EA023945B1 - Мутантная целлобиогидролаза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к мутантной целлобиогидролазе, являющейся мутантом SEQ ID NO:1, которая содержит замены в положении N247(I,F,H,W) в SEQ ID NO:1, которая идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO:1 и имеет активность CBH-I.

Description

Изобретение направлено на новые мутантные целлобиогидролазы и композиции, содержащие целлобиогидролазы, которые имеют улучшенную активность СВНЕ В частности, настоящее изобретение относится к семейству целлобиогидролаз из грибов и бактерий, которые родственны продуцируемой Та1агошуее8 етегкопй СВН-Ι и содержат определенные мутации.

Предшествующий уровень техники

Целлюлазы являются ферментами, которые способны гидролизовать бетаГО-глюкозидные связи в целлюлозах. Целлюлолитические ферменты традиционно разделялись на три основных класса: эндоглюканазы, экзоглюканазы или целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы (КпоМек, ί. е! а1., (1987), Т1ВТЕСН 5, 255-261) и известны как продуцируемые большим количеством бактерий, дрожжей и грибов.

Основными среди приложений, которые были разработаны для применения целлюлолитических ферментов, являются те, которые включают деградацию (древесной) целлюлозной пульпы в сахара для выработки (био)этанола, обработки тканей, такой как стирка с камнями и биополировка, и в композициях детергентов.

Таким образом, была продемонстрирована эффективность целлюлаз во многих промышленных процессах. Соответственно в данной области имеет место тенденция, связанная с поиском композиций или компонентов специфических целлюлаз, имеющих особенно эффективные функциональные режимы в отношении одного или большего количества конкретных приложений. В свете этого целлюлазы, вырабатываемые (экспрессируемые) в грибах и бактериях, стали объектом внимания. Например, целлюлазе, вырабатываемой определенными грибами, такими как ТпсНобегта крр. (особенно ТпсНобегта 1опщЪгасЫаШт), уделили много внимания из-за того, что полная целлюлазная система, способная деградировать кристаллические формы целлюлозы, легко производится с помощью процедур ферментации. Этот специфический целлюлазный комплекс был подробно проанализирован для определения природы его специфических компонентов, и способности этих компонентов участвовать в промышленных процессах. Например, \Уооб е! а1., МеШобк ίη Епууто1о§у, 160, 25, с. 234 и далее (1988), пишут, что полные системы грибных целлюлаз включают несколько различных классификаций ферментов, включая те, которые идентифицированы как экзоцеллобиогидролазы (ЕС 3.2.1.91) (СВН), эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) (ЕО), и бета-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.21) (ВО). Классификации грибных целлюлаз СВН, ЕО и ВО могут быть дополнительно расширены для включения множества компонентов в пределах каждой классификации. Были предложены некоторые генетические модификации СВН-Ι. З. Р. УоиШашеп, Р.О. Миггау, М.О. ТиоНу апб А. Ко1уи1а, Рго1еш Епдшеегшд, Ое81дп апб Зе1есбоп, рр. 1-11,2009, описывают экспрессию целлобиогидролазы СЕБ7А Та1аготусе8 етегкоии в ЗассЬаготусек сегеуыае и рациональный мутагенез для улучшения его термостабильности и активности. В этом описании мутант Ы54С/Р191С демонстрировал повышенную термостабильность и улучшенную активность к_са! 35,9 мин-1 (табл. II). Однако, эта активность все еще остается относительно низкой.

В \УО 2010/122141 описана СВН-Ι из Та1агаготусе8 етегкоий, полинуклеотиды, кодирующие СВНI, и клетки, в которые встроены эти полинуклеотиды. Аминокислотная последовательность СВН-Ι из \УО 2010/122141 в данном документе представлена как ЗЕО ГО N0:1.

Несмотря на знания в данной области, связанные со многими композициями целлюлаз, имеющих применение в некоторых или всех из вышеуказанных областей, существует постоянная потребность в новых композициях целлюлаз, которые обладают улучшенной активностью в условиях преобразования лигноцеллюлозы. Следовательно, существует потребность в улучшении существующей активности СВН-Ι, отдельно или в комбинации с другими целлюлазами.

Сущность изобретения

Задача данного изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом СВН-Ι или СВН4-подобной целлюлазы, обладающим улучшенной активностью СВН-Ι.

Активность СВН-Ι измеряется, как описано в примерах. Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом СВН-Ι или СВН4-подобной целлюлазы, обладающим повышенной эффективностью в условиях термического стресса.

Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом СВН-Ι или СВН4-подобной целлюлазы, который обеспечит превосходную эффективность при деградации биологического материала, такого как лигноцеллюлоза.

Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиции с новым вариантом СВН-Ι или СВН4-подобной целлюлазы, который обладает улучшенными характеристиками в отношении уменьшения биомассы, в качестве добавки к корму для животных, обработки крахмала и хлебопечения.

