BR112014014697A2

BR112014014697A2 - polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, para gerar oxigênio molecular, e para remover peróxido de hidrogênio do tecido, processos para degradar ou converter um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células

Info

Publication number: BR112014014697A2
Application number: BR112014014697-7A
Authority: BR
Inventors: Junxin Duan; Yu Zhang; Lan Tang; Ye Liu
Original assignee: Novozymes, Inc.
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2020-10-27
Also published as: EP2794870A1; EP2794870A4; WO2013091547A1

Abstract

  POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E UMA PROTEÍNA, PARA GERAR OXIGÊNIO MOLECULAR, E PARA REMOVER PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO DO TECIDO, PROCESSOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, E, FORMULAÇÃO DE CALDO INTEGRAL OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS. A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com atividade de catalase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também refere-se a construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptÍdeos.

Description

“POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E UMA PROTEÍNA, PARA GERAR OXIGÊNIO MOLECULAR, E PARA REMOVER PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO DO TECIDO, PROCESSOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, E, FORMULAÇÃO DE CALDO INTEGRAL OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS” Declaração Dos Direitos Para As Invenções Realizadas Em Pesquisa E Desenvolvimento Patrocinadas Pelo Governo Federal

[0001] Esta invenção foi realizada com o auxílio do Governo no acordo de cooperação DE-FC36-08GO 18080, concedida pelo Departamento de Energia. O Governo apresenta certos direitos nesta invenção. Referência A Uma Listagem De Sequências

[0002] Este pedido contém uma listagem de sequências na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência. Fundamentos da Invenção Campo da invenção

[0003] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos com atividade de catalase e domínios catalíticos, e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, e domínios catalíticos. A invenção também refere-se a construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos, e domínios catalíticos. Descrição Da Técnica Relacionada

[0004] As catalases [peróxido de hidrogênio: peróxido de hidrogênio oxidorredutases (EC 1.11.1.6) ] são enzimas que catalisam a conversão de peróxido de hidrogênio (H2O,) em oxigênio (O) e água (H2O). Estas enzimas ubíquas foram purificadas a partir de uma variedade de tecidos animais, plantas e micro-organismos (Chance e Maeli, 1955, Métodos Enzymol. 2: 7164-791).

[0005] As preparações de catalase são usadas comercialmente para kits de enzima para diagnósticos, para a produção enzimática de gluconato de sódio a partir da glicose, para a neutralização de HO,» residual, e para a remoção de H7O, e/ou geração de O, em alimentos e bebidas.

[0006] WO 92/17571 descreve uma catalase, que mantém a atividade em temperatura e pH mais elevados do que outras catalases conhecidas, a partir de cepas de Scytalidium e Humicola. UNIPROT:AIDJUS9 descreve uma sequência deduzida de aminoácidos de catalase de Neosartorya fischeri. UNIPROT:P30266 descreve uma catalase de Bacillus pseudofirmu. UNIPROT:P42234 descreve um polipeptídeo de catalase de Bacillus subtilis. JP2007143405-A descreve uma catalase de Thermoascus aurantiacus.

[0007] A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade de catalase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário Da Invenção

[0008] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com atividade de catalase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 83% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, pelo menos pelo menos 76% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, média, média-alta, alta ou muito alta em (1) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência de DNAc do mesmo, ou (li) o complemento de tamanho total de (1) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, pelo menos 76% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5; ou a sequência de DNAc dos mesmos; (d) um variante do polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 8, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de catalase.

A presente invenção também refere-se a polipeptídeos isolados compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico com pelo menos 83% de identidade de sequência com aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, um domínio catalítico com pelo menos 76% de identidade de sequência com aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, um domínio catalítico com pelo menos 60% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou um domínio catalítico com pelo menos 60% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, média, média-alta, alta ou muito alta em (i) nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ

ID NO: 1, nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3, ou nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5, (11) a sequência de DNAc do mesmo, ou (il) o complemento de tamanho total de (1) ou (ii); (c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotíideo com pelo menos 83% de identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76% de identidade de sequência com nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1, um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3, ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5; (d) um variante de aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, um variante de aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, um variante de aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou um variante de aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento do domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de catalase.

[0009] A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico; vetores de expressão recombinantes; células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir os polipeptídeos.

[00010] A presente invenção também refere-se a processos para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

[00011] A presente invenção também refere-se a processos de produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) micro- organismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[00012] A presente invenção também refere-se a processos de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) micro-organismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em um outro aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[00013] A presente invenção também refere-se a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos | a 20 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos | a 24 de SEQ ID NO: 6, que é operavelmente ligado a um gene que codifica uma proteína; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir uma proteína.

Breve Descrição Das Figuras

[00014] Figura 1 mostra a sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 1) e a sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de um gene de catalase de Malbranchea cinnamomea.

[00015] Figura 2 mostra a sequência de DNA genômico (SEQ ID NO:

3) e a sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de um gene de catalase de Rhizomucor pusillus.

[00016] Figura 3 mostra a sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 5) e a sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de um gene de catalase de Rhizomucor pusillus.

[00017] Figura 4 mostra a sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 7) e a sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de um gene de catalase de Penicillium emersonii.

[00018] Fighnra 5 mostra um mapa de restrição de pCat ZY582303 121.

[00019] Figuonra 6 mostra um mapa de restrição de pCat ZY654893 6661.

[00020] Figuonra 7 mostra um mapa de restrição de pCat ZY654878 5541.

[00021] Figohra 8 mostra um mapa de restrição de pCat PE04230007241.

Definições

[00022] Catalase: O termo “atividade de catalase” é aqui definido como uma atividade de peróxido de hidrogênio:peróxido de hidrogênio oxidorredutase (EC 1.11.1.6) que catalisa a conversão de 2 HO», O; + 2 H7O. Com propósitos da presente invenção, atividade de catalase é determinada de acordo com patente U.S. 5.646.025. Uma unidade de atividade de catalase é igual a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 umol de peróxido de hidrogênio nas condições do ensaio. Alternativamente, a atividade de catalase pode ser determinado usando o procedimento descrito nos exemplos 17 e 18 da presente invenção.

[00023] Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de catalase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8.

[00024] Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato alfa-naftila, e acetato de p-nitrofenila. Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilano esterase é determinada usando p- nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM pH 5,0 contendo TWEENTMY 20 a 0.01% (polioxietileno sorbitano monolaurato). Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ânio p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25ºC.

[00025] Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. Variações alélicas surgem naturalmente por meio de mutação, e podem resultar em polimorfismo nas populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou pode codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácido. Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

[00026] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não reduzidos terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo de alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L-

arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 uL por 30 minutos a 40ºC, seguido por análise de arabinose por cromatografia de coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos).

[00027] Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo em D-glicuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ácido glucurônico ou 4- O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40ºC.

[00028] Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1,21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D- glicose. Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato, de acordo com o procedimento de Venturi er al., 2002, Extracellular beta-D- glicosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 umol de ânion p- nitrofenolato produzido por minuto a 25ºC, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil- beta-D-glucopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo TWEENQ 20 0,01%.

[00029] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta —(4)-xilo-oligossacarídeos curtas para remover sucessivos resíduos de

D-xilose a partir das terminações não reduzidas. Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 umol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40ºC, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEENQ 20 0,01%.

[00030] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima que contém a maquinaria catalítica da enzima.

[00031] DNAc: O termo "DNAc" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula RNAm madura, unida obtida de uma célula eucariótica. O DNAc precisa de sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm unido maduro.

[00032] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glicana celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C. 3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo- oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligada a beta-1,4, que libera celobiose a partir da extremidade redutora (celobioidrolase 1) ou extremidade não redutora (celobioidrolase ID) da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283- 288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para determinar a atividade de celobioidrolase.

[00033] Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glucosidase(s), ou combinações das mesmas. As duas abordagens básicas para medir atividade celulítica incluem: (1) medir a atividade celulítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glucosidases) da maneira revisada em Zhang et al.,, Outlook for celulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-

481. Atividade celulítica total é em geral medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman Nº1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulítica total mais comum é o ensaio com papel de filtro usando papel de filtro Whatman Nº1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[00034] Com propósitos da presente invenção, a atividade de enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulósico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) nas seguintes condições: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em PCS (ou outros material celulósico pré-tratado) por 3-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, comparada a uma hidrólise controle sem adição de proteína do tipo enzima celulolítica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado e não lavado, sólidos insolúveis a 5%, acetato de sódio SO mM pH 5, MnSO, 1 mM, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[00035] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, assim, um beta-(1-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora em geral polimórfica, a celulose é encontrada no tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano. As hemiceluloses em geral ligam hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

[00036] A celulose é encontrada em geral, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulolítico pode ser, mas sem limitação, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo culturas que fornecem energia), resíduo sólido municipal, resíduo de polpa e papel moído, papel residual e madeira (incluindo resíduos florestais) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), págs.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3- 16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et a/l., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, págs. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular de planta contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é qualquer material de biomassa. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[00037] Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo herbáceo (incluindo culturas para produção de energia). Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de polpa e papel moído. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel residual. Em um outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduo florestal).

[00038] Em um outro aspecto, o material celulósico é arundo. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço. Em um outro aspecto, o material celulósico é bambu. Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus. Em um outro aspecto, o material celulósico é casa de laranja. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

[00039] Em um outro aspecto, o material celulósico é álamo tremedor. Em um outro aspecto, o material celulósico é eucalipto. Em um outro aspecto, o material celulósico é pinheiro. Em um outro aspecto, o material celulósico é pinh. Em um outro aspecto, o material celulósico é choupo. Em um outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em um outro aspecto, o material celulósico é salgueiro.

[00040] Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de alga. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[00041] Em um outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Da maneira aqui usada, o termo "biomassa aquática" significa a biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser alga, plantas emergentes, plantas com folhas flutuantes ou plantas submersas.

[00042] O material celulolítico pode ser usado como é, ou pode ser submetido a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira descrita aqui. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é pré-tratado.

[00043] Enzima celulolítia ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glucosidase(s), ou combinações destas. As duas abordagens básicas para medir atividade celulítica incluem: (1) medir a atividade celulítica total, e (2) medir o individual atividades celulolíticas (endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glucosidases) da maneira revisada em Zhang et al., Outlook for celulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-

481. Atividade celulítica total é em geral medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman Nº1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulítica total mais comum é o ensaio com papel de filtro usando papel de filtro Whatman Nº] como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[00044] Com propósitos da presente invenção, enzima celulolítica atividade é determinado medindo o aumento em hidrólise de um material celulósico pela enzima celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de enzima celulolítica proteína/g de celulose em PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) por 3-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, comparado com uma hidrólise controle sem adição de enzima celulolítica proteína. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado e não lavado, 5% sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM pH 5, 1 MM MnSO;, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[00045] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificante são determinados em geral por um quadro aberto de leitura, que começa com um códon inicial tal como ATG, GTG, ou TTG, e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, DNAc, DNA sintético, ou uma combinação dos mesmos.

[00046] Sequências controle: O termo “sequências controle” significa sequências de ácido nucléico necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência controle pode ser natural (isto é, do mesmo gene) ou estrangeira (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou natural ou estrangeira uma à outra. Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência principal, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e finalizador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[00047] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.214), que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulolíticos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade de substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um ensaio de redução de açúcar (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato, de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40ºC.

[00048] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacionais e secreção.

[00049] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligada a sequências controle que fornecem sua expressão.

[00050] Família 61 de glicosídeo hidrolase: O termo “Família 61 de glicosídeo hidrolase” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que pertence à família 61 de glicosídeo hidrolase, de acordo com Henrissat, B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino- acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat, B., e Bairoch, A. 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas nesta família foram classificadas originalmente como uma família de glicosídeo hidrolase com base na medição da atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um elemento da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas são não canônicas e não podem ser consideradas como glicosidases autênticas. Entretanto, são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de melhorar a quebra da lignocelulose quando usadas junto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[00051] Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma hidrólise do açúcar 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise dos grupos 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir do açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnÃE, FAE-I, ou FAE-II. Com propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p- nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase equivale à quantidade de enzima capaz de liberar 1 umol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25ºC.

[00052] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que apresenta um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes da terminação amino e/ou carboxila de uma cadeia de polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade de catalase. Em um outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 614 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 650 resíduos de aminoácido ou pelo menos 686 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 604 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 640 resíduos de aminoácido ou pelo menos 676 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 602 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 638 resíduos de aminoácido ou pelo menos 674 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 588 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 623 resíduos de aminoácido ou pelo menos 658 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 6.

[00053] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y. Microbial hemicelullases. Current Opinion in Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas sem limitação, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando-os em uma rede forte. As hemiceluloses também são covalentemente anexadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura muito complexa. A estrutura variável e a organização de hemiceluloses exigem a ação combinada de muitas enzimas para sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são tanto o glicosídeo hidrolases (GHs), que hidrolisam ligações glicosídicas, quanto carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações éster de acetato ou grupos laterais de ácido ferúlico. Estes modos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser determinados nas famílias GO e CE. Algumas famílias, com um dobramento completo similar, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GAZA). Uma classificação mais informativa e a classificação atualizada destas e outras enzimas ativas no carboidrato são disponíveis na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades da enzima hemicelulolítica podem ser avaliadas de acordo com Ghose e Bisaria,

1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada, por exemplo, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, e em pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5.

[00054] Condições de severidade alta: O termo “condições de severidade alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 65ºC.

[00055] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, ou similar a um construto de ácido nucléico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

[00056] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucléico, proteína, peptídeo ou cofator que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais, ou todos, os constituintes de ocorrência natural com os quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada por manipulação humana relacionada àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância relacionada a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância).

[00057] Condições de severidade baixa: O termo “condições de severidade baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada, por 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 50ºC.

