BR112013019038B1 - Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, e, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão - Google Patents

Abstract

célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula originária, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado. a presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase, domínios catalíticos e domínios de ligação à celulose, e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, domínios catalíticos e domínios de ligação à celulose. a invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos, domínios catalíticos, ou domínios de ligação à celulose.

Description

Declaração dos Direitos para as Invenções Realizadas em Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinadas pelo Governo Federal

[0001] Esta invenção foi realizada em parte com o auxílio do Governo no acordo de cooperação DE-FC36-08GO18080, concedida pelo Departamento de Energia. O Governo apresenta certos direitos nesta invenção.

Referência a uma Listagem de Sequências

[0002] Este pedido contém uma listagem de sequências na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico

[0003] Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é aqui incorporado pela referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

[0004] A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos com atividade de celobioidrolase, domínios catalíticos e domínios de ligação à celulose, e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, domínios catalíticos ou domínios de ligação à celulose. A invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos, domínios catalíticos, e domínios de ligação à celulose.

Descrição da Técnica Relacionada

[0005] A celulose é um polímero do açúcar simples glicose, ligado covalentemente por ligações beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam glicanos ligados a beta. Estas enzimas incluem endoglucanases, celobrioidrolases e beta-glicosidases. As endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-o para o ataque por celobrioidrolases. As celobioidrolases liberam sequencialmente as moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado a 1,4-beta de glicose solúvel em água. As beta- glicosidases hidrolisam celobiose em glicose.

[0006] A conversão de matérias primas lignocelulíticas em etanol apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias primas para a produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a ligonocelulose é convertida em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, os açúcares fermentáveis são facilmente fermentados por levedura em etanol.

[0007] A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase selecionados do grupo que consiste em:

[0009] (a) um polipeptídeo com pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

[00010] (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii);

[00011] (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta;

[00012] (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e

[00013] (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[00014] A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados que compreendem um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em:

[00015] (a) um domínio catalítico com pelo menos 90 % de identidade de sequência com aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2;

[00016] (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii);

[00017] (c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 90 % de identidade de sequência com nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta;

[00018] (d) um variante de aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e

[00019] (e) um fragmento do domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[00020] A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados que compreendem um domínio de ligação à celulose selecionado do grupo que consiste em:

[00021] (a) um domínio de ligação à celulose com pelo menos 90 % de identidade de sequência com aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2;

[00022] (b) um domínio de ligação à celulose codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii);

[00023] (c) um domínio de ligação à celulose codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 90 % de identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta;

[00024] (d) um variante de aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e

[00025] (e) um fragmento do domínio de ligação à celulose de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de ligação à celulose.

[00026] A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir os polipeptídeos.

[00027] A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico que compreende: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção.

[00028] A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um produto de fermentação que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00029] A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção.

[00030] A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2, que é operavelmente ligado a um gene que codifica uma proteína; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir uma proteína.

Breve Descrição das Figuras

[00031] A Figura 1 mostra o efeito de uma celobioidrolase da família GH6 de Talaromyces byssochlamydoides na hidrólise de PCS não lavado moído a 50-65°C, por uma composição enzimática em temperatura elevada (HTM).

[00032] A Figura 2 mostra uma comparação de uma celobioidrolase GH6 de Talaromyces byssochlamydoides (Tb6), celobioidrolase GH6A de Aspergillus fumigatus (Af6A) e celobioidrolase GH6A (Mt6A) de Myceliophthora thermophila na hidrólise de PCS lavado e moído a 50-65°C e pH 4,0-5,0, na presença de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus.

Definições

[00033] Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetil a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naptila e acetato de p-nitrodenila. Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilano esterase é determinada usando p- nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, contendo TWEEN™ 20 0,01 % (monolaurato de polioxietileno sorbitano). Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25°C.

[00034] Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácidos. Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

[00035] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos não redutores de alfa-L-arabinofuranosídeo terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima age nos alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanas contendo ligações (1,3) e/ou (1,5)-, arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase também é conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo com viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 μL por 30 minutos a 40°C, seguido por análise de arabinose por cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos).

[00036] Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de uma alfa-D-glucuronosídeo em D-glucuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40°C.

[00037] Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma beta-D-glicosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais, com a liberação de beta- D-glicose. Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glicosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25°C, pH 4,8, a partir de p- nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

[00038] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37), que catalisa a exo-hidrólise de beta (i^4)-xilo-oligossacarídcos curtos para remover sucessivos resíduos de D-xilose a partir das terminações não redutoras. Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40°C, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

[00039] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa o região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[00040] DNAc: O termo “DNAc” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de RNAm madura e unida, obtida de uma célula de eucarioto ou procarioto. O DNAc não apresenta sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm maduro e unido.

[00041] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91 e D.C. 3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo- oligossacarídeos, ou qualquer glicose ligada a beta-1,4 contendo polímero, que libera celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline celullose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade da celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para determinar a atividade de celobioidrolase.

[00042] Os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de celobioidrolase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00043] Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glicosidase(s), ou combinações destas. As duas abordagens básicas para avaliar a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir o individual atividades celulolíticas (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases) da maneira revisada em Zhang et al., Outlook for celullase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452481. A atividade celulolítica total é avaliada em geral usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N«1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio com papel de filtro usando papel de filtro Whatman N«1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of celullase activities, Pure Appl. Chem. 59: 25768).

[00044] Com propósitos da presente invenção, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) por 3-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C, ou 60°C, comparado a uma hidrólise controle sem a adição de proteína enzimática celulolítica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5 %, acetato de sódio 50 mM pH 5, MnSO4 1 mM, 50°C, 55°C, ou 60°C, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos).

[00045] Domínio de ligação à celulose: O termo “domínio de ligação à celulose” significa a região de uma enzima que pode mediar a ligação da enzima em regiões amorfas de um substrato de celulose. O domínio de ligação à celulose (CBD) é observado tipicamente tanto na extremidade N- terminal quanto na C-terminal de uma enzima.

[00046] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose, e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçado por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e é, assim, um beta-(1-4)-D- glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos, e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora seja em geral polimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano. As hemiceluloses em geral ligam o hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[00047] A celulose é encontrada geralmente, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas sem limitação, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo cultivos destinados à produção de energia), resíduo sólido municipal, resíduo de polpa e papel moído, resíduo de papel e madeira (incluindo resíduo florestal) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor executivo, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulósico é qualquer material da biomassa. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[00048] Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulósico é material herbáceo (incluindo cultivos destinados à produção de energia). Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de polpa e papel moído. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de papel. Em um outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduo florestal).

[00049] Em um outro aspecto, o material celulósico é Arundo. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço. Em um outro aspecto, o material celulósico é bambu. Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus. Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

[00050] Em um outro aspecto, o material celulósico é álamo tremedor. Em um outro aspecto, o material celulósico é eucalipto. Em um outro aspecto, o material celulósico é pinheiro. Em um outro aspecto, o material celulósico é pinho. Em um outro aspecto, o material celulósico é álamo. Em um outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em um outro aspecto, o material celulósico é salgueiro.

[00051] Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[00052] Em um outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Da maneira aqui usada o termo “biomassa aquática” significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser de algas, plantas emergentes, plantas de folha flutuante, ou plantas submersas.

[00053] O material celulósico pode ser usado como é, ou pode ser submetido ao pré-tratamento usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira aqui descrita. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.

[00054] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As extremidades da sequência codificante são em geral determinadas por um quadro aberto de leitura, que começa com um códon inicial tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, DNAc, DNA sintético, ou uma combinação destes.

[00055] Sequências controle: O termo “sequências controle” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência controle pode ser natural (isto é, do mesmo gene) ou estrangeira (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou natural ou estrangeira uma a outra. Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência principal, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e finalizador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligadores, com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[00056] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicano mistas tais como beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereal, e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato, ou o aumento nas extremidades redutoras determinadas por um ensaio de açúcar redutor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato, de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40°C.

[00057] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[00058] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligado às sequências controle que fornecem sua expressão.

[00059] Família glicosídeo hidrolase 61: O termo “Família glicosídeo hidrolase 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 61 de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hidrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hidrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas nesta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolase, com base na medição da atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glicanoase em um elemento da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas são não canônicas e não podem ser consideradas como glicosidases autênticas. Entretanto, são mantidas na classificação CAZy, com base em sua capacidade de melhorar a ruptura de lignocelulose quando usadas junto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[00060] Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma hidrólise do açúcar 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise dos grupos 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir do açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos de biomassa natural, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, ou FAE-II. Com propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p- nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase equivale à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25°C.

[00061] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico ou de ligação à celulose, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes na terminação amino e/ou carboxil de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento apresenta atividade de celobioidrolase ou de ligação à celulose. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 375 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 395 resíduos de aminoácido ou pelo menos 415 resíduos de aminoácido.

[00062] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicelullases. Current Opinion in Microbiology, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chaves na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas sem limitação, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, um ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando-os em uma rede forte. As hemiceluloses também são covalentemente anexadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura muito complexa. A estrutura variável e a organização de hemiceluloses exigem a ação combinada de muitas enzimas para sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são tanto as glicosídeo hidrolases (GHs), que hidrolisam ligações glicosídicas, quanto carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações éster de acetato ou grupos laterais de ácido ferúlico. Estes modos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser determinados nas famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobramento completo similar, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e a classificação atualizada destas e outras enzimas ativas no carboidrato são disponíveis na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades da enzima hemicelulolítica podem ser avaliadas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C, ou 60°C, e em pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5.

[00063] Condições de severidade alta: O termo “condições de severidade alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 65°C.

[00064] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

[00065] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais, ou todos, os constituintes de ocorrência natural com os quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada por manipulação humana relacionada àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância relacionada a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, cópias múltiplas de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). O polipeptídeo GH61 da presente invenção pode ser usado em aplicações industriais, na forma de um produto do caldo de fermentação, isto é, o polipeptídeo da presente invenção é um componente de um caldo de fermentação usado como um produto em aplicações industriais (por exemplo, produção de etanol). O produto do caldo de fermentação, além do polipeptídeo da presente invenção, compreenderá ingredientes adicionais usados no processo de fermentação tais como, por exemplo, células (incluindo, a células hospedeiras contendo o gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção, que são usados para produzir o polipeptídeo de interesse), restos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. O caldo de fermentação pode ser opcionalmente submetido a uma ou mais etapas de purificação (incluindo filtração), para remover ou reduzir mais componentes de um processo de fermentação. Dessa maneira, uma substância isolada pode estar presente em um produto do caldo de fermentação como este.

[00066] Condições de severidade baixa: O termo “condições de severidade baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada, por 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 50°C.

[00067] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e qualquer das modificações pós-translacionais, tal como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 20 a 456 de SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), que prevê que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressa pelo mesmo polinucleotídeo.

[00068] Sequência que codifica o polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica o polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 58 a 1786 de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc desta, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal.

[00069] Condições de severidade média: O termo “condições de severidade média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 55°C.

[00070] Condições de severidade média-alta: O termo “condições de severidade média-alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 60°C.

[00071] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada a partir de um gene de ocorrência natural, ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não poderia existir na natureza, ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências controle.

[00072] Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição apropriada com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

[00073] Polipeptídeo com melhor atividade celulolítica: O termo “polipeptídeo com melhor atividade celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima com atividade celulolítica. Com propósitos da presente invenção, a melhor atividade celulolítica é determinada medindo o aumento em açúcares redutores, ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50-99,5 % de p/p de proteína enzimática celulolítica e 0,550 % de p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica por 1-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C, ou 60°C e pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5, comparado a uma hidrólise controle com carga de proteína total sem melhor atividade celulolítica igual (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1,5 L (Novozymes A/S, Bagsv;ml. Dinamarca), na presença de 2-3 % de peso total de proteína beta- glicosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014), ou 2-3 % de peso total de proteína beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae da maneira descrita em WO 2002/095014), da carga proteica de celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[00074] Os polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulósico, catalisado por enzima com atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,10 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes.

[00075] Resíduo de milho pré-tratado: O termo “PCS” ou “Resíduo de milho pré-tratado” significa um material celulósico derivado de resíduo de milho e tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino ou pré-tratamento neutro.

[00076] Identidade de sequência: a relação entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[00077] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usada como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir:

[00078] (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho de alinhamento - Número total de intervalos no alinhamento)

[00079] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usada como a identidade percentual, e é calculado da maneira a seguir:

[00080] (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Tamanho de alinhamento - Número total de intervalos no alinhamento)

[00081] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausente na extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento com atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 1.125 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1.185 nucleotídeos ou pelo menos 1.245 nucleotídeos; ou a sequência de DNAc destes.

[00082] Condições de severidade muito alta: O termo “condições de severidade muito alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 70°C.

[00083] Condições de severidade muito baixa: O termo “condições de severidade muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 45°C.

