromyces.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus.

Em um ' outro aspecto mais preferido, a levedura é Klwyveromyces fragilis.

Em um . outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinir.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensil.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis.

Em um outro — aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G.

P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.

E, ed, Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

As bactérias que podem fermentar de maneira eficiente a hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

Em um aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

As leveduras comercialmente disponíveis para a produção de etanol incluem, por exemplo, levedura ETANOL RED" (disponível pela —Fermentis/Lesaffre, USA), FALI"Y (disponível pela Fleischmann's Yeast, USA), levedura fresca SUPERSTART!M e THERMOSACC'YM (disponível “pela Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM!Y AFT e XR (disponível . — pela NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND'TY (disponível pela Gert Strand AB, Suécia), e FERMIOLTY (disponível pela DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose e que co-utilizam xilose e arabinose.

A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et —al,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783;, Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and

TALI genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper er al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces. cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall er al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram er al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting. Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway | engineering, Áppl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, - xilose isomerase).

Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador 15º geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

Sabe-se bem na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira descrita aqui.

O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado à lignocelulose degradada ou hidrolisado e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 24 a cerca de 60 horas. À temperatura está tipicamente entre cerca de 26ºC a cerca de 60ºC, em particular cerca de 32ºC ou 50ºC, e em cerca de pH 3 a cerca de pH 8, tal como em torno de pH 4-5, 6, ou 7.

Em um aspecto preferido, a levedura e/ou um outro microrganismo é aplicado ao material celulósico ou contendo xilano degradado e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal — como tipicamente 24-60 horas. Em um aspecto preferido, o temperatura está preferivelmente entre cerca de 20ºC a cerca de 60ºC, mais preferivelmente cerca de 25ºC a cerca de 50ºC, e acima de tudo preferivelmente cerca de 32ºC a cerca de 50ºC, em particular cerca de 32ºC ou 50ºC, e o pH está em geral em cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente em torno de pH 4-7.

Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam maior temperatura ideal de fermentação. A levedura ou um outro É microrganismo “que preferivelmente aplicado em quantidades de R aproximadamente 10º a 10"?, de maneira preferível de aproximadamente 10º a 10", de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 10º células viáveis por mL de caldo de fermentação. Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “O Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

Para a produção de etanol, após a fermentação, a lama fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em —combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore er al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu. Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação ' pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, ; glicerol, metanol, 1,3-propanediol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido suceínico e ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina) e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (EH), dióxido de carbono (CO;) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um — álcool. Será entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanediol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol.

Ver, por exemplo, Gong, C.

S., Cao, N. |, Du, J., e Tsao, G.

T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances em Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M.

M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processs for fermentative production of xilitol — a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T.

C., Qureshi, N. e Blaschek, H.

P., 2003, Production of acetone, butanol e ethanol by Clostridium beijerinckii i BAI1OI! e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology

- and Biotechnology 19 (6): 595-603. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido — glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico.

Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido S — propiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido sucínico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico.

Ver, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y.

Y., 1997, Membrane- mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 63-65: 435-448. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona.

Será entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que : contém uma ou mais frações de cetona.

Em um outro aspecto mais preferido, ' a cetona é acetona.

Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é 15" um aminoácido.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina.

Ver, por exemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology e Bioengineering 87 (4): 501-515. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás.

Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano.

Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H>. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO.

Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO.

Ver, por exemplo, Kataoka, N., A.

Miya, e K.

Kiriyama, 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacteria,

Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. em Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: a review. Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser S — opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos * eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico ou contendo xilano fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol — — para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial. . Outros usos Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados com atividade limitada de outras enzimas xilanolíticas para degradar xilanos para a produção de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser usados como agentes de volume, como os oligossacarídeos do tipo arabinoxilano liberados do material da parece celular do cereal, ou arabinoxilanos mais ou menos purificados de cereais.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados em combinação com outras enzimas xilanolíticas para degradar xilanos em xilose e outros monossacarídeos (patente U.S. 5.658.765). À xilose liberada pode ser convertida em outros compostos.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados junto — com outras enzimas, como as glicanases, para melhora a extração de óleo de material vegetal rico em óleo, como óleo de milho a partir de embriões de milho.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados para assar para melhorar o desenvolvimento, elasticidade e/ou estabilidade da massa e/ou o volume, estrutura do miolo e/ou propriedades anti-secura do produto assado (ver patente U.S. 5.693.518). Os polipeptídeos também podem ser usados para a preparação de produtos de massa ou assados preparados a partir de qualquer tipo de farinha ou comida (por exemplo, a S base de trigo, centeio, cevada, aveia ou milho). Os produtos assados sintetizados com um polipeptídeo da presente invenção incluem pão, pãezinhos, baguetes e similares. Com propósitos de assar, um polipeptídeo da presente invenção pode ser usado como apenas, ou a principal, atividade enzimática, ou pode ser usado em combinação com outras enzimas tais como uma xilanase, uma lipase, uma amilase, uma oxidase (por exemplo, glicose oxidase, peroxidase), uma lacase e/ou uma protease. : Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser . usados para a modificação da ração animal e podem exercer seu efeito tanto in vitro (modificando componentes da ração) quanto in vivo para melhorar a digestibilidade da ração e aumentar a eficiência de sua utilização (patente U.S. 6.245.546). Os polipeptídeos podem ser adicionados às composições de ração animal contendo altas quantidades de arabinoxilanos e glicuronoxilanos, por exemplo, ração contendo cereais, tais como cevada, trigo, centeio, aveias ou milho. Quando adicionado à ração, o polipeptídeo —melhorará o rompimento do material da parede celular da planta in vivo parcialmente, em virtude de uma redução da viscosidade intestinal (Bedford et al., 1993, Proceedings do 1st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition, pp. 73-77), por meio do qual uma melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal é atingida. Assim, a taxa de crescimento e/ou razão de conversão —daração (istoé,o peso da ração ingerida com relação ao ganho de peso) do animal é melhor.

Os polipeptídeos da presente invenção também pode ser usados na indústria de papel e polpa, inter alia, em processos de branqueamento para melhorar o brilho das polpas alvejadas, por meio do qual a quantidade de cloro usado nos estágios de alvejamento é reduzida, e para aumenta a liberação de polpas no processo de reciclagem de papel (Eriksson, 1990, Wood Science and Technology 24: 79-101; Paice er al., 1988, Biotechnol. and Bioeng. 32: 235-239, e Pommier et al., 1989, Tappi Journal 187-191). O tratamento de polpa lignocelulósica pode ser realizado, por exemplo, da maneira descrita na patente U.S. 5.658.765, WO 93/08275, WO 91/02839 e WO 92/03608. Os polipeptídeos da presente invenção também pode ser usados na fabricação de cerveja, em particular para melhorar a filtrabilidade do malte contendo, por exemplo, cevada e/ou malte sorgo (WO 2002/24926). Os polipeptídeos podem ser usados da mesma maneira como pentosanases ' convencionalmente usadas para fabrica cerveja, por exemplo, da maneira , descrita por Viêétor et al., 1993, J.

Inst.

Brew. 99: 243-248; e EP 227159. Além do mais, os polipeptídeos pode ser usados para tratamento de grãos de —espelta para fabricação de cervejas, resíduos da produção de malte de cerveja contendo cevada ou cevada maltada ou outros cereais, de maneira a melhorar a utilização dos resíduos, por exemplo, para ração animal.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para a separação de componentes de materiais de célula de planta, em particular de componentes de cereal, tais como componentes de trigo.

De particular interesse é a separação de trigo em glúten e amido, isto é, os componentes de considerável interesse comercial.

O processo de separação pode ser realizado pelo uso de métodos conhecidos na técnica, tal como o assim denominado processo de bater (ou processo de moagem a úmido) realizado como um — hidroclone ou um processo de decantar.

No processo de bater, o material de partida é uma dispersão bombeável diluída do material da planta, tal como o trigo a ser submetido à separação.

Em um processo de separação de trigo, a dispersão é realizada em geral a partir de farinha de trigo e água.

Os polipeptídeos da invenção também podem ser usados na preparação de suco de fruta ou vegetal, a fim de aumentar o rendimento.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados como um componente de um sistema de lavagem enzimática para tecidos.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados em aplicações de detergentes de roupa em combinação com outras funcionalidades da enzima.

Peptídeo sinal A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo em aminoácidos 1 a 23 de SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo pode compreender ; adicionalmente um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente V ligado ao peptídeo sinal. A proteína é preferivelmente estrangeira ao peptídeo sinal.

A presente invenção também diz respeito o construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem um polinucleotídeo como este.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir uma proteína, que compreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira — recombinante que compreende um polinucleotídeo como este; e (b) recuperar a proteína.

A proteína pode ser natural ou heteróloga a um célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui que refere-se a um tamanho específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos e proteínas. O termo “proteína” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta- S — galactosidase, glucoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, lacase, another lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer fonte de procarioto, —eucarioto ou outra.

A presente invenção é descrita adicionalmente pelos exemplos Á a seguir que não devem ser interpretados como limitantes do escopo da ] invenção.

Exemplos Materiais Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau de reagente.

Cepas Penicillium sp.

NN51602 foi usada como a fonte de um gene da família GHIO0 que codifica um polipeptídeo com atividade de xilanase.

Aspergillus niger cepa MBinl120 (WO 2004/090155) foi usada para a expressão do gene de Penicillium sp. que codifica o polipeptídeo com atividade de xilanase.

Myceliophthora thermophila CBS 202.75 foi usada como a fonte do gene para um polipeptídeo da família 6 com atividade de — celobioidrolase II.

Aspergillus oryzae cepa JaL355 (WO 2002/40694) foi usada para a expressão do gene de Myceliophthora thermophila que codifica o polipeptídeo com atividade de celobioidrolase.

Meios As placas de PDA foram compostas de 39 g de ágar batata

À 99 | dextrose e água deionizada para 1 litro.

O meio YP foi composto de 10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto peptona, e água deionizada para 1 litro.

O meio LB foi composto de 10 g de triptona, 5 g de extrato de —levedura,5g de cloreto de sódio, e água deionizada para 1 litro.

As placas de meio mínimo foram compostas de 6 g de NaNO;, 0,52 g de KCl, 1,52 g de KH,PO,s, 1 mL de solução de elementos traço COVE, 20 g de ágar Noble, 20 mL de 50 % glicose, 2,5 mL de MgSO,7H20, 20 mL de uma solução de biotina a 0,02 %, e água deionizada para 1 litro.

