ES2594528T3

ES2594528T3 - Variantes de polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que las codifican

Info

Publication number: ES2594528T3
Application number: ES11767878.9T
Authority: ES
Inventors: Matthew Sweeney; Mark Wogulis
Original assignee: Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2016-12-20
Anticipated expiration: 2031-09-29
Also published as: MX2013003236A; CN103282489B; BR112013007693A2; EP2622068B1; CN103282489A; BR112013007693B1; WO2012044835A1; US20130219568A1; DK2622068T3; EP2622068A1; US10246691B2

Abstract

Variante, que comprende sustituciones L90V + D131 S + M134L del polipéptido maduro de SEC ID n.º: 2, donde la variante tiene actividad de mejora celulolítica y la variante es seleccionada del grupo consistente en: (a) un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID n.º: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia codificante deL polipéptido maduro de SEC ID n.º: 1 o su secuencia de ADNc.

Description

Variantes de polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que las codifican

10001] Esta invención fue realizada con apoyo gubernamental bajo Acuerdo Cooperativo DE-FC36-08GQ18080 otorgado por el Departamento de Energla. El gobierno tiene derechos sobre esta invención.

Referencia a un listado de secuencias

10002] Esta patente contiene un listado de secuencias.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

10003] La presente invención se refiere a polipéptidos con variantes que tienen actividad de mejora celulolítica, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes, y métodos de uso de las variantes.

Descripción de las técnicas relacionadas

10004J l a celulosa es un poli mero de la glucosa de azúcar simple enlazado de manera covalente por enlaces beta

1,4.

Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-enlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas. Endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en ubicaciones al azar, abriéndolo al ataque por celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas consecutivamente liberan moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. la celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble enlazado en beta-1 ,4. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa para dar glucosa.

¡0005]la conversión de materias primas tignocelulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad preparada de cantidades grandes de materia prima, la conveniencia de evitar la combustión o vertido de los materiales, y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos, y residuos sólidos municipales han sido considerados como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa, y lignina. Una vez la lignocelulosa se convierte en azúcares fermentables, por ejemplo, glucosa, los azúcares fermentables son fácilmente fermentados por levadura en etanol.

[0006J WQ 20051074647, WQ 2008/148131, WQ 201 1/035027 revelan polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucleótidos de Thíelavia tenestris. WQ 20051074656 y WQ 20101065830 revelan polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucleótidos de Thermoascus aurantiacus. WQ 2007/089290 divulga un polipéptido GH61 aislado que tiene actividad de mejora celulolítica y su polinucieótido de Trichoderma reesei. WQ 2009/085935, WQ 2009/085859, WO 2009/085864, y WO 20091085868 revelan polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucieótidos de Mycelíophthora thermophila. WQ 20101138754 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolitica y sus polinucleótidos de Aspergíllus fumigatus . WQ 2011/005867 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucleótidos de Penícillíum pinophilum. WO 20111039319 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolitica y sus polinucleótidos de TI¡ermoascus sp. WQ 2011/041397 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucleótidos de Penícillium sp. WO 20111041504 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de mejora celulolítica y sus polinucleótidos de Thermoascus crustaceous. WO 2008/151043 divulga métodos para aumentar la actividad de un polipéptido GH61 que tiene actividad de mejora celulolítica añadiendo un catión metálico bivalente de activación soluble a una composición que comprende el polipéptido.

10007) Sería ventajoso en la técnica mejorar la capacidad de los polipéptidos que tienen actividad de mejora celulolítica para mejorar la degradación enzimálica de materias primas lignocelulósicas.

10008) La presente invención proporciona variantes de un polipéptido con actividad de mejora celulolítica con propiedades mejoradas.

Resumen de la invención

10009) la presente invención se refiere a variantes, que comprenden sustituciones 190V + D131S + M134l del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2, donde la variante tiene actividad de mejora celulolítica y la variante es seleccionada del grupo consistente en:

(a): un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencia al polipéplido maduro de SEC ID n.o: 2;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC tD n.O: 1 o la secuencia de ADNc de la misma.

10010J l a presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que cod ifican las variantes; constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped comprendiendo los polinucleótidos; y métodos de producción de las variantes.

10011] la presente invención también se refiere a métodos para la degradación o conversión de un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico con una composición enzimática en presencia de tal variante que tiene actividad de mejora celulolítica.

10012] la presente invención también se refiere a métodos para producir un producto de fermentación, que comprende:

(a): sacarificación de un material celulósico con una composición enzimática en presencia de tal variante que tiene actividad de mejora celulolítica;

(b): fermentación del material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo; varios) microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación ; y

(e): recuperación del producto de fermentación de la fermentación.

10013] la presente invención también se refiere a métodos de fermentación de un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo; varios) microorganismos fermentadores, donde el material celul6sico se sacarifica con una composición enzimática en presencia de tal variante que tiene actividad de mejora celulolítica.

Breve descripción de las figuras

[OO14[

la Figura 1 muestra la conversión de celulosa hinchada de ácido fosfórico (0.5% pfp) por la combinación de pirogalol y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumigatus; la combinación de pirogalol, polipéptido de tipo salvaje GH616 de A. fumigatus. y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumigatus; y la combinación de pirogalol. variante 190V + D131S + M134l + A14 1W de GH616 de A. fumigatus. y beta-gluoosidasa CEl3A de A. fumigatus. Figuras 2A y 26 muestran el efecto del polipéptido GH61 6 de tipo salvaje de A. fumigatus y la variante 190V + D131S + M134l + A14 1W de GH61B de A. fumigatus en la conversión de rastrojos de maíz pretratados (PCS) por la oombinación de una composición de celulasa de Trichoderma reesei y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumigatus a bien 50Q C o 55Q C. Figuras 3A (0.45 mgfg GH61) y 36 (0.75 mg/g GH61) muestran el efecto del polipéptido GH61 B de tipo salvaje de

A. fumigatus y variante 190V + D131S + M134l + A141W de GH61 B de A. fumigatus en la conversión de PCS por la combinación de una composición de celulasa de alta temperatura y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumigatus a 50°C. 55°C, 60°C, o 65"C.

Defin iciones

10015] Acetilxilano esterasa: el término "acetilxilano esterasa" significa una carboxilesterasa (EC 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos de acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato, y p-nitrofenil acetato. Para fines de la presente invención. actividad de acetihc.ilano esterasa es determinada usando 0.5 mM de p nitrofenilacetato como sustrato en 50 mM de acetato sódico pH 5.0 conteniendo 0.01 % TWEEN '" 20 (polioxietileno sorbitán monolaurato). Una unidad de acetilxilano esterasa es definida como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 IJmol de anión de p nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

10016) Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. Variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos teniendo secuencias de aminoácidos alteradas.

Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

10017) Alfa-L-arabinofuranosidasa: el término "alfa-L-arabinofuranosidasa" significa una alfa-L-arabinofuranósido arabinofuranohidrolasa (EC 3.2.1.55) que cataliza la hidrólisis de residuos de alfa-L-arabinofuranósido terminales no reductores en alfa-L-arabinósidos. La enzima actúa en alfa-L-arabinofuranósidos, alfa-L-arabinanos que contienen enlaces (1 ,3) yfo (1 ,5), arabinoxilanos, yarabinogalactanos. Alfa-L-arabinofuranosidasa es también conocida como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosidasa polisacárida, alfa-L-arabinofuranósido hidrolasa, L-arabinosidasa, o alfa-L-arabinanasa. Para fines de la presente invención, la actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa es determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidad media (Megazyme International Ireland, LId., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mi de 100 mM de acetato sódico pH 5 en un volumen total de 200 1.11 durante 30 minutos a 40~C seguido de análisis de arabinosa por cromatografía en columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

10018J Alfa-glucuronidasa: el término ~alfa-glucuronidasa" significa una alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolasa (EC 3.2.1.139) que cata liza la hidrólisis de un alfa-D-glucuronósido en D-glucuronato y un alcohol. Para fines de la presente invención, la actividad de alfa-glucuronidasa se determina según de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Una unidad de alfa-glucuronidasa equivale a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 IJmol de ácido glucurónico o 4-0 -metilglucurónico por minuto a pH 5, 40"C.

10019J Beta-glucosidasa: el término "beta-glucosidasa" significa una beta-D-gluc6sido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductores terminales con la liberación de beta- D-glucosa. Para fines de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa es determinada usando el p-nitrofenil-beta-D glucopiranósido como sustrato según el procedimiento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa es definida como 1.0 IJmol de anión de p-nitrofenolato producido por minuto a 25"C, pH 4.8 de 1 mM de p-nilrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato en 50 mM de citrato sódico conteniendo 0,01% de TWEEN® 20.

10020] Beta-xilosidasa: el término "beta-xilosidasa" significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exohidrólisis de beta (1 -4}-xilooligosacáridos. para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de terminales no reductores. Para fines de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa es definida como 1.0 IJmol de anión de p nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5 de 1 mM p-nitrofenil-beta-D-xilósido como sustrato en 100 mM de citrato sódico conteniendo 0.01% TWEEN® 20.

10021J ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula de ARNm, madura, empalmada, obtenida de una célula eucariótica o procariótica. ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN inicial primario es un precursor para ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

10022) Celobiohidrolasa: el término ~celobiohidrolasa~ significa una 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1 ,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celooligosacáridos, o cualquier polímero que contiene glucosa enlazada en beta-1,4, que libera celobiosa de las extremidades reductoras o no reductoras de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Actividad de celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem.

47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; and Tomme et al., 1988, Eur. J. Blochem. 170: 575-581. En la presente invención, el método Tomme et al. puede utilizarse para determinar la actividad de celobiohidrolasa.

10023] Material celulósico: el término "material celulósico~ significa cualquier material que contiene celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de biomasa es celulosa, el segundo más abundante es hemicelulosa, y el tercero es pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y es reforzada por lignina polimérica reticulada de manera covalente a hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y por tanto un beta-(1-4}-D-glucano lineal, mientras las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz

cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. En las hemicelulosas normalmente el hidrógeno se une a celulosa, al igual que a otras hemicelutosas, ayudando a estabilizar la matriz de pared celular.

10024] La celulosa generalmente se encuentra, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras, y mazorcas de plantas u hojas, ramas, y madera de árboles. El material celulósico puede ser, pero no está limitado a, residuo agrícola, material herbáceo (incluyendo cultivos de energía), residuos sólidos municipales, residuo de fábrica de pulpa y de papel, residuos de papel, y madera (incluyendo residuo de silvicultura) (ver, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioelhanol (Charles E. Wyman, editor), págs.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd , 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24125: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor gerente, Volumen 65, págs.23-40, Springer-Verlag, New York). Se entiende aqul que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa, y hemicelulosa en una matriz mezclada. En un aspecto preferido, el material celu16sico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosas, y lignina.

10025J En un aspecto, el material celul6sico es residuo agrícola. En otro aspecto, el material celul6sico es material herbáceo (incluyendo plantas energéticas). En otro aspecto, el material celul6sico es residuos sólidos municipales. En otro aspecto, el material celul6sico es residuo de fábrica de papel. En otro aspecto, el material celul6sico es residuo de papel. En otro aspecto, el material celul6sico es madera (incluyendo residuo forestal).

10026] En otro aspecto, el material celulósico es arundo. En otro aspecto, el material celul6sico es bagazo. En otro aspecto, el material celul6sico es bambú. En otro aspecto, el material celul6sico es mazorca de ma Iz. En otro aspecto, el material celul6sico es fibra de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es rastrojo de maíz. En otro aspecto, el material celul6sico es miscanthus. En otro aspecto, el material celul6sico es piel de naranja. En otro aspecto, el material celul6sico es paja de arroz. En otro aspecto, el material celul6sico es pasto varilla. En otro aspecto, el material celul6sico es paja de trigo.

100271 En otro aspecto, el material celulósico es álamo. En otro aspecto, el material celul6sico es eucaliptus. En otro aspecto, el material celul6sico es abeto. En otro aspecto, el material celul6sico es pino. En otro aspecto, el material celul6sico es álamo. En otro aspecto, el material celul6sico es pícea. En otro aspecto, el material celul6sico es sauce.

10028J En otro aspecto, el material celulósico es celulosa algal. En otro aspecto, el material celul6sico es celulosa bacteriana. En otro aspecto, el material celul6sico es pelusa de algodón. En otro aspecto, el material celul6sico es papel de filtro. En otro aspecto, el material celul6sico es celulosa microcristalina. En otro aspecto, el material celul6sico es celulosa tratada con ácido fosfórico.

10029] En otro aspecto, el material celulósico es una biomasa acuática. Como se utiliza en este caso el término "biomasa acuática" significa biomasa producida en un ambiente acuático por un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hoja flotante, o plantas sumergidas.

10030J El material celul6sico se puede utilizar porque se somete o se puede someter a pretratamiento, usando métodos convencionales conocidos en la técnica, como se describe en este caso. En un aspecto preferido, el material celulósico es pretratado.

10031J Enzima celulolitlca o celulasa: el término "enzima celulolitica" o "celulasa" significa una o más (por ejemplo; varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Tales enzimas incluyen endoglucanasa(s), celobiohidrolasa(s), beta-glucosidasa(s), o combinaciones de las mismas. Los dos métodos básicos para medir actividad celulolílica incluyen: (1) medici6n de la actividad celulolítica total, y (2) medición de las actividades celuloliticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-gtucosidasas) como

65 El1767878

se revisa en Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. la actividad celulolítica total es normalmente medida usando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro N°1 de Whatman, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa algal, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel de filtro que usa papel de filtro N°1 de Whatman como sustrato. El ensayo fue establecido por la Unión Internacional de Química Aplicada y Pura (IUPAC, por sus siglas en inglés) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

10032J Para fines de la presente invención, la actividad enzimática celulolitica se determina por la medición del aumento en la hidrólisis de un material celulósico por enzima(s) celulolitica(s) bajo las condiciones siguientes: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en PCS (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 5O~C, 55~C, o 60~C, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína enzimática celulolitica. Condiciones típicas son reacciones de 1 mi, PCS lavado o sin lavar, 5% de sólidos insolubles, 50 mM pH de acetato sódico 5,1 mM de MnS04,50°C, 55°C, o 60°C, 72 horas, análisis de azúcar por columna AMINEX® HPX-87H (Bio Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA USA).

10033J Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los limites de la secuencia codificante son generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que empieza con un codón de inicio tal como, ATG, GTG o TTG y termina con un codón de parada tal como, TM, TAG,

o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, AONc, ADN sintético, o una combinación de los mismos.

10034] Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o foránea (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica la variante o nativa o foránea entre sI. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y seriales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores para el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan el ligamiento de las secuencias de control con la región coficante del polinucleótido que codifica una variante.

10035] Endoglucanasa: el término "endoglucanasa" significa una endo-l,4-(l ,3,1,4)-beta-D-glucano 4glucanohidrolasa (EC. 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en la celulosa, derivados químicos de la celulosa (tal como carboximetilcelulosa y hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta-l,4 mezclados en beta-l,3 glucanos tales como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos, y otro material vegetal que contiene componentes celulósicos. La actividad de endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción en la viscosidad de sustrato o aumento en extremidades reductoras determinadas por un ensayo de azúcar reductor (Zhang et al., 2006, avances de biotecnología 24: 452-481). Para fines de la presente invención, la actividad de endoglucanasa es determinada usando la carboximetil celulosa (CMC) como sustrato según el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

10036] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de una variante incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

100371 Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y es operativamente enlazado a secuencias de control que proporcionan su expresión.

10038] Glícósido hidralasa de familia 61: el término "glicósido hidrolasa de Familia 61" o "Familia GH61" o "GH61" significa un polipéptido que cae en la glicósido hidrolasa de Familia 61 según Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat B., and Bairoch A, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas en esta familia fueron originalmente clasificadas como una familia glicósido hidrolasa con base en la medición de la actividad endo-l ,4-beta-O-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y modo de acción de estas enzimas son no canónicas y no se pueden considerar como glicosidasas auténticas. Sin embargo. se mantienen en la clasificación CAZy basándose en su capacidad para mejorar la descomposición de lignocelulosa cuando se usan conjuntamente con una celulasa o una mezcla de celulasas.

65 El1767878

[0039) Feruloil esterasa: el término "feruloil esterasa" significa una hidrolasa de 4-hidroxi-3-metoxicinamoil-azucar (EC 3.1.1.73) que catatiza ta hidrólisis de grupos 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (feruloilo) de azúcar esterificado, que es nonnalmente arabinosa en los sustratos de biomasa natural, para producir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). Feruloil esterasa es también conocida como esterasa de ácido ferúlico, esterasa de hidroxicinamoilo, FAE-III, hidrolasa de éster de cinamoilo, FAEA, cinnAE, FAE-I, o FAE-II. Para fines de la presente invención, actividad feruloil esterasa es determinada usando 0.5 mM de p-nitrofenilferulato como sustrato en 50 mM de acetato sódico pH 5.0. Una unidad de feruloil esterasa equivale a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 IJmol de anión de p-nitrofenolato por minuto a pH S, 25Q C.

10040] Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo; varios) aminoácidos ausentes del término amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de mejora celulolítica. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 200 residuos de aminoácidos, por ejemplo, al menos 210 residuos de aminoácidos o al menos 220 residuos de aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2.

10041] Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: el término "enzima hemicelulolitica" o "hemicelulasa" significa una

o más (por ejemplo; varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulÓsico. Ver, por ejemplo, Shallom, D. y Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). Hemicelulasas son componentes clave en la degradación de biomasa vegetal. Ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero de forma no limitativa, una esterasa de acetilmanano, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que son ligados vía enlaces de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular vegetal, reticulándolos en una red robusta. Hemicelulosas son también fijadas de manera covalente a lignina, formando junto con celulosa una estructura altamente compleja. La estructura variable y organización de hemicelulosas requiere la acci6n convenida de muchas enzimas para su degradación completa. los módulos catalíticos de hemicelulasas son bien glicósido hidrolasas (GHs) que hidrolizan enlaces glicosídicos, o carbohidrato esterasas (CEs), que hidrolizan enlaces de éster de acetato o grupos laterales de ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, basados en homología de su secuencia primaria, se pueden asignar en las familias GH y

CE .

Algunas familias, con un pliegue similar total, pueden ser además reagrupadas en clanes, marcadas alfabéticamente (por ejemplo, GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de éstas y otras enzimas activas de carbohidrato está disponible en la base de datos de enzimas activas por carboh idratos (CAZy). Actividades enzimáticas hemiceluloliticas se pueden medir según Ghose y Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura adecuada, por ejemplo, 5QQC, 55QC, o 60"C, Y pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5.

[0042J Condiciones de astríngencia altas: el término "condiciones de alta astringencia" se refiere a sondas de al menos 100 nucle6tidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón corlado y desnaturalizado, y 50% de forma mida, después de los procedimientos de Southem blol durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 65"C.

[0043J Célula huésped: el término "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, o similar con un constructo de ácidos nucleicos o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

[0044J Actividad ténnica aumentada: el término "actividad térmica aumentada" significa un perfil de actividad dependiente de la temperatura más alto o más amplio de una variante en comparación oon el perfil de actividad dependiente de la temperatura del progenitor. la actividad térmica aumentada de la variante mejora la catálisis de una reacción a una o más (por ejemplo; varias) temperaturas específicas con respecto al progenitor. Una variante más termoactiva llevará a una reducción en el tiempo requerido y/o una reducción en la concentración enzimática requerida para catálisis de la reacción. La actividad térmica aumentada de la variante con respecto al progenitor puede ser evaluada, por ejemplo, bajo condiciones de una o más (por ejemplo; varias) temperaturas. Por ejemplo, las una o más (por ejemplo; varias) temperaturas pueden ser cualquiera en el rango de temperatura de

25"C a 95"C, por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95"C (o entre estas) a un pH en el rango de 3 a 8, por ejemplo, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o 8.0, (o en entre estos).

10045J En un aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 40"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 45"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 50"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 55"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 60"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 65"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 70"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 75"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 80"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 85"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 90"C.

10046J En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 3.5 Y 40"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 45"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 50"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 3.5 Y 55"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 60"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 65"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 3.5 Y 70"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 3.5 Y 75"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 80"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 3.5 Y 85"C. En otro aspecto, ta actividad térmica de la variante con respecto al originat se determina a pH 3.5 Y 90"C.

(0047) En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 4.0 Y 40"C. En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 4.0 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica de la variante con respecto al original se determina a pH 4.0 Y 50°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 55"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 60"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 65"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 70°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 75"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 80"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 85"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 90"C.

10048] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 40"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 45"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 50"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 55"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 60"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 65"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 70"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 75"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 80°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 85"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 90°C.

10049] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 40"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 45"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 50"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 55"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 60°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 65"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 70°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 7S"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 80°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 85"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 90"C.

10050J En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 40°C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 50"C. En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 55"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 60"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 65"C. En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 70"C. En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 75"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 80"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 85"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 9O"C.

10051] En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto at progenitor se determina a pH 6.0 Y 40"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 50"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 55"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 60"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 65"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 70"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 75"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 80"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 85"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 90"C.

10052] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 40"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 50"C.

En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 55"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 60"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 65"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 70"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 75"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 80"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 85"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 90"C.

10053] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 40"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 50"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 55"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 60"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 65"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 70"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 75"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 80"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 85"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 90"C.

10054] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 40"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 45"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 50"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 55"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 60"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 65"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 70"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 75"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 80"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 85"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 90"C.

10055] En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 40"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 45"C.

En otro aspecto. la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 50"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 55"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 60"C.

En otro aspecto. la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 65"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 70"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 75"C.

En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 80"C. En otro aspecto, ta actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 85"C. En otro aspecto, la actividad térmica del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 90"C.

10056] La actividad térmica aumentada de ta variante con respecto at original se puede determinar utilizando cualquier ensayo enzimático conocido en ta técnica para polipéptidos GH61 que tienen actividad de mejora celulolítica. Ver por ejemplo, WO 2005/074647, WO 2008/148131 WO 2005/074656, WOO, WO 2007/089290, WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868, y WO 2008/151043. Alternativamente, la actividad térmica aumentada de la variante con respecto al original se puede determinar utilizando cualquier ensayo de aplicación para la variante donde el rendimiento de la variante es comparado con el progenitor. Por ejemplo, el ensayo de aplicación descrito en ejemplo 12 o 14 puede ser usado.

10057) En un aspecto, la actividad térmica de la variante es al menos 1.01 veces, por ejemplo, al menos 1.05 veces, al menos 1.1 veces, al menos 1.5 veces, al menos 1.8 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, y al menos 50 veces más térmicamente activa que el progenitor.

10058] Una variante con actividad térmica aumentada puede o no puede mostrar termoestabilidad aumentada con respecto al progenitor. Por ejemplo, una variante puede tener una actividad térmica mejorada con respecto al progenitor, pero no tiene termoestabilidad aumentada.

{OOS9] Termoestabilidad aumentada: el término "termoestabilidad aumentada" significa una retención más alta de actividad de mejora celulolitica de una variante después de un periodo de incubación a una temperatura con respecto al progenitor. La tennoestabilidad aumentada de la variante con respecto al progenitor puede ser evaluada, por ejemplo, bajo cond iciones de una o más (por ejemplo; varias) temperaturas. Por ejemplo, la una o más (por ejemplo; varias) temperaturas pueden ser cualquier en el rango de temperatura de 4S"C a 9S"C, por ejemplo, 45, SO, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o 95"C (o en1re estas) a un pH en el rango de 3 a 8, por ejemplo, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o 8.0, (o entre estos) durante un periodo adecuado de incubación, por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, o 60 minutos, de manera que la variante retiene actividad residual.

10060] En un aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 5O"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 5S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 60"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 65"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y70"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y7S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 80"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 8S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.0 Y 90"C.

10061) En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y SO"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y 5S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 y 60·C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y 65"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y70"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y75"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y 80"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y 8S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 3.5 Y 90"C.

10062] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y SQ"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y SS"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 60"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 65"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 70"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 75"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 80"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 8S"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.0 Y 90"C.

10063] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y SQ"C.

En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 55QC. En otro aspecto, ta termoestabilidad de la variante con respecto at progenitor se determina a pH 4.5 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 70QC. 5 En otro aspecto, ta termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 75QC. En otro aspecto, ta termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 4.5 Y 90QC.

10064] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y SOQC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 70QC.

15 En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 75QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.0 Y 90QC.

10065] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 50QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 60QC.

Q

En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 65C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 70QC. 25 En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 75QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 5.5 Y 90QC.

10066] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y SOQC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 70QC.

35 En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 75QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.0 Y 90QC.

10067J En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y SOQC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 70QC.

45 En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 75QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 6.5 Y 90QC.

10068] En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y SOQC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 70QC.

55 En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 75"C. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 80QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 85QC. En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.0 Y 90QC.

(0069J En otro aspecto, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y SOQC. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 55QC. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 60QC. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 65QC. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 70QC.

65 En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 75QC. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 80QC.

En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 85Q C. En otro aspecto, ta termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 7.5 Y 9O Q C.

¡0070J En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 50Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 55Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 60Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 65Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 70Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 75Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 80Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 85Q C. En otro aspecto, la termoestabilidad del variante con respecto al progenitor se determina a pH 8.0 Y 9O Q C.

10071] En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 1 minuto. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 5 minutos. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 10 minutos. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 15 minutos. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 30 minutos. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 45 minutos. En cada uno de los aspectos anteriores, la termoestabilidad de la variante con respecto al progenitor se puede determinar incubando la variante y el progenitor durante 60 minutos.

[0072] La termoestabilidad aumentada de la varianle con respecto al progenitor se puede determinar por calorimetría diferencial de barrido (OSC) usando métodos estandar en la técnica (ver, por ejemplo, Sturtevant, 1987, Annual Review of Physical Chemistry 38: 463-488). La termoestabilidad aumentada de la variante con respecto al progenitor puede también ser determinada utilizando cualquier ensayo enzimatico conocido en la técnica para polipéptidos GH61 que lienen actividad de mejora celulolítica. Ver por ejemplo, WO 2005/074647, WO 2008/148131 WO 2005/074656, WO 20101065830, WO 2007/089290, WO 20091085935, WO 2009f085859, WO 2009f085864, WO 20091085868, Y WO 2008f151043. Altemativamenle, la termoestabilidad aumentada de la variante con respeclo al progenitor se puede determinar utilizando cualquier ensayo de aplicación para la variante donde el rendimiento de la variante es comparado con el progenitor. Por ejemplo, el ensayo de aplicación descrito en ejemplo 12 o 14 puede ser usado.

[0073J En un aspeclo, la termoestabilidad de la varianle que tiene actividad de mejora celulolílica es al menos 1.01 veces, por ejemplo, al menos 1.05 veces, al menos 1.1 veces, al menos 1.5 veces, al menos 1.8 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, y al menos 50 veces mas termoestable que el progenitor.

10074J Una variante con lermoestabilidad aumenlada puede o no puede mostrar actividad lérmica aumentada con respecto al progenitor. Por ejemplo, una variante puede tener una capacidad mejorada para replegarse después de la incubación a una temperatura elevada con respecto al progenitor, pero no tiene actividad térmica aumentada.

10075] Aíslado: el término ~aislado~ significa una sustancia en una forma o ambiente que no ocurrir en la naluraleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se origina de forma natural,

(2) cualquier sustancia incluyendo, pero no limitado a, cualquier enzima, variante, ácido nudeico, proteína, péptido o cofaclor, que es al menos parcialmente eliminado de uno o varios o todos los oonstituyentes de origen natural con el cual se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales está asociada de forma natural (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado de forma natural al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

10076] Condiciones de astringencia baja: el término "condiciones de astringencia baja" se refiere a sondas de al menos 100 nucle6tidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42Q C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 25% de forma mida, después de los procedimientos de Soulhem blol estándar durante 12 a 24 horas.

El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SOS a 50"C.

¡oo77J Polipéptido maduro: el término ~polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 22 a 250 de SEC ID n.O: 2 basado en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 21 de SEC ID n.o: 2 son un péptido sei'ial. Se conoce en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos de los polipéptidos maduros más diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleótido.

¡0078J Secuencia codificante del polipéptido maduro: el ténnino "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de mejora celulolítica. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro es nucleótidos 64 a 859 de SEC ID n.o: 1 con base en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice nucleótidos 1 a 63 de SEC ID n.o: 1 codifica un péptido sei'ial. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 64 a 859 de SEC ID n.o: 1.

10079] Condiciones de astringencia media: el término "condiciones de astringencia media" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0.3% SOS, 200 microgramos/ml de AON de espenna de salmón cortado y desnaturalizado, y 35% de fonnamida, después de los procedimeintos de Southem blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SOS a 55"C.

(0080J Condiciones de astringencia media-alta: el término "condiciones de astringencia media-alta" para sondas de al menos 100 nucteótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0.3% SOS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 35% de forma mida, después de los procedimientos de Southem blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 60"C.

10081J Mutante: el término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

10082] Constructo de ácidos nucleicos: el ténnino "constructo de ácidos nucleicos" significa una molécula de ácido nucleico, bien mono o bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nudeicos en cierlo modo que de lo contrario no existirían en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o varias secuencias de control.

[0083] Operatlvamente enlazado: el término "operativa mente enlazado" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada relativa a la secuencia de cod ificación de un polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

10084J Polipéptido progenitor o progenitor con act ividad de mejora celulolitica: el término "progenitor" o "polipéptido progenitor con actividad de mejora celulol1tica parent polypeptide" significa un polipéptido que tiene actividad de mejora celulolítica al cual se le hace una alteración para producir las variantes de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido (tipo salvaje) de origen natural o una variante del mismo, o un fragmento del mismo.

10085] Polipéptido con actividad de mejora celulolitica: el ténnino "polipéptido que tiene actividad de mejora celulolítica" significa un polipéptido GH61 que cataliza la mejora de la hidrólisis de un material celulósico por la enzima que tiene actividad celulolítica. Para fines de la presente invención, actividad de mejora celulolítica se determina midiendo el aumento en azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa desde la hidrólisis de un material celulósico por la enzima celulolítica bajo las condiciones siguientes: 1-50 mg de total proteínalg de celulosa en PCS, donde la proteína total está compuesta de 50-99.5% plp de proteína enzimática celulolítica y 0.5-50% plp de proteína de un polipéptido con actividad de mejora celulolítica durante 1-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, SO"C, 55"C, o 6O"C, y pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5, en comparación con una hidrólisis de control con carga de proteína total igual sin actividad de mejora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS). En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes NS, Bagsvrerd, Dinamarca) en presencia de 2-3% en peso de proteína total beta-glucosidasa de Aspergíllus oryzae (recombinantemente producida en Aspergillus oryzae según WO 02/095014) o 2-3% en peso de proteína total de beta-glucosidasa de Aspergillus fumiga tus (recombinantemente producida en Aspergillus oryzae como se describe en WO 2002/095014) de carga de proteína de celulasa se usa como la fuente de la actividad celulolítica.

[0086) los polipéptidos GH61 que tienen actividad de mejora celulolftica mejoran la hidrólisis de un material celulósico catalizado por una enzima con actividad celulolítica reduciendo la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferiblemente al menos 1.01 veces, por ejemplo, al menos

1.05 veces, al menos 1.10 veces, al menos 1.25 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 20 veces.

[0087J Rastrojos de maíz pretratados: el término "PCS" o "rastrojos de maiz pretratados" significa un material celulósico derivado de rastrojos de maíz por tratamiento con calor y ácido sulfúrico diluido, pretratamiento alcalino, o pretratamiento neutro.

[0088) Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos está descrita por el parámetro "identidad de secuencia".

[0089) Para fines de la presente invención, la identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos es determinada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Gene!. 16: 276-277), preferiblemente versión 3.0.0,5.0.0 o posterior. los parámetros usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5, y la matriz de sustitución EBlOSUM62 (versión de EMBOSS de BlOSUM62) . El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y es calculado de la siguiente manera:

(residuos idénticos x 100)/(longitud de alineamiento -número total de gaps en el alineamiento)

10090J Para fi nes de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos es determinada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 3.0.0,5.0.0 o posterior. los parámetros usados son penalización por apertura de espacio de 10, penalización por extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULl (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y es calculado de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de alineamiento -Número total de gaps en el alineamiento)

10091] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido teniendo uno o más (por ejemplo; varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante de polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de mejora celulolílica. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 600 nucleótidos, por ejemplo, al menos 630 nucleótidos o al menos 660 nucleótidos de la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 1.

10092] Variante: el término "variante" se refiere a un polipéptido con actividad de mejora celulolitica que incluye una alteración, es decir, una deleción, inserción, y/o eliminación, en una o más (por ejemplo; varias) posiciones. Una sustitución significa reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de un aminoácido adyacente e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición. las variantes de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 100% de la actividad de mejora celulolitica del pOlipéptido maduro de SEC ID n.o: 2.

10093J Condiciones de astringencia muy altas: el término "condiciones de astrigencia muy altas" se refiere a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0.3% SOS, 200 microgramos/ml de AON de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 50% de forma mida, después de los procedimientos de Southem blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SOS a 70°C.

10094J Condiciones de astringencia muy bajas: el término ·condiciones de astrigencia muy baja" se refiere a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0.3% SOS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 25% de formamida, después de procedimientos estándar de Southern blot durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SOS a 45"C.

[0095J Material que contiene xilano: el término "material que contiene xilano" se refiere a cualquier material que comprende un polisacárido de pared celular vegetal con una estructura de residuos de xilosa enlazados en beta-(1

65 El1767878

4). Xilanos de plantas terrestres son heteropolímeros que poseen una estructura de beta-(1 -4)-0-xilopiranosa, que se ramifica por cadenas de carbohidralos cortas. Comprenden ácido O-glucur6nico o su éter de 4-0-metilo, L-arabinosa, y{o varios oligosacáridos, compuestos por Dxilosa, L-arabinosa, D-o L-galactosa, y O-glucosa. Polisacáridos tipo xilano se pueden dividir en homoxilanos y heteroxilanos, que incluyen glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos, y heteroxilanos complejos. Ver, por ejemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

10096J En los métodos de la presente invención, cualquier material que contiene xilano puede ser utilizado. En un aspecto preferido, el material que contiene xilano es lignocelulosa.

10097) Actividad degradadora de xii ano o actividad xilanolitica: el ténnino "actividad degradadora de xilano" o "actividad xilanolítica" significa una actividad biológica que hidroliza material que contiene xilano. Los dos mélodos básicos para medir actividad xilanolítica incluyen: (1) medición de la actividad xilanolítica lotal, y (2) medición de las actividades xilanolíticas individuales (por ejemplo, endoxilanasas, beta-xilosidasas, arabinofuranosidasas, alfa-glucuronidasas, acetilxilano esterasas, feruloil esterasas, y alfa-glucuronil esterasas). Progreso reciente en ensayos de enzimas xilanoliticas fue resumido en diferentes publicaciones incluyendo Biely y Puchard, Recent progress in the assays of xylanolylic enzymes, 2006, Joumal ofthe Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, Glucuronoyl esterase -Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, and Kubicek, 1997, The beta-O-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-O-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

{0098] La actividad degradadora de xilano total se puede medir por la determinación de los azúcares reductores formados de varios tipos de xilano, incluyendo, por ejemplo, xilanos de espelta de avena, de madera de haya, y de madera de alerce, o por determinación fotométrica de fragmentos teñidos por xilano liberados de varios xilanos teñidos de manera covalente. El ensayo de actividad xilanolitica total más común se basa en la producción de azúcares reductores de glucuronoxilano de 4-0-metilo polimérico como se describe en Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of melhods for assay of xylanase aClivily, Joumal of Biolechnology 23(3): 257-270. Actividad de xilanasa puede también ser determinada con 0,2% AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0,01% TRITON® X-l OO (4-(l ,l ,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietileno glicol) y 200 mM de tampón de fosfato sódico pH 6 a 37"C. Una unidad de actividad de xilanasa es definida como 1.0 ~mol de azurina producida por minuto a 37"C, pH 6 de 0.2% AZCL-arabinoxilano como sustrato en 200 mM de tampón de fosfato sódico pH 6.

10099J Para fines de la presente invención, actividad de degradación de xilano se determina midiendo el aumento en la hidrólisis de xilano de madera de abedul (Sigma Chemical Co., Inc., SI. Louis, MO, EE.UU) por enzima(s) degradadora(s) de xilano bajo las siguientes condiciones típicas: 1 mi reacciones, 5 mg/ml sustrato (sólidos totales), 5 mg de proteína xilanolíticalg de sustrato, 50 mM de acetato sódico pH 5, 50"C, 24 horas, análisis de azúcar usando el ensayo de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) como se describe por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

10100] Xilanasa: el término "xilanasa" significa una 1,4-beta-D-xilan-xilohidrolasa (E.C. 3,2,1,8) que cataliza la endohidr6lisis de enlaces l ,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. Para fines de la presente invención, la actividad de xilanasa se determina con 0.2% AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0.01% TRITON®X-l00 y 200 mM de tampón de fosfato sódico pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa es definida como 1.0 ~mol de azurina producida por minuto a 37"C, pH 6 de 0.2% AZCL-arabinoxilano como sustrato en 200 mM tampón de fosfato sódico pH 6.

10101] Polipéptido tipo salvaje: el término "polipéptido tipo salvaje" significa un polipéptido que tiene actividad de mejora celulolitica expresado por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura, u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Descripción detallada de la invención

10102J la presente invención se refiere las variantes descritas en la reivindicación 1.

Convenios para designación de variantes

10103J Para fines de la presente invención, el polipéptido maduro descrito en SEC ID n.O: 2 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otro polipéptido que tiene actividad de mejora celulolítica. La secuencia de aminoácidos de otro polipéptido que tiene actividad de mejora celulolitica se alinea con el polipéptido maduro descrito en SEC ID n.o: 2, y basado en el alineamiento, el número de posición de aminoácido que corresponde a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro descrito en SEC ID n.O: 2 es

determinado utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Gene!. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62).

10104J La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otro polipéptido que tiene actividad de mejora celulolítica se puede determinar por un alineamiento de secuencias polipeptídicas múltiples usando diferentes programas informáticos incluyendo, pero no limitado a, MUSCLE (comparación de secuencias múltiples por logesperanza; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research

33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), y EMBOSS EMMA usando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando sus parámetros por defecto respectivos.

10105J Cuando el otro polipéptido ha divergido del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2 de manera que la comparación basada en secuencias tradicional no logra detectar su relación (lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol.

295: 613-615), otros algoritmos de comparación de pares de secuencias pueden ser usados. Sensibilidad superior en la búsqueda basada en secuencias se puede lograr usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilisticas de (perfiles) de familias de polipéptidos para buscar bases de datos. Por ejemplo, el programa PSt-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de base de datos reiterativa y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Sensibilidad incluso superior se puede conseguir si la familia o supertamilia para el polipéptido tiene uno o varios representantes en las bases de datos de estructuras de proteinas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural, y potenciales de disolución) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia buscada. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de supertamilia presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos pueden sucesivamente usarse para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos se pueden evaluar para exactitud usando una variedad de herramientas desarrolladas para tal fin.

10106] Para protelnas de estructura conocida, diferentes herramientas y recursos están disponibles para la recuperación y generación de alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas han sido estructuralmente alineadas, y aquellos alineamientos son accesibles y descargables. Dos o más estructuras de proteinas se pueden alinear utilizando una variedad de algoritmos como la matriz de alineamiento de distancias (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Boume, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos puede ser utilizada adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

10107J Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita abajo se adapta para facilidad de referencia. La letra única aceptada por la IUPAC o abreviaturas de tres letras de aminoácidos es empleada.

10108] Sustituciones. Para una sustitución de aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se designa como "Thr226Ala" o MT226A". Mutaciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411 Phe" o "G205R + S411 F", representando sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente.

10109] Deleciones. Para una eliminación de aminoácidos, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido orig inal, posición, •. Por consiguiente, la eliminación de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195·" o "G195·". Deleciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195· + Ser411·" o "G195· + S411·".

10110J Inserciones. Para una inserción de aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 es designada "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de aminoácidos múltiples es designada [aminoácido original, posición, aminoácido original,

aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2 etc. ]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla"

o "G195GKA".

101111 En tales casos el residuo(s) de aminoácido insertado se enumeran por la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido que precede al residuo(s) de aminoácido insertado. En el ejemplo anterior, la secuencia por tanto sería:

PrQgenitor:: Variante:

195: 195 195a 195b

G: G-K-A

101121 Alteraciones múltiples. Variantes que comprenden alteraciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Ar9170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" representando una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 con tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

10113J Alteraciones diferentes. Donde alteraciones diferentes se pueden introducir en una posición, las alteraciones diferentes se separan por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 con tirosina o ácido glutámico. Así, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa las variantes siguientes: "Tyr167Gly+Arg170GIy", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", y "Tyr167 Ala+Arg170Ala" .

Va riant es

10114] La presente invención proporciona variantes, que comprenden sustituciones L90V + 01315 + M134L del polipéptido maduro de 5EC ID n.o: 2, donde la variante tiene actividad de mejora celulolítica y la variante es seleccionada del grupo consistente en:

(b): un polipéptido codificado por un polinucieótido con al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 1 o la secuencia de ADNc de la misma.

101 15J En una forma de realización preferida la variante comprende o consiste en las sustituciones L90V + 0 1315 + M134L+ A141W del polipéptido maduro de 5EC ID n.o: 2.

10116] En una forma de realización, la variante tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia al pOlipéptido maduro de SEC ID n.o: 2.

10117J En un aspecto, el número de sustituciones en las variantes de la presente invención es 1-4, tal como 1, 2, 3, o 4 sustituciones.

10118J En otro aspecto, el variante comprende o consiste en las sustituciones L90V + 01315 + M134L del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2.

10119] l as variantes de la presente invención pueden comprender además una alteración, por ejemplo, eliminación, inserción, ylo sustitución en una o más (por ejemplo; varias) otras posiciones.

10120] Los cambios de aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, que lo son las sustituciones de aminoácidos conservadoras o inserciones que no afectan significativamente al pliegue y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido de enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epitopo antigénico o un dominio de unión.

10121J Ejemplos de sustituciones conservadoras son en los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (Ieucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran una actividad especifica se conocen en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.l. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York.

Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, AlafThr, Ser/Asn, AlalVal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, LyslArg, Asp/Asn, Leullle, LeuNal, Ala/Glu, y AsplGly.

10122J Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físicoquímicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustralo, cambiar el pH óptimo, y similar.

10123J Los aminoácidos esenciales en un polipéplido se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la lécnica anterior, mulaciones de alanina única se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para polipéptido que tiene actividad de mejora celulolitica para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio aclivo del polipéptido que tiene actividad de mejora celulolítica u otra interacción biológica puede también ser determinado por análisis fisico de estructura, como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putalivo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. BioL 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también puede ser inferida a partir de un alineamienlo con un polipéptido relacionado.

{0124] Las varianles pueden consistir en 200 a 220 aminoácidos, por ejemplo, 205 a 220, 210 a 220, y 215 a 220 aminoácidos.

(01 25) En una forma de realización, la variante ha aumentado la actividad térmica.

10126J En una forma de realización, la variante ha aumentado la termoestabilidad.

10127J En una forma de realización, la variante ha aumentado la actividad térmica y ha aumentado la termoestabilidad.

Polipéptidos progenitores que tienen actividad de mejora celulolítica

10128] El polipéptido progenitor que tiene actividad de mejora celulolitica puede ser (a) un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2 o (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia codifícante de polipéptido maduro de SEC ID n.o: 1 o la secuencia de ADNc de la misma.

[0129J En un aspecto, el originat tiene una identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2 de al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 86%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tiene actividad de mejora celulolitica. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, por 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9, o 10 aminoácidos, del polipéptido maduro de SEC ID n.o; 2.

10130J En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.o; 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en los aminoácidos 22 a 250 de SEC ID n.o: 2.

10131J En otro aspecto, el progenitor es un fragmento del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2 que oontiene al menos 200 residuos de aminoácidos, por ejemplo, al menos 210 residuos de aminoácidos o al menos 220 residuos de aminoácidos.

[0132J En otro aspecto, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de SEC ID n.o; 2.

10133] En otro aspecto, el progenitor se codifica por un po'inucleótido con una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 1 o la secuencia de AONc de la misma de al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, un al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que codifica un polipéptido con actividad de mejora celulolitica. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro es los nucleótidos 64 a 859 de SEC ID n.o: 1.

10134J El progenitor puede ser un polipéptido híbrido donde una región de un polipéptido se fusiona en el N-término

o el C-término de una región de otro polipéptido.

10135] El progenitor puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión divisible donde otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce por la fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen unir las secuencias codificantes que cod ifican los pol ipéptidos de modo que éstas están en marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador. Polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología de inteína donde los polipéptidos de fusión se crean postraduccionalmente (Cooper et al. , 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Oawson et al., 1994, Science 266: 776779).

10136] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión entre tos dos polipéptidos. En la secreción de la proteína de fusión, el sitio es dividido liberando dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotecnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotecnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

10137J El progenitor puede ser obtenido de microorganismos de cualquier género. Para fines de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en este caso en retación con una fuente dada debe significar que el progenitor codificado por un polinucleótido se produce por la fuente o por una cepa donde et potinucle6tido de ta fuente ha sido insertado. En un aspecto, el progenitor es secretado extracelularmente.

10138] El progenitor puede ser un polipéptido bacteriano que tiene actividad de mejora celulolitica. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido bacteriano gram-positivo tal como un polipéptido de Bacil/us, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacil/us, estafilococo, Streptococcus, o polipéptido de Streptomyces que tiene actividad de mejora celulolitica, o un polipéplido bacteriano gram-negativo tal como un Gampylobacter, E. coli, F/avobacterium, Fusobacterium, helicobacteria, lIyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, o Ureaplasma que tiene actividad de mejora celulolítica.

10139) En un aspecto, el progenitor es un polipéptido de Bacil/us a/ka/ophilus, Bacillus amy/oliquefaciens, Bacillus brevis, Bacil/us circulans, Bacillus c/ausi;, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus /autus, Bacillus, lentus Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis que tiene actividad de mejora celulolítica.

10140] En otro aspecto, el progenitor es un polipéptidos de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus que tiene actividad de mejora celulolitica.

10141J En otro aspecto, el progenitor es un polipéptido de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitifis, Streptomyces cee/icolor, Streptomyces griseus, o Streptomyces lividans que tiene actividad de mejora celulolitica.

10142] El progenitor puede ser un polipéptido fúngico que tiene actividad de mejora celulolitica. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido de levadura que tiene actividad de mejora celulolítica tal como un polipéptido de Gandida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia que tiene actividad de mejora celulolítica. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido fúngico filamentoso que tiene actividad de mejora celulolitica tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Altemaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Geriporiopsis, Ghaetomidium, Ghrysosporium, Glaviceps, Gochliobolus, Goprinopsis, Goptotermes, Gorynascus, Gryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humico/a, Irpex, Lentinu/a, Leplospaeria, Magnapotte, Me/anocarpus, Meripilus, Mueor, Myceliophllwra, Neoeallimaslix, Neurospora, Paeci/omices, Penici/lium, Phanerochaete, Piromices, Poitrasia, Pseudopleetania, Pseudotriehonympha, Rhizomueor, Sehizofilum, seita/idio, Talaromyces, Termoascus, Thie/avia, Tolipocladium, Triehoderma, Trichophaea, Vetticilfium, Vo/variella, o Xylaria que tiene actividad de mejora celulolitica.

(0143J En otro aspecto, el progenitor es un pol ipéptido de Saceharomyces carlsbergensis, Saccharomyces eerevisiae, Saecharomyces diastaticus, Saceharomyces doug/asii, Saecharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis que tiene actividad de mejora celulolitica.

10144J En otro aspecto, el progenitor es un polipéptido de Acremonium cellulo/ytieus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergil/us fumiga tus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidu/ans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Ghrysosporium inops, Ghrysosporium keratinophilum, Ghrysosporium

lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium tuniculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia timeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthennophila, Thielavia teffestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodenna longibrachiatum, Trichodenna reesei, o Trichodenna viride que tiene actividad de mejora celulolítica.

10145J En olro aspeclo, el progenitor es un polipéplido de Aspergillus tumigatus que tiene aclividad de mejora celulolítica, por ejemplo, el polipéptido que comprende el polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2.

10146J Se enliende que para las especies anleriormenle mencionadas, la invención abarca los eslados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especies por los que se conocen. Expertos en la lécnica fácilmente reconocerán la idenlidad de equivalentes apropiados.

10147] Cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tal como la colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulluren GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y colección de Patentes de Cutivos del SelVicio de Investigación para la Agricultura, centro de investigación Regional del Norte (NRRL).

10148] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas arriba. Técnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales se conocen en la técnica. Un polinucleótido que codifica un progenitor puede luego ser obtenido seleccionando de forma similar una genoteca de ADN gen6mico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez que un polinucleótido que codifica un progenitor ha sido detectado con la(s) sonda(s), el polinucleótido se puede aislar o clonar por la utilización de técnicas que se conocen por los técnicos (ver, por ejemplo, Sambrook et al. , 1989, supra).

Preparación de variantes

10149] Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semi-sintéticos, mutagénesis aleatoria, redistribución, etc.

[0150] Mutagénesis dirigida al sitio es una técnica donde una o más (por ejemplo; varias) mutaciones se introducen en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que cod ifica el progenitor.

10151] Mutagénesis dirigida al sitio se puede realizar in vitre por PCR implicando el uso de cebadores oligonucteótidos con la mutación deseada. Mutagénesis dirigida al sitio puede también ser realizada in vitro por mutagénesis de "cassette" implicando la escisión por una enzima de restricción a un sitio en el plásmido que comprende un pOlinucleótido que codifica el ligamiento progenitor y posterior de un oligonucleótido con la mutación en el polinuc!eótido. Normalmente la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo extremidades pegajosas del plásmido y el inserto unirse entre sí. Ver, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. ScL EE.UU 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

10152] Mutagénesis dirigida al sitio puede también ser realizada in vivo por métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, publicaCión de solicitud de patente EEUU nO 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Na!. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Gene!. Newslelt. 43: 15-16.

10153] Cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio se puede usar en la presente invención. Hay muchos equipos comerciales disponibles que pueden utilizarse para preparar variantes.

10154] La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diset'iada para cod ificar un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede realizar utilizando un número de técnicas, como la tecnología con base de microchip multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares donde oligonucteótidos se sintetizan y se unen en chips microfluídicos fotoprogramables.

[0155) Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples, deleciones, y/o inserciones pueden ser hechas y evaluadas usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o redistribución, seguido de un procedimiento de selección pertinente, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentación en fa90s (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente US No. 5,223,409; WO 92/06204 y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0156J Métodos de mutagénesislredistribución se pueden combinar con alto rendimiento, métodos de selección automatizados para detectar actividad de polipéptidos clonados, mutagenizados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y ordenar rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

10157) Construcción de genes semisintéticos se realiza por la combinación de aspectos de construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida al sitio, y/o mutagénesis aleatoria, y/o redistribución. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que son sintetizados, en combinación con técnicas PCR. Regiones definidas de genes pueden as 1 ser sintetizadas de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos de sitio, mientras otras regiones se pueden someter a PCR con tendencia al error o amplificación de PCR sin tendencia al error. Subsecuencias de polinucleótidos pueden luego ser redistribuidas.

Polinucle6tidos

10158J La presente invención también se refiere a polinucle6tidos aislados que codifican una variante de la presente invención.

Constructos de ácidos nucleicos

10159] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativa mente enlazada a una o varias secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

10160] El polinucleótido se puede manipular en una variedad de vías para proveer a la expresión de una variante. La manipulación del polinucle6tido antes de su inserci6n en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

[0161J la secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que se reconoce por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucle6tido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares

o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

10162J Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacíllus amyloliquefaciens, gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus lichenifonnis, gen de penicilinasa (penP) de Bacillus lichenifonnis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearolhennophilus, de gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, genes }(ylA y }(ylB de Bacillus sublilis, gen crylllA de Bacillus Ihuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promolor lre de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomyces coe/ic%r (dagA), y gen de beta-lacta masa procariótica (Villa Kamaroff el al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), al igual que el promolor lac (DeSoer el al., 1983, Proc. Nat!. Acad. Sc;. USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos de promotores en serie se describen en WO 99/43835.

10163J Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promolores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergíllus niger, alfa-amilasa estable en ácido de

S

Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori , TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergíllus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergíllus oryzae, proteasa de tipo lripsina de Fusarium oxysporum (WO 96f00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO OOf56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00(56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor mieheí, proteinasa aspértica de Rhizomucor míehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reeseí, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa 11 de Trichoderma reeseí, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa 111 de Trichoderma reeseí, endoglucanasa V de Trichoderma reeseí, xilanasa I de Trichoderma reeseí, xilanasa 11 de Trichoderma reesei, xilanasa 111 de Trichoderma reeseí, beta-xilosidasa de Trichoderma reeseí, y factor de alargamiento del movimiento de Trichoderma reeseí, al igual que el promotor NA2-tp; (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde ellider no traducido ha sido sustituido por un lider no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergíllus; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos. Otros promotores son descritos en la patente de EEUU nO 6,011,147.

10164] En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevísiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevísíae (GAL 1 l, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisíae (ADH1, aDH2/GAP), triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisíae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisíae , y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisíae.

Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423

488.

¡0165] l a secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción, que se reconoce por una célula huésped para terminar la transcripción. la secuencia terminadora está operativa mente enlazada al término 3' del polinucleótido que codifica la variante. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped puede ser utilizado.

10166] Terminadores preferidos para células huésped bacterianas son obtenidos de los genes para proteasa alcalina (aprH) de Baeillus cJausii, atfa-amitasa (amyL) de Baeillus lieheniformis, y ARN ribosómico (rmB) de Eseherichia eoli.

10167] Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidas de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, antranilato sintasa de Aspergillus nídulans, glucoamilasa de Aspergíllus níger, alfa-glucosidasa de Aspergíllus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de fusarium oxysporum, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reeseí, celobiohidrolasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reeseí, endoglucanasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa 111 de Trichoderma reeseí, endoglucanasa V de Trichodenna reesei, xilanasa I de Trichodenna reeseí, xilanasa 11 de Trichoderma reeseí, xilanasa 111 de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, y factor de elongación de la traducción de Trichodenna reeseí.

[0168] Terminadores preferidos para células huésped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisíae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevísiae, y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura están descritos por Romanos et al., 1992, supra.

10169] La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm corriente abajo de un promotor y corriente arriba de la secuencia codificante de una variante de la presente invención que aumenta la expresión de la variante.

10170J Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas son obtenidas de un gen crylllA de Bacillus thuringiensis (WO 94(25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilís (Hue et al., 1995, Joumal of Bacteriology 177: 34653471).

10171J l a secuencia de oontrol también puede ser un lider, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' del polinude6tido que codifica la variante. Cualquier líder que es funcional en la célula huésped puede ser utilizado.

10172J Lideres preferidos para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

10173J Lideres adecuados para células huésped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0174) la secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilaci6n, una secuencia operativamente enlazada alténnino de 3' de la secuencia de codificación de variante y, cuando se transcribe, se reconoce por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped puede ser utilizada.

[017SJ Secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidas de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

10176] Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

10177] la secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido sef'lal que cod ifica un péptido señal enlazado al N-término de una variante y dirige la variante en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia cod ificante del polinucieótido puede intrínsecamente contener una secuencia codificante del péptido sel'ial naturalmente enlazada en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido sel'ial que es foránea a la secuencia codificante. Una secuencia cod ifica nte del péptido sel'ial foráneo se puede requerir donde la secuencia codlficante no contiene naturalmente una secuencia codificante del péptido señal. Altemativamente, una secuencia codificante del péptido sel'ial foráneo puede sencillamente reemplazar la secuencia codificante del péptido sel'ial natural para mejorar la secreci6n de la variante. Sin embargo, cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirige la variante expresada en la vía secretora de una célula huésped puede ser utilizada.

(0178] Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias codificantes del péptido sel'ial obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIS 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-Iactamasa de Bacillus 'icheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos sel'ial son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

10179] Secuencias codificantes del péptido sel'ial eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, T AKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

{0180J Péptidos señal útiles para células huésped de levadura son obtenidas de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del péptido sel'ial útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

(0181] la secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido posicionado en el N-término de una variante. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zim6geno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. la secuencia cod ificante del propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis , proteasa neutra (npr1) de Bacillus subtifis, lacasa de Myceliophlhora lhermophila (WO 9S(33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae.

(0182] Donde ambas secuencias del péptido sel'ial y de propéptido están presentes, la secuencia del propéptido está situada junto al N-término de la variante y la secuencia del péptido sel'ial está situada junto al N-término de la secuencia del propéptido.