[00084] Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material compreendendo um polissacarídeo de parede celular vegetal contendo uma parte principal de resíduos de xilose ligados a beta-(1-4). Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma parte principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias de carboidrato curto. Eles compreendem ácido D-glucurônico ou seu 4-O-metil éter, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos compostos de D- xilose, L-arabinose, D ou L-galactose, e D-glicose. Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

[00085] Nos métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

[00086] Atividade que degrada o xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada o xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para avaliar a atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa- glicuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glucuronil esterases). O progresso recente nos ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, 2006, Recent progress in the assays of xilanolytics enzymes, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoil esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann et al., 1997, The beta-D- xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

[00087] A atividade que degrada o xilano total pode ser avaliada determinando os açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio de atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glicuronoxilano polimérico maneira, descrito em Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade da xilanase também pode ser determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em TRITON® X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil- polietileno glicol) a 0,01 %, e tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato, em tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6.

[00088] Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada o xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, Estados Unidos) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

[00089] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D- xilano-xiloidrolase (E.C. 3.2.1,8) que catalisa a endo-hidrólise das ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em TRITON® X-100 a 0,01 %, e tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL- arabinoxilano a 0,2 % como substrato em tampão de fosfato de sódio a 200 mM pH 6.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos com atividade de celobioidrolase

[00090] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %, que apresenta atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00091] Um polipeptídeo da presente invenção compreende ou consiste preferivelmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico desta; ou é um fragmento desta com atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 20 a 456 de SEQ ID NO: 2.

[00092] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase que são codificado por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito alta, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00093] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência deste, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento deste, pode ser usado para determinar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos com atividade de celobioidrolase a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização no DNA genômico ou DNAc de uma célula de interesse, seguindo os procedimentos padrões Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente menores que a sequência total, mas podem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em tamanho. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em tamanho. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são incluídas na presente invenção.

[00094] Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc preparada a partir de tais outras cepas pode ser selecionada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas anteriormente e codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase. O DNA genômico ou outro, a partir de tais outras cepas, pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que hibridiza em SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, o material carreador é usado em um Southern blot.

[00095] Com propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda marcada de ácido nucleico que corresponde a (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) a sequência de DNAc desta; (iv) o complemento de tamanho total desta; ou (v) uma subsequência desta; em condições de severidade muito baixa a muito alta. As moléculas ns quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00096] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico apresenta os nucleotídeos 58 a 1786 de SEQ ID NO: 1 ou o DNAc destes. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro deste; ou um fragmento deste. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é o polinucleotídeo contido no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é a região que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474.

[00097] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase, codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência, com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta de pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %.

[00098] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito aos variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que compreendem uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos introduzida no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As mudanças de aminoácido podem ser de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mudando a carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00099] Exemplos de substituições conservativas estão nos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[000100] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades fisico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudam o pH ideal e similares.

[000101] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade de celobioidrolase para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, da maneira determinada por tais técnica como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com o polipeptídeo relacionado.

[000102] As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese região- direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[000103] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893896). As moléculas de DNA mutagenizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[000104] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo é fundida na terminação N ou na terminação C de uma região de um outro polipeptídeo.

[000105] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável, no qual um outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na tecnologia, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira tal que elas estejam em alinhamento, e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e finalizador(s). Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando tecnologia de inteína, em que os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[000106] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas sem limitação, o sítios revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fontes de polipeptídeos com atividade de celobioidrolase

[000107] Um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, da maneira aqui usada junto com uma dada fonte, pode significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[000108] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram-positiva, tal como um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como um polipeptídeo de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[000109] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[000110] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000111] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[000112] O polipeptídeo também pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou um polipeptídeo de fungo filamentoso, tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[000113] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[000114] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride ou Trichophaea saccata.

[000115] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces byssochlamydoides, por exemplo, um polipeptídeo obtido de Talaromyces byssochlamydoides CBS 413.71.

[000116] Será entendido que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção inclui tanto os estágios perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em consideração o nome da espécie pelo qual são conhecidas. Os versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes adequados.

[000117] As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tais como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[000118] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas anteriormente mencionadas. As técnicas para isolar os microrganismos e o DNA diretamente dos habitats naturais são bem conhecidas na tecnologia. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode então ser obtido selecionando de maneira similar uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc de um outro microrganismo, ou amostra mista de DNA. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Domínios catalíticos

[000119] Em uma modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios catalíticos, com uma identidade de sequência com aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %. Em uma outra modalidade, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir dos aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2.

[000120] Em uma modalidade preferida, o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste com atividade de celobioidrolase.

[000121] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito alta, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) em (i) nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc destes, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).

[000122] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1, ou o DNAc desta, de pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %.

[000123] Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste preferivelmente em nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1 ou é a sequência contida no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474.

[000124] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos variantes do domínio catalítico de aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2, que compreendem uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma outra modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2 é 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ou 10.

Domínios de ligação

[000125] Em uma modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios de ligação à celulose, com uma identidade de sequência com aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %. Em uma outra modalidade, os domínios de ligação à celulose compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir dos aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2.

[000126] Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação à celulose compreende ou consiste preferivelmente em aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2, ou um variante alélico desta; ou é um fragmento desta com atividade de ligação à celulose.

[000127] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios de ligação à celulose codificados por polinucleotídeos que hibridizam em condições de severidade muito alta, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) em (i) os nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc de nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).

[000128] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos domínios de ligação à celulose, codificados por polinucleotídeos com uma identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1 ou o DNAc desta de pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %.

[000129] Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação à celulose compreende ou consiste em nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1, ou é a sequência contida no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474.

[000130] Em uma outra modalidade, a presente invenção também diz respeito aos variantes do domínio de ligação à celulose dos aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2, os quais compreendem uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma outra modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2 é 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ou 10.

[000131] Um domínio catalítico operavelmente ligado ao domínio de ligação pode ser de uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase, ou transferase, por exemplo, uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa- glicosidase, beta-glicosidase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou beta- xilosidase. O polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico pode ser obtido a partir de qualquer procarioto, eucarioto ou outra fonte.

Polinucleotídeos

[000132] A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo, um domínio catalítico, ou um domínio de ligação à celulose da presente invenção, da maneira aqui descrita.

[000133] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na tecnologia e incluem o isolamento a partir do DNA genômico ou DNAc, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos a partir do DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou a seleção de anticorpo das bibliotecas de expressão para detectar fragmentos clonados de DNA com características estruturais similares. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação a base de polinucleotídeo (NASBA), podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Talaromyces ou um organismo relacionado e, assim, por exemplo, podem ser uma espécie alélica ou variante da região do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[000134] A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir de alguma maneira geneticamente modificada do polipeptídeo isolado a partir de sua fonte natural, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares. Os variantes podem ser construídos com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc desta, e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a uma sequência diferente de aminoácidos. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construtos de ácido nucleico

[000135] A presente invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada, em condições compatíveis com as sequências controle.

[000136] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão de um polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar os polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia.

[000137] A sequência controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, tanto homólogos quanto heterólogos para a célula hospedeira.

[000138] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção, em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir do gene alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA) e gene beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 7494; e em Sambrook et al., 1989, supra. Os exemplos de promotores em tandem são revelados em WO 99/43835.

[000139] Exemplos de promotores adequados para direcionar transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção, em uma célula hospedeira de fungo filamentoso, são promotores obtidos a partir dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável ao ácido de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus, em que a sequência principal não traduzida foi substituída por uma região principal a partir de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir de um gene de alfa- amilase neutra de Aspergillus niger, em que a região principal não traduzida foi substituída por uma sequência principal não traduzida de um gene de isomerase triose fosfato de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae) e promotores mutantes, truncados e híbridos destes. Outros promotores são descritos na patente U.S. 6.011.147.

[000140] Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[000141] A sequência controle também pode ser um finalizador de transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição. O finalizador é operavelmente ligado na terminação 3’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer finalizador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[000142] Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes para protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossomal (rrnB) de Escherichia coli.

[000143] Os finalizadores preferidos para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

[000144] Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3- phosphate desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros finalizadores usados para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[000145] A sequência controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm, à jusante de um promotor e à montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[000146] Os exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidas de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[000147] A sequência controle também pode ser uma sequência principal, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência principal é operavelmente ligada na terminação 5’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência principal que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[000148] As sequências principais preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[000149] As sequências líderes adequadas para as células hospedeiras de leveduras são obtidas dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[000150] A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada na terminação 3’ do polipeptídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[000151] As sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa- glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[000152] As sequências de poliadenilação usadas para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[000153] A sequência controle também pode ser uma região codificante de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado na terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via secretória da célula. A extremidade 5’ da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter de maneira inerente uma sequência de peptídeo sinal codificante, naturalmente ligada ao quadro de aberto de leitura, com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. Uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante. Alternativamente, uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante, a fim de melhorara a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante, que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira, pode ser usado.

[000154] As sequências de peptídeo sinal eficiente que codificam as células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[000155] As sequências de peptídeo sinal eficientes que codificam células hospedeiras de fungo filamento são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[000156] Os peptídeos sinais usados para as células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeo sinal codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[000157] A sequência controle também pode ser uma sequência de pró- peptídeo codificante que codifica um pró-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró- enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo é em geral inativo, e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou auto-catalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de pró-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, laccase (WO 95/33836) de Myceliophthora thermophila, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[000158] Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pró- peptídeos estão presentes, a sequência de pró-peptídeo é posicionada próxima à terminação N do polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal é posicionada próxima à terminação N da sequência de pró-peptídeo.

[000159] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que regulam a expressão do polipeptídeo, com relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sequências regulatórias são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja acionada e desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. As sequências regulatórias em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobioidrolase I de Trichoderma reesei, e promotor de celobioidrolase II de Trichoderma reesei podem ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene di-idrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado à sequência regulatória.

Vetores de expressão

[000160] A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotídeo e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante, que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo, em um vetor para a expressão apropriado. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor, de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada nas sequências controle apropriadas para a expressão.

[000161] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser submetido convenientemente aos procedimentos de DNA recombinante, e podem resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira, na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[000162] O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado. Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

[000163] O vetor contém preferivelmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

[000164] Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou os marcadores que conferem resistência aos antibióticos, tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura incluem, mas sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol- succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes destes. São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae, e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. São preferidos para uso em uma célula de Trichoderma os genes adeA, adeB, amdS, hph e pyrG.

[000165] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável duplo, da maneira descrita em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.

[000166] O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[000167] Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[000168] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[000169] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMβl que permitem a replicação em Bacillus.

[000170] Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 micron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[000171] Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883.

[000172] Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

[000173] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras

[000174] A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor auto replicante extra-cromossomal da maneira descrita anteriormente. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá muito do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[000175] A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[000176] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[000177] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[000178] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000179] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[000180] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de célula competente (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). O introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser realizada por transformação de protoplasto, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 62896294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser realizada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbes 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[000181] A célula hospedeira também pode ser de um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[000182] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, da maneira aqui usada, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como Oomycota e todos os fungos mitospóricos (da maneira definida por Hawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[000183] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, R.R., editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[000184] A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[000185] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

[000186] As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[000187] Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[000188] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81: 1470-1474, e Christensen ET. AL., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 1920.

Métodos de produção

[000189] A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces. Em um outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces byssochlamydoides. Em um outro aspecto, a célula é Talaromyces byssochlamydoides CBS 413.71.

[000190] A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[000191] A célula é cultivada em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, em um meio e condições adequadas que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

[000192] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

[000193] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação.

[000194] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[000195] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas

[000196] A presente invenção também diz respeito a plantas isoladas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, de maneira a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado a partir da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator anti-nutritivo.

[000197] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicotilédone) ou monocotiledônea (um monocotilédone). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho).

[000198] Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana.

[000199] Exemplos de parte da plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomos e citoplasma também são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma maneira, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

[000200] São também incluídas no escopo da presente invenção a progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta.

[000201] A planta transgênica ou célula de planta que expressa o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na tecnologia. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando um ou mais construtos de expressão que codificam o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira, ou genoma do cloroplasto, e que propagam a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

[000202] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico, que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou domínio operavelmente ligado a sequências regulatórias adequadas exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável usado para identificar células de planta, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado).

[000203] A escolha das sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em onde, quando e como deseja-se expressar o polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser para o desenvolvimento, específica de estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte da planta tal como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[000204] Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina 1 do milho, ou o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de um proteína de corpo oleoso de semente Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1.000), o promotor do gene adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade, ou induzido por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

[000205] Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um polipeptídeo ou domínio na planta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, revelam o uso do primeiro intron do gene actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

[000206] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[000207] O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[000208] A transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38), e para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação possam ser usados para estas plantas. Um método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas na íntegra pela referência).

[000209] Após a transformação, os transformantes que incorporaram o construto de expressão são selecionados e regenerados nas plantas completas, de acordo com os métodos bem conhecidos na tecnologia. Frequentemente, o procedimento da transformação é determinado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto nas gerações seguintes usando, por exemplo, co-transformação com dois construtos de DNA-T separados ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica.