A solução de elementos traço COVE foi composta de 0,04 & de Na;B1O07 10H,0, 0,4 g de CuSO,'5HLO, 1,2 g de FeSO,7H,0, 0,7 g de Ê MnSO4y HÃO, 0,8 g de NaMoO;2H,O, 10 g de ZnSO,47HÃO, e água : deionizada para 1 litro.

O meio MDU2BP foi composto de 45 g de maltose, 1 g de MgSO+7H,7O, 1 g de NaCl, 2 g de K3SO,, 12 g de KH5PO;, 7 g de extrato de levedura, 2 g de uréia, 0,5 mL de solução de metais traço AMG, e água deionizada para 1 litro; pH 5,0. A solução de metais traço AMG foi composta de 14,3 g de ZnSO47H,0, 2,5 g de CuSO,y5H,O, 0,5 g de NICI6H2O, 13,8 g de —FeSO,7H,O, 8,5 g de MnSO,y7H,O, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

O meio YEG foi composto por litro de 20 g de dextrose, 5 g de extrato de levedura, e água deionizada para 1 litro.

As placas de COVE A uréia- acetamida+ foram compostas de? Exemplo 1: Isolamento de Penicillium sp.

Penicillium sp.

NN51602 foi isolado de uma amostra composta de palha de arroz e excremento bovino localizado em uma vila rural em Yunnan China em julho de 2007. A cepa foi isolada em placas de PDA

| incubadas a 45ºC.

Exemplo 2: Crescimento de Penicillium sp tipo selvagem.

Cem mL de meio em frasco de agitação foram adicionados a um frasco de agitação de 500 mL. O meio em frasco de agitação foi composto —del5gde glicose, 4g de KHPO,, 1 g de NaCl, 0,2 g de MgSO,7H20O, 2 g de MES sem ácido, 1 g de Bacto Peptona, 5 g de extrato de levedura, 2,5 g de ácido cítrico, 0,2 g de CaCl;2H,O, 5 g de NHNO;3, 1 mL de solução de elementos traço, e água deionizada para 1 litro. A solução de elementos traço foi composta de 1,2 g de FeSO,7H,O, 10 g de ZnSO,47H2O, 0,7 g de MnSOH,O, 0,4 g de CuSOr5H,O, 0,4 g de Na?B1O07 10H20, 0,8 g de Na>MoO;-2H,0O, e água deionizada para 1 litro. O frasco de agitação foi inoculado com dois êmbolos de uma cultura em placa sólida de Penicillium . sp. NN51602 e incubado a 45ºC em um agitador orbital a 200 rpm por 48 horas. Cinquenta mL do caldo do frasco agitado por 48 horas foram usados —parainocular um vaso de fermentação de 2 litros.

Um total de 1,8 litros de meio de fermentação em lotes foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de dois litros (Applikon Biotechnology, Schiedam, Holanda). O meio de fermentação em lotes foi composto de 5 g de extrato de levedura, 176 g de celulose em pó, 2 g de glicose, 1 g de NaCl, 1 g de Bacto Peptona, 4 g de KHPO,, 0,2 g de CaCl;-2H,0, 0,2 g de MgSO4s.7H,O, 2,5 g de ácido cítrico, 5 g de NHANO;, 1,8 mL de anti-espuma, 1 mL de solução de elementos traço (anterior), e água deionizada para 1 litro. O meio de alimentação da fermentação foi dosado em uma taxa de 4 g/I/hr por um período de 72 horas. O meio de alimentação da — fermentação foi composto de água e anti-espuma. O vaso de fermentação foi mantida em uma temperatura de 45ºC e o pH foi controlado usando um sistema de controle Applikon 1030 (Applikon Biotechnology, Schiedam, Holanda) em um ponto de ajuste de 5,6 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por uma rotação impulsora i 101 | Rushton a 1.100 a 1.300 rpm. No final da fermentação, todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado a 3.000 x g para remover a biomassa. Exemplo 3: Purificação de todo o caldo de xilanase de Penicillium sp. tipo selvagem O caldo coletado obtido no exemplo 2 foi centrifugado em garrafas de 500 mL a 13.000 x g por 20 minutos a 4ºC e então esterilizado por filtro usando uma membrana de polietersulfona de 0,22 um (Millipore, Bedford, MA, USA). O caldo filtrado foi concentrado e o tampão trocado por Tris-HCl 20 mM pH 8,5 usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, North Borough, MA, USA) equipado com uma membrana de polietersulfona 10kDa em aproximadamente 20 psi (137,9 kPa). Para detectar í a quantidade de pigmento, o concentrado foi aplicado em uma coluna de 60 . mLQ SEPHAROSE"Y Big Bead (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com Tris-HCI 20 mM pH 8,5, e a etapa eluída com tampão de equilíbrio contendo NaCl 600 mM. As frações eluídas por meio de fluxo foram examinadas em géis SDS-PAGE a 8-16 % de CRITERIONTY (Bio- Rad, Hercules, CA, USA) corados com reagente de corante azul GELCODER (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A fração eluída continha uma banda de proteína de aproximadamente 50 kDa por SDS-PAGE.

A fração eluída foi concentrada usando um dispositivo de ultrafiltração Amicon (Millipore, Bedford, MA, USA; membrana de polietersulfona de 10 kDa, 40 psi (275,8 kPa), 4ºC) e dessalinizada (HIPREPTY colunas de dessalinização, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) em Tris-HCI 20 mM pH 8,5. O material dessalinizado foi carregado em uma coluna MONO Q'”M (HR 16/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com Tris-HCI 20 mM pH 8,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de sal de NaCl O M ao NaCl 600 mM em Tris-HCI 20 mM pH 8,5 (20 volumes de coluna). As frações foram examinadas por géis de SDS-PAGE a 8-16 %, da maneira descrita anteriormente, que revelou que a i 102 i xilanase de Penicillium sp. eluiu em aproximadamente NaCl 120 mM.

As frações contendo a xilanase foram agrupadas e misturadas com um volume igual de Tris-HCI 20 mM pH 7.5 contendo sulfato de amônio 3,4 M para uma concentração final de sulfato de amônio 1,7 M.

A amostra foi filtrada (filtro de seringa de 0,2 uM, membrana de polietersulfona, Whatman, Maidstone, Reino Unido) para remover o material particulado antes do carregamento em uma coluna PHENYL SUPEROSE"Y (HR 16/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com sulfato de amônio 1,7 M em Tris-HCl 20 mM pH 7,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de sal decrescente de sulfato de amônio 1,7 M para sulfato de amônio O M em Tris-HCl 20 mM pH 7,5 (15 volumes de coluna). As frações É foram analisadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE a 8-16 %, da maneira ! descrita anteriormente, que revelou a xilanase de Penicillium sp eluída até o fim do gradiente (aproximadamente sulfato de amônio 50 mM). A. xilanase de Penicillium sp foi >90 % pura da maneira avaliada por SDS-PAGE.

As concentrações de proteína foram determinadas usando um Kkit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), em que a albumina bovina sérica foi usada como um padrão de proteína.

A atividade de xilanase foi determinada usando AZCL- —arabinoxilano a 0,2% e AZCL-xilano a 0,2 % como substratos, da maneira descrita supra.

A xilanase purificada de Penicillium sp. mostrou atividade tanto para AZCL -arabinoxilano quanto para AZCL-xilano.

Exemplo 4: Identificação de proteína de xilanase de Penicillium sp.

Digestão em gel de polipeptídeos para sequenciamento de peptídeo.

Un MULTIPROBEG UH Liquid Handling Robot (PerkinElmer Life e Analytical Sciences, Boston, MA, USA) foi usado para realizar a digestão em géis.

A banda em gel de proteína de 50 kDa (Exemplo 3) foi reduzida com 50 uL de ditiotreitol 10 mM (DTT) em bicarbonato de amônio 100 mM pH

Á 103 | 8,0 por 30 minutos.

Após a redução, o pedaço de gel foi alquilado com 50 uL de iodoacetamida de 55 mM em bicarbonato de amônio 100 mM pH 8,0 por 20 minutos.

O pedaço de gel seco inchou naturalmente em 25 uL de uma solução de digestão de tripsina contendo 6 ng de tripsina de grau de — sequenciamento (Promega, Madison, WI, USA) por uL de bicarbonato de amônio 50 mM pH 8 por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido por uma digestão de 8 horas a 40ºC.

Cada uma das etapas da reação descritas anteriormente foi seguida por numerosas lavagens e pré-lavagens com as soluções apropriadas seguindo o protocolo padrão do fabricante.

Cinquenta uL de acetonitrila foram usados para desidratar o pedaço de gel entre as reações e o pedaço de gel secou ao ar entre etapas.

Os peptídeos foram i extraídos duas vezes com 1 % de ácido fórmico /2 % de acetonitrila em água g de grau HPLC por 30 minutos.

As soluções de extração de peptídeo foram transferidas para uma placa do tipo PCR saia de 96 poços (ABGene, Rochester, NY, USA) que foram resfriadas a 10-15ºC e cobertas com uma tampa de placa de 96 poços (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA) para prevenir a evaporação.

As placas foram armazenadas adicionalmente a 4ºC até que a análise por espectrometria de massa pudessem ser realizadas Identificação de proteína.

Para o novo sequencimento de peptídeo por espectrometria de massa em tandem, um Q-TOFMICRO'YM (Waters Micromass MS Technologies, Milford,, MA, USA), um espectrômetro de massa de tempo de voo quádruplo ortogonal híbrido, foram usados para análise LC/MS/MS.

O Q-TOF MICRO'!YM é um microprocessador —completamente controlado usando o software MASSLYNX'Y versão 4.1 (Waters Micromass MS Technologies, Milford, MA, USA). O Q-TOF MICRO'Y foi ajustado com um NANOACQUITY UPLCG& (Waters Corp, Milford, MA, USA) para concentrar e dessalinizar amostras.

As amostras foram carregadas em uma coluna de captura (180 um ID X 20 mm, 5 um

| 104 | SYMMETRYQO C18, Waters Corp, Milford, MA, USA) ajustada na alça de injeção e lavada com ácido fórmico a 0,1 % em água a 15 uL por minuto, por 1 minuto usando uma bomba de administração de solvente binário.