Одной или нескольких целей добиваются согласно изобретению. Согласно настоящему изобретению предлагается мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом ЗЕО ГО N0:1, содержащая замены в положении N247(ΕБ.Η.\V) из ЗЕО ГО N0:1, где мутантная целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности ЗЕО ГО N0:1 и имеет активность СВН-Ι.

В одном из воплощений мутант содержит замену N247?. В другом воплощении мутант содержит замену N2470

Краткое описание списка последовательностей

- 1 023945 δΕΟ ΙΌ N0:1. В δΕΟ ΙΌ N0:1 представлена аминокислотная последовательность СВН-Ι из Та1аготусек етегкоий, обозначенная как δΕΟ ΙΌ N0:1 в 3702010/122141.

δΕΟ ΙΌ N0:2. В δΕΟ ΙΌ N0:2 представлена сигнальная последовательность для целлобиогидролазы с δΕΟ ΙΌ N0:1.

δΕΟ ΙΌ N0:3. В δΕΟ ΙΌ N0:3 представлена ДНК-последовательность СВН-Ι (ΕΒΑ205).

Подробное описание изобретения

Во всем настоящем описании и в сопровождающей формуле изобретения слова содержать и включать и вариации, такие как содержит, содержащий, включает и включающий, должны толковаться включительно. Т.е. эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или чисел специально не перечисленных там, где позволяет контекст. В данном документе слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число. К примеру, элемент может обозначать один элемент или более одного элемента.

Мутантная целлобиогидролаза по изобретению, являющаяся мутантом δΕΟ ΙΌ N0:1, содержит замену в положении К247(!.Е.Н.^) последовательности δΕΟ ΙΌ N0:1, где мутантная целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 1 и имеет активность СВН-Ι.

В одном из воплощений мутант содержит замену Ш47Е. В другом воплощении мутант содержит замену N2474.

В дополнительном воплощении СВН-Ι содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа Е445, К163, 0357, δ36, Ό77 и/или Ц232, саму по себе или в комбинации с ранее упоминаемыми мутациями. Мутации в этих положениях могут быть заменой на С, Р, 0, А, V, Ь, Ι, М, Е, ^,У, Н, δ, Т, N Ц, Ό, Е, К, К или делецией. В дополнительном воплощении мутант содержит одну или несколько замен из числа Ε445Ι, К163К 0357К, δ36Ε, Ό77Μ и/или Ο232Α.

В другом воплощении мутант целлобиогидролазы содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам Т52, ν101, δ192, Т198, Т344, Ό346, А375 или А376 из δΕΟ ΙΌ N0:1, саму по себе или в комбинации с ранее упоминаемыми мутациями. Мутации в этих положениях могут быть заменой С, Р, 0, А, V, Ь, Ι, М, Е, ^,У, Н, δ, Т, N Ц, Ό, Е, К, К или делецией. В дополнительном воплощении мутант содержит одну или большее количество из числа представленных ниже замен: Т52(О,М,У,О,Н,К,К), V101(Т,I,Е,Н), 8192(АД,Е,р,Н), Т198(А,СА,Р,О,Н), Т246(0,Α,Υ,N,Н), ^47(^,^), Т344(А,8,С,ЬД,У,^), Ό346(Ρ,Ε,0,Κ), А375(0,Т;^,У,Н,К,К) и/или А376(Т,УЪ,Υ,^,Ο). В любом из воплощений мутант содержит одну или несколько замен из числа: Т52(М,О,К), ν101(Ι,Ε), δ192Ε, Т198А, Ю47Е, Т344(С,Ь), А375(У,Н), предпочтительно А375Н и/или А376О.

В другом воплощении мутант целлобиогидролазы содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, Ь34, ν41, У47, Т48, δ99, ν144, δ171, Ь177, N194, N195, А196, 1200, δ205, Т243, У244, δ245, У249, Р255, Ц337, Ό343, Н350, ν367, Ό372, Т393 и/или ν396, саму по себе или в комбинации с ранее упомянутыми мутациями.

В данном документе целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-в-О-гликозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с невосстановленных концов цепей. Этот фермент может также называться целлюлазой 1,4-в-целлобиозидазой, 1,4-в-целлобиогидролазой, 1,4-в-Э-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой, экзо-1,4-3-О-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. Целлобиогидролаза в данном документе сокращенно называется СВН. Целлобиогидролаза-Ι в данном документе сокращенно называется СВН-Ι. Мутантная целлобиогидролаза сокращенно называется Мутантная СВН или мутант. Полинуклеотид мутантной СВН в данном документе является полинуклеотидом, который кодирует Мутантную СВН.

Последовательность мутантной СВН идентична по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 97, 98, 99% последовательности δΕΟ ΙΌ N0:1.