[000210] Além da transformação direta de um genótipo de planta particular com um construto da presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o construto e uma segunda planta que não apresenta o construto. Por exemplo, um construto que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de sempre transformar diretamente uma planta daquela variedade fornecida. Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente a partir das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também da progênie de tais plantas. Da maneira aqui usada, progênie pode se referir aos descendentes de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta na introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem inicial com uma linhagem de planta doadora. Exemplos não limitantes de tais etapas são descritos adicionalmente na patente U.S. 7.151.204.

[000211] As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão de retrocruzamento. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, inato, híbrido convertido por retrocruzamento.

[000212] Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um antecedente genético em um outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação à reprodução convencional, na qual ele pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que de outra forma apresenta um antecedente genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma mãe elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que possui não apenas a característica de interesse, mas também apresentam uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta maneira, o número de gerações exigidas pata introgressar uma ou mais características em um antecedente genético particular é minimizado.

[000213] A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo ou domínio da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo, a qual codifica o polipeptídeo ou domínio em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperar o polipeptídeo ou domínio.

Remoção ou Redução da atividade de celobioidrolase

[000214] A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um mutante de uma célula mãe, que compreendem interromper ou deletar um polinucleotídeo, ou uma porção deste, codificar um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula mãe quando cultivada nas mesmas condições.

[000215] A célula mutante pode ser construída reduzindo ou eliminando a expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, interrupções, substituições ou deleções. Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é inativado. O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificante, ou uma parte desta, essencial para a atividade, ou um elemento regulatório exigido para a expressão da região codificante. Um exemplo de uma sequência regulatória ou controle como esta pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo. Outras sequências controle para possível modificação incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, sequência de peptídeo sinal, finalizador de transcrição e ativador transcricional.

[000216] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada submetendo a célula mãe à mutagênese e selecionando células mutantes nas quais a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo a sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Além do mais, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes mutagênicos.

[000217] Exemplos de um agente mutagênico físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

[000218] Quando tais agentes são usados, a mutagênese é realizada tipicamente incubando a célula mãe a ser mutagenizada na presença do agente mutagênico de escolha em condições adequadas, e triando e/ou selecionando células mutantes que exibem expressão reduzida ou nenhuma expressão do gene.

[000219] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada pela inserção, substituição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos no gene, ou um elemento regulatório exigido para a transcrição ou tradução deste. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de maneira a resultar na introdução de um códon de parada, na remoção do códon inicial, ou em uma mudança no quadro aberto de leitura. Tal modificação ou inativação pode ser realizada por mutagênese sítio direcionada ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Embora a princípio a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa o polinucleotídeo a ser modificado, é preferível que a modificação seja realizada in vitro da maneira exemplificada a seguir.

[000220] Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo baseia-se nas técnicas de substituição de gene, deleção de gene ou rompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde ao polinucleotídeo endógeno é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácidos nucleicos defeituosa que é então transformada na célula mãe para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de ácidos nucleicos defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso também codifique um marcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que o polinucleotídeo foi modificado ou destruído. Em um aspecto, o polinucleotídeo é interrompido com um marcador selecionável tais como aqueles aqui descritos.

[000221] A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de fita dupla (RNAds), em que o RNAds compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o RNAds tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[000222] O RNAds é preferivelmente um RNA de interferência pequeno (RNAsi) ou um RNA micro (RNAmi). Em um aspecto preferido, o RNAds é RNA de interferência pequeno para inibir a transcrição. Em um outro aspecto preferido, o RNAds é RNA micro para inibir a tradução.

[000223] A presente invenção também diz respeito a tais moléculas de RNA de fita dupla (RNAds) que compreendem uma porção da sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 para inibir expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por nenhum mecanismo de ação particular, o RNAds pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de fita simples (RNAss) de sequências similares ou idênticas, incluindo RNAms endógenos. Quando uma célula é exposta ao RNAds, o RNAm do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo denominado RNA de interferência (RNAi).

[000224] Os RNAsds da presente invenção podem ser usados no silenciamento de gene. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para degradar seletivamente o RNA usando um RNAids da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAds podem ser usadas para gerar uma mutação de perda-de- função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos de preparar e usar moléculas de RNAds para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, patentes U.S. 6.489.127, 6.506.559, 6.511.824 e 6.515.109.

[000225] A presente invenção diz respeito adicionalmente a uma célula mutante de uma célula mãe que compreende uma interrupção ou deleção de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou uma sequência controle deste, ou um gene silenciado que codifica o polipeptídeo, que resulta na célula mutante processando menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo, comparada à célula mãe.

[000226] As células mutantes deficientes em polipeptídeo são particularmente usadas nas células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos naturais e heterólogos. Portanto, a presente invenção diz respeito adicionalmente a métodos de produzir um polipeptídeo heterólogo ou natural que compreende: (a) cultivar a célula mutante em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo “polipeptídeos heterólogos” significa polipeptídeos que não são naturais da célula hospedeira, por exemplo, um variante de uma proteína natural. A célula hospedeira pode compreender mais de uma cópia de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo heterólogo ou natural.

[000227] Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na técnica.

[000228] Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente livre de celobioidrolase são de particular interesse na produção de polipeptídeos de eucariotos, em particular, proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes em celobioidrolase também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico, tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores e similares. O termo “polipeptídeos de eucarioto” inclui não apenas polipeptídeos naturais, mas também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados por substituições, deleções ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para melhorar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e similares.

[000229] Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um produto de proteína essencialmente livre de atividade de celobioidrolase que é sintetizado por um método da presente invenção.

Composições

[000230] A presente invenção também diz respeito às composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas com um polipeptídeo como este. O termo “enriquecida” indica que a celobioidrolase da composição foi melhorada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[000231] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição mono-componente. Alternativamente, as composições podem compreender atividades enzimáticas múltiplas, tal como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas adicionais selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[000232] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[000233] Em uma modalidade, a composição compreende adicionalmente uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma ou mais (por exemplo, várias) xilanases, mananases, glucanases, celulases, lipases, esterases, proteases, endoglicosidases, endo-beta-1,4- glucanases, beta-glucanases, endo-beta-1,3(4)-glucanases, cutinases, peroxidases, catalases, laccases, amilases, glucoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mananases, xiloglucanases, xilanases, mananases, glucanases, pectina acetil esterases, ramnogalacturonana acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturonases, galactanases, pectin liases, pectina metilesterases e transglutaminases.

[000234] As composições podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica, e podem apresentar qualquer aparência física tal como líquido, pasta ou sólido. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode ser formulada usando métodos conhecidos na técnica de formular enzimas e/ou produtos farmacêuticos, por exemplo, em grânulos ou micro grânulos revestidos ou não revestidos. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, estabilizando o polipeptídeo na composição pela adição de um antioxidante ou agente redutor para limitar a oxidação, ou o polipeptídeo pode ser estabilizado pela adição de polímeros tais como PVP, PVA, PEG ou outros polímeros adequados conhecidos por serem benéficos para a estabilidade de polipeptídeos nas composições sólidas ou líquidas.

[000235] As composições podem ser uma formulação em caldo de fermentação ou uma composição de células da maneira aqui descrita. Consequentemente, a presente invenção também diz respeito às formulações de caldo de fermentação e composições celulares compreendendo um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase, endoglucanases, melhor atividade celulolítica ou de xilanase da presente invenção. Em algumas modalidades, a composição é um caldo completo de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou restos celulares, e meio de cultura.

[000236] O termo “caldo de fermentação”, da maneira aqui usada, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que se submete à mínima ou nenhuma purificação e/ou recuperação. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando as culturas microbianas são crescidas em saturação, incubadas em condições de limitação de carbono, para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção em um meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados, a partir dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de célula usado, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[000237] Em uma modalidade, a formulação do caldo de fermentação e as composições celulares compreendem um primeiro componente de ácido orgânico, compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um sal deste, e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um sal deste. Em uma modalidade específica, o primeiro componente do ácido orgânico é o ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal deste, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente do ácido orgânico é ácido benzóico, ácido cicloexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal deste, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

[000238] Em um aspecto, a composição contém ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém células mortas e/ou restos celulares adicionais. Em uma modalidade, as células mortas e/ou restos celulares são removidos de um caldo completo com células mortas para fornecer uma composição que é livre destes componentes.

[000239] As formulações do caldo de fermentação ou composições celulares podem compreender, adicionalmente, um agente conservante e/ou anti-microbiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas sem limitação, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[000240] O caldo ou composição completa com células mortas podem compreender adicionalmente uma ou mais atividades de enzima, tais como acetilxilano esterase, alfa-arabinofuranosidase, alfa-galactosidase, alfa- glucuronidase, amilase, arabinanase, arabinofuranosidase, beta-galactosidase, beta-glicosidade, celobioidrolase, endoglucanase, endo-beta-1,3(4)-glucanase, ácido ferrúlico esterase, galactanase, glucoamilase, glicoidrolase, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, laccase, lignina peroxidase, peroxidases dependentes de manganês, mananase, manana acetil esterase, manosidase, pectato liase, pectina acetil esterase, pectinase liase, pectina metil esterase, poligalacturonase, protease, ramnogalacturonana liase, ramnogalacturonana acetil esterase, ramnogalacturonase, xilanase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, xiloglucanase e xilosidase.

[000241] Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de célula morta ou composição inclui enzimas celulolíticas incluindo, mas sem limitação, (i) endoglucanases (EG) ou 1,4-D-glucan-4-glucanohidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanases, incluindo 1,4-D-glucan glucanoidrolases (também conhecidas como celodextanases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-D-glucan celobrioidrolases (exo-celobrioidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91), e (iii) beta- glicosidase (BG) ou beta-glicosídeo glucoidrolases (EC 3.2.1.21).

[000242] Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de células mortas inclui enzima celulolíticas incluindo, mas sem limitação, (i) endoglucanases (EG) ou 1,4-D-glucan-4-glicanoidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanases, incluindo 1,4-D-glucan glicanoidrolases (também conhecida como celodextanases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-D-glucan celobioidrolases (exo- celobioidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91), e (iii) beta-glicosidase (BG) ou beta- glicosídeo glicoidrolases (EC 3.2.1.21).

[000243] O caldo ou composição completa de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados do final da fermentação. Tipicamente, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) crescerem por saturação, são incubados em condições de limitação de carbono para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão da(s) enzima(s) celulase e/ou glicosidase). Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado, enzimas extracelulares e células mortas de fungo filamentoso. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo ou composição completa de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[000244] Uma composição ou caldo completo de células, da maneira aqui descrita, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, restos celulares, componentes do meio de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(s). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer uma composição líquida límpida.

[000245] As formulações em caldo completo e composições celulares da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

[000246] Os exemplos fornecidos a seguir são dos usos preferidos das composições da presente invenção. A dosagem da composição, e outras condições nas quais a composição é usada, podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica. Usos

[000247] A presente invenção é também diz respeito aos seguintes métodos para usar os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase, ou composições destes.

[000248] A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar um material celulósico que compreende: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, os métodos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido. Os produtos solúveis de degradação ou conversão do material celulósico podem ser separados a partir do material celulósico insolúvel usando um método conhecido na técnica, tal como, por exemplo, centrifugação, filtração ou estabelecimento da gravidade.

[000249] A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um produto de fermentação que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima, na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[000250] A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico que compreendem: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em um outro aspecto, os métodos compreendem adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[000251] Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis, e para converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos químicos de plataforma (por exemplo, ácidos, alcoóis, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente o pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

[000252] O processamento de material celulósico, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado usando métodos convencionais na técnica. Além do mais, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

[000253] A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas sem limitação, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultânea (SSF); sacarificação e co- fermentação simultânea (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e co-fermentação separadas (SHCF); hidrólise e co-fermentação híbridas (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC), algumas vezes também denominada bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa etapas de processo separadas para hidrolisar de maneira enzimática primeiro o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, monômeros do tipo glicose, celobiose e pentose, e então fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a co-fermentação de múltiplos açúcares (Sheehan e Himmel, 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817827). HHF envolve uma etapa separada de hidrólise e, além disso, uma etapa simultânea de sacarificação e hidrólise que pode ser realizada no mesmo reator. As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em alta temperatura seguida por SSF em uma temperatura menor que a cepa da fermentação possa tolerar. DMC combina todos os três processos (produção, hidrólise e fermentação enzimática) em uma ou mais (por exemplo, várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para a conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd et al., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes, pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.

[000254] Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado com lote alimentado, um reator agitado em lotes, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Corazza et al., 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the celobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov e Sinitsyn, 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu e Lee, 1983, Bioconversion of waste cellulose using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov et al., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrudor para hidrólise e/ou fermentação.

[000255] Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas do material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. de Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[000256] O material celulósico também pode ser submetido a redução de tamanho de partícula, peneiração, pré-enxarcamento, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica.

[000257] Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré- tratamentos adicionais incluem tratamentos com percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico e irradiação gama.

[000258] O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a etapa de pré- tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[000259] Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-250°C, por exemplo, 160-200°C ou 170190°C, onde a faixa de temperatura ideal depende da adição de um catalisador químico. O tempo de permanência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-60 minutos, por exemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos ou 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e da adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o material celulósico seja úmido em geral apenas durante o pré- tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida em apenas uma extensão limitada.