Os peptídeos foram separados em uma coluna de capilar fundida em nanofluxo 100umIDx100mm,CI8,1.7 um, BEHI30"M C1I8 (Waters Corp, Milford, MA, USA) em uma vazão de 400 nL por minuto.

Uma etapa de gradiente de eluição de acetonitrila a 1% a 85 % em ácido fórmico a 0,1 % foi aplicada por um intervalo de 30 minutos.

O eluente de coluna foi monitorado em 214 nm e introduzido no Q-TOF MICROTY por meio de uma fonte de fon de —eletroaspersão ajustada com uma interface de nanoaspersão.

Os dados foram adquiridos no modo de pesquisa de varredura . de uma faixa de massa de 400 a 1.990 m/z com critérios de permuta para MS . em MS/MS para incluir uma intensidade de íon maior que 10.0 contagens por segundo e estados de carga de +2, +3, e +4. Os espectros de análise de até 6 espécies que co-eluem com um tempo de varredura de 1,9 segundos e tempo de inter-varredura de 0,1 segundo podem ser obtidos.

Uma voltagem do cone de 45 volts foi usada tipicamente e a energia de colisão foi programada para ser variada de acordo com o massa e estado da carga do peptídeo que elui e na faixa de 10-60 volts.

Os espectros adquiridos foram combinados, nivelados e centralizados de uma maneira automatizada e uma lista de picos foi gerada.

À lista de pico foi pesquisada contra as bases de dados usando o software PROTEINLYNX GLOBAL SERVER'Y 2.3 (Waters Micromass MS Technologies, Milford, MA, USA) e PEAKS Studio versão 4.5 (SP1) (Bioinformatic Solutions Inc., Waterloo, Ontario, Canadá). Os resultados das — pesquisas de PROTEINLYNX GLOBAL SERVER" e PEAKS Studio foram avaliados e as proteínas não identificadas foram analisadas adicionalmente avaliando os espectros MS/MS de cada íon de interesse e a sequência nova foi determinada identificando a série de íon y e b e combinando as diferenças de massa com o aminoácido adequado.

E CARMEN AASLeGGua als sanada AMARAL CASSA | 105 i As sequências de peptídeos foram obtidas de vários íons de cargas múltiplas para a banda em gel de polipeptídeo de 50 kDa digerida em gel. Um íon de peptídeo tríptico de carga dupla de sequência de 403,231 m/z foi determinado como Ala-Asn-Gly-Gln-Met(ox)-[Ile/Leu]-Arg (aminoácidos 97a103deSEQID NO: 2). Um outro íon de peptídeo tríptico de carga dupla de sequência de 442,592 m/z foi determinado como Asn-His-[Ile/Leu]-Thr- Asn-Val-Val-Thr-His-Tyr-Lys (aminoácidos 133 a 142 de SEQ ID NO: 2). Um outro fon de peptídeo tríptico de carga dupla de sequência de 447,1993 m/z foi determinado como [Ile/Leu]-Val-Gln-Ser-Tyr-Gly-Ala-Arg (aminoácidos 215 a 222 de SEQ ID NO: 2). Um outro fon de peptídeo tríptico de carga dupla de sequência de 458,262 m/z foi determinado como Ala-Thr- i Ala-Ala-Gln-Asn-[Hle/Leu]-Val-Lys (aminoácidos 206 a 214 de SEQ ID NO: E 2). Um outro íon de peptídeo tríptico de carga dupla de uma sequência parcial de 663,380 m/z foi determinado como Ser-Gly-Gly-Asp-Gln-[Ile/Leu]-Ala-

15. Asn-[Ile/Leu]-Ala-Lys (aminoácidos 86 a 96 de SEQ ID NO: 2). Met(ox) é metionina oxidada. [Ile/Leu] e [Gln/Lys] não podem ser distinguidas em decorrência de apresentarem massas equivalentes. Exemplo 5: Extração do DNA genômico de Penicillium sp. Penicillium sp. cresceu em placas de PDA a 37ºC para confluência. Três quadrados de 4 mm” foram cortados das placas PDA, inoculados em 25 mL de meio YP contendo glicose a 2 % em frasco de agitação de 125 mL com defletor, e incubados a 37ºC por 2 dias com agitação a 200 rpm. Os micélios foram coletados por filtração usando MIRACLOTHE (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), lavados duas vezes em água deionizada, e — congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, por almofariz e pilão, em um pó fino e o DNA total foi isolado usando um kit DNEASYQO Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Exemplo 6: Isolamento de um fragmento parcial de um gene de xilanase de Penicillium sp.

Usando o programa Consensus-Degenerate — Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP; Rose er al., 1998, Nucleic Ácids Research 26: 1628-1635), os oligonucleotídeos iniciadores degenerados, mostrados as seguir, foram determinados em regiões de homologia com — sequências de xilanase relacionadas com base nos fragmentos identificados de peptídeo descritos no exemplo 4. Oligonucleotídeo iniciador Penuldeg220F: S!-CAACGGCCAGATGYTNMGNTGYCAY-3' (SEQ ID NO: 3) Tradução de proteína para oligonucleotideo iniciador degenerado Penuldeg220F:

NGQMXXCH - Oligonucleotídeo iniciador Penul345R 128fold: — S-GCGCCGTASGAYTGNACSARYTT-3' (SEQ ID NO: 4) Tradução de proteina para oligonucleotídeo iniciador degenerado Penul345R 128fold:

KXVQSYG Para obter o fragmento de DNA inicial do gene xilanase de Penicillium sp., a PCR de gradiente foi realizada em 6 diferentes temperaturas de anelamento que variam de 45ºC a 65ºC. As reações de amplificação (25 uL) foram compostas de 100 ng de DNA genômico de Penicillium sp. como molde, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 50 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador Penuldeg220F e oligonucleotídeo iniciador Penul345R128fold, tampão 1X ADVANTAGE& GC-Melt LA (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), e 1,25 unidades de mistura de

15. polimerase genômica ADVANTAGEGR GC Genomic (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA). As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF8 MASTERCYCLERGO 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado para desnaturar a 95ºC por 1 minuto; 30 ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 95ºC por 30 segundos;

| 107 | temperatura de anelamento de 55ºC +/- 10ºC por 30 segundos (6 opções de gradiente) e elongamento a 70ºC por 1 minuto; e elongamento final a 70ºC por 5 minutos.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel — de agarosea 1,0% em tampão TBE (10,8 g de Tris base, 5,5 g de ácido bórico e 4 mL de EDTA 0,5 M pH 8,0 por litro). Uma banda de produto de PCR de aproximadamente 375 bp a partir de uma temperatura de anelamento de 55,8ºC foi excisada do.gel, purificada usando um kit de extração de gel QIAQUICKGO (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante, e sequenciada com um sequenciador de DNA automatizado Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL (Perkin- fl Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) usando química E terminadora de corante (Giesecke er al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60) e oligonucleotídeo iniciador complementar.

Uma sequência parcial que foi obtida codificou um peptídeo que compreende vários dos fragmentos de peptídeo identificados no exemplo 4. Exemplo 7: Identificação de um gene de xilanase de tamanho completo de Penicillium sp.

Um gene xilanase de tamanho completo foi identificado a partir do Penicillivm sp. usando um kit GENOMEWALKERTY Universal (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Resumidamente, o DNA genômico total de Penicillium sp. foi digerido separadamente com quatro enzimas de restrição diferentes (Dra 1, Eco RV, Pvu II, e Stu 1) que deixam as extremidades cegas. — Cada lote de DNA genômico digerido foi então ligado separadamente ao adaptador GENOMEWALKERTYM (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) para criar quatro bibliotecas.

As quatro bibliotecas foram então empregadas como moldes em reações de PCR usando quatro oligonucleotídeos iniciadores gene-específicos mostrados a seguir, dois para

| uma amplificação de PCR primária e secundária à montante do fragmento por meio da extremidade 5º que codifica a terminação N da xilanase e dois para uma amplificação de PCR primária e secundária à jusante do fragmento por meio da extremidade 3º que codifica a terminação C da xilanase. Os — oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram determinados com base na sequência parcial do gene xilanase de Penicillium sp. descrita no exemplo 6.

Terminação N: Oligonucleotídeo iniciador PenulGSPIR (primário): S-GCCCTTGTAATGGGTAACGACGTTGGTGA-3' (SEQ ID NO: 5) Oligonucleotídeo iniciador PenulGSP2R (secundário): S"GCAAGCAGCGTCTCGTTGGTCCAGGATC-3' (SEQ ID NO: 6) ' Terminação C: . Oligonucleotídeo iniciador PenulGSP1F (primário): S-GGCACCTACCGCAGCAACGTCTTCTACCA-3' (SEQ ID NO: 7) Oligonucleotídeo iniciador PenulGSP2F (secundário): 5'-ACGGCGGCGCAGAACATCGTCAAGCT-3' (SEQ ID NO: 8) As amplificações primárias foram compostas de 1 uL (aproximadamente 6 ng) de cada biblioteca como molde, 0,4 mM de cada dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 10 pmol de oligonucleotídeo iniciador 1 adaptador (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), 50 pmol de oligonucleotídeo iniciador PenulGSPIR ou oligonucleotídeo iniciador PenulGSP1F, tampão 1X ADVANTAGEG& GC-Melt LA, e 1,25 unidades de mistura de polimerase genômica ADVANTAGEG? GC em um volume final de25 ul As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORFO MASTERCYCLERO 5333 programado para desnaturar a 95ºC por 1 minuto; 7 ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 95ºC por 25 segundos; anelamento e elongamento a 72ºC por 5 minutos; 32 ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 95ºC por 25 segundos; anelamento e elongamento a 67ºC por 5 minutos; e elongamento final a 67ºC por 7

| minutos.