10183] También puede ser deseable af'iadir secuencias reguladoras que regulan la expresión de la variante con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que causan que la expresión del gen sea activada o desactivada en respuesta a una sustancia química o estímulo físico, con la presencia de un compuesto regulador. Secuencias reguladoras en sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAl1 puede ser utilizado. En hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae, promotor de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, y promotor de celobiohidrolasa 1I de Trichoderma raesei puede ser utilizado. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucari6ticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica

en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante seria operativamente enlazado a la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0184] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las distintas secuencias de nucleótidos y de control se pueden unir entre si para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (por ejemplo; varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Altemativamente, el polinucleótido se puede expresar por la inserción del polinucleótido o un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante es operativa mente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0185] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en que el vector debe ser introducido. El vector puede ser un plásmido lineal o cerrado circular.

[0186] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el(los) cromosoma(s) en que ha sido integrado. Además, un vector único o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón, puede ser utilizado.

[0187] El vector contiene preferiblemente uno o más (por ejemplo; varios) marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas, modificadas, transducidas, o similares. Una etiqueta seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similar.

[0188] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes dal de Bacíllus lichenifonnis o de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, o tetracidina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, Y URA3. Marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintasa), amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaO (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Son preferidos para usar en una célula de Aspergillus son Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae los genes amdS y pyrG Yun gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Son preferidos para usar en una célula de Tríchodenna los genes adeA, adeB, amdS, hph. y pyrG.

[0189] El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable doble como se describe en WQ

2010f039889. En un aspecto, el marcador seleccionable doble es un sistema de marcador seleccionable doble hph-tk.

[0190] El vector contiene preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

10191) Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica de variante o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Altemativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nudeicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un grado alto de identidad de secuencia a la secuencia objetivo

correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos inte9racionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser polinudeótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

10192J Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicarse autónoma mente en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador del plásmido que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador del plásmido" significa un polinucleótido que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo.

10193] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194; pTA1060, y pAMr..1 que permiten la replicación en Bacillus.

10194] Ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

10195] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA 1 Y construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos descritos en WO 00/24883.

10196] Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de una variante. Un aumento en el número de copias del polinucle6tido puede ser obtenido por la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o inctuyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y copias así adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

10197] los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

10198J La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente enlazado a una o más (por ejemplo; varias) secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el constructo o vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se describe anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. la elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifica de la variante y la fuente del progenitor.

10199J l a célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariola.

10200] l a célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Baclerias gram-positivas incluyen, pero de rorma no limitativa, Bacillus, Closlridium, Enlerococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, estafilococo, Streptococcus, y Streptomyces. Bacterias gram-negativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, lIyobacter, Neisseria, PseucJomonas, Salmonella, y Ureaplasma.

/0201) La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de BacilJus, incluyendo, pero no limitada a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coaguJans, Bacillus firmus, Bacillus Jautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumiJus, Bacillus stearothermophiJus, Bacillus subtiJis, and Bacillus thuringiensis y Bacillus thuringiensis.

10202J La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluyendo, pero no limitada a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus

equi subesp. Zooepidemicus.

10203] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, pero no limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y de Streptomyces livídans.

10204] La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang y eohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación celular competente (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thome, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271 -5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (ver, por ejemplo, Dower et al., 19M, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar por transformación de protoplasto, electroporación (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transducción (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporación (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), o conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71 : 51 -57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (ver, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infecl. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, AppL Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, cualquier método conocido en la técnica para la introducción de ADN en una célula huésped puede ser usada.

[0205] la célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o fúngica .

[0206] la célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye los filos de Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota al iguat que Oomycota y todos hongos mitospóricos (como se define por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 81 edición, 1995, CAB Intemational, University Press, Cambridge, UK).

[0207] l a célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporogénea, y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, y Davenport, editors, Soco App. Bacteriol. Serie de simposio nO 9, 1980).

10208] La célula huésped de levadura puede ser una célula de Gandida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.

10209] la célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). los hongos filamentosos son generalmente caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Sacc/¡aromyces cerevisiae es por el injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

10210J la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Geriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Corio/us, Gryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.

10211 J Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Geriporiopsis caregiea, Geriporiopsis gilvescens, Geriporiopsis

65 El1767878

pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratínophilum, Chrysosporium lueknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium panníeola, Chrysosporium queens/andícum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporíum zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridíoides, Fusarium eerealís, Fusarium crookwel/ense, Fusarium culmorum, Fusarium gramínearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium retíeulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambueínum, Fusarium sareochroum, Fusarium sporotriehíoides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecíoides, Fusarium venenatum, Humícola ínsolens, Humícola lanugínosa, Mueor míehei, Myceliophthora thermophíla, Neurospora erassa, Penieillium purpurogenum, Phaneroehaete ehrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes vil/osa, Trametes versieolor, Triehoderma harzíanum, Tríehoderma koníngíi, Triehoderma longíbraehíatum, Triehoderma reesei, o Triehoderma víride.

10212j Células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la fomación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergil/us y Trichoderma están descritas en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, BiofTechnotogy6: 1419-1422. Métodos adecuados para transformar las especies de fusarium están descritas por Matardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. Levadura se puede transformar utilizando tos procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abetson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biotogy, Methods in Enzymology, votumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., New Yorio;; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de producción

10213J La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped de la presente invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperación de la variante.

10214J l as células huéspedes se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden cultivar por cultivo en matraz de agitación, o fermentación a escala pequef'ia o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, lote continuo, lote alimentado, o estado sólido) en los fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten a la variante ser expresada y/o aislada. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Si la variante se segrega en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no es segregada, se puede recuperar de lisatos de células.

10215] La variante se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técn ica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, pero de forma no limitativa, uso de anticuerpos especificos, formación de un producto enzimático, o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático se puede utilizar para determinar la actividad de la variante.

10216J la variante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales induyendo, pero no limitados a, colección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. En un aspecto, el caldo de fermentación entero es recuperado.

10217J La variante se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, cromatograría (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidroróbica, de cromatoenroque, y de exclusión por tamaf'ios), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New Yorio;, 1989) para obtener variantes sustancialmente

puras.

Composiciones

10218J La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una variante de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal variante. El término "enriquecido" indica que la actividad de mejora celulolitica de la composición ha sido aumentada, por

ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.

10219] Las composiciones pueden comprender una variante de la presente invención como el componente enzimático mayor, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, las composiciones pueden comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una o más (varias) enzimas seleccionadas del grupo consistente en una celulasa, un polipéptido con actividad de mejora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y un swolen ina.

10220J Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un liquido o una composición seca. Las composiciones se pueden estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

10221 ] Las composiciones pueden ser una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, como se describe en este caso. Consecuentemente, la presente invención también se refiere a formulaciones de caldo de fermentación y composiciones celulares que comprenden una variante de la presente invención. En atgunas formas de realización, la composición es un caldo completo con inactivación celular que contiene ácido(s) orgánico(s), células muertas ylo detrito celular, y medio de cultivo.

10222] El término "caldo de fermentación" como se utiliza en este caso se refiere a una preparación producida por fermentación celular que no sufre ninguna recuperación y/o purificación o una mínima. Por ejemplo, caldos de fermentación se producen cuando cultivos microbianos crecen por saturación, se incuban bajo condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, expresión de enzimas por células huésped) y secreción en el medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenido sin fraccionar o fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación no es fraccionado y comprende el medio de cultivo consumido y detrito celular presente después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) son quitadas, por ejemplo, por centrifugación. En algunas formas de realización, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares, y células microbianas viables y/o no viables.

10223] En una forma de realización, la formulación de caldo de fermentación y composiciones celulares comprenden un primer componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal derivada y un segundo componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 6 o más carbonos ylo una sal derivada. En una forma de realización especifica, el primer componente de ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal derivada, o una mezcla de dos o más de los anteriormente mencionados y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal derivada, o una mezcla de dos o más de los anteriormente mencionados.

10224] En un aspecto, la composición contiene un(os) ácido(s) orgánico(s), y opcionalmente además contiene células muertas ylo detrito celular. En una forma de realización, las células muertas y/o detrito celular son quitadas de un caldo completo con inactivación celular para proporcionar una composición que está libre de estos componentes.

10225] Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares pueden comprender además un agente conservante y/o antimicrobiano (por ejemplo; bacterioestático) incluyendo, pero no limitado a, sorbitol, cloruro sódico, sorbato de potasio, y otros conocidos en la técnica.

10226] Todo el caldo o composición con células muertas puede comprender además una o varias actividades enzimáticas tal como celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, endo-beta-1,3(4)-glucanasa, glucohidrolasa, xiloglucanasa, xilanasa, xilosidasa, arabinofuranosidasa, alfa-glucuronidasa, acetil xilano esterasa, mananasa, manosidasa, alfa-galactosidasa, acetil manano esterasa, galactanasa, arabinanasa, pectato liasa, liasa de pectinasa, pectato liasa, poligalacturonasa, acetil pectina esterasa, pectina metilesterasa, beta-galactosidasa, galactanasa, arabinanasa, alfa-arabinofuranosidasa, ramnogalacturonasa, ramnogalacturonano liasa esterasas de ácido ferrúlico, acetil ramnogalacturonano esterasa, xilogalacturonosidasa, xilogalacturonasa, ramnogalacturonano liasa, lignina peroxidasas, peroxidasas dependientes de manganeso, peroxidasas híbridas, con propiedades combinadas de lignina peroxidasas y peroxidasas dependientes de manganeso, glucoamilasa, amilasa, proteasa, y lacasa.

10227] En algunas formas de realización, todo el caldo o composición con células muertas incluye enzimas celulolíticas incluyendo, pero no limitado a, endoglucanasas (i) (EG) o 1,4-D-glucan-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanasas, incluyendo 1,4-D-glucan glucanohidrolasas (también conocidas como celodextrinasas) (EC 3.2.1.74) y 1,4-D-glucan celobiohidrolasas (exo-celobiohidrolasas; CBH) (EC 3.2.1.91), Y (iji) beta-glucosidasa

(BG) o beta-gluc6sido glucohidrolasas (EC 3.2.1.21).

10228] Todo el caldo o composición con células muertas puede contener el contenido no fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, todo el caldo o composición con inactivación celular contiene el medio de cultivo consumido y detrito celular presente después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) crezcan por saturación, se incuben bajo condiciones de limitación de carbono para permitir síntesis de proteína (por ejemplo, expresión de enzima(s) celulasa y/o glucosidasa). En algunas formas de realización, todo el caldo o composición con células muertas contiene el medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares, y células fúngicas filamentosas muertas. En algunas formas de realización, las células microbianas presentes en todo el caldo o composición con células muertas se pueden permeabilizar ylo lisar usando métodos conocidos en la técnica.

10229] Un caldo o composición celular entero como se describe en este caso es típicamente un líquido, pero puede contener componentes insolubles, tales como células muertas, detrito celular, componentes de medios de cultivo, y/o enzima(s) insoluble(s). En algunas formas de realización, componentes insolubles se pueden quitar para proporcionar una composición líquida clarificada.

10230] las formulaciones de caldo entero y composiciones celulares de la presente invención se pueden producir por un método descrito en WQ 90/15861 o WQ 20101096673.

10231J Ejemplos son dados a continuación de usos preferidos de las composiciones de la presente invención. la dosificación de la composición y otras condiciones bajo las cuales la composición se usa se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.

Usos

10232J la presente invención está también dirigida a los métodos siguientes para utilizar las variantes, o composiciones de las mismas.

10233] la presente invención también se refiere a métodos para la degradación o conversión de un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico con una composición enzimática en presencia de una variante de la presente invención. En un aspecto, los métodos además comprenden la recuperación del material celulósico degradado o convertido. Productos solubles de degradación o conversión del material celulósico se pueden separar del material celulósico insoluble usando cualquier método bien conocido en la técnica tal como, por ejemplo, centrifugación, filtración, y/o asentamiento de gravedad.

10234J la presente invención también se refiere a métodos para producir un proclucto de fermentación, que comprende: (a) sacarificación de un material celulósico con una composición enzimática en la presencia de una variante de la presente invención; (b) fermentación del material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo; varios) microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y (c) recuperación del producto de fermentación de la fermentación.

10235J la presente invención también se refiere a métodos de fermentación de un material celulósico, que comprende: fermentación del material celulósico con uno o más (por ejemplo; varios) microorganismos fermentadores, donde el material celulósico se sacarifica con una composición enzimática en presencia de una variante de la presente invención. En un aspecto, la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación. En otro aspecto, los métodos además comprenden la recuperación del producto de fermentación de la fermentación.

10236] los métodos de la presente invención pueden utilizarse para sacarificar el material celulósico en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en muchos productos de fermentación útiles, por ejemplo, combustible, etanol potable, y/o productos químioos de plataforma (por ejemplo, ácidos, alcoholes, celonas, gases, y similares). la producción de un producto de fermentación deseado del material celulósico implica típicamente pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación), y fermentación.

10237) El procesamiento del material celulósico según la presente invención se puede realizar usando procesos convencionales en la técnica. Además, los métodos de la presente invención se pueden implementar utilizando cualquier equipo de procesamiento de biomasa oonvencional configurado para operar conforme a la invención.

10238) Hidrólisis (sacarificación) y fermentación, separada o simultánea, incluyen, pero de forma no limitativa, hidrólisis y fermentación separada (SHF); sacarificación y fermentación simultánea (SSF); sacarificación simultánea y co-fermentación (SSCF); hidrólisis híbrida y fermentación (HHF); hidrólisis separada y co-fermentación (SHCF);

hidrólisis híbrida y co-fermentación (HHCF); y conversión microbiana directa (DMC), también a veces llamado bioprocesamiento consolidado (CBP). SHF usa pasos del proceso separados para primero hidrolizar enzimáticamente el material celulósico en azúcares fermentables, por ejemplo, glucosa, celobiosa, y monómeros de pentosa, y luego fermentar los azúcares fermentables a etanol. En SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de azúcares a etanol se combinan en un paso (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, OC, 179-212). SSCF implica la co-fermentación de azúcares múltiples (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF implica un paso de hidrólisis separada, y además un paso simultáneo de sacarificación y de hidrólisis, que pueden efectuarse en el mismo reactor. Los pasos en un proceso HHF pueden llevarse a cabo a temperaturas diferentes, es decir, sacarificación enzimática de alta temperatura seguida de SSF a una temperatura inferior que la que puede tolerar la cepa de fermentación. DMC combina los tres procesos (producción enzimática, hidrólisis, y fermentación) en uno o más (por ejemplo; verios) pasos donde el mismo organismo se usa para producir las enzimas para conversión del material celulósico en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en un producto final (Lynd, L R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., y Pretorius, 1. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Se entiende aquí que cualquier método conocido en la técnica que comprende pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación), fermentación, o una combinación de los mismos, se puede usar en la práctica de los métodos de la presente invención.

{0239] Un equipo convencional puede incluir un reactor agitado de lote alimentado, un reactor agitado de lote, un reactor agitado de flujO continuo con ultrafiltración, y/o un reactor de columna de flujO de pistón continuo (Femanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-balch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., YSinitsyn, A. P. , 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), un reactor de desgaste (Ryu, S. K., y Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53.-65), o un reactor con agitación intensiva inducida por un campo electromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, 1. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Tipos de reactor adicionales incluyen: reactores de lecho fluidificado, de manto de flujo ascendente, inmovilizado, y de tipo extrusor para hidrólisis ylo fermentación.

10240] Pretratamiento. Al poner en práctica los métodos de la presente invención, cualquier proceso de pretratamiento conocido en la técnica puede utilizarse para interrumpir componentes de pared celular vegetal del material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin.lBiotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. I Biotechnol. 108: 41 -65; Hendriks y Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh y Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Inl. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang y Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

10241J El material celul6sico puede también ser sometido a reducción de tamat'io de partícula, tamizado, prerremojo, humid ificación, lavado, y/o acondicionamiento antes del pretratamiento usando métodos conocidos en la técnica.

10242] Pretratamientos convencionales incluyen, pero de forma no limitativa, pretratamiento con vapor (con o sin explosión), pretratamiento de ácido diluido, pretratamiento de agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento de cal, oxidación en húmedo, explosión en húmedo, explosión de fibra de amoníaco, pretratamiento organosolv, y pretratamiento biológico. Pretratamientos adicionales incluyen pretratamientos de filtración de amoníaco, de ultrasonidos, de electroporación, de microondas, de C02 supercrílico, de H20 supercrítico, de ozono, de líquido iónico, y de irradiación gamma.

10243J El material celul6sico se puede pretratar antes de hidrólisis ylo fermentación. El pretratamiento es preferiblemente realizado antes de la hidrólisis. Altemativamente, el pretratamiento puede llevarse a cabo simultáneamente con hidrólisis enzimática para liberar azúcares fermentables, tal como glucosa, xilosa, y/o celobiosa. En la mayoría de los casos el paso de pretratamiento mismo produce alguna conversión de la biomasa en azúcares fermentables (incluso en ausencia de enzimas).

10244J Pretratamiento con vapor. En el pretratamiento con vapor, el material celulósico se calienta para interrumpir los componentes de la pared celular vegetal, incluyendo lignina, hemicelulosa, y celulosa para hacer la celulosa y otras fracciones, por ejemplo, hemicelulosa, accesible para enzimas. El material celulósico se pasa a o a través de un recipiente de reacción donde se inyecta vapor para aumentar la temperatura a la temperatura requerida y presión y se retiene ahl durante el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento con vapor es preferiblemente realizado a 140-250"C, por ejemplo, 160-200"C o 170-190"C, donde la gama de temperatura óptima depende de la adición de un catalizador qulmico. El periodo de permanencia para el pretratamiento con vapor es preferiblemente 1-60 minutos, por ejemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, o 4-10 minutos, donde el periodo de permanencia óptimo depende de la gama de temperatura y adición de un catalizador quimico. El pretratamiento con vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que el material celulósico es generalmente húmedo solo durante el pretratamiento. El pretratamiento con vapor es frecuentemente combinado con una descarga explosiva del material después del pretratamiento, lo que se conoce como explosión de vapor, es decir, expansión rápida hasta la presión atmosférica y flujo turbulento del material para aumentar el área de superficie accesible por fragmentación (Duff y Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe y Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotecnol. 59: 618-628; solicitud de patente estadounidense nO 20020164730). Durante el pretratamiento con vapor, los grupos de acetil hemicelulosa se dividen y el ácido resultante autocataliza la hidrólisis parcial de la hemicelulosa a monosacáridos y oligosacáridos. La lignina es quitada solo hasta una extensión limitada.

10245J Pretratamiento quimico: el término "tratamiento qulmico" se refiere a cualquier pretratamiento qulmico que promueve la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina. Tal pretratamiento puede convertir celulosa cristalina en celulosa amorfa. Ejemplos de procesos de pretratamiento qulmico adecuado incluyen, por ejemplo, pretratamiento de ácido diluido, pretratamiento de cal, oxidación en húmedo, explosión por congelación de la fibra de amoníaco (AFEX), filtración de amoníaco (APR), liquido iónico, y pretratamientos de organosolv.

10246] Un catalizador tal como H2S04 o S02 (típicamente 0,3 a 5% p/p) es frecuentemente adicionado antes del pretratamiento de vapor, que reduce el tiempo y temperatura, aumenta la recuperación, y mejora la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzym Microb.Technol. 39: 756-762). En el pretratamiento de ácido diluIdo, el material celulósico se mezcla con ácido diluido, tipicamente HzS04, yagua para formar un lodo, calentado por vapor a la temperatura deseada, y después de un periodo de permanencia expandido hasta la presión atmosférica. El pretratamiento de ácido diluido se puede realizar con un número de disel'ios de reactor, por ejemplo, reactores de flujO de pistón, reactores de contracorriente, o reactores de lecho de encogimiento de contracorriente continua (Duff y Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[0247) Diferentes métodos de pretratamiento bajo condiciones alcalinas también pueden usarse. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, pero de forma no limitativa, hidróxido sódico, cal, oxidación en húmedo, filtración de amoníaco (APR), y explosión por congelación de la fibra de amoníaco (AFEX).

10248J Pretratamiento de cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido cálcico a temperaturas de 85-150"C y tiempos de estancia desde 1 hora a varios dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006f110891 , WO 20061110899, WO 2006f110900, y WO 2006f110901 revelan métodos de pretratamiento usando amoniaco.

10249] Oxidación en húmedo es un pretratamiento térmico realizado tlpicamente a 180-200"C durante 5-15 minutos con adición de un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o sobrepresión de oxigeno (Schmidt y Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biolechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biolechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biolechnol. 81 : 1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% sustancia seca, por ejemplo, 2-30% sustancia seca o 5-20% sustancia seca, y frecuentemente el pH inicial se aumenta por la adición de álcali tal como carbonato de sodio.

10250J Una modificación del método de pretratamiento de oxidación en húmedo, conocido como explosión en húmedo (combinación de oxidación en húmedo y explosión de vapor) puede manipular la sustancia seca hasta 30%. En la explosión en húmedo, el agente oxidante se introduce durante pretratamiento después de un determinado tiempo de estancia. El pretratamiento es luego terminado por la expansión hasta la presión atmosférica (WO 2006(032282).

10251) Explosión de fibra de amoníaco (AFEX) implica tratamiento del malerial celulósico con líquido o amoníaco gaseoso a temperaturas moderadas tal como 9O-150"C y alta presión tat como 17-20 bar durante 5-10 minutos,

donde el contenido de sustancia en seco puede ser tan alto como 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Siochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Siotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Siotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Sioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante el pretratamienlo de AFEX la celulosa y hemicelulosas permanecen relativamente intactas. Complejos de lignina-carbohidrato son divididos.

10252J Pretratamiento de organosolv delignifica el material celulósico por extracción usando etanol acuoso (40-60% etanol) a 160-200~C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Sioeng. 90: 473-481 ; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol.121: 219-230). Acido sulfúrico es normalmente adicionado como un catalizador. En el pretratamiento de organOSOlv, la mayoría de hemicelulosa y lignina es quitada.

10253J Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados están descritos por Schell et al., 2003, App!. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105-108, pág. 69-85, Y Mosier et al., 2005, Sioresource Technology 96: 673-686, y solicitud estadounidense publicada 2002/0164730.

10254] En un aspecto, el pretratamiento químico es preferiblemente realizado como un tratamiento de ácido diluído, y más preferiblemente como un tratamiento de ácido diluido continuo. El ácido es típicamente ácido sulfúrico, pero otros ácidos también pueden usarse, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro de hidrógeno, o mezclas derivadas. Tratamiento de ácido moderado se conduce en el margen de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo, 1-4 o 1-2.5. En un aspecto, la concentración de ácido está en el rango de preferiblemente 0,01 a 10 % en peso de ácido, por ejemplo, 0,05 a 5 % en peso de ácido o 0,1 a 2 % en peso de ácido. El ácido se contacta con el material celulósico y se mantiene a una temperatura en el rango de preferiblemente 140200~C, por ejemplo, 165-190"C, durante periodos que varían de 1 a 60 minutos.

10255J En otro aspecto, el pretratamiento tiene lugar en un lodo acuoso. En aspectos preferidos, el material celul6sico está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80 % en peso, por ejemplo, 20-70 % en peso o 30-60 % en peso, tal como alrededor de 40 % en peso. El material celulósico pretratado puede ser no lavado o lavado utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, lavado con agua.

10256] Pretratamiento mecánico o pretratamiento fisico: el término "pretratamiento mecánico" o "pretratamiento fisico" se refiere a cualquier pretratamiento que promueve la reducción del tamal'io de particulas. Por ejemplo, tal pretratamiento puede implicar varios tipos de trituración o fresado (por ejemplo, molienda en seco, molienda en húmedo, o fresado de bola vibratoria).

10257] El material celulósico se puede pretratar tanto físicamente (mecánicamente) como químicamente. El pretratamiento mecánico o físico se puede acoplar con explosión de vaporización, hidrotermólisis, tratamiento de ácido diluido o moderado, alta temperatura, tratam iento de alta presión, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas), o combinaciones de los mismos. En un aspecto, alta presión se refiere a presión en el rango de preferiblemente aproximadamente 100 a aproximadamente 400 psi, por ejemplo, aproximadamente 150 a aproximadamente 250 psi. En otro aspecto, alta temperatura significa temperaturas en el rango de aproximadamente 100 a aproximadamente 300"C, por ejemplo, aproximadamente 140 a aproximadamente 200"C. En un aspecto preferido, pretratamiento mecánico o físico se realiza en un procesamiento por lotes que utiliza un sistema de hidrolizador de pistola de vapor que usa alta presión y alta temperatura tal como se ha defínido anteriormente, por ejemplo, un Sunds Hydrolyzer disponible por Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos pueden llevarse a cabo consecutivamente o simultáneamente, como se desee.

10258] Por consiguiente, en un aspecto preferido, el material celulósico está sujeto a pretratamiento físico (mecánico)

o químico, o cualquier combinación de los mismos, para promover la separaCión yfo liberar celulosa, hemicelulosa, yfo lignina.

10259] Pretratamiento biológico: el término "pretratamiento biológico" se refíere a cualquier pretratamiento biológico que promueve la separación yfo libera celulosa, hemicelulosa, y/o lignina del material celulósico. Técnicas de pretratamiento biológico pueden implicar aplicar microorganismos yfo enzimas solubilizantes de lignina (ver, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Sioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, OC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatmenls for enzymaliclmicrobial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbio!. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E. , Baker, J. O. , Y Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, OC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Siotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic

hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; y Vallander y Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

10260J Sacarificación. En la etapa de hidrólisis, también conocida como sacarificación, el material celulósico, por ejemplo, pretratado, se hidroliza para descomponer celulosa y/o hemicelulosa a azúcares fermentables, tal como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, manosa, galactosa, y/o oligosacáridos solubles. La hidrólisis se realiza enzimáticamente por una composición enzimática en presencia de una variante de la presente invención. Los componentes de las composiciones se pueden adicionar simultáneamente o consecutivamente.

10261) Hidrólisis enzimática es preferiblemente realizada en un ambiente acuoso adecuado bajo condiciones que pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la técnica. En un aspecto, la hidrólisis es realizada bajo condiciones adecuadas para la actividad de los componentes enzimáticos, es decir, óptimas para los componentes enzimáticos. La hidrólisis puede llevarse a cabo como un flujo continuo o proceso continuo donde el material celulósico es alimentado gradualmente a, por ejemplo, una solución de hidrólisis que contiene enzima.

10262J La sacarificación es generalmente realizada en los reactores de tanque agitado o fermentadores bajo pH, temperatura, y condiciones de mezcla controlados. Tiempo de proceso, temperatura y condiciones de pH adecuados pueden rápidamente ser determinados por un experto en la técnica. Por ejemplo, la sacarificación puede durar hasta 200 horas, pero es típicamente realizada durante preferiblemente aproximadamente 12 a aproximadamente 120 horas, por ejemplo, aproximadamente 16 a aproximadamente 72 horas o aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. La temperatura está en el rango de preferiblemente aproximadamente 25"C a aproximadamente 70"C, por ejemplo, aproximadamente 30"C a aproximadamente 65"C, aproximadamente 40"C a aproximadamente 60"C, o aproximadamente 50"C a aproximadamente 55"C. El pH está en el rango de preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 8, por ejemplo, aproximadamente

3.5 a aproximadamente 7, aproximadamente 4 a aproximadamente 6, o aproximadamente 5.0 a aproximadamente

5.5. El contenido en sustancias secas está en el rango de preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 50 % en peso, por ejemplo, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 % en peso o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 % en peso.

10263J Las composiciones enzimáticas pueden comprender cualquier proteína útil en la degradación del material celulósico.

10264] En un aspecto, la composición enzimática comprende o comprende además una o más (por ejemplo; varias) proteínas seleccionadas del grupo cons istente en una celulasa, un polipéptido con actividad de mejora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina. En otro aspecto, la celulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo; varias) enzimas seleccionadas del grupo consistente en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la hemicelulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo; varias) enzimas seleccionadas del grupo consistente en una esterasa de acetilmanano, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa.

10265J En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo; varias) enzimas celulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende o comprende además una o más (por ejemplo: varias) enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimálica comprende una o más (por ejemplo; varias) enzimas celuloliticas y una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemiceluloliticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo; varias) enzimas seleccionadas del grupo de enzimas celuloliticas y enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una beta-glucosidasa y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una celobiohidrolasa.

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa. En otro aspeclo, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una beta-glucosidasa, y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En olro aspeclo, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa, y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica. En olro aspeclo, la composición enzimálica comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una belaglucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una beta glucosidasa, y un polipéptido con actividad de mejora celulolítica.

10266] En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilmanano esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilxilano esterasa. En otro aspeclo, la composición enzimática comprende una arabinanasa (por ejemplo, alfa-L-arabinanasa). En otro aspecto, la composición enzimática comprende una arabinofuranosidasa (por ejemplo, alfa-L arabinofuranosidasa). En otro aspecto, la composición enzimática comprende una esterasa de ácido cumánco. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una feruloil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una galactosidasa (por ejemplo, alfa-galactosidasa y/o beta galactosidasa). En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronidasa (por ejemplo, alfa-D-glucuronidasa). En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronoil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una mananasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una manosidasa (por ejemplo, beta manosidasa). En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilanasa. En un aspecto prefendo, la xilanasa es una xilanasa de Familia 10. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilosidasa (por ejemplo, beta-xilosidasa).

10267) En airo aspeclo, la composición enzimálica comprende una esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una expansina. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una lacasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una enzima ligninolitica. En un aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una manganeso peroxidasa. En otro aspecto prefendo, la enzima ligninolítica es una lignina peroxidasa. En otro aspecto prefendo, la enzima ligninolítica es una enzima productora de H202. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una pectinasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una peroxidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una proteasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una swolenina.

10268] En los métodos de la presente invención, la(s) enzima(s) se puede(n) adicionar antes de o durante sacarificación, sacarificación y fermentación, o fermentación.

10269J Uno o más (por ejemplo; varios) componentes de la composición enzimática pueden ser proteínas tipo salvaje, proteínas recombinantes, o una combinación de proteínas de tipo salvaje y proteínas recombinantes. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo; varios) componentes pueden ser protelnas nativas de una célula, que se usan como una célula huésped para expresar recombinantemente uno o más (por ejemplo; varios) otros componentes de la composición enzimática. Uno o más (por ejemplo; varios) componentes de la composición enzimática se pueden producir como monocomponentes, que son luego combinados para formar la composición enz¡mática. La composición enzimática puede ser una combinación de preparaciones de protelnas mUlticomponentes y monocomponentes.

10270J Las enzimas usadas en los métodos de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para el uso, tal como, por ejemplo, una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, un lisado celular con o sin detrito celular, una preparación semi-purificada o purificada enzimática, o una célula huésped como una fuente de las enzimas. La composición enzimática puede ser un polvo seco o granulado, un granulado no en polvo, un líquido, un líquido estabilizado. o una enzima protegida estabilizada. Preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas at'iadiendo estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico según procesos establecidos.

10271 ) Las cantidades óptimas de las enzimas y una variante de la presente invención dependen de diferentes factores incluyendo, pero no limitados a, la mezcla de componentes enzimáticos celuloliticos y/o hemicelulolíticos, el

sustrato celulósico, la concentración de sustrato celulósico, el(los) pretratamiento(s) del sustrato celulósico, temperatura, tiempo, pH, e inclusión de organismo fermentador (por ejemplo, levadura para sacarificación simultánea y fermentación).

102721 En un aspecto, una cantidad eficaz de proteína enzimática celutolítica o hemicetulolitica para material cetulósico es de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg, preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg, más preferiblemente de aproximadamente

0.75 a aproximadamente 15 mg, aún más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg, y de ta forma más preferible de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 10 mg por 9 de material celutósico.

10273) En otro aspecto, una cantidad eficaz de una variante con actividad de mejora celulolítica para material celulósico es aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50.0 mg, preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg, más preferiblemente de aproximadamente

0.01 a aproximadamente 10 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg, más preferiblemente de aproximadamente de 0.025 a aproximadamente 1.5 mg, más preferibtemente de aproximadamente de 0.05 a aproximadamente 1.25 mg, más preferiblemente de aproximadamente de 0.075 a aproximadamente 1.25 mg, más preferiblemente de aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 1.25 mg, aún más preferiblemente de aproximadamente de 0.15 a aproximadamente 1.25 mg, y de la forma más preferible de aproximadamente de 0.25 a aproximadamente 1.0 mg por 9 de materiat celutósico.

10274J En otro aspecto, una cantidad eficaz de una variante con actividad de mejora celulolitica para proteína enzimática celutolítica es aproximadamente 0.005 a aproximadamente 1.0 g, preferibtemente de aproximadamente

0.01 a aproximadamente 1.0 g, más preferiblemente de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.75 g, más preferiblemente de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.5 g, más preferibtemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 g, aún más preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 g, Y de la forma más preferible de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 9 por 9 de proteína enzimática celulolítica.

10275] l os polipéptidos con actividad enzimática celulolítica o actividad enzimática hemicelulolítica al igual que otras proteínas/polipéptidos útiles en la degradaci6n del material celul6sico, por ejemplo, polipéptidos GH61 que tienen actividad de mejora celulolítica (colectivamente de ahora en adelante "polipéptidos que tienen actividad enzimática") se pueden derivar u obtener de cualquier origen adecuado, incluyendo bacteriano fúngico, levadura, planta, u origen mamífero. El término "obtenido" también significa aquí que la enzima se puede producir recombinantemente en un organismo huésped empleando métodos descritos aquí, donde la enzima producida recombinantemente es bien nativa o foránea al organismo huésped o tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, teniendo uno o más (por ejemplo; varios) aminoácidos que son eliminados, insertados y/o sustituidos, es decir, una enzima producida recombinantemente que es un mutante y{o un fragmento de una secuencia de aminoácidos nativa o una enzima producida por procesos de redistribución de ácidos nucleicos conocidos en la técnica. Comprendidas en el significado de una enzima nativa están las variantes naturales y en el significado de una enzima foránea están las variantes obtenidas recombinantemente. tal como por mutagénesis dirigida al sitio o redistribución.

10276) Un polipéptido con actividad enzimática puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano gram pOSitivo tal como un polipéptido de Bacíllus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia, u Oceanobacíllus teniendo actividad enzimática, o un polipéptido bacteriano Gram negativo tal como un polipéptido de E. col;, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Ne;sseria, o Ureaplasma teniendo actividad enzimática.

10277] En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacíllus circulans, Bacíllus c/ausi;, Bacíllus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus /autus, Bacíllus lenfus, Bacíllus licheníformís, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtílis, o Bacillus thuringiensis teniendo actividad enzimática.

10278] En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptococcus equisímilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus ten iendo actividad enzimática.

10279) En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, o Streptomyces lividans teniendo actividad enzimática.

10280J El polipéptido con actividad enzimática también puede ser un polipéptido fúngico, y más preferiblemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Píchía, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yanuwia teniendo actividad enzimática; o más preferiblemente un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidiurn, Botryospaeria, Ceriporiopsís, Chaetomidíum, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus. Coprinopsís, Coptotermes, Corynascus,

Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripílus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastíx, Neurospora, Paecilomyces, Penicíllium, Phanerochaete, Píromyces, Poítrasia, Pseudoplectanía, Pseudotrichonympha, Rhízomucor, Schizophyllum, Scytalídíum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, TolYPocladíum, Trichodenna, Trichophaea, Vertícillium, Volvariel/a, o Xylaria teniendo actividad enzimática.

[0281J En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces noroensis, o Saccharomyces oviformis teniendo actividad enzimática.

[0282] En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Acremonium cel/ulolyticus, Aspergíllus aculeatus, Aspergil/us awamori, Aspergil/us fumigatus, Aspergíllus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergíllus nidulans, Aspergil/us niger, Aspergíllus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium luchnowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporíum merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucínum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioídes, Fusarium sulphureum, Fusarium, torulosum Fusarium trichothecioídes, Fusarium venenatum, Humico/a grisea, Humico/a insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicíllium funiculosum, Penicíllium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thíelavia achromatíca, Thielavía albomyces, Thíelavia albopilosa, Thielavia australeínsís, Thíelavia timeti, mícrospora de Thielavia, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavía terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma víride, o Trichophaea saccata teniendo actividad enzimática.

[0283] Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas de polipéptidos teniendo actividad enzimática también pueden ser usados.

[0284] Uno o más (por ejemplo; varios) componentes de la composición enzimática pueden ser un componente recombinante, es decir, producido por clonación de una secuencia de AON que codifica el componente único y célula posterior transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped (ver, por ejemplo, WO 91/17243 yW091/17244). El huésped es preferiblemente un huésped heterólogo (enzima es foránea al huésped), pero el huésped puede bajo ciertas condiciones también ser un huésped homólogo (enzima es nativa para el huésped). Proteínas celulolíticas monocomponenles también se pueden preparar por la purifICación de tal proteína de un caldo de fermentación.

[0285] En un aspecto, una o más (por ejemplo; varias) enzimas celulolíticas comprenden una preparación enzimática celulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas celulolíticas comerciales adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, CELlIC® CTec (Novozymes NS), CELlIC® CTec2 (Novozymes NS), CELLUCLAST™ (Novozymes NS), NQVOZYM'" 188 (Novozymes NS), CELLUZYME'" (Novozymes NS), CEREFLO'" (Novozymes NS), y ULTRAFLO'" (Novozymes NS), ACCELERASE'" (Genencor Int.), LAMINEX'" (Genencor Int.), SPEZYME'" CP (Genencor In!.), FIL TRASE® NL (OSM); METHAPLUS® SIL 100 (OSM), ROHAMENP'" 7069 W (ROhm GmbH), FIBREZYME® LOI (Oyadic Intemational, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic Intemational, Inc.) o VISCOSTAR® 150L (Oyadic Inlemational, Inc.). Las enzimas de celulasa se agregan en cantidades efectivas de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 5.0 % en peso de sólidos, por ejemplo, aproximadamente 0.025 a aproximadamente 4.0 % en peso de sólidos o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 2.0 % en peso de sólidos.

10286J Ejemplos de endoglucanasas bacterianas que se pueden usar en los mélodos de la presenle invención, incluyen, pero de forma no limitativa, una endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente estadounidense nO 5.275.944; WO 96/02551; patente estadounidense nO 5.536.655, WO 00170031, WO 05/093050); endoglucanasa 111 de Thermobifida fusca (WO 05/093050); y endoglucanasa V de Thennobífida fusca 0NO 05/093050).

[0287] Ejemplos de endoglucanasas fúngicas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, una endoglucanasa I de Trichoderma reesei (Penttila el al., 1986, Gene 45: 253-263; endoglucanasa I de Trichoderma reesei CeI7B; número de accesión de GENBANK'" M15665 SEC ID n.o: 4); endoglucanasa 11 de Trichoderma reese; (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; endoglucanasa II Cel5A de Trichoderma reese;; número de accesión de GENBANKTM M19373 SEC ID n.o: 6) endoglucanasa 111 de Trichodenna reesei (Okada el al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; número de accesión de GENBANK'" AB003694 SEC ID n.O: 8) endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; número de accesión de GENBANKTM Z33381; SEC ID n.o: 10) endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884) endoglucanasa de Aspergíllus kawachií (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics

27: 435-439) endoglucanasa de Erwínia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14) endoglucanasa de

Fusarium oxysporum (número de accesión de GENBANKTM L29381); endoglucanasa de Humicola grisea var. thermoidea (número de accesión de GENBANK'" AB003107) end091ucanasa de Melanocarpus albomyces (número de accesión de GENBANKTM MAL515703) endoglucanasa de Neurospora crassa (número de accesión de GENBANKTM XM 324477) endoglucanasa V de Humicola insolens (SEC ID nO 12); endoglucanasa de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (SEC ID nO: 14); endoglucanasa de basidiomiceto CBS 495.95 (SEC ID nO: 16); endoglucanasa de basidiomiceto CBS 494.95 (SEC ID nO: 18); endoglucanasa CEL6B de Thielavia terrestris NRRL 8126 (SEC ID nO: 20); endoglucanasa CEL6C de Thielavia lerreslris NRRL 8126 (SEC ID nO: 22); endoglucanasa CEL7C de Thielavia teffestris NRRL 8126 (SEC ID nO: 24); endoglucanasa CEL7E de Thielavia lerreslris NRRL 8126 (SEC ID nO: 26); endoglucanasa CEL7F de Thielavia lerreslris NRRL 8126 (SEC ID nO: 28); endoglucanasa CEL7A de Cladoffhinum foecundissimum ATCC 62373 (SEC ID nO 30); y endoglucanasa de la cepa de Trichoderma reesei nO. VTT-D-80133 (SEC ID n.O: 32; número de accesión de GENBANK'" M15665). Las endoglucanasas de SEC ID n.o: 4, SEC ID n.o: 6, SEC ID n.o: 8, SEC ID n.o: 10, SEC ID n.o: 12, SEC ID n.o: 14, SEC ID n.o: 16, SEC ID n.o: 18, SEC ID n.o: 20, SEC ID n.o: 22, SEC ID n.o: 24, SEC ID n.o: 26, SEC ID n.o: 28, SEC ID n.o: 30, y SEC ID n.o: 32, anteriormente descritas se codifican por la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 3, SEC ID n.o: 5, SEC ID n.o: 7, SEC ID n.o: 9, SEC ID n.o: 11, SEC ID n.o: 13, SEC ID n.o: 15, SEC ID

n.o: 17, SEC ID n.o: 19, SEC ID n.o: 21, SEC ID n.o: 23, SEC ID n.o: 25, SEC ID n.o: 27, SEC ID n.o: 29, y SEC ID n.o: 31 , respectivamente.

¡0288J Ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei (SEC ID n.o: 34); celobiohidrolasa 11 de Trichoderma reesei (SEC ID n.O: 36); celobiohidrolasa I de Humicola insolens (SEC ID n.o: 38); celobiohidrolasa 11 de Myceliophthora thermophila (SEC ID n.o: 40 y SEC ID n.o: 42); celobiohidrolasa U (CEL6A) de Thielavia te"estris (SEC ID n.o: 44); celobiohidrolasa I de Chaetomium lhermophilum (SEC ID n.o: 46); y celobiohidrolasa 11 de Chaetomium thermophilum (SEC ID n.O: 48), celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus (SEC ID n.O: 50), y celobiohidrolasa 11 de Aspergillus fumigatus (SEC ID n.o: 52). Las celobiohidrolasas de SEC ID n.O: 34, SEC ID n.O: 36, SEC ID n.O: 38, SEC ID n.O: 40, SEC ID n.O: 42, SEC ID n.O: 44, SEC ID n.o: 46, SEC ID n.o: 48, SEC ID n.o: SO, y SEC ID n.o: 52, anteriormente descritas se codifican por la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 33, SEC ID n.o: 35, SEC ID n.o: 37, SEC ID n.o: 39, SEC ID n.o: 41, SEC ID n.o: 43, SEC ID n.O: 45, SEC ID n.O: 47, SEC ID n.O: 49, y SEC ID n.O: 51, respectivamente.

¡0289J Ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, beta glucosidasa de Aspergíllus oryzae (SEC ID n.O: 54); beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID n.o: 56); beta-glucosidasa de Penicillium brasilianum IBT 20888 (SEC ID n.o: 58); beta-glucosidasa de Aspergillus niger(SEC ID n.O: 60); y beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (SEC ID n.O: 62). Las beta-glucosidasas de SEC ID n.o: 54, SEC ID n.o: 56, SEC ID n.o: 58, SEC ID n.o: 60, y SEC ID n.o: 61 descritas arriba se cod ifican por la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID n.o: 53, SEC ID n.o: 55, SEC ID n.o: 57, SEC ID n.O: 59, y SEC ID n.O: 61, respectivamente.

¡0290J Ejemplos de otras beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen una proteína de fusión de variante de beta-glucosidasa de AspergiJ/us oryzae de SEC ID n.o: 64 o la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de SEC ID n.O: 66. Las proteínas de fusión de beta-glucosidasa de SEC ID n.O: 64 y SEC ID n.O: 66 se codifican por SEC ID n.O: 63 y SEC ID n.O: 65, respectivamente.

10291] La beta-glucosidasa de Aspergíllus oryzae puede ser obtenida según WO 20021095014. La beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus puede ser obtenida según WO 20051047499 . La beta-glucosidasa de Penicillium brasilianum puede ser obtenida según WQ 2007/019442. La beta-glucosidasa de Aspergillus niger puede ser obtenida según Dan el al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. La beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus puede ser obtenida según Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.

10292J Otras endoglucanasas útiles, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas se describen en numerosas familias de glicosil hidrolasa que utilizan la clasificación según Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat B., y Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

10293] Otras enzimas celulolíticas que se pueden usar en la presente invención son descritas en WQ 98113465 , WQ 981015619, WO 981015633, WO 99106574, WO 99110481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 20021101078, WO 20031027306, WO 2003/052054, WO 20031052055, WO 20031052056, WO 2003/052057, WO 200310521 18, WO

2004/016760. WO 2004/043980. WO 2004/048592. WO 2005/001065. WO 2005/028636. WO 2005/093050. WO

20051093073, WO 2006/074005, WO 20061117432, WO 20071071818, WO 2007/071820, WO 20081008070, WO 20081008793, patente estadounidense nO 5.457.046, patente estadounidense nO 5.648.263, y patente estadounidense nO 5.686.593.

10294J En un aspecto, el polipéptido con actividad de mejora celulolítica se usa en la presencia de un catión metálico bivalente de activación soluble según WO 20081151043, por ejemplo, sulfato de manganeso.

65 El1767878

[0295J En otro aspecto, el polipéptido con actividad de mejora celulolítica se usa en presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicíclico, un compuesto heterocictico, un compuesto con nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto con sulfuro, o una solución obtenida de un material celulósico pretratado tal como rastrojos de maíz pretratados (peS).

[0296J El compuesto dioxi puede incluir cualquier compuesto adecuado conteniendo dos o más átomos de oxígeno. En algunos aspectos, los compuestos dioxi contienen una fracción de arilo sustituido como se describe aquí. Los compuestos dioxi pueden comprender uno o más (por ejemplo: varios) hidroxilo y/o derivados de hidroxilo, pero también incluyen fracciones de arilo sustituido careciendo de hidroxilo y derivados hidroxilo. Ejemplos no limitativos de los compuestos dioxi incluyen pirocatecol o catecol; écido cafeico; écido 3,4dihidroxibenzoico; 4-tert-butil-5-metoxi-l ,2-bencenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-trihidroxibenzoato; 2,3,4trihidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-dihidroxibenzoico; 4-cloro-l,2-bencenodiol; 4nitro-1,2-bencenodiol; ácido tánico; galato de etilo; glioolato de metilo; ácido dihidroxifumarico; 2-butina-1,4-diol; (ácido crocónico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3-etioxi-l,2-propanodiol; 2,4,4'trihidroxibenzofenona; cis-2-buteno-l,4-diol; 3,4-dihidroxi-3-ciclobuteno-l ,2-diona; dihidroxiacetona; acroleina acetálica; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzoico; y metil-3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato; o una sal o solvato de la misma.

10297J El compuesto bicíclico puede incluir cualquier sistema anular fusionado sustituido adecuado como se describe en este caso. Los compuestos pueden comprender uno o más (por ejemplo; varios) anillos adicionales, y no se limitan a un número específico de anillos a menos que se declare lo contrario. En un aspecto, el compuesto bicíclico es un flavonoide. En otro aspecto, el compuesto biciclico es un isoflavonoide opcionalmente substituido. En otro aspecto, el compuesto bicíclico es un Ión de flavilio opcionalmente sustituido, tal como una antocianidina opcionalmente sustituida o antocianina opcionalmente sustituida, o su derivado. Ejemplos no limitativos de los compuestos bicíclicos incluyen epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; kaempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; kuromanina; keracianina; o una salo solvato del mismo.

10298J El compuesto heterocíclico puede ser cualquier compuesto adecuado, tal como un anillo aromático opcionalmente sustituido o no aromático que comprende un heteroátomo, como se describe en este caso. En un aspecto, el heterocíclico es un compuesto que incluye una fracción de heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o una fracción de heteroarilo opcionalmente sustituido. En otro aspecto, la fracción de heterocicloalquilo opcionalmente sustituida o fracción de heteroarilo opcionalmente sustituida es un heterocicloalquilo dividido en 5 miembros opcionalmente sustituido o una fracción de heteroarilo dividida en 5 miembros opcionalmente sustituida. En otro aspecto, el heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o fracción de heteroarilo opcionalmente sustituida es una fracción opcionalmente sustituida seleccionada de pirazolilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, pirrolilo, piridilo, pirimidilo, piridazinilo, tiazolilo, triazolilo, tienilo, dihidrotieno-pirazolilo, tianaftenilo, catbazolilo, bencimidazolilo, benzotienilo, benzofuranilo, indolilo, quinoleinilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, benzimidazolilo, isoquinoleinilo, isoindolilo, acridinilo, benzoisazolilo, dimetilhidantoina, pirazinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, morfinilo, indolilo, diazepinilo, azepinilo, tiepinilo, piperidinilo, y oxepinilo. En otro aspecto, la fracción de heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o fracción de heteroarilo opcionalmente sustituido es un furanilo opcionalmente sustituido. Ejemplos no limitativos de los compuestos heterocíclicos incluyen (1,2-dihidroxietil)-3,4-dihidroxifuran-2(5H)-ona; 4hidroxi-5-metil-3-fura nona; 5-hidroxi-2( 5H)-fura nona; [1 ,2 -dihidroxietil)furan-2,3,4(5H )-triona; a-hidroxi-y

butirolactona; y-Iactona ribónica; ácido aldohexuronicaldohexurónico y-Iactona; ácido glucónico ó-Iactona; 4hidroxicoumarina; dihidrobenzofurano; 5-(hidroximetil)furfural; furoina; 2(5H)-furanona; 5,6-dihidro-2H-piran-2-ona; y 5,6-dihidro-4-hidroxi-6-metil-2H-piran-2-ona; o una salo solvato de los mismos.

{0299] El compuesto que contiene nitrógeno puede ser cualquier compuesto adecuado con uno o varios átomos de nitrógeno. En un aspecto, el compuesto que contiene nitrógeno comprende una fracción de amina, imina, hidroxilamina, o nitróxido. Ejemplos no limitativos de los compuestos que contienen nitrógeno incluyen acetona oxima; ácido violúrico; piridina2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-bencenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi; 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina; 6,7dimetil-5,6,7,8-tetrahidropterina; y ácido maleámico; o una salo solvato de los mismos.

¡0300J El compuesto de quinona puede ser cualquier compuesto adecuado que comprende una fracción de qu inona como se describe en este caso. Ejemplos no limitativos de los compuestos de quinona incluyen 1,4-benzoquinona, 1,4-naftoquinona: 2-hidroxi-l,4naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-l,4-benzoquinona o coenzima 00, 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona o duroquinona; 1 ,4-dihidroxiantraquinona; 3-hidroxi-1-metil-5,6-indolinediona o adrenocromo; 4-tert-butil-5-metoxi-l,2benzoquinona; pirroloquinolina quinona; o una salo solvato de los mismos.

10301) El compuesto que contiene sulfuro puede ser cualquier compuesto adecuado comprendiendo uno o varios átomos de azufre. En un aspecto, el compuesto que contiene sulfuro comprende una fracción seleccionada de tionilo, tioéter, sulfinilo, sulfonilo, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfónico, y éster sulfónico. Ejemplos no limitativos de los compuestos que contienen sutfuro incluyen etanotiot; 2-propanotiot; 2-propeno-1-tiol; ácido 2-mercaptoetanesulfonico; bencenotiol; benceno-1 ,2-ditiol; cisteína; metionina; gtutationa; cistina; o una sat o solvato de los mismos.

10302J En un aspecto, una cantidad eficaz de tal compuesto anteriormente descrito para material celulósico como una proporción molar para unidades glucosílicas de celulosa es aproximadamente 10.{¡ a aproximadamente 10, por ejemplo, aproximadamente 10.{¡ a aproximadamente 7.5, aproximadamente 10.{¡ a aproximadamente 5, aproximadamente 10.{l a aproximadamente 2.5, aproximadamente 10.{l a aproximadamente 1, aproximadamente 105 a aproximadamente 1, aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10.1, aproximadamente 10"" a aproximadamente 10-', aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10·" o aproximadamente 10.3 a

aproximadamente 10. . En otro aspecto, una cantidad eficaz de tal compuesto anteriormente descrito es aproximadamente 0,1 IJM a aproximadamente 1 M, por ejemplo, aproximadamente 0,5 IJM a aproximadamente 0,75 M, aproximadamente 0,75 IJM a aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 1 IJM a aproximadamente 0,25 M, aproximadamente 1 IJM a aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 5 IJM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 IJM a aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 IJM a aproximadamente 25 mM, aproximadamente 10 IJM a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 5 IJM a aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM.

[0303] El término "licor" significa la fase de la solución, bien acuosa, orgánica, o una combinación de los mismos, que surgen del tratamiento de una lignocelulosa y/o material de hemicelulosa en un Iodo, o monosacáridos de los mismos, por ejemplo, xilosa, arabinosa, manosa, etc., bajo condiciones como se describe aquí, y el contenido soluble de los mismos. Un lícor para realce celulolítico de un polipéptido GH61 se puede producir tratando una lignocelulosa o material de hemicelulosa (o materia prima) aplicando calor y/o presión, opcionalmente en presencia de un catalizador, por ejemplo, ácido, opcionalmente en presencia de un solvente orgánico, y opcionalmente en combinación con interrupción física del material, y luego separando la solución de los sólidos residuales. Tales condiciones deciden el grado de realce celulolitico obtenible a través de la combinación de solución y un polipéptido GH61 durante la hidrólisis de un sustrato celulósico por una preparación con celulasa. La solución se puede separar del material tratado que utiliza un método estándar en la técnica, tal como filtración, sedimentación, o centrifugación.

10304] En un aspecto, una cantidad eficaz de la solución para celulosa es aproximadamente 10.{¡ a aproximadamente 10 9 por 9 de celulosa, por ejemplo, aproximadamente 10-6 a aproximadamente 7.5 g, aproximadamente 10-6 a aproximadamente 5, aproximadamente 10-6 a aproximadamente 2.5 g, aproximadamente 10-6 a aproximadamente 1 g, aproximadamente 10.{i a aproximadamente 1 g, aproximadamente 10.5 a aproximadamente 10.1 g, aproximadamente 10"" a aproximadamente 10-1 g, aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10-1 g, o aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10-29 por 9 de celulosa.

10305J En un aspecto, una o más (por ejemplo; varias) enzimas hemicelulolíticas comprenden una preparación enzimática hemicelulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas hemicelulolíticas comerciales adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, SHEARZVME""" (Novozymes AlS), CELlIC® HTec (Novozymes AlS), CELlIC® HTec2 (Novozymes AlS), VISCOZYME® (Novozymes AlS), ULTRAFLO® (Novozymes AlS), PULPZVME® HC (Novozymes AlS), MULTIFECT® Xylanase (Genencor), ACCELLERASE® XV (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xylanase (DSM), DEPOL """ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL TM 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK)" y DEPOLTM 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

10306] Ejemplos de xilanasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, xilanasas de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:M R63790 WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 20061078256; Xyl 3 SEC ID n.O: 67 [secuencia de ADN] y SEC ID n.o: 68 [secuencia de aminoácidos deducida]), Penicíllium pinophilum (WO 2011/041405), Penícillíum sp. (WO 2010(126772), Thielavía terrestris NRRL 8126 (WO 20091079210 ), y Trichophaea saccata GH1 0 (WO 2011 /057083).

¡0307) Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei (número de accesión de UniProtKB{frEMBL 092458 SEC ID n.o: 69 lsecuencia de ADN] y SEC ID n.o: 70 (secuencia de aminoácidos deducida n, Talaromyces emersonii (número de accesión de SwissProt Q8X212), y Neurospora crassa (número de accesión de SwissProt Q7S0W4).

¡0308) Ejemplos de acetilxilano esterasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, acetilxilano esterasas de Aspergillus aculeatus (WO 2010(108918), Chaetomium globosum (número de accesión de Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracíle (número de accesión de GeneSeqP MB82124), Humícola

insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hipocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010f014880), Neurospora crassa (número de accesión de UniProt q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de accesión de Uniprot QOUHJ1 ), y Thielavia terrestris NRRl 8126 (WO 2009f042846).

10309] Ejemplos de feruloil esterasas (esterasas de ácido ferúlico) útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, feruloil esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009f076122), Neosarlorya fischeri (número de accesión de UniProt A1 D9T4), Neurospora crassa (número de accesión de UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogríseum (!NO 2009f127729), Y Thielavia terrestris (!NO 2010f053838 y WO 2010/065448).

10310] Ejemplos de arabinofuranosidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger (número de accesión de GeneSeqP AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (!NO 2006f114094 Y WO 2009f073383), YM. giganteus (WO 2006f114094).