[000260] Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Um pré-tratamento como este pode converter a celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de processos de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) líquido iônico e pré-tratamentos com organosolv.

[000261] Um catalisador, tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 5 % p/p), é em geral adicionado ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré- tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com o ácido diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[000262] Vários métodos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas sem limitação, hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX).

[000263] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio em temperaturas de 85-150°C e tempo de permanência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 19591966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 revelam métodos de pré-tratamento que usa amônia.

[000264] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200°C por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40 % de material seco, por exemplo, 2-30 % de material seco ou 5-20 % de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

[000265] Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de explosão de oxidação úmida e vapor), pode manusear material seco até 30 %. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de permanência. O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[000266] A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas, tal como 90-150°C, e alta pressão tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento com AFEX, a celulose e as hemicelulose permanecem relativamente intactas. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[000267] O pré-tratamento com organosolv delignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60 % etanol) a 160-200°C por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalizador. Em pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[000268] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730.

[000269] Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento com ácido diluído, e mais preferivelmente como um tratamento contínuo com ácido diluído. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. O tratamento com ácido fraco é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, por exemplo, 1-4 ou 1-2,5. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 10 % em peso de ácido, por exemplo, 0,05 a 5 % em peso de ácido ou 0,1 a 2 % em peso de ácido. O ácido é colocado em contato com o material celulósico e mantido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 140-200°C, por exemplo, 165-190°C, por períodos que variam de 1 a 60 minutos.

[000270] Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, por exemplo, 20-70 % em peso ou 30-60 % em peso, tal como em torno de 40 % em peso. O material celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

[000271] Pré-tratamento mecânico ou pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” refere-se a qualquer pré-tratamento que promove redução do tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bola vibratória).

[000272] O material celulósico pode ser pré-tratado tanto fisicamente (mecanicamente) quanto quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com explosão vaporosa/de vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido fraco ou diluído, alta temperatura, tratamento com alta pressão, irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas), ou combinações destes. Em um aspecto, a pressão elevada significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 100 a cerca de 400 psi, por exemplo, cerca de 150 a cerca de 250 psi. Em um outro aspecto, temperatura elevada significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300°C, por exemplo, cerca de 140 a cerca de 200°C. Em um aspecto preferido, o pré- tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo em lotes usando um sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos químicos ou físicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, se desejado.

[000273] Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido ao pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[000274] Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material celulósico. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos e/ou enzimas que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical e biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alamanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from material lignocelullosics: State do art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[000275] Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, por exemplo, pré-tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção. As enzimas das composições podem ser adicionadas simultaneamente ou sequencialmente.

[000276] A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em um ambiente aquoso adequado, em condições que podem ser facilmente determinada pelos versados na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo contínuo ou de lote alimentado, onde o material celulósico é alimentado gradualmente, por exemplo, a uma enzima contendo solução de hidrólise.

[000277] A sacarificação é realizada em geral em reatores ou fermentadores de tanque agitado em condições controladas de pH, temperatura e mistura. As condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, por exemplo, cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, ou cerca de 50°C a cerca de 55°C. O pH é na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O teor de sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 40 % em peso ou cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

[000278] As composições de enzima podem compreender qualquer proteína usada na degradação do material celulósico.

[000279] Em um aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta- glicosidase. Em um outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

[000280] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas e uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma celobioidrolase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica.

[000281] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilmanana esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilxilano esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ácido coumárico esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma feruloil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronidase (por exemplo, alfa-D-glicuronidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronoil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma mananase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma manosidase (por exemplo, beta- manosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilanase. Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família 10. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilosidase (por exemplo, beta-xilosidase).

[000282] Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma expansina. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma laccase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferido, a enzima lignolítica é um manganês peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma pectinase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma peroxidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma protease. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

[000283] Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a sacarificação, sacarificação e fermentação, ou fermentação.

[000284] Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (por exemplo, vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que são usadas como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (por exemplo, vários) outros componentes da composição enzimática. Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição enzimática. A composição enzimática pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

[000285] As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semi- purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição enzimática pode ser um pó ou granulado seco, um granulado que não está em pó, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionado estabilizadores tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico, de acordo com os processos estabelecidos.

[000286] As quantidades ideais das enzimas e polipeptídeos com atividade de celobioidrolase dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, da mistura de enzimas de componente celulolítico e/ou enzimas hemicelulolíticas, do material celulósico, da concentração de material celulósico, do(s) pré-tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultâneas).

[000287] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de enzima celulolítica ou hemicelulolítica para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por grama do material celulósico.

[000288] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase para o material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, ou cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por grama do material celulósico.

[000289] Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase para a enzima celulolítica ou hemicelulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por grama de enzima celulolítica ou hemicelulolítica.

[000290] Os polipeptídeos com atividade da enzima celulolítica ou atividade da enzima hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos usados na degradação do material celulósico, por exemplo, polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica (coletivamente daqui por diante “polipeptídeos com atividade enzimática”), podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo de origem bacteriana, fúngica, levedura, planta ou mamífero. O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, empregando métodos aqui descritos, em que a enzima produzida recombinantemente é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira são os variantes obtidos recombinantemente, tal como por mutagênese sítio-direcionada ou embaralhamento.

[000291] Um polipeptídeo com atividade enzimática pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram positiva, tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia, ou Oceanobacillus, ou um polipeptídeo de bactéria Gram negativa tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter Neisseria ou Ureaplasma.

[000292] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[000293] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberi, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000294] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

[000295] O polipeptídeo com atividade enzimática também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[000296] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[000297] Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride ou Trichophaea saccata.

[000298] Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica também podem ser usados.

[000299] Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As proteínas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

[000300] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação de enzima celulolítica comercial. Os exemplos de preparações de enzima celulolítica comercial adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, por exemplo, cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

[000301] Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III d e Thermobifida fusca (WO 05/093050) e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[000302] Exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanase I de Trichoderma reesei Cel7B (acesso ao GENBANK™ número M15665), endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A (acesso ao GENBANK™ número M19373), endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, acesso ao GENBANK™ número AB003694), endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, acesso ao GENBANK™ número Z33381), endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanases de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanase de Fusarium oxysporum (acesso ao GENBANK™ número L29381), endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (acesso ao GENBANK™ número AB003107), endoglucanases de Melanocarpus albomyces (acesso ao GENBANK™ número MAL515703), endoglucanases de Neurospora crassa (acesso ao GENBANK™ número XM_324477), endoglucanase V de Humicola insolens, endoglucanases Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanases de basidiomiceto CBS 495.95, endoglucanases de basidiomiceto CBS 494.95, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanases de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e endoglucanase de Trichoderma reesei cepa número VTT-D-80133 (acesso ao GENBANK™ número M15665).

[000303] Os exemplos de celobrioidrolases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, celobioidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), celobioidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase II de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase I de Humicola insolens, celobioidrolase II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobioidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei e celobioidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

[000304] Os exemplos de beta-glicosidases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glicosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 49734980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029) e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[000305] A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é uma proteína de fusão variante BG da beta- glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) ou uma proteína de fusão de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[000306] Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidades usadas são reveladas em várias famílias de glicosil hidrolase, usando a classificação de acordo com Henrissat, 1991, A classification of glycosil hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316, e Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[000307] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263 e patente U.S. 5.686.593.

[000308] Nos métodos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica pode ser usado como um componente da composição enzimática.

[000309] Os exemplos de polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica usados nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, polipeptídeos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), polipeptídeos GH61 de Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397) e Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504).

[000310] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente de ativação solúvel, de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês ou cobre.

[000311] Em um outro aspecto, o polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um composto de dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado, tal como resíduo de milho pré-tratado (PCS).

[000312] O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída, da maneira aqui descrita. Os compostos dióxi podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem frações arila substituída que não apresentam hidroxila e derivados de hidroxila. Os exemplos não limitantes dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido caféico; ácido 3,4-di-idroxibenzóico; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2- benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-triidroxibenzoato; 2,3,4- triidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-di- idroxibenzóico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; metil glicolato; ácido di-idroxifumárico; 2-butino-1,4- diol; (ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3- etióxi-1,2-propanodiol; 2,4,4’-triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-di-idróxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; di-idroxiacetono; acroleína acetal; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzóico e metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato, ou um sal ou solvato destes.

[000313] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado, da maneira aqui descrita. Os compostos podem compreender um ou mais (por exemplo, vários) anéis adicionais, e não são limitados a um número específico de anéis, a menos que de outra forma declarada. Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonóide. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonóide opcionalmente substituído. Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou derivados destes. Os exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; caempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina ou um sal ou solvato destes.

[000314] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído compreendendo um heteroátomo, da maneira aqui descrita. Em um aspecto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída, é uma heterocicloalquila de 5 elementos opcionalmente substituída ou uma fração de heteroarila de 5 elementos opcionalmente substituída. Em um outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, di-idrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morpholinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila. Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-di-idroxietil)-3,4-di-idroxifuran-2(5H)-ona; 4-hidróxi-5-metil-3- furanona; 5-hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2-di-idroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidróxi-Y-butirolactona; ribônico Y—lactona; ácido aldoexurônico Y—lactona; ácido glucônico δ-lactona; 4-hidroxicoumarina; di-idrobenzofurano; 5- (hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)-furanona; 5,6-di-idro-2H-piran-2-ona; e 5,6-di-idro-4-hidróxi-6-metil-2H-piran-2-ona; ou um sal ou solvato destes.

[000315] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina ou fração de nitróxido. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilóxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina e ácido maleâmico; ou um sal ou solvato destes.

[000316] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma fração de quinona da maneira aqui descrita. Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-di-idroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um sal ou solvato destes.

[000317] O composto contendo enxofre pode ser qualquer suitable composto compreendendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; 2-ácido mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato destes.

[000318] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente para o material celulósico como uma razão molar em unidades de glucosila de celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5, cerca de 10-6 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 10-1, cerca de 10-4 a cerca de 10-1, cerca de 10-3 a cerca de 10-1, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente é cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, cerca de 5 μM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[000319] O termo “licor” significa a fase da solução, tanto aquosa, orgânica, quanto uma combinação destas, que surge a partir do tratamento de um material com lignocelulose e/ou hemicelulose em uma lama, ou monossacarídeos destes, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., em condições da maneira aqui descrita, e os conteúdos solúveis destes. Um licor para melhoria celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido tratando um material com lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria prima), aplicando calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com interrupção física do material, e a seguir separando a solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de melhoria celulolítica, obtido por meio da combinação de licor e um polipeptídeo GH61, durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[000320] Em um aspecto, uma quantidade eficiente do licor para celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5 g, cerca de 10-6 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

[000321] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação de enzima hemicelulolítica comercial. Os exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC® HTec (Novozymes A/S), CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ACCELLERASE® XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido).

[000322] Os exemplos de xilanases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) e Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083).

[000323] Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidases de Neurospora crassa (número de acesso ao SwissProt Q7SOW4), Trichoderma reesei (número de acesso ao UniProtKB/TrEMBL Q92458), e Talaromyces emersonii (número de acesso ao SwissProt Q8X212).

[000324] Os exemplos de acetilxilano esterases usados nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de acesso GeneSeqP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de acesso Uniprot Q0UHJ1) e Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846).

[000325] Os exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4), Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[000326] Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (WO 2006/114094).

[000327] Os exemplos de alfa-glicuronidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glicuronidases de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcc12), Aspergillus fumigatus (número de acesso SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot Q96WX9), Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211) e Trichoderma reesei (número de acesso Uniprot Q99024).

[000328] Os polipeptídeos com atividade enzimática, usados nos métodos da presente invenção, podem ser produzidos por fermentação das cepas microbianas citadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

[000329] A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína. Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

[000330] Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

[000331] Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

[000332] Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é em geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

[000333] Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF).

[000334] “Microrganismo fermentador” refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose, ou uma combinação destes. Tanto os organismos fermentadores de hexose quanto de pentose são bem conhecidos na técnica. Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[000335] Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[000336] Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar os açúcares hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

[000337] Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar os açúcares pentose em seu estado natural incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. As leveduras fermentadoras de xilose preferidas incluem cepas de Candida, preferivelmente C. sheatae ou C. sonorensis; e cepas de Pichia, preferivelmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. As leveduras fermentadoras de pentose preferidas incluem cepas de Pachysolen, preferivelmente P. tannophilus. Organismos que não são capazes de fermentar açúcares pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para realizar isto por métodos conhecidos na técnica.

[000338] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[000339] Outros organismos fermentadores incluem cepas de Bacillus, tal como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis e C. scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutilicum, C. thermocellum e C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento do etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans e K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis.

[000340] Em um aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida sonorensis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida blankii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida entomophiliia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida scehatae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Kluyveromyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[000341] Em um aspecto preferido, a bactéria é um Bacillus. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Bacillus coagulans. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium acetobutilicum. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Geobacilus sp. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é um Thermoanaerobacter. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[000342] As leveduras comercialmente disponíveis e adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, Estados Unidos), levedura ETANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre, Estados Unidos), FALI™ (Fleischmann’s Yeast, Estados Unidos), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, Estados Unidos).