В данном документе мутации указаны однобуквенными аминокислотами и положениями этих аминокислот. Например, А6 в данном документе обозначает аминокислоту (однобуквенный код) в определенном положении в δΕΟ ΙΌ N0:1, здесь А (аланин) в положении 6 белка. А6 (^/N/^/0/V/I/У/δ/Ε/К) в данном документе указывает на мутации аминокислоты в определенном положении, здесь А (аланин) в положении 6 белка заменен на любую аминокислоту из числа Ь (лейцин), N (аспарагин), О (глутамин), ν (валин), Ι (изолейцин), У (тирозин), δ (серин), У (глутаминовая кислота) или К (лизин).

Мутантная СВН изобретения может иметь одну или несколько альтернативных и/или дополнительных активностей, отличных от активности целлобиогидролазы, например одна из целлюлазных активностей, упомянутых в данном документе.

Мутантная СВН по изобретению может модифицировать углеводный материал, модифицируя такой материал химически или физически. Химическая модификация углеводного материала может привести к деградации такого материала, например, гидролизом, окислением или другой химической модификацией, такой как действие лигазы. Физическая модификация может проводиться вместе с химической модификацией или без нее.

Мутант может иметь одну или несколько из числа представленных ниже ферментных активностей

- 2 023945 или ферментная композиция, содержащая фермент, мутантную СВН по изобретению, может содержать один или несколько из числа следующих ферментов:

эндо-1,4-в-глюканазы (ЕС) и экзоцеллобиогидролазы (СВН, например, СВН-Ι или СВН-ΙΙ) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы на целлоолигосахариды (целлобиоза как основной продукт), в то время как β-глюкозидазы (ВС) преобразуют олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу. Ферментные активности ЕС, СВН, ВС, ксиланазы и пектиназы могут быть активностями мутантной СВН или активностями, присутствующими в других составляющих пептидной композиции, содержащей мутантную СВН.

Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с α-Ьарабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкуронидазами и β-ксиланазами, катализируют гидролиз гемицеллюлоз.

Пектиназы включают, например, эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзогалактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамноглактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамноглактуронангалактуроногидролазу, ксилогалактуроназу, αарабинофуранозидазу.

Как изложено выше, мутантная СВН изобретения, как правило, обладает активностью целлобиогидролазы. Однако, мутантная СВН изобретения может иметь одну или несколько активностей, изложенных выше, в дополнение к этой активности или в качестве альтернативы к ней. Также описанная здесь композиция с мутантной СВН по изобретению может иметь одну или несколько активностей упомянутых выше в дополнение к той, которая обеспечена мутантом целлобиогидролазы по изобретению, обладающего активностью целлобиогидролазы, или активности могут присутствовать в ферментной композиции, содержащей фермент мутантной СВН по изобретению.

Полинуклеотидная последовательность.

С помощью мутантной СВН и ее аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе, специалист может определить подходящие полинуклеотиды, которые кодируют мутантную СВН.

Следовательно, в изобретении предлагаются полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий мутантную СВН, а также кодирующую ее последовательность.

Полинуклеотиды изобретения могут быть выделены или синтезированы. Синтетические полинуклеотиды могут быть получены с помощью коммерчески доступных автоматических синтезаторов полинуклеотидов.

Полипептиды мутантной СВН и полинуклеотиды мутантной СВН в данном документе могут быть синтетическими полипептидами и соответственно полинуклеотидами. Синтетические полинуклеотиды могут быть оптимизированы по использованию кодонов предпочтительно согласно способам, описанным в \νϋ 2006/077258 и/или РСТ/ЕР 2007/055943, которые включены в данный документ ссылкой. В РСТ/ЕР 2007/055943 рассматривается оптимизация кодоновых пар.

Термин относится к полинуклеотидной молекуле, которая является молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) либо одно-, либо двухцепочечной. Полинуклеотид может либо присутствовать в выделенной форме, или может быть включен в рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или векторы, или может быть включен в клетку-хозяин.

Слово полипептид используется в данном документе для цепей, содержащих больше чем 7 аминокислотных остатков. Олигопептидные и полипептидные формулы и последовательности в данном описании пишутся слева направо и в направлении от Ν-конца к С-концу. Используемый в данном документе однобуквенный аминокислотный код широко известен в данной области.

Под выделенным полипептидом или белком понимается полипептид или белок, удаленный из своей естественной среды. Например, рекомбинантно продуцируемые полипептиды и белки, продуцируемые к клетках-хозяевах, рассматриваются как выделенные в целях изобретения, если являются естественными или рекомбинантными полипептидами, которые были в значительной степени очищены любым подходящим методом, таким как, например метод одностадийной очистки, описанный в работе 8шйй аиб Ιοίιηδοη. Сепе 67:31-40 (1988).

Полинуклеотиды настоящего изобретения, такие как полинуклеотиды, кодирующие мутантную СВН, могут быть выделены или синтезированы с помощью стандартных методов молекулярной биологии, а информация о последовательности представлена в данном документе.