As amplificações secundárias foram compostas de 1 uL de cada produto de PCR primário como molde, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 10 pmol de oligonucleotídeo iniciador 2 adaptador S —(Clontech Laboratories, Inc. Mountain View, CA, USA), 50 pmol de oligonucleotídeo iniciador PenulGSP2R ou oligonucleotídeo iniciador PenulGSP2F, tampão IX ADVANTAGEê& GC-Melt LA, e 1,25 unidades mistura de polimerase genômica de ADVANTAGEQ& GC em um volume final de 25 uL. As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORFO 10 MASTERCYCLERG 5333 programado para desnaturar a 95ºC por | minuto; ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 95ºC por 25 segundos; . anelamento e elongamento a 72ºC por 5 minutos; 20 ciclos cada em uma . temperatura de desnaturação de 95ºC por 25 segundos; anelamento e elongamento a 67ºC por 5 minutos; e elongamento final a 67ºC por 7 minutos.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % em tampão TBE. A partir da amplificação por PCR da extremidade 5º, 4 bandas do produto foram analisadas: uma banda produto de 450 bp da biblioteca Dra 1, uma banda de produto de 1,6 kb da biblioteca Eco —RV,uma banda de produto de 1,7 kb da biblioteca Pvu II, e uma banda de 550 bp da biblioteca Stu 1. As 4 bandas de produto foram excisadas dos géis, purificadas usando um kit de extração em gel QIAQUICKO de acordo com as instruções do fabricante, e sequenciadas. A partir da amplificação por PCR da extremidade 3º, 3 bandas de produto foram analisadas: uma banda de produto —de450 bp da biblioteca Dra 1, e bandas de produto de 600 bp e 800 bp da biblioteca Eco RV. As 3 bandas de produto foram excisadas dos géis, purificadas usando um kit de extração em gel QIAQUICKQO de acordo com as instruções do fabricante, e sequenciadas.

O sequenciamento de DNA dos fragmentos de PCR foi

| 110 i realizado com um sequenciador de DNA automatizado Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL usando química terminadora de corante (Giesecke et al., 1992, supra), e estratégia de oligonucleotídeo iniciador complementar usando oligonucleotídeo iniciador 2 adaptador, oligonucleotídeo iniciador — PenulGSP2R, e oligonucleotídeo iniciador PenulGSP2F para sequenciamento.

Os dados de sequência de nucleotídeo foram examinados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com o auxílio do software de PHRED/PHRAP (Universidade de Washington, Seattle, WA, USA). Os resultados da sequência de fragmentos de PCR foram comparados e alinhados com a sequência parcial do gene xilanase de Penicillium sp. obtido da maneira descrita no exemplo 6. Um : modelo de gene foi construído com base nos fragmentos de gene obtidos aqui : e no exemplo 6, permitindo a determinação das extremidades 5º e 3º do gene com outras xilanases homólogas.

Exemplo 8: Clonagem do gene xilanase de Penicillium sp. e construção de um vetor de expressão de Aspergillus niger Dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene xilanase de Penicillium sp. a partir do DNA genômico preparado no exemplo 5. Um kit — de clonagem IN-FUSION'TY (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pBM120a (WO 2006/078256). PenulxyINCOIF: S"ACACAACTGGCCATGGTTCGCCTCAGTCCAGTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 9) PenulxyIPACIR: S"CAGTCACCTCTAGTTATTACAGACACTGCGAGTAATACTCG-3' (SEQ ID NO: 10) As letras em negrito representam sequência codificante.

À

| um À sequência que permanece é homóloga aos sítios de inserção de pBM120a.

Cinquenta picomoles de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 105 ng de DNA genômico de Penicillium sp., tampão 1X EXPANDO 2 (Roche S —Diagnostics Corporation, Indianapolis, EM, USA), 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, e 1 unidade de DNA polimerase EXPANDO DNA (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, EM, USA) em um volume final de 50 ul. A amplificação foi realizada usando um EPPENDORF& MASTERCYCLERQO 5333 programado para 1 ciclo a 95ºC por 1 minuto; 30 ciclos cada a 95ºC por 30 segundos, 63,5ºC por 30 segundos, e 72ºC por 90 segundos; e um elongamento final a 72ºC por 7 minutos. O bloco aquecido foi então para um ciclo de absorção a 4ºC.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % em tampão TBE onde uma banda de produto de aproximadamente 1,4 kb foi excisada do gel, e purificada usando um kit de extração em gel QIAQUICKG, de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pBM120a foi digerido com Noco I e Pac 1, isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % em tampão TBE, e purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICKQO, de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados juntos usando um kit de clonagem IN-FUSIONTWY que resulta em pMMar31, em que a transcrição do gene xilanase estava no controle de um híbridos de promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans (promotor NA2-tpi). A reação de ligação (20 uL) foi composta de tampão 1X IN-FUSIONTY (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 1 uL de enzima IN-FUSIONTY (diluída 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 132 ng de pBM120a digerido com Nco | e Pac 1, e 104 ng do produto

| 112 | de PCR purificado de Penicillium sp.. A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Dois uL da reação foram usados para transformar células ultracompetentes de E. coli XL10 SOLOPACKG& Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Os — transformantes foram transferidos para meio LB suplementado com 100 ug de ampicilina por mL e crescidos por toda a noite a 37ºC.

O DNA plasmidial foi preparado a partir de cada uma das culturas usando um BIOROBOTE 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) e submetido ao sequenciamento de DNA com um sequenciador de DNA automatizado Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL, usando química terminadora de corante (Giesecke et al., 1992, supra) e estratégia complementar de oligonucleotídeo iniciador usando os oligonucleotídeos iniciadores a seguir para sequenciar.

Um transformante de E. coli foi identificado contendo o gene xilanase de Penicillium sp.. O plasmídeo contendo o gene xilanase foi determinado pMMar31 (Figura2). 996271 Nal2tpi promotor direto: 5-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3' (SEQ ID NO: 11) 996270 AMG inv: S-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3' (SEQ ID NO: 12) Penulxy1367F: 5" -ATGITGAGGTGCCATAATC-3' (SEQ ID NO: 13) Penulxy11025R: 5" -TCTGGTAGTCGGTCGCCTG-3" (SEQ ID NO: 14) O mesmo fragmento de PCR de 1,4 kb foi clonado em pCRO2.1-TOPOR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um kit TOPOÊ TA CLONING (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) para gerar pMMar26 (Figura 3). O inserto de xilanase de Penicillium sp. em pMMar26 foi confirmado por —sequenciamento de DNA.

E. coli pMMar26 foi depositada no Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research i Center, Peoria, IL, USA, em 13 de março de 2009, e o número de acesso foi determinado como NRRL B-50266. Exemplo 9: Caracterização da sequência genômica de Penicillium sp. que codifica uma xilanase da família GH10 Os dados da sequência de nucleotídeos foram examinados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas às outras com o auxílio do software PHRED/PHRAP (Universidade de Washington, Seattle, WA, USA). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 2) do gene xilanase de Penicillium sp. são mostradas nas figuras 1A e IB. O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 403 aminoácidos, interrompido por 3 introns previstos de 65, 55, e 52 pares de bases. O teor de G+C % da sequência codificante de tamanho completo e a sequência codificante madura são 60,2 % e 60,0 %, respectivamente. Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al, 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 23 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 380 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 41,1 kDa. Os aminoácidos 25 a 340 são indicativos de uma glicosil hidrolase da família 10. Com base na sequência de aminoácidos deduzida, a xilanase parece estar na família GH10 de xilanase, de acordo com Coutinho e Henrissat, 1999, supra.

Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), da maneira — implementada no programa Needle de EMBOSS, com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUMO62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácidos deduzida do polipeptídeo maduro do gene xilanase da família GHIO0 de Penicillium sp. compartilha 93 % de identidade (excluindo intervalos) com a

À 114 | sequência deduzida de aminoácidos de um gene xilanase de Talaromyces emersonii (GeneSeq número de acesso AAB84358). Exemplo 10: Transformação e expressão do gene xilanase da família GH10 de Penicillium sp. em Aspergillus niger MBin120 O gene xilanase da família GH1I0 de Penicillium sp. foi expresso em Aspergillus niger MBin120 (WO 2004/090155). Os protoplastos de Aspergillus niger MBin120 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Aproximadamente 8 ug de pMMar31 foram usados para transformar Aspergillus niger MBin120. A transformação de Aspergillus niger MBinl20 com pMMar31 rendeu aproximadamente 20 transformantes.

Os 20 transformantes foram isolados em placas individuais de COVE A uréia- acetamida+ e crescidos para confluência a 34ºC.

Dois pedaços de ágar quadrados de 3 mm foram excisados dos 20 transformantes e inoculados separadamente em 25 mL de meio YP contendo 2 % de glicose em frascos de agitação de plástico de 125 mL e incubados a 34ºC com agitação a 250 rpm.

Após 3 dias de incubação, 7,5 uL de sobrenadante de cada cultura foram analisados em um gel SDS-PAGE CRITERION'Y Tris-HCl 8-16 % usando uma célula CRITERIONTY (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), de acordo comas instruções do fabricante.

O gel resultante foi corado com corante BIO- SAFE!“ Coomassie (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Os perfis SDS-PAGE das culturas mostraram que 13 dos transformantes apresentavam uma banda de aproximadamente 50 kDa.

Um transformante de alta expressão, Aspergillus niger —MMar246, foi congelado como estoque e também crescido para purificação.

Aspergillus niger MMar246 foi crescido em placas de COVE A uréia- acetamida+ para confluência a 34ºC.

Cinco pedaços quadrados de 3 mm foram excisados e inoculados em 500 mL de meio YP contendo 2 % de glicose em um frasco de 2,8 litros e incubados a 34ºC com agitação a 250 rpm

| 15 | e coletados após 4 dias.

As amostras de caldo dos frascos foram esterilizadas por filtro usando um filtro de 0,22 mícron EXPRESS? Plus (Millipore, Bedford, MA, USA). O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado por —Tris-HCl 20 mM pH 8,0 usando um concentrador de fluxo tangencial equipado com uma membrana de polietersulfona 10kDa em aproximadamente 20 psi (137,9 kPa). O material dessalinizado foi aplicado em uma coluna de alto desempenho de 70 mL Q SEPHAROSETY (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com Tris-HCIl 20 mM pH 8,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de sal (10 volumes de coluna) de NaACI 0 Ma NaCl 320 mM em Tris-HCI 20 mM, pH 8,0. As frações foram examinadas em géis a 8-16 % CRITERION'Y SDS-PAGE STAIN FREETY (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), que revelaram que a xilanase de Penicillium sp. eluiu em aproximadamente NaCl 120 mM.

A xilanase foi >90 % pura, da maneira observada em SDS-PAGE.

As concentrações de proteína foram determinadas usando um Kkit de ensaio de proteína BCA, em que a albumina bovina sérica foi usada como um padrão de proteína.

Atividade da xilanase foi determinada usando AZCL- arabinoxilano a 0,2 % e AZCL-xilano a 0,2 % como substratos descritos supra.

À xilanase purificada de Penicillium sp. mostrou atividade tanto para AZCL-arabinoxilano quanto para AZCL-xilano.