[0311] Ejemplos de alfa-glucuronidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, alfa-glucuronidasas de Aspergillus clavatus (número de accesión de UniProt alcc12), Aspergillus fumigatus (número de accesión de SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de accesión de Uniprot 096WX9), Aspergillus teffeus (número de accesión de SwissProt aOCJP9), Humicola insolens (!NO 2010f014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de accesión de UniProt QBX211 ), y Tríchoderma reesei (número de accesión de Uniprot 099024).

[0312) Los polipéptidos con actividad enzimática usados en los métodos de la presente invención se pueden producir por fennentación de las cepas microbianas mencionadas anteriormente en un medio nutritivo que contiene fuentes de nitrógeno y carbono adecuadas y sales inorgénicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bennetl, J.W. y LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catélogos de la colección americana de cultivos tipo). Rangos de temperatura y otras condiciones adecuadas para crecimiento y producción enzimática se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

10313] l a fermentación puede ser cualquier método de cultivo de una célula dando como resultado la expresión o aislamiento de una enzima o proteina. La fermentación puede, por lo tanto, son entendida como que comprende cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, de lote, de lote alimentado, o de estado sólido) en los fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten a la enzima ser expresada o aislada. las enzimas resultantes producidas por los métodos anteriormente descritos se pueden recuperar del medio de fermentación y purificar por procedimientos convencionales.

10314] Fermentación. Los azúcares fermentables obtenidos del material celulósico hidrolizado se pueden fermentar por uno o más (por ejemplo; varios) microorganismos fermentadores capaces de fermentar los azúcares directa o indirectamente en un producto de fermentación deseado. "Fermentación" o "proceso de fermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o cualquier proceso que comprende un paso de fermentación. Procesos de fermentación también incluyen procesos de fermentación usados en la industria de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria lechera (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria de cuero, e industria de tabaco. Las condiciones de fermentación dependen del producto de fermentación deseado y organismo fermentador y pueden fácilmente ser detenninadas por un experto en la técnica.

10315] En la etapa de fermentación, azúcares, liberados del material celulósico como resultado del pretratamiento y pasos de hidrólisis enzimética, se fermentan a un producto, por ejemplo, etanol, por un organismo fermentador, tal como levadura. Hidrólisis (sacarificaciÓn) y fermentación pueden ser separadas o simultáneas, como se describe en este caso.

[0316] Cualquier material celulósico hidrolizado adecuado se puede usar en el paso de fermentación al poner en práctica la presente invención. El material es generalmente seleccionado basado en el producto de fermentación deseado, es decir, la sustancia para ser obtenida de la fermentación, y el proceso empleado, como es bien conocido en la técnica.

[0317) El término "medio de fermentación" se entiende aqur para referirse a un medio antes de que el(los) microorganismo(s) de fermentación sea(sean) at'iadido(s), tal como, un medio resultante de un proceso de sacarificación, al igual que un medio usado en una sacarificación simultánea y proceso de fermentación (SSF).

10318] "Microorganismo fermentador" se refiere a cualquier microorganismo, incluyendo organismos bacterianos y

fúngicos, adecuados para usar en un proceso de fermentación deseado para producir un producto de fermentación. El or9anismo fermentador puede ser organismos fermentadores de hexosa y/o de pentosa, o una combinación de los mismos. Los organismos fermentadores tanto de hexosa como de pentosa se conocen en la técnica. Microorganismos fermentadores adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tal como glucosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, maltosa, manosa, galactosa, y/o oligosacáridos, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organ ismos fermentadores bacterianos y fúngicos productores de etanol están descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

10319] Ejemplos de microorganismos fermentadores que pueden fermentar azúcares de hexosa incluyen organismos bacterianos y fúngicos, lal como levadura. Levadura preferida incluye cepas de Gandida, Kluyveromyces, y Saccharomyces, por ejemplo, Gandida sonorensis, Kluyveromyces marxíanus, y Saccharomyces cerevísíae.

10320J Ejemplos de organismos fermentadores que pueden fermentar azúcares de pentosa en su estado nativo incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tal como alguna levadura. Levadura fermentadora de xilosa preferida incluyen cepas de Gandida, preferiblemente G. sheatae o G. sonorensis; y cepas de Pichia, preferiblemente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. Levadura fermentadora de pentosa preferida incluye cepas de Pachysolen, preferiblemente P. tannophílus. Organismos no capaces de fermentar los azúcares de pentosa, tal como xilosa y arabinosa, pueden ser genéticamente modificados para hacerto por métodos conocidos en la técnica.

[0321] Ejemplos de bacterias que pueden fermentar eficazmente hexosa y pentosa a etanol incluyen, por ejemplo,

Bacil/us coagulans, Glostridium acetobuty/icum, Clostridium thermocel/um, Glostridium phytofermentans, Geobacillus, sp. Therm08naerobacter saccharolíticum, y Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[0322J Otros organismos fermentadores incluyen cepas de Bacillus coagulans; Gandida, such as G. sonorensis, G.

methanosorbosa, G. diddensíae, G. parapsilosis, G. naedodendra, G. b/ankii, C. entomophilía, G. brassicae, G.

pseudotropicalís, G. boidinií, G. utilís, and G. scehatae; Clostridium, tal como G. acetobutylícum, G. thermocellum, y

G. phytofermentans: E. coli, especialmente cepas de E. coN que se han modificado genéticamente para mejorar el rendimiento de etanol; Geobacíllus sp. ; Hansenula, tal como Hansenula anoma/a; K/ebsíella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como K. marxíanus, K. lactís, K. thermotolerans, y K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; Thermoanaerobacter, tal como S. pambe; Thermoanaerobacter, tal como Therm08naerobacter saccharoliticum; y Zymomonas, tal como Zymomonas mobílis.

10323] En un aspecto preferido, la levadura es un Bretannomyces. En un aspecto más preferido, la levadura es Bretannomyces c/ausenii. En otro aspecto preferido, la levadura es una Gandida. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida sonorensis. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida boidínií. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida b/ankii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida brassicae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida diddensii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida entomophíliia. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida pseudotropicalis. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida scehatae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Gandida utilis. En otro aspecto preferido, la levadura es una G/avispora. En otro aspecto más preferido, la levadura es G/avispora lusitaniae. En otro aspecto más preferido, la levadura es G/avispora opuntiae. En otro aspecto preferido, la levadura es un Kluyveromyces. En otro aspecto más preferido, la levadura es K/uyveromyces fragilis. En otro aspecto más preferido, la levadura es K/uyveromyces marxianus.

En otro aspecto más preferido, la levadura es K/uyveromyces t!¡ermolo/erans.

En otro aspecto preferido, la levadura es una Pachysolen.

En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen tannophilus.

En otro aspecto preferido, la levadura es una Pichia.

En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia stípitís.

En otro aspecto preferido, la levadura es una Saccharomyces spp.

En un aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces distatícus.

En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces uvarum.

10324J En un aspecto preferido. la bacteria es una Bacil/us. En un aspecto más preferido, la bacteria es Bacíllus coagu/ans.

En otro aspecto preferido, la bacteria es una Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium acetobutylicum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium phytofermentans. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium thermocellum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Geobacilus sp. En otro aspecto más preferido, la bacteria es un Thermoanaerobacter. En otro aspeclo más preferido, la bacleria es Thermoanaerobacter saccharoliticum. En otro aspecto preferido, la bacteria es una Zymomonas. En otro aspeclo más preferido, la bacleria es Zymomonas mobilis.

10325] levadura disponible comercialmente adecuada para producción de etanol incluyen. por ejemplo, BIOFERMTIoI AH and XR (NABC -North American Bioproducts Corporation, GA, USA), ETHANOL REDTIoI yeast (Fermentis/Lesaffre, USA), FALl TIoI (Fleischmann's Veas!, USA), FERMIOL TIoI (DSM Specialties), GERT STRANDTIoI (Gert Strand AB, Suecia), y SUPERSTARTTIoI y levadura fresca de THERMOSACCTIoI (Ethanol Technol09Y, WI, USA).

10326] En un aspecto preferido, el microorganismo fermentador ha sido genéticamente modificado para proporcionar la capacidad para fermentar azúcares de pentosa, tal como microorganismos que utilizan xilosa, que utilizan arabinosa, y y que ulilizan xilosa yarabinosa.

10327] la clonación de genes heteról090S en varios microor9anismos fermentadores ha conducido a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y penlosas a etanol (ca-fermenlación) (Che n y Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically en9ineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotler y Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae slrains overexpressing Ihe TKL 1 and TAL 1 genes encoding Ihe pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Minimal metabolic en9ineerin9 of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Veast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and olher sugars by reeombinanl Escherichia eoli, Biolech. Bioeng. 38: 296-303: Ingram el al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003f062430, xilosa isomerasa).

10328] En un aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Gandida sonorensis. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Escherichia coli. En otro aspeclo preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Klebsiella oxytoca. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Kluyveromyces marxianus. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto preferido, el microorganismo fermentador genéticamente modificado es Zymomonas mobilis.

10329J Es bien conocido en la técnica que los organismos anleriormenle descritos también pueden usarse para producir otras sustancias, como se describe aqu1.

10330] El microorganismo fermentador es típicamente ai'iadido al material celulósico degradado o hidrolizado y la fermentación se realiza durante aproximadamente 8 a aproximadamente 96 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 a aproximadamente 60 horas. La temperatura es típicamente entre aproximadamente 26"C a aproximadamente 6O"C, por ejemplo, aproximadamente 32"C o 50"C, y aproximadamente pH 3 a aproximadamente de pH 8, por ejemplo, pH 4-5, 6, o 7.

10331] En un aspecto, la levadura y/o otro microorgan ismo se aplican al material celulósico degradado y la fermentación se realiza duranle aproximadamenle 12 a aproximadamenle 96 horas, ta l camo lípicamente 24-60 horas. En otro aspecto, la temperatura es preferiblemente entre aproximadamente 20"C a aproximadamente 60°C, por ejemplo, aproximadamenle 25"C a aproximadamente SO·C, aproximadamenle 32"C a aproximadamente 50·C, o aproximadamente 32"C a aproximadamente SO"C, y el pH es generalmente de aproximadamente pH 3 a aproximadamente de pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7. Sin embargo, algunos organismos fermentadores, por ejemplo, bacterias, tienen temperatura de fermentación más alta óptima. Levadura u otro microorganismo es preferiblemente aplicado en cantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferiblemente de aproximadamente 10' a 1010, especialmente aproximadamente 2 x 108 concentración de células viables por mi de caldo de fermentación. Otra guía con respeclo al uso de levadura para fermenlación se puede encontrar en, por ejemplo, "The Alcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T.P. Lyons y D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999).

El1767878

{0332J Para producción de etanol, después de la fermentación del lodo fermentado se destila para extraer el etanol. El etanol obtenido segun los métodos de la invención se pueden usar como, por ejemplo, etanol combustible, etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables, o etanol industrial.

10333] Un estimulador de fermentación se puede usar en combinación con cualquiera de los métodos descritos aqul para mejorar adicionalmente el proceso de fermentación, y en particular, el rendimiento del microorganismo fermentador, tal como, mejora del indice y rendimiento de etanol. Un "estimulador de la fermentación" se refiere a estimuladores para el crecimiento de los microorganismos fermentadores, en particular, levadura. Estimuladores de fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tia mina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina, y Vitaminas A, B, C, D, y E. Ver, por ejemplo, Alfenore et al., Improvin9 ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feedin9 strate9Y durin9 fed-batch process, Springer-Verlag (2002). Ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes que comprenden P, K, M9, S, Ca, Fe, Zn, Mn, y Cu.

{0334) Productos de fermentación: un producto de fermentación puede ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. El producto de fermentación puede ser, sin limitación, un alcohol (por ejemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenoglicol, 1,3-propanodiol Ipropilenglicol], butanodiol, glicerina, sorbilol, y xililol); un alcano (por ejemplo, penlano, hexano, heptano, octano, nona no, decano, undecano, y dodecano), un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, y ciclooctano), un alqueno (por ejemplo penteno, hexeno, hepteno, y ocleno); un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina, y treonina); un gas (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2), dióxido de carbono (C02), y monóxido de carbono (CO»; isopreno; una cetona (por ejemplo, de acetona); un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acélico, ácido acetónico, ácido adípico, ácido asc6rbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-gluc6nico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucuronico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico, y ácido xilónico); y policétido. El producto de fermentación puede también ser proteína como un producto de valor alto.

10335] En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entiende que el término "alcohol" abarca una sustancia que contiene una o más fracciones de hidroxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilenoglicol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1,3-propanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es $OrbitoL En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Ver, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Ou, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Silveira, M. M., Y Jonas, R. , 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., y Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol -a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. y Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA10l and in situ recovery by gas stripping, World Joumal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

10336] En otro aspecto preferido, el producto de rermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcano no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano. En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nona no. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecano.

10337] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano.

En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano.

En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano.

En otro aspeclo más preferido, el cicloalcano es cicloheptano.

En otro aspeclo más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.

10338] En olro aspeclo preferido, el producto de fermentación es un alqueno.

El alqueno puede ser un no ramificado o un alqueno ramificado.

En otro aspeclo más preferido, el alqueno es penleno.

En otro aspeclo más preferido, el alqueno es hexeno.

En otro aspeclo más preferido, el alqueno es hepleno.

En otro aspeclo más preferido, el alqueno es ocleno.

10339J En airo aspeclo preferido, el producto de fennentación es un aminoácido.

En otro aspeclo más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico.

En otro aspecto más preferido, el aminoácido es ácido glutámico.

En otro aspeclo más preferido, el aminoácido es glicina.

En otro aspecto más preferido, el aminoácido es lisina.

En otro aspecto más preferido, el aminoácido es serina.

En otro aspecto más preferido, el aminoácido es treonina.

Ver, por ejemplo, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fennentalion kinelics far

poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnologyand Bioengineenng 87 (4): 501 -515.

10340J En airo aspeclo preferido, el producto de fermentación es un gas.

En otro aspecto más preferido, el gas es metano.

En otro aspecto más preferido, el gas es H2.

En otro aspecto más preferido, el gas es C02.

En otro aspecto más preferido, el gas es CO.

Ver, por ejemplo, Kataoka, N., A. Miya, y K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture

system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; y Gunaseelan

V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-1 14, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

10341] En otro aspecto preferido, el producto de fennentación es isopreno.

10342] En airo aspeclo preferido, el producto de fennentación es una celona.

Se entiende que el ténnino "cetona" abarca una sustancia que contiene una o más fracciones de cetona.

En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona.

Ver, por ejemplo, Qureshi y Blaschek, 2003, supra.

10343J En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acet6nico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido adípico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido 2,5-diceto-D-gluc6nico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido gluc6nico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico.

En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3-hidroxipropi6nico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico.

En olro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propi6nico.

En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succínico.

En otro aspecto más preferido. el ácido orgánico es ácido xil6nico.

Ver, por ejemplo, Chen, R. , y Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production

from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

10344J En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es policétido.

El1767878

10345J Recuperación. EI(los) producto(s) de fermentación puede(n) ser opcionalmente recuperado(s) del medio de fermentación utilizando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación, o extracción. Por ejemplo, alcohol es separado del material celulósico fermentado y purificado por métodos convencionales de destilación. Etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96 vol.% puede ser obtenido, que se puede usar como, por ejemplo, etanol combustible, etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables, o etanol industrial.

Composiciones detergentes

10346J Los polipéptidos variantes que tienen actividad de mejora celulolítica de la presente invención se pueden adicionar y así volverse un componente de una composición de detergente.

10347) La composición de detergente de la presente invención puede ser formulada, por ejemplo, como una composición de detergente para lavado de la ropa a mano o a máquina que incluye una composición de aditivo de lavandería adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante at'iadida al enjuague, o para ser formulada como una composición de detergente para usar en operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máqu ina.

10348J En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo de detergente que comprende un polipéptido variante de la invención. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una o más (por ejemplO; varias) enzimas tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xitanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o peroxidasa.

(0349J En general las propiedades de la(s) enzima(s) seleccionada(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con olros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.

(0350] Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente por proteínas están incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas del género 8acíllus, Pseudomonas, Humícola, Fusarium, Thielavía, Acremoníum, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insofens, Mycefiophthora theímophíla y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691 ,178, US 5,776,757 YWO 89/09259.

10351] Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cu idado del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP O 495 257, EP O 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los descritos en WQ 94107998, EP O 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WQ 95/24471 , WQ 98112307 Y PCT/OK98/00299.

10352] Celulasas disponibles comercialmente incluyen CELLUZYMP"', y CAREZYME"" (Novozymes NS), CLAZINASE"", y PURADAX HA TM (Genencor lntemational lnc.), y KAC-SOO(B)"" (Kao Corporation).

10353] Proteasas: proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Origen microbiano es preferido. Mutantes qulmicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina

o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de 8acíllus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proleasas de lipo tripsina son lripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WQ 89/06270 y WQ 94125583.

10354J Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/201 15, WO 98/201 16, Y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76,87,97, 101,104,120, 123,167,170, 194,206,218,222, 224, 235, Y 274.

10355J Enzimas proteásicas disponibles comercialmente preferidas incluyen ALCALASE"", SAVINASE"", PRIMASE"", DURALASE"", ESPERASE"", Y KANNASE"" (Novozymes NS), MAXATASE"", MAXACAL"", MAXAPEMTM, PROPERASE"", PURAFECT TM, OXP"" PURAFECT, FN2"", Y FN3"" (Genencor Internationallnc.).

10356J Lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico.

Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útites inctuyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , por ejempto, de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) como se describe en EP 258 068 Y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SO 705 (\NO 95106720 Y WO 96(27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Oartois el al., 1993, Biochemica et Biophyisica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 641744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

10357J Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WQ 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WQ 95/35381, WO 96/00292, WO 95130744, WQ 94/25578, WO 95/14783, WO 95122615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

10358J Enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen LlPQLASETM y LlPOLASE ULTRATM (Novozymes NS).

10359) Amilasas: amilasas adecuadas (u y/o ~) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, u-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita con más detalle en GB 1.296.839.

10360] Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WQ 94102597, WQ 94/18314, WO 96123873, y WQ 97143424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209,243, 264, 304, 305,391, 408, Y 444.

10361) Amilasas disponibles comercialmente son DURAMYL TM, TERMAMYL TM, FUNGAMYL TM y BANTM (Novozymes NS), RAPIDASE TM y PURASTARTM (de Genencor Intemationallnc.).

10362] PeroxidasasJoxidasas: peroxidasasloxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. dnereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95110602, y WO 98/15257.

10363J Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen GUARDZYMETM (Novozymes NS).

10364] La(s) enzima(s) detergente{s) se pueden incluir en una composición de detergente afladiendo aditivos separados que contienen una o más (por ejemplo; varias) enzimas, o afladiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un granulado, líquido, lodo, etc. FOnrlulaciones de aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o lodos.

10365) Granulados no en polvo se pueden producir, por ejemplo, como se describe en US 4.106.991 y 4.661.452 Y pueden opcionalmente ser recubiertos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso son productos de óxido de polietileno (polietilenoglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados teniendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono yen el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-y di-Y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento que fOnrlan películas adecuadas para la aplicación por técnicas de lecho flu idificado se dan en GB 1483591 . Preparaciones enzimáticas liquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas afladiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238,216.

(0366J La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, un comprimido, un polvo, un gránulo, una pasta o un liquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente conteniendo hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico,

o no acuoso.

(0367] La composición de detergente comprende uno o más (por ejemplo; varios) tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluyendo semi polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwilteriónicos. Los tensioactivos están típicamente presentes a un nivel de 0.1 % a 60% en peso.

10368] Cuando se incluye en la misma el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, éster metílico de

ácido graso alfa-sulfo, o ácido alquil o alquenilsuccínico, o jabón.

10369] Cuando se incluye aquí el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% de un tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, nonilfenol, alquilpoliglicósido etoxilato, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados N-alquilo N-acilo de glucosamina ("glucamidas~).

10370J El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido elilenodiaminatetraacélico, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles, o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst).

10371J El detergente puede comprender uno o más (por ejemplo; varios) polimeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), alcohol polivinílico, poli(vinilpiridina-Nóxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico, y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

10372] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H20 2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formación de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Altemativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona.

[0373] la(s) enzima(s) de la composición de detergente de la invención se puede(n) estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un polioltal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido léctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido borónico de fenilo tal como écido 4-formilfenil borónico, y la composición se puede formular como se describe en, por ejemplo, WO 92/19709 y WO 92/19708.

10374] El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tal como, por ejemplo, acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes suspensores de suciedad, agentes antirredeposición de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores óptiCOS, hidrótropos, inhibidores de decoloración, o perfumes.

10375] En las composiciones detergentes, cualquier enzima se puede adicionar en una cantidad que corresponde con 0.01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0.05-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.

10376] En las composiciones detergentes, un polipéptido variante de la presente invención que tiene actividad de mejora celulolítica se puede adicionar en una cantidad que corresponde con 0.001-100 mg de proteina, preferiblemente 0.005-50 mg de proteína, más preferiblemente 0.01-25 mg de proteína, aún más preferiblemente 0.05-10 mg de proteína, de la forma más preferible 0.05-5 mg de proteína, e incluso de la forma más preferible 0.011 mg de proteína por litro de solución de lavado.

10377] Un polipéptido variante de la presente invención que tiene actividad de mejora celulolílica también se puede incorporar en las formulaciones detergentes descritas en WO 97107202.

Plantas

10378] la presente invención también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal, que comprende un polinucleótido de la presente invención para expresar y producir la variante en cantidades recuperables. La variante se puede recuperar de la planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que tiene la variante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejora del valor nutricional, palatabilidad, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinulritivo.

10379] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (cereal).

10380J Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semilla de colza , y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabídopsis thaliana.

[0381) Ejemplos de partes de la planta son tallo, callo, hojas, ralz, frutas, semillas, y tubérculos al i9ual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula vegetal especifica, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma están también considerados una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera una parte de la planta. Asimismo, partes de la planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención son también consideradas partes de la planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semilla.

[0382J También se incluye dentro del campo de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de la planta, y células vegetales.

[0383] La planta transgénica o célula vegetal que expresa una variante se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por la incorporación de uno o más (por ejemplo; varios) constructos de expresión que codifican una variante en el genoma huésped de la planta o genoma de cloroplasto y propagando la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.

10384] El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica una variante operativamente enlazada con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células vegetales en que el constructo de expresión ha sido integrado y secuencias de ADN necesarias para introducción del constructo en la planta en cuestión (el último depende del método de introducción de AON para ser usado).

(0385) La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y de terminador y opcionalmente secuencias senal o de tránsito, se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde, y cómo se desea que sea expresada la variante. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica una variante puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica de fase o de tejido, y el producto génico puede ser previsto para un tejido específico o parte de la planta tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiol. 86: 506.

¡0386J Para expresión constitutiva, el 35S-CaMV, la ubiquilina-1 de maíz, y el promotor de actina de arroz 1 se pueden utilizar (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991 , Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales romo semillas, tubérculos de patata, y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Gene!. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Ptant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicía faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrado el al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamienlo de Brassica napus, o cualquier otro promolor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WQ 91 /14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbes de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor de gen de adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Gene!. 248: 668-674), o un promotor inducible de herida como el promolor pin2 de patala (Xu et al. , 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones en la salinidad o inducidas por sustancias aplicadas exógenamenle que activan el promolor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido absclsico, y ácido giberélico, y metales pesados.

[0387J Un elemento inlensificador del promotor también se puede usar para conseguir expresión más alla de una varianle en la planla. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y el polinucleótido que codifica una variante. Por ejemplo, Xu el al., 1993, supra, revelan el uso del primer intr6n del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión.

10388] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes del construclo de expresión se pueden elegir de aquellas disponibles en la lécnica.

[0389) El constructo de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science

244: 1293; Potrykus, 1990, BiofTechnology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0390] Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicots transgénicas (para una revisión, ver Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y también pueden usarse para la transfomación de monocots, aunque otros métodos de transformación son frecuentemente usados para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno recubierto con ADN transfomante) de callos embriogénicos o para desarrollar embriones (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curro Opino Biotechnol. 5: 158-162; Vasil el al., 1992, BiofTechnology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocots se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plan! Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos de transformación adicionales para el uso conforme a la presente divulgación incluyen aquellos descritos en la patente estadounidense Nos. 6.395.966 y 7.151.204.

[0391J Después de la transformación, los transformantes que han incorporado el constructo de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T ADN separados o escisión especifica del sitio del gen de selección por una recombinasa especifica.

{0392] Además de la transformación directa de un genotipo de planta particular con un constructo preparado según la presente invención, las plantas transgénicas pueden ser hechas cruzando una planta que tiene el constructo con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica una variante se puede introducir en una variedad de planta particular cruzando, sin necesidad de transformar siempre directamente una planta de esta variedad dada. Por lo tanto, la presente invención abarca no solo una planta directamente regenerada de células que han sido transformadas conforme a la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. Como se utiliza en este caso, progenie puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada conforme a la presente invención. Tal progenie puede incluir un constructo de ADN preparado conforme a la presente invención, o una porción de un constructo de ADN preparado conforme a la presente invención. El cruce resulta en la introducción de un transgen en una línea de planta por polinización cruzada de una línea precursora con una línea de planta donadora. Ejemplos no limitativos de tales pasos están además articulados en la patente estadounidense nO 7.151.204.

[0393) l as plantas se pueden generar a través de un proceso de conversión por retrocruzamiento. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas referidas como un genotipo , línea, consanguínea, o híbrido convertido por retrocruzamiento.

[0394) Marcadores genéticos se pueden utilizar para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un antecedente genético a otro. la selección asistida por marcador ofrece ventajas con respecto al cultivo convencional en el que se puede usar para evitar errores provocados por variaciones fenotípicas. Además, marcadores genéticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruzamiento particular. Por ejemplo, cuando una planta con una característica deseada que sin embargo tiene un antecedente genético no deseable agronómicamente se cruza con un progen itor de élite, los marcadores genéticos se pueden utilizar para seleccionar la progen ie que no solo posee la característica de interés, sino que también tiene una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, el número de generaciones requerido para introgresión de uno o varios rasgos en un contexto genético particular es minimizado.

[0395) la presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante de la presente invención que comprende: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica la variante bajo condiciones propicias para la producción de la variante; y (b) recuperación de la variante.

[0396) la presente invención es posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no deberían ser interpretados como limitando el ámbito de la invención.

Ejemplos

Medios

¡0397]2X placas YT fueron compuestas de 10 9 de triptona, S 9 de extracto de levadura, S 9 de cloruro sódico, 15 9 de Bacto Agar, yagua desionizada hasta 1 litro.

(0398] Placas PDA fueron compuestas de 39 9 de a9ar de dextrosa de patata y a9ua desionizada hasta 1 litro.

10399] Medio MDU2BP fue compuesto por 45 9 de maltosa, 1 9 de MgS04'7H20 , 1 9 de NaCl, 2 9 de K2HS04,12 9 de KH2P04, 2 9 de urea, sao !JI de solución de metales traza AMG, yagua desionizada hasta 1 litro; el pH fue ajustado a 5.0 y luego esterilizado con filtro con una unidad de filtrado de 0.22 !Jm.

10400] Solución de metales traza AMG fue compuesta por 14.3 9 de ZnS04·7H20, 2.5 9 de CuS04-5H20, 0.5 9 de NiC12·6H20, 13. 8 g de FeS04·H20, 8.5 g de MnS04·7H20, 3 g de ácido cítrico, yagua desionizada hasta 1 litro.

10401) Medio M410 fue compuesto por 50 9 de maltosa, 50 9 de glucosa, 2 9 de MgS04'7H20, 2 9 de KH2P04, 4 9 de polvo de anhidro de ácido cítrico, 8 9 de extracto de levadura, 2 9 de urea, 0.5 9 de solución de metales traza AMG, 0.5 g de CaCI2, yagua desionizada hasta 1 litro (pH 6.0).

10402J Medio LB fue compuesto por 10 9 de bacto-triptona. 5 9 de extracto de levadura, 10 9 de cloruro sódico, y agua desionizada hasta 1 litro.

10403J Placas LB fueron compuestas por 10 9 de bacto-triptona. 5 9 de extracto de levadura, 10 9 de cloruro sódico, 15 g de Bacto-agar, yagua desionizada hasta 1 litro.

(0404) Medio YPG fue compuesto por 4 9 de extracto de levadura, 1 g de K2HP04, 0.5 9 de MgS04, 15.0 9 de glucosa, yagua desionizada hasta 1 litro (pH 6.0).

(0405) Medio YPM fue compuesto por 1% extracto de levadura, 2% peptona, y 2% maltodextrina. Placas de SC agar fueron compuestas por 20 9 de agar por litro de medio SC-URA.

10406J Medio SC-URA con galactosa fue compuesto por 100 mi de 10X sales Basales, 25 mi de 20% ácidos de casamino sin vitaminas, 10 mi de 1% triptófano, 4 mi de 5% treonina (esterilizada con filtro, al'iadida después de autoclave), y 100 mi de 20% glucosa o 100 mi de 20% galactosa (esterilizada con filtro, al'iadida después de autoclave), yagua desionizada hasta 1 litro.

10407J 10X solución de sales basales fue compuesta por 75 9 de base nitrogenada de levadura, 113 9 de ácido succinico, 68 9 de NaOH, yagua desionizada hasta 1 litro.

10408J Medio YP fue compuesto por 10 9 de extracto de levadura, 20 9 de bacto-peptona, yagua desionizada hasta 1 litro.

[0409] Solución salina de COVE fue compuesta por 26 g de KCI, 26 9 de MgS04·7H20, 76 g de KH2P04. 50 mi de solución de metales traza de COVE, yagua des ionizada hasta 1 litro.

10410] Solución de metales traza de COVE fue compuesta por 0.04 9 de NaB407·10H20 , 0.4 9 de CuS04·5H20 , 1.2 9 de FeS04·7H20, 0.7 9 de MnS04·H20 , 0.8 9 de Na2Mo02·2H20, 10 9 de ZnS04·7H20, yagua desionizada hasta 1 litro.

10411 J Placas de COVE fueron compuestas por 342.3 9 de sacarosa, 20 mi de solución salina de COVE, 10 mi de 1 M de acetamida, 10 mi de 1.5 M CsCl, 25 9 de agar Noble (Difco), yagua desionizada hasta 1 litro.

10412] Placas COVE2 fueron compuestas por 30 9 de sacarosa, 20 mi de solución salina de COVE, 10 mi de 1 M aceta mida, 25 9 de agar Noble (Difco), yagua desionizada hasta 1 litro.

(0413] Solución de metales traza de Trichodenna fue compuesta por 216 9 de FeCh'6H20, 58 9 de ZnS04'7H20, 27 9 de MnS04·H20 , 10 9 de CuS04-5H20, 2.4 9 de H3B03, 336 9 de ácido cítrico, yagua desionizada hasta 1 litro.

10414J Medio CIM fue compuesto por 20 9 de celulosa, 10 9 de sólidos de maíz remojados, 1.45 9 de (NH4)2S04,

2.08 9 de KH2P04, 0.28 9 de CaCI2, 0.42 9 de MgS04 '7H20 , 0.42 mi de solución de metales traza de Trichoderma , 1-2 gotas de antiespumante, yagua desionizada hasta 1 litro; pH ajustado a 6.0.

Ejemplo 1: Preparación de polipéptido GH61 B de AspergiJJus fumlgatus que tiene actividad de mejora celulolitica

10415J Una búsqueda de tblastn (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) de la secuencia de genoma parcial de A. fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD, USA) fue realizada utilizando

como pregunta diferentes polipéptidos GH61 conocidos incluyendo el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (número de accesión de GeneSeqP AEC05922). Diferentes genes fueron identificados como homólogos de familia GH61 putativa basados en un grado alto de similitud a las secuencias de pregunta a nivel aminoácido. Una región genómica de aproximadamente 850 pb con más de 70% de identidad de secuencia a la secuencia polipeptídica GH61A de Thermoascus aurantiacus a nivel aminoácido fue elegida para otro estud io.

10416] A. fumígatus NN051616 fue crecida y cosechada como se describe en la patente estadounidense n°

7.244.605. Micelios congelados fueron molidos, por mortero y mano de mortero, hasta que un polvo fino y ADN genómico fue aislado utilizando una planta de DNEASY® Plant Maxi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU) según instrucciones del fabricante.

10417] Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados abajo fueron disel'iados para amplificar por PCR el gen de polipéptido GH61 B de A. fumigatus de la familia del ADN genómico. Un IN-FUSION® Cloning Kit (BO Biosciences, Palo Alto, CA, EE.UU) fue usado para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión pAIL02 01'10 20041099228), sin la necesidad de digestión por restricción y ligamiento. Cebador direclo: 5'-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3' (SEC ID n.O: 71)

Cebador inverso: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAGGACCAG-3' (SEC ID n.o: 72) letras en negrita representan la secuencia codificante. la secuencia restanle es homóloga a los sitios de inserción de pAIL02.

10418J Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por 204 ng de ADN genómico de A. fumigatus, 1X pfx Amplification Buffer (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU), 1,51.11 de un 10 mM mezcla de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 2,5 unidades de PLATINUM® pfx ADN polimerasa (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU), y 1 !JI de 50 mM MgS04 en un volumen final de 50 !JI. La amplificación fue realizada utilizando un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 epgradient S (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, EE.UU) programado para 1 ciclo a 94"C durante 3 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94"C durante 30 segundos, 56"C durante 30 segundos, y 72"C durante 1 minutos. El bloque de calor fue luego mantenido a 72"C durante 15 minutos segu ida de un ciclo de remojo a 4"C.

10419Jlos productos reactivos fueron aislados por 1.0% electroforesis en gel de agarosa ulilizando 40 mM base Tris -20 mM acetato de sOOio-1 mM tampón de EOTA disódico (TAE) donde aproximadamente 850 bp de banda de producto fue extirpado del gel y purificado utilizando un MINELUTE® Gel Extraction Kit (Q1AGEN lnc., Valencia, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante.

10420] El fragmento fue luego clonado en pAIL02 utilizando un IN-FUSION® Cloning Kit. El vector fue digerido con Nco I y Pac 1. El fragmento fue purificado por electroforesis en gel como se ha mencionado y un QIAQUICK® Gel Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). El fragmento de gen y el vector digerido fueron combinados juntos en una reacción dando como resultado el plásmido de expresión pAG43 donde la transcripción del gen del polipéptido de la familia GH61 B estaba bajo el control del promotor NA2-tpi. El promotor NA2-tpi es un promotor modificado del gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido del gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. la reacción de recombinación (20 1.11) fue compuesta por 1X IN-FUSION® Buffer (BO Biosciences, Palo Alto, CA, EE.UU), 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EE.UU), 1 !JI de enzima IN-FUSION® (diluido 1 :10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EE.UU), 166 ng de pAIL02 digerido con Pac I y Nco 1, y 110 ng del producto de PCR purificado del pol ipéptido GH61B de A. fumigatus. La reacción fue incubada a 37"C durante 15 minutos seguidos de 15 minutos a 50"C. La reacción rue diluida con 40 !JI de un tampón de EOTA 10 mM Tris-O. 1 M y 2.5 1.11 de la reacción diluida rueron usados para transrormar células competentes de E. coli XL 10 SOLOPACK® Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Un transformante de E. coli que contiene pAG43 (gen de proteína GH61 B) fue identificado por digestión de enzima de restricción y ADN plásmido fue preparado utilizando un BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

10421) Secuenciación del ADN del fragmento de PCR de 862 pb fue realizada con un Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) de Applied Biosysttems Modelo 377 XL (Applied Biosystlems, Cartsbad, CA, EE.UU) usando química de terminador de coloración (Giesecke et al., 1992, Joumal or Virology Methods 38: 4760) Y estrategia de paseos de cebadores. Los cebadores específicos de vector siguientes fueron usados para la secuenciación: pAll02 5 SEC: S'-TGTCCCTTGTCGATGCG 3' (SEC ID n.O: 73)

s

65 El1767878

PAllo2 3 SEC: S'-CACATGACTTGGCTTCC 3' (SEC ID n.o: 74)

[0422] Oatos de secuencia de nucleótidos fueron escutrinados por su calidad y todas las secuencias fueron comparadas entre sí con asistencia de software PHREOfPHRAP (University ofWashington, Seattle, WA, USA).

10423] Un modelo de gen para la secuencia de A. fumígatus fue construido basado en la similitud de la proteína codificada al polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (número de accesión de GeneSeqP AEC05922). la secuencia de nucleótidos (SEC 10 n.O: 1) y secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID n.O: 2) del gen de polipéptido GH61 B de A. fumígatus se muestran en las Figuras lA y lB. El fragmento genómico codifica un polipéptido de 250 aminoácidos, interrumpido por 2 intrones de 53 y 56 pb. El % de contenido G+C del gen y la secuencia codificante madura son 53.9% y 57%, respectivamente. Utitizando el programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), un péptido seriat de 21 residuos fue predicho. la proteína madura predicha contiene 221 aminoácidos con una masa molecular predicha de 23.39 kDa.

[0424] Protoplastos Jal355 de Aspergillus oryzae fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, BiofTechnology 6: 1419-1422. Seis ¡J9 de pAG43 fueron usados para transformar Jal355 de Aspergíllus oryzae. Veintiséis transformantes fueron aislados a placas de POA individuates.

[0425] Placas de POA confluyentes de 24 transformantes fueron cada una lavada con 5 mi de 0.01 % TWEEN® 20 Y tas esporas fueron recogidas cada una. Ocho ¡JI de cada materia prima de espora fueron adicionadas a 1 mi de medios YPG, YPM, Y M410 separadamente en placas de 24 pocillos e incubadas a 34"C. Después de 3 días de incubación, 7.5 ¡JI de sobrenadante de cuatro transformantes fueron analizados utilizando un CRITERION® sin manchas, gel de SOS-PAGE de gradiente de 8-16% (IBio-Rad laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. Basado en este gel, medio M410 fue elegido como el mejor medio. Cinco días tras la incubación, 7.5 ¡JI de sobrenadante de cada cultivo M410 fueron analizados utilizando un CRITERION® sin manchas, gel de SOS-PAGE de gradiente de 8-16%. Perfiles de SOS-PAGE de los cultivos mostraron que diferentes transformantes tenían una nueva banda mayor de aproximadamente 25 kDa.

10426] Una placa confluyente de un transformante (crecido en una placa PDA) se lavó con 5 mi de 0.01 % TWEEN® 20 Y se inoculó en cuatro matraces de Erlenmeyer de 500 mi conteniendo 100 mi de medio M410 para generar caldo para caracterización de la enzima. los matraces fueron cosechados en el día 5 (300 mi), filtrados utilizando un 0.22 ¡Jm EXPRESSTM Plus Membrane (Millipore, Bedford, MA, EE.UU), y almacenados a 4"C.

[0427) El caldo de matraz de agitación filtrado con el polipéptido GH61B de A. fumígatus recombinantemente producido que tiene actividad de mejora celulolítica fue primero concentrado por un concentrador de flujO tangencial (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU), tampón cambiado en 20 mM pH Tris-HCI 8.0, y luego purificado utilizando una columna de filtración en gel HIGHlOAOTM 26f60 SUPERDEXTM 75 (GE Heallhcare, Piscataway, NJ, EE.UU) con un gradiente isoscrático de 750 mi en 150 mM NaCI, 20 mM pH Tris-HCI 8.0. Fracciones fueron recogidas y agrupadas basadas en análisis SDS-PAGE. la concentración de proteína fue determinada usando un Microplate BCATM Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Il, EE.UU) donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína.

Ejemplo 2: Construcción de variante L90V + 01315 + M134l + A141W de GH61B de Aspergillus fumlgatus

10428) Una variante del polipéptido GH61 B de A. fumiga tus de tipo salvaje que tiene actividad de mejora celulolítica fue oonstruida con las sustituciones 190V, 0131S, M134l, y A141W. la estructura de GH61 B de tipo salvaje de A. fumigatus del plásmido pAG43 (ejemplo 2) fue usada como modelo precursor sobre el cual las sustituciones fueron introducidas en diferentes pasos separados, generando productos intermedios hasta que se obtuvo el plásmido siguiente con las sustituciones de aminoácidos de objetivo finales: pTH230 (L90V + 0131S + M134L + A141W). Un QUIKCHANGE® Xl Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, la Jolla, CA, EE.UU) fue usado para generar las mutaciones por medio de reacciones mediadas por PCR donde pares de cebadores oligonucleótidos sintéticos, como se muestra en tabla 1, diseriados con los cambios objetivo fueron usados para incorporar las sustituciones deseadas.

10429) Plásmido pTH228 de la variante fue generado utilizando el par de cebador inverso y directo 68339 y 68340 Y pAG43 como el modelo precursor.

Plásmido pTH229 de la variante fue generado utilizando el par de cebador inverso y directo 68638 y 68639 Y plásmido pTH228 de la variante como el modelo precursor. Plásmido pTH230 de la variante fue generado utilizando el par de cebador inverso y directo 68640 y 68641 Y plásmido pTH229 de la variante como el modelo precursor. Tabla 1

Cambios: Cebador Secuencia Nombre de plásmido pTH228

aminoacidos L90V: ID 68339 GGCTAACATAGCATAGGTGATTACTTACCTCGCTCC (SEC ID n.o: 75)

68340: GGAGCGAGGTAAGTAATCACCTATGCTATGTTAGCC (SEC ID n.o: 7B}

0131S, M134L: 68638 I gCTGGTG~~GGCTTCCGATGAACTGATCGCCAACAACAACACG SEC ID n.O: 77 pTH229

68639: CGTGTTGTTGTTGGCGATCAGlTCATCGGAAGCCCAAACACCAGGI (SEC ID n.O' 78)

A141W: 68640 GCCAACAACAACACGTGGACAGTGACCAlTCCTGC (SEC ID n.o: 79) pTH230

6864 1: GCAGGAATGGTCACTGTCCACGTGlTGlTGTTGGC (SEC ID n.o: 80)

10430] Los ADNs de plásmido de mutante resultantes fueron preparados utilizando un BIOROBOT® 9600 y secuenciados utilizando un analizador genético 3130xl (Applied Biosysttems, Carisbad, CA, USA).

Ejemplo 3: Expresión de la variante L90V + 01315 + M134L + A141W de GH61B de Aspergi llus fumlgatus en Aspergillus oryzae JaL250

¡0431J Protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 (WO 99f61651) fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, BiofTechnology 6: 1419-1422, y transformados con 5 IJg de pTH230 (o pAll02 como un control). La transformación liberó aproximadamente 20-25 transformantes. Los transformantes fueron luego purificados de esporas a placas PDA selectivas individuales y luego crecieron en placas de cultivo de 24 pocillos conteniendo 1 mi de medio MDU2BP y se incubaron a 34°C fijos durante 5 días. Muestras de caldo fueron cosechadas en el día 5 y analizadas por 8-16% Tris -glicina SOS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Una vez que los cultivos de cada transformante purificado de las esporas fueron confluyentes y habían esporulado, caldos de esporas fueron hechos aplicando 5 mi de TWEEN® 80 filtrados estériles al 0,01% (diluidos con agua destilada en vidrio) sobre el centro de cada placa PDA y utilizando un distribuidor estéril para rascar las esporas en la solución. Caldos de esporas de los transformantes más productores para cada lote identificado por SDS-PAGE como teniendo bandas más oscuras en el peso molecular predicho de 26 kDa fueron usados para inocular un matraz de agitación de 2 litros conteniendo 300 mi de medio MDU2BP. Frascos de agitación fueron incubados durante 5 días a 34°C con agitación a 220 (.p.m. Después de la incubación, los caldos fueron filtrados estériles utilizando una membrana de polietersulfona de 0,22 IJm (Millipore, Bedford, MA, EE.UU) para purificación. La cepa de A. oryzae identificada del análisis SOS-PAGE de los caldos del matraz de agitación con la banda más fuerte a 26 kDa fue designada TH169 (variante L90V + D131S + M134L + A141W de GH61B de A. Fumigatus).

Ejemplo 4: Purificación de la variante GH61B de Aspergillus fumigatus L90V + 01315 + M134L + A141W

¡0432J La variante L90V + D131S + M134L + A141 W de GH61B de Aspergillus fumigatus recombinantemente producida fue primero concentrada por un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU), tampón cambiado en 20 mM pH Tris-HCI 8.0, y luego purificado utilizando una columna Q-SEPHAROSE® High Performance de 75 mi (autoempaquetada) (GE Healthcare, Piscataway, NJ,EE.UU) con un gradiente lineal de NaCI de 800 mi 0600 mM en 20 mM pH Tris-HCI 8.0. Fracciones fueron recogidas y agrupadas basándose en el análisis SDS-PAGE. La concentración de proteína fue determinada usando un Microplate BCA n.o Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína.

Ejemplo 5: Preparación de endoglucanasa 11 CEL5A de Trichoderma reesei

¡0433J La familia del gen de endoglucanasa II GH5A de Trichoderma reesei (SEC ID n.o: 5 ¡secuencia de ADNJ y SEC ID n.o: 6 ¡secuencia de aminoácido deducido J) fue clonada en un vector de expresión de Aspergillus oryzae como se describe abajo.

65 El1767878

{0434) Dos cebadores 0li90nucle6tidos sintéticos, mostrados a continuación, fueron disef'iados para amplificar por PCR el gen de endoglucanasa 11 de ADN genómico RutC30 de T. reesei. ADN genómico fue aislado utilizando un DNEASY® Plant Maxi Kit. Un IN-FUSION .... PCR Cloning Kit fue usado para clonar el fragmento directamente en pAIL02 (WO 2004/099228). Cebador directo: 5'-ACTGGA TTT ACCATGAACAAGTCCGTGGCTCCA TTGCT -3' (SEC ID n.o: 81)

Cebador inverso: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAACTACTTTCTTGCGAGACACG-3' (SEC ID n.O: 82) Las letras en negrita representan una secuencia cod ificante. La secuencia restante contiene identidad de secuencia comparada con los sitios de inserción de pAIL02 (WO

20041099228).

{0435] Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por 200 ng de ADN genómico de T. reesei, 1X Pfx Amplification Buffer, 6 !JI de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx ADN polimerasa, y 1 !JI de 50 mM MgS04 en un volumen final de 50 !JI. La reacción de amplificación fue incubada en un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, EE.UU) programado para 1 ciclo a 98"C durante 2 minutos; y 35 ciclos cada uno a 94"C durante 30 segundos, 61 "C durante 30 segundos, y 68"C durante 1.5 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción fue incubada a 68"C durante 10 minutos y luego enfriada a 10"C. Un producto de reacción por PCR de 1.5 kb fue aislado en un gel de agarosa de GTG® al 0.8% (Cambrex Bioproducts, Rutherford, NJ, EE.UU) usando tampón TAE y 0,1 !Jg de bromuro de etidio por mI. la banda de ADN fue visualizada con la ayuda de un DARKREADERTM (Ciare Chemical Research, Dolores, CO, USA). la banda de ADN de 1,5 kb fue cortada con una cuchilla de afeitar desechable y purificada utilizando una centrifugadora UL TRAFREE® DA (Millipore, Billerica, MA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante.

{0436] Plásmido pAll02 fue linealizado por digestión con Nco I y Pac 1. El fragmento de plásmido fue purificado por electroforesis en gel y ultrafiltraci6n como se ha descrito anteriormente. La clonación del fragmento de PCR purificado en el vector pA1L02 linealizado y purificado fue realizada utilizando un IN-FUSION"TM PCR Cloning Kit. La reacción (20 !JI) contenía enzima 1X IN-FUSION'" Buffer, lX BSA, 1 j..Il of IN-FUSION"TM (diluido 1:10), 100 ng de pAIl02 digerido con Pac I y Nco 1, y 100 ng del producto de PCR de endoglucanasa II CEl5A de T. reesei. la reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una muestra de 2 !JI de la reacción fue usada para transformar células competentes de E. coli XL 10 SOLOPACK® Gold según las instrucciones del fabricante. Después de un periodo de recuperación, dos partes alícuotas de 100 !JI de la reacción de transformación fueron colocadas en placas sobre placas 2X YT de 150 mm suplementadas con 100 I.Jg de ampicilina por mI. Las placas fueron incubadas durante toda la noche a 37"C. Un conjunto de 3 clones recombinantes putativos fue recuperado de las placas de selección y ADN plásmido fue obtenido a partir de cada uno utilizando un BIOROBOT® 9600. Clones fueron analizados por digestión de restricción de Pei I/Bsp lUl1 1. Un clon con el modelo de digestión de restricción previsto fue luego secuenciado para confirmar que no habra mutaciones en el inserto clonado. Clon #3 fue seleccionado y designado pA1L027.

{0437] los protoplastos de Jal250 de Aspergillus otyzae (WO 99/61651) fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, supra, y transformados con 5 !J9 de pAIl027 (o pAIl02 como un control). la transformación liberó aproximadamente 50 transformantes. Once transformantes fueron aislados a placas PDA individuales e incubados durante cinco dras a 34"C.

{0438) Placas de esporas confluyentes fueron lavadas con 3 mi de 0.01% TWEEN® 80 Y la suspensión de esporas fue usada para inocular 25 mi de medio MDU2BP en frascos de agitación de vidrio de 125 mI. Cultivos transformantes fueron incubados a 34"C con agitación constante a 200 r.p.m. Al quinto día post-inoculación, los cultivos fueron centrifugados a 6000 x 9 y sus sobrenadantes fueron recogidos. Cinco microlitros de cada sobrenadante fueron mezclados con un volumen igual de 2X tampón de carga (10% beta mercaptoetanol) y cargado sobre 1.5 mm 8%-16% gel de SDS-PAGE Tris-glicina y manchado con SIMPlYBlUETM SafeStain (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Perfiles de SDS-PAGE de los caldos de cultivo mostraron que diez de once transformantes produjeron una banda proternica nueva de aproximadamente 45 kDa. Transformante número 1, designado Aspergillus otyzae JaL250AIL027, fue cultivado en un fermentador.

10439) Medio de matraz de agitación fue compuesto por 50 9 de sacarosa, 10 9 de KH2P04,0.5 9 de CaCI2, 2 9 de MgS04-7H20, 2 g de K2S04, 2 g de urea, 10 g de extracto de levadura, 2 g de ácido cítrico, 0.5 mi de solución de

metales traza, yagua desionizada hasta 1 litro. La solución de metales traza fue compuesta por 13.8 9 de FeSO.·7H20 , 14. 3 9 de ZnS04·7H20 , 8.59 de MnS04 ·H20, 2.5 g de CuS04·5H20, 3 g de ácido cítrico, yagua desionizada hasta 1 litro.

[0440] Cien mi de medio de matraz de agitación fueron at'iadidos a un matraz de agitación de 500 mI. El matraz de agitación fue inoculado con dos tapones de JaL250AIL027 de A. oryzae de una placa POA e incubado a 34Q C en una coctelera orbital a 200 r.p.m. durante 24 horas. Cinquenta mi del caldo de matraz de agitación fueron usados para inocular un vaso de fermentación de 3 litros.

[0441J Medio de lote de fermentación fue compuesto por 10 9 de extracto de levadura, 24 9 de sacarosa, 5 9 de (NH4)2S0., 2 9 de KH2P04, 0,5 9 de CaCI2·2H20, 2 9 de MgSO.·7H20, 1 9 de ácido cítrico, 2 9 de K2S0., 0,5 mi de anli espuma, 0,5 mi de solución de metales traza, yagua desionizada hasta 1 litro. La solución de metales traza fue compuesta por 13,8 9 de FeS04·7H20, 14,3 9 de ZnS04·7H20, 8,5 9 de MnS04 ·H20, 2,5 9 de CuS04·5H20, 3 g de ácido cítrico, yagua desionizada hasta 1 litro. El medio de suministro de fermentación estaba compuesto de maltosa.

[0442] Un total de 1,8 litros del medio de lote de fermentación se at'iad ió a un fermentador cubierto de vidrio de tres litros de Applikon Biotechnology (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA, USA). Medio de suministro de fermentación fue dosificado a razón de O a 4.4 gllfhr durante un periodo de 185 horas. El vaso de fermentación fue mantenido a una temperatura de 34Q C y el pH fue controlado utilizando un sistema de control de Applikon 1030 Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA, EE.UU) a un punto de ajuste de 6.1 +/-0.1. Aire se at'iadió al vaso a razón de 1 wm y el caldo fue agitado por impulsor Rushton rotativo a 1100 a 1300 r.p.m. Al final de la fermentación, todo el caldo fue cosechado del vaso y centrifugado a 3000 x g para eliminar la biomasa. El sobrenadante fue filtrado estéril utilizando 0,22 IJm EXPRESSTIoI Plus Membrane, y almacenado a 4Q C.

[0443] El sobrenadante fue desalado y cambiado de tampón en 20 mM pH Tris-HCI 8.0 utilizando una columna de desalación de 400 mi SEPHADEXTIoI G25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. Endoglucanasa 11 CEL5A desalada de Trichoderma reesei fue cargada sobre una columna de intercambio iónico MONOQTM 16/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU) y eluida con 300 mi de gradiente de NaCllineal 0-300 mM en 20 mM pH Tris-HCI 8 con colección de fracciones de 10 mi . Fracciones fueron agrupadas basándose en análisis SOS-PAGE. La concentración de proteína fue determinada usando un Microplate BCA TIoI Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como una proteína estándar.

Ejemplo 6: Preparación de beta-glucosidasa GH3A de Aspergillus fumigatus

[0444] Una beta-glucosidasa GH3A de A. fumigatus (SEC ID n.O: 55 [secuencia de ADN] y SEC ID n.O: 56 [secuencia de aminoácido deducida]) fue preparada según la patente de estadounidense nO 7.244.605. La concentración de proteína fue determinada usando un Microplate BCA TIoI Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína.

Ejemplo 7: Preparación de celobiohidrolasa 1 Cel7A de AspergiIJus fumigatus NN055679

[0445] Una búsqueda lfasty (Pearson et al., 1997, Genomics 46:24-36) de la secuencia de genoma parcial de A. fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MO, EE.UU) fue realizada utilizando como pregunta una secuencia de proteína de celobiohidrolasa Cel7 de Trichoderma reeseí (accesión nO P00725). Diferentes genes fueron identificados como homólogos de familia putativa GH7 basándose en un grado alto de similitud a la secuencia de pregunta a nivel aminoácido. Una región genómica con identidad de secuencia significativa a la secuencia de pregunta fue elegida para otro estudio, y el gen correspondiente fue denominado ce17A.

[0446] Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados a continuación fueron diset'iados para amplificar por PCR el gen de celobiohidrolasa I cel7A de A. fumigatus NN055679 (SEC ID n.o: 49 [secuencia de AON] y SEC ID

n.O: 50 [secuencia de aminoácidos deducida]) de AON genómico de A. fumígatus preparado romo se describe en W02005/047499. Cebador directo: 5'-gggcATGCTGGCCTCCACCnCTCC-3' (SEC ID n.o: 83)

Cebador inverso: 5'-gggttaaltaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3' (SEC ID n.o: 84)

[0447] Las mayúsculas representan la secuencia codificante. El resto de la secuencia proporciona sitios de restricción de endonucleasa para Sph I y Pac I en las secuencias directa e inversa, respectivamente. Utilizando estos cebadores, el gen cel7A de A. fumígatus fue amplificado utilizando los métodos de PCR estándar y

el producto de reacción aislado por 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE y purificado utilizando un QIAQUICK® Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante.

[0448J El fragmento fue digerido con Sph I y Pac I y ligado en el vector de expresión pAIL02 también digerido con Sph I y Pac I según procedimientos estándar. Los productos de ligamiento fueron transformados en células competentes de E. coli XL 10 SOLOPACK® Gold según las instrucciones del fabricante. Un transformante de E. coli con un plásmido del tamai'io correcto fue detectado por digestión de restricción y ADN plásmido fue preparado utilizando un BIOROBOT® 9600. Secuenciación del ADN del inserto de este plásmido fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado de Perkin-Elmer Applied Biosystems Modelo 377 XL (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU) usando química de terminador de coloración (Giesecke et al., 1992, supra) y estrategia de paseos de cebadores. Datos de la secuencia de nucleótidos fueron escutrinados para calidad y todas las secuencias fueron comparadas entre si con asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). La secuencia de nucle6tidos mostró que correspondía con la secuencia genómica determinada por TIGR (SEC ID

n.o: 49 [secuencia de AONJ y SEC ID n.o: 50 [secuencia de aminoácido deducida]). El plásmido resultante fue denominado pEJG93.

[0449J Protoplastos JaL250 de Aspergillus oryzae fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, supra , y transformados con 5 IJg de pEJG93 (así como pAIL02 como un control de vector). La transformación liberó aproximadamente 100 transformantes. Diez transformantes fueron aislados a placas PDA individuales.