[00058] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo na sua forma final após a tradução e qualquer das modificações pós-translacionais, tais como processamento Nr-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 20 a 741 de SEQ ID NO: 8 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8 são um peptídeo sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 17 a 729 de SEQ ID NO: 2 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 21 a 730 de SEQID NO: 4 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 4 são um peptídeo sinal. Em um outro aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 25 a 717 de SEQ ID NO: 6 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos | a 24 de SEQ ID NO: 6 são um peptídeo sinal. Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Sabe-se também na técnica que células hospedeiras diferentes processam polipeptídeos de maneira diferente e, assim, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, com um aminoácido C-terminal e/ou N-

terminal diferente), comparada a uma outra célula hospedeira que expressa o mesmo polinucleotídeo.

[00059] Sequência que codifica o polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica o polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de catalase. Em um outro aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 58 a 2476 de SEQ ID NO: 7 ou a sequência de DNAc do mesmo com base no programa SignalP que prevê que os nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 7 codificam um peptídeo sinal. Em um aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 49 a 2619 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc do mesmo com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 48 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em um outro aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 61 a 2708 de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNAc do mesmo com base no programa SignalP que prevê que os nucleotídeos 1 a 60 de SEQ ID NO: 3 codificam um peptídeo sinal. Em um outro aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 73 a 2670 de SEQ ID NO: 5 ou a sequência de DNAc do mesmo com base no programa SignalP que prevê que os nucleotídeos 1 a 72 de SEQ ID NO: 5 codificam um peptídeo sinal.

[00060] Condições de severidade média: O termo “condições de severidade média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35% formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 55ºC.

[00061] Condições de severidade média-alta: O termo “condições de severidade média-alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35% formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 60ºC.

[00062] Construto de ácido nucléico: O termo "construto de ácido nucléico" significa uma molécula de ácido nucléico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que pode não existir de outra forma na natureza, ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências controle.

[00063] Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição apropriada, com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

[00064] Polipeptídeo com melhor atividade celulolítica: O termo “polipeptídeo com melhor atividade celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima que apresenta atividade celulolítica. Com propósitos da presente invenção, a melhor atividade celulolítica é determinada avaliando o aumento nos açúcares redutores, ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em resíduo de milho pré- tratado (PCS), em que a proteína total é compreendida de 50-99,5% de p/p de proteína enzimpatica celulolítica e 0,5-50% de p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica por 1-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50ºC, 55ºC, ou 60ºC, e um pH adequdo tal como 4-9, por exemplo, 5,0 ou 5,5, comparado a uma hidrólise controle com igual carga total de proteína sem melhor atividade celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST& 1.5L (Novozymes UM/S, Bagsverd, Dinamarca) na presença de 2-3% de peso total de proteína beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014), ou 2-3% de peso total de proteína de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae da maneira descrita em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase proteína é usado como a fonte da atividade celulolítica.

[00065] Os polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulósico, catalisado por enzima que apresenta atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,10 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos vezes.

[00066] Resíduo de milho pré-tratado: O termo “PCS” ou “resíduo de milho pré-tratado” significa um material celulolítico derivado de resíduo de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino ou pré-tratamento neutro.

[00067] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[00068] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle do pacote

EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice er al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão

3.0.0, 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUMO62). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número total de intervalos no alinhamento)

[00069] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir:

[00070] (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento — Número total de intervalos no alinhamento)

[00071] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes na extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento com atividade de catalase. Em um outro aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1842 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1950 nucleotídeos ou pelo menos

2058 nucleotídeos.de SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1812 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1920 nucleotídeos ou pelo menos 2028 nucleotídeos.de SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1806 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1914 nucleotídeos ou pelo menos 2022 nucleotídeos.de SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1764 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1869 nucleotídeos ou pelo menos 1974 nucleotídeos.de SEQ ID NO: 5.

[00072] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade de catalase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou eliminação, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a troca do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um aminoácido adjacente e imediatamente após o aminoácido que ocupa uma posição.

[00073] Condições de severidade muito alta: O termo “condições de severidade muito alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 70ºC.

[00074] Condições de severidade muito baixa: O termo “condições de severidade muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 45ºC.

[00075] Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material que compreende um polissacarídeo de parede celular vegetal, contendo uma parte principal de resíduos beta-(1-4)- ligados à xilose. Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma parte principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada carboidratos de cadeias curtas. Compreendem ácido D-glucurônico ou seu éter de 4-O-metila, L-arabinose e/ou vários oligossacarídeos compostos de D- xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose e D-glicose. Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, os quais incluem glucuronoxilanos, — (arabino)glucuronoxilanos, — (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

[00076] Nos processos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

[00077] Atividade que degrada xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, —beta-xilosidases, — arabinofuranosidases, — alfa-glucuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glicuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios de enzimas xilanolíticas foram sumarizados em, por exemplo, várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely e Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-

xylano xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

[00078] A atividade total que degrada xilano pode ser medida determinando a redução de açúcares formada a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares reduzidos de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico, da maneira descrita em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também pode ser determinada com 0,2% de AZCL-arabinoxilano como substrato em TRITONG& X-100 0,01% (4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol) e tampão sulfato de sódio 200 mM pH 6 a 37ºC. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 umol de azurina produzida por minuto a 37ºC, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2% como substrato em tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

[00079] Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Clerical Coo., Inc., St. Louis, MO, Estados Unidos) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50ºC, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazina do ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

[00080] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano 0,2% como substrato em

TRITON X-100 0,01% e tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37ºC. Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 umol de azurina produzida por minuto a 37ºC, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2% como substrato em tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6. Descrição Detalhada Da Invenção Polipeptídeos Com atividade de catalase

[00081] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que apresentam atividade de catalas. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com um identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que apresentam atividade de catalase. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com um identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que apresentam atividade de catalase. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com um identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que apresentam atividade de catalase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em mais de 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir do polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[00082] Um polipeptídeo da presente invenção compreende ou consiste preferivelmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica do mesmo; ou é um fragmento do mesmo com atividade de catalase. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 20 a 741 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 17 a 729 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 21 a 730 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 25 a 717 de SEQ ID NO: 6.

[00083] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo isolado com atividade de catalães codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (li) a sequência de DNAc do mesmo, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00084] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5, ou uma subsequência do mesmo, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou um fragmento do mesmo, podem ser usados para desenhar as sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos com atividade de catalase a partir das cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou DNAc de uma célula de interesse, seguindo os procedimentos padrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente menores que a sequência total, mas podem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em tamanho. Preferivelmente, a sonda de ácido nucléico apresenta pelo menos 100 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em tamanho. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com *?P, ?H, *S, biotina ou avidina). Tais sondas são incluídas pela presente invenção.

[00085] Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc preparada a partir de tais outras cepas pode ser selecionada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas anteriormente e codifica um polipeptídeo com atividade de catalase. O DNA genômico ou outro, a partir de tais outras cepas, pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que hibridiza em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da mesma, ou uma subsequência da mesma, o material carreador é usado em um Southern blot.

[00086] Com propósitos da presente invenção, hibridização indica que os polinucleotídeos hibridizam em uma sonda marcada de ácido nucleico que corresponde a (i) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; (11) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: l, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5; (iii) a sequência de DNAc do mesmo; (iv) o complemento de tamanho total do mesmo; ou (v) uma subsequência do mesmo; em condições de severidade muito baixa a muito alta. As moléculas nas quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00087] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro do mesmo; ou um fragmento do mesmo. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; ou a sequência de DNAc do mesmo. Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[00088] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com atividade de catalase codificado por um polinucleotíideo com um identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, ou a sequência de DNAc do mesmo, de pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados com atividade de catalase codificado por um polinucleotídeo com um identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: l, ou a sequência de DNAc do mesmo, de pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere- se a um polipeptídeo isolado com atividade de catalase codificado por um polinucleotídeo com um identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência de DNAc do mesmo, de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos

90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere- se a um polipeptídeo isolado com atividade de catalase codificado por um polinucleotídeo com um identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 5, ou a sequência de DNAc do mesmo, de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[00089] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido introduzido no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As alterações de aminoácidos podem ser de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de 1-30 aminoácidos; extensões pequenas amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligante pequeno de até 20- resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação mudando a carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00090] Os exemplos de substituições conservativas estão nos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leuw/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[00091] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudam o pH ideal e similares.

[00092] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade de catalase para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, da maneira determinada por tais técnica como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith er al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com o polipeptídeo pai. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00093] As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles descritos por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese região-direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00094] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893- 896). As moléculas de DNA mutagenizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[00095] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido, em que uma região de um polipeptídeo é fundido à terminação N ou à terminação C de uma região de um outro polipeptídeo.

[00096] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável, em que um outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira que eles fiquem em alinhamento e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e finalizador(s). Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando tecnologia de inteína, na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00097] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas sem limitação, o sítios descritos em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. Fontes de polipeptídeos com atividade de catalase

[00098] Um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, da maneira aqui usada junto com uma dada fonte, pode significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente. O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de Malbranchea, Penicillium, ou Rhizomucor.

[00099] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Malbranchea cinnamomea. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Rhizomucor pusillus. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium emersonil. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium funiculosum. Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium purpurogenum.

[000100] Será entendido que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção inclui tanto os estágios perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em consideração o nome da espécie pelo qual são conhecidas. Os versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes adequados.

[000101] As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tals como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[000102] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas anteriormente mencionadas. As técnicas para isolar microrganismos e DNA diretamente de seus habitats naturais são bem conhecidas na tecnologia. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptideo pode então ser obtido selecionando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc de um outro microrganismo ou amostra mista de DNA. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Domínios catalíticos

[000103] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos com uma identidade de sequência com aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos com uma identidade de sequência com aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos com uma identidade de sequência com aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos

92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos com uma identidade de sequência com aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em um aspecto, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácido que diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, ou 10, dos aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6.

[000104] O domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8 ou um variante alélico do mesmo; ou é um fragmento do mesmo com atividade de catalase. O domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico do mesmo; ou é um fragmento do mesmo com atividade de catalase. O domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4 ou um variante alélico do mesmo; ou é um fragmento do mesmo com atividade de catalase. O domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6 ou um variante alélico do mesmo; ou é um fragmento do mesmo com atividade de catalase.

[000105] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa,

condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, e condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) com nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3, ou nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5, ou o complemento de tamanho total deste (Sambrook er al., 1989, supra).

[000106] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7 de pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[000107] O polinucleotideco que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7. O polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1. O polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3. O polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5.

[000108] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a variantes de domínio catalítico de aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, variantes de domínio catalítico de aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, variantes de domínio catalítico de aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4 ou variantes de domínio catalítico de aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em um aspecto, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido introduzido na sequência de aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 38 a 711 de

SEQ ID NO: 6, é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,9, ou 10. Polinucleotídeos

[000109] A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo, um domínio catalítico da presente invenção, da maneira aqui descrita.

[000110] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na tecnologia e incluem o isolamento a partir do DNA genômico ou DNAc, ou uma combinação dos mesmos. A clonagem dos polinucleotídeos a partir do DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou a seleção de anticorpo das bibliotecas de expressão para detectar fragmentos clonados de DNA com características estruturais similares. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucléico, tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação a base de polinucleotíideo (NASBA), podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Malbranchea, Rhizomucor ou Penicillium, ou um organismo relacionado e, assim, por exemplo, pode ser um variante alélico ou de espécie da região do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[000111] A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos — substancialmente “similares ao polipeptideco. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir de alguma maneira geneticamente modificada do polipeptídeo isolado a partir de sua fonte natural, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares. Os variantes podem ser construídos com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, ou a sequência de DNAc do mesmo, ou uma subsequência deste, pela introdução de substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a uma sequência diferente de aminoácidos. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-

107. Construtos de ácido nucleico

[000112] A presente invenção também refere-se a construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotideo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle (por exemplo, várias) que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as sequências controle.

[000113] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia. [0001 14] A sequência controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos quanto heterólogos à célula hospedeira.

[000115] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene de alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de levanasacarase de Bacillus subtilis (sacB), gene xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagÃ), e gene de beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 3727- 3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Os exemplos de promotores em tandem são descrevedos em WO 99/43835.

[000116] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucléico da presente invenção, em uma célula hospedeira de fungo filamentoso, são os promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, catalase 1 de Trichoderma reesei, catalase II de Trichoderma reesei, catalase III de Trichoderma reesei, catalase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase IM de Trichoderma reesei beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento de tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida, a partir de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos. Outros promotores são descritos na patente U.S. 6.011.147.

[000117] Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-I), galactoquinasse — de — Saccharomyces — cerevisiaee —“(GALI), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato — desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1I, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para leveduras como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[000118] A sequência controle também pode ser um finalizador de transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição. O finalizador é operavelmente ligado na terminação 3º do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer finalizador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[000119] Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes para protease alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL) e RNA ribossomal de Escherichia coli (rrnB).

[000120] Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa- Blicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, catalase I de Trichoderma reesei, catalase II de Trichoderma reesei, catalase III de Trichoderma reesei, catalase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento de tradução de Trichoderma reesei.

[000121] Os finalizadores preferidos para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros finalizadores usados para levedura como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[000122] A sequência controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm à jusante de um promotor e à montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[000123] Os exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidos a partir de um gene crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal de Bacteriology 177: 3465-3471).

[000124] A sequência controle também pode ser uma parte principal, uma região de um RNAm não traduzida, que é importante para a tradução pela célula hospedeira. À parte principal é operavelmente ligada à terminação 5? do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer parte principal que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[000125] As partes principais preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[000126] As partes principais adequadas para levedura como células hospedeiras são obtidas dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-I), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[000127] A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada à terminação 3º do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[000128] As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[000129] As sequências de poliadenilação usadas para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol.

Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[000130] A sequência controle também pode ser uma região que codifica um peptídeo sinal, que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via de secreção da célula. A extremidade 5º da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter intrinsecamente uma sequência de peptídeo sinal codificante naturalmente ligada no quadro aberto de leitura, com o segmente da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5º da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. Uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante. Alternativamente, uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira pode ser usada.