Полинуклеотид, кодирующий мутантную СВН изобретения, может быть амплифицирован с помощью кДНК, мРНК или в ином случае, с помощью геномной ДНК, используемых в качестве матрицы, и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными методами амплификации ПЦР. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК.

Трансформация.

Полипептид по изобретению может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Следовательно,

- 3 023945 могут быть использованы стандартные методы трансформации.

Изобретение также относится к нуклеотидному конструкту, содержащему полинуклеотид, описанный ранее, например вектор.

Другой аспект изобретения, таким образом, относится к векторам, включая векторы для клонирования и экспрессии, содержащие полинуклеотид по изобретению, кодирующий белок СВН или его функциональный эквивалент, и к способам выращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящую клетку-хозяин, например, в условиях, в которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. При использовании в данном документе термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой они связаны.

Полинуклеотиды по изобретению могут быть встроены в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например вектор для клонирования или экспрессии. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, в дополнительном воплощении изобретение обеспечивает способ получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в реплицирующийся вектор, путем введения вектора в подходящую клеткухозяин и путем выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описаны ниже.

Специалистам в данной области понятно, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор траснформируемой клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка и т. п. Векторы по изобретению, такие как экспрессирующие векторы, могут быть введены в клетки-хозяева с тем, чтобы продуцировать белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе (например, белки СВН, мутантные формы белков СВН, их фрагменты, варианты или функциональные эквиваленты). Векторы, такие как рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению, могут быть сконструированы для экспрессии белков СВН в прокариотических и эукариотических клетках.

Например, белки СВН могут экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. сой, клетках насекомых (с помощью бакуловирсных экспрессирующих векторов), мицелиальных грибах, дрожжевых клетках, или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева дополнительно обсуждаются в книге Ооеббе1, Оепе Ехргеккюп Тесйпо1оду: МеОюбк ίη Еп/уто1оду 185, Асабетю Ргекк, 8ап И1едо, СА (1990). Характерные примеры подходящих хозяев описаны далее в данном документе.

Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в данной области.

Для большинства мицелиальных грибов и дрожжей вектор или экспрессирующая конструкция предпочтительно интегрируется в геном клетки-хозяина для получения стабильных трансформантов. Однако, для некоторых дрожжей также доступны подходящие эписомальные векторы, в которые для стабильной и высокоуровневой экспрессии может быть вставлена экспрессирующая конструкция, примеры таких векторов включают векторы, полученные из плазмид 2 μ и рКИ1 §ассйатотусек и К1иууетотусек соответственно или векторов, содержащих АМА-последовательности (например, АМА1 из Акрег§111ик). В случае, если экспрессирующая конструкция интегрирована в геном клетки-хозяина, конструкции интегрируются либо в случайные локусы в геноме, либо в заранее определенные целевые локусы с помощью гомологичной рекомбинации, в случае которой целевые локусы предпочтительно содержат сильно экспрессируемый ген.

Соответственно полезные в настоящем изобретении экспрессирующие векторы включают векторы, полученные на основе хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы-дифтерии птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные на основе их комбинаций, таких как те, что получены из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагмиды.

Если полипептид по изобретению будет секретироваться клеткой-хозяином в среду для культивирования, то к полипептиду может быть добавлена соответствующая сигнальная последовательность для направления синтезированного бе поуо полипептида в путь секреции клетки-хозяина. Специалистам в данной области известно, как выбрать подходящую сигнальную последовательность для конкретного хозяина.

Вектор может дополнительно включать последовательности, фланкирующие полинуклеотид, дающий начало РНК, которые содержат последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям или вирусным геномным последовательностям. Это позволяет внедрить полинуклеотиды по изобретению в геном клетки-хозяина.

Интегрирующий клонирующий вектор может быть интегрирован в случайном или заданном локусе-мишени в хромосоме(ах) клетки-хозяина, в которую он интегрируется.

Векторная система может быть одиночным вектором, таким как одиночная плазмида, двумя или несколькими векторами, такими как две или несколько плазмид, которые вместе содержат общую ДНК, вводимую в геном клетки-хозяина.

Вектор может содержать полинуклеотид по изобретению, ориентированный в антисмысловом на- 4 023945 правлении для обеспечения продукции антисмысловой РНК.

Векторная ДНК может быть внедрена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычных методов трансфекции и трансформации. Использованные в данном документе термины трансформация и трансфекция предназначены для обозначения множества признанных в данной области методов внедрения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяин, включая копреципитацию с фосфатом кальция и хлоридом кальция, ΌΕΑΕ-декстран опосредованную трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, катионную опосредованную липидами трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в §атЬтоок, е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 2'¹ , ей. Со1й 8рттд НатЬот ЬаЬогаФгу, Со1й 8рттд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1й 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989), Эа\л5 е! а1., Вакю Мейюйк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и в других лабораторных руководствах.