[0450] Placas PDA confluyentes de cinco de los diez transformantes fueron lavadas con 5 mi de 0,01% TWEEN® 20 e inoculadas separadamente en 25 mi de medio MDU2BP en frascos de agitación de vidrio de 125 mi e incubadas a 34°C, 250 r.p.m. Cinco días después de la incubación, 0,5 1.11 de sobrenadante de cada cultivo fue analizado utilizando los geles de SDS-PAGE tris-glicina 8-16% (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que uno de los transformantes tuvo una gran banda de aproximadamente 70 kDa. Este transformante fue denominado JaL250EJG93 de A. of}'zae.

10451] Cien mi de medio de matraz de agitación (ejemplo 5) fueron ai'iadidos a un matraz de agitación de 500 mi . El matraz de agitación fue inoculado con dos tapones de JaL250EJG93 de A. oryzae de una placa PDA e incubado a 34°C en una coctelera orbital a 200 Lp.m. durante 24 horas. Cinquenta mi del caldo de matraz de agitación fue usado para inocular un vaso de fermentación de 3 litros.

10452] Un total de 1.8 litros del medio de lote de fermentación (ejemplo 5) se ai'iadió a un fermentador cubierto de vidrio de tres litros de Applikon Biotechnology. Medio de suministro de fermentación (ejemplo 5) fue dosificado a razón de O a 4.4 gllfhr durante un periodo de 185 horas. El vaso de fermentación fue mantenido a una temperatura de 34°C y el pH fue controlado utilizando un sistema de control de Applikon 1030 a un punto de ajuste de 6.1 +1-0.1. Se añadió aire al vaso a razón de 1 wm y el caldo fue agitado por impulsor Rushton rotativo a 1100 a 1300 r.p.m. Al final de la fermentación, el caldo completo fue cosechado del vaso y centrifugado a 3000 x 9 para eliminar la biomasa. El sobrenadante fue filtrado estéril utilizando un 0.22 IJm EXPRESSTIoI Plus Membrane, y almacenado a 4°C.

[0453J Caldo filtrado fue concentrado y el tampón cambiado utilizando un concentrador de flujo tangencial (pPall Filtron, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, EE.UU) con 20 mM pH Tris-HCI 8., y luego purificado utilizando una columna Q-SEPHAROSE® High Performance (autoempaquetada) de 75 mi (con un 750 mi 0-600 mM gradiente lineal de NaCI en 20 mM pH Tris-HCI 8.0 con colección de 10 mi fracciones. Las fracciones fueron agrupadas basándose en análisis SOS-PAGE. Concentración de proteina fue determinada usando un Microplate BCA no Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína. Ejemplo 8: preparación de celobiohidrolasa 11 Cel6A de Aspergillus fumigatus

(0454J Celobiohidrolasa II de A. fumigatus NN055679 (CBHII) (SEC ID n.o: 51 (secuencia de ADN] y SEC ID n.o: 52 [secuencia de aminoácido deducido]) fue preparada según el procedimiento siguiente.

10455] Dos cebadores oligonucle6tidos sintéticos, mostrados a continuación, fueron disei'iados para amplificar por PCR el marco de lectura abierto en toda su longitud de la glicosil hidrolasa de la Familia 6A de A. fumigatus de AON genómico. Un equipo de clonación de TQPO® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU) fue usado para clonar el producto PCR.

65 El1767878

Un IN-FUSION TM Cloning Kit fue usado para clonar el fragmento en pAIL02. Cebador directo: 5'-ACTGGATTTACCATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3' (SEC ID n.O: 85)

Cebador inverso: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGT-3' (SEC ID n.O: 86) Letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante contiene identidad de secuencia comparada con los sitios de inserción de pA1L02.

10456J Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por 500 ng de AON genómico de A. fumigatus, tampón de reacción lX ThermoPol Taq (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU), 6 !JI de un 10 mM mezcla de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 0,1 unidad de Taq DNA polimerasa (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU), en un volumen final de 50 !JI. Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue usado para amplificar el fragmento programado para 1 ciclo a 98"C durante 2 minutos; y 35 ciclos cada a 96"C durante 30 segundos, 61"C durante 30 segundos, y n "c durante 2 minutos. DespuéS de los 35 ciclos, la reacción fue incubada a n "c durante 10 minutos y luego enfriada a 10"C hasta ser procesada adicionalmente. Para eliminar las colas A producidas por Taq ADN polimerasa la reacción fue incubada durante 10 minutos a 68"C en presencia de 1 unidad de Pfx AON polimerasa (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA).

10457) Un producto de reacción por PCR de 1.3 kb fue aislado en un gel de GTG-agarosa al 0.8% (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, EE.UU) usando tampón TAE y 0.1 I-Ig de bromuro de etidio por mI. la banda de ADN fue visualizada con la ayuda de un OARK REAOER TN (Ciare Chemical Research, Dolores, CO, EE.UU) para evitar mutaciones inducidas por UV. la banda de AON de 1.3 kb fue cortada con una hoja de afeitar desechable y purificada con una centrifugadora ULTRAFREE® DA según las instrucciones del fabricante .

10458J El producto de PCR purificado de 1,3 kb fue clonado en el pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA, USA). Dos microlitros del producto de PCR purificado fueron mezclados con 1 IJI de una solución de cloruro sódico de 2 M y 1 !JI del vector de pCR®4Blunt-TOPO®. la reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego 2 !JI de la reacción fueron usados para transformar células competentes TOP10 de E. coli (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. Dos parles alícuotas de 100 microlitros cada una de la reacción de transformación fueron difundidas sobre dos placas de 150 mm 2X YT suplementadas con 100 !Jg de ampicilina por mi e incubadas durante toda la noche a 37"C.

10459J Ocho colonias recombinantes fueron usadas para inocular cultivos liquidos conteniendo 3 mi de medio LB suplementado con 100!Jg de ampicilina por m!. AON plásmido fue obtenido a partir de estos cultivos utilizando un BIOROBOT® 9600. Clones fueron analizados por digestión de restricción. ADN plásmido de cada clan fue digerido con Eco RI y analizado por electroforesis en gel de agarosa como anteriormente. Seis de ocho clones tuvieron el modelo de digestión de restricción previsto y los clones 2, 4, 5, 6,7 Y 8 fueron secuenciados para confirmar que no había mutaciones en el inserto clonado. El análisis de secuencias de sus extremos S-prima y 3-prima indicó que los clones 2, 6 y 7 tuvieron la secuencia correcta. Estos tres clones fueron seleccionados para la redonación en pAIL02. Un microlitro alícuota de cada clan fue mezclado con 17 ¡JI de 1: 1 O diluido 0.1 mM EDT A-lO mM Tris pH 7.4 Y 1 !JI de esta mezcla fue usada para reamplificar la región codificante de glicosil hidrolasa 6A de A. fumigatus.

10460J Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por 1 !JI de la mezcla diluida de clones 2,6 y 7,lX Pfx tampón de amplificación, 6 ¡JI de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx ONA polimerasa, 1 ¡JI de 50 mM MgS04, en un volumen final de 50 ¡JI. Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue usado para amplificar el fragmento programado para 1 ciclo a 98"C durante 2 minutos; y 35 ciclos cada uno a 94"C durante 30 segundos, 61 "C durante 30 segundos, y 68"C durante 1.5 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción fue incubada a 68"C durante 10 minutos y luego enfriada a 10"C hasta ser procesada adicionalmente. Un producto de reacción por PCR de 1.3 kb fue aislado en un gel de GTG-agarosa al 0.8% usando tampón TAE y

0.1 !Jg de bromuro de elidio por m!. La banda de ADN fue visualizada con la ayuda de un transiluminador de DARKREADERTN para evitar mutaciones inducidas por UV.

65 El1767878

La banda de ADN de 1.3 kb fue cortada del gel con una hoja de afeitar desechable y purificada con una centrifugadora UL TRAFREE® DA según las instrucciones del fabricante.

10461J El vector pAIL02 fue linealizado por digestión con Pac I y Nco 1. El fragmento fue purificado por electroforesis en gel y ultrafíltración como se ha descrito anteriormente. La clonación del fragmento de PCR purificado en el vector pAIL02 linealizado y purificado fue realizada con un IN FUSION TM Cloning Kit. La reacción (20 !JI) se compuso de lX IN-FUSION"TM Buffer, lX BSA, 1 !JI de enzima IN-FUSION"TM (diluida 1:10), 100 ng de pAIL02 digerido con Pac / y Nco /, y 50 ng del producto de PCR purificado de GH6A de A. fumigatus. la reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una muestra de 2 !JI de la reacción fue usada para transformar células competentes TOP10 de E. coli según las instrucciones del fabricante. Después del periodo de recuperación, dos partes alícuotas de 100 !JI de la reacción de transformación fueron colocadas en placas sobre placas de 150 mm 2X YT suplementadas con 100!Jg de ampicilina por mI. Las placas fueron incubadas durante toda la noche a 37°C. Un conjunto de ocho clones recombina ntes putativos fue seleccionado al azar de las placas de selección y ADN plásmido fue preparado a partir de cada una utilizando un BIOROBOT® 9600. Clones fueron analizados por digestión de restricción Pst l. Siete de ocho clones tuvieron el modelo de digestión de restricción previsto. Clones 1. 2 Y 3 fueron luego secuenciados para confirmar que no había mutaciones en el inserto clonado. Clan #2 fue seleccionado y designado pA1L033.

10462J Protoplastos JaL355 de Aspergillus of}'Zse fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, supra, y transformado con 5 !Jg de pAILo33 (asl como pAIL02 como un control de vector). La transformación liberó aproximadamente 100 transformantes. Diez transformantes fueron aislados en placas PDA individuales.

(0463J Placas PDA confluyentes de cinco de los diez transformantes fueron lavadas con 5 mi de 0.01% TWEEN® 20 e inoculadas separadamente en 25 mi de medio MDU2BP en 125 mi frascos de agitación de vidrio e incubadas a 34°C, 250 r.p.m. Cinco días tras la incubación, 0.5 !JI de sobrenadante de cada cultivo fue analizado utilizando geles de Tris-Glicina SDS-PAGE al 8-16% (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. Los perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que uno de los transformantes tuvo una gran banda de aproximadamente 70 kDa. Este transformante fue denominado JaL355 AIL033 de A oryzae.

10464] Cien mi de medio de matraz de agitación (ejemplo 5) se at'iadieron a un matraz de agitación de sao mI. El matraz de agitación fue inoculado con dos tapones de Jal355 AlI033 de A. oryzae de una placa PDA e incubado a 34°C en un agitador orbital a 200 r.p.m. durante 24 horas. Cinquenta mi del caldo de matraz de agitación fue usado para inocular un vaso de fermentación de 3 litros.

[0465J Un total de 1.8 litros del medio de lote de fermentación (ejemplo 5) se at'iadió a un fermentador cubierto de vidrio de tres litros de Appl ikon Biotechnology. Medio de suministro de fermentación (ejemplo 5) fue dosificado a razón de Oa 4.4 gllfhr durante un periodo de 185 horas. El vaso de fermentación fue mantenido a una temperatura de 34°C y el pH fue controlado utilizando un sistema de control Applikon 1030 a un punto de ajuste de 6.1 +/-0.1 . Aire se at'iadió al vaso a razón de 1 wm y el caldo fue agitado por impulsor Rushton girando a 1100 a 1300 r.p.m. Al final de la fermentación, et'i caldo completo fue cosechado del vaso y centrifugado a 3000 x g para eliminar la biomasa. El sobrenadante fue filtrado estéril utilizando 0.221Jm EXPRESSTM Plus Membrane, y almacenado a 4Q C.

10466] El caldo fue filtrado utilizando un filtro de vidrio GFfF de 0.7 IJm (Whatman, Piscataway, NJ, EE.UU) y luego utilizando un EXPRESS TM Plus Membrane 0.22 IJm. El caldo filtrado fue concentrado y el tampón cambiado utilizando un concentrador de nujo tangencial (Pal! Filtran, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pal! Filtron, Northborough, MA, EE.UU) con 20 mM pH Tris-HCI 8.0.

10467) Caldo desalado fue cargado sobre una columna de intercambio iónico MONOQ"TM 16/10 y eluido con un gradiente de NaCI lineal de 300 mi 0-300 mM en 20 mM pH Tris-HCI 8 con colección de fracciones de 10 mI. Las fracciones fueron agrupadas basándose en análisis SDS-PAGE. Fracciones agrupadas fueron ajustadas a 1.2 M (NH4)2S04 en 20 mM Tris, pH 8.0 Y luego aplicadas a una columna PHENYL SEPHAROSE"TM FAST-FLOW® HIGH-SUB® autovertida de 75 mi (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU) y eluidas con un gradiente de (NH4)2S04 lineal de 750 mi 1.2-0 M en 20 mM Tris-HCI pH 8 con colección de fracciones de 10 mi . Fracciones agrupadas basadas en SDS-PAGE fueron concentradas utilizando un concentrador centrífugo MWCO

S

VIVASPIN® de 10 kDa (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EEUU). El material concentrado fue lue90 purificado utilizando una columna de filtración en gel HIGHLOAO"TM 26/60 Superclex 75 con un gradiente isoscrático de 200 mi en 1SO mM NaCl, 20 mM pH Tris-HCI 8.0. Las fracciones fueron recog idas y agrupadas basándose en SDS-PAGE y concentradas utilizando concentradores centrífu90S MWCO VIVASPIN® de 10 kDa. Concentración de proteína fue determinada usando un Mieroplate BCA"TM Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína.

Ejemplo 9: Preparación de xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus

[0468] Xilanasa GH10 de NNOSS679 de Aspergillus fumígatus (xyn3 SEC ID n.O: 67 [secuencia de ADN] y SEC ID

n.o: 68 [secuencia de aminoácido deducido]) se preparó recombinantemente conforme a WO 2006/078256 usando BECh2 de Aspergíllus oryzae como un huésped.

10469] El caldo filtrado fue desalado y cambiado de tampón utilizando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, EE.UU) con 25 mM pH Tris-HCI 8.5. Material desalado se aplicó a 400 mi de columna Q-SEPHAROSE"TM Fast-Flow"TM (vertida a mano) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU), lavada con 400 mi 25 mM Tris pH 8.5, Y eluida con un gradiente lineal de 1400 mi 0-600 mM de NaCI en 25 mM Tris pH 8.5 con colección de fracciones de 10 mi . Las dracciones fueron agrupadas basándose en SDS-PAGE, y ajustadas a 1.5 M (NH412S04, 20 mM de Tris pH 8.0 Y aplicado a una columna PHENYL SEPHAROSE"TM FAST-FLOW® HIGH-SUB® autovertida de 75 mi, lavada con 75 ml 20 mM pH Tris-HCI 8.0, y eluidaa con un gradiente lineal de (NH4)2S04 de 1500 mi 1.5-0 M en 20 mM pH Tris HCI 8 con colección de fracciones de 10 mi . las fracciones fueron agrupadas basándose en el análisis SDS-PAGE y concentradas utilizando un dispositivo de concentración de células agitado de 300 mi (Millipore, Bedford, MA, USA) equipado con una membrana MWCO de 10 kDa y desalada en 20 mM de Tris-HCI pH 8.0, 150 mM de NaCI. Concentración de proteína fue determinada usando un Microplate BCA"TM Protein Assay Kit con albúmina de suero bovino como un estándar de proteína.

Ejemplo 10: Preparación de beta-xilosidasa GH3 de RutC30 de Trichoderma reesei

[0470] Un gen de beta-xilosidasa de RutC30 de Trichoderma reeseí (SEC ID n.O: 69 [secuencia de ADN] y SEC ID

n.O: 70 (secuencia de aminoácido deducido]) fue aislado por la selección de una Lambda ZAP®-CMR XR library preparada de ADN genómico de RutC30 de T. reeseí usando un lambda ZAP®-CMR XR library Construction Kit (Stratagene, la Jolla, CA, EE.UU) según las instrucciones del fabricante. ADN genómico de RutC30 de T. reesei se preparó utilizando los métodos estándar. Un segmento de ADN que codifica 2300 pb de la beta-xilosidasa de T. reeseí fue amplificado utilizando los cebadores de la PCR mostrados a continuación. Cebador directo: S'-gtgaataacgcagctcttctcg-3' (SEC ID n.O: 87)

Cebador inverso: S'-ccttaattaattatgcgtcaggtgt-3' (SEC ID n.o: 88)

10471) Cebador 994768 fue diseñado para amplificar desde la primera base después del sitio de inicio de beta xilosidasa y el cebador 994769 fue diseñado con un sitio Pac I en el extremo S'.

10472J Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por SO ng de ADN plásmido de la biblioteca lamda zap, 1 ~I de una mezda 10 mM de dATP, dTIP dGTP, Y dCTP, S ~I de 10X PLATlNUM® Pfx DNA Polymerase Buffer, y 1 unidad de PLATINUM® Pfx ADN Polimerasa, en un volumen final de SO ~I. Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue usado para amplificar el fragmento de ADN programado para 1 ciclo a 9SQ C durante 3 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94Q C durante 45 segundos, 55Q C durante 60 segundos, y 72"C durante 1 minuto 30 segundos. Después de los 30 ciclos, la reacción fue incubada a 72"C durante 10 minutos y luego enfriada a 4"C hasta otro tratamiento.

10473] Un producto de PCR de 2.3 kb fue purificado por electroforesis en gel de agarosa a11% usando tampón TAE, cortado del gel, y purificado utilizando un QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El producto de PCR de 2.3 kb fue luego digerido con Pac I para facilitar la inserción en pAll01 (WO 2004/099228).

[0474] El vector pAILol fue digerido con Nco I y luego rellenado usando T4 ADN polimerasa (Rache Applied Science, Nutiey, NJ, EE.UU) según instrucciones del fabricante. Una segunda enzima, Pac 1, fue luego usada para digerir el extremo S' de pAIL01 y la reacción fue purificada por electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente para aislar un fragmento de vector de 6.9 kb.

[0475) El fragmento de beta-xilosidasa de 2.3 kb fue luego ligado al fragmento de vector de 6.9 kb Y transformado en células competentes de subclonación de E. coN Xl1-Blue (lnvitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU) segun instrucciones del fabricante. Transformantes fueron seleccionados usando análisis de digestión de restricción para identificar aquellos con el inserto correcto. Un nuevo vector de expresión, pSaMe04, fue confirmado por la secuenciación usando un ABI 3700 ONA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU) y quimica de terminadores fluorescentes (Giesecke et al., 1992, supra).

10476] Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados a continuación fueron disel'iados para amplificar por PCR el gen de beta-xilosidasa de Trichoderma reesei de pSaMe04 para construir un vector de expresión de Trichoderma. Un IN-FUSION'"" Cloning Kit fue usado para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión pMJ09 01'10 2005/056772), sin la necesidad de digestión por restricci6n y ligamiento. TrBXYL-F (ID 064491): 5'-CGGACTGCGCACCATGGTGAATAACGCAGCTCT-3' (SEC ID n.O: 89)

TrBXYL-R (ID 064492): 5'-TCGCCACGGAGCTTATTATGCGTCAGGTGTAGCAT-3' (SEC ID n.o; 90)

10077J letras en negrita representan la secuencia codificante. la secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pMJ09.

10478] Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR compuesta por 50 ng de pSaMe04,1 ¡.JI de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 5 ¡.JI de 10XACCUTAQTM ONA Polymerase Buffer (Sigma-Aldrich, St. louis, MO, EE.UU), y 5 unidades de ACCUTAQTM ONA polymerase (Sigma-Aldrich, SI. Louis, MO, EE.UU), en un volumen final de 50 ¡.JI. Un EPPENOORF® MASTERCYCLER® 5333 fue usado para amplificar el fragmento de AON programado para 1 ciclo a 95Q C durante 3 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94Q C durante 45 segundos, 55Q C durante 60 segundos, y 72°C durante 1 minuto 30 segundos. DespuéS de los 30 ciclos, la reacción fue incubada a 72"C durante 10 minutos y luego enfriada a 4"C hasta otro tratamiento.

10479] los productos reactivos fueron aislados por electroforesis en gel de agarosa al 1.0% usando tampón TAE donde una banda de producto de 1.2 kb fue cortada del gel y purificada utilizando un QIAQUICK® Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.

10480] El fragmento d 1,2 kb fue luego clonado en pMJ09 utilizando un IN-FUSION TM Cloning Kit. El vector fue digerido con Pac I y Nco I y purificado por electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. El fra9mento de gen y el vector digerido fueron li9ados juntos en una reacción dando como resultado el plásmido de expresión pSaMe-TrBXYL donde la transcripción del gen de beta-xilosidasa estaba bajo el control del promotor del gen cbh1 de T. reesei. la reacción de ligamiento (50 ¡.JI) fue compuesta por 1X IN-FUSION"TM Buffer, 1X BSA, 1 ¡.JI de enzima IN-FUS10N"TM (diluida 1 :10), 100 ng de pMJ09 digerido con Pac I y Nco 1, y 100 ng del producto PCR purificado de beta-xilosidasa de T. reeseí. la reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un ¡.JI de la reacción fue usado para transformar células competentes de E. colí XL10 SOLOPACK® Gold. Un transformante de E. coli que contiene pSaMe-TrBXiLo fue detectado por digestión de enzima de restricción y ADN plásmido fue preparado utilizando un BIOROBOT® 9600. Secuenciación del AON del gen de beta-xilosidasa de T. reeseí de pSaMe-TrBXYL fue realizada utilizando la química de terminadores de coloración (Giesecke et at., 1992, supra) y estrate9ia de paseos con cebadores.

10481) El plásmido PSaMe-AaXYL fue construido para comprender el promolor y terminador del gen de celobioh idrolasa I de Trichoderma reesei y la secuencia codificante de xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus.

10482J La clonación de la xilanasa de A aculealus seguida del protocolo de clonación de expresión tota l como se indica en H. Dalb0ge et al., 1994, Mol. Gen. Gene!. 243: 253-260.

10483] ARN fue aislado de micelio de A. aculeatus CBS 101.43. Poli(A)+ ARN fue aislado de ARN total por cromatografía en oligo(dT)-celulosa. AONc bicatenario fue sintetizado como se describe por Maniatis et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbar Laboratory Press, 1982). Después de la síntesis el AONc fue tratado con nucleasa de la judía de Mung, con extremos redondeados con T4 DNA polimerasa, y ligado a adaptadores Bst XI no palindrómicos (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA).

El AONc fue fraccionado por tamaño por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando tampón TAE donde se usaron fra9mentos que varían de 600 pb a 4000 pb en la construcción de la biblioteca. El ADN fue ligado en pYES 2.0 digerido con Sst XI (Invitrogen Corp., Cartsbad, CA, EE.UU) entre el promotor GAL 1 Y el terminador iso-1-citocromo c y transformado en células MC1061 de Escherichia col; (Stratagene, la Jolla, CA, USA). La biblioteca fue colocada en placas de LB e incubada durante toda la noche a 37"C. Las colonias fueron rascadas de las placas y resuspendidas en el medio LB suplementado con 100 !Jg de ampicilina por mI. ADN plásmido fue aislado utilizando un Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). El AON plásmido purificado fue a9rupado.

[0484J La mezcla de AON plásmido purificado fue transformada en células W3124 de Saccharomyces cerevisiae (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3: prbl:: LEU2; cir+: van den Hazel et al., 1992, Eur.

J. Biochem. 207: 277-2B3). Cultivo, tra nsformación y medios fueron como se describe por Guthrie et al., 1991, Meth. Enzymol. Vol 194, Academic Press. las células transformadas fueron colocadas en placas agar completas sintéticas conteniendo glucosa al 2% durante 3 días a 30"C. Después de 3 días las colonias fueron replicadas en placas de SC agar con galactosa al 2% e incubadas durante 4 días a 30"C. Colonias de expresión de xilanasa fueron identificadas utilizando una cobertura de agarosa a11% con 0.1 % AZCl birch-xilano a pH 4.5 (Oalb0ge, 2006, FEMS Microbiology Reviews 21: 29-42). Las colonias que expresaron actividad de xilanasa fueron rodeadas por una zona azul. AON plásmido, salvado de las colonias positivas, contenía un inserto de ADN de aproximadamente 1.3 kb. la secuenciación del fragmento de gen aislado reveló un marco de lectura abierto de 1218 pb que codificaba un polipéptido con un peso molecular teórico de 43.0 kOa. El fragmento de ADNc fue subclonado en el vector de expresión pH0464 de Aspergillus (Dalb0ge y Heldt-Hansen, 1994, Mol. Gen. Genet. 243,253-260) digerido con Bam HI y Xho I digiriendo el clan con Bam HI y Xho I y aislando el inserto de ADNc de 1.2 kb (Christgau et al., 1996, Biochem. J. 319: 705-712) para generar el plásmido pA2X2.

[0485J La secuencia cod ificante de xilanasa GH10 de A. aculeatus fue amplificada por PCR usando el plásmido pA2x2 como modelo y cebadores 153505 y 153506 mostrados a continuación usando métodos estándar para producir un fragmento de aproximadamente 1.2 kb . El fragmento de 1.2 kb fue digerido con Bam HI y Xho I (introducido en los cebadores de PCR) y clonado en el vector pCaHj527 (WO 2004/099228). El plásmido resultante fue designado pMT2155 donde el ADNc estaba bajo control transcripcional del promotor de la ami lasa neutra 11 (NA2) de A. niger y el terminador AMG de A. niger. Cebador 153505: 5'-TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3' (SEC ID n.O: 91)

Cebador 153506: 5'-TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3' (SEC ID n.O: 92)

[0486J Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados a continuación fueron diseñados para amplificar por PCR el gen GH10 de A. aculeatus del plásmido pMT2155 e introducir regiones f1anqueantes para inserción en el vector de expresión pMJ09 (WO 20051056772). letras en negrita representan la secuencia codificante y la secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pMJ09. Cebador directo: 5'-cggactgcgcaccatggtcggactgctttcaat-3' (SEC ID n.o: 93)

Cebador inverso: 5'-tcgccacggagcttatcacagacactgcgagtaat-3' (SEC ID n.O: 94)

10487J Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción por PCR consistente en 50 ng de pMT2155,1 111 de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP dGTP, Y dCTP, 5 ¡JI de 10X ACCUTAQTM DNA Polymerase Buffer, y 5 unidades de ACCUTAQTM DNA polimerasa, en un volumen final de 50 !JI. Un EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 fue usado para amplificar el fragmento de ADN programado para 1 ciclo a 95"C durante 3 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94"C durante 45 segundos, 55"C durante 60 segundos, y 72"C durante 1 minuto 30 segu ndos. Después de los 30 ciclos, la reacción fue incubada a 72"C durante 10 minutos y luego enfriada a 4"C hasta otro tratamiento.

[0488J Los productos reactivos fueron aislados por eleclroforesis en gel de agarosa al 1 % usando tampón T AE donde una banda de producto de 1.2 kb fue cortada del gel y purificada utilizando un QIAquick Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante.

{0489] El fragmento fue luego clonado en pMJ09 utilizando un IN·FUSIONlM Cloning Kit. El vector fue digerido con Pac I y Nco I y purificado por electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. El fragmento de gen de 1.2 kb Y el vector digerido fueron ligados juntos en una reacción dando como resultado el plásmido de expresión pSaMe·AaXYL donde la transcripción del gen de la Familia GH10 estuvo bajo el control del promotor cbh 1 de T. reesei. La reacción de ligamiento (SO ul) fue compuesta por 1X IN·FUS10NlM Buffer, 1X BSA, 1 !JI de enzima IN·FUSIONlM (diluida 1:10), 100 ng de pAIL02 digerido con Pac I y Nco 1, y 100 ng del producto de PCR purificado de xilanasa GH10 de A. aculeatus. La reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un 111 de la reacción fue usada para transformar células competentes de E. cofi XL10 SOLOPACK® Gold según el fabricante. Un transformante de E. coli que contiene pSaMe·AaGH10 fue detectado por digestión de enzima de restricción y ADN plásmido fue preparado utilizando un BIOROBOT® 9600. La secuenciación del ADN del gen GH10 de A. aculealus de pSaMe·AaXYL fue realizada utilizando la química de terminadores de coloración (Giesecke et al., 1992, supra) y estrategia de paseos con cebadores.

10490J Los plásmidos PSaMe·AaXYL que codifican la endoglucanasa GH10 de A. aculealus y pSaMe·TrBXYL que codifica la beta-xilosidasa de T. reeseifueron cotransformados en RutC30 de Trichoderma reesei por transformación mediada por PEG (Penttila etal., 1987, Gene 61 155·164) para generar la cepa SaMe·BXX13 de T. reesei. Cada plásmido contuvo el gen amdS de A nidulans para permitir que los transformanles crecieran en aceta mida como la única fuente de nitrógeno.

10491 ) RutC30 de T. reesei fue cultivado a 2rC y 90 r.p.m. en 25 mi de medio YP suplementado con glucosa al 2% (pfv) y 10 mM de uridina durante 17 horas. Micelios fueron recogidos por filtración usando un sistema de filtración desechable impulsado por vacío (Millipore, Bedford, MA, EE.UU) y lavado dos veces con agua desionizada y dos veces con 1.2 M sorbito!. Los protoplastos fueron generados por la suspensión de los micelios lavados en 20 mi de 1.2 M sorbitol conteniendo 15 mg de GLUCANEXlM (Novozymes NS, Bagsvaerd, Dinamarca) por mi y 0.36 unidades de quitinasa (Sigma Chemical Co., SI. Louis, MO, EE.UU) por mi e incubando durante 15-25 minutos a 34°C con agitaci6n suave a 90

r.p.m. Los protoplastos fueron recog idos por centrifugado durante 7 minutos a 400 x g y lavados dos veces con 1.2 M de somitol frío. Los protoplastos fueron contados utilizando un hemocit6melro y resuspend idos en STC hasta una concentraci6n final de 1 X 108 protoplastos por mI. Los protoplastos en exceso fueron almacenados en un Cryo 1"C Freezing Container (Nalgene, Rochester, NY, EE.UU) a -80"C.

10492) Aproximadamente 4119 de plásmidos pSaMe·AaXYL y pSaMe·TrBXYL fueron digeridos con Pme I yai'iadidos a 100 111 de solución de protoplastos y mezclados suavemente, seguido de 250 111 de 10 mM CaCIz-10 mM pH Tris· HCI7.5·60% PEG 4000, mezclados, e incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos. STC (3 mi) fue luego adicionada y mezclada y la solución de transformación fue colocada en placas COVE usando selección de amdS de Aspergillus nidulans. Las placas fueron incubadas a 28"C durante 5·7 días. Transformantes fueron sub-cultivados en placas COVE2 y crecidos a 28"C.

10493] Unos 40 transformantes fueron subcultivados en placas frescas que contenían acetamida y se dejaron esporular durante 7 días a 28°C.

10494J Los transforman tes de Trichoderma reesei fueron cultivados en frascos de agitación disipados de 125 mi conteniendo 25 mi de medio CIM a pH 6.0 por la inoculación de esporas de los transformantes e incubando a 28"C y 200 r.p.m. durante 7 días. RulC30 de Trichoderma reeseifue ejecutado como un control. Las muestras de caldo de cultivo fueron quitadas el día 5. Un mi de cada caldo de cultivo fue centrifugado a 15.700 x g durante 5 minutos en una microcentrifugadora y los sobrenadanles transferidos a nuevos lubos.

10495J SDS-PAGE fue realizada usando CRITERION® Tris-HCI (5% red isolviendo) geles con un CRITERION® System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Cinco 111 de sobrenadantes del día 7 (ver arriba) fueron suspendidos en 2X concentración de tampón de muestra de Laemmli Sample Buffer (Bio·Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU) y hervidos en presencia de 5% de bela mercaptoetanol durante 3 minutos. Las muestras sobrenadantes fueron cargadas en gel de poliacrilamida y somelidas a electrofóresis con 1X TrisfGlicina/SDS como tampón de desplazamiento (Bio-Rad Laboralories, Inc., Hercules, CA, USA). El gel resultanle fue manchado con BIO·SAFElM Coomassie Stain.

El transformante que muestra la expresión máxima de la xilanasa GH10 de A. aculealus y la beta-xilosidasa de T. reeseí basada en el gel de proteína fue designado SaMe-BXX13 de T. reeseí.

10496J SaMe-BXX13 de Trichoderma reesei fue cultivado en frascos de agitación de 500 mi disipados conteniendo 250 mi de medio CIM a pH 6.0 inoculado con esporas de SaMe-BXX13 de T. reeseí. Frascos de agitación fueron incubados a 28"C a 200 r.p.m. durante cinco días. El caldo de cultivo fue luego filtrado utilizando una EXPRESS TM Plus Membrane de 0.22¡Jm.

10497J El caldo filtrado fue concentrado y el tampón cambiado utilizando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU) equipado con una membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtran, Northborough, MA, EE.UU) a pH 4.0 con ácido acético. La muestra fue cargada sobre una columna de SEPHAROSE® SP (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU) equilibrada en 50 mM de acetato sódico pH 4.0, eludiendo las proteínas ligadas con un gradiente de 0-1000 mM de cloruro sódico. Las fracciones fueron intercambiadas del tampón en 20 mM de fosfato sódico pH 7.0 usando un concentrador de flujo tangencial y aplicado a una columna de PHENYL SUPEROSE TM HR 16/10 (GE Heallhcare, Piscataway, NJ, EE.UU) equilibrada con 1.5 M (NH.)2S0.-20 mM de fosfato sódico pH 7.0. Proteínas ligadas fueron eluidas con un gradiente lineal sobre 20 volumenes de columna de 1.5 a OM (NH4nS04 en 20 mM Tris-HCI pH 7.0. Las fracciones de protelna fueron intercambiadas del tampón en 20 mM TEA HCI pH 7.5 usando un concentrador de flujo tangencial. La muestra fue aplicada a una columna de intercambio iónico MONOQ TM HR 16/10, equ ilibrada en 20 mM TEA HCI pH 7.5, eludiendo las proteínas ligadas con un gradiente de 0-300 mM cloruro sódico. Tampón de fracciones de proteína final fue 20 mM TEA-100 mM de cloruro sódico pH 7.5. Concentración de proteínas fue determinada usando un Microplate SCA TM Protein Assay Kit donde albúmina de suero bovino fue usada como un estándar de proteína.

Ejemplo 11: Preparación de celulosa hinchada de ácido fosfórico

10498J Celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC) fue obtenida a partir de AVICEL® PH1Q1, (FMC, Philadelphia, PA, EE.UU) utilizando el prortocolo descrito por Zhang et al., 2006, Biomacromolecules 7: 644-648.

Ejemplo 12: Ensayo de hidrólisis de celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASe)

10499J Un lodo al 1.0% de PASC preparado como se describe en el ejemplo 11 fue íntegramente resuspendido por agitación, y rápidamente transferido a un vaso de precipitado de 100 mi y agitado rápidamente con un agitador magnético. Partes allcuotas de quinientos j.Jl del lodo PASC 1.0% fueron pipetados en pocillos de una placa de 96 pocillos de

2.0 mi (Axygen, Union Cily, CA, EE.UU) utilizando una micropipeta de 1000 ¡JI con una punta de abertura amplia (extremo de corte de punta aproximadamente 2 mm desde la base). Cien j.Jl de 10 mM MnSO.-500 mM de acetato sódico pH 5 fueron luego afiadidos a cada pocillo. Doscientos j.Jl de bien agua desionizada o una solución de pirogalol al 1,0% (p/p ) (Sigma Chemical Ca., Inc., SI. Louis, MO, EE.UU) fueron adicionados a cada pocillo. Mezclas enzimáticas fueron preparadas y luego adicionadas simultáneamente a todos los pocillos en un volumen de 200 j.Jl, para un total de 1 mi en cada reacción. La placa fue luego sellada utilizando un termosellador de placas de ALPS 300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido), mezclada íntegramente, e incubada a bien 50"C o 65"C durante aproximadamente 3 dlas. Todos los experimentos proporcionados fueron realizados por triplicado.

10500J Análisis primario de las reacciones de hidrólisis fue realizado utilizando una AGILENT® 1100 HPLC (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE.UU) con software de CHEMSTATION® (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE.UU) equipado con una columna AMINEXTM HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Después de aproximadamente 4 días, la placa de pocillos profundos fue quitada de la incubadora y helada durante tooa la noche a 4"C. La placa fue luego bien mezclada por inversión y brevemente centrifugada a 52 x 9 en un SORVALL® RT7 centrífugo durante 10 segundos. Las muestras fueron luego mezcladas por pipeteo, y 200 j.Jl de cada pocillo fueron transferidos a un conjunto de placas de filtración centrífuga MULTISCREEN® HV (Millipore, Bedford, MA, EE.UU) . El conjunto de placas de filtración centrífuga fue centrifugada a 2000 r.p.m. en un SORVALL® RT7 centrífugo durante 20 minutos. los filtrados fueron transferidos a una placa automuestreadora de 96 pocillos y diluidos 1:1 con 5 mM H2S0., sellados con red de sellado de silicona, e insertados en un módulo de inyector de HPLC (ajustado a 4"C) para inyección de 20 j.Jl sobre una columna de protección CATION HTM conectada a una columna 4,6 )( 250 mm AMINEX® HPX-87H seguida de elución con 0.05% plp ácido benzoico en 5 mM H2S04. Azúcares fueron detectados por detección de indice de refracción con cuantificación por integración en comparación

con estándares de azúcar purificado.

10501 ) Todo el procesamiento de datos de HPLC fue realizado usando el software de MICROSOFT EXCEL TM (M icrosoft, Richland, WA, USA). Concentraciones de glucosa medidas fueron ajustadas para el factor de dilución apropiado. En este ensayo solo glucosa fue medida ya que la beta-glucosidasa estaba a altos niveles en todas las muestras menos en los controles. Porcentaje de conversión relativa fue calculado utilizando la ecuación siguiente:

% conversión = [concentración de glucosa de la muestra] I [concentración de glucosa en una digestión límite] x 100

¡0502] Para calcular % conversión, un punto de conversión del 100% fue ajustado basado en un control de celulasa de 100 mg de celulasa de Trichoderma reesei por gramo de celulosa (CELLUCLAST PLUS TM, Novozymes AlS, 8agsvaerd, Dinamarca), y todos los valores fueron divididos por este número y luego multiplicados por 100. Se hizo un promedio de los puntos de datos triplicados y la desviación estándar fue calculada.

Ejemplo 13: Efecto de la adición de la variante L90V + 01315 + M134L + A141W de GH61B de Aspergillus fumigatus en la conversión de celulosa hinchada de ácido fosfórico por beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus en presencia de pirogalol a 5O"C y 65"C

10503] Polipéptido de tipo salvaje GH61B de A. fumígatusy variante 190V + 01 31S + M134l + A141W de GH618 de

A. fumigatus fueron evaluados para su capacidad para mejorar la hidrólisis de celulosa hinchada con ácido fosfórico por beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus en presencia de pirogalol. El ensayo de hidrólisis de celulosa hinchada con ácido fosfórico fue realizado como se describe en el ejemplo 12.

10504] La conversión de celulosa hinchada con ácido fosfórico (0.5% pfp) por la combinación de pirogalol (0.2% pfp) Y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (5 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de (0.2% pfp) pirogalol, polipéptido de tipo salvaje GH61 8 de A. fumigatus (10 rng proteína por 9 celulosa), y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (5 mg proteína por 9 celulosa); y la combinación de pirogalol (0.2% pfp), variante GH61 8 L90V + 0131S + M134l + A141W de A. fumigatus (10 mg proteína por 9 celulosa), y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (5 mg de proteína por 9 celulosa) fue determinada según el ensayo descrito en ejemplo 12. Los datos fueron recogidos y analizados, como se describe en el ejemplo 12, después de 72 horas de incubación a bien 50"C o 65"C. Los resultados se muestran en la figura 2.

¡0505J La combinación de pirogalol (0.2% pfp) Y beta-glucosidasa CEl3A de A fumigatus (5 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de celulosa hinchada con ácido fosfórico de 2.1 ± 0.3% y 2.2 ± 1.0% a 50"C y 65°C, respectivamente. la adición de potipéptido tipo salvaje GH61 8 de A fumígatus (10 mg proteína por 9 celulosa) a la combinación de pirogalol (0.2% p/p) y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (5 mg de proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de celulosa hinchada con ácido fosfórico de 23.8 ± 0.6% y 16.8 ± 0.4% a 50°C y 65°C, respectivamente. la adición de variante L90V + 0131S + M134l + A141W de GH618 de A. fumigatus (10 mg proteína por 9 celulosa) a la combinación de pirogalol (0.2% plp) Y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (5 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de celulosa hinchada con ácido fosfórico de 46.1 ± 1.1% y 23.4 ± 0.7% a 50"C y 65"C, respectivamente.

Ejemplo 14: Ensayo de hidrólisis de rastrojos de maíz pretratados

10506] Rastrojos de maíz fueron pretratados en el U.S. Oepartment of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREl) utilizando 1.4 % en peso de ácido sulfúrico a 165°C y 107 psi durante 8 minutos. Los sólidos insolubles en agua en los rastrojos de maíz pretratados (PCS) contenían aproximadamente 59% celulosa, 5% hemicelulosa y 28% lignina. Celulosa y hemicelulosa fueron determinadas por una hidrólisis de ácido sulfúrico de dos etapas con análisis posterior de azúcares por cromatografía líquida de alto rendimiento usando procedimiento analítico estándar NREL

#002.

Lignina fue determinada gravimétricamente después de hidrolizar la celulosa y fracciones de hemicelulosa con ácido Sulfúrico usando procedimiento analítica estándar NREL #003.

10507] La hidrólisis de PCS fue conducida utitizando placas de pocillos profundos de 2,2 mi (Axygen, Union City, CA, EE.UU) en un volumen de reacción total de 1,0 mI. La hidrólisis fue realizada con 50 mg de PCS por mi de 50 mM tampón de de acetato sódico pH 5.0 conteniendo 1 mM de sulfato de manganeso y varias cargas de protelna de la composición de celulasa (expresada como mg proteína por gramo de celulosa).

Mezclas enzimáticas fueron preparadas y luego adicionadas simultáneamente a todos los pocillos en un volumen de 100111, para un volumen finat de 1 mt en cada reacción. la placa fue luego sellada utilizando un termosellador de placas AlPS-30Q "N, mezclada íntegramente, e incubado a 50"C, 55"C, 60"C, y/o 65"C durante 72 horas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

¡0508J Después de la hídrólisis, las muestras fueron filtradas utilizando una placa de filtración de 96 pocillos de 0.45 IJm MUL TISCREEN® (Millipore, Bedford, MA EE.UU) y los filtrados fueron analizados para el contenido de azúcar como se describe abajo. Cuando no se usaron inmediatamente, las partes alicuotas azucaradas filtradas fueron congeladas a -20"C. Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas en 0.005 M H2S0. fueron medidas utilizando una columna

4.6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H por elución con 0.05% p/p de ácido benzoico-0.005 M H2S0. a una velocidad de flujo de 0.6 mi por minuto a 65"C, y lacuantificación por integración de glucosa y se"'al de celobiosa de detección de índice de refracción (CHEMSTATION®. AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU) calibrada por muestras de azúcar puro. Los equivalentes resultantes fueron usados para calcular el porcentaje de conversión de celulosa para cada reacción.

¡0509J Todo el procesamiento de datos de HPLC fue realizado usando el software de MICROSOFT EXCEL"N. Concentraciones de azúcar medidas fueron ajustadas para el factor de dilución apropiado. Glucosa y celobiosa fueron medidas individualmente. Sin embargo, para calcular la conversión total los valores de glucosa y celobiosa fueron combinados. La concentración de celobiosa fue multiplicada por 1.053 para convertir equivalentes de glucosa y se a"'adió a la concentración de glucosa. El grado de conversión de celulosa fue calculado utilizando la ecuación siguiente:

[0510J Para calcular % de conversión, un punto de conversión del 100% fue ajustado basándose en un control de celulasa de 100 mg de la composición de celulasa por gramo de celulosa (CELLUCLAST PLUS"N , Novozymes AlS, Bagsvaerd, Dinamarca), y todos los valores fueron divididos por este número y luego multiplicados por 100. Se hizo un promedio de los puntos de datos triplicados y la desviación estándar fue calculada.

Ejemplo 15: Efecto de la adición de variante L90V + 01315 + M134L + A141W de GH61B de Aspergillus fumigatus en la conversión de pes por una composición de celulasa de Trichoderma reesei y beta glucosidasa CEL3A de Aspergillus fumigafus a 50"C y 55°C

10511] Una composición de celulasa de la cepa 981-0-8 (04) de Trichoderma reeseí fue preparada según el protocolo de fermentación descrito abajo. La cepa 981 -0-8 (D4) de T. reeseí es una cepa mutagenizada de RutC30 de Trichoderma reeseí (ATCC 56765; Montenecourt and Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181 : 289-301 l. La composición de celulasa es similar a CELLUCLAST (Novozymes AlS, Bagsvaerd, Dinamarca). la composición de celulasa fue suplementada con beta-glucosidasa de A. fumigatus . la composición de celulasa suplementada con beta-glucosidasa de A. fumigatus se designa en los ejemplos como ~composición de celulasa de Trichoderma reesei".

10512J Medio de matraz de agitación fue compuesto por 20 9 de dextrosa, 10 9 de sólidos de maíz remojados, 1.45 9 de (NH.l2S0., 2.08 9 de KH2PO., 0.36 9 de CaCI2, 0.42 9 de MgSO.·7H20, 0.42 mi de solución de metales traza, y agua des ionizada hasta 1 litro. Solución de metales traza fue compuesta por 216 9 de FeCI3-6H20 , 58 9 de ZnS04"7H20 , 27 g de MnS04-H20 , 10 9 de CuSO.·5H20, 2.4 9 de H3B03,336 9 de ácido cítrico, yagua desionizada hasta 1 litro.

10513] Cien mi de medio de matraz de agitación se a"'adió a un matraz de agitación de 500 mI. El matraz de agitación fue inoculado con dos tapones de un cultivo de placa sólida e incubado a 28"C en una coctelera orbital a 200 Lp.m. durante 48 horas. Cinquenta mi del caldo de matraz de agitación fue usado para inocular un vaso de fermentación de 2 litros.

10514J El medio de lote de fermenlación fue compuesto por 30 9 de celulosa, 4 9 de dextrosa, 10 9 de sólidos de maíz remojados, 3.8 9 de (NH.}2S0., 2,8 9 de KH2PO. , 2,64 9 de CaCI2, 1,63 9 de MgS04 .7H20, 1.8 mi de anti espuma, 0.66 mi de solución de metales traza, yagua desionizada hasta 1 litro. Solución de metales traza fue compuesta por 216 9 de FeCI3-6H20, 58 9 de ZnS04 -7H20, 27 9 de MnS04-H20, 10 9 de CuSO.·5H20, 2.4 9 de H3B03,336 9 de ácido cílrico·H20, yagua desionizada hasta 1 litro. El medio de suministro de fermentación fue compuesto por dextrosa.

10515J Un total de 1.8 litros del medio de lote de fermentación se añadió a un fermentador cubierto de vidrio de Applikon Biotechnology de tres litros. El medio de suministro de fermentación fue dosificado a razón de Oa 4 glllhr durante un periodo de 185 horas. El vaso de fermentación fue mantenido a una temperatura de 28"C y el pH fue controlado utilizando un sistema de control de Applikon 1030 hasta un punto de ajuste de 4.5 +/·0.1. Aire se at'iadió al vaso a razón de 1 wm y el caldo fue agitado por impulsor Rushton girando a 1100 a 1300 r.p.m. Al final de la fermentación, todo el caldo fue cosechado del vaso y centrifugado a 3000 x 9 para eliminar la biomasa. El sobrenadante fue sometido a filtración estéril y almacenado a 5 a 10"C.

10516J Polipéptido de tipo salvaje GH61 B de A. fumígatus y variante 190V + 0131S + M134l + A141W de GH61 6 de A. fumígatus fueron evaluados por su capacidad para mejorar la hidrólisis de PCS por la combinación de la composición de celulasa de T. reesei y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumígatus a bien 50"C o 55"C. El ensayo de hidrólisis PCS fue realizado como se describe en el ejemplo 14.

10517) l a conversión de PCS por la combinación de la composición de celulasa de T. reeseí(2.7 mg de proteína por gramo de celulosa) y beta-glucosidasa CEl3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg de proteína por gramo de celulosa), polipéptido tipo salvaje GH61 B de

A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa), y beta·glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg de proteína por gramo de celulosa), polipéptido de tipo salvaje GH61B de A. fumigatus (0.45 mg de proteína por 9 celulOsa), y beta·glucosidasa CEl3A de A. fumígatus (0.3 mg de proteína por 9 de celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei

(2.7 mg de proteína por gramo de celulosa), polipéptido tipo salvaje GH61 6 de A. fumigatus (0.6 mg proteína por 9 celulosa), y beta·glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por celulosa de gramo), polipéptido GH61 B tipo salvaje de A. fumigatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa), y beta..glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por celulosa de gramo), variante GH61B L90V + 0131S + M134L + A141W de A. fumigatus «0.3 mg proteína por 9 celulosa), y beta· glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH61B L90V + 0131S + M134L + A141W de A. fumigatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa), y beta..glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg de proteína por 9 celulosa): la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH616 L90V + 0131S + M134L + A141W de A. fumigatus (0.6 mg proteína por 9 celulOsa), y beta glucosidasa CEL3A de A. fumígatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa); y la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH616 L90V + 0 131S + M134L + A141W de A. fumigatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa), y beta·glucosidasa CEl 3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) fue ensayada como se describe en el ejemplo 14. Los datos fueron recogidos y analizados, como se describe en el ejemplo 14, después de 72 horas de incubación a bien 50"C o 55"C. Resultados para 5O"C y 55"C se muestran en las Figuras 3A y 36, respectivamente.

10518J La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa) y beta glucosidasa CEL3A de A. fumígatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 53.5 t 0.2% Y 52.2 t 0.3% a 50"C y 55"C, respectivamente.

10519J La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulOsa), polipéptido tipo salvaje GH61 6 de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa), y beta·glucosidasa CEl 3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 62.6 t 0.1 % Y 61.5 t 0.4% a 50"C y 55"C, respectivamente. La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), polipéptido de tipo salvaje GH61 6 de A. fumigatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa), y beta-glucosidasa CEL3A de A. fumigatus

(0.3 mg de proteína por 9 de celulosa) resultó en la conversión de PCS de 64.3 ± 0.1% y 63.4 ± 0.1% a 50"C y 55"C, respectivamente.

10520J La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), polipéptido tipo salvaje GH61 6 de A. (umígatus (0.6 mg proteína por 9 celulosa), y beta·glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg de proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 65.0 ± 0.5% y 64.5 t 0.6% a 50"C y 55"C, respectivamente. La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), polipéptido de tipo salvaje GH61B de A. fumigatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa), y beta..glucosidasa CEL3A de A. fumigatus

(0.3 mg de proteina por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 66.4 ± 0.2% y 66.1 ± 0.4% a 50"C y 55"C, respectivamente.

/0521 ] La combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg de proteína por gramo de celulosa), variante GH616 L90V + 0131S + M134L + A141W de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa), y beta· glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 63.9 ± 0.2% y 62.4 t 0.7% a 50"C y 55"C, respectivamente.

la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH61B 190V + 01315 + M134l + A141W de A. fumígatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa), y beta.glucosidasa CEL3A de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PCS de 65.2 ± 0.3% y 64.9 ± 0.4% a 50QC y 55QC, respectivamente. la combinación de la composición de celulasa de T. reesei (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH61B 190V + 0131S + M134l + A141W de A. fumigatus (0.6 mg proteína por 9 celulosa), y CEL3A beta· glucosidasa de A. fumigatus (0.3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de PC5 de 65.7 ± 0.6% y 65.7

QQ

± 0.4% a 50C y 55C, respectivamente. la combinación de la composición de celulasa de T. reeseí (2.7 mg proteína por gramo de celulosa), variante GH61B 190V + 01315 + M134l + A141W de A. fumígatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa), y beta.glucosidasa CEl3A de A. fumigatus (0.3 mg de proteína por 9 celulOsa) resultó en la conversión de PC5 de 67.4 ± 0.1% y 67.7 ± 0.4% a 50QC y 55QC, respectivamente.

Ejemplo 16: Efecto de la adíción de la variante 190V + 01315 + M134l + A141W de GH61B de Aspergíllus fumigatus en la conversión de PCS por una composición de celulasa de alta temperatura a 50°C. 55°C. 60°C. Y 65°C

10522] Una mezcla de enzimas de celulasa, designada "composición de celulasa de alta temperatura", se preparó mediante la mezcla de componentes enzimáticos preparados en las siguientes proporciones (de proteína total): 43.5% celobiohidrolasa I de Aspergíllus fumígatus, 29.4 % celobiohidrolasa 11 de AspergíJ/us fumígatus, 5.9% beta· glucosidasa de Aspergíllus fumígatus, 5.9% xilanasa 3 GH1 0 de Aspergíllus fumígatus, 3.5% beta·xilosidasa de Trichoderma reesei, y 11.8% endoglucanasa 11 CEl5A de Trichoderma reeseí. la composición cuando se carga en el ensayo a 3 mg de proteína total por gramo de celulosa tuvo las siguientes cargas enzimáticas por gramo de celulosa: 1.31 mg de celobiohidrolasa I de A. fumigatus por gramo de celulosa,

0.88 mg de celobiohidrolasa 11 de A. fumigatus por gramo de celulosa, 0.18 mg de beta·glucosidasa de A. fumigatus por gramo de celulosa, 0.18 mg xilanasa 3 GH10 por gramo de celulosa, 0.11 mg beta·xilosidasa de T. reesei por gramo de celulosa, y 0.35 mg endoglucanasa II CEl5A de T. reesei por gramo de celulosa.

[0523] Polipéptido de tipo salvaje GH61B de A. fumigatus y variante 190V + 0131S + M134l + A141W de GH61B de A. fumigatus fueron evaluados para su capacidad para mejorar la hidrólisis de PCS por la composición de celulasa a alta temperatura a 50°C, 55QC, 60QC, o 65QC. El ensayo de hidrólisis de rastrojos de maíz pretratados fue realizado como se describe en el ejemplo 14.

10524] la conversión de rastrojos de malz pretratados por la composición de celulasa de alla temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y polipéptido de tipo salvaje GH61 B de A. fumígatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de alla temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y polipéptido tipo salvaje GH61 B de

A. fumigatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa); la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y variante 190V + 0131 S + M134l + A141W de GH61 B de A. fumigatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa); y la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y variante 190V + 01315 + M134l + A14 1W de GH61 B de A. fumígatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa) fue ensayada como se describe en el ejemplo 14. los datos fueron recogidos y analizados, como se describe en el ejemplo 14, después de 72 horas de incubación a 50°C, 55QC, 60QC, o 65"C. los resultados para 0.45 mg de adición del polipéptido GH61 por gramo de celulosa y 0.75 mg de adición del polipéptido GH61 por gramo de celulosa se muestran en las Figuras 4A y 48, respectivamente.

10525] la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de rastrojos de maíz pretratados de 48.5 ± 0.3%, 52. O ± 0.1%, 43. 7 ± 0.2%, y 36.4 ± 0.1 % a 50°C, 55QC, 60QC, o 65"C, respectivamente.

10526] la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y polipéptido GH61 B de tipo salvaje de A. fumigatus (0.45 mg proteína por 9 celutosa) resultó en la conversión de rastrojos de maíz pretratados de 60.4 ± 0.2%, 65. 8 ± 0.1 %,55. 8 ± 0.1%, y 45.2 ± 0.2% a 50QC, 55°C, 60QC, o 65QC, respectivamente. l a combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y polipéptido GH61 B de tipo salvaje de A. fumígatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de rastrojos de maíz pretratados de 61.9 ± 0.1%, 67. 6 ± 0.2%, 57. 8 ± 0.3%, y 45.5 ± 0.7% a SOQC, 55QC, 60QC, o 65QC, respectivamente.