Exemplo 11: Extração de DNA genômico de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 Myceliophthora thermophila CBS 202.75 foi crescida em 100 —mLdemeioYEG em um frasco de agitação com defletor a 45ºC e 200 rpm por 2 dias.

Os micélios foram coletados por filtração usando MIRACLOTHO, lavados duas vezes em água deionizada, e congelados em nitrogênio líquido.

Os micélios congelados foram moídos por almofariz e pilão em um pó fino, e o DNA total foi isolado usando um kit DNEASYQG Plant Maxi (QIAGEN

| 16 Inc., Valencia, CA, USA). Exemplo 12: Isolamento de um gene celobioidrolase da família 6 de tamanho completo (cel6a) de Myceliophthora thermophila CBS202.75 Um gene celocioidrolase da família 6 de tamanho completo (cel6a) foi isolado de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 usando um kit GENOMEWALKERTY Universal de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o DNA genômico total de Myceliophthora thermophila CBS

202.75 foidigerido separadamente com quatro diferentes enzimas de restrição (Dra 1, Eco RV, Pvu II, e Stu 1) que deixam as extremidades cegas. Cada lote do DNA genômico digerido foi então ligado separadamente no adaptador GENOMEWALKERTMY para criar quatro bibliotecas. As bibliotecas foram então empregadas como moldes em reações de PCR usando dois oligonucleotídeos iniciadores gene-específicos mostrados a seguir, um para PCR primária e um para PCR secundária. Os oligonucleotídeos iniciadores foram determinados com base em uma sequência do gene celobioidrolase parcial da família 6 (celba) de Myceliophthora thermophila (WO 2004/056981). Oligonucleotídeo iniciador MtCel6a-R4: 5-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 15) Oligonucleotídeo iniciador MtCel6a-R5: S-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3' (SEQ ID NO: 16) As amplificações primárias foram compostas de 1 uL (aproximadamente 6 ng) de cada biblioteca como molde, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 10 pmol de oligonucleotídeo iniciador 1 adaptador, 10 pmol de oligonucleotídeo iniciador MtCel6a-R4, tampão 1X ADVANTAGEG?& GC-Melt LA, e 1,25 unidades de mistura de polimerase — genômica de ADVANTAGE& GC em um volume final de 25 uL. As

] 117 amplificações foram — realizadas usando — um EPPENDORFE MASTERCYCLERO 5333 programado para desnaturar a 94ºC por 1 minuto; sete ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 94ºC por 30 segundos; anelamento e elongamento a 72ºC por 5 minutos; e 32 ciclos cada a 67ºCpor5 minutos.

As amplificações secundárias foram compostas de 1 uL de cada produto de PCR primário como molde, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 10 pmol de oligonucleotídeo iniciador 2 adaptador, 10 pmol de oligonucleotideo iniciador MitCel6a-R5, tampão 1X ADVANTAGE?& GC-Melt LA, e 1,25 unidades de mistura de polimerase genômica de ADVANTAGE& GC em um volume final de 25 uL. As amplificações — foram — realizadas usando — um EPPENDORFER MASTERCYCLERQG 5333 programado para desnaturar a 94ºC por 1 minuto; 5 ciclos cada em uma temperatura de desnaturação de 94ºC por 30 segundos; —anelamento e elongamento a 72ºC por 5 minutos; e 20 ciclos a 67ºC por 5 minutos.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão Tris base 40 mM - acetato de sódio 20 mM — EDTA dissódico 1 mM (TAE), onde uma banda de produto de 3,5 kb da — biblioteca Eco RV foi excisada do gel, purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICKGO, de acordo com as instruções do fabricante, e sequenciada.

Exemplo 13: Caracterização da sequência genômica de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 que codifica uma celobioidrolase NMdafamília6 O sequenciamento de DNA do fragmento de PCR de 3,5 kb foi realizado com um sequenciador de DNA automatizado Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL usando química terminadora de corante (Giesecke et al., 1992, supra) e estratégia de oligonucleotídeo iniciador complementar.

| 118 | Os oligonucleotídeos iniciadores gene específicos a seguir foram usados para sequenciamento: MtCel6a-F2: | 5” -GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 17) | MtCel6a-F3: 5” -GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3' (SEQ ID NO: 18) MtCel6a-R8: 5”-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3' (SEQ ID NO: 19) Os dados da sequência de nucleotídeos foram examinados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas às outras como auxílio do software PHRED/PHRAP (Universidade de Washington, Seattle, WA, USA). A sequência de 3,5 kb sequência foi comparada e alinhada com uma sequência de gene celobioidrolase parcial da família 6 (cel6a) de Myceliophthora thermophila (WO 2004/056981). Um modelo de gene para a sequência de Myceliophthora thermophila foi construído com base na similaridade da proteína codificada com as proteínas homólogas glicosídeo hidrolase da família 6 de Thielavia terrestris, Chaetomium thermophilum, Humicola insolens, e Trichoderma reesei.

A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida do gene celobioidrolase de Myceliophthora thermophila são mostradas em SEQID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, respectivamente.

O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 482 aminoácidos, interrompido por 3 introns de 96, 87 e 180 bp.

O teor de G+C % do gene e da sequência codificante são madura 61.6 % e 64 %, respectivamente.

Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 17 resíduos foi previsto.

A proteína madura prevista contém 465 aminoácidos com uma massa molecular de 49,3 kDa.

Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch i 119 E (Needleman e Wunsch, 1970, J.

Mol.

Biol. 48: 443-453) da maneira implementada no programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência deduzida de S — aminoácidos do gene Myceliophthora thermophila que codifica o polipeptídeo maduro CEL6A com atividade de celobioidrolase compartilhada 78,6 % e 77,6 % de identidade (excluindo intervalos) com as sequências deduzidas de aminoácidos de duas proteínas de glicosídeo hidrolase da família 6 de Chaetomium thermophilum e Humicola insolens, respectivamente (GeneSeqP — números de acesso ADP84824 e AAWA44853, respectivamente). Exemplo 14: Clonagem do gene celobioidrolase (cel6a) de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 e construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae Dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a — seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene celobioidrolase de Myceliophthora thermophila a partir do DNA genômico preparado no exemplo 11. Um kit de clonagem IN-FUSION'Y foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pAlLo2 (WO 2004/099228), sem a necessidade de digestão por restrição e ligação.

MItCel6a-F4: S"-ACTGGATTTACCATGGCCAAGAAGCTTITCATCACC-3' — (SEQ ID NO: 22) MtCel6a-R9: S8*-TCACCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGGTTGGCGT-3" (SEQ ID NO: 23) As letras em negrito representam sequência codificante.

À sequência que permanece é homóloga aos sítios de inserção de pAlLo2. Cinquenta picomoles de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 100 f 120 | ng de DNA genômico de Myceliophthora thermophila, tampão 1X ADVANTAGEG& GC-Melt LA, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 1,25 unidades de mistura de polimerase genômica de ADVANTAGEG8 GC em um volume final de 25 uL.

A amplificação foi — realizada usando um EPPENDORF& MASTERCYCLERO 5333 programado para 1 ciclo a 94ºC por 1 minuto; e 30 ciclos cada a 94ºC por 30 segundos, 62ºC por 30 segundos, e 72ºC por 2 minutos.

O bloco aquecido foi então para um ciclo de absorção a 4ºC.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarosea 1,0% usando tampão TAE, onde uma banda de produto de 1.842 bp foi excisada do gel, e purificados usando um kit de extração de gel QIAQUICKRG, de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pAlLo2 (WO 2004/099228) foi digerido com Neco I e Pac [, isolado em um gel de agarose 1,0 % usando tampão TAE, e purificado usando um kit de extração de gel QIAQUICKG, de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados juntos usando um kit de clonagem IN-FUSION que resulta em pSMai180 (Figura 4), em que a transcrição do gene celobioidrolase estava no controle de um híbrido — de promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans (promotor NA2-tpi). A reação de ligação (50 uL) foi composta de tampão 1X IN-FUSION, 1X BSA, 1 uL de enzima IN-FUSION (diluída 1:10), 100 ng de pAlLo2 digerido com Nco | e Pac 1, e 50 ng do produto de PCR purificado de Myceliophthora thermophila celóa.

A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Um uL da reação foi usado para transformar células supercompetentes de E. coli XL1I0 SOLOPACKG& Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Um transformante de E. coli contendo pPSMai180 foi detectado por digestão por restrição e o DNA plasmidial foi preparado usando um BIOROBOTO 9600.

FERRARA SA EA RANGERS SiS. i 121 | O inserto de Myceliophthora thermophila cel6a em pSMai180 foi confirmado por sequenciamento de DNA.

O mesmo fragmento de PCR de 1.842 bp foi clonado no vetor pCRO2.1-TOPOR usando um kit TOPOR TA CLONINGO, para gerar —pSMail82 (Figura 5). O inserto de Myceliophthora thermophila cel6a em pSMai182 foi confirmado por sequenciamento de DNA. £. coli pSMai182 foi depositada no Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, USA, wm 6 de setembro de 2007 e o número de acesso foi determinado NRRL B-

50059.

Exemplo 15: Expressão do gene celobioidrolase da família 6 cel6a de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 em Aspergillus oryzae JaL355 Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL355 (WO — 2002/40694) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Três ug de pPSMai180 foram usados para transformar Aspergillus oryzae JalL355. A transformação de Aspergillus oryzae JaL355 com pSMail80 rendeu cerca de 50 transformantes. Vinte transformantes foram isolados em placas de meio mínimo individual.

As placas de meio mínimo confluente dos 20 transformantes foram lavadas com 5 mL de TWEENÊ& 20 0,0l % e inoculadas separadamente em 25 mL de meio MDU2BP em frascos de agitação de vidro de 125 mL e incubadas a 34ºC, 250 rpm. Após 5 dias de incubação, 5 uL de sobrenadante de cada cultura foram analisados em géis SDS-PAGE a 8-16 % CRITERION'M com uma célula CRITERIONQO (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi corado com corante BIO-SAFE"Y Coomassie. Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que a maioria dos transformantes apresentou uma banda principal de aproximadamente 70-75 kDa.

ANNALS ANA, i 122 É Uma placa confluente de um transformante, determinado transformante 14, foi lavada com 10 mL de TWEENQ 20 0,01 % e inoculada em dois frascos Fernbach de 2 litros, cada um contendo 500 mL de meio MDUZ2BP para gerar caldo para a caracterização da enzima.