Как указано ранее, в изобретении предлагается выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно §ЕЦ ГО N0: 1, или §ЕЦ ГО N0: 2 с мутациями, указанными в п.1.

Мутантная СВН по изобретению может быть извлечена и очищена из рекомбинантных клеточных культур известными в данной области способами. Наиболее предпочтительно жидкостная хроматография, такая как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), используется для очистки, которая может включать, без ограничения перечисленным, применение ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографии и гель-фильтрации для дальнейшего отделения целевой СВН от основной части белка для извлечения целевой СВН в высокоочищенном состоянии.

Полипептиды настоящего изобретения включают естественно очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза, а также продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотических или эукариотических хозяев, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного получения, полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированы или не гликозилированы. Кроме того, полипептиды изобретения могут также включать начальный модифицированный остаток метионина или пироглутамат, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов. Пироглутаминовая кислота (также известная как 5-оксопролин, пидолевая кислота или пироглутамат в случае ее основной формы) является нераспространенным аминокислотным производным, в котором свободная аминогруппа глутаминовой кислоты циклизуется с образованием лактама. Она обнаружена во множестве белков, включая бактериородопсин.

Изобретение также описывает биологически активные фрагменты полипептида по изобретению.

Также предлагаются клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор изобретения. Полинуклеотид может быть гетерологичным по отношению к геному клетки-хозяина. Термин гетерологичный обычно по отношению к клетке-хозяину означает, что полинуклеотид не встречается естественным образом в геноме клетки-хозяина или что полипептид не продуцируется клеткой естественным образом.

В другом воплощении в изобретении описаны клетки, например трансформированные клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, охваченную изобретением. Трансформированная клетка или рекомбинантная клетка является клеткой, в которую (или в предшественник которой) посредством методов рекомбинантных ДНК вводится нуклеиновая кислота по изобретению. К ним относятся как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности АкретдШик тдег.

Клетки-хозяева могут быть выбраны таким образом, чтобы модулировать экспрессию внедренных последовательностей или чтобы модификация и процессинг генного продукта прошли специфическим требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, гидролиз) белковых продуктов могут облегчить оптимальное функционирование белка.

Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфичными механизмами для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, хорошо знакомые специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, могут быть выбраны для обеспечения требуемой и корректной модификации и процессинга продуцируемого чужеродного белка. С этой целью могут использоваться эукариотические клеткихозяева, которые обладают клеточной машинерией для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области.

При необходимости, описанная выше клетка может быть использована для получения полипептида по изобретению. Такой способ, как правило, включает культивирование клетки-хозяина (например, трансформированной или трансфецированной вектором, таким как экспрессирующий вектор, как описано выше), в условиях, которые позволяют осуществить экспрессию последовательности (вектором), кодирующей полипептид, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида. Полинуклеотид изобретения может быть встроен в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например в экспрессирующий вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в подходящей

- 5 023945 клетке-хозяине. Таким образом, в дополнительном воплощении в изобретении предлагается способ получения полинуклеотида изобретения путем введения полинуклеотида изобретения в реплицирующийся вектор, путем введения вектора в подходящую клетку-хозяин и путем выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина.

Предпочтительно, если полипептид продуцируется в виде секретируемого белка что происходит в случае, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в экспрессирующей конструкции, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность. Предпочтительно, если сигнальная последовательность является естественной (гомологичной) нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. В ином случае сигнальная последовательность является чужеродной (гетерологичной) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и в этом случае сигнальная последовательность предпочтительно является эндогенной относительно клетки-хозяина, в которой экспрессируется нуклеотидная последовательность по изобретению. Примерами подходящих сигнальных последовательностей для дрожжевых клетокхозяев являются сигнальные последовательности, полученные из дрожжевых генов α-фактора. Подобным образом, подходящей сигнальной последовательностью для клеток-хозяев из мицелиальных грибов является, например, сигнальная последовательность, полученная из гена амилоглюкозидазы (АС) мицелиальных грибов, например ген д1аА из А. тдег. Сигнальная последовательность может быть использована в комбинации с промотором амилоглюкозидазы (также называемой (глюко)амилазой), а также в комбинации с другими промоторами. Гибридные сигнальные последовательности могут также использоваться в контексте настоящего изобретения.

Предпочтительные гетерологичные лидерные последовательности для секреции, таким образом, происходят из гена грибной амилоглюкозидазы (АС) (как 18-, так и 24-аминокислотные версии, например, из АкрегдШик), из гена α-фактора (дрожжи, например, ЗассНаготусек апб К1иууеготусек) или из гена α-амилазы (ВасШик).

Векторы могут быть трансформированы или трансфецированы в подходящую клетку-хозяин, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида изобретения. Этот процесс может включать культивирование клетки-хозяина, трансформированной экспрессирующим вектором, как описано выше, в условиях, которые обеспечивают экспрессию вектором последовательности, кодирующей полипептид.