20527J la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y variante 190V + 01 315 + M134l + A141W de GH61B de A. fumigatus (0.45 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de rastrojos de maíz pretratados de 61.7 ± 1.1 %, 66. 7 ± 0.1%, 57. 9 ± 0.2%, y 45.4 t 2.1 % a SO"C, 55QC, 60"C, o 65"C, respectivamente. la combinación de la composición de celulasa de alta temperatura (3 mg proteína por 9 celulosa) y variante 190V + 0131S + M134l + A141W de GH61B de A. fumigatus (0.75 mg proteína por 9 celulosa) resultó en la conversión de

rastrojos de maíz pretratados de 62.7 ± 0.3%, 68. 5 ± 0.5%, 60. 4 ± 0.8%, y 48.6 ± 0.8% a 5OQ C, 55Q C, 60Q C, o 65Q C,

respectivamente.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Novozymes, Inc. Sweeney, Matt Wogulis, Mark

<120> Variantes de polipéptidos que tienen actividad de mejora celul olítica y polinucleótidos que los codifican

<130> 12033-WQ-PCT

<140> PCT/US 11 /054034

<141> 2011-09-29

<150> US 61/388,530

<151> 2010-09-30

<160> 94

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<211> 862

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 1 atgactttgt ccaagatcac ttccattgct ggccttctgg cctcagcgtc tctcgtggct 60 ggccacggct ttgtttctgg cattgttgct gatgggaaat agtatgtgct tgaaccacac 120 aaatgacagc tgcaacagct aacttctatt ccagttacgg agggtacctt gttaaccaat 180 acccctacat gagcaaccct cccgacacca ttgcctggtc caccaccgcc accgacctcg 240 gctttgtgga cggcaccggc taccagtctc cggatattat ctgccacaga gacgcaaaga 300 atggcaagtt gaccgcaacc gttgcagccg gttcacagat cgaattccag tggacgacgt 360 ggccagagtc tcaccatgga ccggtacgac gccgaagaga agagaacata ttgtgaccag 420 ataggctaac atagcatagt tgattactta cctcgctcca tgcaacggcg actgtgccac 480 cgtggacaag accaccctga agtttgtcaa gatcgccgct caaggcttga tcgacggctc 540 caacccacct ggtgtttggg ctgatgatga aatgatcgcc aacaacaaca cggccacagt 600 gaccattcct gcctcctatg cccccggaaa ctacgtcctt cgccacgaga tcatcgccct 660 tcactctgcg ggtaacctga acggcgcgca gaactacccc cagtgtttca acatccaaat 720 caccggtggc ggcagtgctc agggatctgg caccgctggc acgtccctgt acaagaatac 780 tgatcctggc atcaagtttg acatctactc ggatctgagc ggtggatacc ctattcctgg 840 tcctgcactg ttcaacgctt aa 862

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> Aspergi11us fumigatus

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1) •• (21)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (22) •• ( 250)

<400> 2

Met Thr Leu Ser Lys l1e Thr Ser l1e Ala G1y Leu Leu Ala Ser Ala -20 -15 -10

Ser Leu Val Ala G1y Bis Gly Phe Val Ser G1y l 1e Val Ala Asp G1y -5 -1 1 5 10

Lys Tyr Tyr G1y Gly Tyr Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser Asn 15 20 25

Pro Pro ASp Thr ¡le Ala Trp Ser Thr Thr Ala Thr ASp Leu Gly Phe 30 35 40

Val Asp G1y Thr G1y Tyr Gln Ser Pro Asp I1e I 1e Cys Bis Arg Asp 45 50 55

Ala Lys Asn G1y Lys Leu Thr Ala Thr val Ala Ala G1y Ser Gln I1e 60 65 70 75

G1u Phe Gln Trp Thr Thr Trp Pro Glu Ser Bis Bis Gly Pro Leu Ile 80 85 90

Thr Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly ASp Cys Ala Thr Val ASp Lys Thr 95 100 105

Thr Leu Lys Phe val Lys Ile Ala Ala Gln Gly Leu ¡le ASp Gly Ser 110 115 120

Asn Pro Pro Gly val Trp Ala ASp ASp Glu Met Ile Ala Asn Asn Asn 125 130 135

Thr Ala Thr Val Thr l1e Pro Ala Ser Tyr Ala Pro Gly Asn Tyr Val

140 145 150 155

Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Leu Asn Gly 160 165 170

Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Phe Asn Ile Gln I le Thr Gly Gly Gly 175 180 185

Ser Ala Gln Gly Ser Gly Thr Ala Gly Thr Ser Leu Tyr Lys Asn Thr 190 195 200

Asp Pro Gly Ile Lys Phe Asp Ile Tyr Ser Asp Leu Ser Gly Gly Tyr 205 210 215

Pro Ile Pro Gly Pro Ala Leu Phe Asn Ala

220 225

<210> 3

<211> 1377

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 3 atggcgccct cagttacact gccgttgacc acggccatcc tggccattgc ccggctcgtc 60 gccgcccagc aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120 tgtacaaagt ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tggtccttga ctggaactac 180 cgctggatgc acgacgcaaa ctacaactcg tgcaccgtca acggcggcgt caacaccacg 240 ctctgccctg acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tcgagggcgt cgactacgcc 300 gcctcgggcg tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360 tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420 gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480 tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540 tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600 acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgcaa cgagatggat 660 atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720 tgcgactctg ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780 cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840 aacggctcgc cctcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900

gacatcccca gcgcccagcc: cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960

tacggcggcc tcgccaccat: gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020

5: atttggaacg acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080

agcagcaccg agggcaaccc: atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140

ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc: gcccccgccc 1200

ccgcctgcgt ccagcacgac: gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260

ccgagctgca cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag: 1320

15: acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctt 1377

<210> <211> <212> <213>: 4 459 PRT Trichoderma reesei

<400>: 4

25: Met Ala Pro Ser 1 Val 5 Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala 10 Ile Leu Ala 15 Ile

Ala Arg Leu Val 20: Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val 25 30

35: His Pro Lys 35 Leu Thr Thr Tyr Lys Cys 40 Thr Lys Ser Gly Gly Cys 45 Val

Ala Gln 50: ASp Thr Ser Val Val 55 Leu ASp Trp Asn Tyr Arg Trp Met 60 His

Asp Ala Asn 65: Tyr Asn Ser Cys 70 Thr Val Asn Gly Gly 75 Val Asn Thr Thr 80

4S: Leu Cys Pro ASp Glu Ala Thr Cys Gly Lys 85 90 Asn Cys Phe Ile Glu Gly 95

Val: Asp Tyr Ala 100 Ala Ser Gly Val Thr Thr 105 Ser Gly Ser Ser Leu Thr 110

55: Met Asn Gln Tyr 115 Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr 120 Ser Ser Val 125 Ser

Pro Arg 130: Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu 135 Tyr Val Met 140 Leu Lys

Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro 145 150 155 160

Cys G1y Glu Asn: Gly Ser Leu Tyr Leu Ser G1n Met ASp Glu Asn G1y

165: 170 175

Gly Ala Asn: Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr

180: 185 190

Cys ASp Ala G1n: Cys Pro Val G1n Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn

195: 200 205

Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met ASp Ile Leu Glu Gly 210 215 220

Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala 225 230 235 240

Cys ASp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys 245 250 255

Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr 260 265 270

Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr ASp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu 275 280 285

Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser 290 295 300

Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala 305 310 315 320

Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met val 325 330 335

Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu 340 345 350

Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser 355 360 365

Asn rle Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile 370 375 380

Arg Trp Gly ASp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro 385 390 395 400

Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr 405 410 415

Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly 420 425 430

Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys 435 440 445

Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 450 455

<210> 5

<211> 1254

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 5 atgaacaagt ccgtggctcc attgctgctt gcagcgtcca tactatatgg cggcgccgtc 60 gcacagcaga ctgtctgggg ccagtgtgga ggtattggtt ggagcggacc tacgaattgt 120 gctcctggct cagcttgttc gaccctcaat ccttattatg cgcaatgtat tccgggagcc 180 actactatca ccacttcgac ccggccacca tccggtccaa ccaccaccac cagggctacc 240 tcaacaagct catcaactcc acccacgagc tctggggtcc gatttgccgg cgttaacatc 300 gcgggttttg actttggctg taccacagat ggcacttgcg ttacctcgaa ggtttatcct 360 ccgttgaaga acttcaccgg ctcaaacaac taccccgatg gcatcggcca gatgcagcac 420 ttcgtcaacg aggacgggat gactattttc cgcttacctg tcggatggca gtacctcgtc 480 aacaacaatt tgggcggcaa tcttgattcc acgagcattt ccaagtatga tcagcttgtt 540 caggggtgcc tgtctctggg cgcatactgc atcgtcgaca tccacaatta tgctcgatgg 600 aacggtggga tcattggtca gggcggccct actaatgctc aattcacgag cctttggtcg 660 cagttggcat caaagtacgc atctcagtcg agggtgtggt tcggcatcat gaatgagccc 720 cacgacgtga acatcaacac ctgggctgcc acggtccaag aggttgtaac cgcaatccgc 780 aacgctggtg ctacgtcgca attcatctct ttgcctggaa atgattggca atctgctggg 840 gctttcatat ccgatggcag tgcagccgcc ctgtctcaag tcacgaaccc ggatgggtca 900 acaacgaatc tgatttttga cgtgcacaaa tacttggact cagacaactc cggtactcac 960

gccgaatgta ctacaaataa cattgacggc gccttttctc cgcttgccac ttggctccga: 1020

5: cagaacaatc gccaggctat cctgacagaa accggtggtg gcaacgttca gtcctgcata caagacatgt gccagcaaat ccaatatctc aaccagaact cagatgtcta tcttggctat 1080 1140

gttggttggg gtgccggatc atttgatagc acgtatgtcc tgacggaaac: accgactagc 1200

agtggtaact catggacgga cacatccttg gtcagctcgt gtctcgcaag aaag: 1254

15: <210> <211> <212> <213> 6 418 PRT Trichoderma reesei

<400>: 6

Met Asn 1: Lys Ser Val 5 Ala Pro Leu Leu Leu 10 Ala Ala Ser Ile Leu Tyr 15

25: Gly Gly Ala val Ala Gln 20 Gln Thr val Trp Gly Gln Cys Gly Gly 25 30 Ile

Gly Trp Ser Gly 35: Pro Thr Asn Cys 40 Ala Pro Gly Ser Ala Cys 45 Ser Thr

Leu Asn 50: Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys 55 Ile Pro Gly Ala Thr Thr 60 Ile Thr

35: Thr Ser Thr Arg 65 Pro Pro Ser Gly Pro Thr Thr Thr Thr Arg 70 75 Ala Thr 80

Ser Thr: Ser Ser Ser Thr 85 Pro Pro Thr Ser Ser Gly val Arg 90 Phe Ala 95

4S: Gly val Asn Ile Ala Gly Phe ASp 100 Phe Gly Cys 105 Thr Thr ASp Gly Thr 110

Cys val Thr Ser Lys 115: val Tyr Pro Pro Leu Lys 120 Asn Phe Thr Gly Ser 125

Asn Asn Tyr Pro Asp Gly 130: Ile Gly Gln Met Gln His 135 140 Phe Val Asn Glu

55: Asp Gly Met 145 Thr Ile Phe Arg 150 Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val 155 160

74

Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr 165 170 175

Asp Gln Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val

180 185 190

ASp Ile Bis Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly 195 200 205

Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser 210 215 220

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro 225 230 235 240

Bis Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Val 245 250 255

Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser Leu Pro 260 265 270

Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala 275 280 285

Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu 290 295 300

Ile Phe ASp val Bis Lys Tyr Leu ASp Ser ASp Asn Ser Gly Thr Bis 305 310 315 320

Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala 325 330 335

Thr Trp Leu Arg G1n Asn Asn Arg Gln Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly 340 345 350

Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln 355 360 365

Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly 370 375 380

Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val Leu Thr Glu Thr Pro Thr Ser 385 390 395 400

Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala 405 410 415

Arg Lys

<210> 7

<211> 702

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 7 atgaagttcc ttcaagtcct ccctgccctc ataccggccg ccctggccca aaccagctgt 60 gaccagtggg caaccttcac tggcaacggc tacacagtca gcaacaacct ttggggagca 120 tcagccggct ctggatttgg ctgcgtgacg gcggtatcgc tcagcggcgg ggcctcctgg 180 cacgcagact ggcagtggtc cggcggccag aacaacgtca agtcgtacca gaactctcag 240 attgccattc cccagaagag gaccgtcaac agcatcagca gcatgcccac cactgccagc 300 tggagctaca gcgggagcaa catccgcgct aatgttgcgt atgacttgtt caccgcagcc 360 aacccgaatc atgtcacgta ctcgggagac tacgaactca tgatctggct tggcaaatac 420 ggcgatattg ggccgattgg gtcctcacag ggaacagtca acgtcggtgg ccagagctgg 480 acgctctact atggctacaa cggagccatg caagtctatt cctttgtggc ccagaccaac 540 actaccaact acagcggaga tgtcaagaac ttcttcaatt atctccgaga caataaagga 600 tacaacgctg caggccaata tgttcttagc taccaatttg gtaccgagcc cttcacgggc 660 agtggaactc tgaacgtcgc atcctggacc gcatctatca ac 702

<210> 8

<211> 234

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 8

Met Lys Phe Leu G1n val Leu Pro Ala Leu 11e Pro Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15

Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr 20 25 30

Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys 35 40 45

Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp Bis Ala Asp Trp

50 55 60

5 Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln 65 70 75 80

Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro 85 90 95

Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val 100 105 110 15

Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn Bis Val Thr Tyr Ser 115 120 125

Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly 130 135 140

25 Pro I1e G1y Ser Ser G1n Gly Thr Val Asn Val G1y G1y G1n Ser Trp 145 150 155 160

Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln val Tyr Ser Phe val 165 170 175

Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe 180 185 190 35

Asn Tyr Leu Arg ASp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr val 195 200 205

Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu 210 215 220

4S Asn val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 225 230

<210> 9

<211> 726

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 9 55 atgaaggcaa ctctggttct cggctccctc attgtaggcg ccgtttccgc gtacaaggcc 60

accaccacgc gctactacga tgggcaggag ggtgcttgcg gatgcggctc gagctccggc 120

gcattcccgt ggcagctcgg catcggcaac ggagtctaca cggctgccgg ctcccaggct 180

ctcttcgaca cggccggagc ttcatggtgc ggcgccggct gcggtaaatg ctaccagctc 240 acctcgacgg gccaggcgcc ctgctccagc tgcggcacgg gcggtgctgc tggccagagc 300 atcatcgtca tggtgaccaa cctgtgcccg aacaatggga acgcgcagtg gtgcccggtg 360 gtcggcggca ccaaccaata cggctacagc taccatttcg acatcatggc gcagaacgag 420 atctttggag acaatgtcgt cgtcgacttt gagcccattg cttgccccgg gcaggctgcc 480 tctgactggg ggacgtgcct ctgcgtggga cagcaagaga cggatcccac gcccgtcctc 540 ggcaacgaca cgggctcaac tcctcccggg agctcgccgc cagcgacatc gtcgagtccg 600 ccgtctggcg gcggccagca gacgctctat ggccagtgtg gaggtgccgg ctggacggga 660 cctacgacgt gccaggcccc agggacctgc aaggttcaga accagtggta ctcccagtgt 720 cttcct 726

<210> 10

<211> 242

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 10

Met Lys Ala Thr Leu Val Leu G1y Ser Leu Ile Val G1y Ala Val Ser 1 5 10 15

Ala Tyr Lys Ala Thr Thr Thr Arg Tyr Tyr ASp G1y G1n G1u Gly Ala 20 25 30

Cys Gly Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Phe Pro Trp Gln Leu Gly Ile 35 40 45

Gly Asn Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gly Ser Gln Ala Leu Phe Asp Thr 50 55 60

Ala Gly Ala Ser Trp Cys Gly Ala Gly Cys Gly Lys Cys Tyr Gln Leu

65 70 75 80

Thr Ser Thr Gly Gln Ala Pro Cys Ser Ser Cys Gly Thr Gly Gly Ala 85 90 95

Ala Gly Gln Ser Ile Ile Val Met Val Thr Asn Leu Cys Pro Asn Asn 100 105 110

Gly Asn Ala Gln Trp Cys Pro Val Val Gly Gly Thr Asn Gln Tyr Gly 115 120 125

Tyr Ser Tyr His Phe Asp Ile Met Ala Gln Asn Glu Ile Phe Gly Asp 130 135 140

Asn Val Val Val ASp Phe Glu Pro Ile Ala Cys Pro Gly Gln Ala Ala 145 150 155 160

Ser ASp Trp Gly Thr Cys Leu Cys val Gly Gln Gln Glu Thr ASp Pro 165 170 175

Thr Pro Val Leu Gly Asn Asp Thr Gly Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 180 185 190

Pro Pro Ala Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gln Gln Thr 195 200 205

Leu Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ala Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys 210 215 220

Gln Ala Pro Gly Thr Cys Lys Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys 225 230 235 240

Leu Pro

<210> 11

<211> 923

<212> ADN

<213> Humicola insolens

<400> 11 atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60 gccgctgatg gcaggtccac ccgctactgg gactgctgca agccttcgtg cggctgggcc 120 aagaaggctc ccgtgaacca gcctgtcttt tcctgcaacg ccaacttcca gcgtatcacg 180 gacttcgacg ccaagtccgg ctgcgagccg ggcggtgtcg cctactcgtg cgccgaccag 240 accccatggg ctgtgaacga cgacttcgcg ctcggttttg ctgccacctc tattgccggc 300 agcaatgagg cgggctggtg ctgcgcctgc tacgagctca ccttcacatc cggtcctgtt 360 gctggcaaga agatggtcgt ccagtccacc agcactggcg gtgatcttgg cagcaaccac 420 ttcgatctca acatccccgg cggcggcgtc ggcatcttcg acggatgcac tccccagttc 480 ggcggtctgc ccggccagcg ctacggcggc atctcgtccc gcaacgagtg cgatcggttc 540 cccgacgccc tcaagcccgg ctgctactgg cgcttcgact ggttcaagaa cgccgacaat 600

ccgagcttca gcttccgtca ggtccagtgc ccagccgagc tcgtcgctcg caccggatgc cgccgcaacg acgacggcaa cttccctgcc gtccagatcc cctccagcag caccagctct ccggtcaacc agcctaccag caccagcacc acgtccacct ccaccacctc gagcccgcca gtccagccta cgactcccag cggctgcact gctgagaggt gggctcagtg cggcggcaat ggctggagcg gctgcaccac ctgcgtcgct ggcagcactt gcacgaagat taatgactgg: 660 720 780 840 900

taccatcagt gcctgtagaa: ttc 923

<210> <211> <212> <213>: 12 305 PRT Humicola insolens

<400>: 12

Met Arg Ser Ser 1: Pro Leu 5 Leu Arg Ser Ala 10 Val Val Ala Ala Leu 15 Pro

val: Leu Ala Leu 20 Ala Ala ASp Gly Arg 25 Ser Thr Arg Tyr Trp ASp Cys 30

Cys Lys: Pro Ser 35 Cys Gly Trp Ala Lys Lys 40 Ala Pro Val 45 Asn Gln Pro

val: Phe 50 Ser Cys Asn Ala Asn 55 Phe Gln Arg 11e Thr 60 ASp Phe ASp Ala

Lys 65: Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly 70 Val Ala Tyr Ser Cys 75 Ala ASp Gln 80

Thr Pro Trp Ala: Val 85 Asn Asp Asp Phe Ala Leu 90 Gly Phe Ala Ala Thr 95

Ser: Ile Ala Gly 100 Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys 105 Ala Cys Tyr Glu 110

Leu: Thr Phe 115 Thr Ser Gly Pro Val 120 Ala G1y Lys Lys Met Val 125 Val G1n

Ser Thr 130: Ser Thr G1y Gly Asp 135 Leu G1y Ser Asn His 140 Phe Asp Leu Asn

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly 145 150: I le Phe Asp Gly Cys 155 Thr Pro Gln Phe 160

Gly Gly Leu: Pro Gly Gln 165 Arg Tyr Gly Gly 170 Ile Ser Ser Arg Asn 175 Glu

Cys ASp Arg: Phe 180 Pro ASp Ala Leu Lys 185 Pro Gly Cys Tyr Trp Arg 190 Phe

ASp Trp Phe Lys 195: Asn Ala ASp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg 200 205 Gln val

Gln: Cys 210 Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg 215 Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 220

Asp Gly Asn 225: Phe Pro Ala Val 230 Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr 235 Ser Ser 240

Pro Val Asn: Gln Pro Thr 245 Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 250 255

Ser Ser Pro Pro Val 260: Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys 265 Thr Ala Glu 270

Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn 275 280: Gly Trp Ser Gly Cys 285 Thr Thr Cys

Val: Ala Gly Ser 290 Thr Cys Thr Lys 295 Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys 300

Leu 305

<210> <211> <212> <213>: 13 1188 ADN Myceliophthora thermophila

<400> 13 cgacttgaaa cgccccaaat gaagtcctcc atcctcgcca gcgtcttcgc cacgggcgcc: 60

gtggctcaaa gtggtccgtg gcagcaatgt ggtggcatcg gatggcaagg atcgaccgac: 120

tgtgtgtcgg gctaccactg cgtctaccag aacgattggt acagccagtg cgtgcctggc: 180

gcggcgtcga caacgctgca gacatcgacc acgtccaggc: ccaccgccac cagcaccgcc 240

cctccgtcgt: ccaccacctc gcctagcaag ggcaagctga agtggctcgg cagcaacgag 300

tcgggcgccg agttcgggga gggcaattac cccggcctct ggggcaagca cttcatcttc: 360

ccgtcgactt cggcgattca gacgctcatc aatgatggat acaacatctt ccggatcgac 420 ttctcgatgg agcgtctggt gcccaaccag ttgacgtcgt ccttcgacca gggttacctc 480 cgcaacctga ccgaggtggt caacttcgtg acgaacgcgg gcaagtacgc cgtcctggac 540 ccgcacaact acggccggta ctacggcaac atcatcacgg acacgaacgc gttccggacc 600 ttctggacca acctggccaa gcagttcgcc tccaactcgc tcgtcatctt cgacaccaac 660 aacgagtaca acacgatgga ccagaccctg gtgctcaacc tcaaccaggc cgccatcgac 720 ggcatccggg ccgccggcgc gacctcgcag tacatcttcg tcgagggcaa cgcgtggagc 780 ggggcctgga gctggaacac gaccaacacc aacatggccg ccctgacgga cccgcagaac 840 aagatcgtgt acgagatgca ccagtacctc gactcggaca gctcgggcac ccacgccgag 900 tgcgtcagca gcaccatcgg cgcccagcgc gtcgtcggag ccacccagtg gctccgcgcc 960 aacggcaagc tcggcgtcct cggcgagttc gccggcggcg ccaacgccgt ctgccagcag 1020 gccgtcaccg gcctcctcga ccacctccag gacaacagcg acgtctggct gggtgccctc 1080 tggtgggccg ccggtccctg gtggggcgac tacatgtact cgttcgagcc tccttcgggc 1140 accggctatg tcaactacaa ctcgatcttg aagaagtact tgccgtaa 1188

<210> 14

<211> 389

<212> PRT

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 14

Met Lys Ser Ser Ile Leu Ala Ser Val Phe Ala Thr Gly Ala Val Ala 1 5 10 15

Gln Ser Gly Pro Trp Gln Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Gln Gly Ser 20 25 30

Thr ASp Cys val Ser Gly Tyr Bis Cys val Tyr Gln Asn ASp Trp Tyr 35 40 45

Ser Gln Cys Val Pro Gly Ala Ala Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ser Thr 50 55 60

Thr Ser Arg Pro Thr Ala Thr Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ser Th r Thr 65 70 75 80

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Leu Lys Trp Leu Gly Ser Asn Glu Ser Gly 85 90 95

Ala Glu Phe Gly Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Leu Trp Gly Lys His Phe 100 105 110

11e Phe Pro Ser Thr Ser Ala 11e Gln Thr Leu 11e Asn ASp Gly Tyr 115 120 125

Asn Ile Phe Arg 11e ASp Phe Ser Met Glu Arg Leu val Pro Asn Gln 130 135 140

Leu Thr Ser Ser Phe Asp Gln Gly Tyr Leu Arg Asn Leu Thr Glu Val 145 150 155 160

Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Val Leu Asp Pro His 165 170 175

Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn 11e Ile Thr Asp Thr Asn Ala Phe 180 185 190

Arg Thr Phe Trp Thr Asn Leu Ala Lys Gln Phe Ala Ser Asn Ser Leu 195 200 205

Val Ile Phe ASp Thr Asn Asn Glu Tyr Asn Thr Met ASp Gln Thr Leu 210 215 220

Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala 11e Asp Gly 11e Arg Ala Ala Gly 225 230 235 240

Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly Asn Ala Trp Ser Gly Ala 245 250 255

Trp Ser Trp Asn Thr Thr Asn Thr Asn Met Ala Ala Leu Thr ASp Pro 260 265 270

Gln Asn Lys 11e Val Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu ASp Ser ASp Ser 275 280 285

Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Ala Gln Arg 290 295 300

val val Gly Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Leu Gly val 305 310 315 320

Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Ala Val Cys Gln Gln Ala Val

325 330 335

Thr Gly Leu Leu ASp Bis Leu Gln ASp Asn Ser ASp val Trp Leu Gly 340 345 350

Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly ASp Tyr Met Tyr Ser 355 360 365

Phe G!u Pro Pro Ser Gly Thr Gly Tyr Val Asn Tyr Asn Ser Ile Leu 370 375 380

Lys Lys Tyr Leu Pro 385

<210> 15

<211> 1232

<212> ADN

<213> Basidiomycete CBS 495.95

<400> 1 5 ggatccactt agtaacggcc gccagtgtgc tggaaagcat gaagtctctc ttcctgtcac 60 ttgtagcgac cgtcgcgctc agctcgccag tattctctgt cgcagtctgg gggcaatgcg 120 gcggcattgg cttcagcgga agcaccgtct gtgatgcagg cgccggctgt gtgaagctca 180 acgactatta ctctcaatgc caacccggcg ctcccactgc tacatccgcg gcgccaagta 240 gcaacgcacc gtccggcact tcgacggcct cggccccctc ctccagcctt tgctctggca 300 gccgcacgcc gttccagttc ttcggtgtca acgaatccgg cgcggagttc ggcaacctga 360 acatccccgg tgttctgggc accgactaca cctggccgtc gccatccagc attgacttct 420 tcatgggcaa gggaatgaat accttccgta ttccgttcct catggagcgt cttgtccccc 480 ctgccactgg catcacagga cctctcgacc agacgtactt gggcggcctg cagacgattg 540 tcaactacat caccggcaaa ggcggctttg ctctcattga cccgcacaac tttatgatct 600 acaatggcca gacgatctcc agtaccagcg acttccagaa gttctggcag aacctcgcag 660 gagtgtttaa atcgaacagt cacgtcatct tcgatgttat gaacgagcct cacgatattc 720 ccgcccagac cgtgttccaa ctgaaccaag ccgctgtcaa tggcatccgt gcgagcggtg 780 cgacgtcgca gctcattctg gtcgagggca caagctggac tggagcctgg acctggacga 840 cctctggcaa cagcgatgca ttcggtgcca ttaaggatcc caacaacaac gtcgcgatcc 900 agatgcatca gtacctggat agcgatggct ctggcacttc gcagacctgc gtgtctccca 960 ccatcggtgc cgagcggttg caggctgcga ctcaatggtt gaagcagaac aacctcaagg 1020

gcttcctggg cgagatcggc gccggctcta actccgcttg catcagcgct gtgcagggtg: 1080

cgttgtgttc gatgcagcaa tctggtgtgt ggctcggcgc tctctggtgg gctgcgggcc: 1140

5: cgtggtgggg cgactactac cagtccatcg agccgccctc tggcccggcg gtgtccgcga 1200

tcctcccgca ggccctgctg ccgttcgcgt: aa 1232

<210> <211> <212> <213>: 16 397 PRT Basidiornycete CBS 495 .95

15: <400> 16

Met 1: Lys Ser Leu Phe Leu 5 Ser Leu Val Ala Thr Val Ala Leu 10 Ser Ser 15

Pro Val: Phe Ser Val Ala Val 20 Trp G1y 25 Gln Cys Gly G1y Ile Gly Phe 30

25: Ser G1y Ser Thr 35 Val cys ASp Ala G1y Ala G1y 40 cys Val 45 Lys Leu Asn

Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln Pro G1y Ala 50 55: Pro Thr Ala Thr 60 Ser Ala

35: Ala Pro Ser Ser Asn Ala 65 70 Pro Ser G1y Thr Ser Thr Ala Ser Ala Pro 75 80

Ser Ser Ser Leu: Cys 85 Ser Gly Ser Arg Thr 90 Pro Phe Gln Phe Phe Gly 95

Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn 100 105: Leu Asn Ile Pro Gly Val 110

4S: Leu Gly Thr ASp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser 115 120 Ile ASp 125 Phe Phe

Met: Gly Lys Gly Met Asn 130 Thr Phe 135 Arg Ile Pro Phe Leu Met Glu Arg 140

55: Leu Val 145 Pro Pro Ala Thr Gly 150 Ile Thr Gly Pro Leu 155 Asp Gln Thr Tyr 160

Leu: Gly Gly Leu Gln Thr 165 Ile Val Asn Tyr 170 Ile Thr Gly Lys Gly Gly 175

85

Phe Ala Leu 1le Asp Pro His Asn Phe Met 1le Tyr Asn Gly Gln Thr 180 185 190

11e Ser Ser Thr Ser ASp Phe G1n Lys Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly 195 200 205

Val Phe Lys Ser Asn Ser His Val 1le Phe Asp Val Met Asn G1u Pro 210 215 220

His ASp 11e Pro Ala G1n Thr val Phe Gln Leu Asn G1n Ala Ala val 225 230 235 240

Asn G1y 11e Arg Ala Ser Gly Ala Thr Ser G1n Leu 11e Leu val Glu 245 250 255

Gly Thr Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ser Gly Asn Ser 260 265 270

ASp Ala Phe G1y Ala 11e Lys ASp Pro Asn Asn Asn val Ala 11e Gln 275 280 285

Met Bis Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Gln Thr Cys 290 295 300

val Ser Pro Thr 11e G1y Ala G1u Arg Leu G1n Ala Ala Thr G1n Trp 305 310 315 320

Leu Lys Gln Asn Asn Leu Lys G1y Phe Leu G1y Glu 11e Gly Ala Gly 325 330 335

Ser Asn Ser Ala Cys 11e Ser Ala Val Gln Gly Ala Leu Cys Ser Met 340 345 350

Gln G1n Ser G1y val Trp Leu G1y Ala Leu Trp Trp Ala Ala G1y Pro 355 360 365

Trp Trp Gly Asp Tyr Tyr Gln Ser 11e Glu Pro Pro Ser Gly Pro Ala 370 375 380

Val Ser Ala 11e Leu Pro Gln Ala Leu Leu Pro Phe Ala 385 390 395

<210> 17

<211> 1303

<212> ADN

<213> Basidiornycete CBS 495 . 95

<400> 17 ggaaagcgtc agtatggtga aatttgcgct tgtggcaact gtcggcgcaa tcttgagcgc 60 ttetgeggcc aatgcggett ctatetaeca geaatgtgga ggcattggat ggtetgggtc 120 caetgtttgc gaegccggte tcgcttgegt tatcctcaat gcgtaetaet ttcagtgctt 180 gaegcecgcc gegggccaga caacgaeggg etegggcgea ecggcgteaa cateaacete 240 tcaeteaacg gteactaegg ggageteaca eteaacaaee gggacgaegg cgaegaaaac 300 aaetaecact eegtcgaeea ccacgaeect aeecgccate tctgtgtetg gtcgegtctg 360 ctetggctcc aggacgaagt tcaagttett cggtgtgaat gaaageggeg ccgaattcgg 420 gaaeaetgct tggccaggge agctegggaa agactataea tggccttegc ctageagcgt 480 ggaetacttc atgggggetg gatteaatac attccgtate accttettga tggagegtat 540 gagecetccg getaccggae tcactggecc attcaaccag aegtacetgt cgggeetcac 600 caeeattgtc gaetacatea cgaaeaaagg aggatacget ettattgaec cccaeaactt 660 catgcgttac aaeaacggea taateageag eaeatctgae ttcgcgaett ggtggagcaa 720 tttggecact gtattcaaat ccacgaagaa egecatctte gacateeaga acgageegta 780 cggaatcgat gegcagaeeg tataegaact gaatcaaget gccateaatt cgateegcgc 840 cgetggcgct aegtcacagt tgattetggt tgaaggaaeg tcataeaetg gagettggac 900 gtgggtctcg teeggaaaeg gagctgettt egeggccgtt acggateett acaaeaacac 960 ggeaattgaa atgcaccaat acctegaeag egacggttet gggacaaaeg aagaetgtgt 1020 cteetecacc attgggtege aacgteteca agetgccaet gcgtggetgc aacaaacagg 1080 acteaaggga ttectcggag agacgggtgc tgggtcgaat tcccagtgea tcgaegccgt 1140 gttegatgaa etttgctata tgcaaeagca aggcggctce tggatcggtg cactetggtg 1200 ggetgegggt eeetggtggg gcacgtaeat ttactcgatt gaaccteega gcggtgccgc 1260 tateceagaa gtecttcete agggtetegc teeattccte tag 1303

<210> 18

<211> 429

<212> PRT

<213> Sasidiornycete CSS 495 . 95

<400> 18

Met Val Lys Phe Ala Leu Val Ala Thr Val G1y Ala Ile Leu Ser Ala 1 5 10 15

Ser Ala Ala Asn Ala Ala Ser Ile Tyr Gln Gln Cys Gly Gly Ile Gly 20 25 30

Trp Ser Gly Ser Thr val Cys ASp Ala Gly Leu Ala Cys val lle Leu 35 40 45

Asn Ala Tyr Tyr Phe Gln Cys Leu Thr Pro Ala Ala Gly Gln Thr Thr 50 55 60

Thr Gly Ser Gly Ala Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Bis Ser Thr val 65 70 75 80

Thr Thr Gly Ser Ser Bis Ser Thr Thr Gly Thr Thr Ala Thr Lys Thr 85 90 95

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Thr Thr Thr Leu Pro Ala Ile Ser Val Ser 100 105 110

Gly Arg val Cys Ser Gly Ser Arg Thr Lys Phe Lys Phe Phe Gly val 115 120 125

Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Thr Ala Trp Pro Gly Gln Leu 130 135 140

Gly Lys ASp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser val ASp Tyr Phe Met 145 150 155 160

Gly Ala Gly Phe Asn Thr Phe Arg Ile Thr Phe Leu Met Glu Arg Met 165 170 175

Ser Pro Pro Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Phe Asn Gln Thr Tyr Leu 180 185 190

Ser Gly Leu Thr Thr Ile val ASp Tyr Ile Thr Asn Lys Gly Gly Tyr 195 200 205

Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Phe Met Arg Tyr Asn Asn Gly Ile Ile 210 215 220

Ser Ser Thr Ser Asp Phe Ala Thr Trp Trp Ser Asn Leu Ala Thr Val 225 230 235 240

Phe Lys Ser Thr Lys Asn Ala Ile Phe Asp Ile Gln Asn Glu Pro Tyr 245 250 255

Gly: Ile Asp Ala Gln Thr Val 260 Tyr Glu Leu 265 Asn Gln Ala Ala !le Asn 270

Ser Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr 275 280: Ser Gln Leu !le Leu Val Glu Gly 285

Thr Ser Tyr Thr 290: Gly Ala Trp Thr Trp val Ser Ser Gly Asn Gly Ala 295 300

Ala Phe Ala Ala Val 305: Thr Asp 310 Pro Tyr Asn Asn 315 Thr Ala !le Glu Met 320

His: Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Asn Glu Asp Cys 325 330 335 Val

Ser Ser Thr: Ile Gly Ser Gln Arg 340 Leu Gln Ala Ala Thr Ala Trp Leu 345 350

Gln Gln Thr Gly Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu Thr Gly Ala Gly Ser 355 360 365

Asn Ser Gln Cys 370: !le ASp Ala val Phe ASp Glu Leu Cys Tyr Met Gln 375 380

Gln Gln Gly Gly 385: Ser Trp !le Gly 390 Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro 395 400

Trp Trp Gly Thr: Tyr 405 Ile Tyr Ser Ile Glu Pro Pro Ser Gly Ala Ala 410 415

Ile Pro Glu val Leu 420: Pro Gln Gly Leu Ala Pro Phe Leu 425

<210> <211> <212> <213>: 19 1580 ADN Thielavia terrestris

<400> 19 agccccccgt tcaggcacac ttggcatcag atcagcttag: cagcgcctgc acagcatgaa 60

gctctcgcag tcggccgcgc: tggcggcact caccgcgacg gcgctcgccg ccccctcgcc 120

cacgacgccg caggcgccga: ggcaggcttc agccggctgc tcgtctgcgg tcacgctcga 180

cgccagcacc aacgtttgga agaagtacac gctgcacccc: aacagctact accgcaagga 240

ggttgaggcc gcggtggcgc agatctcgga cccggacctc gccgccaagg ccaagaaggt 300 ggccgacgtc ggcaccttcc tgtggctcga ctcgatcgag aacatcggca agctggagcc 360 ggcgatccag gacgtgccct gcgagaacat cctgggcctg gtcatctacg acctgccggg 420 ccgcgactgc gcggccaagg cgtccaacgg cgagctcaag gtcggcgaga tcgaccgcta 480 caagaccgag tacatcgaca gtgagtgctg ccccccgggt tcgagaagag cgtgggggaa 540 agggaaaggg ttgactgact gacacggcgc actgcagaga tcgtgtcgat cctcaaggca 600 caccccaaca cggcgttcgc gctggtcatc gagccggact cgctgcccaa cctggtgacc 660 aacagcaact tggacacgtg ctcgagcagc gcgtcgggct accgcgaagg cgtggcttac 720 gccctcaaga acctcaacct gcccaacgtg atcatgtacc tcgacgccgg ccacggcggc 780 tggctcggct gggacgccaa cctgcagccc ggcgcgcagg agctagccaa ggcgtacaag 840 aacgccggct cgcccaagca gctccgcggc ttctcgacca acgtggccgg ctggaactcc 900 tggtgagctt ttttccattc catttcttct tcctcttctc tcttcgctcc cactctgcag 960 ccccccctcc cccaagcacc cactggcgtt ccggcttgct gactcggcct ccctttcccc 1020 gggcaccagg gatcaatcgc ccggcgaatt ctcccaggcg tccgacgcca agtacaacaa 1080 gtgccagaac gagaagatct acgtcagcac cttcggctcc gcgctccagt cggccggcat 1140 gcccaaccac gccatcgtcg acacgggccg caacggcgtc accggcctgc gcaaggagtg 1200 gggtgactgg tgcaacgtca acggtgcagg ttcgttgtct tctttttctc ctcttttgtt 1260 tgcacgtcgt ggtccttttc aagcagccgt gtttggttgg gggagatgga ctccggctga 1320 tgttctgctt cctctctagg cttcggcgtg cgcccgacga gcaacacggg cctcgagctg 1380 gccgacgcgt tcgtgtgggt caagcccggc ggcgagtcgg acggcaccag cgacagctcg 1440 tcgccgcgct acgacagctt ctgcggcaag gacgacgcct tcaagccctc gcccgaggcc 1500 ggcacctgga acgaggccta cttcgagatg ctgctcaaga acgccgtgcc gtcgttctaa 1560 gacggtccag catcatccgg 1580

<210> 20

<211> 396

<212> PRT

<213> Thie1avia terrestris

<400> 20

Met Lys Leu Ser Gln Ser Ala Ala Leu Ala Ala Leu Thr Ala Thr Ala 1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Ser Pro Thr Thr 20: Pro Gln Ala Pro Arg 25 Gln 30 Ala Ser

5: Ala Gly Cys 35 Ser Ser Ala Val Thr Leu Asp Ala Ser Thr Asn 40 45 Val Trp

Lys Lys Tyr Thr 50: Leu Bis Pro Asn 55 Ser Tyr Tyr Arg Lys 60 Glu Val Glu

15: Ala Ala Val Ala 65 Gln Ile Ser Asp 70 Pro Asp Leu Ala Ala Lys 75 Ala Lys 80

Lys: Val Ala Asp Val 85 Gly Thr Phe Leu Trp Leu Asp Ser Ile Glu Asn 90 95

Ile Gly Lys: Leu 100 Glu Pro Ala Ile Gln Asp Val 105 Pro Cys Glu 110 Asn Ile

25: Leu Gly Leu Val 115 Ile Tyr ASp Leu 120 Pro Gly Arg ASp cys Ala Ala Lys 125

Ala Ser Asn 130: Gly Glu Leu Lys Val Gly Glu 135 Ile Asp Arg Tyr Lys 140 Thr

35: Glu Tyr 145 Ile Asp Lys Ile Val 150 Ser Ile Leu Lys 155 Ala His Pro Asn Thr 160

Ala Phe Ala Leu: val 165 Ile Glu Pro ASp Ser Leu 170 Pro Asn Leu Val 175 Thr

Asn Ser Asn: Leu 180 Asp Thr Cys Ser Ser Ser Ala Ser Gly Tyr Arg 185 190 Glu

4S: Gly Val Ala Tyr 195 Ala Leu Lys Asn 200 Leu Asn Leu Pro Asn Val 205 Ile Met

Tyr Leu 210: Asp Ala Gly Bis Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asp Ala Asn 215 220 Leu

55: Gln Pro Gly Ala 225 Gln Glu 230 Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Asn Ala Gly Ser 235 240

Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ser Thr Asn Val Ala Gly Trp Asn Ser 245 250 255

Trp Asp Gln Ser Pro Gly Glu Phe Ser Gln Ala Ser Asp Ala Lys Tyr 260 265 270

Asn Lys Cys Gln Asn Glu Lys I le Tyr val Ser Thr Phe Gly Ser Ala 275 280 285

Leu Gln Ser Ala Gly Met Pro Asn His Ala Ile Val Asp Thr Gly Arg 290 295 300

Asn Gly val Thr Gly Leu Arg Lys Glu Trp Gly ASp Trp Cys Asn val 305 310 315 320

Asn Gly Ala Gly Phe Gly val Arg Pro Thr Ser Asn Thr Gly Leu Glu 325 330 335

Leu Ala Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly 340 345 350

Thr Ser ASp Ser Ser Ser Pro Arg Tyr ASp Ser Phe Cys Gly Lys ASp 355 360 365

Asp Ala Phe Lys Pro Ser Pro Glu Ala Gly Thr Trp Asn Glu Ala Tyr 370 375 380

Phe Glu Met Leu Leu Lys Asn Ala val Pro Ser Phe 385 390 395

<210> 21

<211> 1203

<212> ADN

<213> Thielavia terrestris

<400> 21 atgaagtacc tcaacctcct cgcagctctc ctcgccgtcg ctcctctctc cctcgctgca 60

cccagcatcg aggccagaca gtcgaacgtc aacccataca tcggcaagag cccgctcgtt 120

attaggtcgt acgcccaaaa gcttgaggag accgtcagga ccttccagca acgtggcgac 180

cagctcaacg ctgcgaggac acggacggtg cagaacgttg cgactttcgc ctggatctcg 240

gataccaatg gtattggagc cattcgacct ctcatccaag atgctctcgc ccagcaggct 300

cgcactggac agaaggtcat cgtccaaatc gtcgtctaca acctcccaga tcgcgactgc 360

tctgccaacg cctcgactgg agagttcacc gtaggaaacg acggtctcaa ccgatacaag 420

aactttgtca acaccatcgc ccgcgagctc tcgactgctg acgctgacaa gctccacttt 480

gccctcctcc tcgaacccga cgcacttgcc aacctcgtca ccaacgcgaa tgcccccagg 540 tgccgaatcg ccgctcccgc ttacaaggag ggtatcgcct acaccctcgc caccttgtcc 600 aagcccaacg tcgacgtcta catcgacgcc gccaacggtg gctggctcgg ctggaacgac 660 aacctccgcc ccttcgccga actcttcaag gaagtctacg acctcgcccg ccgcatcaac 720 cccaacgcca aggtccgcgg cgtccccgtc aacgtctcca actacaacca gtaccgcgct 780 gaagtccgcg agcccttcac cgagtggaag gacgcctggg acgagagccg ctacgtcaac 840 gtcctcaccc cgcacctcaa cgccgtcggc ttctccgcgc acttcatcgt tgaccaggga 900 cgcggtggca agggcggtat caggacggag tggggccagt ggtgcaacgt taggaacgct 960 gggttcggta tcaggcctac tgcggatcag ggcgtgctcc agaacccgaa tgtggatgcg 1020 attgtgtggg ttaagccggg tggagagtcg gatggcacga gtgatttgaa ctcgaacagg 1080 tatgatccta cgtgcaggag tccggtggcg catgttcccg ctcctgaggc tggccagtgg 1140 ttcaacgagt atgttgttaa cctcgttttg aacgctaacc cccctcttga gcctacctgg 1200 taa 1203

<210> 22

<211> 400

<212> PRT

<213> Thielavia terrestris

<400> 22

Met Lys Tyr Leu Asn Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Val Ala Pro Leu 1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Pro Ser 11e Glu Ala Arg Gln Ser Asn Val Asn Pro 20 25 30

Tyr Ile Gly Lys Ser Pro Leu Val 11e Arg Ser Tyr Ala Gln Lys Leu 35 40 45

Glu Glu Thr Val Arg Thr Phe Gln Gln Arg Gly ASp Gln Leu Asn Ala 50 55 60

Ala Arg Thr Arg Thr val Gln Asn val Ala Thr Phe Ala Trp 11e Ser 65 70 75 80

ASp Thr Asn Gly 11e Gly Ala 11e Arg Pro Leu 11e Gln ASp Ala Leu 85 90 95

Ala Gln Gln Ala Arg Thr Gly Gln Lys Val 11e Val Gln 11e Val Val

100: 105 110

5: Tyr Asn Leu 115 Pro ASp Arg ASp Cys 120 Ser Ala Asn Ala Ser Thr Gly 125 Glu

Phe: Thr 130 val Gly Asn ASp Gly 135 Leu Asn Arg Tyr Lys 140 Asn Phe val Asn

Thr 145: Ile Ala Arg Glu Leu 150 Ser Thr Ala Asp Ala Asp Lys 155 Leu His Phe 160

15: Ala Leu Leu Leu Glu 165 Pro Asp Ala Leu Ala 170 Asn Leu Val Thr Asn Ala 175

Asn Ala: Pro Arg Cys Arg 180 Ile Ala Ala Pro Ala Tyr Lys 185 Glu Gly 190 Ile

25: Ala Tyr Thr Leu 195 Ala Thr Leu Ser Lys 200 Pro Asn Val ASp 205 val Tyr Ile

ASp: Ala Ala Asn 210 Gly Gly Trp Leu 215 Gly Trp Asn ASp 220 Asn Leu Arg Pro

Phe Ala Glu 225: Leu Phe Lys 230 Glu Val Tyr Asp Leu Ala 235 Arg Arg Ile Asn 240

35: Pro Asn Ala Lys Val 245 Arg Gly Val Pro Val 250 Asn Val Ser Asn Tyr Asn 255

Gln: Tyr Arg Ala Glu val Arg 260 Glu Pro Phe 265 Thr Glu Trp Lys ASp 270 Ala

4S: Trp ASp Glu Ser 275 Arg Tyr val Asn 280 val Leu Thr Pro Bis 285 Leu Asn Ala

val: Gly 290 Phe Ser Ala Bis Phe 295 Ile val ASp Gln Gly Arg Gly Gly Lys 300

Gly Gly 305: Ile Arg Thr Glu 310 Trp Gly Gln Trp Cys 315 Asn Val Arg Asn Ala 320

55

Gly: Phe Gly Ile Arg Pro Thr Ala Asp Gln Gly Val Leu Gln Asn Pro

325: 330 335

94

Asn Val Asp Ala Ile Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly 340 345 350

Thr Ser Asp Leu Asn Ser Asn Arg Tyr Asp Pro Thr Cys Arg Ser Pro 355 360 365

val Ala His Val Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln Trp Phe Asn Glu Tyr 370 375 380

Val Val Asn Leu Val Leu Asn Ala Asn Pro Pro Leu Glu Pro Thr Trp 385 390 395 400

<210> 23

<211> 1501

<212> ADN

<213> Thielavia terrestris

<400> 23 gccgttgtca agatgggcca gaagacgctg cacggattcg ccgccacggc tttggccgtt 60 ctcccctttg tgaaggctca gcagcccggc aacttcacgc cggaggtgca cccgcaactg 120 ccaacgtgga agtgcacgac cgccggcggc tgcgttcagc aggacacttc ggtggtgctc 180 gactggaact accgttggat ccacaatgcc gacggcaccg cctcgtgcac gacgtccagc 240 ggggtcgacc acacgctgtg tccagatgag gcgacctgcg cgaagaactg cttcgtggaa 300 ggcgtcaact acacgagcag cggtgtcacc acatccggca gttcgctgac gatgaggcag 360 tatttcaagg ggagcaacgg gcagaccaac agcgtttcgc ctcgtctcta cctgctcggc 420 tcggatggaa actacgtaat gctcaagctg ctcggccagg agctgagctt cgatgtcgat 480 ctctccacgc tcccctgcgg cgagaacggc gcgctgtacc tgtccgagat ggacgcgacc 540 ggtggcagga accagtacaa caccggcggt gccaactacg gctcgggcta ctgtgacgcc 600 cagtgtcccg tgcagacgtg gatgaacggc acgctgaaca ccaacgggca gggctactgc 660 tgcaacgaga tggacatcct cgaggccaac tcccgcgcca acgcgatgac acctcacccc 720 tgcgccaacg gcagctgcga caagagcggg tgcggactca acccctacgc cgagggctac 780 aagagctact acggaccggg cctcacggtt gacacgtcga agcccttcac catcattacc 840 cgcttcatca ccgacgacgg cacgaccagc ggcaccctca accagatcca gcggatctat 900 gtgcagaatg gcaagacggt cgcgtcggct gcgtccggag gcgacatcat cacggcatcc 960 ggctgcacct cggcccaggc gttcggcggg ctggccaaca tgggcgcggc gcttggacgg 1020 ggcatggtgc tgaccttcag catctggaac gacgctgggg gctacatgaa ctggctcgac 1080 agcggcaaca acggcccgtg cagcagcacc gagggcaacc cgtccaacat cctggccaac 1140

tacccggaca cccacgtggt cttctccaac: atccgctggg gagacatcgg ctcgacggtc 1200

5: caggtctcgg gaggcggcaa cggcggctcg accaccacca cgtcgaccac cacgctgagg acctcgacca cgaccaccac caccgccccg acggccactg ccacgcactg gggacaatgc 1260 1320

ggcggaatcg gggtacgtca accgcctcct gcattctgtt gaggaagtta actaacgtgg: 1380

cctacgcagt ggactggacc: gaccgtctgc gaatcgccgt acgcatgcaa ggagctgaac 1440

ccctggtact accagtgcct ctaaagtatt gcagtgaagc catactccgt gctcggcatg: 1500

15: g 1501

<210> <211> <212> <213>: 24 464 PRT Thie1avia terrestris

<400>: 24

25: Met 1 G1y Gln Lys Thr Leu 5 Bis Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu 10 Ala val 15

Leu: Pro Phe val Lys 20 Ala Gln Gln Pro Gly Asn 25 Phe Thr Pro Glu Val 30

Bis: Pro Gln Leu 35 Pro Thr Trp Lys Cys 40 Thr Thr Ala Gly Gly Cys 45 Val

35: Gln Gln Asp 50 Thr Ser Val Val 55 Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Ile Bis 60

Asn Ala ASp Gly 65: Thr Ala Ser Cys 70 Thr Thr Ser Ser Gly val ASp 75 Bis 80

4S: Thr Leu Cys Pro ASp 85 Glu Ala Thr Cys Ala Lys 90 Asn Cys Phe val Glu 95

Gly val Asn: Tyr 100 Thr Ser Ser Gly val 105 Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu 110

Thr Met: Arg 115 Gln Tyr Phe Lys Gly Ser Asn 120 Gly Gln Thr Asn 125 Ser Val

55: Ser Pro Arg 130 Leu Tyr Leu Leu Gly 135 Ser Asp Gly Asn 140 Tyr Val Met Leu

Lys Leu Leu Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Leu 145 150 155 160

Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Asp Ala Thr 165 170 175

Gly Gly Arg Asn Gln Tyr Asn Thr Gly Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly 180 185 190

Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Met Asn Gly Thr Leu 195 200 205

Asn Thr Asn Gly Gln Gly Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu 210 215 220

Ala Asn Ser Arg Ala Asn Ala Met Thr Pro His Pro Cys Ala Asn Gly 225 230 235 240

Ser cys ASp Lys Ser G1y cys G1y Leu Asn Pro Tyr Ala Glu Gly Tyr 245 250 255

Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe 260 265 270

Thr Ile Ile Thr Arg Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Ser Gly Thr 275 280 285

Leu Asn Gln Ile Gln Arg Ile Tyr val Gln Asn Gly Lys Thr val Ala 290 295 300

Ser Ala Ala Ser Gly Gly Asp Ile Ile Thr Ala Ser Gly Cys Thr Ser 305 310 315 320

Ala Gln Ala Phe Gly Gly Leu Ala Asn Met Gly Ala Ala Leu Gly Arg 325 330 335

Gly Met val Leu Thr Phe Ser Ile Trp Asn Asp Ala Gly Gly Tyr Met 340 345 350

Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Asn Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly 355 360 365

Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Tyr Pro Asp Thr His Val Val Phe 370 375 380

Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Val Gln Val Ser Gly 385 390 395 400

Gly Gly Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Arg 405 410 415

Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ala Thr Ala Thr His 420 425 430

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr val Cys Glu 435 440 445

Ser Pro Tyr Ala Cys Lys Glu Leu Asn Pro Trp Tyr Tyr Gln Cys Leu 450 455 460

<210> 25

<211> 1368

<212> ADN

<213> Thie1avia terrestris

<400> 25 accgatccgc tcgaagatgg cgcccaagtc tacagttctg gccgcctggc tgctctcctc 60 gctggccgcg gcccagcaga tcggcaaagc cgtgcccgag gtccacccca aactgacaac 120 gcagaagtgc actctccgcg gcgggtgcaa gcctgtccgc acctcggtcg tgctcgactc 180 gtccgcgcgc tcgctgcaca aggtcgggga ccccaacacc agctgcagcg tcggcggcga 240 cctgtgctcg gacgcgaagt cgtgcggcaa gaactgcgcg ctcgagggcg tcgactacgc 300 ggcccacggc gtggcgacca agggcgacgc cctcacgctg caccagtggc tcaagggggc 360 cgacggcacc tacaggaccg tctcgccgcg cgtatacctc ctgggcgagg acgggaagaa 420 ctacgaggac ttcaagctgc tcaacgccga gctcagcttc gacgtcgacg tgtcccagct 480 cgtctgcggc atgaacggcg ccctgtactt ctccgagatg gagatggacg gcggccgcag 540 cccgctgaac ccggcgggcg ccacgtacgg cacgggctac tgcgacgcgc agtgccccaa 600 gttggacttt atcaacggcg aggtatttct tctctcttct gtttttcttt tccatcgctt 660 tttctgaccg gaatccgccc tcttagctca acaccaacca cacgtacggg gcgtgctgca 720 acgagatgga catctgggag gccaacgcgc tggcgcaggc gctcacgccg cacccgtgca 780 acgcgacgcg ggtgtacaag tgcgacacgg cggacgagtg cgggcagccg gtgggcgtgt 840 gcgacgaatg ggggtgctcg tacaacccgt ccaacttcgg ggtcaaggac tactacgggc 900 gcaacctgac ggtggacacg aaccgcaagt tcacggtgac gacgcagttc gtgacgtcca 960

acgggcgggc tgatccagaa tctgcaacgc ccatcggccg actggctcga tcctgcagca gcagcacgta

<210> 26

<211> 423

<212> PRT

ggacggcgag

ccacgcggtc gacggccacc cggcatggtg

cagcggcaac

gcacccggac caagagcgag

ctgaccgaga acggcgggcg tggacgcagc ctcatcttca gccgggccct gccagcgtca tgcagccact

<213> Thielavia terrestris

<400> 26

Met Ala Pro Lys Ser Thr Val Leu 1 5

tccggcggct gtacgtgcag gacggcgtgg

gggcgacgta cgacagcatc acggacggct

agcggggcgg gctcgcgcgc atgggcgagg

gcctgtgggt tgacaacggc ggcttcatga

gcaacgccac cgagggcgac ccggccctga

ccttctccaa catccgatgg ggcgagatcg

agagtagagc ttgtaatt

Ala Ala Trp Leu Leu Ser Ser Leu 10 15

Ala Ala Ala Gln Gln Ile Gly Lys Ala Val Pro Glu val His Pro Lys 20 25 30

Leu Thr Thr Gln Lys Cys Thr Leu Arg Gly Gly Cys Lys Pro val Arg 35 40 45

Thr Ser Val Val Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Leu His Lys Val Gly