[000343] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose, e que co-utilizam xilose e arabinose.

[000344] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

[000345] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[000346] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira aqui descrita.

[000347] O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material celulósico degradado ou hidrolisado, e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, por exemplo, cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 60°C, por exemplo, cerca de 32°C ou 50°C, e cerca de pH 3 a cerca de pH 8, por exemplo, pH 4-5, 6, ou 7.

[000348] Em um aspecto, a levedura e/ou um outro microrganismo são aplicados ao material celulósico degradado, e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em um outro aspecto, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20°C a cerca de 60°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 50°C, cerca de 32°C a cerca de 50°C, ou cerca de 32°C a cerca de 50°C, e o pH é em geral cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam temperatura de fermentação ideal mais elevada. A levedura ou um outro microrganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, de maneira preferível em aproximadamente 107 a 1010, de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 108 células viáveis por mL de caldo de fermentação. Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

[000349] Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

[000350] Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n- butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e ciclooctano), um alceno (por exemplo penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico) e policetídeo. O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

[000351] Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será bem entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é n-butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é isobutanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etileno glicol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerina. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400408; Nigam e Singh, 1995, Processs for fermentative production of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[000352] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é pentano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é hexano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é heptano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é octano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é nonano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é decano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é undecano. Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é dodecano.

[000353] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é ciclopentano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloexano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloeptano. Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloctano.

[000354] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é penteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hexeno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hepteno. Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é octeno.

[000355] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard e Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production e other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[000356] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka et al., 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan, 1997 em Biomass and Bioenergy, 13 (1-2): 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for metano production: A review.

[000357] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é isopreno.

[000358] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será bem entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[000359] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen e Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

[000360] Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é policetídeo.

[000361] Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Peptídeo sinal

[000362] A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal compreendendo ou consistindo em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo pode compreender adicionalmente um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente ligado ao peptídeo sinal. A proteína é preferivelmente estrangeira ao peptídeo sinal. Em um aspecto, o polinucleotídeo para o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 1.

[000363] A presente invenção também diz respeito aos construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais polinucleotídeos.

[000364] A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir uma proteína que compreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende tal polinucleotídeo; e (b) recuperar a proteína.

[000365] A proteína pode ser natural ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui que se refere a um tamanho específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos. O termo “proteína” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.

[000366] Preferivelmente, a proteína é um hormônio, enzima, receptor ou porção desta, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase, ou transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glicosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glicosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[000367] O gene pode ser obtido de qualquer procarioto, eucarioto ou outra fonte.

[000368] A presente invenção é descrita adicionalmente pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos Meios

[000369] O meio COVE N era composto de 218 g de sorbitol, 50 mL de solução de sal de COVE, 10 g de dextrose, 2,02 g de KNO3, 25 g de ágar, e água deionizada para 1 litro.

[000370] A solução de sal de COVE era composta de 26 g de MgSO4^7H2O, 26 g de KCl, 76 g de KH2PO4, 50 mL de solução de metais traço de COVE, e água deionizada para 1 litro.

[000371] A solução de metais traço de COVE era composta de 0,04 g de Na2B4O?40H2O, 0,4 g de (’uSO/5112( O 1,2 g de FeSO/7| I2( O, 0,7 g de MnSO4^H2O, 0,8 g de Na2MoO.^2H2O, 10 g de ZnS( K7112(), e água deionizada para 1 litro.

[000372] O meio DAP4C-1 era composto de 11 g de MgSO4^7H2O, 1 g de KH2P)4, 2 g de ácido cítrico monoidratado, 20 g de dextrose, 10 g de maltose, 6 g de K3PO4^3H2O, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 mL de solução de metais traço, 1 mL de plurônico, e água deionizada para 1 litro. O meio foi dividido em frascos, adicionando 250 mg de CaCO3 em cada porção de 150 mL. O meio foi esterilizado em uma autoclave. Após o resfriamento, foi adicionado a seguir a 150 mL de meio: 3,5 mL de (NH4)2HPO4 esterilizado por filtração 50 % p/v, e 5,0 mL de ácido lático 20 % esterilizado por filtração.

[000373] A solução de metais traço do meio DAP4C-1 era composta de 6,8 g de ZnCl2, 2,5 g de CiiSíbol F( O, 0,24 g de \iCk6lFO, 13,9 g de F'cSOrVIFO, 8,45 g de MnSOrlFO, 3 g de ácido cítrico monoidratado, e água deionizada para 1 litro.

[000374] O meio MDU2BP era composto por litro de 45 g de maltose, 1 g de MgSO4^7H2O, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KH2PO4, 7 g de extrato de levedura, 2 g de ureia, 0,5 mL de solução de metais traço AMG, e água deionizada para 1 litro; pI 5,0.

[000375] A solução de metais traço AMG era composta de 14,3 g de ZnSO4^7H2O, 2,5 g de CuSO4^5H2O, 0,5 g de NiClróHO, 13,8 g de FeSO4^7H2O, 8,5 g de MnSO4^7H2O, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

[000376] O meio MY25 era composto por litro de 25 g de maltodextrina, 2 g de MgSO4^7H2O, 10 g de KH2PO4, 2 g de ácido cítrico, 2 g de K2SO4, 2 g de ureia, 10 g de extrato de levedura, 1,5 mL de solução de metais traço AMG, e água deionizada para 1 litro; ajustado para pI 6.

[000377] O meio SY50 era composto de 50 g de sacarose, 2 g de MgSO4^7H2O, 10 g de KH2PO4 anidro, 2 g de K2SO4, 2 g de ácido cítrico, 10 g de extrato de levedura, 2 g de ureia, 0,5 g de CaC^2H2O, e 0,5 g de solução de metais traço AMG 200X, e água deionizada para 1 litro; pI 6,0.

[000378] A solução de metais traço AMG 200X era composta de 3 g de ácido cítrico, 14,3 g de ZnSO4^7H2O, 2,5 g de CuSO4^5H2O, 13,8 g de FeSO4^7H2O, 8,5 g de MnSO4^H2O, e água deionizada para 1 litro.

Exemplo 1: Amplificação por PCR de um gene de celobioidrolase a partir do DNA genômico de Talaromyces byssochlamydoides CBS 413.71

[000379] Um gene que codifica celobioidrolase foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Talaromyces byssochlamydoides CBS 413.71, em um processo de duas etapas. Primeiro, um fragmento central do gene foi amplificado por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores degenerados e determinados para combinar duas regiões conservadas de sequência em genes que codificam enzimas celobioidrolase da família GH6. Após a amplificação do fragmento interno, a sequência do fragmento foi determinada e usada para determinar os oligonucleotídeos iniciadores gene específicos para gene que caminha tanto na direção 5’ quanto na 3’, para obter a sequência codificante completa.

[000380] O fragmento de gene interno foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos iniciadores degenerados 859 e 860, mostrados a seguir em um protocolo de PCR touch-down no qual a temperatura de anelamento inicial de 67°C foi diminuída em 1°C em cada ciclo sucessivo, por um total de 10 ciclos, até que uma temperatura de anelamento de 57°C fosse atingida. A amplificação por PCR foi então completada com mais 29 ciclos utilizando uma temperatura de anelamento de 57°C. Oligonucleotídeo iniciador 859: TKCCYGAYCGYGAYTGYGC (SEQ ID NO: 3) Oligonucleotídeo iniciador 860: TCRCCACCKGGCTTKAYCCA (SEQ ID NO: 4)

[000381] A amplificação foi realizada usando uma mistura principal de PCR REDDYMIX™ (ABgene Ltd, Epsom, Reino Unido). A reação de amplificação era composta de 1 μL de DNA genômico de T. byssochlamydoides CBS 413.71 como molde, 50 pmol cada um dos oligonucleotídeos iniciadores 859 e 860, e 12,5 μL de mistura principal PCR de REDDYMIX™ em um volume final de 25 μL. O DNA genômico de T. byssochlamydoides foi extraído a partir do micélio fresco usando um protocolo de FastDNA® SPIN (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, Estados Unidos). A amplificação foi realizada em um termociclador programado para uma etapa de desnaturação molde inicial a 94°C por 2 minutos; 11 ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento a 67°C por 45 segundos com uma diminuição de 1°C para cada ciclo subsequente, e alongamento a 72°C por 1 minuto; e 29 ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento a 57°C por 45 segundos, e extensão a 72°C por 1 minuto. Um alongamento final foi realizado a 72°C por 7 minutos.

[000382] Os produtos de reação foram determinados em eletroforese em gel de agarose a 1 %, onde uma banda do produto de PCR de aproximadamente 700-800 bp foi observada. A banda foi cortada do gel e o DNA foi purificado usando um DNA para PCR ILLUSTRATM GFXTM e estojo de purificação de banda em gel (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). O fragmento de PCR purificado foi clonado no vetor pCR®2.1- TOPO® (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) usando um estojo TOPO® TA CLONING® (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante, e a seguir foi transformado em células de E. coli quimicamente competentes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante.

[000383] A sequência do produto de PCR foi determinada diretamente com os oligonucleotídeos iniciadores 859 e 860, e sequenciando 4 clones individuais do produto de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores do vetor M13 sentido e M13 reverso mostrados a seguir. M13 sentido: TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 5) M13 reverso: AGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEQ ID NO: 6)

[000384] A sequência foi comparada com as sequências conhecidas usando a ferramenta de pesquisa BLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410) e confirmada como similar ao gene conhecido que codifica as celobioidrolases.

[000385] A sequência parcial do gene de Talaromyces byssochlamydoides que codifica celobioidrolase foi usada para determinar os oligonucleotídeos iniciadores gene específicos 934, 935, 1044 e 1045, mostrados a seguir, para possibilitar a caminhada do gene a partir de ambas as extremidades da sequência. Oligonucleotídeo iniciador 934: AGAGTCTCGTCTCAGTACATG (SEQ ID NO: 7) Oligonucleotídeo iniciador 935: CGAATACGTCACCAGCCAC (SEQ ID NO: 8) Oligonucleotídeo iniciador 1044: AATTGCTGAGCTGTTTCAGC (SEQ ID NO: 9) Oligonucleotídeo iniciador 1045: TGACTGGTGCAACGTGATCG (SEQ ID NO: 10)

[000386] A caminhada ao longo do gene foi realizada usando um estojo de DNA Walking SPEEDUP™ Premix (Seegene, Seoul, Coreia), com base no protocolo do fabricante com algumas modificações. Apenas os dois primeiros conjuntos de reações de PCR descritos no protocolo foram utilizados, os quais incluíram um conjunto inicial de amplificações com um oligonucleotídeo iniciador gene específico e quatro oligonucleotídeos iniciadores de retorno diferentes, e um conjunto de reações aninhadas com um segundo oligonucleotídeo iniciador gene específico. Metade dos volumes de reação recomendado foi usado para o primeiro conjunto de reações.

[000387] Para caminhar na direção 5’, o primeiro conjunto de reações de PCR foi realizado com o oligonucleotídeo iniciador gene específico 934. Após a amplificação, as reações foram diluídas com 150 μL de água, e 5 μL da diluição foram usados como molde no segundo conjunto de reações de PCR aninhada, com o oligonucleotídeo iniciador gene específico 935. As segundas amplificações foram realizadas da maneira descrita pelo protocolo do estojo de DNA Walking SPEEDUP™ Premix, com uma temperatura de anelamento de 58°C. Os produtos de reação foram determinados em eletroforese em gel de agarose a 1 %, onde foi observada uma única banda fraca de aproximadamente 1.000 bp em uma das quatro reações aninhadas. O fragmento de 1.000 bp foi re-amplificado duas vezes, primeiro repetindo a reação de PCR aninhada usando 1 μL da reação, incluindo o produto de 1.000 bp como molde. Os produtos de reação foram determinados em eletroforese em gel de agarose a 1 %, e uma segunda re-amplificação foi realizada a partir desta removendo um pequeno pedaço da banda de 1.000 bp a partir do gel com uma ponta de pipeta, o qual foi usado como molde em uma reação de PCR nas mesmas condições. Os produtos de reação foram determinados em eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão Tris base 40 mM - acetato de sódio 20 mM - EDTA dissódico 1 mM (TAE), e a banda de 1.000 bp foi cortada do gel e o DNA foi purificado usando um DNA para PCR ILLUSTRATM GFXTM e estojo de purificação de banda em gel. A sequência do produto de PCR foi determinada usando o oligonucleotídeo iniciador 935.