[000131] As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para NCIB 11837 amilase maltogênica de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[000132] As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras de fungo filamentoso são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae,

celulase de Humicola insolens, catalase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[000133] Os peptídeos sinais usados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeos sinais codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[000134] A sequência controle também pode ser uma sequência de pro- peptídeo codificante que codifica um pro-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pro- enzima ou pro-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pro- polipeptídeo é em geral inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pro-peptídeo a partir do pro- polipeptídeo. A sequência de pro-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[000135] Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pro- peptídeos estão presentes, a sequência de pro-peptídeo está posicionada próxima à terminação N de um polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal está posicionada próxima à terminação N da sequência de pro-peptídeo.

[000136] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que regulam a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sequências regulatórias são aqueles que causam expressão do gene a ser ativado e desativado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. As sequências regulatórias nos sistemas procariotos incluem os sistemas operacionaus lac, tac e trp. Em leveduras, o sistema ADH2 ou o sistema GALI podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae, e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobioidrolase I de Trichoderma reesei, e promotor de celobioidrolase II Trichoderma reesei podem ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem à amplificação de gene. Em sistemas eucariotos, estas sequências regulatórias incluem o gene di- hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado à sequência regulatória.

Vetores de expressão

[000137] A presente invenção também refere-se a vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parade transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotídeo e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (por exemplo, vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor, de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada com as sequências controle apropriadas para a expressão.

[000138] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[000139] O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja a replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com O(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado. Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

[000140] O vetor contém preferivelmente um ou mais (por exemplo, vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

[000141] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura incluem, mas sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1I e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol- succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amds (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-S*-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes dos mesmos. São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. São preferidos para uso em uma célula de Trichoderma os genes adeA, adeB, amdS, hph, e pyrG genes.

[000142] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável duplo da maneira descrita em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.

[000143] O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[000144] Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucléicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a

10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[000145] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[000146] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, puUC19, pACYC177, e pAUCYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, prTA1060, e pAMBI que permitem a replicação em Bacillus.

[000147] Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 mícron, ARSI, ARSA, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CENG6.

[000148] Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de filamentoso são AMA 1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA! e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos descrevedos em WO 00/24883.

[000149] Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

[000150] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células hospedeiras

[000151] A presente invenção também refere-se às células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor auto replicante extra- cromossomal da maneira descrita anteriormente. O termo "célula hospedeira" inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá muito do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[000152] A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[000153] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococceus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[000154] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus,

Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[000155] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000156] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, — Streptomyces — avermitilis, — Streptomyces — coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[000157] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de célula competente (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823- 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de £E. coli pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). À introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser realizada por transformação de protoplasto, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 6289- 6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets,

2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser realizada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, fInfect Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usada.

[000158] A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[000159] A célula hospedeira pode ser uma célula de fungo. “Fungos” da maneira aqui usada inclui os filos Ascomicota, Basidiomicota, Chitridiomicota e Zigomicota, bem como o Oomicota e todos os fungos mitospóricos (da maneira definida por Hawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8º edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

[000160] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. Apágs. Bacteriol. Symposium número de série 9, 1980).

[000161] A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces —carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[000162] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

[000163] As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, — Chrysosporium, — Coprinus, —Coriolus, —Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[000164] Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, — Chrysosporium —inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, — Chrysosporium — queenslandicum, —Chrysosporium — tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[000165] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, MJ, editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 1920. Métodos de produção

[000166] A presente invenção também refere-se a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem sintetiza o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é uma célula de Malbranchea. Em um aspecto mais preferido, a célula é uma célula de Malbranchea cinnamomea. Em um aspecto mais preferido, a célula é Malbranchea cinnamomea NNO44758. Em um aspecto preferido, a célula é uma célula de Rhizomucor. Em um aspecto mais preferido, a célula é uma célula de Rhizomucor pusillus. Em um aspecto mais preferido, a célula é Rhizomucor pusillus NNO046782. Em um outro aspecto, a célula é uma célula de Penicillium. Em um outro aspecto, a célula é uma célula de Penicillium emersonii. Em um outro aspecto, a célula é uma célula de Penicillium emersonii NN051602.

[000167] A presente invenção também refere-se a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições que conduzem para produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

[000168] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, alimentado em batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, em um meio e condições adequados que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

[000169] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

[000170] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação. Em um aspecto, o caldo de fermentação que compreende o polipeptídeo é recuperado.

[000171] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Torque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[000172] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. Plantas

[000173] A presente invenção também refere-se a plantas isoladas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, que compreende um polinucleotídeo da presente invenção de maneira a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[000174] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicotilédone) ou monocotiledôneca (um monocotilédone): Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho).

[000175] Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana.

[000176] Exemplos de parte das plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomos e citoplasma também são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma maneira, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

[000177] São também incluídas no escopo da presente invenção são a progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta.

[000178] A planta transgênica ou célula de planta que expressa o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na tecnologia. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando um ou mais construtos de expressão que codificam o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto, e que propagam a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

[000179] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucléico, que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou domínio operavelmente ligado a sequências regulatórias adequadas exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável usado para identificar células de planta, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado).

[000180] A escolha das sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em onde, quando e como deseja-se expressar o polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser para o desenvolvimento, específica de estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte da planta tal como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[000181] Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina 1 do milho ou o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675- 689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885- 889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de um proteína de corpo oleoso de semente Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1.000), o promotor do gene adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade, ou induzido por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

[000182] Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um polipeptídeo ou domínio na planta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, descrevem o uso do primeiro intron do gene actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

[000183] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[000184] O construto de ácido nucléico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação Dbiolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[000185] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação possam ser usados por estas plantas. Um método para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos de transformação adicionais incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra).

[000186] Após a transformação, os transformantes com o construto de expressão incorporados são selecionados e regenerados nas plantas completas, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, o procedimento da transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto após as gerações usando,

por exemplo, co-transformação com dois construtos de DNA-T separados ou excisão sítio específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[000187] Além de direcionar a transformação de um genótipo particular de planta com um construto da presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o construto em uma segunda planta que precisa do construto. Por exemplo, um construto que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta daquela dada variedade. Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Da maneira aqui usada, progênie pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta mãe preparada de acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. Os cruzamentos resultam na introdução de um transgene em uma linhagem de planta polinizando de maneira cruzada uma linhagem inicial com uma linhagem de planta doadora. Os exemplos não limitantes de tais etapas são descritos na patente U.S. 7.151.204.

[000188] As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão de retrocruzamento. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, inato, híbrido convertido por retrocruzamento.

[000189] Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um antecedente genético em um outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação à reprodução convencional, na qual ele pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que de outra forma apresenta um antecedente genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma mãe elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que possui não apenas a característica de interesse, mas também apresentam uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta maneira, o número de gerações exigidas pata introgressar uma ou mais características em um antecedente genético particular é minimizado.

[000190] A presente invenção também refere-se aos métodos de produzir um polipeptídeo ou domínio da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta, que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou domínio, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo ou domínio; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo ou domínio. Remoção ou redução da atividade de catalase

[000191] A presente invenção também refere-se a métodos de produzir um mutante de uma célula mãe, que compreendem interromper ou deletar um polinucleotídeo, ou uma porção do mesmo, codificar um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula mãe quando cultivada nas mesmas condições.

[000192] A célula mutante pode ser construída reduzindo ou eliminando a expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, interrupções, substituições ou deleções. Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é inativado. O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificante, ou uma parte da mesma, essencial para a atividade, ou um elemento regulatório exigido para a expressão da região codificante. Um exemplo de uma sequência regulatória ou controle como esta pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional da mesma, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo. Outras sequências controle para possível modificação incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, sequência de peptídeo sinal, finalizador de transcrição e ativador transcricional.

[000193] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada submetendo a célula mãe à mutagênese e selecionando células mutantes nas quais a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo a sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Além do mais, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação dos mesmos agentes mutagênicos.

[000194] Exemplos de um agente mutagênico físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, — N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), — O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

[000195] Quando tais agentes são usados, a mutagênese é realizada tipicamente incubando a célula mãe a ser mutagenizada na presença do agente mutagênico de escolha em condições adequadas, e triando e/ou selecionando células mutantes que exibem expressão reduzida ou nenhuma expressão do gene.

[000196] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada pela inserção, substituição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos no gene, ou um elemento regulatório exigido para a transcrição ou tradução do mesmo. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de maneira a resultar na introdução de um códon de parada, na remoção do códon inicial, ou em uma mudança no quadro aberto de leitura. Tal modificação ou inativação pode ser realizada por mutagênese sítio direcionada ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Embora a princípio a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa o polinucleotídeo a ser modificado, é preferível que a modificação seja realizada in vitro da maneira exemplificada a seguir.

[000197] Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo baseia-se nas técnicas de substituição de gene, deleção de gene ou rompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, uma sequência de ácidos nucléicos que corresponde ao polinucleotídeo endógeno é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácidos nucléicos defeituosa que é então transformada na célula mãe para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de ácidos nucléicos defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso também codifique um marcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que o polinucleotídeo foi modificado ou destruído. Em um aspecto, o polinucleotídeo é interrompido com um marcador selecionável tais como aqueles aqui descritos.

[000198] A presente invenção também refere-se a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de catalase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de fita dupla (RNAds), em que o RNAds compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o RNAds tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[000199] O RNAds é preferivelmente um RNA de interferência pequeno (RNAsi) ou um RNA micro (RNAmi). Em um aspecto preferido, o RNAds é RNA de interferência pequeno para inibir a transcrição. Em um outro aspecto preferido, o RNAds é RNA micro para inibir a tradução.

[000200] A presente invenção também refere-se a tais moléculas de

RNA de fita dupla (RNAds) que compreendem uma porção da sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 5, para inibir a expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por nenhum mecanismo de ação particular, o RNAds pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de fita simples (RNAss) de sequências similares ou idênticas, incluindo RNAms endógenos. Quando uma célula é exposta ao RNAds, o RNAm do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo denominado RNA de interferência (RNAi).

[000201] Os RNAsds da presente invenção podem ser usados no silenciamento de gene. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para degradar seletivamente o RNA usando um RNAids da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAds podem ser usadas para gerar uma mutação de perda-de-função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos de preparar e usar moléculas de RNAds para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, patentes U.S. 6.489.127, 6.506.559, 6.511.824 e 6.515.109.

[000202] A presente invenção refere-se adicionalmente a uma célula mutante de uma célula mãe que compreende uma interrupção ou deleção de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou uma sequência controle deste, ou um gene silenciado que codifica o polipeptídeo, que resulta na célula mutante processando menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo, comparada à célula mãe.

[000203] As células mutantes deficientes em polipeptídeo são particularmente usadas nas células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos naturais e heterólogos. Portanto, a presente invenção refere-se adicionalmente a métodos de produzir um polipeptídeo heterólogo ou natural que compreende: (a) cultivar a célula mutante em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo. O termo "polipeptídeos heterólogos" significa polipeptídeos que não são naturais da célula hospedeira, por exemplo, um variante de uma proteína natural. A célula hospedeira pode compreender mais de uma cópia de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo heterólogo ou natural.

[000204] Os métodos usados para cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na técnica.

[000205] Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente livre de catalase são de particular interesse na produção de polipeptídeos de eucarioto, em particular proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes em catalasetb. Podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores e similares. O termo "polipeptídeos eucarióticos" inclui não apenas os polipeptídeos naturais, mas também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados por substituições, eliminações ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para melhorar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e similares.

[000206] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um produto proteico essencialmente livre de atividade de catalase que é produzido por um método da presente invenção. Formulações de caldo de fermentação ou composições de célula

[000207] A presente invenção também refere-se a uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de célula compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto do caldo de fermentação compreende adicionalmente mais ingredientes usados no processo de fermentação, tal como, por exemplo, células (incluindo, as células hospedeiras que contêm o gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção, as quais são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), restos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo integral de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou restos celulares, e meio de cultura.

[000208] O termo "caldo de fermentação", da maneira aqui usada, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que se submete à mínima ou nenhuma purificação e/ou recuperação. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando as culturas microbianas são crescidas em saturação, incubadas em condições de limitação de carbono, para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção em um meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados, a partir dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de célula usado, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[000209] Em uma modalidade, a formulação do caldo de fermentação e as composições celulares compreendem um primeiro componente de ácido orgânico, compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um sal do mesmo, e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo. Em uma modalidade específica, o primeiro componente do ácido orgânico é o ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente do ácido orgânico é ácido benzoico, ácido cicloexanocarboxílico,

ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal do mesmo, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

[000210] Em um aspecto, a composição contém ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém células mortas e/ou restos celulares adicionais. Em uma modalidade, as células mortas e/ou restos celulares são removidos de um caldo integral com células mortas para fornecer uma composição que é livre destes componentes.

[000211] As formulações do caldo de fermentação ou composições celulares podem compreender, adicionalmente, um agente conservante e/ou antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas sem limitação, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[000212] As formulações de caldo de fermentação ou composições de célula podem compreender adicionalmente múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. As formulações de caldo de fermentação ou composições de célula também podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma hidrolase, uma isomerase, uma ligase, uma liase, uma oxidorredutase, ou uma transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, catalase, esterase, glucoamilase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[000213] O caldo ou composição completa de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados do final da fermentação. Tipicamente, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) crescerem por saturação, são incubados em condições de limitação de carbono para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão da(s) enzima(s) celulase e/ou glucosidase). Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado, enzimas extracelulares e células mortas de fungo filamentoso. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo ou composição completa de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[000214] Uma composição ou caldo integral de células, da maneira aqui descrita, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, restos celulares, componentes do meio de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(s). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer uma composição líquida límpida.

[000215] As formulações em caldo integral e composições celulares da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

[000216] Os exemplos fornecidos a seguir são de usos preferidos das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condiçõesna qual a composição é usada pode ser determinada com base nos métodos conhecidos na técnica. Composições enzimáticas

[000217] A presente invenção também refere-se a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um polipeptídeo como este. O termo "enriquecida" indica que a atividade de catalase da composição foi melhorada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[000218] As composições podem compreendem um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição mono-componente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tal como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptideo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. As composições também podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma hidrolase, uma isomerase, uma ligase, uma liase, uma oxidorredutase, ou uma transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, catalase, esterase, glucoamilase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou uma seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[000219] Os exemplos fornecidos a seguir são de usos preferidos das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições na qual a composição é usada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica. Usos

[000220] Em termos gerais, o polipeptídeo pode ser usdo em qualquer situação na qual é desejado para remover o peróxido de hidrogênio residual de uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado, por exemplo, para a pasteurização ou branqueamento.