Os caldos de — cultura foram coletados no dia 5 e filtrados usando uma membrana de 0,22 um EXPRESS'Y Plus (Millipore, Bedford, MA, USA). Exemplo 16: Purificação de celobioidrolase recombinante da família 6 de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 expressa em Aspergillus oryzae O caldo de cultura filtrado de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 descrito no exemplo 15 foi concentrado 20 vezes em 50 mL, usando um dispositivo de ultrafiltração Amicon (Millipore, Bedford, MA, USA) equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa a 70 psi (482,6 kPa), 4ºC.

O caldo concentrado foi dessalinizado usando uma coluna de dessalinização HIPREP"Y26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) em tampão Tris-HCI 20 mM, pH 8. O caldo dessalinizado foi misturado com um volume apropriado de Tris-HCI 20 mM, pH 7,5, contendo sulfato de amônio 3,4 M para uma concentração final de sulfato de amônio 1,2 M.

A amostra foi carregada em uma coluna PHENYL SUPEROSE"Y (HR 16/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com sulfato de amônio 360 mM em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. As proteínas indesejadas foram eluídas com um gradiente de etapa de sulfato de amônio 120 mM, seguido por eluição da celobioidrolase Cel6A de Myceliophthora thermophila com Tris-HCI 20 mM pH 7,5. As frações foram analisadas usando géis SDS-PAGE a 8-16 % CRITERION'Y e coradas com reagente de corante azul GELCODER.

A celobioidrolase Cel6A de Myceliophthora thermophila foi >90 % pura, da maneira analisada por SDS-PAGE.

A concentração de proteína foi determinada usando um kit de ensaio de proteína BCA, em que a albumina bovina sérica foi usada como um padrão de proteína.

i 123 | Exemplo 17: Crescimento de Myceliophthora thermophila cepa CBS 117.65 tipo selvagem Cem mL de meio em frasco de agitação foram adicionados em um frasco de agitação de 500 mL. O meio em frasco de agitação foi composto de 15 g de glicose, 4 g de KHPO,, 1 g de NaCl, 0,2 g de MgSO,7H,0, 2 g de MES sem ácido, 1 g de Bacto Peptona, 5 g de extrato de levedura, 2,5 g de ácido cítrico, 0,2 g de CaCl;2H,O, 5 g de NHNO;, 1 mL de solução de elementos traço, e água deionizada para 1 litro. A solução de elementos traço foi composta de 1,2 g de FeSO,7H,O, 10 g de ZnSO,7H,O, 0,7 g de MnSOH,O, 0,4 g de CuSO,5H,O, 0,4 g de NaB1O0710H,0, 0,8 g de Na;MoO,;2H,O, e água deionizada para 1 litro. O frasco de agitação foi inoculado com dois êmbolos de uma cultura em placa sólida de Myceliophthora thermophila cepa CBS 117.65 e incubado a 45ºC em um agitador orbital a 200 rpm por 48 horas. Cinquenta mL do caldo no frasco de agitação foram usados para inocular um vaso de fermentação de 2 litros.

Meio de fermentação em lotes foi composto de 5 g de extrato de levedura, 176 g de celulose em pó, 2 g de glicose, 1 g de NaCl, 1 g de Bacto Peptona, 4 g de KHPO;, 0,2 g de CaCl;2H720, 0,2 g de MgSO,.7H,20, 2,5 g de ácido cítrico, 5 g de NH,NO;, 1,8 mL de anti-espuma, 1 mL de

20. solução de elementos traço (anterior), e água deionizada para 1 litro. O meio de alimentação da fermentação foi composto de água e anti-espuma.

Um total de 1,8 litros do meio de fermentação em lotes foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de dois litros (Applikon Biotechnology, Schiedam, Holanda). O meio de alimentação da fermentação — foi dosado em uma taxa de 4 g/I/hr por um período de 72 horas. O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 45ºC e o pH foi controlado usando um sistema de controle Applikon 1030 (Applikon Biotechnology, Schiedam, Holanda) em um ponto de ajuste de 5,6 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por rotação impulsora

| 124 | Rushton a 1.100 a 1.300 rpm. No final da fermentação, todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado a 3.000 x g para remover a biomassa.

Exemplo 18: Purificação de celobioidrolase IT Cel6A natural a partir do caldo completo de Myceliophthora thermophila CBS S —117.65tiposelvagem O caldo coletado obtido no exemplo 17 foi centrifugado em garrafas de 500 mL a 13.000 x g por 20 minutos a 4ºC, e então esterilizado por filtro usando uma membrana de polietersulfona de 0,22 um (Millipore, Bedford, MA, USA). O caldo filtrado foi concentrado e o tampão trocado por Tris-HCl 20 mM pH 8,5, usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, North Borough, MA, USA) equipado com uma membrana de polietersulfona 10kDa em aproximadamente 20 psi (137,9 kPa). Para detectar a quantidade de pigmento, o concentrado foi aplicado em uma coluna de 60 mL Q SEPHAROSETM Big Bead equilibrada com Tris-HCI 20 mM pH 8,5, eactapa eluída com tampão de equilíbrio contendo NaCl 600 mM. As frações E eluídas por meio de fluxo foram examinadas em géis SDS-PAGE 8-16 % CRITERION'Y corados com reagente de corante azul GELCODER. A fração de fluxo atravessante continha celobioidrolase Cel6A de Myceliophthora thermophila, da maneira avaliada na presença de uma banda correspondente ao peso molecular aparente da proteína por SDS-PAGE (celobioidrolase Cel6A: aproximadamente 70-75 kDa).

A fração de fluxo atravessante foi concentrada usando um dispositivo de ultrafiltração Amicon (Millipore, Bedford, MA, USA) equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa a 40 psi (275,8 kPa), 4ºC, e misturada com um volume igual de Tris-HCI 20 mM pH 7,5 contendo sulfato de amônio 3,4 M para uma concentração final de sulfato de amônio 1,7 M. A amostra foi filtrada (filtro de seringa de 0,2 uM, membrana de polietersulfona, Whatman, Maidstone, Reino Unido) para remover material particulado antes de carregar em uma coluna PHENYL SUPEROSE"Y (HR

| 125 | 16/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com sulfato de amônio 1,7 M em Tris-HCI 20 mM pH 7,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um volume de coluna 12 que diminui o gradiente de sal de sulfato de amônio 1,7 M para sulfato de amônio O M em Tris-HCI 20 mM pH 7,5. As frações foram analisadas por gel de eletroforese SDS-PAGE 8-16 %, da maneira descrita anteriormente, que revelou que a celobioidrolase Cel6A eluiu até o final do gradiente (aproximadamente sulfato de amônia 20 mM).

As frações contendo celobioidrolase II Cel6A foram agrupadas e diluídas 10 vezes em Tris-HCI 20 mM pH 9,0 (para diminuir o sal e aumentar o pH) e então aplicada em uma coluna de 1 ml RESOURCE'!Y Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com Tris-HCI 20 mM pH 9,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de sal de volume de coluna 20 de NaCl O mM a 550 mM em Tris-HCI 20 mM pH 9,0. À celobioidrolase Il Cel6A de M. thermophila eluiu como um pico único anteriormente no gradiente (aproximadamente NaCl 25 mM). A celobioidrolase II foi >90 % puro, da maneira analisada por SDS-PAGE. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de proteína BCA, em que a albumina bovina sérica foi usada como um padrão de proteína.

Exemplo 19: Efeito da celobioidrolases II da família 6 de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 e CBS 202.75 e xilanase da família 10 de Penicillium sp. em hidrólise PCS A palha de milho foi pré-tratada no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido — sulfúrico diluído. As seguintes condições foram usadas para o pré-tratamento: 1,4 % em peso de ácido sulfúrico a 165ºC e 107 psi (737,7 kPa) por 8 minutos. De acordo com NREL, os sólidos insolúveis e água na palha de milho pré-tratada (PCS) continham 56,5 % de celulose, 4,6 % de hemicelulose e 28,4 % de lignina. A celulose e hemicelulose foram i determinadas por uma hidrólise de ácido sulfúrico em duas etapas com análise subsequente de açúcares por cromatografia líquida de alto desempenho usando procedimento analítico padrão NREL %002. A lignina foi determinada gravimetricamente após hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com — ácido sulfúrico usando procedimento analítico padrão NREL %003. O PCS foi lavado com um grande volume de água deionizada em um filtro de vidro.

A celobioidrolase II CEL6 de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 (recombinante) ou celobioidrolase II CEL6 de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (natural) e xilanase da família 10 de Penicillium sp.

foram avaliadas por sua capacidade de melhorar a hidrólise de PCS lavado por uma composição celulósica de proteína de Trichoderma reesei (caldo de Trichoderma reesei que expressa o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus com atividade celulósica intensificada e proteína de fusão beta- glicosidase de Aspergillus oryzae) obtida de acordo com WO 2008/151079.

A hidrólise de PCS foi conduzida usando 2,2 mL placas de poços fundos (Axygen, Union City, CA, USA) em um volume de reação total de 1,0 mL. A hidrólise foi realizada com 50 mg de PCS por mL de tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês | mM e um carregamento de proteína fixo de 2 mg da preparação de proteína celulósica de reeseipor gram de celulose, ou uma substituição a 20 % (por proteína) da preparação de proteína celulósica de 7. reesei com cada enzima (1,6 mg da composição de proteína celulósica de 7. reesei por g de celulose e 0,4 mg de cada enzima por g de celulose). Os ensaios de hidrólise foram realizados em triplicata por 72 horas a 50ºC. Após a hidrólise, as amostras foram filtradas com uma placa de filtro de 96 poços de 0,45 um Multiscreen (Millipore, Bedford, MA, USA) e os filtrados foram analisados com relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir.