50 55 60

ASp Pro Asn Thr Ser Cys Ser val Gly Gly ASp Leu Cys Ser ASp Ala 65 70 75 80

Lys Ser Cys Gly Lys Asn Cys Ala Leu Glu Gly val ASp Tyr Ala Ala 85 90 95

His Gly Val Ala Thr Lys Gly ASp Ala Leu Thr Leu His Gln Trp Leu 100 105 110

Lys Gly Ala ASp Gly Thr Tyr Arg Thr val Ser Pro Arg val Tyr Leu 115 120 125

Leu Gly Glu ASp Gly Lys Asn Tyr Glu ASp Phe Lys Leu Leu Asn Ala 130 135 140

Glu Leu Ser Phe ASp Val Asp Val Ser Gln Leu Val Cys Gly Met Asn 99

1020 1080 1140 1200 1260

145: 150 155 160

5: Gly Ala Leu Tyr Phe 165 Ser Glu Met Glu Met 170 ASp Gly Gly Arg Ser Pro 175

Leu Asn: Pro Ala Gly Ala Thr Tyr Gly 180 185 Thr Gly Tyr Cys ASp 190 Ala Gln

Cys: Pro Lys 195 Leu Asp Phe Ile Asn 200 Gly Glu Leu Asn Thr Asn 205 His Thr

15: Tyr Gly Ala Cys Cys 210 Asn Glu Met 215 Asp Ile Trp Glu 220 Ala Asn Ala Leu

Ala Gln Ala Leu 225: Thr Pro His 230 Pro Cys Asn Ala Thr Arg Val Tyr Lys 235 240

25: Cys ASp Thr Ala ASp 245 Glu Cys Gly Gln Pro Val 250 Gly val Cys ASp 255 Glu

Trp Gly Cys: Ser 260 Tyr Asn Pro Ser Asn 265 Phe Gly val Lys ASp Tyr Tyr 270

Gly Arg: Asn 275 Leu Thr Val Asp Thr 280 Asn Arg Lys Phe Thr Val 285 Thr Thr

35: Gln Phe 290 Val Thr Ser Asn Gly Arg Ala Asp Gly 295 Glu 300 Leu Thr Glu rle

Arg Arg Leu 305: Tyr val Gln 310 ASp Gly val val !le Gln Asn 315 Bis Ala val 320

4S: Thr Ala Gly Gly Ala Thr 325 Tyr ASp Ser Ile Thr ASp Gly 330 Phe Cys 335 Asn

Ala Thr: Ala Thr 340 Trp Thr Gln Gln Arg Gly Gly 345 Leu Ala Arg Met 350 Gly

Glu Ala: Ile Gly Arg Gly Met Val Leu 355 360 Ile Phe Ser Leu 365 Trp Val Asp

55: Asn Gly Gly 370 Phe Met Asn Trp Leu 375 Asp Ser Gly Asn 380 Ala Gly Pro Cys

100

Asn Ala Thr Glu Gly Asp Pro Ala Leu Ile Leu Gln Gln His Pro Asp 385 390 395 400

Ala Ser Val Thr Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr 405 410 415

Tyr Lys Ser Glu Cys Ser His 420

<210> 27

<211> 1011

<212> ADN

<213> Thielavia terrestris

<400> 27 atgaccctac ggctccctgt catcagcctg ctggcctcgc tggcagcagg cgccgtcgtc 60 gtcccacggg cggagtttca cccccctctc ccgacttgga aatgcacgac ctccgggggc 120 tgcgtgcagc agaacaccag cgtcgtcctg gaccgtgact cgaagtacgc cgcacacagc 180 gccggctcgc ggacggaatc ggattacgcg gcaatgggag tgtccacttc gggcaatgcc 240 gtgacgctgt accactacgt caagaccaac ggcaccctcg tccccgcttc gccgcgcatc 300 tacctcctgg gcgcggacgg caagtacgtg cttatggacc tcctcaacca ggagctgtcg 360 gtggacgtcg acttctcggc gctgccgtgc ggcgagaacg gggccttcta cctgtccgag 420 atggcggcgg acgggcgggg cgacgcgggg gcgggcgacg ggtactgcga cgcgcagtgc 480 cagggctact gctgcaacga gatggacatc ctcgaggcca actcgatggc gacggccatg 540 acgccgcacc cgtgcaaggg caacaactgc gaccgcagcg gctgcggcta caacccgtac 600 gccagcggcc agcgcggctt ctacgggccc ggcaagacgg tcgacacgag caagcccttc 660 accgtcgtca cgcagttcgc cgccagcggc ggcaagctga cccagatcac ccgcaagtac 720 atccagaacg gccgggagat cggcggcggc ggcaccatct ccagctgcgg ctccgagtct 780 tcgacgggcg gcctgaccgg catgggcgag gcgctggggc gcggaatggt gctggccatg 840 agcatctgga acgacgcggc ccaggagatg gcatggctcg atgccggcaa caacggccct 900 tgcgccagtg gccagggcag cccgtccgtc attcagtcgc agcatcccga cacccacgtc 960 gtcttctcca acatcaggtg gggcgacatc gggtctacca cgaagaacta 9 1011

<210> 28

<211> 336

<212> PRT

<213> Thielavia terrestris

<400> 28 101

Met Thr Leu Arg Leu Pro Val Ile Ser Leu Leu Ala Ser Leu Ala Ala 1 5 10 15

Gly Ala val val val Pro Arg Ala Glu Phe His Pro Pro Leu Pro Thr 20 25 30

Trp Lys Cys Thr Thr Ser Gly Gly Cys Val Gln Gln Asn Thr Ser Val 35 40 45

val Leu ASp Arg ASp Ser Lys Tyr Ala Ala His Ser Ala Gly Ser Arg 50 55 60

Thr Glu Ser ASp Tyr Ala Ala Met Gly val Ser Thr Ser Gly Asn Ala 65 70 75 80

Val Thr Leu Tyr His Tyr Val Lys Thr Asn Gly Thr Leu Val Pro Ala 85 90 95

Ser Pro Arg Ile Tyr Leu Leu Gly Ala ASp Gly Lys Tyr val Leu Met 100 105 110

Asp Leu Leu Asn G1n Glu Leu Ser Val Asp Val Asp Phe Ser Ala Leu 115 120 125

Pro Cys Gly G1u Asn G1y Ala Phe Tyr Leu Ser Glu Met Ala Ala ASp 130 135 140

Gly Arg Gly Asp Ala Gly Ala Gly ASp Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys 145 150 155 160

G1n Gly Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp I1e Leu G1u Ala Asn Ser Met 165 170 175

Ala Thr Ala Met Thr Pro His Pro Cys Lys Gly Asn Asn Cys ASp Arg 180 185 190

Ser Gly Cys Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Ser Gly G1n Arg G1y Phe Tyr 195 200 205

G1y Pro G1y Lys Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe Thr Val Val Thr 210 215 220

Gln Phe Ala Ala Ser Gly Gly Lys Leu Thr Gln Ile Thr Arg Lys Tyr 225 230 235 240

rle Gln Asn Gly Arg Glu rle Gly Gly Gly Gly Thr rle Ser Ser Cys 245 250 255

Gly Ser Glu Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Gly Met Gly Glu Ala Leu 260 265 270

Gly Arg Gly Met val Leu Ala Met Ser Ile Trp Asn ASp Ala Ala Gln 275 280 285

Glu Met Ala Trp Leu Asp Ala Gly Asn Asn Gly Pro Cys Ala Ser Gly 290 295 300

Gln Gly Ser Pro Ser Val rle Gln Ser Gln His Pro Asp Thr His Val 305 310 315 320

Val Phe Ser Asn rle Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Lys Asn 325 330 335

<210> 29

<211> 1480

<212> ADN

<213> Cladorrhinum foecundissimum

<400> 29 gatccgaatt cctcctctcg ttctttagtc acagaccaga catctgccca cgatggttca 60 caagttcgcc ctcctcaccg gcctcgccgc ctccctcgca tctgcccagc agatcggcac 120 cgtcgtcccc gagtctcacc ccaagcttcc caccaagcgc tgcactctcg ccggtggctg 180 ccagaccgtc gacacctcca tcgtcatcga cgccttccag cgtcccctcc acaagatcgg 240 cgacccttcc actccttgcg tcgtcggcgg ccctctctgc cccgacgcca agtcctgcgc 300 tgagaactgc gcgctcgagg gtgtcgacta tgcctcctgg ggcatcaaga ccgagggcga 360 cgccctaact ctcaaccagt ggatgcccga cccggcgaac cctggccagt acaagacgac 420 tactccccgt acttaccttg ttgctgagga cggcaagaac tacgaggatg tgaagctcct 480 ggctaaggag atctcgtttg atgccgatgt cagcaacctt ccctgcggca tgaacggtgc 540 tttctacttg tctgagatgt tgatggatgg tggacgtggc gacctcaacc ctgctggtgc 600 cgagtatggt accggttact gtgatgcgca gtgcttcaag ttggatttca tcaacggcga 660 ggccaacatc gaccaaaagc acggcgcctg ctgcaacgaa atggacattt tcgaatccaa 720 ctcgcgcgcc aagaccttcg tcccccaccc ctgcaacatc acgcaggtct acaagtgcga 780 aggcgaagac gagtgcggcc agcccgtcgg cgtgtgcgac aagtgggggt gcggcttcaa 840

cgagtacaaa tggggcgtcg agtccttcta cggccggggc: tcgcagttcg ccatcgactc 900

5: ctccaagaag ttcaccgtca ccacgcagtt cctgaccgac aacggcaagg aggacggcgt cctcgtcgag atccgccgct tgtggcacca ggatggcaag ctgatcaaga acaccgctat 960 1020

ccaggttgag gagaactaca gcacggactc ggtgagcacc gagttctgcg agaagactgc: 1080

ttctttcacc atgcagcgcg gtggtctcaa ggcgatgggc gaggctatcg gtcgtggtat: 1140

ggtgctggtt ttcagcatct gggcggatga ttcgggtttt atgaactggt tggatgcgga: 1200

15: gggtaatggc ccttgcagcg cgactgaggg cgatccgaag gagattgtca agaataagcc ggatgctagg gttacgttct caaacattag gattggtgag gttggtagca cgtatgctcc 1260 1320

gggtgggaag tgcggtgtta agagcagggt tgctaggggg cttactgctt cttaaggggg: 1380

gtgtgaagag aggaggaggt gttgttgggg gttggagatg ataattgggc gagatggtgt: 1440

agagcgggtt ggttggatat gaatacgttg aattggatgt: 1480

25: <210> <211> <212> <213> 30 440 PRT Cladorrhinum foecundissimum

<400>: 30

Met Val 1: His Lys Phe Ala Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala Ser Leu 5 10 15 Ala

35: Ser Ala Gln Gln 20 rle G1y Thr Val Val 25 Pro Glu Ser His Pro Lys 30 Leu

Pro Thr Lys Arg Cys 35: Thr Leu Ala Gly Gly Cys 40 Gln Thr val ASp 45 Thr

4S: Ser I le val 50 I le ASp Ala Phe Gln 55 Arg Pro Leu His Lys 60 I le Gly ASp

Pro Ser Thr Pro Cys 65: val val Gly Gly Pro Leu 70 75 Cys Pro ASp Ala Lys 80

Ser Cys: Ala Glu Asn 85 Cys Ala Leu Glu Gly Val Asp Tyr Ala 90 Ser Trp 95

55: Gly Ile Lys Thr 100 Glu Gly Asp Ala Leu 105 Thr Leu Asn Gln Trp Met 110 Pro

104

Asp Pro Ala Asn Pro Gly Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Pro Arg Thr Tyr 115 120 125

Leu Val Ala Glu: Asp Gly Lys Asn Tyr Glu Asp Val Lys Leu Leu Ala

130: 135 140

Lys: Glu Ile Ser Phe ASp Ala ASp val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Met

145: 150 155 160

Asn: Gly Ala Phe Tyr Leu Ser Glu Met Leu Met Asp Gly Gly Arg Gly

165: 170 175

Asp Leu Asn Pro Ala Gly Ala Glu Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala 180 185 190

Gln Cys Phe Lys Leu Asp Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Asp Gln 195 200 205

Lys His Gly Ala cys cys Asn Glu Met ASp Ile Phe Glu Ser Asn Ser 210 215 220

Arg Ala Lys Thr Phe Val Pro Bis Pro Cys Asn Ile Thr Gln Val Tyr 225 230 235 240

Lys Cys Glu Gly Glu Asp Glu Cys Gly Gln Pro Val Gly Val Cys Asp 245 250 255

Lys Trp Gly Cys Gly Phe Asn Glu Tyr Lys Trp Gly val Glu Ser Phe 260 265 270

Tyr Gly Arg Gly Ser Gln Phe Ala Ile Asp Ser Ser Lys Lys Phe Thr 275 280 285

val Thr Thr Gln Phe Leu Thr ASp Asn Gly Lys Glu ASp Gly val Leu 290 295 300

val Glu Ile Arg Arg Leu Trp Bis Gln Asp Gly Lys Leu Ile Lys Asn 305 310 315 320

Thr Ala Ile Gln Val Glu Glu Asn Tyr Ser Thr Asp Ser Val Ser Thr 325 330 335

Glu Phe Cys Glu Lys Thr Ala Ser Phe Thr Met Gln Arg Gly Gly Leu 340 345 350

Lys Ala Met Gly Glu Ala Ile Gly Arg Gly Met Val Leu Val Phe Ser 355 360 365

Ile Trp Ala ASp ASp Ser Gly Phe Met Asn Trp Leu ASp Ala Glu Gly 370 375 380

Asn Gly Pro Cys Ser Ala Thr Glu Gly Asp Pro Lys Glu Ile Val Lys 385 390 395 400

Asn Lys Pro ASp Ala Arg Val Thr Phe Ser Asn Ile Arg Ile Gly Glu 405 410 415

Val Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Gly Gly Lys Cys Gly Val Lys Ser Arg 420 425 430

Val Ala Arg Gly Leu Thr Ala Ser 435 440

<210> 31

<211> 1380

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 31 atggcgccct cagttacact gccgttgacc acggccatcc tggccattgc ccggctcgtc 60 gccgcccagc aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120 tgtacaaagt ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tggtccttga ctggaactac 180 cgctggatgc acgacgcaaa ctacaactcg tgcaccgtca acggcggcgt caacaccacg 240 ctctgccctg acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tcgagggcgt cgactacgcc 300 gcctcgggcg tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360 tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420 gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480 tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540 tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600 acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgcaa cgagatggat 660 atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720 tgcgactctg ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780 cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840

aacggctcgc cctcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900 gacatcccca gcgcccagcc cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960 tacggcggcc tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020 atttggaacg acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080 agcagcaccg agggcaaccc atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140 ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200 ccgcctgcgt ccagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260 ccgagctgca cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320 acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctttag 1380

<210> 32

<211> 459

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 32

Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala 11e Leu Ala 11e 1 5 10 15

Ala Arg Leu val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu val 20 25 30

His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val 35 40 45

Ala Gln ASp Thr Ser val val Leu ASp Trp Asn Tyr Arg Trp Met Bis 50 55 60

ASp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr val Asn Gly Gly val Asn Thr Thr 65 70 75 80

Leu Cys Pro ASp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe 11e Glu Gly 85 90 95

val ASp Tyr Ala Ala Ser Gly val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr 100 105 110

Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser val Ser 115 120 125

Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys

130: 135 140

5: Leu Asn 145 Gly Gln Glu Leo 150 Ser Phe ASp val ASp 155 Leu Ser Ala Leu Pro 160

Cys Gly Glu Asn: Gly Ser Leu 165 Tyr Leu Ser Gln Met 170 ASp Glu Asn 175 Gly

Gly Ala: Asn Gln 180 Tyr Asn Thr Ala Gly Ala 185 Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr 190

15: Cys Asp Ala Gln 195 Cys Pro Val Gln 200 Thr Trp Arg Asn Gly 205 Thr Leu Asn

Thr Ser His 210: Gln Gly Phe Cys Cys 215 Asn Glu Met Asp 220 1le Leu Glu Gly

25: Asn 225 Ser Arg Ala Asn Ala Leu 230 Thr Pro His Ser Cys 235 Thr Ala Thr Ala 240

Cys ASp: Ser Ala Gly Cys Gly 245 Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys 250 255

Ser Tyr Tyr Gly 260: Pro Gly Asp Thr Val 265 Asp Thr Ser Lys Thr 270 Phe Thr

35: Ile Ile Thr Gln 275 Phe Asn Thr Asp Asn 280 Gly Ser Pro Ser Gly Asn 285 Leu

val: Ser 290 ¡le Thr Arg Lys Tyr Gln 295 Gln Asn Gly val ASp 300 Ile Pro Ser

4S: Ala Gln 305 Pro Gly Gly ASp Thr 310 Ile Ser Ser Cys 315 Pro Ser Ala Ser Ala 320

Tyr Gly Gly: Leu Ala Thr 325 Met Gly Lys Ala Leu 330 Ser Ser Gly Met val 335

Leu Val: Phe Ser 340 Ile Trp Asn Asp Asn 345 Ser Gln Tyr Met Asn 350 Trp Leu

55: Asp Ser Gly Asn 355 Ala Gly Pro Cys 360 Ser Ser Thr Glu Gly Asn 365 Pro Ser

Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile 370 375 380

Arg Trp Gly Asp rle Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro 385 390 395 400

Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr 405 410 415

Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly 420 425 430

Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys 435 440 445

Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 450 455

<210> 33

<211> 1545

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 33 atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60 tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120 acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180 acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240 aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300 gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360 gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420 ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480 ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540 ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600 aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660 ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720 gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780 ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840 aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900

accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac: 960

5: tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1020 1080

tcagacaagg gcggcctgac: tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140

atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca: 1200

aacgagacct: cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260

15: cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc ggacccattg gcagcaccgg caaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg aaacccgcct 1320 1380

ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg acctacccag: 1440

tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg cgccagcggc: 1500

acaacttgcc aggtcctgaa: cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1545

25: <210> <211> <212> <213> 34 514 PRT Trichoderma reesei

<400>: 34

Met 1: Tyr Arg Lys Leu Ala Val 5 Ile Ser Ala 10 Phe Leu Ala Thr Ala Arg 15

35: Ala Gln Ser Ala Cys 20 Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr 25 30

Trp Gln: Lys Cys 35 Ser Ser Gly Gly 40 Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser 45

4S: val val 50 Ile ASp Ala Asn Trp Arg Trp Thr 55 His Ala Thr Asn 60 Ser Ser

Thr Asn 65: Cys Tyr ASp Gly Asn 70 Thr Trp Ser Ser Thr Leu 75 Cys Pro ASp 80

Asn: Glu Thr Cys Ala Lys 85 Asn Cys Cys Leu 90 Asp Gly Ala Ala Tyr Ala 95

55: Ser Thr Tyr Gly 100 Val Thr Thr Ser Gly Asn 105 Ser Leu Ser Ile G!y 110 Phe

Val: Thr Gln Ser Ala Gln 115 Lys Asn 120 Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met 125

5: Ala Ser Asp 130 Thr Thr Tyr Gln Glu 135 Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe 140

Ser Phe ASp val ASp Val 145 150: Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala 155 160

15: Leu Tyr Phe Val Ser Met 165 Asp Ala Asp Gly Gly Val 170 Ser Lys Tyr Pro 175

Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln 180 185 190

Cys: Pro Arg Asp 195 Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly 200 205

25: Trp Glu 210 Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn 215 Thr Gly Ile Gly Gly His 220 Gly

Ser Cys Cys 225: Ser Glu Met 230 Asp Ile Trp Glu Ala Asn 235 Ser Ile Ser Glu 240

35: Ala Leu Thr Pro His 245 Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu 250 Ile Cys 255 Glu

Gly ASp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr 260: Ser ASp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr 265 270

Cys Asp: Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn 275 280 Pro Tyr Arg Leu Gly Asn 285 Thr

4S: Ser Phe Tyr Gly 290 Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu ASp Thr Thr Lys Lys 295 300

Leu 305: Thr val Val Thr Gln 310 Phe Glu Thr Ser Gly Ala 315 Ile Asn Arg Tyr 320

55: Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln 325 330 Pro Asn Ala Glu Leu Gly 335

Ser Tyr: Ser Gly Asn 340 Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu 345 350

Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe 355 360: Ser Asp Lys Gly Gly Leu 365 Thr Gln

Phe Lys Lys 370: Ala Thr Ser Gly Gly Met val Leu val Met Ser Leu Trp 375 380

Asp Asp Tyr Tyr 385: Ala Asn 390 Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr 395 Pro Thr 400

Asn: Glu Thr Ser Ser Thr 405 Pro Gly Ala val Arg Gly Ser Cys 410 Ser Thr 415

Ser Ser Gly val 420: Pro Ala Gln val Glu Ser Gln Ser Pro Asn 425 430 Ala Lys

Val: Thr Phe Ser Asn 435 Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn 440 445

Pro Ser Gly Gly Asn 450: Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr 455 460

Thr Arg Arg 465: Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln 470 475 480

Ser Bis Tyr Gly Gln Cys Gly Gly 485: Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val 490 495

Cys Ala Ser Gly 500: Thr Thr Cys Gln Val 505 Leu Asn Pro Tyr Tyr 510 Ser Gln

Cys Leu

<210> <211> <212> <213>: 35 1611 ADN Trichoderma reesei

<400> 35 atgattgtcg gcattctcac cacgctggct acgctggcca cactcgcagc tagtgtgcct ctagaggagc ggcaagcttg ctcaagcgtc tggtaattat gtgaaccctc tcaagagacc: 60 120

caaatactga gatatgtcaa ggggccaatg tggtggccag aattggtcgg gtccgacttg ctgtgcttcc ggaagcacat gcgtctactc caacgactat tactcccagt gtcttcccgg: 180 240

cgctgcaagc tcaagctcgt ccacgcgcgc cgcgtcgacg acttctcgag tatcccccac 300 aacatcccgg tcgagctccg cgacgcctcc acctggttct actactacca gagtacctcc 360 agtcggatcg ggaaccgcta cgtattcagg caaccctttt gttggggtca ctccttgggc 420 caatgcatat tacgcctctg aagttagcag cctcgctatt cctagcttga ctggagccat 480 ggccactgct gcagcagctg tcgcaaaggt tccctctttt atgtggctgt aggtcctccc 540 ggaaccaagg caatctgtta ctgaaggctc atcattcact gcagagatac tcttgacaag 600 acccctctca tggagcaaac cttggccgac atccgcaccg ccaacaagaa tggcggtaac 660 tatgccggac agtttgtggt gtatgacttg ccggatcgcg attgcgctgc ccttgcctcg 720 aatggcgaat actctattgc cgatggtggc gtcgccaaat ataagaacta tatcgacacc 780 attcgtcaaa ttgtcgtgga atattccgat atccggaccc tcctggttat tggtatgagt 840 ttaaacacct gcctcccccc ccccttccct tcctttcccg ccggcatctt gtcgttgtgc 900 taactattgt tccctcttcc agagcctgac tctcttgcca acctggtgac caacctcggt 960 actccaaagt gtgccaatgc tcagtcagcc taccttgagt gcatcaacta cgccgtcaca 1020 cagctgaacc ttccaaatgt tgcgatgtat ttggacgctg gccatgcagg atggcttggc 1080 tggccggcaa accaagaccc ggccgctcag ctatttgcaa atgtttacaa gaatgcatcg 1140 tctccgagag ctcttcgcgg attggcaacc aatgtcgcca actacaacgg gtggaacatt 1200 accagccccc catcgtacac gcaaggcaac gctgtctaca acgagaagct gtacatccac 1260 gctattggac gtcttcttgc caatcacggc tggtccaacg ccttcttcat cactgatcaa 1320 ggtcgatcgg gaaagcagcc taccggacag caacagtggg gagactggtg caatgtgatc 1380 ggcaccggat ttggtattcg cccatccgca aacactgggg actcgttgct ggattcgttt 1440 gtctgggtca agccaggcgg cgagtgtgac ggcaccagcg acagcagtgc gccacgattt 1500 gactcccact gtgcgctccc agatgccttg caaccggcgc ctcaagctgg tgcttggttc 1560 caagcctact ttgtgcagct tctcacaaac gcaaacccat cgttcctgta a 1611

<210> 36

<211> 471

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 36

Met Ile val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15

Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly

20: 25 30

5: Gln Cys Gly Gly 35 Gln Asn Trp Ser Gly 40 Pro Thr Cys Cys 45 Ala Ser Gly

Ser Thr Cys 50: val Tyr Ser Asn ASp Tyr Tyr 55 Ser Gln 60 Cys Leu Pro Gly

Ala Ala 65: Ser Ser Ser Ser 70 Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr 75 Ser Arg 80

15: Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg 85 Ser Ser Ser Ala Thr 90 Pro Pro Pro Gly 95

Ser Thr Thr Thr 100: Arg Val Pro Pro Val 105 Gly Ser Gly Thr Ala Thr Tyr 110

25: Ser Gly Asn 115 Pro Phe val Gly val Thr Pro Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr 120 125

Ala Ser Glu val 130: Ser Ser Leu Ala 135 11e Pro Ser Leu 140 Thr Gly Ala Met

Ala Thr 145: Ala Ala Ala Ala Val 150 Ala Lys Val Pro Ser 155 Phe Met Trp Leu 160

35: ASp Thr Leu Asp Lys 165 Thr Pro Leu Met Glu 170 Gln Thr Leu Ala Asp 175 1le

Arg: Thr Ala Asn 180 Lys Asn Gly Gly Asn 185 Tyr Ala Gly Gln Phe 190 val val

4S: Tyr ASp Leu 195 Pro ASp Arg ASp Cys 200 Ala Ala Leu Ala Ser Asn 205 Gly Glu

Tyr Ser 210: Ile Ala ASp Gly Gly val Ala 215 Lys Tyr Lys 220 Asn Tyr Ile ASp

Thr 225: Ile Arg Gln Ile Val Val 230 Glu Tyr Ser Asp 235 Ile Arg Thr Leu Leu 240

55

Val: Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly Thr

245: 250 255

114

Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn Tyr 260 265 270

Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala 275 280 285

Gly Bis Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gln ASp Pro Ala Ala 290 295 300

Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu 305 310 315 320

Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile Thr 325 330 335

Ser Pro Pro Ser: Tyr Thr Gln Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys Leu

340: 345 350

Tyr: Ile His Ala I1e Gly Arg Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn

355: 360 365

Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly 370 375 380

Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly 385 390 395 400

Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly ASp Ser Leu Leu ASp Ser Phe Val 405 410 415

Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala 420 425 430

Pro Arg Phe ASp Ser His Cys Ala Leu Pro ASp Ala Leu Gln Pro Ala 435 440 445

Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Val Gln Leu Leu Thr 450 455 460

Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu 465 470

<210> 37

<211> 2046

<212> ADN <213> Humico1a inso1ens

<400> 37 gccgtgacct tgcgcgcttt gggtggcggt ggcgagtcgt ggacggtgct tgctggtcgc 60 cggccttccc ggcgatccgc gtgatgagag ggccaccaac ggcgggatga tgctccatgg 120 ggaacttccc catggagaag agagagaaac ttgcggagcc gtgatctggg gaaagatgct 180 ccgtgtctcg tctatataac tcgagtctcc ccgagccctc aacaccacca gctctgatct 240 caccatcccc atcgacaatc acgcaaacac agcagttgtc gggccattcc ttcagacaca 300 tcagtcaccc tccttcaaaa tgcgtaccgc caagttcgcc accctcgccg cccttgtggc 360 ctcggccgcc gcccagcagg cgtgcagtct caccaccgag aggcaccctt ccctctcttg 420 gaacaagtgc accgccggcg gccagtgcca gaccgtccag gcttccatca ctctcgactc 480 caactggcgc tggactcacc aggtgtctgg ctccaccaac tgctacacgg gcaacaagtg 540 ggatactagc atctgcactg atgccaagtc gtgcgctcag aactgctgcg tcgatggtgc 600 cgactacacc agcacctatg gcatcaccac caacggtgat tccctgagcc tcaagttcgt 660 caccaagggc cagcactcga ccaacgtcgg ctcgcgtacc tacctgatgg acggcgagga 720 caagtatcag agtacgttct atcttcagcc ttctcgcgcc ttgaatcctg gctaacgttt 780 acacttcaca gccttcgagc tcctcggcaa cgagttcacc ttcgatgtcg atgtctccaa 840 catcggctgc ggtctcaacg gcgccctgta cttcgtctcc atggacgccg atggtggtct 900 cagccgctat cctggcaaca aggctggtgc caagtacggt accggctact gcgatgctca 960 gtgcccccgt gacatcaagt tcatcaacgg cgaggccaac attgagggct ggaccggctc 1020 caccaacgac cccaacgccg gcgcgggccg ctatggtacc tgctgctctg agatggatat 1080 ctgggaagcc aacaacatgg ctactgcctt cactcctcac ccttgcacca tcattggcca 1140 gagccgctgc gagggcgact cgtgcggtgg cacctacagc aacgagcgct acgccggcgt 1200 ctgcgacccc gatggctgcg acttcaactc gtaccgccag ggcaacaaga ccttctacgg 1260 caagggcatg accgtcgaca ccaccaagaa gatcactgtc gtcacccagt tcctcaagga 1320 tgccaacggc gatctcggcg agatcaagcg cttctacgtc caggatggca agatcatccc 1380 caactccgag tccaccatcc ccggcgtcga gggcaattcc atcacccagg actggtgcga 1440 ccgccagaag gttgcctttg gcgacattga cgacttcaac cgcaagggcg gcatgaagca 1500 gatgggcaag gccctcgccg gccccatggt cctggtcatg tccatctggg atgaccacgc 1560 ctccaacatg ctctggctcg actcgacctt ccctgtcgat gccgctggca agcccggcgc 1620 cgagcgcggt gcctgcccga ccacctcggg tgtccctgct gaggttgagg ccgaggcccc 1680

caacagcaac tctccccggc cacctcctcg gcagcagtgc caccaagctc tcacggccgg gatgtc: gtcgtcttct ccaacatccg gcgggcaacg gcggcaacaa gctccggcca ccaccaccac ggcggcatcg gcttcactgg aacgactggt actctcagtg tttttgcatg aaaggaaaca cttcggcccc atcggctcga ccgttgctgg cggcggcaac cccccgcccc ccaccaccac cgccagcgct ggccccaagg ctggccgctg cccgacccag tgcgaggagc cctacatttg cctgtaaatt ctgagtcgct gactcgacga aacgaccgcg ataaaaatgg agggtaatga 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2046

<210> <211> <212> <213>: 38 525 PRT Humicola insolens

<400>: 38

Met Arg Thr Ala 1: Lys 5 Phe Ala Thr Leu Ala Ala Leu 10 Val Ala Ser Ala 15

Ala Ala Gln Gln 20: Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu Arg His Pro Ser Leu 25 30

Ser Trp Asn 35: Lys Cys Thr Ala Gly Gly 40 Gln Cys Gln Thr val Gln Ala 45

Ser: Ile Thr Leu 50 Asp Ser Asn 55 Trp Arg Trp Thr His Gln Val 60 Ser Gly

Ser Thr 65: Asn Cys Tyr Thr 70 Gly Asn Lys Trp ASp 75 Thr Ser Ile Cys Thr 80

ASp: Ala Lys Ser Cys 85 Ala Gln Asn Cys Cys 90 val ASp Gly Ala ASp Tyr 95

Thr Ser Thr Tyr Gly ¡le Thr Thr 100: Asn 105 Gly ASp Ser Leu Ser Leu 110 Lys

Phe val Thr Lys Gly 115: Gln His Ser Thr Asn val 120 Gly Ser Arg 125 Thr Tyr

Leu Met 130: ASp Gly Glu ASp Lys Tyr 135 Gln Thr Phe Glu 140 Leu Leu Gly Asn

Glu: Phe Thr Phe ASp Val Asp Val Ser Asn ¡le Gly Cys Gly Leu Asn

145: 150 155 160

5: Gly Ala Leu Tyr Phe val Ser Met 165 ASp Ala ASp Gly Gly 170 Leu Ser Arg 175

Tyr Pro Gly Asn 180: Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly 185 Thr Gly Tyr Cys ASp 190

Ala Gln: Cys 195 Pro Arg Asp Ile Lys 200 Phe Ile Asn Gly Glu Ala 205 Asn Ile

15: Glu Gly Trp Thr 210 Gly Ser Thr Asn 215 Asp Pro Asn Ala Gly Ala Gly Arg 220

Tyr Gly Thr Cys Cys 225: Ser Glu Met Asp 230 Ile Trp Glu Ala Asn 235 Asn Met 240

25: Ala Thr Ala Phe Thr 245 Pro His Pro Cys Thr 250 11e Ile Gly Gln Ser Arg 255

Cys: Glu Gly ASp 260 Ser Cys Gly Gly Thr Tyr 265 Ser Asn Glu Arg Tyr Ala 270

Gly Val Cys Asp 275: Pro Asp Gly Cys Asp 280 Phe Asn Ser Tyr Arg 285 Gln Gly

35: Asn Lys 290 Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met 295 Thr Val Asp Thr Thr 300 Lys Lys

11e Thr 305: val val Thr Gln 310 Phe Leu Lys ASp Ala Asn Gly ASp 315 Leu Gly 320

4S: Glu Ile Lys Arg Phe 325 Tyr val Gln ASp Gly Lys 330 Ile Ile Pro Asn 335 Ser

Glu: Ser Thr Ile 340 Pro Gly val Glu Gly Asn 345 Ser Ile Thr Gln 350 ASp Trp

Cys Asp Arg 355: Gln Lys Val Ala Phe 360 Gly Asp Ile Asp Asp 365 Phe Asn Arg

55: Lys Gly Gly Met 370 Lys Gln Met 375 Gly Lys Ala Leu Ala Gly 380 Pro Met Val

Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ser Asn Met Leu Trp Leu 385 390 395 400

Asp Ser Thr Phe Pro Val Asp Ala Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Arg 405 410 415

Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Glu 420 425 430

Ala Pro Asn Ser Asn Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile 435 440 445

Gly Ser Thr Val Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gly Asn Gly Gly Asn Asn 450 455 460

Gly Gly Asn Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Ala 465 470 475 480

Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Gly Pro Lys Ala Gly Arg Trp Gln Gln 485 490 495

Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Glu Pro Tyr 500 505 510

Ile Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 515 520 525

<210> 39

<211> 1812

<212> ADN

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 39 atggccaaga agcttttcat caccgccgcc cttgcggctg ccgtgttggc ggcccccgtc 60

attgaggagc gccagaactg cggcgctgtg tggtaagaaa gcccggtctg agtttcccat 120

gactttctca tcgagtaatg gcataaggcc caccccttcg actgactgtg agaatcgatc 180

aaatccagga ctcaatgcgg cggcaacggg tggcagggtc ccacatgctg cgcctcgggc 240

tcgacctgcg ttgcgcagaa cgagtggtac tctcagtgcc tgcccaacaa tcaggtgacg 300

agttccaaca ctccgtcgtc gacttccacc tcgcagcgca gcagcagcac ctccagcagc 360

agcaccagga gcggcagctc ctcctcctcc accaccacgc cccctcccgt ctccagcccc 420

gtgactagca ttcccggcgg tgcgaccacc acggcgagct actctggcaa ccccttctcg 480

ggcgtccggc tcttcgccaa cgactactac aggtccgagg tccacaatct cgccattcct 540

agcatgaccg gtactctggc ggccaaggct tccgccgtcg ccgaagtccc tagcttccag 600 tggctcgacc ggaacgtcac catcgacacc ctgatggtcc agactctgtc ccagatccgg 660 gctgccaata atgccggtgc caatcctccc tatgctggtg agttacatgg cggcgacttg 720 ccttctcgtc ccccaccttt cttgacggga tcggttacct gacctggagg caaaacaaaa 780 ccagcccaac ttgtcgtcta cgacctcccc gaccgtgact gcgccgccgc tgcgtccaac 840 ggcgagtttt cgattgcaaa cggcggcgcc gccaactaca ggagctacat cgacgctatc 900 cgcaagcaca tcattgagta ctcggacatc cggatcatcc tggttatcga gcccgactcg 960 atggccaaca tggtgaccaa catgaacgtg gccaagtgca gcaacgccgc gtcgacgtac 1020 cacgagttga ccgtgtacgc gctcaagcag ctgaacctgc ccaacgtcgc catgtatctc 1080 gacgccggcc acgccggctg gctcggctgg cccgccaaca tccagcccgc cgccgacctg 1140 tttgccggca tctacaatga cgccggcaag ccggctgccg tccgcggcct ggccactaac 1200 gtcgccaact acaacgcctg gagtatcgct tcggccccgt cgtacacgtc ccctaaccct 1260 aactacgacg agaagcacta catcgaggcc ttcagcccgc tcctgaacgc ggccggcttc 1320 cccgcacgct tcattgtcga cactggccgc aacggcaaac aacctaccgg tatggttttt 1380 ttcttttttt ttctctgttc ccctccccct tccccttcag ttggcgtcca caaggtctct 1440 tagtcttgct tcttctcgga ccaaccttcc cccaccccca aaacgcaccg cccacaaccg 1500 ttcgactcta tactcttggg aatgggcgcc gaaactgacc gttcgacagg ccaacaacag 1560 tggggtgact ggtgcaatgt caagggcact ggctttggcg tgcgcccgac ggccaacacg 1620 ggccacgacc tggtcgatgc ctttgtctgg gtcaagcccg gcggcgagtc cgacggcaca 1680 agcgacacca gcgccgcccg ctacgactac cactgcggcc tgtccgatgc cctgcagcct 1740 gctccggagg ctggacagtg gttccaggcc tacttcgagc agctgctcac caacgccaac 1800 ccgcccttct aa 1812

<210> 40

<211> 482

<212> PRT

<213> Myce1iophthora thermophila

<400> 40

Met Ala Lys Lys Leu Phe Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Leu 1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Ile Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ala Val Trp Thr 20 25 30

Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Gln Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly 35 40 45

Ser Thr Cys Val Ala Gln Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn 50 55 60

Asn Gln val Thr Ser Ser Asn Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gln 65 70 75 80

Arg Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Ser Ser Ser 85 90 95

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Pro Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Ser Ile 100 105 110

Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Ser 115 120 125

Gly Val Arg Leu Phe Ala Asn ASp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Asn 130 135 140

Leu Ala rle Pro Ser Met Thr Gly Thr Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala 145 150 155 160

Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile 165 170 175

ASp Thr Leu Met val Gln Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Asn 180 185 190

Ala G1y Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Ala G1n Leu Val val Tyr ASp Leu 195 200 205

Pro ASp Arg ASp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile 210 215 220

Ala Asn G1y G1y Ala Ala Asn Tyr Arg Ser Tyr Ile ASp Ala Ile Arg 225 230 235 240

Lys His ¡le I1e Glu Tyr Ser ASp ¡le Arg Ile Ile Leu val rle Glu 245 250 255

Pro Asp Ser Met Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys

260: 265 270

5: Ser Asn Ala Ala 275 Ser Thr Tyr Bis Glu 280 Leo Thr val Tyr Ala Leu 285 Lys

Gln: Leu 290 Asn Leu Pro Asn val Ala Met 295 Tyr Leu ASp 300 Ala Gly Bis Ala

Gly Trp Leu 305: Gly Trp Pro Ala Asn 310 Ile Gln Pro Ala 315 Ala Asp Leu Phe 320

15: Ala Gly Ile Tyr Asn Asp Ala Gly Lys 325 Pro Ala Ala 330 Val Arg Gly 335 Leu

Ala Thr: Asn Val 340 Ala Asn Tyr Asn Ala 345 Trp Ser Ile Ala Ser Ala 350 Pro

25: Ser Tyr Thr Ser 355 Pro Asn Pro Asn 360 Tyr ASp Glu Lys Bis 365 Tyr rle Glu

Ala Phe 370: Ser Pro Leu Leo Asn Ala Ala Gly 375 Phe Pro Ala Arg 380 Phe Ile

Val 385: Asp Thr Gly Arg Asn 390 Gly Lys Gln Pro Thr Gly 395 Gln Gln Gln Trp 400

35: Gly Asp Trp Cys Asn Val Lys Gly Thr Gly Phe 405 410 Gly Val Arg Pro Thr 415

Ala Asn: Thr Gly 420 Bis ASp Leu val ASp 425 Ala Phe val Trp val Lys 430 Pro

4S: Gly Gly Glu Ser 435 ASp Gly Thr Ser ASp 440 Thr Ser Ala Ala Arg Tyr ASp 445

Tyr Bis Cys Gly 450: Leu Ser ASp 455 Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu 460 Ala Gly

Gln 465: Trp Phe Gln Ala Tyr 470 Phe Glu Gln Leu Leu 475 Thr Asn Ala Asn Pro 480

55: Pro Phe

122

<210> 41

<211> 1802

<212> ADN

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 41 atggccaaga agcttttcat caccgccgcg cttgcggctg ccgtgttggc ggcccccgtc 60 attgaggagc gccagaactg cggcgctgtg tggtaagaaa gcccggtccg agtctcccat 120 gattttctcg tcgagtaatg gcataagggc caccccttcg actgaccgtg agaatcgatc 180 aaatccagga ctcaatgcgg cggtaacggg tggcaaggtc ccacatgctg cgcctcgggc 240 tcgacctgcg ttgcgcagaa cgagtggtac tctcagtgcc tgcccaacag ccaggtgacg 300 agttccacca ctccgtcgtc gacttccacc tcgcagcgca gcaccagcac ctccagcagc 360 accaccagga gcggcagctc ctcctcctcc tccaccacgc ccccgcccgt ctccagcccc 420 gtgaccagca ttcccggcgg tgcgacctcc acggcgagct actctggcaa ccccttctcg 480 ggcgtccggc tcttcgccaa cgactactac aggtccgagg tccacaatct cgccattcct 540 agcatgactg gtactctggc ggccaaggct tccgccgtcg ccgaagtccc tagcttccag 600 tggctcgacc ggaacgtcac catcgacacc ctgatggtcc agactctgtc ccaggtccgg 660 gctctcaata aggccggtgc caatcctccc tatgctggtg agttacatgg cgacttgcct 720 tctcgtcccc tacctttctt gacgggatcg gttacctgac ctggaggcaa aacaacaaca 780 gcccaactcg tcgtctacga cctccccgac cgtgactgtg ccgccgctgc gtccaacggc 840 gagttttcga ttgcaaacgg cggcgccgcc aactacagga gctacatcga cgctatccgc 900 aagcacatca ttgagtactc ggacatccgg atcatcctgg ttatcgagcc cgactcgatg 960 gccaacatgg tgaccaacat gaacgtggcc aagtgcagca acgccgcgtc gacgtaccac 1020 gagttgaccg tgtacgcgct caagcagctg aacctgccca acgtcgccat gtatctcgac 1080 gccggccacg ccggctggct cggctggccc gccaacatcc agcccgccgc cgagctgttt 1140 gccggcatct acaatgatgc cggcaagccg gctgccgtcc gcggcctggc cactaacgtc 1200 gccaactaca acgcctggag catcgcttcg gccccgtcgt acacgtcgcc taaccctaac 1260 tacgacgaga agcactacat cgaggccttc agcccgctct tgaactcggc cggcttcccc 1320 gcacgcttca ttgtcgacac tggccgcaac ggcaaacaac ctaccggtat gttttttttt 1380 cttttgtctc tgtccccccc ttttctcccc cttcagttgg cgtccacaag gtctcttagt 1440 cctgcttcat ctgtgaccaa cctccccccc cccggcaccg cccacaaccg tttgactcta 1500 tactcttggg aatgggcgcc gaaactgacc gttccacagg ccaacaacag tggggtgact 1560 ggtgcaatgt caagggcacc ggctttggcg tgcgcccgac ggccaacacg ggccacgagc 1620

tggtcgatgc ctttgtctgg gtcaagcccg gcggcgagtc cgacggcaca agcgacacca gcgccgcccg ctacgactac cactgcggcc tgtccgatgc cctgcagcct gcccccgagg ctggacagtg gttccaggcc tacttcgagc agctgctcac caacgccaac ccgcccttct aa: 1680 1740 1800 1802

<210> <211> <212> <213> <400>: 42 481 PRT Myce1iophthora thermophila 42

Met Ala Lys Lys 1: Leu 5 Phe Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala val Leu 10 15

Ala Ala: Pro Val 20 Ile G1u Glu Arg G1n Asn 25 Cys Gly Ala Val Trp Thr 30

Gln Cys Gly Gly Asn 35: Gly Trp Gln 40 Gly Pro Thr Cys Cys 45 Ala Ser Gly

Ser Thr Cys 50: Val Ala Gln Asn Glu 55 Trp Tyr Ser Gln Cys 60 Leu Pro Asn

Ser Gln val Thr 65: Ser Ser Thr Thr 70 Pro Ser Ser Thr 75 Ser Thr Ser Gln 80

Arg Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Thr Arg Ser Gly Ser Ser Ser 85 90 95

Ser Ser Ser Thr 100: Thr Pro Pro Pro Val 105 Ser Ser Pro Val Thr 110 Ser Ile

Pro G1y Gly Ala Thr Ser Thr Ala Ser Tyr 115 120: Ser Gly Asn 125 Pro Phe Ser

Gly Val Arg 130: Leu Phe Ala Asn Asp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val 135 140 His Asn

Leu Ala 145: Ile Pro Ser Met Thr G1y Thr Leu 150 Ala Ala Lys 155 Ala Ser Ala 160

Val Ala Glu Val: Pro Ser Phe Gln 165 Trp Leu 170 Asp Arg Asn Val Thr 175 Ile

124

ASp: Thr Leu Met Val Gln Thr Leu Ser Gln Val Arg Ala Leu Asn Lys

180: 185 190

Ala Gly Ala Asn: Pro Pro Tyr Ala Ala Gln Leu Val Val Tyr ASp Leu

195 200 205

Pro ASp Arg ASp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile 210 215 220

Ala Asn Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Arg Ser Tyr Ile Asp Ala Ile Arg 225 230 235 240

Lys Bis Ile Ile Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Leu Val Ile Glu 245 250 255

Pro Asp Ser Met Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys 260 265 270

Ser Asn Ala Ala Ser Thr Tyr His Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys 275 280 285

Gln Leu Asn Leu Pro Asn val Ala Met Tyr Leu ASp Ala Gly His Ala 290 295 300

Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu Phe 305 310 315 320

Ala Gly 1le Tyr Asn ASp Ala Gly Lys Pro Ala Ala val Arg Gly Leu 325 330 335

Ala Thr Asn val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ala Ser Ala Pro 340 345 350

Ser Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr ASp Glu Lys His Tyr 1le Glu 355 360 365

Ala Phe Ser Pro Leu Leu Asn Ser Ala Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ile 370 375 380

val ASp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp 385 390 395 400

Gly Asp Trp Cys Asn Val Lys Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr

405 410 415

Ala Asn Thr Gly His Glu Leu val ASp Ala Phe val Trp val Lys Pro 420 425 430

Gly Gly Glu Ser ASp Gly Thr Ser ASp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr ASp 435 440 445

Tyr Bis Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly 450 455 460

Gln Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro 465 470 475 480

Pro

<210> 43

<211> 1446

<212> ADN

<213> Thielavia terrestris

<400> 43 atggctcaga agctccttct cgccgccgcc cttgcggcca gcgccctcgc tgctcccgtc 60 gtcgaggagc gccagaactg cggttccgtc tggagccaat gcggcggcat tggctggtcc 120 ggcgcgacct gctgcgcttc gggcaatacc tgcgttgagc tgaacccgta ctactcgcag 180 tgcctgccca acagccaggt gactacctcg accagcaaga ccacctccac caccaccagg 240 agcagcacca ccagccacag cagcggtccc accagcacga gcaccaccac caccagcagt 300 cccgtggtca ctaccccgcc gagtacctcc atccccggcg gtgcctcgtc aacggccagc 360 tggtccggca acccgttctc gggcgtgcag atgtgggcca acgactacta cgcctccgag 420 gtctcgtcgc tggccatccc cagcatgacg ggcgccatgg ccaccaaggc ggccgaggtg 480 gccaaggtgc ccagcttcca gtggcttgac cgcaacgtca ccatcgacac gctgttcgcc 540 cacacgctgt cgcagatccg cgcggccaac cagaaaggcg ccaacccgcc ctacgcgggc 600 atcttcgtgg tctacgacct tccggaccgc gactgcgccg ccgccgcgtc caacggcgag 660 ttctccatcg cgaacaacgg ggcggccaac tacaagacgt acatcgacgc gatccggagc 720 ctcgtcatcc agtactcaga catccgcatc atcttcgtca tcgagcccga ctcgctggcc 780 aacatggtga ccaacctgaa cgtggccaag tgcgccaacg ccgagtcgac ctacaaggag 840 ttgaccgtct acgcgctgca gcagctgaac ctgcccaacg tggccatgta cctggacgcc 900

ggccacgccg gctggctcgg ctggcccgcc aacatccagc cggccgccaa cctcttcgcc 960 gagatctaca cgagcgccgg caagccggcc gccgtgcgcg gcctcgccac caacgtggcc 1020 aactacaacg gctggagcct ggccacgccg ccctcgtaca cccagggcga ccccaactac 1080 gacgagagcc actacgtcca ggccctcgcc ccgctgctca ccgccaacgg cttccccgcc 1140 cacttcatca ccgacaccgg ccgcaacggc aagcagccga ccggacaacg gcaatgggga 1200 gactggtgca acgttatcgg aactggcttc ggcgtgcgcc cgacgacaaa caccggcctc 1260 gacatcgagg acgccttcgt ctgggtcaag cccggcggcg agtgcgacgg cacgagcaac 1320 acgacctctc cccgctacga ctaccactgc ggcctgtcgg acgcgctgca gcctgctccg 1380 gaggccggca cttggttcca ggcctacttc gagcagctcc tgaccaacgc caacccgccc 1440 ttttaa 1446

<210> 44

<211> 481

<212> PRT

<213> Thielavia terrestris

<400> 44

Met Ala Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Leu 1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ser Val Trp Ser 20 25 30

Gln Cys Gly Gly !le Gly Trp Ser Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ser Gly 35 40 45

Asn Thr Cys Val Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn 50 55 60

Ser Gln val Thr Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ser Thr Thr Thr Arg 65 70 75 80

Ser Ser Thr Thr Ser His Ser Ser Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr 85 90 95

Thr Thr Ser Ser Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Ser Ile Pro 100 105 110

Gly G1y Ala Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ser G1y Asn Pro Phe Ser Gly 115 120 125

Val: Gln Met Trp Ala Asn Asp Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu

130: 135 140

Ala 11e: Pro Ser Met Thr Gly Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Glu val

145: 150 155 160

Ala Lys Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp 165 170 175

Thr Leu Phe Ala His Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Gln Lys 180 185 190

Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Gly Ile Phe val val Tyr ASp Leu Pro 195 200 205

Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala 210 215 220

Asn Asn Gly Ala Ala Asn Tyr Lys Thr Tyr Ile ASp Ala Ile Arg Ser 225 230 235 240

Leu Val Ile Gln Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Phe Val Ile Glu Pro 245 250 255

ASp Ser Leu Ala Asn Met val Thr Asn Leu Asn val Ala Lys Cys Ala 260 265 270

Asn Ala Glu Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Gln Gln 275 280 285

Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly Bis Ala Gly 290 295 300

Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn 1le Gln Pro Ala Ala Asn Leu Phe Ala 305 310 315 320

Glu Ile Tyr Thr Ser Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala 325 330 335

Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Ser Leu Ala Thr Pro Pro Ser 340 345 350

Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Tyr Asp Glu Ser Bis Tyr Val Gln Ala 355 360 365

Leu Ala Pro Leu Leu Thr Ala Asn Gly Phe Pro Ala His Phe !le Thr 370 375 380

ASp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Arg Gln Trp Gly 385 390 395 400

ASp Trp Cys Asn val Ile Gly Thr Gly Phe Gly val Arg Pro Thr Thr 405 410 415

Asn Thr G1y Leu Asp Ile Glu Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro G1y 420 425 430

G1y Glu Cys Asp G1y Thr Ser Asn Thr Thr Ser Pro Arg Tyr Asp Tyr 435 440 445

His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr 450 455 460

Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Pro 465 470 475 480

Phe

<210> 45

<211> 1593

<212> ADN

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 45 atgatgtaca agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgccgc cgcccagcag 60 gcttgctccc tcaccactga gacccacccc agactcactt ggaagcgctg cacctctggc 120 ggcaactgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180 actgtttccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaacgagt gggatacctc catctgctct 240 gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgacggcg ctgactactc ttcgacctat 300 ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagcacggc 360 accaatgtcg gctctcgtgt ctacctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420 ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcta acctgggctg cggtctcaac 480 ggcgccctct acttcgtctc catggacgct gatggtggta tgagcaagta ctctggcaac 540 aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgaccttaag 600

ttcatcaacg gcgaggccaa cattgagaac tggacccctt cgaccaatga tgccaacgcc 660 ggtttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggata tctgggatgc caacaacatg 720 5 gctactgcct tcactcctca cccttgcacc attatcggcc agagccgctg cgagggcaac 780 agctgcggtg gcacctacag ctctgagcgc tatgctggtg tttgcgatcc tgatggctgc 840 gacttcaacg cctaccgcca gggcgacaag accttctacg gcaagggcat gaccgtcgac 900 accaccaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960 gagatcaagc gcttctacgt tcaggacggc aagatcattg ccaacgccga gtccaagatc 1020 15 cccggcaacc ccggcaactc catcacccag gagtggtgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080 ggtgacatcg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgag 1140 ggccctatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200 gactcgacct accccattga caaggccggc acccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260 accacctccg gtgtccctgc cgagattgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgttatcttc 1320 25 tccaacatcc gcttcggccc catcggctcg accgtccctg gcctcgacgg cagcaccccc 1380 agcaacccga ccgccaccgt tgctcctccc acttctacca ccaccagcgt gagaagcagc 1440 actactcaga tttccacccc gactagccag cccggcggct gcaccaccca gaagtggggc 1500 cagtgcggtg gtatcggcta caccggctgc actaactgcg ttgctggcac tacctgcact 1560 gagctcaacc cctggtacag ccagtgcctg taa 1593 35

<210> 46

<211> 530

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 46

Met Met Tyr Lys Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu val Ala Gly Ala 4S 1 5 10 15

Ala Ala Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu Thr His Pro Ar g Leu 20 25 30

Thr Trp Lys Arg Cys Thr Ser Gly Gly Asn Cys Ser Thr Val Asn Gly 35 40 45

55 Ala Val Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Thr Val Ser Gly 50 55 60

Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp Asp Thr Ser Ile Cys Ser 65 70 75 80

Asp Gly Lys Ser Cys Ala Gln Thr Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr 85 90 95

Ser Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly ASp Ser Leu Asn Leu Lys 100 105 110

Phe Val Thr Lys: His Gln His Gly Thr Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr

115: 120 125

Leu Met: Glu Asn Asp Thr Lys Tyr Gln Met Phe Glu Leu Leu Gly Asn

130: 135 140

Glu: Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn

145: 150 155 160

Gly Ala Leu: Tyr Phe Val Ser Met ASp Ala ASp Gly Gly Met Ser Lys

165: 170 175

Tyr Ser Gly Asn: Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp

180: 185 190

Ala Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile 195 200 205

Glu Asn Trp Thr Pro Ser Thr Asn ASp Ala Asn Ala Gly Phe Gly Arg 210 215 220

Tyr Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Asp Ala Asn Asn Met 225 230 235 240

Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Thr Ile Ile Gly Gln Ser Arg 245 250 255

Cys Glu Gly Asn Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Glu Arg Tyr Ala 260 265 270

Gly Val Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ala Tyr Arg Gln Gly 275 280 285

Asp Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys 290 295 300

Met Thr Val Val Thr Gln Phe His Lys Asn Ser Ala Gly Val Leu Ser 305 310 315 320

G1u Ile Lys Arg Phe Tyr val Gln ASp Gly Lys Ile Ile Ala Asn Ala 325 330 335

Glu Ser Lys Ile Pro Gly Asn Pro Gly Asn Ser Ile Thr Gln Glu Trp 340 345 350

Cys ASp Ala Gln Lys val Ala Phe Gly ASp !le ASp ASp Phe Asn Arg 355 360 365

Lys Gly Gly Met Ala Gln Met Ser Lys Ala Leu Glu Gly Pro Met val 370 375 380

Leu Val Met Ser Val Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu 385 390 395 400

ASp Ser Thr Tyr Pro Ile ASp Lys Ala Gly Thr Pro Gly Ala Glu Arg 405 410 415

Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Ile Glu Ala Gln 420 425 430

val Pro Asn Ser Asn val Ile Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile 435 440 445

Gly Ser Thr Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Thr Pro Ser Asn Pro Thr 450 455 460

Ala Thr Val Ala Pro Pro Thr Ser Thr Thr Thr Ser Val Arg Ser Ser 465 470 475 480

Thr Thr Gln Ile Ser Thr Pro Thr Ser Gln Pro Gly Gly Cys Thr Thr 485 490 495

Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn 500 505 510

Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Glu Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gln 515 520 525