[000221] Os polipeptídeos com atividade de catalase da presente invenção podem ser usados comercialmente para kits de enzimas para diagnóstico, para a produção enzimática de gluconato de sódio a partir da glicose, para a neutralização de H7O, residual, e para a remoção de HO,» e/ou geração de O; em alimentos e bebidas usando métodos bem estabelecidos na técnica.

[000222] Em um aspecto, a presente invenção também refere-se a métodos para remover peróxido de hidrogênio, compreendendo tratar uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado com um polipeptídeo da presente invenção.

[000223] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para remover peróxido de hidrogênio de tecido.

[000224] Durante a fabricação de tecido, peróxido de hidrogênio é usado na etapa de branqueamento para remover completamente as impurezas coloridas, melhorar a absorbância, e atingir brancura adequada e capacidade de absorver corante. Entretanto, o excesso do produto de peróxido permanece no tecido e pode interferir com o mesmo e apresentar um efeito adverso nas colorações subsequentes com carantes aniônicos, por exemplo, corantes reativos onde o corante é em parte ou totalmente destruído. Em geral, a catalase é aplicada após a etapa de branqueamento para auxiliar a destruir o excesso de peróxido de hidrogênio. Em um outro aspecto, a presente invenção também refere-se a métodos para gerar oxigênio molecular, compreendendo tratar uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado com um polipeptídeo da presente invenção.

[000225] A presente invenção também refere-se aos seguintes processos para usar os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase, ou composições dos mesmos.

[000226] A presente invenção também refere-se a processos para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido. Os produtos solúveis de degradação ou conversão do material celulósico podem ser separados do material celulósico insolúvel usando um método conhecido na técnica tal como, por exemplo, centrifugação, filtração ou estabelecimento da gravidade.

[000227] A presente invenção também refere-se a processos de produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[000228] A presente invenção também refere-se a processos de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em um outro aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[000229] Os processos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável, e/ou produtos químicos de plataforma (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente o pré- tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), e fermentação.

[000230] O processamento do material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser realizado usando processos convencionais na técnica. Além disso, os processos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para funcionar de acordo com a invenção.

[000231] A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas sem limitação, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultânea (SSF); sacarificação e co- fermentação simultânea (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e co-fermentação separadas (SHCF); hidrólise e co-fermentação híbridas (HHCF) e conversão microbiana direta (DMO), algumas vezes também denominada bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa etapas de processo separadas para hidrolisar de maneira enzimática primeiro o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, monômeros do tipo glicose, celobiose e pentose, e então fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a co-fermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817- 827). HHF envolve uma etapa separada de hidrólise e, além disso, uma etapa simultânea de sacarificação e hidrólise que pode ser realizada no mesmo reator. As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em alta temperatura seguida por

SSF em uma temperatura menor que a cepa da fermentação possa tolerar. DMC combina todos os três processos (produção, hidrólise e fermentação enzimática) em uma ou mais (por exemplo, várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para a conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., and Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré- tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação dos mesmos, pode ser usado na prática dos processos da presente invenção.

[000232] Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado alimentado em batelada, um reator agitado em batelada, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the celobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:

1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrusor para hidrólise e/ou fermentação.

[000233] Pré-tratamento. Na prática dos processos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas do material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. de Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[000234] O material celulósico também pode ser submetido a redução de tamanho de partícula, peneiração, pré-enxarcamento, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os processos conhecidos na técnica.

[000235] Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré- tratamentos adicionais incluem tratamentos com percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO; supercrítico, HO supercrítica, ozônio, líquido iônico e irradiação gama.

[000236] O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. — Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a etapa de pré- tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[000237] Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-250ºC, por exemplo, 160-200ºC ou 170- 190ºC, onde a faixa de temperatura ideal depende da adição de um catalisador químico. O tempo de permanência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-60 minutos, por exemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos ou 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e da adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o material celulósico seja úmido em geral apenas durante o pré- tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. À lignina é removida em apenas uma extensão limitada.

[000238] Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Um pré-tratamento como este pode converter a celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de processos de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) líquido iônico e pré-tratamentos com organosolv.

[000239] Um catalisador, tal como H2SO, ou SO, (tipicamente 0,3 a 5% Pp/p), é em geral adicionado ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com o ácido diluído, tipicamente H/SO,, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[000240] Vários processos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas sem limitação, hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX). [000241 ]| O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio em temperaturas de 85-150ºC e tempo de permanência de

1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959- 1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 descrevem processos de pré-tratamento que usa amônia.

[000242] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200ºC por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40% de material seco, por exemplo, 2-30% de material seco ou 5-20% de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

[000243] Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de explosão de oxidação úmida e vapor), pode manusear material seco até 30%. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de permanência. O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[000244] A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas, tal como 90-150ºC, e alta pressão tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60% (Gollapalli er al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento com AFEX, a celulose e as hemicelulose permanecem relativamente intactas. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[000245] O pré-tratamento com organosolv delignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60% etanol) a 160-200ºC por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalizador. Em pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[000246] Outros exemplos de processos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. Vol. 105- 108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730.

[000247] Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento com ácido diluído, e mais preferivelmente como um tratamento contínuo com ácido diluído. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succeínico, cloreto de hidrogênio ou misturas dos mesmos. O tratamento com ácido fraco é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, por exemplo, 1-4 ou 1-2,5. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 10% em peso de ácido, por exemplo, 0,05 a 5% em peso de ácido ou 0,1 a 2% em peso de ácido. O ácido é colocado em contato com o material celulósico e mantido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 140-200ºC, por exemplo, 165-190ºC, por períodos que variam de 1 a 60 minutos.

[000248] Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré- tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80% em peso, por exemplo, 20-70% em peso ou 30-60% em peso, tal como em torno de 40% em peso. O material celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

[000249] Pré-tratamento mecânico ou pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento mecânico“ ou “pré-tratamento físico” refere-se a qualquer pré-tratamento que promove redução do tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bola vibratória).

[000250] O material celulósico pode ser pré-tratado tanto fisicamente (mecanicamente) quanto quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com explosão vaporosa/de vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido fraco ou diluído, alta temperatura, tratamento com alta pressão, irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas), ou combinações dos mesmos. Em um aspecto, a pressão elevada significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 0,68 (100) a cerca de 2,75 MPa (400 psi), por exemplo, cerca de 1,03 (150) a cerca de 1,72 MPa (250 psi). Em um outro aspecto, temperatura elevada significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300ºC, por exemplo, cerca de 140 a cerca de 200ºC. Em um aspecto preferido, o pré-tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo em batelada usando um sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos químicos ou físicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, se desejado.

[000251] Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido ao pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer combinação dos mesmos, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[000252] Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material celulósico. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos e/ou enzimas que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Ultilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical e biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P.., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from material lignocelullosics: Estado da Técnica, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[000253] Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, por exemplo, pré-tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada de maneira enzimática por uma composição de enzima, da maneira aqui descrita na presença de um polipeptídeo com atividade de catalase da presente invenção. Os components de enzima das composições podem ser adicionados de maneira simultânea ou de maneira sequencial.

[000254] A hidrólise enzimática é realizada preferivelmente em um ambiente aquoso adequado, em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade dos componentes de enzima, isto é, ideais para os componentes de enzima. A hidrólise pode ser realizada como um método alimentado em batelada ou contínuo, onde o material celulósico é alimentado gradualmente, por exemplo, por uma solução de hidrólise contendo enzima.

[000255] A sacarificação é realizada em geral em reatores ou fermentadores de tanque agitado em condições controladas de pH, temperatura e mistura. As condições adequadas de tempo de método, temperatura e pH podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, por exemplo, cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25ºC a cerca de 70ºC, por exemplo, cerca de 30ºC a cerca de 65ºC, cerca de 40ºC a cerca de 60ºC, ou cerca de 50ºC a cerca de 55ºC. O pH é na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O teor de sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50% em peso, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 40% em peso ou cerca de 20 a cerca de 30% em peso.

[000256] As composições enzimáticas podem compreender qualquer proteína usada em degradar ou converter o material celulósico.

[000257] Em um aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende — adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) proteínas/polipeptídeos selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma catalase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

[000258] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas e uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase e um polipeptideo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase e uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase, uma celobioidrolase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolíticaa. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase, uma celobioidrolase, e uma beta- glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma catalase, uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica.

[000259] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilmanana esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilxilano esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ácido coumárico esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma feruloil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronidase (por exemplo, alfa-D-glicuronidase). Em um outro aspecto, à composição enzimática compreende uma glicuronoil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma mananase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma manosidase (por exemplo, beta-

manosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilanase. Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família

10. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilosidase (por exemplo, beta-xilosidase).

[000260] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma expansina. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma laccase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferido, a enzima lignolítica é um manganês peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H;O,. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma pectinase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma peroxidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma protease. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

[000261] Nos processos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a sacarificação, sacarificação e fermentação, ou fermentação.

[000262] Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (por exemplo, vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que são usadas como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (por exemplo, vários) outros componentes da composição enzimática. Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição enzimática. A composição enzimática pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

[000263] As enzimas usadas nos processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. À composição enzimática pode ser um pó ou granulado seco, um granulado que não está em pó, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionado estabilizadores tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico, de acordo com os processos estabelecidos.

[000264] As quantidades ideais das enzimas e um polipeptídeo com atividade de catalase dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, a mistura de componentes de enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica, o material celulósico, a concentração de material celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultânea).

[000265] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de enzima celulolítica ou hemicelulolítica para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2.5 a cerca de 10 mg por g do material celulósico.

[000266] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de catalase para o material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, ou cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por grama do material celulósico.

[000267] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de catalase para a enzima celulolítica ou hemicelulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por grama de enzima celulolítica ou hemicelulolítica.

[000268] Os polipeptídeos com atividade da enzima celulolítica ou atividade da enzima hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos usados na degradação do material celulósico, por exemplo, polipeptidcos GH61 com melhor atividade celulolítica (coletivamente daqui por diante “polipeptídeos com atividade enzimática”), podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo de origem bacteriana, fúngica, levedura, planta ou mamífero. O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, empregando processos aqui descritos, em que a enzima produzida recombinantemente é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucléico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira são os variantes obtidos recombinantemente, tal como por mutagênese sitio-direcionada ou embaralhamento.

[000269] Um polipeptídeo com atividade enzimática pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram positiva, tal como um polipeptídeo com atividade — enzimática = de — Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, — Caldicellulosiruptor, — Acidothermus, — Thermobifidia, ou Oceanobacillus, ou um polipeptídeo de bactéria Gram negativa tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter Neisseria ou Ureaplasma.

[000270] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[000271] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberi, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000272] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermiltilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

[000273] O polipeptídeo com atividade enzimática também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium, Agaricus, Alternaria,

Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[000274] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[000275] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus Jjaponicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium

Juniculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride ou Trichophaea saccata.

[000276] Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica também podem ser usados.

[000277] Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As proteínas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

[000278] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzima celulolítica. Os exemplos de preparações comerciais de enzima celulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC& CTec (Novozymes A/S), CELLIC& CTec2 (Novozymes A/S), CELLIC& Ctec3 (Novozymes A/S), CELLUCLAST'Y (Novozymes A/S), NOVOZYM'Y 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME'"Y (Novozymes A/S), CEREFLOTY (Novozymes A/S), e ULTRAFLOTY (Novozymes A/S), ACCELERASETM (Genencor Int.), LAMINEX'TYM (Genencor Int.), SPEZYMETY CP (Genencor Int), FILTRASEO NL (DSM); METHAPLUS& SL 100 (DSM),

ROHAMENT'!M 7069 W (Róhm GmbH), FIBREZYMER LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYMEG?& LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTARG 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0% em peso de sólidos, por exemplo, cerca de 0,025 a cerca de 4,0% em peso de sólidos, ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0% em peso de sólidos.

[000279] Os exemplos de catalases bacterianas que podem ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, uma catalase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S.

5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); catalase III d e Thermobifida fusca (WO 05/093050) e catalase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[000280] Exemplos de catalases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, uma catalase | de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, catalase I de Trichoderma reesei Cel7B (acesso ao GENBANKTY número MI15665), catalase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), catalase II de Trichoderma reesei Cel5A (acesso ao GENBANKTYM número M19373), catalase II de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, acesso ao GENBANK'YN número ABO003694), catalase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, acesso ao GENBANKTYM número Z33381), catalase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic AÁcids Research 18: 5884), catalases de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), catalase de Erwinia carotovara (Saarilahti er al., 1990, Gene 90: 9-14), catalase de Fusarium oxysporum (acesso ao GENBANK'Y número L29381), catalase de Humicola grisea var. thermoidea (acesso ao GENBANKTY número ABO003107), catalases de Melanocarpus alhbomyces (acesso ao GENBANKTM número MALS15703), catalases de

Neurospora crassa (acesso ao GENBANKTY número XM 324477), catalase V de Humicola insolens, catalases Myceliophthora thermophila CBS 117.65, catalases de basidiomiceto CBS 495.95, catalases de basidiomiíceto CBS 494,95, catalases de Thielavia terrestris NRKRL 8126 CEL6B, catalases de Thielavia terrestris NRKRRL 8126 CEL6C, catalases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, catalases de Thielavia terrestris NKRL 8126 CEL7E, catalases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, catalases de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e catalase de Trichoderma reesei cepa número VTT-D-80133 (acesso ao GENBANKTY número M15665).

[000281] Os exemplos de celobrioidrolases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, celobioidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), — celobioidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase Il de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase I de Humicola insolens, celobioidrolase Il de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobioidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei e celobioidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

[000282] Os exemplos de beta-glicosidases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glicosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973- 4980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029) e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[000283] A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é uma proteína de fusão variante BG da beta- glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) ou uma proteína de fusão de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[000284] Outras catalases, celobioidrolases e beta-glicosidades usadas são descritas em várias famílias de glicosil hidrolase, usando a classificação de acordo com Henrissat, B., 1991, A classification of glycosil hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat, B., and Bairoch, A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[000285] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263 e patente U.S. 5.686.593.