Quando não usado imediatamente, as alíquotas de açúcar filtrado foram congeladas a -20ºC. As concentrações de açúcar de amostras

Ú : | 127 | diluídas em H2SO, 0,005 M foram medidas após a eluição de H;SO, 0,005 M com 0,05 % p/p de ácido benzóico em uma vazão de 0,6 mL por minuto de uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEXG& HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a 65ºC com quantificação por integração de glicose e sinais de Í —celobiose obtidos da detecção de índice refratário (CHEMSTATIONG, ! AGILENTO 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), calibrados por amostras de açúcar puro. Os equivalentes resultantes foram usados para calcular o percentual de conversão de celulose para cada reação. O grau da conversão de celulose foi calculado usando a equação a seguir: % conversão = [concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose)]/[(concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose) em uma digestão limite]. O fator 1,053 para celobiose leva em consideração o aumento em massa quando a celobiose é convertida em glicose. Sessenta mg da preparação de proteína celulósica de 7. reesei por g de celulose foram usados para a digestão limite. Os resultados mostrados na figura 6 demonstraram que uma substituição de 20 % (por proteína) da preparação de proteína celulósica de 7. reesei (carregada em 2 mg por g de celulose) pela celobioidrolase TI recombinante de M. thermophila CBS 202.75 Cel6A ou celobioidrolase TI natural de M. thermophila CBS 117.65 Cel6A melhorou o rendimento da hidrólise de 72 horas em 3,1% e 6,2 %, respectivamente. Alternativamente, a conversão percentual com uma substituição de 20 % de uma preparação de proteína celulósica de 7. reesei (carregada em 2 mg por g de celulose) pela celobioidrolase Il recombinante de M. thermophila CBS 202.75 Cel6A foi equivalente a um carregamento de 2,15 mg da preparação de proteína — celulósica de 7. reesei por g de celulose (uma melhoria de 1,08). Com a celobioidrolase II de M. thermophila natural CBS 117.65 Cel6A, a conversão

Í

Ea AA EEE EEE ESA ANEAADS | i 128 Á percentual com uma substituição de 20 % foi equivalente a um carregamento de 2,25 mg da preparação de proteína celulósica de T. reesei por g de celulose (uma melhoria de 1,13 vez). Uma substituição de 20 % da preparação de proteína celulósica de 7. reesei (carregada em 2 mg por g de celulose) pela — xilanaseda família 10 de Penicillium sp. melhorou o rendimento da hidrólise em 7,7 %. A conversão percentual com uma substituição de 20 % de uma preparação de proteína celulósica de T. reesei (carregada em 2 mg por g de celulose) pela xilanase de Penicillium sp. foi equivalente a um carregamento de 2,32 mg da preparação de proteína celulósica de 7. reesei por g de celulose (uma melhoria de 1,16 vez).

Exemplo 20: Xilanase da família 10 de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 Cel6A ou Myceliophthora thermophila CBS

117.65 Cel6A e Penicillium sp. melhora sinergisticamente a hidrólise de uma mistura de celulase de Trichoderma reesei Um ensaio de hidrólise de PCS foi realizado da maneira descrita no exemplo 19 com uma substituição de 20 % da composição de proteína celulósica de 7. reesei (2 mg por g de carregamento total da celulose) por uma mistura 50:50 da celobioidrolase Il M. thermophila CBS 202.75 CEL6 (recombinante) ou da celobioidrolase 1 M. thermophila CBS 117.65 —CEL6 (natural) e da xilanase da família 10 de Penicillium sp. (1,6 mg da composição de proteína celulósica 7. reesei por & celulose; 0,2 mg da celobioidrolase II de M. thermophila CBS 202.75 ou da celobioidrolase II de M. thermophila CBS 117,65 por g de celulose; e 0,2 mg da xilanase de Penicillium sp. por g de celulose).

Da maneira mostrada na figura 7, uma mistura de celobioidrolase IT de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 CEL6 (recombinante) ou celobioidrolase II de Myceliophthora thermophila CBS

117.65 CEL6 (natural) e xilanase de Penicillium sp. demonstrou uma melhoria de 19,2 % e 16,6 % do rendimento de hidrólise de 72 horas,

dias RES NRSNARANNARINEAALE ro “ ! É 129 i | respectivamente. Estes resultados correspondem a uma conversão percentual equivalente de 2,78 mg/g de celulose e 2,68 mg/g de celulose, i respectivamente, da composição de proteína celulósica de Trichoderma reesei | (uma melhoria de 1,39 e 1,34 vez). ! Uma melhoria significativa na conversão percentual de PCS pela composição de proteína celulósica de Trichoderma reesei que compreende uma substituição de 10 % pela celobioidrolase Il de M. thermophila CBS 202.75 CEL6 (recombinante) ou celobioidrolase II de M. thermophila CBS 117.65 CEL6 (natural) e uma substituição de 10 % pela —xilanasede Penicillium sp. (celobioidrolase II de M. thermophila CBS 202.75 recombinante CEL6 e xilanase de Penicillium sp.: 19,2 %:; celobioidrolase II de M. thermophila CBS 117.65 natural CEL6 e xilanase de Penicillium sp: 16,6 %) com relação a uma substituição de 20 % por cada proteína individualmente (celobioidrolase Il de M. thermophila CBS 202.75 CEL6 (recombinante): 3,1 %; celobioidrolase IL de M. thermophila CBS 117.65 CEL6 (natural): 6,2 %; xilanase de Penicillium sp.: 8.2 %), demonstraram que a celobioidrolase II de M. thermophila Cel6A (tanto recombinante de M. thermophila cepa CBS 202.75 quanto natural de M. thermophila cepa CBS

11.65) e xilanase de Penicillium sp. exibem sinergismo na melhoria da — composição de proteína celulósica de 7: reesei. Depósito de material biológico O material biológico a seguir foi depositado nos termos do Budapest Treaty with the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 University — Street, Peoria, IL, USA, e forneceram o número de acesso a seguir: Depósito Número de acesso Data do depósito E. coli (oMMar26) NRRL B-50266 13 de março de 2009 A cepa foi depositada em condições que garantem que o acesso à cultura será disponível durante a pendência deste pedido de patente

130 | | determinada por leis estrangeiras de patente a serem intituladas a esta. O | depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível da maneira exigida pelas leis de patente estrangeira em países em que as duplicatas do pedido submetido, ou sua progênie, são — depositadas. Entretanto, pode-se entender que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção submetida em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental. A presente invenção é descrita adicionalmente pelos parágrafos numerados a seguir:

[1] Um polipeptídeo isolado com atividade de xilanase, selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 95 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, e 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada (1) na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) na sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) na fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um —polinucleotíideo com pelo menos 95 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, e 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) um variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do —polipeptideco maduro de SEQ ID NO: 2; e (e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de xilanase.

[2] O polipeptídeo do parágrafo 1, com pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

f 131 Ê | [3] O polipeptídeo do parágrafo | ou 2, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada (1) na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (i) na sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro —deSEQIDNO:!, ou (ii) na fita complementar de comprimento total de (1) ou (ii).

[4] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-3, que é Í codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, | pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

[5] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-4, que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 2.

[6] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-4, que compreende ou que consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[7] O polipeptídeo do parágrafo 6, em que o polipeptídeo maduro são aminoácidos 24 a 403 de SEQ ID NO: 2.

[8] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-7, que é um fragmento de SEQ ID NO: 2, em que o fragmento apresenta atividade de —xilanase.

[9] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é um variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[10] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-9, que é — codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pMMar26 que está contido em E. coli NKRL B-50266.

[11] Uma composição que compreende o polipeptídeo de Í qualquer um dos parágrafos 1-10.

[12] Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo

| | 132 i de qualquer um dos parágrafos 1-10.

[13] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende .o polinucleotídeo do parágrafo 12, operavelmente ligado a uma ou mais (vários) sequências controle que direcionam a produção do — polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[14] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 12, operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

[15] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-10, que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[16] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-10, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[17] Uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-10.

[18] Um método de produzir um polipeptídeo com atividade de xilanase, que compreende: (a) cultivar a planta transgênica ou a célula de planta do parágrafo 17 em condições que conduzem para a produção do — polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[19] Um método de produzir um mutante de uma célula mãe, que compreende inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-10, que resulta no mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula mãe.

i [20] Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo

19.

[21] A célula mutante do parágrafo 20, que compreende adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[22] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar a célula mutante do parágrafo 20 ou 21 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[23] Uma molécula de RNA inibitório de fita dupla (RNAds) que compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 12, em que opcionalmente o RNAds é uma molécula de RNAsi ou uma de RNAmi.

[24] A molécula de RNA inibitório de fita dupla (RNAds) do parágrafo 23, que tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[25] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de xilanase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de fita dupla (RNAds), em que o RNAds compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 12.

[26] O método do parágrafo 25, em que o RNAds tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[27] Uma célula produzida pelo método do parágrafo 25 ou 26.

[28] A célula do parágrafo 27, que compreende adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[29] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (2) cultivaracélulado parágrafo 27 ou 28 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[30] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste em aminoácidos | a 23 de SEQ ID NO:

2.

l 134

[31] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 30, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[32] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 30, operavelmente ligado a um gene que codifica uma proteína, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[33] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (29) cultivar a célula hospedeira recombinante do parágrafo 32 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[34] Um método para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição de enzima na presença do

15. polipeptídeo com atividade de xilanase de qualquer um dos parágrafos 1-10.

[35] O método do parágrafo 34, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado.

[36] O método de qualquer um dos parágrafos 34 ou 35, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade celulósica intensificada, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[37] O método do parágrafo 37, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglicanase, uma — celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[38] O método do parágrafo 37, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[39] O método de qualquer um dos parágrafos 34-38, que compreende recuperar adicionalmente o material celulósico ou contendo xilano degradado.

[40] O método do parágrafo 39, em que o material celulósico —oucontendo xilano degradado é um açúcar.

[41] O método do parágrafo 40, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[42] Um método para produzir um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar um material celulósico ou contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo com atividade de xilanase de qualquer um dos parágrafos 1-10; (b) fermentar o material celulósico ou contendo xilano sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[43] O método do parágrafo 42, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado.

[44] O método do parágrafo 42 ou 43, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade celulósica intensificada, 20: uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[45] O método do parágrafo 44, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglicanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[46] O método do parágrafo 44, em que a hemicelulase é uma —oumais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[47] O método de qualquer um dos parágrafos 42-46, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e i 136 fermentação simultânea.

[48] O método de qualquer um dos parágrafos 42-47, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

[49] Um método de fermentar um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo com atividade de xilanase de qualquer umdos parágrafos 1-10.

[50] O método do parágrafo 49, em que a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação.

[51] O método do parágrafo 50, que compreende recuperar adicionalmente o produto de fermentação a partir da fermentação.

[52] O método de qualquer um dos parágrafos 49-51, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado antes da sacarificação.