Cys Leu 530

<210> 47

<211> 1434

<212> ADN

<213> Chaetomium thermophi1um

<400> 47 atggctaagc agctgctgct cactgccgct cttgcggcca cttcgctggc tgcccctctc 60 cttgaggagc gccagagctg ctcctccgtc tggggtcaat gcggtggcat caattacaac 120 ggcccgacct gctgccagtc cggcagtgtt tgcacttacc tgaatgactg gtacagccag 180 tgcattcccg gtcaggctca gcccggcacg actagcacca cggctcggac caccagcacc 240 agcaccacca gcacttcgtc ggtccgcccg accacctcga atacccctgt gacgactgct 300 cccccgacga ccaccatccc gggcggcgcc tcgagcacgg ccagctacaa cggcaacccg 360 ttttcgggtg ttcaactttg ggccaacacc tactactcgt ccgaggtgca cactttggcc 420 atccccagct tgtctcctga gctggctgcc aaggccgcca aggtcgctga ggttcccagc 480 ttccagtggc tcgaccgcaa tgtgactgtt gacactctct tctccggcac tcttgccgaa 540 atccgcgccg ccaaccagcg cggtgccaac ccgccttatg ccggcatttt cgtggtttat 600 gacttaccag accgtgattg cgcggctgct gcttcgaacg gcgagtggtc tatcgccaac 660 aatggtgcca acaactacaa gcgctacatc gaccggatcc gtgagctcct tatccagtac 720 tccgatatcc gcactattct ggtcattgaa cctgattccc tggccaacat ggtcaccaac 780 atgaacgtcc agaagtgctc gaacgctgcc tccacttaca aggagcttac tgtctatgcc 840 ctcaaacagc tcaatcttcc tcacgttgcc atgtacatgg atgctggcca cgctggctgg 900 cttggctggc ccgccaacat ccagcctgct gctgagctct ttgctcaaat ctaccgcgac 960 gctggcaggc ccgctgctgt ccgcggtctt gcgaccaacg ttgccaacta caatgcttgg 1020 tcgatcgcca gccctccgtc ctacacctct cctaacccga actacgacga gaagcactat 1080 attgaggcct ttgctcctct tctccgcaac cagggcttcg acgcaaagtt catcgtcgac 1140 accggccgta acggcaagca gcccactggc cagcttgaat ggggtcactg gtgcaatgtc 1200 aagggaactg gcttcggtgt gcgccctact gctaacactg ggcatgaact tgttgatgct 1260 ttcgtgtggg tcaagcccgg tggcgagtcc gacggcacca gtgcggacac cagcgctgct 1320 cgttatgact atcactgcgg cctttccgac gcactgactc cggcgcctga ggctggccaa 1380 tggttccagg cttatttcga acagctgctc atcaatgcca accctccgct ctga 1434

<210> 48

<211> 477 133

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 48

Met Ala Lys Gln Leu Len Leu Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Leu Glu Glu Arg Gln Ser Cys Ser Ser Val Trp Gly 20 25 30

Gln Cys Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Gly Pro Thr Cys Cys Gln Ser Gly 35 40 45

Ser val Cys Thr Tyr Len Asn ASp Trp Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Gly 50 55 60

Gln Ala Gln Pro Gly Thr Thr Ser Thr Thr Ala Arg Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80

Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ser val Arg Pro Thr Thr Ser Asn Thr Pro 85 90 95

Val Thr Thr Ala Pro Pro Thr Thr Thr Ile Pro Gly Gly Ala Ser Ser 100 105 110

Thr Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro Phe Ser Gly val Gln Len Trp Ala 115 120 125

Asn Thr Tyr Tyr Ser Ser Glu Val His Thr Leu Ala Ile Pro Ser Leu 130 135 140

Ser Pro Glu Leu Ala Ala Lys Ala Ala Lys Val Ala Glu Val Pro Ser 145 150 155 160

Phe Gln Trp Len ASp Arg Asn val Thr val ASp Thr Leu Phe Ser Gly 165 170 175

Thr Leu Ala Glu Ile Arg Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ala Asn Pro Pro 180 185 190

Tyr Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala 195 200 205

Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Trp Ser Ile Ala Asn Asn Gly Ala Asn 210 215 220

Asn Tyr Lys Arg Tyr Ile ASp Arg Ile Arg Glu Leu Leu Ile Gln Tyr

225 230 235 240

Ser ASp Ile Arg Thr Ile Leu Val Ile Glu Pro ASp Ser Leu Ala Asn 245 250 255

Met val Thr Asn Met Asn val Gln Lys Cys Ser Asn Ala Ala Ser Thr 260 265 270

Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asn Leu Pro His 275 280 285

Val Ala Met Tyr Met Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro 290 295 300

Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu Phe Ala Gln Ile Tyr Arg Asp 305 310 315 320

Ala Gly Arg Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn 325 330 335

Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ala Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Ser Pro Asn 340 345 350

Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu Ala Phe Ala Pro Leu Leu 355 360 365

Arg Asn Gln Gly Phe ASp Ala Lys Phe Ile val ASp Thr Gly Arg Asn 370 375 380

Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Leu Glu Trp Gly His Trp Cys Asn Val 385 390 395 400

Lys Gly Thr Gly Phe Gly val Arg Pro Thr Ala Asn Thr Gly His Glu 405 410 415

Leu val ASp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser ASp Gly 420 425 430

Thr Ser Ala ASp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr ASp Tyr His Cys Gly Leu 435 440 445

Ser Asp Ala Leu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln Trp Phe Gln Ala 135

450 455 460

Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Ile Asn Ala Asn Pro Pro Leu 465 470 475

<210> 49

<211> 1599

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 49 atgctggcct ccaccttctc ctaccgcatg tacaagaccg cgctcatcct ggccgccctt 60 ctgggctctg gccaggctca gcaggtcggt acttcccagg cggaagtgca tccgtccatg 120 acctggcaga gctgcacggc tggcggcagc tgcaccacca acaacggcaa ggtggtcatc 180 gacgcgaact ggcgttgggt gcacaaagtc ggcgactaca ccaactgcta caccggcaac 240 acctgggaca cgactatctg ccctgacgat gcgacctgcg catccaactg cgcccttgag 300 ggtgccaact acgaatccac ctatggtgtg accgccagcg gcaattccct ccgcctcaac 360 ttcgtcacca ccagccagca gaagaacatt ggctcgcgtc tgtacatgat gaaggacgac 420 tcgacctacg agatgtttaa gctgctgaac caggagttca ccttcgatgt cgatgtctcc 480 aacctcccct gcggtctcaa cggtgctctg tactttgtcg ccatggacgc cgacggtggc 540 atgtccaagt acccaaccaa caaggccggt gccaagtacg gtactggata ctgtgactcg 600 cagtgccctc gcgacctcaa gttcatcaac ggtcaggcca acgtcgaagg gtggcagccc 660 tcctccaacg atgccaatgc gggtaccggc aaccacgggt cctgctgcgc ggagatggat 720 atctgggagg ccaacagcat ctccacggcc ttcacccccc atccgtgcga cacgcccggc 780 caggtgatgt gcaccggtga tgcctgcggt ggcacctaca gctccgaccg ctacggcggc 840 acctgcgacc ccgacggatg tgatttcaac tccttccgcc agggcaacaa gaccttctac 900 ggccctggca tgaccgtcga caccaagagc aagtttaccg tcgtcaccca gttcatcacc 960 gacgacggca cctccagcgg caccctcaag gagatcaagc gcttctacgt gcagaacggc 1020 aaggtgatcc ccaactcgga gtcgacctgg accggcgtca gcggcaactc catcaccacc 1080 gagtactgca ccgcccagaa gagcctgttc caggaccaga acgtcttcga aaagcacggc 1140 ggcctcgagg gcatgggtgc tgccctcgcc cagggtatgg ttctcgtcat gtccctgtgg 1200 gatgatcact cggccaacat gctctggctc gacagcaact acccgaccac tgcctcttcc 1260 accactcccg gcgtcgcccg tggtacctgc gacatctcct ccggcgtccc tgcggatgtc 1320 gaggcgaacc accccgacgc ctacgtcgtc tactccaaca tcaaggtcgg ccccatcggc 1380

tcgaccttca acagcggtgg ctcgaacccc ggtggcggaa ccaccacgac: aactaccacc 1440

cagcctacta ccaccacgac cacggctgga aaccctggcg gcaccggagt cgcacagcac tatggccagt gtggtggaat cggatggacc ggacccacaa cctgtgccag cccttatacc: 1500 1560

tgccagaagc tgaatgatta ttactctcag tgcctgtag: 1599

<210> <211> <212> <213>: 50 532 PRT Aspergillus fumigatus

<400>: 50

Met 1: Leu Ala Ser Thr Phe 5 Ser Tyr Arg Met Tyr Lys Thr Ala Leu 10 15 Ile

Leu Ala Ala Leu 20: Leu G1y Ser G1y G1n Ala G1n 25 Gln Val Gly Thr Ser 30

Gln Ala Glu Val 35: His Pro Ser Met 40 Thr Trp G1n Ser cys 45 Thr Ala Gly

Gly Ser Cys 50: Thr Thr Asn Asn G1y Lys 55 val val Ile Asp Ala Asn 60 Trp

Arg Trp Val 65: His Lys Val Gly Asp Tyr Thr Asn 70 75 Cys Tyr Thr Gly Asn 80

Thr Trp ASp: Thr Thr 85 Ile Cys Pro ASp ASp Ala Thr Cys 90 Ala Ser Asn 95

Cys Ala Leu Glu 100: Gly Ala Asn Tyr Glu Ser Thr Tyr Gly Val Thr Ala 105 110

Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn 115 120: Phe val Thr Thr Ser Gln Gln Lys 125

Asn: I1e Gly Ser Arg 130 Leu Tyr Met 135 Met Lys Asp Asp Ser Thr Tyr G1u 140

Met 145: Phe Lys Leu Leu Asn 150 Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val 155 Ser 160

Asn: Leu Pro Cys Gly Leu 165 Asn G1y Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp 170 175

Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys 180 185 190

Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys ASp Ser G1n Cys Pro Arg ASp Leu Lys Phe 195 200 205

Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp 210 215 220

Ala Asn Ala Gly Thr G1y Asn Bis G1y Ser Cys Cys Ala Glu Met ASp 225 230 235 240

Ile Trp Glu Ala Asn Ser lle Ser Thr Ala Phe Thr Pro Bis Pro Cys 245 250 255

Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly Asp Ala Cys Gly Gly Thr 260 265 270

Tyr Ser Ser ASp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys ASp Pro ASp Gly Cys ASp 275 280 285

Phe Asn Ser Phe Arg Gln Gly Asn Lys Thr Phe Tyr Gly Pro Gly Met 290 295 300

Thr val ASp Thr Lys Ser Lys Phe Thr val val Thr Gln Phe Ile Thr 305 310 315 320

ASp Asp Gly Thr Ser Ser Gly Thr Leu Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr 325 330 335

Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu Ser Thr Trp Thr Gly 340 345 350

val Ser Gly Asn: Ser Ile Thr Thr Glu Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ser

355: 360 365

Leu: Phe Gln Asp Gln Asn Val Phe Glu Lys His Gly Gly Leu Glu Gly

370: 375 380

Met: Gly Ala Ala Leu Ala Gln Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp

385: 390 395 400

Asp Asp His Ser Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Asn Tyr Pro Thr 405 410 415

Thr Ala Ser Ser Thr Thr Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys Asp Ile 420 425 430

Ser Ser Gly Val Pro Ala ASp Val Glu Ala Asn Bis Pro ASp Ala Tyr 435 440 445

val val Tyr Ser Asn Ile Lys val Gly Pro Ile Gly Ser Thr Phe Asn 450 455 460

Ser Gly Gly Ser Asn Pro Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 465 470 475 480

Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Gly Asn Pro Gly Gly Thr Gly 485 490 495

Val Ala Gln Bis Tyr Gly Gln Cys Gly Gly !le Gly Trp Thr Gly Pro

Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr 515 520

Ser Gln Cys Leu 530

<210> 51

<211> 1713

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 51 atgaagcacc ttgcatcttc catcgcattg cagaccgtat ggggccaatg tatgttctgg tgatatgctt ctaggtggcg gccaaggctg agcctgtagc acactgaatc cctgtatgtt acttccttag actacgctca gtgtatcccg acgacgacgg cggcgacgac gacatcccag actacatccg cacccaccgt gaccgcatcc gccaacccct actactcctc cgaggtccat ctgcagccca aggctagtgc tgttgctgaa ttatcccaat actgagacca actctctgac

505 510 Cys Gln Lys Leu Asn ASp Tyr Tyr

actctactgt tgcctgccgt ctgtcactgg aataagactg gtctggcccg acgagctgtg agatatcgtc ctgagtggag ggagccaccg cgacgtccac accaccacca aacctaccac ggtaaccctt tcagcggcta actctggcca tgccttctct gtgccctcat ttgtttggct agtcgtagcg acgttgccgc

gcaggcccag 60 tatcaactgc 120 ttgccggcgc 180 acttatactg 240 caccctcacg 300 gactggtcca 360 ccagctgtat 420 gcccagctcg 480 gtaagtggcc 540 caaggtgccc 600

actatgggaa cctacctggc cgacattcag gccaagaaca aggccggcgc caaccctcct 660 atcgctggta tcttcgtggt ctacgacttg ccggaccgtg actgcgccgc tctggccagt 720 aatggcgagt actcaattgc caacaacggt gtggccaact acaaggcgta cattgacgcc 780 atccgtgctc agctggtgaa gtactctgac gttcacacca tcctcgtcat cggtaggccg 840 tacacctccg ttgcgcgccg cctttctctg acatcttgca gaacccgaca gcttggccaa 900 cctggtgacc aacctcaacg tcgccaaatg cgccaatgcg cagagcgcct acctggagtg 960 tgtcgactat gctctgaagc agctcaacct gcccaacgtc gccatgtacc tcgacgcagg 1020 tatgcctcac ttcccgcatt ctgtatccct tccagacact aactcatcag gccatgcggg 1080 ctggctcgga tggcccgcca acttgggccc cgccgcaaca ctcttcgcca aagtctacac 1140 cgacgcgggt tcccccgcgg ctgttcgtgg cctggccacc aacgtcgcca actacaacgc 1200 ctggtcgctc agtacctgcc cctcctacac ccagggagac cccaactgcg acgagaagaa 1260 gtacatcaac gccatggcgc ctcttctcaa ggaagccggc ttcgatgccc acttcatcat 1320 ggatacctgt aagtgcttat tccaatcgcc gatgtgtgcc gactaatcaa tgtttcagcc 1380 cggaatggcg tccagcccac gaagcaaaac gcctggggtg actggtgcaa cgtcatcggc 1440 accggcttcg gtgttcgccc ctcgactaac accggcgatc cgctccagga tgcctttgtg 1500 tggatcaagc ccggtggaga gagtgatggc acgtccaact cgacttcccc ccggtatgac 1560 gcgcactgcg gatatagtga tgctctgcag cctgctcctg aggctggtac ttggttccag 1620 gtatgtcatc cattagccag atgagggata agtgactgac ggacctaggc ctactttgag 1680 cagcttctga ccaacgctaa cccgtccttt taa 1713

<210> 52

<211> 454

<212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 52

Met Lys His Leu

Val Gln Ala Gln 20

Ser Gly Pro Thr 35

Ala Ser Ser I le Ala Leu Thr Leu Leu Leu Pro Ala 5 10 15

Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp 25 30

Ser Cys Val Ala Gly Ala Ala Cys Ser Thr Leu Asn 40 45

Pro Tyr Tyr Ala 50: Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr 55 60

5: Leu 65 Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr 70 Ser Gln Thr Thr Thr Lys 75 80

10: Pro Thr Thr Thr Gly Pro Thr Thr 85 Ser Ala Pro Thr val Thr Ala Ser 90 95

15: Gly Asn Pro Phe 100 Ser Gly Tyr Gln Leu 105 Tyr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ser 110

Ser Glu Val 115: Bis Thr Leu Ala Met 120 Pro Ser Leu Pro Ser Ser Leu Gln 125

20: Pro Lys Ala Ser Ala Val Ala Glu 130 135 Val Pro Ser Phe Val 140 Trp Leu Asp

25: Val Ala Ala Lys 145 Val Pro Thr Met 150 G1y Thr Tyr Leu 155 Ala ASp I1e Gln 160

30: Ala Lys Asn Lys Ala Gly Ala Asn 165 Pro Pro Ile Ala Gly 170 Ile Phe Val 175

35: Val Tyr Asp Leu 180 Pro Asp Arg Asp Cys 185 Ala Ala Leu Ala Ser Asn 190 Gly

Glu Tyr: Ser Ile Ala Asn 195 Asn Gly Val Ala Asn 200 Tyr Lys 205 Ala Tyr Ile

40: Asp Ala 210 Ile Arg Ala Gln Leu Val Lys Tyr 215 Ser Asp Val 220 Bis Thr Ile

45: Leu val 225 Ile Glu Pro ASp 230 Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn 235 Leu Asn 240

SO: Val Ala Lys Cys Ala Asn 245 Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys 250 Val Asp 255

55: Tyr Ala Leu Lys 260 Gln Leu Asn Leu Pro Asn 265 Val Ala Met Tyr Leu Asp 270

Ala Gly Bis Ala 275: Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn 280 Leu Gly Pro Ala 285

Ala Thr Leu Phe 290: Ala Lys Val 295 Tyr Thr Asp Ala Gly 300 Ser Pro Ala Ala

val Arg Gly Leu 305: Ala Thr Asn val Ala Asn Tyr Asn 310 315 Ala Trp Ser Leu 320

Ser Thr Cys: Pro Ser Tyr Thr Gln 325 Gly Asp 330 Pro Asn Cys Asp Glu Lys 335

Lys Tyr: Ile Asn 340 Ala Met Ala Pro Leu 345 Leu Lys Glu Ala Gly Phe ASp 350

Ala His Phe 355: Ile Met ASp Thr Ser Arg Asn Gly val Gln Pro Thr Lys 360 365

Gln Asn 370: Ala Trp Gly Asp Trp Cys 375 Asn Val Ile Gly Thr Gly 380 Phe Gly

val Arg Pro Ser Thr Asn 385 390: Thr Gly ASp Pro Leu 395 Gln ASp Ala Phe val 400

Trp: Ile Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser Thr Ser 405 410 415

Pro Arg Tyr ASp 420: Ala Bis Cys Gly Tyr Ser ASp Ala Leu Gln 425 430 Pro Ala

Pro Glu Ala Gly Thr Trp Phe Gln 435 440: Ala Tyr Phe Glu Gln Leu 445 Leu Thr

Asn Ala Asn Pro Ser Phe 450

<210> <211> <212> <213>: 53 2586 ADN Aspergillus oryzae

<400> 53 atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgccaag: 60

gatgatctcg cgtactcccc: tcctttctac ccttccccat gggcagatgg tcagggtgaa 120

tgggcggaag tatacaaacg cgctgtagac atagtttccc agatgacgtt gacagagaaa: 180

gtcaacttaa cgactggaac aggatggcaa ctagagaggt gtgttggaca aactggcagt: 240

gttcccagac tcaacatccc cagcttgtgt ttgcaggata gtcctcttgg tattcgtttc 300 tcggactaca attcagcttt ccctgcgggt gttaatgtcg ctgccacctg ggacaagacg 360 ctcgcctacc ttcgtggtca ggcaatgggt gaggagttca gtgataaggg tattgacgtt 420 cagctgggtc ctgctgctgg ccctctcggt gctcatccgg atggcggtag aaactgggaa 480 ggtttctcac cagatccagc cctcaccggt gtactttttg cggagacgat taagggtatt 540 caagatgctg gtgtcattgc gacagctaag cattatatca tgaacgaaca agagcatttc 600 cgccaacaac ccgaggctgc gggttacgga ttcaacgtaa gcgacagttt gagttccaac 660 gttgatgaca agactatgca tgaattgtac ctctggccct tcgcggatgc agtacgcgct 720 ggagtcggtg ctgtcatgtg ctcttacaac caaatcaaca acagctacgg ttgcgagaat 780 agcgaaactc tgaacaagct tttgaaggcg gagcttggtt tccaaggctt cgtcatgagt 840 gattggaccg ctcatcacag cggcgtaggc gctgctttag caggtctgga tatgtcgatg 900 cccggtgatg ttaccttcga tagtggtacg tctttctggg gtgcaaactt gacggtcggt 960 gtccttaacg gtacaatccc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg tatcatggcc 1020 gcttattaca aggttggccg cgacaccaaa tacacccctc ccaacttcag ctcgtggacc 1080 agggacgaat atggtttcgc gcataaccat gtttcggaag gtgcttacga gagggtcaac 1140 gaattcgtgg acgtgcaacg cgatcatgcc gacctaatcc gtcgcatcgg cgcgcagagc 1200 actgttctgc tgaagaacaa gggtgccttg cccttgagcc gcaaggaaaa gctggtcgcc 1260 cttctgggag aggatgcggg ttccaactcg tggggcgcta acggctgtga tgaccgtggt 1320 tgcgataacg gtacccttgc catggcctgg ggtagcggta ctgcgaattt cccatacctc 1380 gtgacaccag agcaggcgat tcagaacgaa gttcttcagg gccgtggtaa tgtcttcgcc 1440 gtgaccgaca gttgggcgct cgacaagatc gctgcggctg cccgccaggc cagcgtatct 1500 ctcgtgttcg tcaactccga ctcaggagaa ggctatctta gtgtggatgg aaatgagggc 1560 gatcgtaaca acatcactct gtggaagaac ggcgacaatg tggtcaagac cgcagcgaat 1620 aactgtaaca acaccgttgt catcatccac tccgtcggac cagttttgat cgatgaatgg 1680 tatgaccacc ccaatgtcac tggtattctc tgggctggtc tgccaggcca ggagtctggt 1740 aactccattg ccgatgtgct gtacggtcgt gtcaaccctg gcgccaagtc tcctttcact 1800 tggggcaaga cccgggagtc gtatggttct cccttggtca aggatgccaa caatggcaac 1860 ggagcgcccc agtctgattt cacccagggt gttttcatcg attaccgcca tttcgataag 1920 ttcaatgaga cccctatcta cgagtttggc tacggcttga gctacaccac cttcgagctc 1980 tccgacctcc atgttcagcc cctgaacgcg tcccgataca ctcccaccag tggcatgact 2040 gaagctgeaa agaaetttgg tgaaattgge gatgegtegg agtaegtgta tecggagggg 2100 etggaaagga teeatgagtt tatetatece tggatcaaet etaccgacct gaaggcatcg 2160 tctgacgatt ctaactacgg ctgggaagac tccaagtata ttcccgaagg cgccacggat 2220 gggtctgccc agccccgttt gcccgctagt ggtggtgccg gaggaaaccc cggtctgtac 2280 gaggatettt tccgegtctc tgtgaaggte aagaaeaegg geaatgtcge eggtgatgaa 2340 gttccteage tgtacgtttc eetaggcgge ecgaatgagc ceaaggtggt aetgcgeaag 2400 tttgagcgta ttcacttggc cccttcgcag gaggccgtgt ggacaacgac ccttacccgt 2460 egtgacettg caaaetggga egtttcgget caggaetgga cegteactce ttaccceaag 2520 acgatctacg ttggaaactc ctcacggaaa ctgccgctcc aggcctcgct gcctaaggcc 2580 eagtaa 2586

<210> 54

<211> 861

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 54

Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val 1 5 10 15

val Ser Ala Lys ASp ASp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser 20 25 30

Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala 35 40 45

Val Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr 50 55 60

Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Glu Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser 65 70 75 80

Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu 85 90 95

Gly Ile Arg Phe Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn 100 105 110

Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala 115 120 125

Met Gly Glu Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro 130 135 140

Ala Ala Gly Pro Leu: Gly Ala His Pro ASp Gly Gly Arg Asn Trp Glu

145: 150 155 160

Gly: Phe Ser Pro ASp Pro Ala Leu Thr Gly val Leu Phe Ala Glu Thr

165: 170 175

Ile Lys Gly: Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr

180: 185 190

Ile Met: Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly

195: 200 205

Tyr Gly Phe Asn Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys 210 215 220

Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala ASp Ala Val Arg Ala 225 230 235 240

Gly val Gly Ala val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr 245 250 255

Gly Cys Glu Asn Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu 260 265 270

Gly Phe Gln Gly Phe val Met Ser ASp Trp Thr Ala His His Ser Gly 275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu ASp Met Ser Met Pro Gly ASp val 290 295 300

Thr Phe ASp Ser Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly 305 310 315 320

Val Leu Asn Gly Thr Ile Pro Gln Trp Arg val ASp ASp Met Ala val 325 330 335

Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg ASp Thr Lys Tyr Thr 340 345 350

Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Ala His

355: 360 365

5: Asn Bis val 370 Ser Glu Gly Ala Tyr 375 Glu Arg val Asn 380 Glu Phe val ASp

val 385: Gln Arg ASp His Ala ASp 390 Leu Ile Arg Arg 395 Ile Gly Ala Gln Ser 400

Thr Val: Leu Leu Lys 405 Asn Lys Gly Ala Leu 410 Pro Leu Ser Arg Lys 415 Glu

15: Lys Leu Val Ala 420 Leu Leu Gly Glu Asp Ala Gly 425 Ser Asn Ser Trp Gly 430

Ala Asn: Gly Cys Asp Asp Arg Gly Cys Asp Asn 435 440 Gly Thr Leu 445 Ala Met

25: Ala Trp Gly Ser 450 Gly Thr Ala Asn 455 Phe Pro Tyr Leu 460 Val Thr Pro Glu

Gln Ala 465: Ile Gln Asn Glu 470 val Leu Gln Gly Arg Gly Asn val 475 Phe Ala 480

Val: Thr Asp Ser Trp Ala Leu Asp Lys 485 Ile Ala Ala 490 Ala Ala Arg 495 Gln

35: Ala Ser Val Ser 500 Leu Val Phe Val Asn 505 Ser Asp Ser Gly Glu 510 Gly Tyr

Leu: Ser val ASp Gly Asn 515 Glu Gly ASp Arg Asn Asn 520 Ile Thr 525 Leu Trp

4S: Lys Asn 530 Gly ASp Asn val val 535 Lys Thr Ala Ala Asn 540 Asn Cys Asn Asn

Thr val val 545: Ile Ile Bis 550 Ser val Gly Pro val 555 Leu Ile ASp Glu Trp 560

Tyr Asp: His Pro Asn Val Thr Gly 565 Ile Leu 570 Trp Ala Gly Leu Pro Gly 575

55

Gln Glu Ser Gly Asn Ser Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn 580 585 590

Pro Gly Ala Lys 595: Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys 600 Thr Arg 605 Glu Ser Tyr

5: Gly Ser Pro Leu 610 Val Lys Asp Ala Asn Asn 615 Gly Asn Gly Ala Pro Gln 620

Ser ASp 625: Phe Thr Gln Gly Val 630 Phe 11e ASp Tyr Arg His 635 Phe ASp Lys 640

15: Phe Asn Glu Thr Pro 11e Tyr Glu 645 Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr 650 655

Thr Phe Glu Leu 660: Ser Asp Leu His Val 665 Gln Pro Leu Asn Ala 670 Ser Arg

Tyr Thr: Pro Thr 675 Ser Gly Met Thr Glu Ala Ala Lys Asn 680 685 Phe Gly Glu

25: 11e Gly ASp Ala 690 Ser Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Glu 695 700 Arg 11e

His 705: Glu Phe 11e Tyr Pro Trp 11e Asn Ser Thr Asp Leu Lys 710 715 Ala Ser 720

35: Ser Asp Asp Ser Asn 725 Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Lys Tyr 11e 730 Pro Glu 735

Gly Ala Thr ASp Gly Ser Ala Gln 740: Pro Arg Leu 745 Pro Ala Ser Gly Gly 750

Ala Gly Gly Asn 755: Pro Gly Leu Tyr Glu Asp Leu 760 Phe Arg Val 765 Ser Val

4S: Lys val Lys 770 Asn Thr Gly Asn val Ala Gly ASp 775 Glu val Pro Gln Leu 780

Tyr val Ser Leu 785: Gly Gly Pro Asn 790 Glu Pro Lys 795 val val Leu Arg Lys 800

55: Phe Glu Arg Ile His 805 Leu Ala Pro Ser Gln Glu Ala Val 810 Trp Thr Thr 815

Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn 820 825: Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp 830

Trp Thr Val Thr Pro Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Val Gly Asn Ser Ser 835 840 845

Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Lys Ala Gln 850 855 860

<210> 55

<211> 3060

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 55 atgagattcg gttggctcga ggtggccgct ctgacggccg cttctgtagc caatgcccag 60 gtttgtgatg ctttcccgtc attgtttcgg atatagttga caatagtcat ggaaataatc 120 aggaattggc tttctctcca ccattctacc cttcgccttg ggctgatggc cagggagagt 180 gggcagatgc ccatcgacgc gccgtcgaga tcgtttctca gatgacactg gcggagaagg 240 ttaaccttac aacgggtact gggtgggttg cgactttttt gttgacagtg agctttcttc 300 actgaccatc tacacagatg ggaaatggac cgatgcgtcg gtcaaaccgg cagcgttccc 360 aggtaagctt gcaattctgc aacaacgtgc aagtgtagtt gctaaaacgc ggtggtgcag 420 acttggtatc aactggggtc tttgtggcca ggattcccct ttgggtatcc gtttctgtga 480 gctatacccg cggagtcttt cagtccttgt attatgtgct gatgattgtc tctgtatagc 540 tgacctcaac tccgccttcc ctgctggtac taatgtcgcc gcgacatggg acaagacact 600 cgcctacctt cgtggcaagg ccatgggtga ggaattcaac gacaagggcg tggacatttt 660 gctggggcct gctgctggtc ctctcggcaa atacccggac ggcggcagaa tctgggaagg 720 cttctctcct gatccggttc tcactggtgt acttttcgcc gaaactatca agggtatcca 780 agacgcgggt gtgattgcta ctgccaagca ttacattctg aatgaacagg agcatttccg 840 acaggttggc gaggcccagg gatatggtta caacatcacg gagacgatca gctccaacgt 900 ggatgacaag accatgcacg agttgtacct ttggtgagta gttgacactg caaatgagga 960 ccttgattga tttgactgac ctggaatgca ggccctttgc agatgctgtg cgcggtaaga 1020 ttttccgtag acttgacctc gcgacgaaga aatcgctgac gaaccatcgt agctggcgtt 1080 ggcgctgtca tgtgttccta caatcaaatc aacaacagct acggttgtca aaacagtcaa 1140 actctcaaca agctcctcaa ggctgagctg ggcttccaag gcttcgtcat gagtgactgg 1200 agcgctcacc acagcggtgt cggcgctgcc ctcgctgggt tggatatgtc gatgcctgga 1260 gacatttcct tcgacgacgg actctccttc tggggcacga acctaactgt cagtgttctt 1320

aacggcaccg ttccagcctg gcgtgtcgat gacatggctg ttcgtatcat gaccgcgtac 1380 tacaaggttg gtcgtgaccg tcttcgtatt ccccctaact tcagctcctg gacccgggat 1440 gagtacggct gggagcattc tgctgtctcc gagggagcct ggaccaaggt gaacgacttc 1500 gtcaatgtgc agcgcagtca ctctcagatc atccgtgaga ttggtgccgc tagtacagtg 1560 ctcttgaaga acacgggtgc tcttcctttg accggcaagg aggttaaagt gggtgttctc 1620 ggtgaagacg ctggttccaa cccgtggggt gctaacggct gccccgaccg cggctgtgat 1680 aacggcactc ttgctatggc ctggggtagt ggtactgcca acttccctta ccttgtcacc 1740 cccgagcagg ctatccagcg agaggtcatc agcaacggcg gcaatgtctt tgctgtgact 1800 gataacgggg ctctcagcca gatggcagat gttgcatctc aatccaggtg agtgcgggct 1860 cttagaaaaa gaacgttctc tgaatgaagt tttttaacca ttgcgaacag cgtgtctttg 1920 gtgtttgtca acgccgactc tggagagggt ttcatcagtg tcgacggcaa cgagggtgac 1980 cgcaaaaatc tcactctgtg gaagaacggc gaggccgtca ttgacactgt tgtcagccac 2040 tgcaacaaca cgattgtggt tattcacagt gttgggcccg tcttgatcga ccggtggtat 2100 gataacccca acgtcactgc catcatctgg gccggcttgc ccggtcagga gagtggcaac 2160 tccctggtcg acgtgctcta tggccgcgtc aaccccagcg ccaagacccc gttcacctgg 2220 ggcaagactc gggagtctta cggggctccc ttgctcaccg agcctaacaa tggcaatggt 2280 gctccccagg atgatttcaa cgagggcgtc ttcattgact accgtcactt tgacaagcgc 2340 aatgagaccc ccatttatga gtttggccat ggcttgagct acaccacctt tggttactct 2400 caccttcggg ttcaggccct caatagttcg agttcggcat atgtcccgac tagcggagag 2460 accaagcctg cgccaaccta tggtgagatc ggtagtgccg ccgactacct gtatcccgag 2520 ggtctcaaaa gaattaccaa gtttatttac ccttggctca actcgaccga cctcgaggat 2580 tcttctgacg acccgaacta cggctgggag gactcggagt acattcccga aggcgctagg 2640 gatgggtctc ctcaacccct cctgaaggct ggcggcgctc ctggtggtaa ccctaccctt 2700 tatcaggatc ttgttagggt gtcggccacc ataaccaaca ctggtaacgt cgccggttat 2760 gaagtccctc aattggtgag tgacccgcat gttccttgcg ttgcaatttg gctaactcgc 2820 ttctagtatg tttcactggg cggaccgaac gagcctcggg tcgttctgcg caagttcgac 2880 cgaatcttcc tggctcctgg ggagcaaaag gtttggacca cgactcttaa ccgtcgtgat 2940 ctcgccaatt gggatgtgga ggctcaggac tgggtcatca caaagtaccc caagaaagtg 3000 cacgtcggca gctcctcgcg taagctgcct ctgagagcgc ctctgccccg tgtctactag 3060

5: <210> <211> <212> <213> <400> 56 863 PRT Aspergillus fumigatus 56

Met Arg Phe Gly Trp Leu 1 5: Glu val Ala Ala Leu 10 Thr Ala Ala Ser val 15

Ala Asn: Ala Gln 20 Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro 25 30

15: Trp Ala Asp Gly Gln Gly 35 Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg 40 45 Ala Val

Glu: Ile Val 50 Ser Gln Met Thr Leu 55 Ala Glu Lys Val Asn 60 Leu Thr Thr

25: Gly Thr Gly Trp Glu Met 65 70 ASp Arg Cys val Gly Gln Thr Gly Ser val 75 80

Pro Arg Leu Gly: Ile Asn 85 Trp Gly Leu Cys Gly Gln ASp 90 Ser Pro Leu 95

Gly: Ile Arg Phe 100 Ser Asp Leu Asn Ser Ala 105 Phe Pro Ala Gly Thr Asn 110

35: Val Ala Ala Thr 115 Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu 120 Arg Gly Lys Ala 125

Met: Gly Glu Glu 130 Phe Asn ASp Lys Gly val ASp 135 Ile Leu Leu Gly Pro 140

4S: Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr 145 150 Pro ASp Gly Gly Arg 155 Ile Trp Glu 160

Gly Phe: Ser Pro ASp 165 Pro Val Leu Thr Gly val Leu 170 Phe Ala Glu Thr 175

Ile Lys Gly: Ile Gln Asp Ala Gly Val 180 185 Ile Ala Thr Ala Lys 190 His Tyr

55: Ile Leu Asn 195 Glu Gln Glu His Phe 200 Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly 205

150

Tyr Gly Tyr Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys 210 215 220

Thr Met Bis Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala 225 230 235 240

Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr 245 250 255

Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu 260 265 270

Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala Bis Bis Ser Gly 275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile 290 295 300

Ser Phe ASp ASp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser 305 310 315 320

Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val 325 330 335

Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile 340 345 350

Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg ASp Glu Tyr Gly Trp Glu Bis 355 360 365

Ser Ala Val Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn 370 375 380

Val Gln Arg Ser Bis Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser 385 390 395 400

Thr Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu 405 410 415

Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly 420 425 430

Ala Asn Gly Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met 435 440 445

Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu 450 455 460

Gln Ala 11e Gln Arg Glu val 11e Ser Asn Gly Gly Asn val Phe Ala 465 470 475 480

Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln 485 490 495

Ser Ser val Ser Leu val Phe val Asn Ala ASp Ser Gly Glu Gly Phe 500 505 510

11e Ser val ASp Gly Asn Glu Gly ASp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp 515 520 525

Lys Asn Gly Glu Ala Val 11e Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn 530 535 540

Thr Ile val val 11e Bis Ser val Gly Pro val Leu 11e ASp Arg Trp 545 550 555 560

Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala 11e Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly 565 570 575

Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu val ASp val Leu Tyr Gly Arg val Asn 580 585 590

Pro Ser Ala Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr 595 600 605

Gly Ala Pro Leu Leu Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln 610 615 620

ASp ASp Phe Asn Glu Gly val Phe 11e ASp Tyr Arg Bis Phe ASp Lys 625 630 635 640

Arg Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr 645 650 655

Thr Phe Gly Tyr Ser His Leu Arg Val Gln Ala Leu Asn Ser Ser Ser 660 665 670

Ser Ala Tyr Val: Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr

675: 680 685

152

Gly Glu 690: Ile Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys 695 700

Arg 705: Ile Thr Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu 710 Asn Ser Thr ASp Leu Glu 715 720

ASp: Ser Ser ASp ASp 725 Pro Asn Tyr Gly Trp Glu ASp Ser Glu 730 Tyr 735 Ile

Pro Glu Gly Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln 740 745: Pro Leu Leu Lys 750 Ala Gly

Gly Ala: Pro Gly Gly Asn 755 Pro Thr Leu 760 Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val 765

Ser Ala Thr 770: Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu 775 780 Val Pro

Gln Leu Tyr Val 785: Ser Leu 790 Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val 795 Leu 800

Arg Lys Phe ASp Arg 805: Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys 810 Val 815 Trp

Thr Thr Thr Leu 820: Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn 825 Trp Asp Val Glu Ala 830

Gln ASp Trp val 835: Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys 840 val His val Gly Ser 845

Ser Ser Arg Lys 850: Leu Pro Leu Arg 855 Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr 860

<210> <211> <212> <213>: 57 2800 ADN Penicillium brasilianum

<400> 57 tgaaaatgca gggttctaca atctttctgg: ctttcgcctc atgggcgagc caggttgctg 60

ccattgcgca gcccatacag aagcacgagg: tttgttttat cttgctcatg gacgtgcttt 120

gacttgacta attgttttac atacagcccg: gatttctgca cgggccccaa gccatagaat 180

cgttctcaga accgttctac ccgtcgccct: ggatgaatcc tcacgccgag ggctgggagg 240

ccgcatatca gaaagctcaa gattttgtct cgcaactcac tatcttggag aaaataaatc 300 tgaccaccgg tgttgggtaa gtctctccga ctgcttctgg gtcacggtgc gacgagccac 360 tgactttttg aagctgggaa aatgggccgt gtgtaggaaa cactggatca attcctcgtc 420 tcggattcaa aggattttgt acccaggatt caccacaggg tgttcggttc gcagattatt 480 cctccgcttt cacatctagc caaatggccg ccgcaacatt tgaccgctca attctttatc 540 aacgaggcca agccatggca caggaacaca aggctaaggg tatcacaatt caattgggcc 600 ctgttgccgg ccctctcggt cgcatccccg agggcggccg caactgggaa ggattctccc 660 ctgatcctgt cttgactggt atagccatgg ctgagacaat taagggcatg caggatactg 720 gagtgattgc ttgcgctaaa cattatattg gaaacgagca ggagcacttc cgtcaagtgg 780 gtgaagctgc gggtcacgga tacactattt ccgatactat ttcatctaat attgacgacc 840 gtgctatgca tgagctatac ttgtggccat ttgctgatgc cgttcgcgct ggtgtgggtt 900 ctttcatgtg ctcatactct cagatcaaca actcctacgg atgccaaaac agtcagaccc 960 tcaacaagct cctcaagagc gaattgggct tccaaggctt tgtcatgagc gattggggtg 1020 cccatcactc tggagtgtca tcggcgctag ctggacttga tatgagcatg ccgggtgata 1080 ccgaatttga ttctggcttg agcttctggg gctctaacct caccattgca attctgaacg 1140 gcacggttcc cgaatggcgc ctggatgaca tggcgatgcg aattatggct gcatacttca 1200 aagttggcct tactattgag gatcaaccag atgtcaactt caatgcctgg acccatgaca 1260 cctacggata taaatacgct tatagcaagg aagattacga gcaggtcaac tggcatgtcg 1320 atgttcgcag cgaccacaat aagctcattc gcgagactgc cgcgaagggt acagttctgc 1380 tgaagaacaa ctttcatgct ctccctctga agcagcccag gttcgtggcc gtcgttggtc 1440 aggatgccgg gccaaacccc aagggcccta acggctgcgc agaccgagga tgcgaccaag 1500 gcactctcgc aatgggatgg ggctcagggt ctaccgaatt cccttacctg gtcactcctg 1560 acactgctat tcagtcaaag gtcctcgaat acgggggtcg atacgagagt atttttgata 1620 actatgacga caatgctatc ttgtcgcttg tctcacagcc tgatgcaacc tgtatcgttt 1680 ttgcaaatgc cgattccggt gaaggctaca tcactgtcga caacaactgg ggtgaccgca 1740 acaatctgac cctctggcaa aatgccgatc aagtgattag cactgtcagc tcgcgatgca 1800 acaacacaat cgttgttctc cactctgtcg gaccagtgtt gctaaatggt atatatgagc 1860 acccgaacat cacagctatt gtctgggcag ggatgccagg cgaagaatct ggcaatgctc 1920 tcgtggatat tctttggggc aatgttaacc ctgccggtcg cactccgttc acctgggcca 1980

aaagtcgaga ggactatggc actgatataa tgtacgagcc caacaacggc cagcgtgcgc 2040 ctcagcagga tttcaccgag agcatctacc tcgactaccg ccatttcgac aaagctggta 2100 tcgagccaat ttacgagttt ggattcggcc tctcctatac caccttcgaa tactctgacc 2160 tccgtgttgt gaagaagtat gttcaaccat acagtcccac gaccggcacc ggtgctcaag 2220 caccttccat cggacagcca cctagccaga acctggatac ctacaagttc cctgctacat 2280 acaagtacat caaaaccttc atttatccct acctgaacag cactgtctcc ctccgcgctg 2340 cttccaagga tcccgaatac ggtcgtacag actttatccc accccacgcg cgtgatggct 2400 cccctcaacc tctcaacccc gctggagacc cagtggccag tggtggaaac aacatgctct 2460 acgacgaact ttacgaggtc actgcacaga tcaaaaacac tggcgacgtg gccggcgacg 2520 aagtcgtcca gctttacgta gatctcgggg gtgacaaccc gcctcgtcag ttgagaaact 2580 ttgacaggtt ttatctgctg cccggtcaga gctcaacatt ccgggctaca ttgacgcgcc 2640 gtgatttgag caactgggat attgaggcgc agaactggcg agttacggaa tcgcctaaga 2700 gagtgtatgt tggacggtcg agtcgggatt tgccgctgag ctcacaattg gagtaatgat 2760 catgtctacc aatagatgtt gaatgtctgg tgtggatatt 2800

<210> 58

<211> 878

<212> PRT

<213> Penicillium brasilianum

<400> 58

Met Gln Gly Ser Thr Ile Phe Leu Ala Phe Ala Ser Trp Ala Ser Gln 1 5 10 15

Val Ala Ala Ile Ala Gln Pro Ile Gln Lys His Glu Pro Gly Phe Leu 20 25 30

His Gly Pro Gln Ala Ile Glu Ser Phe Ser Glu Pro Phe Tyr Pro Ser 35 40 45

Pro Trp Met Asn Pro His Ala Glu Gly Trp Glu Ala Ala Tyr Gln Lys 50 55 60

Ala Gln Asp Phe Val Ser Gln Leu Thr Ile Leu Glu Lys Ile Asn Leu 65 70 75 80

Thr Thr Gly Val Gly Trp Glu Asn Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Gly 85 90 95

Ser 11e Pro Arg Leu Gly Phe Lys Gly Phe Cys Thr Gln Asp Ser Pro 100 105 110

G1n G1y val Arg Phe Ala ASp Tyr Ser Ser Ala Phe Thr Ser Ser Gln 115 120 125

Met Ala Ala Ala Thr Phe Asp Arg Ser 11e Leu Tyr Gln Arg Gly Gln 130 135 140

Ala Met Ala Gln Glu Bis Lys Ala Lys Gly 11e Thr 11e Gln Leu Gly 145 150 155 160

Pro val Ala Gly Pro Leu Gly Arg 11e Pro Glu Gly G1y Arg Asn Trp 165 170 175

Glu Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly 11e Ala Met Ala Glu 180 185 190

Thr I1e Lys Gly Met G1n ASp Thr G1y val 11e Ala Cys Ala Lys Bis 195 200 205

Tyr 11e Gly Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Ala 210 215 220

Gly Bis Gly Tyr Thr 11e Ser ASp Thr Ile Ser Ser Asn 11e ASp ASp 225 230 235 240

Arg Ala Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg 245 250 255

Ala Gly Val Gly Ser Phe Met Cys Ser Tyr Ser Gln 11e Asn Asn Ser 260 265 270

Tyr G1y Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ser Glu 275 280 285

Leu Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser 290 295 300

Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp 305 310 315 320

Thr Glu Phe Asp Ser Gly Leu Ser Phe Trp Gly Ser Asn Leu Thr 11e 325 330 335

Ala Ile Leu Asn Gly Thr Val Pro Glu Trp Arg Leu Asp Asp Met Ala 340 345 350

Met Arg 11e Met Ala Ala Tyr Phe Lys Val Gly Leu Thr 11e Glu ASp 355 360 365

Gln Pro ASp val Asn Phe Asn Ala Trp Thr His ASp Thr Tyr Gly Tyr 370 375 380

Lys Tyr Ala Tyr Ser Lys Glu Asp Tyr Glu Gln Val Asn Trp His Val 385 390 395 400

Asp Val Arg Ser Asp His Asn Lys Leu Ile Arg Glu Thr Ala Ala Lys 405 410 415

Gly Thr Val Leu Leu Lys Asn Asn Phe His Ala Leu Pro Leu Lys Gln 420 425 430

Pro Arg Phe Val Ala Val Val Gly Gln ASp Ala Gly Pro Asn Pro Lys 435 440 445

Gly Pro Asn Gly Cys Ala ASp Arg Gly Cys ASp Gln Gly Thr Leu Ala 450 455 460

Met Gly Trp Gly Ser Gly Ser Thr Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro 465 470 475 480

ASp Thr Ala Ile Gln Ser Lys Val Leu Glu Tyr Gly Gly Arg Tyr Glu 485 490 495

Ser Ile Phe ASp Asn Tyr ASp ASp Asn Ala 11e Leu Ser Leu val Ser 500 505 510

Gln Pro ASp Ala Thr Cys 11e Val Phe Ala Asn Ala ASp Ser Gly Glu 515 520 525

Gly Tyr 11e Thr val ASp Asn Asn Trp Gly ASp Arg Asn Asn Leu Thr 530 535 540

Leu Trp Gln Asn Ala ASp Gln val 11e Ser Thr val Ser Ser Arg Cys 545 550 555 560

Asn Asn Thr Ile Val Val Leu His Ser Val Gly Pro Val Leu Leu Asn

565: 570 575

5: Gly Ile Tyr Glu 580 His Pro Asn Ile Thr Ala 585 Ile val Trp Ala Gly Met 590

Pro Gly Glu 595: Glu Ser Gly Asn Ala Leu val ASp 600 Ile Leu 605 Trp Gly Asn

Val: Asn 610 Pro Ala Gly Arg Thr Pro Phe 615 Thr Trp Ala 620 Lys Ser Arg Glu

15: Asp Tyr Gly 625 Thr Asp ¡le Met 630 Tyr Glu Pro Asn Asn 635 Gly Gln Arg Ala 640

Pro Gln: Gln Asp Phe 645 Thr Glu Ser rle Tyr Leu Asp Tyr Arg 650 His 655 Phe

25: ASp Lys Ala Gly ¡le Glu 660 Pro Ile Tyr Glu 665 Phe Gly Phe Gly Leu Ser 670

Tyr Thr Thr Phe 675: Glu Tyr Ser ASp Leu Arg val val Lys Lys Tyr val 680 685

Gln: Pro Tyr Ser 690 Pro Thr Thr Gly Thr Gly Ala Gln 695 700 Ala Pro Ser rle

35: Gly 705 Gln Pro Pro Ser Gln 710 Asn Leu Asp Thr Tyr Lys Phe Pro Ala Thr 715 720

Tyr Lys Tyr: Ile Lys 725 Thr Phe Ile Tyr Pro Tyr Leu 730 Asn Ser Thr val 735

4S: Ser Leu Arg Ala 740 Ala Ser Lys ASp Pro Glu 745 Tyr Gly Arg Thr 750 ASp Phe

1le Pro Pro Bis 755: Ala Arg ASp Gly Ser Pro Gln 760 Pro Leu Asn 765 Pro Ala

Gly Asp 770: Pro Val Ala Ser Gly Gly Asn Asn 775 Met Leu 780 Tyr Asp Glu Leu

55

Tyr Glu Val Thr Ala Gln 1le Lys Asn Thr Gly Asp Val Ala Gly Asp 785 790 795 800

Glu Val Val Gln Leu Tyr Val Asp Leu Gly Gly Asp Asn Pro Pro Arg 805 810 815

Gln Leu Arg Asn Phe Asp Arg Phe Tyr Leu Leu Pro Gly Gln Ser Ser 820 825 830

Thr Phe Arg Ala Thr Leu Thr Arg Arg ASp Leu Ser Asn Trp ASp Ile 835 840 845

Glu Ala Gln Asn Trp Arg Val Thr Glu Ser Pro Lys Arg Val Tyr Val 850 855 860

Gly Arg Ser Ser Arg Asp Leu Pro Leu Ser Ser Gln Leu Glu 865 870 875

<210> 59

<211> 2583

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 59 atgaggttca ctttgatcga ggcggtggct ctgactgccg tctcgctggc cagcgctgat 60 gaattggcct actccccacc gtattaccca tccccttggg ccaatggcca gggcgactgg 120 gcgcaggcat accagcgcgc tgttgatatt gtctcgcaaa tgacattgga tgagaaggtc 180 aatctgacca caggaactgg atgggaattg gaactatgtg ttggtcagac tggcggtgtt 240 ccccgattgg gagttccggg aatgtgttta caggatagcc ctctgggcgt tcgcgactcc 300 gactacaact ctgctttccc tgccggcatg aacgtggctg caacctggga caagaatctg 360 gcataccttc gcggcaaggc tatgggtcag gaatttagtg acaagggtgc cgatatccaa 420 ttgggtccag ctgccggccc tctcggtaga agtcccgacg gtggtcgtaa ctgggagggc 480 ttctccccag accctgccct aagtggtgtg ctctttgccg agaccatcaa gggtatccaa 540 gatgctggtg tggttgcgac ggctaagcac tacattgctt acgagcaaga gcatttccgt 600 caggcgcctg aagcccaagg ttttggattt aatatttccg agagtggaag tgcgaacctc 660 gatgataaga ctatgcacga gctgtacctc tggcccttcg cggatgccat ccgtgcaggt 720 gctggcgctg tgatgtgctc ctacaaccag atcaacaaca gttatggctg ccagaacagc 780 tacactctga acaagctgct caaggccgag ctgggcttcc agggctttgt catgagtgat 840 tgggctgctc accatgctgg tgtgagtggt gctttggcag gattggatat gtctatgcca 900 ggagacgtcg actacgacag tggtacgtct tactggggta caaacttgac cattagcgtg 960 ctcaacggaa cggtgcccca atggcgtgtt gatgacatgg ctgtccgcat catggccgcc 1020

tactacaagg tcggccgtga ccgtctgtgg actcctccca acttcagctc atggaccaga 1080 gatgaatacg gctacaagta ctactacgtg tcggagggac cgtacgagaa ggtcaaccag 1140 tacgtgaatg tgcaacgcaa ccacagcgaa ctgattcgcc gcattggagc ggacagcacg 1200 gtgctcctca agaacgacgg cgctctgcct ttgactggta aggagcgcct ggtcgcgctt 1260 atcggagaag atgcgggctc caacccttat ggtgccaacg gctgcagtga ccgtggatgc 1320 gacaatggaa cattggcgat gggctgggga agtggtactg ccaacttccc atacctggtg 1380 acccccgagc aggccatctc aaacgaggtg cttaagcaca agaatggtgt attcaccgcc 1440 accgataact gggctatcga tcagattgag gcgcttgcta agaccgccag tgtctctctt 1500 gtctttgtca acgccgactc tggtgagggt tacatcaatg tggacggaaa cctgggtgac 1560 cgcaggaacc tgaccctgtg gaggaacggc gataatgtga tcaaggctgc tgctagcaac 1620 tgcaacaaca caatcgttgt cattcactct gtcggaccag tcttggttaa cgagtggtac 1680 gacaacccca atgttaccgc tatcctctgg ggtggtttgc ccggtcagga gtctggcaac 1740 tctcttgccg acgtcctcta tggccgtgtc aaccccggtg ccaagtcgcc ctttacctgg 1800 ggcaagactc gtgaggccta ccaagactac ttggtcaccg agcccaacaa cggcaacgga 1860 gcccctcagg aagactttgt cgagggcgtc ttcattgact accgtggatt tgacaagcgc 1920 aacgagaccc cgatctacga gttcggctat ggtctgagct acaccacttt caactactcg 1980 aaccttgagg tgcaggtgct gagcgcccct gcatacgagc ctgcttcggg tgagaccgag 2040 gcagcgccaa ccttcggaga ggttggaaat gcgtcggatt acctctaccc cagcggattg 2100 cagagaatta ccaagttcat ctacccctgg ctcaacggta ccgatctcga ggcatcttcc 2160 ggggatgcta gctacgggca ggactcctcc gactatcttc ccgagggagc caccgatggc 2220 tctgcgcaac cgatcctgcc tgccggtggc ggtcctggcg gcaaccctcg cctgtacgac 2280 gagctcatcc gcgtgtcagt gaccatcaag aacaccggca aggttgctgg tgatgaagtt 2340 ccccaactgt atgtttccct tggcggtccc aatgagccca agatcgtgct gcgtcaattc 2400 gagcgcatca cgctgcagcc gtcggaggag acgaagtgga gcacgactct gacgcgccgt 2460 gaccttgcaa actggaatgt tgagaagcag gactgggaga ttacgtcgta tcccaagatg 2520 gtgtttgtcg gaagctcctc gcggaagctg ccgctccggg cgtctctgcc tactgttcac 2580 taa 2583

<210> 60

<211> 860

<212> PRT 160

<213>: Aspergi11us niger

<400>: 60

5: Met Arg 1 Phe Thr Leu 5 I1e Glu Ala Val Ala Leu 10 Thr Ala Val Ser Leu 15

Ala Ser Ala ASp 20: Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro 25 30

15: Trp Ala Asn 35 G1y Gln G1y Asp Trp Ala Gln Ala Tyr G1n Arg 40 45 Ala Val

Asp: I1e Val 50 Ser Gln Met Thr Leu 55 Asp G1u Lys Val Asn 60 Leu Thr Thr

Gly Thr Gly Trp Glu Leu 65 70: Glu Leu Cys Val G1y 75 Gln Thr Gly G1y Val 80

25: Pro Arg Leu G1y Val 85 Pro Gly Met cys Leu G1n ASp Ser Pro Leu Gly 90 95

Val Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe 100 105: Pro Ala G1y Met 110 Asn Val

35: Ala Ala Thr Trp Asp Lys 115 Asn Leu 120 Ala Tyr Leu Arg G1y Lys 125 Ala Met

Gly Gln Glu Phe 130: Ser ASp Lys Gly Ala ASp 135 11e Gln Leu Gly Pro Ala 140

Ala G1y 145: Pro Leu Gly Arg 150 Ser Pro Asp Gly G1y Arg 155 Asn Trp Glu Gly 160

4S: Phe Ser Pro ASp Pro Ala Leu Ser Gly Val Leu 165 170 Phe Ala Glu Thr 175 Ile

Lys G1y: 11e G1n 180 Asp Ala Gly Val val Ala Thr Ala Lys 185 His Tyr 190 Ile

55: Ala Tyr Glu Gln 195 Glu Bis Phe Arg 200 Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Phe 205

Gly Phe Asn 210: I1e Ser G1u Ser G1y 215 Ser Ala Asn Leu 220 Asp Asp Lys Thr

Met Bis Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala 1le Arg Ala Gly 225 230 235 240

Ala Gly Ala val Met Cys Ser Tyr Asn Gln ¡le Asn Asn Ser Tyr Gly 245 250 255

Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly 260 265 270

Phe Gln Gly Phe val Met Ser ASp Trp Ala Ala Bis Bis Ala Gly val 275 280 285

Ser Gly Ala Leu Ala Gly Leu ASp Met Ser Met Pro Gly ASp Val ASp 290 295 300

Tyr Asp Ser Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr 11e Ser Val 305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr val Pro Gln Trp Arg val ASp ASp Met Ala val Arg 325 330 335