[000388] Para caminhar na direção 3’, o primeiro conjunto de reações de PCR foi realizado com o oligonucleotídeo iniciador gene específico 1044. Após a amplificação, as reações foram diluídas com 150 μL de água, e 5 μL da diluição foram usados como molde no segundo conjunto de reações de PCR aninhada com o oligonucleotídeo iniciador gene específico 1045. As segundas amplificações foram realizadas da maneira descrita pelo protocolo do estojo de DNA Walking SPEEDUP™ Premix, com uma temperatura de anelamento de 56°C. Os produtos de reação foram purificados a partir dos componentes de reação de PCR usando um DNA para PCR ILLUSTRATM GFXTM e estojo de purificação de banda em gel, e foram concentrados eluindo em 10 μL de tampão de eluição fornecido com o estojo. Os produtos foram analisados clonando primeiro 4 μL de cada reação de PCR purificada diretamente em pCR®2.1-TOPO®, usando uma reação do estojo TOPO TA CLONING® e transformando as reações do estojo TOPO TA CLONING® em células de E. coli TOP10 quimicamente competentes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante. Os clones obtidos foram selecionados para inserções por meio de digestão com restrição, e aqueles contendo inserções foram sequenciados com os oligonucleotídeos iniciadores do vetor M13 sentido (SEQ ID NO: 5) e M13 reverso (SEQ ID NO: 6). Quatro clones individuais, cada um de aproximadamente 800 bp, forneceram a sequência 3’ para o gene que codifica celobioidrolase de T. byssochlamydoides. Todas as sequências foram montadas em um contíguo único.

[000389] A sequência de DNA genômico e a sequência de aminoácidos deduzida da sequência que codifica celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. A sequência de DNA genômico de 1789 bp (incluindo o códon de parada) contém 7 introns localizados nos nucleotídeos 80 a 131, 201 a 253, 540 a 592, 847 a 897, 1036 a 1095, 1354 a 1443, e 1686 a 1744 de SEQ ID NO: 1. O fragmento do DNA genômico codifica um polipeptídeo de 456 aminoácidos. O teor % de G+C da sequência que codifica o polipeptídeo maduro é 56 %. Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 19 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 437 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 46 kDa e um ponto isoelétrico de 4,0. A proteína contém um módulo de ligação de celulose do tipo CBM1 na terminação N (aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2). O domínio catalítico apresenta os aminoácidos 98 a 456.

[000390] Um alinhamento comparativo das sequências maduras de aminoácidos de celobioidrolase, sem os peptídeos sinais, foi determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle de EMBOSS, com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência deduzida de aminoácidos da celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides (polipeptídeo maduro) compartilha 84 % de identidade (excluindo os intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma celobioidrolase de Talaromyces emersonii (UNIPROT:Q8NIB5).

Exemplo 2: Clonagem do gene de Talaromyces byssochlamydoides que codifica celobioidrolase em um vetor de expressão Aspergillus

[000391] O gene que codifica celobioidrolase de T. byssochlamydoides foi clonado no vetor de expressão Aspergillus pMStr57 (WO 2004/032648), por meio de amplificação por PCR da sequência que codifica proteína a partir do DNA genômico com dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir. O vetor pMStr57 contém as sequências para seleção e propagação em E. coli, e seleção e expressão em Aspergillus. A seleção em Aspergillus é facilitada pelo gene amdS de Aspergillus nidulans que permite o uso de acetamida como uma única fonte de nitrogênio. A expressão em Aspergillus é mediada por um promotor de amilase II neutra modificada (NA2) de Aspergillus niger, que é fundido à sequência principal 5’ do gene que codifica triose fosfato isomerase (tpi) de Aspergillus nidulans, e ao finalizador do gene que codifica amiloglicosidase de Aspergillus niger. Oligonucleotídeo iniciador 1167: ACACAACTGGGGATCCTCACCATGCGAAATATTCTTG (SEQ ID NO: 11) Oligonucleotídeo iniciador 1168: CCCTCTAGATCTCGAGCTAGAATGACGGATTGGCGTT (SEQ ID NO: 12)

[000392] A amplificação foi realizada usando a mistura principal 2X de alta fidelidade de IPROOF™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos), seguindo as instruções do fabricante. A reação de amplificação era composta de DNA genômico de T. byssochlamydoides CBS 413.71 como um molde, 25 pmol de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores 1167 e 1168, e 25 μL de mistura principal 2X de alta fidelidade de IPROOF ™ em um volume final de 50 μL. A amplificação foi realizada em um termociclador programado para uma etapa de desnaturação molde inicial a 98°C por 2 minutos; 5 ciclos cada com desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 65°C for 10 segundos, e alongamento a 72°C por 1 minuto; e 30 ciclos cada com desnaturação a 98°C por 10 segundos, e anelamento e extensão combinados a 72°C for 1 minuto. Um alongamento final foi realizado a 72°C por 10 minutos.

[000393] Um produto de PCR de aproximadamente 2.000 bp foi separado dos componentes de reação residual usando um DNA para PCR de GFX® e estojo de purificação de banda em gel, de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado foi sequenciado, e a sequência foi completamente semelhante com a sequência de SEQ. ID NO. 1.

[000394] O fragmento de PCR foi clonado em pMStr57 digerido com Bam HI e Xho I, usando um estojo de clonagem por PCR IN-FUSION™ DryDown (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA que codifica celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides a partir do construto de expressão de Aspergillus resultante, pMStr215, foi sequenciado e a sequência estava completamente de acordo com a sequência de SEQ ID NO: 1.

Exemplo 3: Expressão do gene que codifica celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides em Aspergillus oryzae MT3568

[000395] A cepa hospedeira fúngicas de expressão Aspergillus oryzae MT3568 foi transformada com pMStr215, de acordo com Christensen et al., 1988, Biotechnology 6, 1419-1422 e WO 2004/032648. Aspergillus oryzae MT3568 apresenta um gene amdS (acetamidase) interrompido derivado de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694), em que a auxotrofia de pyrG foi restabelecida no processo de neutralizar o gene amdS de A. oryzae. Oito transformantes foram cultivados por 4 dias a 30°C em 750 μL de meio DAP2C-1 (WO 2004/032648). As amostras foram monitoradas por SDS- PAGE usando géis a 8 % de E-PAGE 48 com padrões de peso molecular SeeBlue Plus2 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O gel foi corado com INSTANTBLUE™ (Expedeon Protein Solutions, Cambridge, Reino Unido). Seis transformantes produziram uma banda de proteína inédita de aproximadamente 55 kDa.

[000396] Dois destes transformantes, determinados Aspergillus oryzae MStr390 e MStr391, foram isolados duas vezes inoculando por diluição os conídios em meio seletivo (amdS) contendo TRITON® X-100 0,01 % para limitar o tamanho da colônia.

Exemplo 4: Cultivos em frasco de agitação de Aspergillus oryzae MStr391 recombinante para a produção da celobioidrolase de Talaromyces byssochlamydoides

[000397] Os esporos de dois Aspergillus oryzae MStr391 confluentes crescidos em tubos inclinados com COVE N, determinados EXP03666, foram coletados com uma solução de 0,01 % de TWEEN® 20 e usados para inocular 10 frascos de agitação contendo cada qual 150 mL de meio DAP4C- 1. Os frascos foram incubados a 30°C por 4 dias, com agitação constante a 200 rpm. Os micélios e esporos de fungos foram removidos durante a coleta filtrando primeiro o caldo de fermentação por meio de um sanduíche de 3 filtros de microfibra de vidro, com tamanhos crescentes de retenção de partícula de 1,6 μm, 1,2 μm e 0,7 μm, e a seguir filtrando por meio de um filtro de água subterrânea de 0,45 μm.

[000398] O caldo filtrado foi adicionado ao sulfato de amônio 1,8 M e ajustado para pH 5,6. Após a filtração em um filtro PES de 0,22 μm (Nalge Nunc International, Rochester, NY, Estados Unidos) o filtrado foi colocado em uma coluna de fluxo rápido Fenil Sepharose™ 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada com sulfato de amônio 1,8 M pH 5,6, e as proteínas ligadas foram eluídas com HEPES 25 mM pH 7,0. As frações foram agrupadas e aplicadas em uma coluna SEPHADEX™ G-25 (médio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada em HEPES 50 mM pH 7,0. As frações foram aplicadas a uma coluna SOURCE™ 15Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada em HEPES 50 mM pH 7,0, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de cloreto de sódio 0-1.000 mM. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos), no qual a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 5: Ensaio de hidrólise do resíduo de milho pré-tratado

[000399] O resíduo de milho foi pré-tratado no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando 1,4 % em peso de ácido sulfúrico a 165°C e 107 psi por 8 minutos. Os sólidos insolúveis em água no resíduo de milho pré-tratado (PCS) continham 56,5 % de celulose, 4,6 % de hemicelulose e 28,4 % de lignina. A celulose e hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de ácido sulfúrico em duas etapas, com análise subsequente de açúcares por cromatografia líquida de alto desempenho, usando o procedimento analítico padrão NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente após hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfúrico usando o procedimento analítico padrão NREL #003.

[000400] O PCS não lavado e não moído (a lama complete de PCS) foi preparado ajustando o pH do PCS para 5,0 pela adição de NaOH 10 M com mistura extensiva, e a seguir autoclavando por 20 minutos a 120°C. O peso seco da lama completa de PCS foi 29 %. O PCS não lavado moído (peso seco 32,35 %) foi preparado moendo a lama completa de PCS em um moedor de multi-utilidades úmido Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, Índia). O PCS lavado e moído (peso seco 32,35 %) foi preparado da mesma maneira, com subsequente lavagem com água deionizada e decantando a fração de sobrenadante repetidamente.

[000401] A hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de poços fundos de 2,2 mL (Axygen, Union City, CA, Estados Unidos), em um volume de reação total de 1,0 mL. A hidrólise foi realizada com 50 mg de sólidos insolúveis de PCS por mL de tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM e vários carregamentos proteicos de várias composições de enzima (expresso como mg de proteína por grama de celulose). As composições de enzima foram preparadas e a seguir foram adicionadas simultaneamente a todos os poços, em um volume que varia de 50 μL a 200 μL, para um volume final de 1 mL em cada reação. A placa foi então selada usando um selador quente de placas ALPS-300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido), totalmente misturada e incubada em uma temperatura específica por 72 horas. Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicata.

[000402] Após a hidrólise, as amostras foram filtradas usando uma placa de 96 poços com filtro de 0,45 μm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos), e os filtrados foram analisados com relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir. Quando não usadas imediatamente, as alíquotas filtradas foram congeladas a -20°C. As concentrações de açúcar das amostras diluídas em H2SO4 0,005 M foram medidas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos) por eluição com 0,05 % p/p de ácido benzóico-H2SO4 0,005 M a 65°C, em uma vazão de 0,6 mL por minuto, e a quantificação por integração dos sinais de glicose, celobiose e xilose a partir da detecção do índice refrativo (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos) foi calibrada por amostras puras de açúcar. Os equivalentes de glicose e celobiose resultantes foram usados para calcular o percentual da conversão de celulose para cada reação.

[000403] A glicose, celobiose e xilose foram medidas individualmente. As concentrações medidas de açúcar foram ajustadas com o fator de diluição apropriado. As concentrações líquidas dos açúcares, produzidos enzimaticamente a partir de PCS não lavado, foram determinadas ajustando as concentrações medidas de açúcar às concentrações de açúcar anteriores correspondentes em PCS não lavado no ponto de tempo zero. Todos os processamentos de dados de HPLC foram realizados usando o software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, Estados Unidos).

[000404] O grau de conversão de celulose para glicose foi calculado usando a seguinte equação: % de conversão = (concentração de glicose / concentração de glicose em uma digestão limite) x 100. Para calcular a conversão total, os valores de glicose e celobiose foram combinados. A concentração de celobiose foi multiplicada por 1,053, a fim de converter em equivalentes de glicose e adicionar à concentração de glicose. O grau de conversão total de celulose foi calculado usando a seguinte equação: % de conversão = ([concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose)] / [(concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose) em uma digestão limite]) x 100. O fator 1,053 para celobiose leva em conta o aumento em massa quando a celobiose é convertida em glicose. A fim de calcular o % de conversão, um ponto de conversão de 100 % foi ajustado com base em um controle de celulase (50-100 mg de celulase de Trichoderma reesei por grama de celulose), e todos os valores foram divididos por este número e a seguir multiplicado por 100. Os pontos de dados em triplicata tiveram a média calculada e o desvio padrão foi calculado.

Exemplo 6: Preparação de celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus NN055679 Cel7A

[000405] Uma pesquisa tfasty (Pearson et al., 1997, Genomics 46:24-36) da sequência parcial do genoma de Aspergillus fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) foi realizada usando como entrada uma sequência de proteína celobioidrolase Cel7 de Trichoderma reesei (número de acesso P00725). Vários genes foram identificados como possíveis homólogos da família GH7, com base em um grau elevado de similaridade com a sequência de entrada no nível do aminoácido. Uma região genômica com identidade significativa para a sequência de entrada foi escolhida para estudo adicional, e o gene correspondente foi denominado cel7A.

[000406] Os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR um gene de celobioidrolase I cel7A de Aspergillus fumigatus NN055679 (SEQ ID NO: 13 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 14 [sequência deduzida de aminoácidos]), a partir do DNA genômico de Aspergillus fumigatus preparado da maneira descrita em WO 2005/047499. Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5'-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 15) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5'-gggttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’ (SEQ ID NO: 16)

[000407] As letras maiúsculas representam a sequência codificante. O restante da sequência fornece sítios de endonuclease de restrição para Sph I e Pac I nas sequências sentido e reverso, respectivamente. Usando estes oligonucleotídeos iniciadores, o gene de Aspergillus fumigatus cel7A foi amplificado usando os métodos padrões de PCR e o produto de reação foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 %, usando tampão TAE e foi purificado usando um estojo de extração em gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante.