В данном случае используются стандартные методы выделения, гибридизации, трансформации и клонирования (например, как описано в руководстве ЗатЪгоок 1., Ргйкй Е. Р. апб Матайк, Т. Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪога1огу Мапиа1. 2пб, еб., Со1б Зргшд НагЪог ЬаЪога1огу, Со1б Зргтд НагЪог ЬаЪога1огу Ргекк, Со1б Зргшд НагЪог, ΝΥ, 1989).

Гомология и идентичность.

Аминокислотные или нуклеотидные последовательность указаны как гомологичные, если они демонстрируют некоторый уровень сходства. Гомологичность двух последовательностей указывает на общее эволюционное происхождение. На то, являются ли две гомологичные последовательности близко или более удаленно родственными, указывает процент идентичности или процент сходства, который является высоким или низким соответственно. Несмотря на спорность указания на процент идентичности или процент сходства, уровень гомологии или процент гомологии часто используются взаимозаменяемо.

Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с помощью математических алгоритмов. Специалистам известно, что для выравнивания двух последовательностей и определения гомологии между двумя последовательностями доступны несколько различных компьютерных программ (Кгикка1 ГВ. (1983) Ап оуег\ае\у о! кдиепсе сотрапкоп 1п Ό. ЗапкоГГ апб ГВ. Кгикка1, (еб.), Пте теагрк, кйшд ебйк апб тасгото1еси1ек: 1Пе (Неогу апб ргасйсе оГ кесщепсе сотрапкоп, рр. 1-44 Аббйоп ^ек1еу). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с помощью алгоритма НидлманаВунша для сравнения двух последовательностей (№еб1етап З.В. апб ХУипксН С.Э. (1970) 1. Мо1. Вю1. 48, 443-453). Алгоритм выравнивает аминокислотные последовательности, а также нуклеотидные последовательности. Алгоритм Нидлмана-Вунша был реализован в компьютерной программе ΝΕΕΌΕΕ. Для цели настоящего изобретения была использована программа ΝΕΕΌΕΕ из пакета ЕМВОЗЗ (Аегкюп 2.8.0 или выше, ΕМВОδδ: ТЬе Бигореап Мо1еси1аг Вю1о§у Ореп Зой^аге Зийе (2000) Ктсе Р., ^ои§беи I. апб В1еакЪу А. Тгепбк ш Сепейск 16, (6) рр 276-277, Ьйр://етЪокк.ЪюшГогтайск.п1/). Для белковых последовательностей в качестве подстановочной матрицы использовалась ΕВ^ОЗυМ62. Для нуклеотидной последовательности использовалась матрица ΕΌΝΆΡυΕΕ. Могут быть указаны другие матрицы. Необязательными параметрами, используемыми для сравнения аминокислотных последовательностей, являются штраф за внесение разрыва, равный 10, и штраф за продолжение разрыва, равный 0,5. Специалист поймет, что все эти различные параметры дадут несколько различающиеся результаты, но общий процент идентичности двух последовательностей не изменится значительно при использовании различных алгоритмов.

Глобальное определение гомологии.

- 6 023945

Гомология или идентичность является процентом полных совпадений между двумя полными последовательностями по всей выровненной области, включая любые разрывы или удлинения. Г омологию или идентичность между двумя выровненными последовательностями рассчитывают следующим образом: количество соответствующих позиций в выравнивании, демонстрирующих идентичные аминокислоты в обеих последовательностях, разделенное на общую длину выравнивания, включая разрывы. Идентичность, определенная в данном документе, может быть получена в ΝΕΕΌΕΕ и отмечена в выходных данных программы как ΙΌΕΝΤΙΤΥ.

Определение наиболее длинной идентичности.

Гомологию или идентичность между двумя выровненными последовательностями рассчитывают следующим образом: количество соответствующих позиций в выравнивании, демонстрирующих идентичные аминокислоты в обеих последовательностях, разделенное на общую длину выравнивания после вычитания общего количества разрывов в выравнивании. Определенная в данном документе идентичность может быть получена в ΝΕΕΌΕΕ с помощью опции ΝΘΒΚΙΕΡ и отмечена в выходных данных программы как 1опдекНбепШу. Предпочтительно, если для расчета идентичности используется наиболее длинная идентичность.

Клетки-хозяева.

В изобретении, таким образом, предлагаются клетки-хозяева, трансформированные или трансфецированные полинуклеотидом или вектором изобретения. Предпочтительно, если полинуклеотид вводится в вектор для репликации и экспрессии полинуклеотида. Клетки будут отобраны так, чтобы быть совместимыми с указанным вектором и могут, например, быть клетками прокариот (например, бактерий), грибов, дрожжей, или растений.