[000286] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica pode ser usado.

[000287] Os exemplos de polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica usados nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, polipeptídeos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), polipeptídeos GH61 from Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397), e Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504).

[000288] Em um aspecto, o polipeptideo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente de ativação solúvel, de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, manganês ou cobre.

[000289] Em um outro aspecto, o polipeptideo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um composto de dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado, tal como resíduo de milho pré-tratado (PCS).

[000290] O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída, da maneira aqui descrita. Os compostos dióxi podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem frações arila substituída que não apresentam hidroxila e derivados de hidroxila. Os exemplos não limitantes dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido caféico; ácido 3,4-di-hidroxibenzoico; d4-terc-butil-S-metóxi-1,2- benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-triidroxibenzoato; 2,3,4- trildroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-di- hidroxibenzoico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; metil glicolato; ácido di-hidroxifumárico; 2-butino-1,4- diol; (ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3- etióxi-1,2-propanodiol; 2,4,4”-triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-di-hidróxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; di-hidroxiacetono; acroleína acetal; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzoico e metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato, ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000291] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado, da maneira aqui descrita. Os compostos podem compreender um ou mais (por exemplo, vários) anéis adicionais, e não são limitados a um número específico de anéis, a menos que de outra forma declarada. Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonoide. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonoide opcionalmente substituído. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou derivados destes. Os exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; caempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000292] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído compreendendo um heteroátomo, da maneira aqui descrita. Em um aspecto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma fração heteroarila opcionalmente — substituída. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila — opcionalmente — substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída, é uma heterocicloalquila de 5 elementos opcionalmente substituída ou uma fração de heteroarila de 5 elementos opcionalmente substituída. Em um outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, di-hidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, morfolinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila — opcionalmente — substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-di- hidroxietil)-3,4-di-hidroxifuran-2(5H)-ona; 4-hidróxi-S-metil-3-furanona; 5- hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2-di-hidroxietil |furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidróxi- y-butirolactona; ribônico 7-lactona; ácido aldoexurônico y-lactona; ácido glucônico — ô-lactona; — 4-hidroxicoumarina; di-hidrobenzofurano; 5- (hidroximetil)furfural; furoína; 2(5SH)-furanona; 5,6-di-hidro-2H-piran-2-ona; e 5,6-di-hidro-4-hidróxi-6-metil-2H-piran-2-ona; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000293] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina ou fração de nitróxido. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidinilóxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina e ácido maleâmico; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000294] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma fração de quinona da maneira aqui descrita. Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Qo; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-di-hidroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-S-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000295] O composto contendo enxofre pode ser qualquer suitable composto compreendendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-l-tiol; 2-ácido mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[000296] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente para o material celulósico como uma razão molar em unidades de glucosila de celulose é cerca de 10 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 7,5, cerca de 10 a cerca de 5, cerca de 10 a cerca de 2.5, cerca de 10 a cerca de 1, cerca de 10” a cerca de 1, cerca de 10º a cerca de 10, cerca de 10º a cerca de 10), cerca de 10º? a cerca de 10", ou cerca de 10º a cerca de 10º. Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente é cerca de 0,1 uM a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 uM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 uM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 uM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 uM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 uM a cerca de 50 mM, cerca de 10 uM a cerca de mM, cerca de 50 uM a cerca de 25 mM, cerca de 10 uM a cerca de 10 mM, cerca de 5 uM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 MM.

[000297] O termo “licor” significa a fase da solução, tanto aquosa, orgânica, quanto uma combinação das mesmas, que surge a partir do tratamento de um material com lignocelulose e/ou hemicelulose em uma lama, ou monossacarídeos dos mesmos, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., em condições da maneira aqui descrita, e os conteúdos solúveis dos mesmos. Um licor para melhoria celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido tratando um material com lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria prima), aplicando calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com interrupção física do material, e a seguir separando a solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de melhoria celulolítica, obtido por meio da combinação de licor e um polipeptídeo GH61, durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[000298] Em um aspecto, uma quantidade eficiente do licor para celulose é cerca de 10 a cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 7,5 g, cerca de 10 a cerca de 5, cerca de 10 a cerca de 2.5 g, cerca de 10 a cerca de 1 g, cerca de 10º a cerca de | g, cerca de 10º a cerca de 10" g, cerca de 10% * cerca de 10" g, cerca de 10º a cerca de 10" g, ou cerca de 10º a cerca de 10? g por g de celulose.

[000299] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzima hemicelulolítica. Exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME'Y (Novozymes A/S), CELLIC& HTec (Novozymes A/S), CELLIC& HTec2 (Novozymes A/S), CELLIC& HTec3 (Novozymes A/S), VISCOZYMER (Novozymes A/S), ULTRAFLOR (Novozymes A/S), PULPZYMEG?& HC (Novozymes A/S), MULTIFECTG Xilanase (Genencor), ACCELLERASE& XY (Genencor),) ACCELLERASER& XC (Genencor), ECOPULPR& TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOLTY 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOLTM 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOLTY 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

[000300] Os exemplos de xilanases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSegP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NKRL 8126 (WO 2009/079210) e Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083).

[000301] Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidases de Neurospora crassa (número de acesso ao SwissProt Q7SOWA4), Trichoderma reesei (número de acesso ao UniProtKB/TrEMBL Q92458), e Talaromyces emersonii (número de acesso ao SwissProt Q8X212).

[000302] Os exemplos de acetilxilano esterases usados nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de acesso GeneSeqgP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de acesso Uniprot QOUHIJ1I) e Thielavia terrestris NKRL 8126 (WO 2009/042846).

[000303] Os exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4), Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[000304] Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de acesso GeneSegP AARS94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (WO 2006/114094).

[000305] Os exemplos de alfa-glicuronidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glicuronidases de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcc12), Aspergillus fumigatus (número de acesso SwissProt Q4WWA45), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot QI6WX9I), Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211) e Trichoderma reesei (número de acesso Uniprot Q99024).

[000306] Os polipeptídeos com atividade enzimática, usados nos processos da presente invenção, podem ser produzidos por fermentação das cepas microbianas citadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

[000307] A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína. Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, alimentado em batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos processos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

[000308] Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado.

“Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

[000309] Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

[000310] Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é em geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

[000311] Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF).

[000312] “Microrganismo — fermentador” — refere-se =—a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose, ou uma combinação dos mesmos. Tanto os organismos fermentadores de hexose quanto de pentose são bem conhecidos na técnica. Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[000313] Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin er al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[000314] Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar os açúcares hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

[000315] Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar os açúcares pentose em seu estado natural incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. As leveduras fermentadoras de xilose preferidas incluem cepas de Candida, preferivelmente C. sheatae ou C. sonorensis; e cepas de Pichia, preferivelmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS

5773. As leveduras fermentadoras de pentose preferidas incluem cepas de Pachysolen, preferivelmente P. tannophilus. Organismos que não são capazes de fermentar açúcares pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para realizar isto por processos conhecidos na técnica.

[000316] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium —acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[000317] Outros organismos fermentadores incluem cepas de Bacillus, tal como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis e C.

scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutilicum, C. thermocellum e C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente = modificadas para melhorar o rendimento do etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans e K. fragilis, Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis.

[000318] Em um aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida sonorensis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida blankii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensil. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida entomophilitda. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida scehatae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Kluyveromyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[000319] Em um aspecto preferido, a bactéria é um Bacillus. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Bacillus coagulans. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium acetobutilicum. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Geobacilus sp. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é um . Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[000320] As leveduras comercialmente disponíveis e adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, BIOFERM'!Y AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, Estados Unidos), levedura ETANOL REDY (Fermentis/Lesaffre, Estados Unidos), FALITY (Fleischmann's Yeast, Estados Unidos), FERMIOL'"Y (DSM Specialties)), GERT STRANDTY (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART"Y e THERMOSACC"'Y (Ethanol Technology, WI, Estados Unidos).

[000321] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose, e que co-utilizam xilose e arabinose.

[000322] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL! genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655- 664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al, 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

[000323] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[000324] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira aqui descrita.

[000325] O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material celulósico degradado ou hidrolisado, e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, por exemplo, cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26ºC a cerca de 60ºC, por exemplo, cerca de 32ºC ou 50ºC, e cerca de pH 3 a cerca de pH 8, por exemplo, pH 4-5, 6, ou 7.

[000326] Em um aspecto, a levedura e/ou um outro microrganismo são aplicados ao material celulósico degradado, e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em um outro aspecto, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20ºC a cerca de 60ºC, por exemplo, cerca de 25ºC a cerca de 50ºC, cerca de 32ºC a cerca de 50ºC, ou cerca de 32ºC a cerca de 50ºC, e o pH é em geral cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam temperatura de fermentação ideal mais elevada. A levedura ou um outro microrganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 10º a 10"?º, de maneira preferível em aproximadamente 107 a 10'!º, de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 10º células viáveis por mL de caldo de fermentação. Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

[000327] Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

[000328] Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n- butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e ciclooctano), um alceno (por exemplo penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (Hz), dióxido de carbono (CO) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido múálico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico) e policetídeo. O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

[000329] Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será bem entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é n-butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é isobutanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etileno glicol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerina. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400- 408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processs for fermentative production of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T.C., Qureshi, N., and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckiil BAIO1 e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[000330] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é pentano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é hexano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é heptano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é octano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é nonano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é decano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é undecano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é dodecano.

[000331] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é ciclopentano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloexano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloeptano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloctano.

[000332] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é penteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hexeno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hepteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é octeno.

[000333] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production e other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[000334] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é Ho. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO,. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N., em

Biomass and Bioenergy, 13 (1-2): 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for metano production: A review.

[000335] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é isopreno.

[000336] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será bem entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[000337] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R., and Lee, Y. Y., 1997, Membrane- mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

[000338] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é policetídeo.

[000339] Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por processos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol.% pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial. Peptídeo sinal

[000340] A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados que codificam um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo em aminoácidos | a 19 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos | a 20 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos | a 24 de SEQ ID NO:

6. O polinucleotídeo malmente um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente ligado ao peptídeo sinal. A proteína é preferivelmente estrangeira ao peptídeo sinal. Em um outro aspecto, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 48 de SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 60 de SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 72 de SEQ ID NO: 5.

[000341] A presente invenção também refere-se a construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais polinucleotídeos.

[000342] A presente invenção também refere-se a processos de produzir uma proteína, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um polinucleotídeo como este operavelmente ligado a um gene que codifica a proteína; e opcionalmente (b) recuperar a proteína.

[000343] A proteína pode ser natural ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui que se refere a um tamanho específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos, e polipeptídeos. O termo “proteína” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.

[000344] Preferivelmente, a proteína é um hormônio, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase, ou transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, Dbeta-galactosidase, Dbeta-glucosidase, Dbeta- xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, catalase, esterase, glucoamilase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[000345] O gene pode ser obtido a partir de qualquer proarioto, eucarioto, ou outra fonte.

[000346] A presente invenção é descrita adicionalmente pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos Cepa

[000347] A cepa fúngica NN044758 foi isolada de uma amostra de solo coletada de Yunnan Province na China, pelo método de diluição em placa com meio PDA a 45ºC. Foi então purificada transferindo um único conídio para uma placa de ágar YG. A cepa NNO044758 foi identificada como Malbranchea cinnamomea, com base tanto nas suas características morfológicas quanto na sua sequência de ITS DNAr.

[000348] A cepa fúngica NN046782 foi isolada de uma amostra de solo coletada de Hunan Province na China. A cepa NN046872 foi identificada como Rhizomucor pusillus, com base tanto nas suas características morfológicas quanto na sua sequência de ITS DNAr.

[000349] A cepa fúngica NNO51602 foi isolada de uma amostra de composto coletada de Yunnan Province, China pelo método de diluição em placa com meio PDA a 45ºC. Foi então purificada transferindo um único conídio para uma placa de ágar YG. A cepa NNO051602 foi identificada como Penicillium emersonii, com base tanto nas suas características morfológicas quanto na sua sequência de ITS DNAr. Meios

[000350] O meio PDA era composto de 39 gramas de ágar batata dextrose e água deionizada para 1 litro.

[000351] A placa de ágar YG era composta de 5,0 g de extrato de levedura, 10,0 g de glicose, 20,0 g de agar, e água deionizada para 1 litro.

[000352] O meio YPG era composto de 0,4% de extrato de levedura, 0,1% de KH7;POa, 0,05% de MgSO.s “7H2O, 1,5% de glicose em água deionizada.

[000353] O meio YPM era composto de 1% de extrato de levedura, 2% de peptona, e 2% de maltose em água deionizada.

[000354] As placas de meio mínimo eram compostas de 342 g de sacarose, 20 mL de solução de sal, 20 g de ágar, e água deionizada para | litro. A solução de sal era composta de 2,6% de KCl, 2,6% de MgSO4:7H,0, 7,6% de KH;PO,s, 2 ppm de NasB4O07: 10H70, 20 ppm de CuSO,4 5H7O, 40 ppm de FeSO,:7H,O, 40 ppm de MnSO,:2H;0, 40 ppm de Na;MoO,s:2H,0, e 400 ppm de ZnSO,4:7H,0.