[000408] O fragmento foi digerido com Sph I e Pac I e ligado no vetor de expressão pAlLo2, também digerido com Sph I e Pac I, de acordo com procedimentos padrões. Os produtos de ligação foram transformados em células de E. coli XL10 SOLOPACK® (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante. Uma E. coli transformante contendo um plasmídeo do tamanho correto foi detectada por digestão com restrição, e DNA do plasmídeo foi preparado usando um BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). O sequenciamento do DNA do gene inserido a partir deste plasmídeo foi realizado com um sequenciador de DNA automatizado Applied Biosystems Model 377 XL (Perkin- Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, Estados Unidos) usando química de corante finalizador (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60) e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador que caminha. Os dados de sequência de nucleotídeos foram analisados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, Estados Unidos). A sequência de nucleotídeos mostrou se combinar com a sequência genômica determinada por TIGR (SEQ ID NO: 13 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 14 [sequência deduzida de aminoácidos]). O plasmídeo resultante foi denominado pEJG93.

[000409] Os protoplasto de Aspergillus oryzae JaL250 (WO 99/61651) preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, supra e transformados com 5 μg de pEJG93 (bem como pAlLo2 como um vetor controle) foram usados para transformar Aspergillus oryzae JaL250. A transformação rendeu cerca de 100 transformantes. Dez transformantes foram isolados em placas individuais de PDA.

[000410] As placas de PFA confluentes de cinco dos dez transformantes foram lavadas com 5 mL de 0,01 % de TWEEN® 20, e inoculadas separadamente em 25 mL de meio MDU2BP em frascos de agitação de vidro de 125 mL e incubadas a 34°C, 250 rpm. Cinco dias após a incubação, 0,5 μL do sobrenadante de cada cultura foi analisado usando géis SDS-PAGE de Tris-Glicina a 8-16 % (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. Os perfis SDS-PAGE das culturas mostraram que um dos transformantes apresentou uma banda principal de aproximadamente 70 kDa. Este transformante foi denominado Aspergillus oryzae JaL250EJG93.

[000411] Quinhentos mL de meio no frasco de agitação foram adicionados a um frasco de agitação de 2.800 mL. O meio no frasco de agitação era composto de 45 g de maltose, 2 g de K2HPO4, 12 g de KH2PO4, 1 g de NaCl, 1 g de MgSOrVIFO, 7 g de extrato de levedura, 2 g de ureia, 0,5 mL de solução de elementos traço, e água deionizada para 1 litro. A solução de elementos traço era composta de 13,8 g de FcSOrVI I2O, 14,3 g de ZnSO^IFO, 8,5 g de MnSO^O, 2,5 g de (’iiSO-51 FO, 0,5 g de NiCk-óHO, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro. Dois frascos de agitação foram inoculados com uma suspensão de uma placa de PDA de Aspergillus oryzae JaL250EJG93 com 0,01 % de TWEEN® 80, e foram incubados a 34°C em um agitador orbital a 200 rpm por 120 horas. O caldo foi filtrado usando um filtro de vidro Whatman GF/F de 0,7 μm (Whatman, Piscataway, NJ, Estados Unidos), seguido por uma membrana de 0,22 μm EXPRESS™ Plus (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos).

[000412] O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado por Tris-HCl 20 mM pH 8,5 usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, Estados Unidos), equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, Estados Unidos). A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, no qual a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 7: Preparação de endoglucanase II de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 Cel5A

[000413] O DNAc de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670, que codifica uma endoglucanase II Cel5A (SEQ ID NO: 17 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 18 [sequência deduzida de aminoácidos]), foi clonado de acordo com o procedimento a seguir. A cepa de T. aurantiacus foi crescida em 80 mL de meio CBH1 (2,5 % de AVICEL®, 0,5 % de glicose, 0,14 % de (NH4)2SO4) em frascos do tipo Erlenmeyer com ranhuras no fundo de 500 mL, a 45°C por 3 dias, com agitação a 165 rpm. Os micélios foram coletados por centrifugação a 7.000 rpm por 30 minutos e armazenados a -80°C antes do uso para extração de RNA. O RNA foi isolado a partir de 100 mg de micélios usando um estojo RNEASY® Plant (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos).

[000414] O DNAc para a endoglucanase de Thermoascus aurantiacus foi isolado por RT PCR usando um sistema 3’ RACE e um sistema 5’ RACE (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), e os oligonucleotídeos iniciadores BG025-1, BG025-2, BG025-3, e BG025-4 mostrados a seguir com os aminoácidos N-terminais. Oligonucleotídeo iniciador BG025-1: 5’- AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’ (SEQ ID NO: 19) Oligonucleotídeo iniciador BG025-2: 5’- AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’ (SEQ ID NO: 20) Oligonucleotídeo iniciador BG025-3: 5’- AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT-3’ (SEQ ID NO: 21) Oligonucleotídeo iniciador BG025-4: 5’- AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT-3’ (SEQ ID NO: 22)

[000415] Os produtos de RT PCR foram ligados no plasmídeo pGEM®- T usando um sistema de vetor pGEM®-T (Promega, Madison, WI, Estados Unidos) e transformados na cepa de E. coli JM109. Um único clone que carrega um plasmídeo denominado pBGC1009, contendo o DNAc de endoglucanases, foi isolado.

[000416] Os oligonucleotídeos iniciadores para PCR foram determinados para amplificar o DNAc que codifica a endoglucanase de T aurantiacus a partir do plasmídeo pBGC1009. Os sítios da enzima de restrição Bsp HI e Pac I foram incorporados para clonagem em alinhamento no plasmídeo de expressão de Aspergillus oryzae, pBM120a (WO 2006/039541). Oligonucleotídeo iniciador 996261: 5'-GATCTCATGAAGCTCGGCTCTCTCGT-3 ’ (SEQ ID NO: 23) BspHI Oligonucleotídeo iniciador 996167: 5'-TTAATTAATCAAAGATACGGAGTCAAAATAGG- 3’(SEQ ID NO: 24) PacI

[000417] O fragmento de interesse foi amplificado por PCR usando um sistema de PCR de alta fidelidade EXPAND™. A mistura de reação de amplificação por PCR continha 1 μL de pBGC1009 0,09 μg/μL, 1 μL de oligonucleotídeo iniciador 996261 (50 pmol/μL), 1 μL de oligonucleotídeo iniciador 996167 (50 pmol/μL), 5 μL de tampão de PCR 10X com MgCl2 15 mM, 1 μL de mistura de dNTP (10 mM cada), 37,25 μL de água, e 0,75 μL (3,5 U/μL) de mistura de DNA polimerase. Um termociclador de EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, Estados Unidos) foi usado para amplificar o fragmento e programado para 1 ciclo a 94°C por 2 minutos; 10 ciclos cada um a 94°C por 15 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1,5 minutos; 15 ciclos cada um a 94°C por 15 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 1,5 minutos, e 5 segundos de alongamento em cada ciclo sucessivo; 1 ciclo a 72°C por 7 minutos; e uma retenção a 4°C.

[000418] O produto de PCR de 1.008 bp foi purificado por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, foi excisado do gel e purificado usando um estojo de purificação em gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). O produto purificado foi ligado diretamente em pCR®2.1-TOPO®, de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante foi denominado pBM124a.

[000419] O plasmídeo pBM124a foi digerido com Bsp HI e Pac I, purificado por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, excisado do gel, e purificado usando um estojo de purificação em gel QIAQUICK®. O fragmento do plasmídeo foi ligado ao vetor pBM120a, que foi digerido com Nco I e Pac I. O plasmídeo de expressão resultante foi determinado pBM123a. O plasmídeo pBM123a contém um promotor NA2- TPI em duplicata que direciona a expressão do clone de DNAc de endoglucanase de Thermoascus aurantiacus, o finalizador AMG, e amdS como um marcador selecionável.

[000420] Os protoplasto de Aspergillus oryzae BECh2 (WO 2000/139322) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, supra, e transformados com 6 μg de pBM123a. Os transformantes principais foram selecionados em placas de COVE por 5 dias. Os transformantes tiveram seus esporos purificados duas vezes antes da análise do frasco de agitação.

[000421] Os esporos dos transformantes foram inoculados em 25 mL de meio MY25 em frascos de agitação de 125 mL. As culturas foram incubadas a 34°C, 200 rpm em um agitador de plataforma por cinco dias. No dia 3 e dia 5, os sobrenadantes da cultura foram coletados e clarificados por centrifugação para remover os micélios. Vinte microlitros de sobrenadante dos três transformantes foram analisados usando um gel SDS-PAGE com gradiente a 10-20 % sem corante CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. Os perfis de SDS-PAGE mostraram que todos os transformantes apresentaram uma nova banda principal de aproximadamente 32 kDa. Um transformante foi escolhido e denominado A. oryzae EXP00858.

[000422] Frascos de agitação de 500 mL, de plástico e sem ranhuras no fundo, contendo 100 mL de meio SY50 foram inoculados com 0,1 mL de um estoque de esporo de A. oryzae EXP00858, e incubados a 34°C, 200 rpm por 24 horas para produzir uma cultura de germe. Cinquenta mL da cultura de germe foram inoculados em um tanque de fermentação de 2 litros, contendo 2 litros de meio composto por litro de 0,5 g de ácido plurônico, 30 g de sacarose, 2 g de MgSOr7II2O. 2 g de KH2PO4 anidro, 1 g de ácido cítrico^ 2 g de (NH4)2SO4, 1 g de K2SO4, 20 g de extrato de levedura, e 0,5 g de solução de metais traço AMG 200X, pH 5,0. A fermentação foi alimentada com um fornecimento de maltose. O pH foi controlado usando H3PO4 5 N e 15 % de NH4OH e foi mantido em 5,0, e a seguir aumentou para 5,25. A temperatura foi mantida a 34,0°C +/- 1,0°C. A agitação foi de 1.000 rpm. O fluxo de ar foi 1,0 vvm.

[000423] Um volume de 200 mL do sobrenadante sem célula foi diluído para 1 litro com água deionizada. O pH foi ajustado para 8 e a amostra foi esterilizada por filtração usando um filtro de poliétersulfona de 0,22 μm (PES). A amostra filtrada por esterilização foi carregada em uma coluna de fluxo rápido de 250 mL Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos) pré-equilibrada com Tris pH 8 25 mM. A enzima foi eluída a partir da coluna com um gradiente de NaOH 0 a 1 M no mesmo tampão. As frações contendo a atividade de beta-glicosidase foram agrupadas (400 mL) e a concentração de enzima foi calculada a partir do coeficiente de extinção teórico e da absorbância da amostra a 280 nm.

Exemplo 8: Preparação de polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0583 com melhor atividade celulolítica

[000424] O polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0583 com melhor atividade celulolítica (SEQ ID NO: 25 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 26 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparado de maneira recombinante, de acordo com WO 2005/074656, usando Aspergillus oryzae JaL250 como um hospedeiro. O polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus produzido recombinantemente foi primeiro concentrado por ultrafiltração usando uma membrana de 10 kDa, o tampão foi trocada por Tris-HCl 20 mM pH 8,0, e a seguir foi purificado usando uma coluna de 100 mL Q SEPHAROSE® Big Beads (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos) com 600 mL de um gradiente linear de NaCl 0-600 mM no mesmo tampão. As frações de 10 mL foram coletadas e agrupadas com base em SDS- PAGE.

[000425] As frações agrupadas (90 mL) foram então purificadas adicionalmente usando uma coluna de 20 mL MONO Q® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), com 500 mL de um gradiente linear de NaCl 0-500 mM no mesmo tampão. As frações de 6 mL foram coletadas e agrupadas com base em SDS-PAGE. As frações agrupadas (24 mL) foram concentradas por ultrafiltração usando uma membrana de 10 kDa, e a cromatografia foi realizada usando uma coluna de 320 mL SUPERDEX® 75 SEC (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos) com eluição isocrática de aproximadamente 1,3 litros de NaCl 150 mM - Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. As frações de 20 mL foram coletadas e agrupadas com base em SDS-PAGE. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 9: Preparação de beta-glicosidase Cel3A de Aspergillus fumigatus NN055679

[000426] A beta-glicosidase Cel3A de Aspergillus fumigatus NN055679 (SEQ ID NO: 27 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 28 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada de maneira recombinante, de acordo com WO 2005/047499, usando Trichoderma reesei RutC30 como um hospedeiro.

[000427] O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial, equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa com Tris-HCl 20 mM pH 8,5. A amostra foi carregada em uma coluna de alto desempenho Q SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada em Tris 20 mM, pH 8,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de cloreto de sódio 0-600 mM. As frações foram concentradas e carregadas em uma coluna SUPERDEX® 75 HR 26/60 da GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos, equilibrada com Tris 20 mM - cloreto de sódio 150 mM, pH 8,5. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, em que albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 10: Preparação de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus NN055679

[000428] A xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus NN055679 (xyn3) (SEQ ID NO: 29 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 30 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada recombinantemente, de acordo com WO 2006/078256, usando Aspergillus oryzae BECh2 como um hospedeiro.