Также для продукции полипептида изобретения может быть выбран гетерологичный хозяин, в котором полипептид по изобретению продуцируется в форме, которая в значительной степени свободна от ферментов, разрушающих целлюлозу или гемицеллюлозу. Это может быть достигнуто путем выбора хозяина, который обычно не продуцирует такие ферменты.

Изобретение охватывает способы продуцирования полипептида изобретения посредством рекомбинантной экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Для этой цели последовательность ДНК изобретения может быть использована для амлификации гена и/или замены сигналов экспрессии, таких как промоторы, сигнальные последовательности для секреции, с тем, чтобы обеспечить экономически выгодное производство полипептида в подходящей гомологичной или гетерологичной клетке-хозяине. Гомологичная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин, которая происходит из тех же видов или которая является вариантом в тех же видах, что и виды, из которых получена последовательность ДНК.

Подходящие клетки-хозяева предпочтительно представляют собой прокариотические микроорганизмы, такие как бактерии, или более предпочтительно эукариотические организмы, например грибы, такие как дрожжи или мицелиальные грибы, или растительные клетки. В общем, дрожжевые клетки предпочтительней грибных клеток, потому что с ними легче работать. Однако, некоторые белки либо плохо секретируются из дрожжей, либо в некоторых случаях не процессируются правильно (например, в случае гипергликозилирования в дрожжах). В этих случаях должен быть выбран грибной организмхозяин.

Клетка-хозяин может сверхэкспрессировать полипептид, и методы для конструирования сверхэкспрессии хорошо известны. Хозяин может, таким образом, иметь две или несколько копий, кодирующих полинуклеотид (и вектор, следовательно, может иметь две или несколько копий соответственно).

Бактерии из рода ВасШик очень подходят в качестве гетерологичных хозяев из-за их способности секретировать белки в культуральную среду. Другими подходящими в качестве хозяев бактериями являются бактерии из родов §1гер!отусек и Ркеиботопак. Предпочтительные дрожжевые клетки-хозяева для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид, происходят из родов ЗассЬаготусек, К1иууеготусек, Напкепи1а, РюЫа, Υ;·ιπΌ\νί;·ι и ЗсЫ/окассНаготусек.

Более предпочтительно, если дрожжевая клетка-хозяин выбирается из группы, состоящей из видов БассЬаготусек сегеуыае. К1иууеготусек 1асйк (также известного как К1иууеготусек татапик уагЛасйк), Напкепи1аро1утогрЬа, РюШаракШпк, Υа^^оν^а Ьро1уйса и 8сЫ/окассНаготусек ротЬе.

Наиболее предпочтительными являются, однако, грибные клетки-хозяева (например, мицелиальных грибов). Предпочтительные клетки-хозяева мицелиальных грибов выбираются из группы, состоящей из родов ЛкрегдШик, ТпсЬобегта/Нуросгеа, Рикагшт, ОщрогойтсЬит, РетсШшт, Лсгетотит, №игокрога, ТЬегтоаксик, МусеНорЫога, БрогойтсЬит, ТНе1ау1а, СЬгуокрогшт, Рикагшт, Нитюо1а, №игокрога и Та1аготусек.

Более предпочтительно, если клетка-хозяин мицелиального гриба является видом ЛкрегдШик огу/ае, ЛкрегдШик ко.)ае, ЛкрегдШик шби1апк, или видом из группы ЛкрегдШик шдег. Она включает, без ограничения перечисленным, ЛкрегдШик тдег, АкрегдШикататоп, ЛкрегдШик ШЬшдепык, ЛкрегдШик аси1еаШк, ЛкрегдШик Гоейбик, ЛкрегдШик тби1ап8, ЛкрегдШик .(аротсик, ЛкрегдШик огу/ае и ЛкрегдШик Псиит а также состоит из видов Тйсйобегша гееке1/Нуросгеа .(асойпа, Рикагшт дгаттеагит, Та1аготусек етегкопи, РетсШшт беситЬепк, Лсгетотит а1аЬатепке, №игокрога сгакка, МусейорЫога ШегпаорЬйигй,

- 7 023945

Зрогойтсйиш се11и1орЫ1ит, ΟίφοίΌίπαΙηιιη Фтогрйокрогит, Та1аготусек етегкопй, Та1аготусек κΐίρίΐαΐυδ и Т1йе1а\аа 1еггез1г1з,

Примерами предпочтительных экспрессирующих хозяев в пределах объема настоящего изобретения являются грибы, такие как грибы рода АкрегдШик, рода РешсШшт и рода ТпсНойегта; бактерии, такие как бактерии рода ВасШик, например ВасШик киЫШк, ВасШик ПсНешГогтк. ВасШик атуЫкщеГашепк, рода Ркеиботопак; и дрожжи, такие как дрожжи рода К1иууеготусек, например виды К1иууеготусек 1асйк, и Зассйаготусек, например, Зассйаготусек сегеу1к1ае.