[000355] O meio FG4 era composto de 30 g de farinha de soja, 15 g de maltose, 5 g de peptona, e água deionizada para 1 litro. Exemplo 1: Extração de DNA genômico de Malbranchea cinnamomea

[000356] Malbranchea cinnamomea cepa NNO044758 foi inoculada em uma placa de PDA e incubada por 3 dias a 45ºC no escuro. Vários plugues de micélios-PDA foram inoculados frascos de agitação de 500 mL contendo 100 mL de meio YPG. Os frascos foram incubados por 3 dias a 45ºC com agitação a 160 rpm. Os micélios foram coletados por filtração por meio de MIRACLOTHA (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, por um almofariz e um pistão, em um pó fino, e DNA genômico foi isolado usando Large-Scale Column Fungal DNAout (BAOMAN BIOTECHNOLOGY, Shanghai, China) seguindo as instruções do fabricante. Exemplo 2: Sequenciamento, montagem e anotação do genoma

[000357] As amostras de DNA genômico extraídas foram enviadas para Beijing Genome Institute (BGI, Shenzhen, China) para o sequenciamento do genoma usando um ILLUMINAG GA?2 System (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA). As leituras brutas foram montadas em BGI usando programa SOAPdenovo (Li et al., 2010, Genome Research 20(2): 265-72). As sequências montadas foram analisadas usando métodos padrões de bioinformática para a identificação e previsão funcional do gene. GenelD (Parra er al., 2000, Genome Research 10(4):511-515) foi usado para a previsão de gene. Blastall versão 2.2.10 (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403410, National Center for Biotechnology Information (NCBI),

Bethesda, MD, USA) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBJI), Bethesda, MD, USA) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. A catalase foi identificada por análise dos resultados Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7: 263) e programa SignalP (Nielsen er al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) foram usados para identificar os códons de partida. O programa SignalP foi usado adicionalmente para prever peptídeo sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16(6): 276-277) foi usado para prever ponto isoelétrico e peso molecular da sequência deduzida de aminoácidos. Exemplo 3: Clonagem do gene de catalase de Malbranchea cinnamomea a partir do DNA genômico

[000358] Um gene de catalase, cat ZY582303 121 (SEQ ID NO: 1), foi selecionado para clonagem de expressão.

[000359] Com base na informação do DNA (SEQ ID NO: 1) obtida do sequenciamento do genoma, Oligonucleotídeos iniciadores mostrados a seguir na tabela 1, foram desenhados para amplificar o gene de catalase a partir do DNA genômico de Malbranchea cinnamomea NNO44758. Iniciadores foram sintetizados por Invitrogen Beijing, China.

Tabela 1 iniciadores

[000360] As letras minúsculas do iniciador direto representam as regiões codificantes do gene e as letras minúsculas do iniciador reverso representam a região flanqueante do gene, enquanto as letras maiúsculas eram homólogas aos sítios de inserção do vetor pPFJO355 que foi descrito em WO2011005867.

[000361] Vinte picomoles de cada par de iniciador direto e reverso foram usados em uma reação de PCR composta de 2 uL de DNA genômico de Malbranchea cinnamomea NNO044758, 10 uL de tampão GC 5X, 1,5 uL de dimetil sulfóxido (DMSO), 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 0,6 unidade de DNA polimerase de alta fidelidade PHUSIONTM (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) em um volume final de 50 uL. À amplificação foi realizada usando um termociclador Peltier (M J Research Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) programando para desnaturar a 94ºC por | minuto; 6 ciclos de desnaturação a 94ºC por 15 segundos, anelamento a 68ºC por 30 segundos, com uma diminuição de 1ºC por ciclo e alongamento a 72ºC por 100 segundos; e mais 23 ciclos cada qual a 94ºC por segundos, 65ºC por 30 segundos e 72ºC por 100 segundos; e uma extensão final a 72ºC por 5 minutos. O bloco aquecido foi então deixado em um ciclo de imersão a 4ºC.

[000362] O produto de PCR foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão Tris-borato 90 mM e EDTA 1 mM (TBE) onde uma única banda do produto em torno do tamanho esperado, —2,6 kb, foi visualizada em luz UV. O produto de PCR foi então purificado a partir da solução usando um kit ILLUSTRAR GFX& PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), de acordo com as instruções do fabricante.

[000363] Plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam HI e Bgl II, isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão TBE, e purificado usando um kit ILLUSTRA& GFX& PCR DNA and Gel Band Purification, de acordo com as instruções do fabricante.

[000364] Um kit IN-FUSION'Y CF Dry-down Cloning (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pPFJO355, sem a necessidade de digestão por restrição e ligação.

[000365] O produto de PCR e o vetor digerido foram ligados juntos usando um kit IN-FUSION'Y CF Dry-down PCR Cloning (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) que resulta em plasmídeo pCat ZY582303 121 (Figura 5) em que a transcrição do gene de catalase de Malbranchea cinnamomea estava no controle de um promotor do gene para alfa-amilase de Aspergillus oryzae. A operação de clonagem foi realizada de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, para cada reação de ligação 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam HI e Bgl II, e 60 ng dos produtos de PCR purificados de catalase de Malbranchea cinnamomea foram adicionados aos frascos de reação e o pó foi ressuspenso em um volume final de 10 uL com adição de água deionizada. A reação foi incubada a 37ºC por 15 minutos e a seguir 50ºC por 15 minutos. Três microlitros dos produtos de reação foram usados para transformar células competentes de E. coli TOPIO (TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd., Beijing, China). Os transformantes de £. coli contendo construtos de expressão foram detectados por PCR de colônia que é um método para seleção rápida de inserções de plasmídeo diretamente das colônias de £. coli. Resumidamente, na aliquota de solução de PCR pré-misturada em cada tubo de PCR, incluindo tampão de PCR, MgCl7, dNTP e pares de iniciadores para os quais o fragmento de PCR foi gerado, uma única colônia foi adicionada coletado com uma alça estéril e movimentando a alça na solução de reação. Em geral, 7-10 colônias foram selecionadas. Após o programa de PCR, as reações foram verificadas em gel de agarose. A colônia que fornece a amplificação de tamanho esperado continha possivelmente a inserção correta. O DNA plasmidial foi preparado a partir de colônias que exibem inserções com os tamanhos esperados usando um kit QIAprep* Spin Miniprep (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). O gene de catalase de Malbranchea cinnamomea inserido em pCat ZY582303 121 foi confirmado por sequenciamento de DNA usando um analisador de DNA 3730XL DNA (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, Estados Unidos).

Exemplo 4: Expressão do gene de catalase de Malbranchea cinnamomea em Aspergillus oryzae

[000366] Os protoplastos de Aspergillus oryzae HowB101 (descrito na patente WO9535385, exemplo 1) foram preprados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 e transformados com 3 ug de pCat ZY582303 121.

[000367] A transformação de Aspergillus oryzae HowB1l01l com pCat ZY582303 121 rendeu cerca de 50 transformantes para cada transformação. Oito transformantes foram isolados em placas de meio mínimo individual.

[000368] Quatro transformantes a partir da transformação foram inoculados separadamente em 3 mL de meio YPM em uma placa de 24 poços e incubados a 30ºC com agitação a 150 rpm. Após 3 dias de incubação, 20 uL do sobrenadante de cada cultura foram analisados por SDS-PAGE usando um NUPAGE& NOVEXGO 4-12% Bis-Tris Gel com 50 mM MES (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi corado com INSTANTBLUETY (Expedeon Ltd., Babraham Cambridge, UK). Os perfis SDS-PAGE das culturas mostraram a expressão com bandas de proteína detectadas. O tamanho da banda principal do gene foi em torno de 80 kDa. A cepa de expressão foi determinada como O6QZB. Exemplo 5: Fermentação da cepa de expressão O6QZB

[000369] Um raspado da cepa de expressão, O6QZB, foi lavado com 10 mL de meio YPM e inoculado em oito frascos de 2 litros, cada qual contendo 400 mL de meio YPM para gerar o caldo. A cultura foi coletada no dia 3 e filtrada usando uma membrana de 0,45 um DURAPOREG& (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Exemplo 6: Purificação de catalase recombinante de Malbranchea cinnamomea a partir de Aspergillus oryzae O6QZEB

[000370] O volume de 3.200 mL de sobrenadante filtrado da cepa recombinante O6QZB (Exemplo 5) foi precipitado com sulfato de amônio

(80% de saturação), redissolvido em 50 mL de tampão Bis-Tris 20mM, pH6,5, dialisado contra o mesmo tampão, e filtrado por meio de um filtro de 0,45 um. O volume final foi 80 mL. A solução foi aplicada em uma coluna de fluxo rápido de 40 mL Q SEPHAROSEQG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) equilibrada em tampão Bis-Tris 20 mM, pH 6,5, e as proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl (0-0,5M). As frações eluídas com NaCl 0,2-0,4 M foram coletadas e purificadas adicionalmente em uma coluna de fluxo rápido de 40 mL Phenyl Sepharose 6 (GE 17-0965-05) com um gradiente linear (NH4),SO, (1,2 - O M). As frações da coluna foram analisadas por SDS-PAGE usando um gel NUPAGE& NOVEXQ Bis-Tris, 1,5SMMI1I5SW. As frações contendo uma banda de aproximadamente 80 kDa foram agrupadas e concentradas por ultrafiltração. Exemplo 7: Extração de DNA genômico de Rhizomucor pusillus

[000371] Rhizomucor pusillus cepa NN046782 foi inoculada em uma placa de PDA e incubada por 3 dias a 45ºC no escuro. Vários plugues de micélios-PDA foram inoculados frascos de agitação de 500 mL contendo 100 mL de meio FG4. Os frascos foram incubados por 3 dias a 45ºC com agitação a 160 rpm. Os micélios foram coletados por filtração por meio de MIRACLOTHGO (Calbiochem, La Jolla, CA, Estados Unidos) e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, por um almofariz e um pistão, em um pó fino, e DNA genômico foi isolado usando kit DNeasy& Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) seguindo as instruções do fabricante. Exemplo 8: Sequenciamento, montagem e anotação do genoma

[000372] As amostras de DNA genômico extraídas foram enviadas para Beijing Genome Institute (BGI, Shenzhen, China) para o sequenciamento do genoma usando um ILLUMINAG? GA2 System (Illumina, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos). As leituras brutas foram montadas em BGI usando programa SOAPdenovo (Li et al., 2010, Genome Research 20(2): 265-72). As sequências montadas foram analisadas usando métodos padrões de bioinformática para a identificação e previsão funcional do gene. GenelD (Parra et al., 2000, Genome Research 10(4):511-515) foi usado para a previsão de gene. Blastall versão 2.2.10 (Altschul er al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403410, National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, Estados Unidos) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBIJ), Bethesda, MD, Estados Unidos) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. As catalases foram identificadas por análise dos resultados de Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7: 263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) foram usados para identificar os códons de partida. O programa SignalP foi usado adicionalmente para prever o peptídeo sinal. Pepstats (Rice er al., 2000, Trends Genet. 16(6): 276-277) foi usado para prever pontos isoelétricos e pesos moleculares da sequência deduzida de aminoácidoss. Exemplo 9: Clonagem dos genes de catalase de Rhizomucor pusillus a partir do DNA genômico

[000373] Dois genes de catalase, mostrados na tabela 2, foram selecionados para expressão. Tabela 2: Genes de catalase

[000374] Com base na informação do DNA (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5) obtida do sequenciamento do genoma, iniciadores mostrados a seguir na tabela 3, foram desenhados para amplificar o gene de catalases a partir do DNA genômico de Rhizomucor pusillus NNO46782. Iniciadores foram sintetizados por Invitrogen, Beijing, China. Tabela 3: iniciadores

[000375] As letras minúsculas do iniciador direto representam as regiões codificantes do gene e as letras minúsculas do iniciador reverso representam a região flanqueante do gene, enquanto as letras maiúsculas eram homólogas aos sítios de inserção de pPFJO355 €WO02011005867).

[000376] Para cat ZY654893 6661, 20 picomoles do par de iniciador (SEQID3 forward e SEQID3 reverse) foram usados em uma reação de PCR composta de 2 uL de DNA genômico de Rhizomucor pusillus NNO046782, 10 uL de tampão GC 5X, 1,5uL de DMSO, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 0,6 unidade de DNA polimerase de alta fidelidade PHUSION'TY (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) em um volume final de 50 uL. A amplificação foi realizada usando um termociclador Peltier (M J Research Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) programando para desnaturar a 98ºC por 1 minuto; 6 ciclos de desnaturação a 98ºC por 30 segundos, anelamento a 65ºC por 30 segundos, com uma diminuição de 1ºC por ciclo e alongamento a 72ºC por 2,5 minutos; e mais 25 ciclos cada qual a 94ºC por 30 segundos, 59ºC por 30 segundos e 72ºC por 2,5 minutos; e uma extensão final a 72ºC por 5 minutos. O bloco aquecido foi então deixado em um ciclo de imersão a 4ºC.

[000377] Para cat ZY654893 5541, 20 picomoles do par de iniciador (SEQID5 forward e SEQID5 reverse) foram usados em uma reação de PCR composta de 2uL de DNA genômico de Rhizomucor pusillus NN046782, 5 uL de tampão HIFI 10X, 2 uL de SOMM MgSO4, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 2,5 unidades de DNA polimerase de alta fidelidade PLATINUMPO Tag (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) em um volume final de 50 uL. A amplificação foi realizada usando um termociclador Peltier (M J Research Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) programando para desnaturar a 94ºC por 1 minuto; 6 ciclos de desnaturação a 94ºC por 15 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, com uma diminuição de 1ºC por ciclo e alongamento a 68ºC por 3 minutos; e mais 23 ciclos cada qual a 94ºC por 15 segundos, 58ºC por 30 segundos e 68ºC por 3 minutos; e uma extensão final a 68ºC por 5 minutos. O bloco aquecido foi então deixado em um ciclo de imersão a 4ºC.

[000378] Os produtos de PCR foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão Tris-borato 90 mM e EDTA | mM (TBE) enquanto uma única banda do produto de cada reação em torno do tamanho esperado, -2,6 kb e —-2,8 kb para cat ZY654893 6661 e cat ZY654893 5541 respectivamente, foi visualizada em luz UV. Os produtos de PCR foram a seguir purificados a partir da solução usando um kit ILLUSTRA& GFX& PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) de acordo com as instruções do fabricante.

[000379] Plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam HI e Bgl II, isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão TBE, e purificado usando um kit ILLUSTRA& GFX& PCR DNA and Gel Band Purification, de acordo com as instruções do fabricante.

[000380] Um kit IN-FUSION'Y CF Dry-down Cloning (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pPFJO355, sem a necessidade de digestão por restrição e ligação.