[53] O método de qualquer um dos parágrafos 49-52, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade —celulósica intensificada, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[55] O método do parágrafo 53, em que o celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglicanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[55] O método do parágrafo 53, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[56] O método de qualquer um dos parágrafos 49-55, em que o

| 137 produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

A invenção e as reivindicações aqui descritas não devem ser limitadas no escopo por aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção.

Pretende-se que quaisquer aspectos equivalentes estejam no escopo desta invenção.

De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente.

Também pretende-se que tais modificações estejam no escopo das reivindicações em anexo.

No case de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, controlarão.

Claims (20)

| REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado tendo atividade de xilanase, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 95 % de identidade de — sequência, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, e 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada (i) na sequência que —codificao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (li) na sequência de DNAc contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) na fita complementar de comprimento total de (1) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 95 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 96%, pelomenos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, e 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) um variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQIDNO:2;e (e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de xilanase.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo —pMMar26 que está contido em E. coli NKRL B-50266.

3. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2. 4, Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 3,

i 2 | operavelmente ligado a um ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

5. Método para produzir um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

6. Método para produzir um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operavelmente ligado a um ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

7. Planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, caracterizada pelo fato de que é transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definida na reivindicação 1 ou 2.

8. Método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de —xilanase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar o planta transgênica ou o célula de planta como definida na reivindicação 7, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

9. Método para produzir um mutante de uma célula precursora, caracterizado pelo fato de que compreende inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que resulta no mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula precursora.

10. Molécula de RNA inibitório de fita dupla (RNAds),

À 3 caracterizado pelo fato de que compreende uma subsequência do polinucleotídeo como definido na reivindicação 3, em que opcionalmente o RNAds é uma molécula de RNAsi ou uma de RNAmi.

11. Método para inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de xilanase em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de fita dupla (RNAds), em que o RNAds compreende uma subsequência do polinucleotídeo como definida na reivindicação 3.

12. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que —codificaum peptídeo sinal que compreende ou que consiste em aminoácidos 1 a 23 de SEQID NO: 2.

13. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 12, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

14. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante como definida na reivindicação 13, em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

15. Método para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo com atividade de xilanase como definido na — reivindicação | ou 2.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico ou contendo xilano degradado.

17. Método para produzir um produto de fermentação,

Í 4 caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico ou contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo com atividade de xilanase como definido na reivindicação 1 ou 2; (b) fermentar o material celulósico ou contendo xilano sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para fabricar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

18. Método para fermentar um material celulósico ou contendo xilano, caracterizado pelo fato de que compreende: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo com atividade de xilanase como definido na reivindicação 1 ou 2.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

RSA ANA RANA ARNS tda asa 1/8

M VR LS PV L LAS IAGSGLPLYAQAA 1 ATGGTTCGCCTCAGTCCAGTCCTGCTGGCATCGATCGCAGGCTCTGECCTGCCTCTGTACGCACAAGCAGCC

G LN TA A KA IGLKYFGTATDNPELS 73 GGCCTCAACACCGCCGCCAAAGCCATCGGCCTGAAATACTTCGGCACGGCGACCGACAACCCCGAACTGAGC

D TAYETELNNTQDFGOLTPANS MK 145 GACACCGCGTACGAGACGGAACTGAACAACACGCAGGATTTCGGGCAGTTGACACCTGCGAATTCGATGAAG

W D 217 GTGAGTCTGACAGCTCCCCCCECTCCTGGEGTEAGTGAGTGAGTTCGACGCTAATGGTTTTTGCAGTGGGAC

A TE PQOQNTFTFSGGDQOQIANLARKAN 288 GCAACCGAGCCCCAGCAAAACACTTTCACGTTCAGCGGCGGCGATCAGATCGCTAACCTGGCCAAGGCGAAT

GQMLRCHNLVMWY NQL PSV 361 GGCCAGATGTTGAGGTGCCATAATCTTIGTTTGGTATAATCAGTTGCCGTCGTGGGGTATGTATAGTACCTGC

VTGGSWTNETL 433 GTACTTGTTTGTAATGATTGTCTTGGCTGATTTGTGAAGTCACCGGTGGATCCTGGACCAACGAGACGCTEC L AAMKNHITNVVTHY KGOCYaAMNW DV 505 TTGCTGCCATGAAGAATCACATCACCAACGTCGTTACCCATTACAAGGGCCAGTGCTATGCATGGGATGTCG

VON E A L N D- 377 TGAATGAGGGTACGTCCATATAATTGCTGTTACTATCGAGAGGAATCAGCTAATGACGACAGCCCTCAACGA “DG TYRSNVFYQYr IGEAY II PIAFAT- 849 CGACGGCACCTACCGCAGCAACGTCTTCTACCAGTATATCGGGGAGGCGTACATCCCCATCGCCTTCGCÇAC “A A A A DP DA RKLYY NDY NIE Y PGARKA 721 GGCCECCECCGCCGACCCCGACGCCAAGCTGTACTACAACGACTACAACATCGAGTACCCCGGCGCCAAGEC *T A AQNIVRKLVOS YGARTIDGVGLOS 793 CACGGCGGCGCAGAACATCGTCAAGCTGGTGCAGTCGTACGGGECECGCATCGACEGCETCEGGCCTECAGTC “HF IVGQTPSTSAQÇQONMAAFTALG 865 GCACTTCATCGTGGGCCAGACGCCCAGCACGAGCGCCCAGCAGCAGAACATGGCCGCCTTCACCGCGECTESG Fig. 1A

*V E V A I TE L DIR MÇQL PE TS AQL TQOEQE- S37 CGTCGAGGTCGCCATCACCGAGCTCGACATCCGCATGCAGCTGCCCGAGACGTCCGCGCAGCTGACGCAGCA

“A T DYQ ST VQOQACVNTDSC VGITL MW D- 1009 GGCGACCGACTACCAGAGCACGGTCCAGGCCTGCGTCAACACCGACAGCTGCGTCGGCATTACCCTCTGGGA

*W T DK Y SW V PST FS GW GDA C PW DD N+- 1981 CTGGACCGACAAGTACTCGTGGGTGCCCAGCACCTTCTCAGGCTGGEGCGACGCCTGTCCCTGGGACGAÇAA

*Y Q K K P A Y N G IL TAL GGT PS SS TS Y- 1153 CTACCAGAAGAARACCCGCGTACAACGGCATCCTCACTGCTCTGGGAGGCACGCCCTCCTCCAGTACCAGCTA

*T LTP TT TSSGGSGSPTDVAQH WE GQÇQL- 1225 CACCCTCACGCCGACGACGACCTCAAGCGGCEGCAGTGGCAGCCCGACTGACGTGGCCCAGCATTGEGAGCA

*C G GLGWTGPTV CAS GFTCT VINE Y- 1297 GTGCGGTGGCCTGGGCTGGACTGGGCCEACGGTTTGCGCCAGTGGCTTCACTTGCACTGTCATCAACGAGTA

*Y S$S Q CL* 1369 TTACTCGCAGTGTCTGTAA

Fig. 1B

Pstl (8040 romotor NazT| i e Bel USE Bell (7631 % Neo! (8236) EcoRl (7616 Clal (32) Pstl (7526) - EcoRl (205) Bell (7410 i BamHl (481) caixa Pna2minus TATA Penul GHIOA Bell (71117 Pstl (862) Sall (7102 Sacl (961) Aval (981) Bell (1478) ApaL! (6419 terminador AIG pVIVar31 À VEcoRV (1562) EcoRV (1695) 8236 bp É NCial (2078) Bell (2136) Sacl (2309) EcoRV (2388) &FLactanrase 'Apal! (2859) Apal| (5173 EcoRV (2978)

ANDS Apal! (4676: 'Pstl (3620) Pstl (4194; BambHl (3658) Wmal (3902) Aval (3902) Smal (3904) Pstl (4008) Fig. 2

Hindlll (235) Kpnl (245) Sacl (251) NE. BamHl (253) Apal! (4907) —, = EcoRI (284) ColE1 ori ol (305) Cal (337) 4 EcoRI| (510) / BamHl (786) Penui GHÍ0A Pstl (1167) | Sacl (1266) ba pMMar26 Aval (1286) 5345 bp É Siítiodeinserção

PCR oRI (1716) Apal! (3661 SR Pst| (1725) À j EcoRV (1728) É Notl (1743) Ncol (3294 Aval (1749) kar ” Xbal (1761) Pstl (2915 JR Hori Bell (2703 Fig. 3 i 5/8 Sall (242) Clal (303) Clal (735) EcoRl (768) promotor NA?-tpi Pstl (1188) blaA Clal (1565) pSIVE SO pg sc 7588 bp J | M t cel6a À Sall (2401) Sal (4841) AP saliero) P Ea Pstl (3126) Sal (4335) terminador ANVIG Fig. 4 i 68

E origem puc A CRÍMOS Sall (612) gene de M t cel6a AmpR SEIS? BW Sall (1305) 5743 bp | FF Sal (1630) E ps (2030) KanR EcoRI (2114) Pstl (2123) Psti (3313) — origem £1, Fig. 5

Efeito de família de Myceliophthora thermophila Cel6A(rCel8A e nel6A) e Penicillium ulaiense 10 xilanasena hodrólise de PCS (5% p/v) por Trichoderma reesei expresendo Thermoascus aurantiacus GH61 e Aspergillus oryzae beta-galactosidase BO pais ear errar aaa saem eee eles ntssençeer rave aee aeee mero tra erra ta atenas er esse 7o : a H r i E i E [| E E Em. E o Í “ H o Í FA i 3 j 2 so | o j o í o i e Í 4 - ;

E 8 Se És a 8 8 or DO Po E o ã 23 EE E 3 3 f zo Es 23 Ô Ô ê só FS go s É í ão ãe ê : : - : E Õ ss Pr > > o o Ss É 2 2 Rr r Fig. 6

Efeito de família de Myceliophthora thermophila Cel6A(rCel6A e nel6A) e Penicillium ulaiense 10 xilanasena hodrólise de PCS (5% p/v) por Trichoderma reesei expresendo Thermoascus aurantiacus GH61 e Aspergillus oryzae beta-galactosidase

Í s£ 70 i Fo Í | | g Í o Í 8 : í BR E mo o | & í o Í > Í -) Í 8 i º | 850 |; * | 40 Fs Es = Ss = 36 as à É a =" — Ê 8 Ss s S o ãs Ss e FEET) 28 Fo FS FE 2a FE 2 3 so se ENC o 8 ao Ra R< eo " " s Ss É =S 3 - =

E DE et 2