11e Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Trp Thr Pro 340 345 350

Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg ASp Glu Tyr Gly Tyr Lys Tyr Tyr 355 360 365

Tyr Val Ser Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn Gln Tyr Val Asn Val 370 375 380

Gln Arg Asn Bis Ser Glu Leu 11e Arg Arg 11e Gly Ala Asp Ser Thr 385 390 395 400

val Leu Leu Lys Asn ASp Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg 405 410 415

Leu Val Ala Leu 11e Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala 420 425 430

Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly 435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln 450 455 460

Ala: Ile Ser Asn Glu Val Leu Lys His Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala

465: 470 475 480

Thr ASp Asn: Trp Ala Ile ASp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala

485 490 495

Ser val Ser Leu val Phe val Asn Ala ASp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile 500 505 510

Asn Val Asp Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg 515 520 525

Asn Gly Asp Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr 530 535 540

Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp Tyr 545 550 555 560

ASp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gly Gln 565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala ASp val Leu Tyr Gly Arg val Asn Pro 580 585 590

Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gln 595 600 605

ASp Tyr Leu val Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Glu 610 615 620

ASp Phe val Glu Gly val Phe Ile ASp Tyr Arg Gly Phe ASp Lys Arg 625 630 635 640

Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr 645 650 655

Phe Asn Tyr Ser Asn Leu Glu val Gln val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr 660 665 670

Glu Pro Ala Ser Gly Glu Thr Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val 675 680 685

Gly Asn Ala Ser ASp Tyr Leu Tyr Pro Ser Gly Leu Gln Arg Ile Thr

690: 695 700

Lys 705: Phe 11e Tyr Pro Trp Leu Asn 710 Gly Thr ASp 715 Leu Glu Ala Ser Ser 720

Gly ASp: Ala Ser Tyr Gly Gln ASp 725 Ser Ser ASp Tyr 730 Leu Pro Glu 735 Gly

Ala Thr: Asp Gly 740 Ser Ala Gln Pro rle Leu 745 Pro Ala Gly Gly Gly 750 Pro

Gly Gly Asn 755: Pro Arg Leu Tyr Asp Glu 760 Leu rle Arg Val 765 Ser Val Thr

rle Lys 770: Asn Thr Gly Lys Val 775 Ala Gly Asp Glu Val 780 Pro Gln Leu Tyr

val 785: Ser Leu Gly Gly Pro Asn 790 Glu Pro Lys 11e val Leu Arg Gln 795 Phe 800

Glu Arg: 11e Thr Leu 805 Gln Pro Ser Glu Glu 810 Thr Lys Trp Ser Thr Thr 815

Leu: Thr Arg Arg Asp 820 Leu Ala Asn Trp Asn 825 Val Glu Lys Gln 830 Asp Trp

Glu: Ile Thr Ser 835 Tyr Pro Lys Met 840 Val Phe Val Gly Ser Ser Ser Arg 845

Lys: Leu 850 Pro Leu Arg Ala Ser Leu 855 Pro Thr Val Bis 860

<210> 61 <211> 2583 <212> ADN <213> Aspergillus aculeatus <400> 61 atgaagctca gttggcttga ggcggctgcc ttgacggctg cttcagtcgt cagcgctgat: 60

gaactggcgt tctctcctcc gcggaagcct accagcgtgc: tttctacccc tctccgtggg ccaatggcca gggagagtgg agtggccatt gtatcccaga tgactctgga tgagaaggtc 120 180

aacctgacca ccggaactgg atgggagctg gagaagtgcg tcggtcagac tggtggtgtc: 240

ccaagactga acatcggtgg catgtgtctt caggacagtc ccttgggaat tcgtgatagt: 300

gactacaatt cggctttccc tgctggtgtc aacgttgctg cgacatggga caagaacctt 360 gcttatctac gtggtcaggc tatgggtcaa gagttcagtg acaaaggaat tgatgttcaa 420 ttgggaccgg ccgcgggtcc cctcggcagg agccctgatg gaggtcgcaa ctgggaaggt 480 ttctctccag acccggctct tactggtgtg ctctttgcgg agacgattaa gggtattcaa 540 gacgctggtg tcgtggcgac agccaagcat tacattctca atgagcaaga gcatttccgc 600 caggtcgcag aggctgcggg ctacggattc aatatctccg acacgatcag ctctaacgtt 660 gatgacaaga ccattcatga aatgtacctc tggcccttcg cggatgccgt tcgcgccggc 720 gttggcgcca tcatgtgttc ctacaaccag atcaacaaca gctacggttg ccagaacagt 780 tacactctga acaagcttct gaaggccgag ctcggcttcc agggctttgt gatgtctgac 840 tggggtgctc accacagtgg tgttggctct gctttggccg gcttggatat gtcaatgcct 900 ggcgatatca ccttcgattc tgccactagt ttctggggta ccaacctgac cattgctgtg 960 ctcaacggta ccgtcccgca gtggcgcgtt gacgacatgg ctgtccgtat catggctgcc 1020 tactacaagg ttggccgcga ccgcctgtac cagccgccta acttcagctc ctggactcgc 1080 gatgaatacg gcttcaagta tttctacccc caggaagggc cctatgagaa ggtcaatcac 1140 tttgtcaatg tgcagcgcaa ccacagcgag gttattcgca agttgggagc agacagtact 1200 gttctactga agaacaacaa tgccctgccg ctgaccggaa aggagcgcaa agttgcgatc 1260 ctgggtgaag atgctggatc caactcgtac ggtgccaatg gctgctctga ccgtggctgt 1320 gacaacggta ctcttgctat ggcttggggt agcggcactg ccgaattccc atatctcgtg 1380 acccctgagc aggctattca agccgaggtg ctcaagcata agggcagcgt ctacgccatc 1440 acggacaact gggcgctgag ccaggtggag accctcgcta aacaagccag tgtctctctt 1500 gtatttgtca actcggacgc gggagagggc tatatctccg tggacggaaa cgagggcgac 1560 cgcaacaacc tcaccctctg gaagaacggc gacaacctca tcaaggctgc tgcaaacaac 1620 tgcaacaaca ccatcgttgt catccactcc gttggacctg ttttggttga cgagtggtat 1680 gaccacccca acgttactgc catcctctgg gcgggcttgc ctggccagga gtctggcaac 1740 tccttggctg acgtgctcta cggccgcgtc aacccgggcg ccaaatctcc attcacctgg 1800 ggcaagacga gggaggcgta cggggattac cttgtccgtg agctcaacaa cggcaacgga 1860 gctccccaag atgatttctc ggaaggtgtt ttcattgact accgcggatt cgacaagcgc 1920 aatgagaccc cgatctacga gttcggacat ggtctgagct acaccacttt caactactct 1980 ggccttcaca tccaggttct caacgcttcc tccaacgctc aagtagccac tgagactggc 2040 gccgctccca ccttcggaca agtcggcaat gcctctgact acgtgtaccc tgagggattg 2100

accagaatca gcaagttcat ctatccctgg cttaattcca cagacctgaa ggcctcatct 2160

ggcgacccgt actatggagt cgacaccgcg gagcacgtgc ccgagggtgc tactgatggc 2220 5 tctccgcagc ccgttctgcc tgccggtggt ggctctggtg gtaacccgcg cctctacgat 2280

gagttgatcc gtgtttcggt gacagtcaag aacactggtc gtgttgccgg tgatgctgtg 2340

cctcaattgt atgtttccct tggtggaccc aatgagccca aggttgtgtt gcgcaaattc 2400

gaccgcctca ccctcaagcc ctccgaggag acggtgtgga cgactaccct gacccgccgc 2460

gatctgtcta actgggacgt tgcggctcag gactgggtca tcacttctta cccgaagaag 2520 15 gtccatgttg gtagctcttc gcgtcagctg ccccttcacg cggcgctccc gaaggtgcaa 2580

tga 2583

<210> 62

<211> 860

<212> PRT

<213> Aspergillus aculeatus 25

<400> 62

Met Lys Leu Ser Trp Leo Glu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser val 1 5 10 15

Val Ser Ala Asp Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro 20 25 30

35 Trp Ala Asn Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val 35 40 45

Ala Ile val Ser Gln Met Thr Leu ASp Glu Lys val Asn Leu Thr Thr 50 55 60

Gly Thr Gly Trp Glu Leu Glu Lys Cys val Gly Gln Thr Gly Gly val 4S 65 70 75 80

Pro Arg Leu Asn !le Gly Gly Met Cys Leu Gln ASp Ser Pro Leu Gly 85 90 95

!le Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val 100 105 110

55 Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met 115 120 125

Gly Gln Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro Ala 130 135 140

Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly 145 150 155 160

Phe Ser Pro ASp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile 165 170 175

Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile 180 185 190

Leu Asn Glu Gln Glu Bis Phe Arg Gln Val Ala Glu Ala Ala Gly Tyr 195 200 205

Gly Phe Asn Ile Ser Asp Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr 210 215 220

¡le His Glu Met Tyr Leu Trp Pro Phe Ala ASp Ala Val Arg Ala Gly 225 230 235 240

Val Gly Ala Ile Met Cys Ser Tyr Asn Gln ¡le Asn Asn Ser Tyr Gly 245 250 255

Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly 260 265 270

Phe Gln Gly Phe Val Met Ser ASp Trp Gly Ala Bis Bis Ser Gly Val 275 280 285

Gly Ser Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Thr 290 295 300

Phe ASp Ser Ala Thr Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ala Val 305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg 325 330 335

Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg ASp Arg Leu Tyr Gln Pro 340 345 350

Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Lys Tyr Phe 355 360 365

Tyr Pro Gln Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn His Phe Val Asn Val 370 375 380

Gln Arg Asn Bis Ser Glu val Ile Arg Lys Leu Gly Ala ASp Ser Thr 385 390 395 400

Val Leu Leu Lys Asn Asn Asn Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg 405 410 415

Lys val Ala Ile Leu Gly Glu ASp Ala Gly Ser Asn Ser Tyr Gly Ala 420 425 430

Asn G1y Cys Ser ASp Arg Gly Cys ASp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala 435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro G1u G1n 450 455 460

Ala Ile Gln Ala Glu Val Leu Lys Bis Lys Gly Ser Val Tyr Ala Ile 465 470 475 480

Thr Asp Asn Trp Ala Leu Ser Gln Val Glu Thr Leu Ala Lys G1n Ala 485 490 495

Ser val Ser Leu val Phe Val Asn Ser ASp Ala Gly Glu Gly Tyr Ile 500 505 510

Ser Val ASp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Leu Thr Leu Trp Lys 515 520 525

Asn Gly Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr 530 535 540

Ile val val Ile Bis Ser Val Gly Pro val Leu Val ASp Glu Trp Tyr 545 550 555 560

Asp Bis Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln 565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro 580 585 590

Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gly 595 600 605

ASp Tyr Leu Val Arg Glu Leu Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Asp 610 615 620

ASp Phe Ser Glu Gly Val Phe Ile ASp Tyr Arg Gly Phe ASp Lys Arg 625 630 635 640

Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr 645 650 655

Phe Asn Tyr Ser Gly Leu His Ile Gln Val Leu Asn Ala Ser Ser Asn 660 665 670

Ala Gln Val Ala Thr Glu Thr Gly Ala Ala Pro Thr Phe Gly Gln Val 675 680 685

Gly Asn Ala Ser Asp Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Thr Arg Ile Ser 690 695 700

Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr ASp Leu Lys Ala Ser Ser 705 710 715 720

Gly ASp Pro Tyr Tyr Gly val ASp Thr Ala Glu His val Pro Glu Gly 725 730 735

Ala Thr Asp Gly Ser Pro Gln Pro Val Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser 740 745 750

Gly Gly Asn Pro Arg Leu Tyr ASp Glu Leu Ile Arg val Ser val Thr 755 760 765

val Lys Asn Thr Gly Arg val Ala Gly ASp Ala val Pro Gln Leu Tyr 770 775 780

val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys val Val Leu Arg Lys Phe 785 790 795 800

ASp Arg Leu Thr Leu Lys Pro Ser Glu Glu Thr val Trp Thr Thr Thr 805 810 815

Leu Thr Arg Arg ASp Leu Ser Asn Trp ASp val Ala Ala Gln ASp Trp 820 825 830

Val Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Lys Val His Val G1y Ser Ser Ser Arg

835 840 845

Gln Leu Pro Leu His Ala Ala Leu Pro Lys Val Gln 850 855 860

<210> 63

<211> 3294

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 63 atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60 gccgctgatg gcaggtccac ccgctactgg gactgctgca agccttcgtg cggctgggcc 120 aagaaggctc ccgtgaacca gcctgtcttt tcctgcaacg ccaacttcca gcgtatcacg 180 gacttcgacg ccaagtccgg ctgcgagccg ggcggtgtcg cctactcgtg cgccgaccag 240 accccatggg ctgtgaacga cgacttcgcg ctcggttttg ctgccacctc tattgccggc 300 agcaatgagg cgggctggtg ctgcgcctgc tacgagctca ccttcacatc cggtcctgtt 360 gctggcaaga agatggtcgt ccagtccacc agcactggcg gtgatcttgg cagcaaccac 420 ttcgatctca acatccccgg cggcggcgtc ggcatcttcg acggatgcac tccccagttc 480 ggtggtctgc ccggccagcg ctacggcggc atctcgtccc gcaacgagtg cgatcggttc 540 cccgacgccc tcaagcccgg ctgctactgg cgcttcgact ggttcaagaa cgccgacaat 600 ccgagcttca gcttccgtca ggtccagtgc ccagccgagc tcgtcgctcg caccggatgc 660 cgccgcaacg acgacggcaa cttccctgcc gtccagatcc ccatgcgttc ctcccccctc 720 ctccgctccg ccgttgtggc cgccctgccg gtgttggccc ttgccaagga tgatctcgcg 780 tactcccctc ctttctaccc ttccccatgg gcagatggtc agggtgaatg ggcggaagta 840 tacaaacgcg ctgtagacat agtttcccag atgacgttga cagagaaagt caacttaacg 900 actggaacag gatggcaact agagaggtgt gttggacaaa ctggcagtgt tcccagactc 960 aacatcccca gcttgtgttt gcaggatagt cctcttggta ttcgtttctc ggactacaat 1020 tcagctttcc ctgcgggtgt taatgtcgct gccacctggg acaagacgct cgcctacctt 1080 cgtggtcagg caatgggtga ggagttcagt gataagggta ttgacgttca gctgggtcct 1140 gctgctggcc ctctcggtgc tcatccggat ggcggtagaa actgggaagg tttctcacca 1200 gatccagccc tcaccggtgt actttttgcg gagacgatta agggtattca agatgctggt 1260 gtcattgcga cagctaagca ttatatcatg aacgaacaag agcatttccg ccaacaaccc 1320 gaggctgcgg gttacggatt caacgtaagc gacagtttga gttccaacgt tgatgacaag 1380

actatgcatg aattgtacct ctggcccttc gcggatgcag tacgcgctgg agtcggtgct 1440 gtcatgtgct cttacaacca aatcaacaac agctacggtt gcgagaatag cgaaactctg 1500 aacaagcttt tgaaggcgga gcttggtttc caaggcttcg tcatgagtga ttggaccgct 1560 catcacagcg gcgtaggcgc tgctttagca ggtctggata tgtcgatgcc cggtgatgtt 1620 accttcgata gtggtacgtc tttctggggt gcaaacttga cggtcggtgt ccttaacggt 1680 acaatccccc aatggcgtgt tgatgacatg gctgtccgta tcatggccgc ttattacaag 1740 gttggccgcg acaccaaata cacccctccc aacttcagct cgtggaccag ggacgaatat 1800 ggtttcgcgc ataaccatgt ttcggaaggt gcttacgaga gggtcaacga attcgtggac 1860 gtgcaacgcg atcatgccga cctaatccgt cgcatcggcg cgcagagcac tgttctgctg 1920 aagaacaagg gtgccttgcc cttgagccgc aaggaaaagc tggtcgccct tctgggagag 1980 gatgcgggtt ccaactcgtg gggcgctaac ggctgtgatg accgtggttg cgataacggt 2040 acccttgcca tggcctgggg tagcggtact gcgaatttcc catacctcgt gacaccagag 2100 caggcgattc agaacgaagt tcttcagggc cgtggtaatg tcttcgccgt gaccgacagt 2160 tgggcgctcg acaagatcgc tgcggctgcc cgccaggcca gcgtatctct cgtgttcgtc 2220 aactccgact caggagaagg ctatcttagt gtggatggaa atgagggcga tcgtaacaac 2280 atcactctgt ggaagaacgg cgacaatgtg gtcaagaccg cagcgaataa ctgtaacaac 2340 accgttgtca tcatccactc cgtcggacca gttttgatcg atgaatggta tgaccacccc 2400 aatgtcactg gtattctctg ggctggtctg ccaggccagg agtctggtaa ctccattgcc 2460 gatgtgctgt acggtcgtgt caaccctggc gccaagtctc ctttcacttg gggcaagacc 2520 cgggagtcgt atggttctcc cttggtcaag gatgccaaca atggcaacgg agcgccccag 2580 tctgatttca cccagggtgt tttcatcgat taccgccatt tcgataagtt caatgagacc 2640 cctatctacg agtttggcta cggcttgagc tacaccacct tcgagctctc cgacctccat 2700 gttcagcccc tgaacgcgtc ccgatacact cccaccagtg gcatgactga agctgcaaag 2760 aactttggtg aaattggcga tgcgtcggag tacgtgtatc cggaggggct ggaaaggatc 2820 catgagttta tctatccctg gatcaactct accgacctga aggcatcgtc tgacgattct 2880 aactacggct gggaagactc caagtatatt cccgaaggcg ccacggatgg gtctgcccag 2940 ccccgtttgc ccgctagtgg tggtgccgga ggaaaccccg gtctgtacga ggatcttttc 3000 cgcgtctctg tgaaggtcaa gaacacgggc aatgtcgccg gtgatgaagt tcctcagctg 3060 tacgtttccc taggcggccc gaatgagccc aaggtggtac tgcgcaagtt tgagcgtatt 3120 cacttggccc cttcgcagga ggccgtgtgg acaacgaccc ttacccgtcg tgaccttgca 3180

aactgggacg tttcggctca ggactggacc gtcactcctt accccaagac: gatctacgtt 3240

ggaaactcct cacggaaact gccgctccag gcctcgctgc ctaaggccca gtaa: 3294

<210> <211> <212> <213>: 64 1097 PRT Aspergillus oryzae

<400>: 64

Met Arg Ser Ser 1: Pro Leu 5 Leu Arg Ser Ala val val Ala Ala Leu 10 15 Pro

val: Leu Ala Leu 20 Ala Ala ASp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp ASp Cys 25 30

Cys Lys: Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys 35 40 Ala Pro Val 45 Asn Gln Pro

val: Phe 50 Ser Cys Asn Ala Asn 55 Phe Gln Arg Ile Thr ASp 60 Phe ASp Ala

Thr Pro Trp Ala val Asn 85: ASp ASp Phe Ala Leu 90 Gly Phe Ala Ala Thr 95

Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu 100 105 110

Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln 115 120 125

Ser Thr Ser Thr Gly Gly ASp Leu Gly Ser Asn Bis Phe ASp Leu Asn 130 135 140

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe 145 150 155 160

Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu 165 170 175

Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe 180 185 190

ASp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val 195 200 205

Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn ASp 210 215 220

ASp Gly Asn Phe Pro Ala val Gln Ile Pro Met Arg Ser Ser Pro Leu 225 230 235 240

Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro Val Leu Ala Leu Ala Lys 245 250 255

Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asp 260 265 270

Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala Val Asp Ile Val 275 280 285

Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly 290 295 300

Trp Gln Leu Glu Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser val Pro Arg Leu 305 310 315 320

Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly Ile Arg Phe 325 330 335

Ser ASp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn val Ala Ala Thr 340 345 350

Trp ASp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met Gly Glu Glu 355 360 365

Phe Ser ASp Lys Gly Ile ASp Val Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro 370 375 380

Leu Gly Ala Bis Pro ASp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro 385 390 395 400

ASp Pro Ala Leu Thr Gly val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile 405 410 415

Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Met Asn Glu

420: 425 430

5: Gln Glu His 435 Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly Tyr Gly 440 445 Phe Asn

val: Ser ASp 450 Ser Leu Ser Ser Asn 455 val ASp ASp Lys 460 Thr Met His Glu

Leu 465: Tyr Leu Trp Pro Phe 470 Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly Ala 475 480

15: Val Met Cys Ser Tyr Asn 485 Gln Ile Asn Asn 490 Ser Tyr Gly Cys Glu Asn 495

Ser Glu: Thr Leu 500 Asn Lys Leu Leu Lys 505 Ala Glu Leu Gly Phe 510 Gln Gly

25: Phe val Met 515 Ser ASp Trp Thr Ala His 520 His Ser Gly val 525 Gly Ala Ala

Leu Ala Gly 530: Leu ASp Met Ser Met 535 Pro Gly ASp Val Thr Phe 540 ASp Ser

Gly 545: Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn 550 Leu Thr Val 555 Gly Val Leu Asn Gly 560

35: Thr Ile Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg 565 570 Ile Met Ala 575

Ala Tyr Tyr Lys 580: val Gly Arg ASp Thr Lys Tyr Thr 585 Pro Pro Asn 590 Phe

4S: Ser Ser Trp Thr 595 Arg ASp Glu Tyr Gly 600 Phe Ala Bis Asn 605 Bis val Ser

Glu: Gly Ala Tyr 610 Glu Arg val Asn 615 Glu Phe val ASp 620 val Gln Arg ASp

Bis Ala 625: Asp Leu Ile Arg Arg 630 Ile Gly Ala Gln 635 Ser Thr Val Leu Leu 640

55

Lys: Asn Lys Gly Ala Leu Pro Leu Ser Arg Lys Glu Lys Leu Val Ala

645: 650 655

174

Leu Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly Ala Asn Gly Cys 660 665 670

Asp Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala Trp Gly Ser 675 680 685

Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Gln 690 695 700

Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp Ser 705 710 715 720

Trp Ala Leu Asp Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ser Val Ser 725 730 735

Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Leu Ser Val Asp 740 745 750

G1y Asn G1u G1y ASp Arg Asn Asn I1e Thr Leu Trp Lys Asn Gly ASp 755 760 765

Asn val val Lys Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr val val Ile 770 775 780

Ile Bis Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp Tyr Asp His Pro 785 790 795 800

Asn val Thr Gly Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly 805 810 815

Asn Ser Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Ala Lys 820 825 830

Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr Gly Ser Pro Leu 835 840 845

Val Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Ser Asp Phe Thr 850 855 860

Gln Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys Phe Asn Glu Thr 865 870 875 880

Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Leu 885 890 895

Ser Asp Leu His Val Gln Pro Leu Asn Ala Ser Arg Tyr Thr Pro Thr 900 905 910

Ser Gly Met Thr G1u Ala Ala Lys Asn Phe Gly Glu rle Gly ASp Ala 915 920 925

Ser Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Arg rle His Glu Phe rle 930 935 940

Tyr Pro Trp Ile Asn Ser Thr ASp Leu Lys Ala Ser Ser ASp ASp Ser 945 950 955 960

Asn Tyr Gly Trp Glu ASp Ser Lys Tyr Ile Pro Glu Gly Ala Thr ASp 965 970 975

Gly Ser Ala Gln Pro Arg Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ala Gly Gly Asn 980 985 990

Pro Gly Leu Tyr Glu ASp Leu Phe Arg val Ser val Lys val Lys Asn 995 1000 1005

Thr Gly Asn Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser 1010 1015 1020

Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys val val Leu Arg Lys Phe Glu 1025 1030 1035

Arg Ile His Leu Ala Pro Ser Gln Glu Ala Val Trp Thr Thr Thr 1040 1045 1050

Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp 1055 1060 1065

Trp Thr val Thr Pro Tyr Pro Lys Thr rle Tyr val Gly Asn Ser 1070 1075 1080

Ser Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Lys Ala Gln 1085 1090 1095

<210> 65

<211> 3294

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 65

atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60 gccgctgatg gcaggtccac ccgctactgg gactgctgca agccttcgtg cggctgggcc 120 aagaaggctc ccgtgaacca gcctgtcttt tcctgcaacg ccaacttcca gcgtatcacg 180 gacttcgacg ccaagtccgg ctgcgagccg ggcggtgtcg cctactcgtg cgccgaccag 240 accccatggg ctgtgaacga cgacttcgcg ctcggttttg ctgccacctc tattgccggc 300 agcaatgagg cgggctggtg ctgcgcctgc tacgagctca ccttcacatc cggtcctgtt 360 gctggcaaga agatggtcgt ccagtccacc agcactggcg gtgatcttgg cagcaaccac 420 ttcgatctca acatccccgg cggcggcgtc ggcatcttcg acggatgcac tccccagttc 480 ggtggtctgc ccggccagcg ctacggcggc atctcgtccc gcaacgagtg cgatcggttc 540 cccgacgccc tcaagcccgg ctgctactgg cgcttcgact ggttcaagaa cgccgacaat 600 ccgagcttca gcttccgtca ggtccagtgc ccagccgagc tcgtcgctcg caccggatgc 660 cgccgcaacg acgacggcaa cttccctgcc gtccagatcc ccatgcgttc ctcccccctc 720 ctccgctccg ccgttgtggc cgccctgccg gtgttggccc ttgccaagga tgatctcgcg 780 tactcccctc ctttctaccc ttccccatgg gcagatggtc agggtgaatg ggcggaagta 840 tacaaacgcg ctgtagacat agtttcccag atgacgttga cagagaaagt caacttaacg 900 actggaacag gatggcaact agagaggtgt gttggacaaa ctggcagtgt tcccagactc 960 aacatcccca gcttgtgttt gcaggatagt cctcttggta ttcgtttctc ggactacaat 1020 tcagctttcc ctgcgggtgt taatgtcgct gccacctggg acaagacgct cgcctacctt 1080 cgtggtcagg caatgggtga ggagttcagt gataagggta ttgacgttca gctgggtcct 1140 gctgctggcc ctctcggtgc tcatccggat ggcggtagaa actgggaaag tttctcacca 1200 gatccagccc tcaccggtgt actttttgcg gagacgatta agggtattca agatgctggt 1260 gtcattgcga cagctaagca ttatatcatg aacgaacaag agcatttccg ccaacaaccc 1320 gaggctgcgg gttacggatt caacgtaagc gacagtttga gttccaacgt tgatgacaag 1380 actatgcatg aattgtacct ctggcccttc gcggatgcag tacgcgctgg agtcggtgct 1440 gttatgtgct cttacaacca aatcaacaac agctacggtt gcgagaatag cgaaactctg 1500 aacaagcttt tgaaggcgga gcttggtttc caaggcttcg tcatgagtga ttggaccgct 1560 caacacagcg gcgtaggcgc tgctttagca ggtctggata tgtcgatgcc cggtgatgtt 1620 accttcgata gtggtacgtc tttctggggt gcaaacttga cggtcggtgt ccttaacggt 1680 acaatccccc aatggcgtgt tgatgacatg gctgtccgta tcatggccgc ttattacaag 1740 gttggccgcg acaccaaata cacccctccc aacttcagct cgtggaccag ggacgaatat 1800

ggtttcgcgc ataaccatgt ttcggaaggt gcttacgaga gggtcaacga attcgtggac 1860 gtgcaacgcg atcatgccga cctaatccgt cgcatcggcg cgcagagcac tgttctgctg 1920 aagaacaagg gtgccttgcc cttgagccgc aaggaaaagc tggtcgccct tctgggagag 1980 gatgcgggtt ccaactcgtg gggcgctaac ggctgtgatg accgtggttg cgataacggt 2040 acccttgcca tggcctgggg tagcggtact gcgaatttcc catacctcgt gacaccagag 2100 caggcgattc agaacgaagt tcttcagggc cgtggtaatg tcttcgccgt gaccgacagt 2160 tgggcgctcg acaagatcgc tgcggctgcc cgccaggcca gcgtatctct cgtgttcgtc 2220 aactccgact caggagaagg ctatcttagt gtggatggaa atgagggcga tcgtaacaac 2280 atcactctgt ggaagaacgg cgacaatgtg gtcaagaccg cagcgaataa ctgtaacaac 2340 accgttgtca tcatccactc cgtcggacca gttttgatcg atgaatggta tgaccacccc 2400 aatgtcactg gtattctctg ggctggtctg ccaggccagg agtctggtaa ctccattgcc 2460 gatgtgctgt acggtcgtgt caaccctggc gccaagtctc ctttcacttg gggcaagacc 2520 cgggagtcgt atggttctcc cttggtcaag gatgccaaca atggcaacgg agcgccccag 2580 tctgatttca cccagggtgt tttcatcgat taccgccatt tcgataagtt caatgagacc 2640 cctatctacg agtttggcta cggcttgagc tacaccacct tcgagctctc cgacctccat 2700 gttcagcccc tgaacgcgtc ccgatacact cccaccagtg gcatgactga agctgcaaag 2760 aactttggtg aaattggcga tgcgtcggag tacgtgtatc cggaggggct ggaaaggatc 2820 catgagttta tctatccctg gatcaactct accgacctga aggcatcgtc tgacgattct 2880 aactacggct gggaagactc caagtatatt cccgaaggcg ccacggatgg gtctgcccag 2940 ccccgtttgc ccgctagtgg tggtgccgga ggaaaccccg gtctgtacga ggatcttttc 3000 cgcgtctctg tgaaggtcaa gaacacgggc aatgtcgccg gtgatgaagt tcctcagctg 3060 tacgtttccc taggcggccc gaatgagccc aaggtggtac tgcgcaagtt tgagcgtatt 3120 cacttggccc cttcgcagga ggccgtgtgg acaacgaccc ttacccgtcg tgaccttgca 3180 aactgggacg tttcggctca ggactggacc gtcactcctt accccaagac gatctacgtt 3240 ggaaactcct cacggaaact gccgctccag gcctcgctgc ctaaggccca gtaa 3294

<210> 66

<211> 1097

<212> PRT

<213> Aspergi11us oryzae

<400> 66

Met Arg 1: Ser Ser Pro Leu 5 Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro 10 15

5: Val Leu Ala Leu 20 Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys 25 30

Cys Lys: Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro 35 40 45

15: Val Phe 50 Ser Cys Asn Ala Asn 55 Phe Gln Arg Ile Thr Asp 60 Phe Asp Ala

Thr Pro Trp Ala: Val Asn 85 Asp Asp Phe Ala Leu 90 Gly Phe Ala Ala Thr 95

25: Ser Ile Ala Gly 100 Ser Asn Glu Ala Gly Trp cys 105 cys Ala cys Tyr Glu 110

Leu: Thr Phe Thr 115 Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val 120 125 Gln

35: Ser Thr 130 Ser Thr Gly Gly Asp 135 Leu Gly Ser Asn His 140 Phe Asp Leu Asn

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly 145 150: Ile Phe ASp Gly Cys Thr Pro Gln Phe 155 160

Gly Gly Leu Pro Gly Gln 165: Arg Tyr Gly Gly 170 Ile Ser Ser Arg Asn 175 Glu

4S: Cys ASp Arg Phe 180 Pro ASp Ala Leu Lys 185 Pro Gly Cys Tyr Trp Arg 190 Phe

Asp Trp Phe Lys 195: Asn Ala Asp Asn 200 Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val 205

55: Gln Cys 210 Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg 215 Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 220

Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Met Arg Ser Ser Pro Leu 225 230 235 240

Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro Val Leu Ala Leu Ala Lys 245 250 255

ASp ASp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Ala ASp 260 265 270

Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala Val Asp Ile Val 275 280 285

Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly 290 295 300

Trp Gln Leu Glu Arg Cys val Gly Gln Thr Gly Ser val Pro Arg Leu 305 310 315 320

Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly Ile Arg Phe 325 330 335

Ser ASp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly val Asn val Ala Ala Thr 340 345 350

Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met Gly Glu Glu 355 360 365

Phe Ser ASp Lys Gly Ile ASp val Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro 370 375 380

Leu Gly Ala His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Ser Phe Ser Pro 385 390 395 400

Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile 405 410 415

Gln ASp Ala Gly val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Met Asn Glu 420 425 430

Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Phe Asn 435 440 445

Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr Met His Glu 450 455 460

Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly Ala 465 470 475 480

Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln rle Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Glu Asn 485 490 495

Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln Gly 500 505 510

Phe val Met Ser ASp Trp Thr Ala Gln His Ser Gly val Gly Ala Ala 515 520 525

Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Thr Phe Asp Ser 530 535 540

Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly Val Leu Asn Gly 545 550 555 560

Thr rle Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg rle Met Ala 565 570 575

Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg ASp Thr Lys Tyr Thr Pro Pro Asn Phe 580 585 590

Ser Ser Trp Thr Arg ASp Glu Tyr Gly Phe Ala His Asn His val Ser 595 600 605

Glu Gly Ala Tyr Glu Arg Val Asn Glu Phe Val Asp Val Gln Arg Asp 610 615 620

His Ala ASp Leu 11e Arg Arg Ile Gly Ala Gln Ser Thr val Leu Leu 625 630 635 640

Lys Asn Lys Gly Ala Leu Pro Leu Ser Arg Lys Glu Lys Leu val Ala 645 650 655

Leu Leu Gly Glu ASp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly Ala Asn Gly Cys 660 665 670

ASp ASp Arg Gly Cys ASp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala Trp Gly Ser 675 680 685

Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Gln 690 695 700

Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp Ser

705: 710 715 720

5: Trp Ala Leu ASp Lys 725 Ile Ala Ala Ala Ala Arg 730 Gln Ala Ser val Ser 735

Leu val: Phe val 740 Asn Ser ASp Ser Gly 745 Glu Gly Tyr Leu Ser val ASp 750

Gly Asn: Glu 755 Gly Asp Arg Asn Asn 760 11e Thr Leu Trp Lys 765 Asn Gly Asp

15: Asn Val 770 Val Lys Thr Ala Ala Asn 775 Asn Cys Asn Asn 780 Thr Val Val Ile

11e Bis Ser Val 785: Gly Pro Val 790 Leu 11e Asp Glu 795 Trp Tyr Asp His Pro 800

25: Asn val Thr Gly l1e Leu 805 Trp Ala Gly Leu 810 Pro Gly Gln Glu Ser Gly 815

Asn: Ser l1e Ala 820 ASp val Leu Tyr Gly Arg val Asn 825 Pro Gly Ala Lys 830

Ser Pro Phe 835: Thr Trp Gly Lys Thr 840 Arg Glu Ser Tyr Gly Ser 845 Pro Leu

35: Val Lys Asp Ala 850 Asn Asn Gly Asn 855 Gly Ala Pro Gln Ser Asp 860 Phe Thr

Gln 865: Gly val Phe 11e ASp Tyr Arg 870 His Phe ASp Lys 875 Phe Asn Glu Thr 880

4S: Pro Ile Tyr Glu Phe 885 Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe 890 Glu 895 Leu

Ser ASp: Leu Bis 900 val Gln Pro Leu Asn Ala Ser Arg Tyr Thr 905 910 Pro Thr

Ser Gly Met 915: Thr Glu Ala Ala Lys 920 Asn Phe Gly Glu Ile Gly Asp Ala 925

55: Ser Glu 930 Tyr Val Tyr Pro Glu 935 Gly Leu Glu Arg Ile His 940 Glu Phe Ile

182

Tyr Pro Trp ¡le Asn 945: Ser Thr Asp Leu 950 Lys Ala Ser Ser Asp Asp 955 Ser 960

Asn: Tyr Gly Trp Glu Asp 965 Ser Lys Tyr ¡le Pro Glu Gly Ala Thr Asp 970 975

Gly Ser Ala Gl n 980: Pro Arg Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ala Gly Gly Asn 985 990

Pro Gly Leu 995: Tyr Glu Asp Leu Phe 1000 Arg Val Ser Val Lys 1005 Val Lys Asn

Thr Gly 1010: Asn Val Ala Gly Asp 1015 Glu Val Pro Gln Leu 1020 Tyr Val Ser

Leu: Gly 1025 Gly Pro Asn Glu Pro 1030 Lys Val Val Leu Arg 1035 Lys Phe Glu

Arg ¡le 1040: His Leu Ala Pro Ser 1045 Gln Glu Ala Val Trp 1050 Thr Thr Thr

Leu: Thr 1055 Arg Arg Asp Leu Ala 1060 Asn Trp Asp val Ser 1065 Ala Gln Asp

Trp Thr 1070: Val Thr Pro Tyr Pro 1075 Lys Thr Ile Tyr Val 1080 Gly Asn Ser

Ser Arg 1085: Lys Leu Pro Leu Gln 1090 Ala Ser Leu Pro Lys 1095 Ala Gln

<210> <211> <212> <213>: 67 1415 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 67 atggtccatc: tatcttcatt ggcagcagcc ctggctgctc tgcctctgta tgt ttaccca 60

ctcacgagag gaggaacagc: tttgacattg ctatagtgta tatggagctg gcctgaacac 120

agcagccaaa gccaaaggac: taaagtactt tggttccgcc acggacaatc cagagctcac 180

ggactctgcg tatgtcgcgc aactgagcaa caccgatgat tttggtcaaa tcacacccgg: 240

aaactccatg aaggtttgct tacgtctgcc tccctggagc attgcctcaa aagctaattg: 300

gttgttttgt ttggatagtg ggatgccacc gagccttctc agaattcttt ttcgttcgca: 360

aatggagacg ccgtggtcaa tctggcgaac aagaatggcc agctgatgcg atgccatact: 420

ctggtctggc acagtcagct accgaactgg ggtatgtaaa cgtcttgtct attctcaaat 480 actctctaac agttgacagt ctctagcggg tcatggacca atgcgaccct tttggcggcc 540 5 atgaagaatc atatcaccaa tgtggttact cactacaagg ggaagtgcta cgcctgggat 600 gttgtcaatg aaggtttgtt gctccatcta tcctcaatag ttcttttgaa actgacaagc 660 ctgtcaatct agccctgaac gaggacggta ctttccgtaa ctctgtcttc taccagatca 720 tcggcccagc atacattcct attgcgttcg ccacggctgc tgccgcagat cccgacgtga 780 aactctacta caacgactac aacattgaat actcaggcgc caaagcgact gctgcgcaga 840 15 atatcgtcaa gatgatcaag gcctacggcg cgaagatcga cggcgtcggc ctccaggcac 900 actttatcgt cggcagcact ccgagtcaat cggatctgac gaccgtcttg aagggctaca 960 ctgctctcgg cgttgaggtg gcctataccg aacttgacat ccgcatgcag ctgccctcga 1020 ccgccgcaaa gctggcccag cagtccactg acttccaagg cgtggccgca gcatgcgtta 1080 gcaccactgg ctgcgtgggt gtcactatct gggactggac cgacaagtac tcctgggtcc 1140 25 ccagcgtgtt ccaaggctac ggcgccccat tgccttggga tgagaactat gtgaagaagc 1200 cagcgtacga tggcctgatg gcgggtcttg gagcaagcgg ctccggcacc acaacgacca 1260 ctactactac ttctactacg acaggaggta cggaccctac tggagtcgct cagaaatggg 1320 gacagtgtgg cggtattggc tggaccgggc caacaacttg tgtcagtggt accacttgcc 1380 aaaagctgaa tgactggtac tcacagtgcc tgtaa 1415 35

<210> 68

<211> 397

<212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 68

Met val His Leu Ser Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Leu 4S 1 5 10 15

val Tyr Gly Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Lys Gly Leu Lys 20 25 30

Tyr Phe Gly Ser Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ser Ala Tyr 35 40 45

55 Val Ala Gln Leu Ser Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly 50 55 60

Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Asn Ser Phe Ser 65 70 75 80

Phe Ala Asn Gly Asp Ala Val Val Asn Leu Ala Asn Lys Asn Gly Gln 85 90 95

Leu Met: Arg Cys His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Asn Trp

100: 105 110

Val: Ser Ser Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys

115: 120 125

Asn: His Ile Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Lys Cys Tyr Ala

130: 135 140

Trp Asp Val Val: Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Thr Phe Arg Asn

145: 150 155 160

Ser Val: Phe Tyr Gln Ile Ile Gly Pro Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe

165: 170 175

Ala Thr Ala Ala: Ala Ala Asp Pro Asp Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp

180: 185 190

Tyr Asn: Ile Glu Tyr Ser Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile

195: 200 205

Val Lys Met Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile ASp Gly Val Gly Leu 210 215 220

Gln Ala His Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Asp Leu Thr 225 230 235 240

Thr val Leu Lys Gly Tyr Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr 245 250 255

Glu Leu Asp Ile Arg Met Gln Leu Pro Ser Thr Ala Ala Lys Leu Ala 260 265 270

Gln Gln Ser Thr Asp Phe Gln Gly Val Ala Ala Ala Cys Val Ser Thr 275 280 285

Thr Gly Cys Val Gly Val Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser 290 295 300

Trp Val Pro Ser Val Phe Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Leu Pro Trp Asp 305 310 315 320

G1u Asn Tyr val Lys Lys Pro Ala Tyr ASp Gly Leu Met Ala Gly Leu 325 330 335

Gly Ala Ser Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr 340 345 350

Thr Thr Gly Gly Thr ASp Pro Thr Gly val Ala Gln Lys Trp Gly Gln 355 360 365

Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys val Ser Gly Thr 370 375 380

Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 385 390 395

<210> 69

<211> 2564

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 69 ggacagccgg acgcaatggt gaataacgca gctcttctcg ccgccctgtc ggctctcctg 60 cccacggccc tggcgcagaa caatcaaaca tacgccaact actctgctca gggccagcct 120 gatctctacc ccgagacact tgccacgctc acactctcgt tccccgactg cgaacatggc 180 cccctcaaga acaatctcgt ctgtgactca tcggccggct atgtagagcg agcccaggcc 240 ctcatctcgc tcttcaccct cgaggagctc attctcaaca cgcaaaactc gggccccggc 300 gtgcctcgcc tgggtcttcc gaactaccaa gtctggaatg aggctctgca cggcttggac 360 cgcgccaact tcgccaccaa gggcggccag ttcgaatggg cgacctcgtt ccccatgccc 420 atcctcacta cggcggccct caaccgcaca ttgatccacc agattgccga catcatctcg 480 acccaagctc gagcattcag caacagcggc cgttacggtc tcgacgtcta tgcgccaaac 540 gtcaatggct tccgaagccc cctctggggc cgtggccagg agacgcccgg cgaagacgcc 600 tttttcctca gctccgccta tacttacgag tacatcacgg gcatccaggg tggcgtcgac 660 cctgagcacc tcaaggttgc cgccacggtg aagcactttg ccggatacga cctcgagaac 720 tggaacaacc agtcccgtct cggtttcgac gccatcataa ctcagcagga cctctccgaa 780 tactacactc cccagttcct cgctgcggcc cgttatgcaa agtcacgcag cttgatgtgc 840

gcatacaact ccgtcaacgg cgtgcccagc tgtgccaaca gcttcttcct gcagacgctt 900 ttgcgcgaga gctggggctt ccccgaatgg ggatacgtct cgtccgattg cgatgccgtc 960 tacaacgttt tcaaccctca tgactacgcc agcaaccagt cgtcagccgc cgccagctca 1020 ctgcgagccg gcaccgatat cgactgcggt cagacttacc cgtggcacct caacgagtcc 1080 tttgtggccg gcgaagtctc ccgcggcgag atcgagcggt ccgtcacccg tctgtacgcc 1140 aacctcgtcc gtctcggata cttcgacaag aagaaccagt accgctcgct cggttggaag 1200 gatgtcgtca agactgatgc ctggaacatc tcgtacgagg ctgctgttga gggcatcgtc 1260 ctgctcaaga acgatggcac tctccctctg tccaagaagg tgcgcagcat tgctctgatc 1320 ggaccatggg ccaatgccac aacccaaatg caaggcaact actatggccc tgccccatac 1380 ctcatcagcc ctctggaagc tgctaagaag gccggctatc acgtcaactt tgaactcggc 1440 acagagatcg ccggcaacag caccactggc tttgccaagg ccattgctgc cgccaagaag 1500 tcggatgcca tcatctacct cggtggaatt gacaacacca ttgaacagga gggcgctgac 1560 cgcacggaca ttgcttggcc cggtaatcag ctggatctca tcaagcagct cagcgaggtc 1620 ggcaaacccc ttgtcgtcct gcaaatgggc ggtggtcagg tagactcatc ctcgctcaag 1680 agcaacaaga aggtcaactc cctcgtctgg ggcggatatc ccggccagtc gggaggcgtt 1740 gccctcttcg acattctctc tggcaagcgt gctcctgccg gccgactggt caccactcag 1800 tacccggctg agtatgttca ccaattcccc cagaatgaca tgaacctccg acccgatgga 1860 aagtcaaacc ctggacagac ttacatctgg tacaccggca aacccgtcta cgagtttggc 1920 agtggtctct tctacaccac cttcaaggag actctcgcca gccaccccaa gagcctcaag 1980 ttcaacacct catcgatcct ctctgctcct caccccggat acacttacag cgagcagatt 2040 cccgtcttca ccttcgaggc caacatcaag aactcgggca agacggagtc cccatatacg 2100 gccatgctgt ttgttcgcac aagcaacgct ggcccagccc cgtacccgaa caagtggctc 2160 gtcggattcg accgacttgc cgacatcaag cctggtcact cttccaagct cagcatcccc 2220 atccctgtca gtgctctcgc ccgtgttgat tctcacggaa accggattgt ataccccggc 2280 aagtatgagc tagccttgaa caccgacgag tctgtgaagc ttgagtttga gttggtggga 2340 gaagaggtaa cgattgagaa ctggccgttg gaggagcaac agatcaagga tgctacacct 2400 gacgcataag ggttttaatg atgttgttat gacaaacggg tagagtagtt aatgatggaa 2460 taggaagagg ccatagtttt ctgtttgcaa accatttttg ccattgcgaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2564

<210> 70

<211> 780

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 70

Met val Asn Asn Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro 1 5 10 15

Thr Ala Leu Ala Gln Asn Asn Gln Thr Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Gln 20 25 30

Gly Gln Pro Asp Leu Tyr Pro Glu Thr Leu Ala Thr Leu Thr Leu Ser 35 40 45

Phe Pro Asp Cys Glu His Gly Pro Leu Lys Asn Asn Leu Val Cys Asp 50 55 60

Ser Ser Ala Gly Tyr Val Glu Arg Ala Gln Ala Leu 11e Ser Leu Phe 65 70 75 80

Thr Leu Glu Glu Leu 11e Leu Asn Thr Gln Asn Ser Gly Pro Gly Val 85 90 95

Pro Arg Leu Gly Leu Pro Asn Tyr Gln Val Trp Asn Glu Ala Leu His 100 105 110

Gly Leu Asp Arg Ala Asn Phe Ala Thr Lys Gly Gly Gln Phe Glu Trp 115 120 125

Ala Thr Ser Phe Pro Met Pro 11e Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg 130 135 140

Thr Leu 11e His Gln 11e Ala ASp 11e Ile Ser Thr Gln Ala Arg Ala 145 150 155 160

Phe Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Gly Leu ASp val Tyr Ala Pro Asn Val 165 170 175

Asn Gly Phe Arg Ser Pro Leu Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly 180 185 190

Glu Asp Ala Phe Phe Leu Ser Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Tyr 11e Thr 195 200 205

Gly Ile Gln Gly Gly Val Asp Pro Glu His Leu Lys Val Ala Ala Thr 210 215 220

Val Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Asn Asn Gln Ser 225 230 235 240

Arg Leu Gly Phe ASp Ala Ile Ile Thr Gln Gln ASp Leu Ser Glu Tyr 245 250 255

Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Lys Ser Arg Ser 260 265 270

Leu Met Cys Ala Tyr Asn Ser Val Asn Gly Val Pro Ser Cys Ala Asn 275 280 285

Ser Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Ser Trp Gly Phe Pro Glu 290 295 300

Trp Gly Tyr Val Ser Ser ASp cys ASp Ala Val Tyr Asn Val Phe Asn 305 310 315 320

Pro Bis Asp Tyr Ala Ser Asn Gln Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Leu 325 330 335

Arg Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys Gly Gln Thr Tyr Pro Trp His Leu 340 345 350

Asn Glu Ser Phe Val Ala Gly Glu Val Ser Arg Gly Glu Ile Glu Arg 355 360 365

Ser Val Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp 370 375 380

Lys Lys Asn Gln Tyr Arg Ser Leu Gly Trp Lys ASp val Val Lys Thr 385 390 395 400

Asp Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Val Leu 405 410 415

Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Pro Leu Ser Lys Lys Val Arg Ser Ile 420 425 430

Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Gln Gly Asn 435 440 445

Tyr Tyr Gly Pro Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Glu Ala Ala Lys 450 455 460

Lys Ala Gly Tyr His val Asn Phe Glu Leu Gly Thr Glu Ile Ala Gly 465 470 475 480

Asn Ser Thr Thr Gly Phe Ala Lys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser 485 490 495

ASp Ala Ile Ile Tyr Leu Gly Gly Ile ASp Asn Thr Ile Glu Gln Glu 500 505 510

Gly Ala ASp Arg: Thr ASp Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln Leu ASp Leu

515: 520 525

Ile Lys Gln Leu: Ser G1u Val Gly Lys Pro Leu Val Val Leu Gln Met

530: 535 540

Gly Gly Gly Gln: val ASp Ser Ser Ser Leu Lys Ser Asn Lys Lys val

545: 550 555 560

Asn: Ser Leu Val Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Val Ala

565: 570 575

Leu Phe ASp Ile Leu Ser Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val 580 585 590

Thr Thr Gln Tyr Pro Ala Glu Tyr Val His Gln Phe Pro Gln Asn ASp 595 600 605

Met Asn Leu Arg Pro Asp Gly Lys Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Ile 610 615 620

Trp Tyr Thr Gly Lys Pro Val Tyr Glu Phe Gly Ser Gly Leu Phe Tyr 625 630 635 640

Thr Thr Phe Lys Glu Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Ser Leu Lys Phe 645 650 655

Asn Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ala Pro His Pro Gly Tyr Thr Tyr Ser 660 665 670

Glu Gln Ile Pro Val Phe Thr Phe Glu Ala Asn I le Lys Asn Ser Gly 675 680 685

Lys: Thr Glu Ser 690 Pro Tyr Thr Ala Met 695 Leu Phe Val Arg 700 Thr Ser Asn

Ala Gly Pro Ala 705: Pro Tyr 710 Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe ASp Arg 715 720

Leu Ala ASp: Ile Lys 725 Pro Gly Bis Ser Ser Lys 730 Leu Ser Ile Pro Ile 735

Pro Val: Ser Ala Leu Ala Arg Val Asp Ser His 740 745 Gly Asn Arg 750 Ile Val

Tyr Pro Gly Lys Tyr Glu 755: Leu Ala Leu Asn 760 Thr Asp Glu Ser Val 765 Lys

Leu: Glu Phe Glu 770 Leu Val Gly Glu 775 Glu Val Thr Ile 780

<210> <211> <212> <213>: 71 37 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 71 actggattta ccatgacttt gtccaagatc: acttcca 37

<210> <211> <212> <213>: 72 40 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 72 tcacctctag ttaattaagc gttgaacagt gcaggaccag: 40

<210> <211> <212> <213>: 73 17 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 73 tgtcccttgt cgatgcg: 17

<210> <211> <212> <213>: 74 17 ADN Aspergillus fumigatus

<400>: 74

cacatgactt ggcttcc

<210> 75

<211> 36

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 75 ggctaacata gcataggtga ttacttacct cgctcc

<210> 76

<211> 36

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 76 ggagcgaggt aagtaatcac ctatgctatg ttagcc

<210> 77

<211> 45

<212> ADN

<213> Aspergi11us fumigatus

<400> 77 cctggtgttt gggcttccga tgaactgatc gccaacaaca acacg

<210> 78

<211> 45

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 78 cgtgttgttg ttggcgatca gttcatcgga agcccaaaca ccagg

<210> 79

<211> 35

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 79 gccaacaaca acacgtggac agtgaccatt cctgc

<210> 80

<211> 35

<212> ADN

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 80 gcaggaatgg tcactgtcca cgtgttgttg ttggc

<210> 81

<211> 38

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400>: 81 actggattta ccatgaacaa gtccgtggct ccattgct

<210> <211> <212> <213>: 82 38 ADN Trichoderma reesei

<400> 82 tcacctctag: ttaattaact actttcttgc gagacacg 38

<210> <211> <212> <213>: 83 25 ADN Aspergi11us fumigatus

<400> 83 gggcatgctg gcctccacct: tctcc 25

<210> <211> <212> <213>: 84 30 ADN Aspergi11us fumigatus

<400> 84 gggttaatta actacaggca ctgagagtaa: 30

<210> <211> <212> <213>: 85 37 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 85 actggattta ccatgaagca ccttgcatct tccatcg: 37

<210> <211> <212> <213>: 86 34 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 86 tcacctctag: ttaattaaaa ggacgggtta gcgt 34

<210> <211> <212> <213>: 87 22 ADN Aspergillus fumigatus

<400> 87 gtgaataacg cagctcttct cg: 22

<210> <211> <212> <213>: 88 25 ADN Aspergi11us fumigatus

<400> 88 ccttaattaa: ttatgcgtca ggtgt 25

<210> <211> <212> <213>: 89 33 ADN Trichoderma reesei

<400> 89 cggactgcgc accatggtga ataacgcagc: tct 33

<210> <211> <212> <213>: 90 35 ADN Trichoderma reesei

<400> 90 tcgccacgga gcttattatg cgtcaggtgt agcat: 35

<210> <211> <212> <213>: 91 37 ADN Aspergi11us acu1eatus

<400> 91 tcttggatcc accatggtcg gactgctttc: aatcacc 37

<210> <211> <212> <213>: 92 3' ADN Aspergi11us acu1eatus

<400> 92 ttaactcgag tcacagacac: tgcgagtaat agtc 3'

<210> <211> <212> <213>: 93 33 ADN Aspergi11us acu1eatus

<400> 93 cggactgcgc accatggtcg gactgctttc: aat 33

<210> <211> <212>: 9. 35 ADN

194

<213> Aspergi11us acu1eatus

<400> 94 tcgccacgga gcttatcaca gacactgcga gtaat 35

Claims

REIVINDICACIONES

1. Variante, que comprende sustituciones 190V + 0131 S + M134l del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2, donde la variante tiene actividad de mejora celulolítica y la variante es seleccionada del grupo consistente en:

(a)

un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencia at polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 1 o su secuencia de ADNc.
2.

Variante según la reivindicación 1, que comprende o consiste en las sustituciones L90V + D131S -+ M134l+ A141W del polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2.
3.

Polinucleótido aislado que codifica la variante de la reivindicación 1 02.
4.

Célula huésped que comprende el polinucle6tido de la reivindicación 3.
5.

Método para producir una variante, que comprende:

(a)

cultivo de la célula huésped de la reivindicación 4 bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y

(b)

recuperación de la variante.
6.

Planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal transformada con el polinucleótido de la reivindicación 3.
7.

Método de producción de la variante de la reivindicación 1 o 2, que comprende:

(a)

cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica la variante bajo condiciones propicias para la producción de la variante; y

(b)

recuperación de la variante.
8.

Método de obtención de una variante, que comprende la introducción en un polipéptido progenitor de las sustituciones L90V + D131S + M134L del polipéptido maduro de SEC ID n.o: 2, donde la variante tiene actividad de mejora celulolitica y tiene al menos 85% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID n.O: 2; y recuperación de la variante.
9.

Método para la degradación o conversión de un material celulósico, que comprende: el tratamiento del material celulósico con una composición enzimática en presencia de la variante de las reivindicaciones 1 o 2.
10.

Método de la reivindicación 9, que comprende además la recuperación del material celulósico degradado.
11.

Método de la reivindicación 9 o 10, donde la composición enzimática comprende una o varias enzimas seleccionadas del grupo consistente en una celulasa, un polipéptido con actividad de mejora celulolitica, una hemicelulasa, una expansina, una esterasa, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.
12.

Método para la producción de un producto de fermentación, que comprende:

(a)

sacarificación de un material celulósico con una composición enzimática en presencia de la variante según la reivindicación 1 o 2;

(b)

fermentación del material celulósico sacarificado con uno o varios microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y (el recuperación del producto de fermentación de la fermentación.
13. Método de fermentación de un material celulósico, que comprende: fermentación del material celulósico con uno

o varios microorganismos fermentadores, donde el material celulósico se sacarifica con una composición enzimática en presencia de la variante según la reivindicación 1 02.
14.

Método de la reivindicación 12 o 13, donde la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido con actividad de mejora celulolítica, una hemicelulasa, una expansina, una esterasa, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.
15.

Método de la reivindicación 13 o 14, donde la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación.
16.

Método de la reivindicación 15, que comprende además la recuperación del producto de fermentación de la fermentación.
17.

Composición de detergente que comprende la variante de la reivindicación 1 o 2 y un tensioactivo.
18.

Formulación de caldo completo o composición de cultivo celular que comprende la variante de la reivindicación 1