Tabela 4: Plasmídeos

[000381] Os produtos de PCR e o vetor digerido foram ligados juntos usando um IN-FUSION'Y CF Dry-down PCR Cloning que resulta em plasmídeos mostrados na tabela 4: pCat ZY654893 6661 (Figura 6) e pCat ZY654878 5541 (Figura 7), em que a transcrição dos genes de catalase de Ruzomucor pusillus estava no controle de um promotor do gene para alfa-

amilase de Aspergillus oryzae. À operação de clonagem foi realizada de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam HI e Bgl II, e 60 ng dos produtos de PCR purificados de catalse de Ruzomucor pusillus foram adicionados ao frasco de reação e o pó foi ressuspenso em um volume final de 10uL com adição de água deionizada. O produto de reação foi incubado a 37ºC por 15 minutos e a seguir 50ºC por minutos. Três microlitros da reação foram usados para transformar células competentes de E. coli TOPIO (TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd., Beijing, China). Os transformantes de EF. coli contendo construtos de expressão foram detectados por PCR de colônia e o plasmídeo DNA foi preparado usando um kit QIAprep* Spin Miniprep (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). Os genes de catalase de Ruzomucor pusillus inseridos em pCat ZY654893 6661 e pCat ZY654878 5541 foram confirmados por sequenciamento de DNA usando um analisador de DNA 3730XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, Estados Unidos). Exemplo 10: Extração de DNA genômico de Penicillium emersonii

[000382] Penicillium emersonii cepa NNOS51602 foi inoculada em uma placa de PDA e incubada por 3 dias a 45ºC no escuro. Vários plugues de micélios-PDA foram inoculados frascos de agitação de 500 mL contendo 100 mL de meio YPG. Os frascos foram incubados por 3 dias a 45ºC com agitação a 160 rpm. Os micélios foram coletados por filtração por meio de MIRACLOTHO (Calbiochem, La Jolla, CA, Estados Unidos) e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, por um almofariz e um pistão, em um pó fino, e DNA genômico foi isolado usando um Large-Scale Column Fungal DNAout (Baoman Biotechnology, Shanghai, China) de acordo com as instruções do fabricante. Exemplo 11: Sequenciamento, montagem e anotação do genoma

[000383] As amostras de DNA genômico extraídas foram enviadas para Beijing Genome Institute (BGI, Shenzhen, China) para o sequenciamento do genoma usando um ILLUMINAGÇ GA2 System (Illumina, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos). As leituras brutas foram montadas em BGI usando programa SOAPdenovo (Li et al., 2010, Genome Research 20(2): 265-72). As sequências montadas foram analisadas usando métodos padrões de bioinformática para a identificação e previsão funcional do gene. GenelD (Parra et al., 2000, Genome Research 10(4):511-515) foi usado para a previsão de gene. Blastall versão 2.2.10 (Altschul er al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403410, National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, Estados Unidos) e HMMER versão 2.1.1 (National Center for Biotechnology Information (NCBLJ), Bethesda, MD, Estados Unidos) foram usados para prever a função com base na homologia estrutural. A catalase foi identificada por análise dos resultados Blast. O programa Agene (Munch e Krogh, 2006, BMC Bioinformatics 7: 263) e programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) foram usados para identificar códons iniciais. O programa SignalP foi usado adicionalmente para prever peptídeo sinal. Pepstats (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16(6): 276-277) foi usado para prever ponto isoelétrico de proteínas, e peso molecular da sequência deduzida de aminoácidos. Exemplo 12: Clonagem da catalase de Penicillium emersonii a partir do DNA genômico

[000384] Um gene de catalase, PE04230007241 (SEQ ID NO: 7), foi selecionado para clonagem de expressão.

[000385] Com base na informação do gene (SEQ ID NO: 7) obtida por sequenciamento do genoma, os oligonucleotídeos iniciadores mostrados a seguir na tabela 5, foram desenhados para amplificar o gene de catalase, PE04230007241, a partir do DNA genômico de Penicillium emersonii. Iniciadores foram sintetizados por Invitrogen, Beijing, China.

Tabela 5 iniciadores

[000386] As letras minúsculas do iniciador direto representam as regiões codificantes do gene e as letras minúsculas do iniciador reverso representam a região flanqueante do gene, enquanto as letras maiúsculas eram homólogas aos sítios de inserção do vetor pPFJO355 que foi descrito em WO?2011005867.

[000387] Um kit IN-FUSION'Y CF Dry-down Cloning (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pPFJO355, sem a necessidade de digestão com restrição e ligação.

[000388] Vinte picomoles de cada par de iniciador direto e reverso foram usados em uma reação de PCR composta de 2 uL de DNA genômico de Penicillium emersonii, 10 uL de tampão GC 5X, 1,5 uL de DMSO, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 0,6 unidade de DNA polimerase de alta fidelidade PHUSION'M (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) em um volume final de 50 uL. A amplificação foi realizada usando um termociclador Peltier (M J Research Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) programando para desnaturar a 98ºC por 1 minuto; 8 ciclos de desnaturação a 98ºC por 15 segundos, anelamento a 65ºC por 30 segundos, com uma diminuição de 1ºC por ciclo e alongamento a 72ºC por 3 minutos a 15 segundos; e mais 22 ciclos cada qual a 98ºC por 15 segundos, 58ºC por 30 segundos e 72ºC por 3 minuto a 15 segundos; e uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. O bloco aquecido foi então deixado em um ciclo de imersão a 4ºC.

[000389] O produto de reação foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão Tris-borato 90 mM e EDTA 1 mM (TBE), onde uma banda do produto de —2,5kb foi excisada do gel, e purificado usando um kit ILLUSTRA& GFX& PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), de acordo com as instruções do fabricante.

[000390] Plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam HI e Bgl II,

isolado por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão TBE, e purificado usando um kit ILLUSTRAR GFXR PCR DNA and Gel Band Purification, de acordo com as instruções do fabricante.

[000391] O produto de PCR e o vetor digerido foram ligados juntos usando um kit IN-FUSION'M CF Dry-down PCR Cloning que resulta em pCat PE04230007241 (Figura 8), em que a transcrição do gene de catalase de Penicillium emersonii estava no controle de um promotor do gene para alfa- amilase de Aspergillus oryzae. A operação de clonagem foi realizada de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam HI e Bgl II, e 60 ng do produto de PCR purificado do gene de catalase de Penicillium emersonii foram adicionados aos frascos de reação e o pó foi ressuspenso em um volume final de 10 uL com adição de água deionizada. A reação foi incubada a 37ºC por 15 minutos e a seguir 50ºC por minutos. Três microlitros da reação foram usados para transformar células competentes de £. coli TOPIO (TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd., Beijing, China). Um transformante de £. coli contendo pCat PE04230007241 foi detectado por PCR de colônia. O PCR de colônia é um método para seleção rápida de inserções de plasmídeo diretamente das colônias de £. coli. Resumidamente, na aliquota de solução de PCR pré-misturada em cada tubo de PCR, incluindo tampão de PCR, MgCl7, dNTPs, e pares de iniciadores dos quais o fragmento de PCR foi gerado, uma única colônia foi adicionada coletando com uma alça estéril e movimentando a alça na solução de reação. Em geral, 7-10 colônias foram selecionadas. Após a PCR, as reações foram analisadas por eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão TBE. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de colônias que exibem inserções com os tamanhos esperados usando um kit QIAprep? Spin Miniprep. O gene de catalase de Penicillium emersonii inserido em pCat PE04230007241 foi confirmado por sequenciamento de DNA usando um analisador de DNA 3730XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, Estados Unidos).

Exemplo 13: Expressão de gene de catalase de Penicillium emersonii em Aspergillus oryzae

[000392] Os protoplastos de Aspergillus oryzae HowB101 (descrito na patente WO9535385 exemplo 1) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 e transformados com 3 ug de pCat PE04230007241.

[000393] A transformação de Aspergillus oryzae HowB1l01 com pCat PE04230007241 rendeu cerca de 50 transformantes. “Quatro transformantes foram isolados em placas de meio mínimo individual.

[000394] Quatro transformantes foram inoculados separadamente em 3 mL de meio YPM em uma placa de 24 poços e incubados a 30ºC, com agitação a 150 rpm. Após 3 dias de incubação, 20 uL do sobrenadante de cada cultura foram analisados por SDS-PAGE usando um NUPAGE& NOVEXO 4-12% Bis-Tris Gel com 50 mM MES (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi corado com INSTANTBLUETY (Expedeon Ltd., Babraham Cambridge, UK). Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que todos os transformantes apresentaram uma banda de aproximadamente 80 kDa. A cepa de expressão foi determinada como O6YTS. Exemplo 14: Fermentação da cepa de expressão Aspergillus oryzae O6YTS

[000395] Um raspado da cepa de expressão, O6YTS, foi lavado com 10 mL de meio YPM e inoculado em 7 frascos de 2 litros, cada qual contendo 400 mL de meio YPM para gerar o caldo. A cultura foi coletada no dia 3 e filtrada usando uma membrana de 0,45 um DURAPOREGR (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Exemplo 15: Purificação de catalase recombinante de Penicillium emersonii a partir de Aspergillus oryzae O6YTS

[000396] Um volume de 2.800 mL de sobrenadante filtrado da cepa

O6YTS recombinante (Exemplo 14) foi precipitado com sulfato de amônio (80% de saturação), redissolvido em 50 mL de tampão Tris-HCl 20mM, pH 8,0, dialisado contra o mesmo tampão, e filtrado por meio de um filtro de 0,45 um. O volume final foi 80 mL. A solução foi aplicada em uma coluna de fluxo rápido de 40 mL Q SEPHAROSEQG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) equilibrada em tampão Tris-HCl 20mM, pH 8,0. As frações eluídas com NaCl 0,18-0,25 M foram analisadas por SDS-PAGE usando um NUPAGER& NOVEXG 4-12% Bis-Tris Gel, 1,5MM15W. As frações contendo uma banda em aproximadamente 80 kDa foram agrupadas e concentradas por ultrafiltração. Exemplo 16: Caracterização dos DNAs genômicos que codificam a catalase

[000397] A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 1) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da sequência codificante de catalase de Malbranchea cinnamomea é mostrada na figura 5. A sequência codificante é 2622 bp incluindo o códon de parada e é interrompida por 6 introns de 81 bp (nucleotídeos 289 a 369), 69 bp (nucleotídeos 404 to 472), 72 bp (nucleotídeos 665 a 736), 68 bp (nucleotídeos 1153 a 1220), 71 bp (nucleotídeos 1386 to 1456) e 71 bp (nucleotídeos 1632 a 1702). O teor de G+C da sequência que codifica o polipeptídeo maduro sem introns e códon de parada é 52,8%. A proteína prevista codificada apresenta 729 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1- 6), um peptídeo sinal de 16 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 713 aminoácidos com um peso molecular previsto de 79259,08 Dalton e ponto isoelétrico previsto de 5,13. O domínio catalítico de catalase foi previsto para apresentar aminoácidos 17 a 723, alinhando a sequência de aminoácidos usando BLAST, onde o alinhamento mais significativo em uma subfamília foi usado para prever o domínio catalítico.

[000398] Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a parte madura de sequência de aminoácidos da sequência codificante de Malbranchea cinnamomea que codifica o polipeptídeo de catalase compartilha 75,36% de identidade com a sequência deduzida de aminoácidos de catalase de Neosartorya fischeri (número de acesso UNIPROT:A1DJU9).

[000399] A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 3) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) da sequência codificante de catalase de Rhizomucor pusillus é mostrada na figura 6. A sequência codificante apresenta 2711 bp, incluindo o códon de parada e é interrompida por 7 introns de 124 bp (nucleotídeos 291 a 414), 64 bp (nucleotídeos 648 a 711), 77 bp (nucleotídeos 745 a 821), 67 bp (nucleotídeos 1021 a 1087), 58 bp (nucleotídeos 1179 a 1236), 70 bp (nucleotídeos 1520 a 1589) e 58 bp (nucleotídeos 1729 a 1786). O teor de G+C da sequência que codifica o polipeptídeo maduro sem introns e códon de parada é 50%. A proteína prevista codificada apresenta 730 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 20 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 710 aminoácidos com um peso molecular previsto de 79485,02 Dalton e ponto isoelétrico previsto de 6,03. O domínio catalítico de catalase foi previsto para apresentar aminoácidos 38 a 723, alinhando a sequência de aminoácidos usando BLAST, onde o alinhamento mais significativo em uma subfamília foi usado para prever o domínio catalítico.

[000400] Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a parte madura de sequência de aminoácidos da sequência codificante de Rhizomucor pusillus que codifica o polipeptídeo de catalase compartilha 53,67% de identidade com a catalase de Bacillus pseudofirmus (número de acesso UNIPROT:P30266).

[000401] A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 5) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) da sequência codificante de catalase de Rhizomucor pusillus é mostrada na figura 7. A sequência codificante apresenta 2673 bp incluindo o códon de parada e é interrompida por 7 introns de 72 bp (nucleotídeos 284 to 355), 100 bp (nucleotídeos 584 to 683), 75 bp (nucleotídeos 717 a 791), 57 bp (nucleotídeos 991 a 1047), 72 bp (nucleotídeos 1133 a 1204) e 72 bp (nucleotídeos 1259 a 1330) e 71 bp (nucleotídeos 1697 a 1767). O teor de G+C da sequência que codifica o polipeptídeo maduro sem introns e códon de parada é 50,3%. A proteína prevista codificada apresenta 717 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 24 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 693 aminoácidos com um peso molecular previsto de 77995,99 Dalton e ponto isoelétrico previsto de 5,66. O domínio catalítico de catalase foi previsto para apresentar aminoácidos 38 a 711, alinhando a sequência de aminoácidos usando BLAST, onde o alinhamento mais significativo em uma subfamília foi usado para prever o domínio catalítico.

[000402] Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a parte madura de sequência de aminoácidos da sequência codificante de Malbranchea cinnamomea que codifica o polipeptídeo de catalase compartilha 55,94% de identidade com a catalase de Bacillus subtilis (número de acesso UNIPROT:P42234).