[000429] O caldo filtrado foi dessalinizado e o tampão foi trocado por Tris 20 mM - NaCl 150 mM pH 8,5, usando uma coluna de dessalinização HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, com albumina sérica bovina como um padrão proteico.

Exemplo 11: Efeito da celobioidrolase da família GH6 de Talaromyces byssochlamydoides na hidrólise de PCS não lavado moído a 50-65°C, por uma composição enzimática em temperatura elevada

[000430] A celobioidrolase da família GH6 de Talaromyces byssochlamydoides foi avaliada em uma composição enzimática em temperatura elevada a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C, usando PCS não lavado moído como um substrato. A composição enzimática em temperatura elevada incluiu 40 % de celobioidrolase I Cel7A de Aspergillus fumigatus, 25 % de celobioidrolase da família GH6 de polipeptídeo de Talaromyces byssochlamydoides, 10 % de endoglucanase II Cel5A de Thermoascus aurantiacus, 15 % de polipeptídeo GH61A com melhor atividade celulolítica de Thermoascus aurantiacus, 5 % de beta-glicosidase Cel3A de Aspergillus fumigatus, e 5 % de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus (xyn3). A composição enzimática em temperatura elevada foi adicionada às reações de hidrólise de PCS em 3,0 mg de proteína total por g de celulose, e os resultados de hidrólise foram comparados com os resultados para um composição enzimática em temperatura elevada similar, sem a celobioidrolase GH6 de T. byssochlamydoides (2,25 mg de proteína por g de celulose).

[000431] O ensaio foi realizado da maneira descrita no exemplo 5. As reações de 1 mL com PCS não lavado moído (5 % de sólidos insolúveis) foram conduzidas por 72 horas em tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM. Todas as reações foram realizadas em triplicata e envolveram mistura única no início da hidrólise.

[000432] Os resultados mostrados na figura 1 demonstraram que a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C a composição enzimática em temperatura elevada, que incluía 25 % de celobioidrolase da família GH6 de T. byssochlamydoides, superaram significativamente a composição enzimática sem a celobioidrolase de T. byssochlamydoides.

Exemplo 12: Preparação de celobioidrolase de Aspergillus fumigatus

[000433] A celobioidrolase de Aspergillus fumigatus NN055679 (SEQ ID NO: 31 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 32 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de celobioidrolase GH6A de Aspergillus fumigatus teve seu tampão trocado por Tris 20 mM pH 8,0, usando uma coluna de 400 mL SEPHADEX™ G-25 (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. As frações foram agrupadas e ajustadas para sulfato de amônio 1,2 M - Tris 20 mM pH 8,0. A proteína equilibrada foi carregada em uma coluna de fluxo rápido PHENYL SEPHAROSE™ 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada em Tris 20 mM pH 8,0, com sulfato de amônio 1,2 M, e as proteínas ligadas foram eluídas com Tris 20 mM pH 8,0 sem nenhum sulfato de amônio. As frações foram agrupadas. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, com albumina sérica bovina como um padrão proteico.

Exemplo 13: Preparação de celobioidrolase GH6A de Myceliophthora thermophila CBS 202.75

[000434] A celobioidrolase GH6A de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (SEQ ID NO: 33 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 34 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de celobioidrolase GH6A de Myceliophthora thermophila teve seu tampão trocado por Tris 20 mM pH 8,0, usando uma coluna de 400 mL Sephadex G-25 (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. O caldo com tampão trocado foi ajustado para Tris-HCl 20 mM pH 8,0 com sulfato de amônio 1,2 M, e aplicado em uma coluna de fluxo rápido PHENYL SEPHAROSE™ 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, Estados Unidos), equilibrada com Tris 20 mM pH 8,0 e com sulfato de amônio 1,2 M. As proteínas ligadas foram eluídas com Tris 20 mM pH 8,0 sem nenhum sulfato de amônio e as frações foram agrupadas. As frações agrupadas foram concentradas e o tampão foi trocado por Tris 20 mM pH 8,0, usando um concentrador centrífugo de 10 kDa MWCO Amicon Ultra (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, com albumina sérica bovina como um padrão proteico.

Exemplo 14: Avaliação de três celobrioidrolases em PCS lavado e moído a 50-65°C

[000435] Três celobrioidrolases (celobioidrolase GH6 de Talaromyces byssochlamydoides, celobioidrolase GH6A de Aspergillus fumigatus e celobioidrolase GH6A de Myceliophthora thermophila) foram avaliadas em 1 mg de proteína por g de celulose a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C, usando PCS lavado e moído como um substrato com 1 mg de proteína por g de celulose de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus.

[000436] O ensaio foi realizado da maneira descrita no exemplo 5. As reações de 1 mL com PCS lavado e moído (5 % de sólidos insolúveis) foram conduzidas por 72 horas em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,0, 4,5 e 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM. Todas as reações foram realizadas em triplicata e envolveram uma mistura única no início da hidrólise.

[000437] Os resultados mostrados na figura 2 demonstraram que a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C, e pH 4,0, 4,5 e 5,0, a celobioidrolase GH6 de Talaromyces byssochlamydoides (Tb6) rendeu uma maior conversão de PCS lavado e moído do que a celobioidrolase GH6A de Aspergillus fumigatus (Af6A) ou celobioidrolase GH6A de Myceliophthora thermophila (Mt6A), quando comparadas nas mesmas condições de temperatura e pH.

Exemplo 15: Determinação de Td por calorimetria exploratória diferencial

[000438] A termoestabilidade da celobioidrolase GH6 de Talaromyces byssochlamydoides foi determinada por calorimetria exploratória diferencial (DSC), usando um calorímetro exploratório diferencial VP-Capillary (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi obtida como o pico mais elevado de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T), obtido após aquecer a solução de enzima em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, em uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hr. A amostra e soluções de referência (aproximadamente 0,2 mL) foram colocadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) a partir das condições de armazenamento a 10°C, e foram pré-equilibradas termicamente por 20 minutos a 20°C, antes da varredura DSC de 20°C a 110°C. A Td para a celobioidrolase GH6 de Talaromyces byssochlamydoides foi determinada como 74°C +/- 1°C em pH 5,0. Depósito de Material Biológico

[000439] O material biológico a seguir foi depositado nos termos do Budapest Treaty with the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, Estados Unidos, e forneceu o seguinte número de acesso: Depósito Número de acesso Data do depósito E. coli (pAJ227) NRRL B-50474 1 de março de 2011

[000440] A cepa foi depositada em condições que garantem que o acesso à cultura será disponível durante a pendência deste pedido de patente determinada por leis estrangeiras de patente a serem intituladas a esta. O depósito representa a cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível da maneira exigida pelas leis de patente estrangeira em países em que as duplicatas do pedido submetido, ou sua progênie, são depositadas. Entretanto, pode-se entender que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção submetida em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental.

[000441] A presente invenção é descrita adicionalmente pelos seguintes parágrafos numerados:

[000442] [1] Um isolado polipeptídeo com atividade de celobioidrolase, selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta; (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[000443] [2] O polipeptídeo do parágrafo 1, com pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000444] [3] O polipeptídeo do parágrafo 1 ou 2, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii).

[000445] [4] O polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-3, que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta.

[000446] [5] O polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-4, que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000447] [6] O polipeptídeo do parágrafo 5, em que o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 20 a 456 de SEQ ID NO: 2.

[000448] [7] O polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-4, que é um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições.

[000449] [8] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é um fragmento de SEQ ID NO: 2, em que o fragmento apresenta atividade de celobioidrolase.

[000450] [9] O polipeptídeo do parágrafo 5, que é codificado por um polinucleotídeo que é idêntico ao polinucleotídeo contido no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474.

[000451] [10] O polipeptídeo do parágrafo 5, que é idêntico ao polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pAJ227, que está contido em E. coli NRRL B-50474.

[000452] [11] Um isolado polipeptídeo que compreende um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico com pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com nucleotídeos 397 a 1786 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta; (d) um variante de aminoácidos 98 a 456 de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[000453] [12] O polipeptídeo do parágrafo 11, que compreende adicionalmente um domínio de ligação à celulose.

[000454] [13] Um isolado polipeptídeo que compreende um domínio de ligação à celulose operavelmente ligado a um domínio catalítico, em que o domínio de ligação à celulose é selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio de ligação à celulose com pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2; (b) um domínio de ligação à celulose codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito elevada em (i) nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc desta, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um domínio de ligação à celulose codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com nucleotídeos 58 a 273 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc desta; (d) um variante de aminoácidos 20 a 56 de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de ligação à celulose.

[000455] [14] O polipeptídeo do parágrafo 13, em que o domínio catalítico é obtido de uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase, ou transferase, por exemplo, uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou beta- xilosidase.

[000456] [15] Uma composição que compreende o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000457] [16] Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000458] [17] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 16 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[000459] [18] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 16 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

[000460] [19] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14 que compreende: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[000461] [20] Um método de produzir um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira do parágrafo 18 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[000462] [21] Uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000463] [22] Um método de produzir um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase que compreende: (a) cultivar a planta transgênica ou célula de planta do parágrafo 21 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[000464] [23] Um método de produzir um mutante de uma célula parental que compreende inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14, que resulta no mutante que produz menos do polipeptídeo que a célula parental.

[000465] [24] Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo 23.

[000466] [25] A célula mutante do parágrafo 24, que compreende adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[000467] [26] Um método de produzir uma proteína que compreende: (a) cultivar a célula mutante do parágrafo 24 ou 25 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar o proteína.

[000468] [27] Uma molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) que compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 16, em que opcionalmente o RNAds é uma molécula de RNAsi ou uma de RNAmi.

[000469] [28] A molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) do parágrafo 27, que tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em tamanho.

[000470] [29] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase em uma célula, compreendendo administrar à célula ou expressa na célula a molécula de RNA inibitório dupla fita (RNAds) do parágrafo 27 ou 28.

[000471] [30] Uma célula produzida pelo método do parágrafo 29.

[000472] [31] A célula do parágrafo 30, que compreende adicionalmente um gene que codifica uma proteína natural ou heteróloga.

[000473] [32] Um método de produzir uma proteína que compreende: (a) cultivar a célula do parágrafo 30 ou 31 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[000474] [33] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste em aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2.

[000475] [34] Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 33, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[000476] [35] Uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 33, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[000477] [36] Um método de produzir uma proteína que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 33, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal, em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar o proteína.

[000478] [37] Um método para degradar ou converter um material celulósico que compreende: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de celobioidrolase de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000479] [38] O método do parágrafo 37, em que o material celulósico é pré-tratado.

[000480] [39] O método do parágrafo 37 ou 38, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[000481] [40] O método do parágrafo 39, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[000482] [41] O método do parágrafo 39, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[000483] [42] O método de qualquer dos parágrafos 37-41, que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

[000484] [43] O método do parágrafo 42, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[000485] [44] O método do parágrafo 43, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[000486] [45] Um Método de produzir um produto de fermentação que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de celobioidrolase de qualquer dos parágrafos 1-14; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais dos microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[000487] [46] O método do parágrafo 45, em que o material celulósico é pré-tratado.

[000488] [47] O método do parágrafo 45 ou 46, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[000489] [48] O método do parágrafo 47, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[000490] [49] O método do parágrafo 47, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[000491] [50] O método de qualquer dos parágrafos 45-49, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea.

[000492] [51] O método de qualquer dos parágrafos 45-50, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo.

[000493] [52] Um método de fermentar um material celulósico que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais dos microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade de celobioidrolase de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000494] [53] O método do parágrafo 52, em que a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação.

[000495] [54] O método do parágrafo 53, que compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[000496] [55] O método de qualquer dos parágrafos 52-54, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[000497] [56] O método de qualquer dos parágrafos 52-55, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[000498] [57] O método do parágrafo 56, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[000499] [58] O método do parágrafo 56, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[000500] [59] O método de qualquer dos parágrafos 53-58, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo.

[000501] [60] Uma formulação de caldo completo ou composição de cultura de células que compreende um polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-14.

[000502] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Pretende-se que qualquer dos aspectos esteja no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente. Também pretende-se que tais modificações estejam no escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.

Claims (12)

1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO:1 ou nos nucleotídeos 58 a 1786 da SEQ ID NO: 1.

2. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase consiste na SEQ ID NO: 2 ou nos aminoácidos 20 a 456 da SEQ ID NO: 2.

3. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida na reivindicação 1 ou 2, sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

4. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de compreender uma construção de ácido nucleico ou um vetor de expressão que compreende um gene codificando uma proteína, operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal consistindo nos aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

5. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida na reivindicação 4, sob condições que conduzam a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

6. Método para degradar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, consistindo na SEQ ID NO: 2 ou nos aminoácidos 20 a 456 da SEQ ID NO: 2.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

8. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase consistindo na SEQ ID NO:2 ou nos aminoácidos 20 a 456 da SEQ ID NO: 2; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

9. Método para fermentar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, consistindo na SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo maduro da mesma.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

12. Construção de ácido nucleico ou um vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade celobioidrolase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1 ou nos nucleotídeos 58 a 1786 da SEQ ID NO: 1; operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

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