[000403] A sequência de DNA genômico (SEQ ID NO: 7) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) da sequência codificante de catalase de Penicillium emersonii é mostrada na figura 8. A sequência codificante apresenta 2479 bp, incluindo o códon de parada e é interrompida por 5 introns de 53 bp (nucleotídeos 328 a 380), 50 bp (nucleotídeos 607 a 656), 51 bp (nucleotídeos 1073 a 1123), 52 bp (nucleotídeos 1289 a 1340), e 47 bp (nucleotídeos 1516 to 1562). O teor de G+C da sequência que codifica o polipeptídeo maduro sem introns e códon de parada é 58.6%. A proteína prevista codificada é 741 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 19 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 722 aminoácidos com um peso molecular previsto de 79578.21 Dalton e ponto isoelétrico previsto de

5.12. O domínio catalítico de catalase foi previsto para apresentar aminoácidos 20 a 740, alinhando a sequência de aminoácidos usando BLAST, onde o alinhamento mais significativo em uma subfamília foi usado para prever o domínio catalítico.

[000404] Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a parte madura de sequência de aminoácidos da sequência codificante de Penicillium emersonii que codifica o polipeptídeo de catalase compartilha 82,38% de identidade com uma catalase de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 4 em JP2007143405-A) Exemplo 17: Determinação da atividade de catalase

[000405] A atividade de catalase foi detectada usando peróxido de hidrogênio a 3% como substrato. Peróxido de hidrogênio a 3% foi preparado em diluição de 10 vezes de peróxido de hidrogênio a 30% com H;O bidestilada (ddH7/O). 50 uL de peróxido de hidrogênio a 3% foi adicionado a um poço da placa de microtitulação. A seguir, 20 uL de amostra purificada de amostra catalase foram adicionados ao mesmo poço. À reação foi mantida em temperatura ambiente por 10-30 segundos. A atividade de catalase foi determinada por observação de geração de bolha (oxigênio).

[000406] Se a geração de bolha (oxigênio) foi observada, a amostra de catalase de Malbranchea cinnamomea (Exemplo 6) mostrou atividade de catalase e a amostra de catalase de Penicillium emersonii (Exemplo 15) mostrou atividade de catalase. Exemplo 18: Ensaio da atividade de catalase

[000407] A catalase purificada de Penicillium emersonii (Exemplo 15) foi verificada em relação à atividade de catalase usando o seguinte protocolo.

[000408] O substrato foi preparado por diluição de 1.000 vezes de HO, a 30% (de Xilong Chemical, Guangdong, China) com H,O bidestilada (ddH7O), a concentração final foi 10,3 mM. A reação começou adicionando 1 uL de amostra purificada de catalase de Penicillium emersonii em 1.000 uL de substrato. À densidade ótica (OD) a 240 nm foi lida por Ultrospec 3300 (GE Healtheare, Buckinghamshire, UK) no segundo de O e 16 respectivamente, e a diminuição da OD (de 0,505 a 0,284) mostrou a atividade relacionada da catalase de Penicillium emersonii. Exemplo 19: Efeito de reforço de catalase de Penicillium emersonii na hidrólise de PCS

[000409] O resíduo de milho pré-tratado no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido sulfúrico diluído em condições de 190ºC, tempo de permanência de 1 minuto, 0,05 g de ácido/g de biomassa seca, e em uma concentração de 30% de sólido total em um reator de pré-tratamento. O resíduo de milho pré-tratado (PCS) foi hidrolisado em um sólido total inicial (TS) de 10% e o peso total do sistema de hidrólise de 20 g. A composição de celulase de Trichoderma reesei (CELLICG& CTec2 disponível pela Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) foi adicionada no PCS para hidrólise enzimática. Cinco porcento em peso de composição de celulase de Trichoderma reesei foi substituído por catalase de P. emersonii com base na quantidade de proteína e a dose total de enzima foi de 4 mg/g celulose. O sistema de hidrólise com composição de celulase de Trichoderma reesei, mas sem catalase, foi usado como um controle. Os frascos foram incubados a 50ºC por 72 horas, com agitação a 130 rpm. Após hidrólise ter acabado, o açúcar foi analisado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[000410] Para a medição de HPLC, as amostras coletadas foram filtradas usando filtros de seringa de 0,22 um (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos), e os filtrados foram analisados em relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir. As concentrações de açúcar de amostras diluídas em H;SO, 0,005 M foram medidas usando uma coluna 7,8x300 mm AMINEX?& HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos) por eluição com H2SO, 0,005 M a 65ºC, em uma vazão de 0,7 mL por minuto, e a quantificação por integração do sinal de glicose a partir da detecção do índice de refração (CHEMSTATIONG&, AGILENTE 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos), calibrada por amostras de açúcar puro. A glucose resultante foi usada para calcular o percentual de rendimento de glicose a partir de glucanas para cada reação. As concentrações medidas de açúcar foram ajustadas para o fator de diluição apropriado. As — concentrações líquidas de açúcares produzidos enzimaticamente foram determinadas ajustando as concentrações medidas de açúcar para as concentrações de açúcar de fundo correspondentes na biomassa não lavada no ponto zero. Todo o processamento dos dados de HPLC foi realizado usando o software MICROSOFT EXCEL'YV (Microsoft, Richland,

WA, Estados Unidos).

[000411] O grau de conversão de glicose em glicose foi calculado de acordo com a publication de Zhu, Y., et al. 2010, Bioresource Technology. 102(3): 2897-2903.

[000412] Os resultados mostrados na tabela 6 demonstram que a conversão de PCS em glicose pode ser significativamente melhor adicionando pequenas quantidades de catalase.

Tabela 6. Efeito de catalase de P. emersonii na conversão de glicose de PCS.

[000413] A presente invenção é descrita adicionalmente pelos seguintes parágrafos numerados:

[1] Um polipeptídeo isolado com atividade de catalase, selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeos com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, um polipeptídeo que apresenta pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um polipeptídeos com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um polipeptídeos com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (1) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (11) a sequência de DNAc do mesmo, ou (ii) o complemento de tamanho total de (1) ou (1);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7; ou a sequência de DNAc do mesmo, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQID NO: 5; (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de catalase.

[2] O polipeptídeo do parágrafo 1, com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[3] O polipeptídeo do parágrafo 1 ou 2, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, condições de severidade baixa-média, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência de DNAc do mesmo, ou (iii) o complemento de tamanho total de (1) ou (ii).

[4] O polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-3, que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, ou a sequência de DNAc do mesmo, que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc do mesmo, que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de

SEQ ID NO: 3, ou a sequência de DNAc do mesmo, ou que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, ou a sequência de DNAc do mesmo.

[5] O polipeptiddco de qualquer dos parágrafos 144, compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[6] O polipeptídeo do parágrafo 5, em que o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 20 a 741 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 17 a 729 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 21 a 730 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 25 a 717 de SEQID NO: 6.

[7] O polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-4, que é um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições.

[8] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é um fragmento de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, em que o fragmento tem atividade de catalase.

[9] Um polipeptídeo isolado compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em:

(a) um domínio catalítico com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8; um domínio catalítico com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2; um domínio catalítico com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4; ou um domínio catalítico com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, média, média-alta, alta ou muito alta em (i) nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3, ou nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5, (11) a sequência de DNAc do mesmo, ou (iii) o complemento de tamanho total de (1) ou (ii);

(c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7; um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1; um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3; ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos

83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5; (d) um variante de aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, um variante de aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, um variante de aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou um variante de aminoácidos 38 a 711 de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção de em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), (o), ou (e) que apresenta atividade de catalase.

[10] Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[11] Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[12] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 11 operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controles que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[13] Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 11 operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controles que direcionam a produção do polipeptídeo.

[14] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9, compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem sintetiza o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

[15] Um método de produzir um polipeptídeo com atividade de catalase, compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira do parágrafo 13 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

[16] Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[17] Um método de produzir um polipeptídeo com atividade de catalase, compreendendo: (a) cultivar a planta transgênica ou célula de planta do parágrafo 16 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[18] Um método de produzir um mutante de uma célula parental, compreendendo inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9, que resulta no mutante que produz menos do polipeptídeo que a célula parental.

[19] Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo 18.

[20] A célula mutante do parágrafo 19, compreendendo adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[21] Um método de produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar a célula mutante do parágrafo 19 ou 20 em condições que conduzem para a produção da proteína; e opcionalmente (b) recuperar a proteína.

[22] Uma molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) compreendendo uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 11, em que opcionalmente o RNAds é uma molécula de RNAsi ou uma de RNAmi.

[23] A molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) do parágrafo 22, que apresenta cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[24] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de catalase em uma célula, compreendendo administrar à célula ou expressar na célula a molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) do parágrafo 22 ou 23.

[25] Uma célula produced pelo método do parágrafo 24.

[26] A célula do parágrafo 25, compreendendo adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[27] Um método de produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar a célula do parágrafo 25 ou 26 em condições que conduzem para a produção da proteína; e opcionalmente (b) recuperar a proteína.

[28] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 1 a 24 de SEQ ID NO: 6.

[29] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo do parágrafo 28, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[30] Uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 28, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[31] Um método de produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo do parágrafo 28, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal, em condições que conduzem para a produção da proteína; e opcionalmente (b) recuperar a proteína.

[32] Um processo para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de catalase de qualquer dos parágrafos 1-9.

[33] O processo do parágrafo 32, em que o material celulósico é pré-tratado.

[34] O processo do parágrafo 32 ou 33, em que a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionado do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina.

[35] O processo do parágrafo 34, em que a celulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glucosidase.

[36] O processo do parágrafo 35, em que a hemicelulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilino esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase.

[37] O processo de qualquer dos parágrafos 32-36, compreendendo adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

[38] O processo do parágrafo 37, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[39] O processo do parágrafo 38, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[40] Um processo para produzir um produto de fermentação,

compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de catalase de qualquer dos parágrafos 1-9; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) micro-organismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e opcionalmente (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[41] O processo do parágrafo 40, em que o material celulósico é pré-tratado.

[42] O processo do parágrafo 40 ou 41, em que a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionado do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina.

[43] O processo do parágrafo 42, em que a celulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glucosidase.

[44] O processo do parágrafo 42, em que a hemicelulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase.

[45] O processo de qualquer dos parágrafos 40-44, em que as etapas (a) e opcionalmente (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea.

[46] O processo de qualquer dos parágrafos 40-45, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo.

[47] Um processo de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) micro-organismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de catalase de qualquer dos parágrafos 1-9.

[48] O processo do parágrafo 47, em que a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação.

[49] O processo do parágrafo 48, compreendendo adicionalmente recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[50] O processo de qualquer dos parágrafos 47-49, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[51] O processo de qualquer dos parágrafos 47-50, em que a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que apresenta melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina.

[52] O processo do parágrafo 51, em que a celulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glucosidase.

[53] O processo do parágrafo 51, em que a hemicelulase é uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilino esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, um xilosidase, e uma glucuronidase.

[54] O processo de qualquer dos parágrafos 47-53, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo.

[55] Uma formulação de caldo integral ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[56] Um método para remover peróxido de hidrogênio, compreendendo tratar uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado com o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[57] Um método para gerar oxigênio molecular, compreendendo tratar uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado com o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-9.

[58] Um método para remover peróxido de hidrogênio de tecido, compreendendo tratar o tecido com o polipeptídeo com atividade de catalase de qualquer dos parágrafos 1-9.

[000414] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui descrevedos, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Qualquer dos aspectos equivalentes é pretendido para estar no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são pretendidas para estar no escopo as reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente descrição, incluindo as definições, prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado com atividade de catalase, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: (a) polipeptídeos com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, um polipeptídeo que apresenta pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um polipeptídeos com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um polipeptídeos com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,

pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (1) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, a sequência que codifica o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência de DNAc do mesmo, ou (1ii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos

88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotideo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5; ou à sequência de DNAc do mesmo; (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou um variante do polipeptíideo maduro de SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (0), ou (d) que apresenta atividade de catalase.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

3. Polipeptíideo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 20 a 741 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 17 a 729 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 21 a 730 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 25 a 717 de SEQ ID NO: 6.

4. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em:

(a) um domínio catalítico com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8; um domínio catalítico com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2; um domínio catalítico com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4; ou um domínio catalítico com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 38 a 711 de SEQID

NO: 6;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, média, média-alta, alta ou muito alta em (1) nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3, ou nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência de DNAc do mesmo, ou (il) o complemento de tamanho total de (1) ou (ii);

(c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 83%, por exemplo, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 2473 de SEQ ID NO: 7, um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 76%, por exemplo, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 49 a 2601 de SEQ ID NO: 1; um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2687 de SEQ ID NO: 3; ou um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos

60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com nucleotídeos 112 a 2652 de SEQ ID NO: 5; (d) um variante de aminoácidos 20 a 740 de SEQ ID NO: 8, um variante de aminoácidos 17 a 723 de SEQ ID NO: 2, um variante de aminoácidos 38 a 723 de SEQ ID NO: 4, ou um variante de aminoácidos 38 a 711 de SEQID NO: 6, compreendendo uma substituição, eliminação, e/ou inserção de em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (e) que apresenta atividade de catalase.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6 operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controles que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

8. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6 operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controles que direcionam a produção do polipeptídeo.

9. Método para produzir um polipeptíideo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem sintetiza o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

10. Método para produzir um polipeptídeo com atividade de catalase, caracterizado pelo fato de que compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 8 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

11. Método para produzir um polipeptídeo com atividade de catalase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a planta transgênica ou célula de planta compreendendo o polipeptideo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e opcionalmente (b) recuperar o polipeptídeo.

12. Polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos | a 20 de SEQ ID NO: 4, ou aminoácidos 1 a 24 de SEQ ID NO: 6.

13. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo como definido na reivindicação 12, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal, em condições que conduzem para a produção da proteína; e opcionalmente (b) recuperar o proteína.

14. Processo para degradar ou converter um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de catalase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

15. Processo para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de catalase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) micro-organismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e opcionalmente (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

16. Formulação de caldo integral ou composição de cultura de células, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações | a 4.

17. Método para gerar oxigênio molecular, caracterizado pelo fato de que compreende tratar uma mistura na qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado ou gerado com o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

18. Método para remover peróxido de hidrogênio do tecido, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o tecido com o polipeptídeo com atividade de catalase como definido em qualquer uma das reivindicações | a 4.