Клетки-хозяева по изобретению включают растительные клетки, а изобретение, следовательно, распространяется на трансгенные организмы, такие как растения и их части, которые содержат одну или несколько клеток изобретения. Клетки могут гетерологично экспрессировать полипептид изобретения или могут гетерологично содержать один или несколько полинуклеотидов изобретения. Трансгенное (или генетически модифицированное) растение может, следовательно, иметь вставленную (например, стабильно) в его геном последовательность, кодирующую один или несколько полипептидов изобретения. Трансформация растительных клеток может быть осуществлена с помощью известных методов, например с помощью Т1- или Κί-плазмид из АдгоЬас1епит ШтеГашепк. Плазмида (или вектор) может, таким образом, содержать последовательности, необходимые для инфекции растения, для чего могут быть использованы производные Т1- и/или Κί-плазмид.

В ином случае может быть осуществлена прямая инфекция части растения, такой как лист, корень или стебель. В этом методе инфицируемое растение может быть ранено, например, надрезанием растения бритвой, или прокалыванием растения иглой, или натиранием растения абразивом. Рана затем инокулируется АдгоЬасЮгшт. Затем растение или часть растения могут выращиваться в подходящей культуральной среде, что позволяет развиться зрелому растению. Регенерация трансформированных клеток в генетически модифицированных растениях может быть достигнута с помощью известных методов, например с помощью отбора трансформированных корней, антибиотика и субкультивирования корней в среде, содержащей подходящие питательные вещества, растительные гормоны и т.п.

Изобретение также включает клетки, которые были модифицированы для экспрессии целлобиогидролазы по изобретению или ее варианта. Такие клетки включают временные или предпочтительно стабильные клеточные линии высших эукариот, такие как клетки млекопитающих или клетки насекомых, клетки низших эукариот, таких как дрожжи и (например, мицелиальные) грибные клетки или прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки.

Также возможна временная экспрессия белков изобретения в клеточной линии или на мембране, такой как, например, в бакуловирусной системе экспрессии. Такие адаптированные для экспрессии белков по изобретению системы также включены в объем настоящего изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением получение полипептида изобретения может быть осуществлено культивированием клетки-хозяина по изобретению, которая была трансформирована одним или несколькими полинуклеотидами настоящего изобретения, в обычной питательной среде для ферментации.

Изобретение также относится к способу получения мутантной СВН, включающему стадии:

(a) культивирования клетки-хозяина по изобретению в подходящей культуральной среде в подходящих условиях для получения мутантной СВН;

(b) получения указанной продуцируемой мутантной СВН; и необязательно (c) очистки указанной мутантной СВН для получения продукта с очищенной мутантной СВН.

Изобретение также относится к ферментной композиции, содержащей один или несколько мутантных СВН по изобретению и/или полученной согласно способу изобретения.

Также изобретение относится к способу деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный или гемицеллюлозный материал контактирует с ферментной композицией по изобретению. В любом из воплощений в таком процессе по изобретению вырабатывается один или несколько сахаров. В любом из воплощений выработанный сахар ферментируется для получения продукта ферментации. В любом из воплощений продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластмассы, органической кислоты, растворителя, добавки к корму для животных, лекарственного средства, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.

Продукция полипептида/фермента.

Рекомбинантные клетки-хозяева по изобретению могут культивироваться с помощью способов, известных в данной области. Для каждой комбинации промотора и клетки-хозяина доступны культуральные условия, которые способствуют экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. После достижения требуемой плотности клеток или титра полипептида рост культуры останавливают, и полипептид выделяют известными способами.

Ферментационная среда может содержать известную культуральную среду, включающую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, патоку, крахмал, целлюлозу, ксилан, пектин, гидролизат лигноцеллюлолитической биомассы и т.п.), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлористый аммоний и т.д.), источники органического азота (например, дрожжевой экстракт, солодовый

- 8 023945 экстракт, пептон и т.п.), источники неорганических питательных веществ (например, фосфат, магний, калий, цинк, железо и т.п.). Необязательно может быть включен индуктор (например, целлюлоза, пектин, мальтоза, мальтодекстрин или ксилогалактуронан).

Выбор подходящей среды может быть основан на выборе экспрессирующего хозяина и/или на регуляторных требованиях экспрессирующей конструкции. Такие среды известны специалистам в данной области. Среда может, если требуется, содержать дополнительные компоненты, оказывающие благоприятное воздействие на трансформированных экспрессирующих хозяев по сравнению с потенциально контаминирующими организмами.

Ферментация может быть осуществлена в течение 0,5-30 дней. Ферментация может быть периодическим процессом, непрерывным процессом, периодическим процессом с добавлением субстрата при соответствующей температуре в диапазоне, например, от около 0 до около 45°С и/или при рН, например, от около 2 до около 10. Предпочтительными условиями ферментации являются температура в диапазоне от около 20 до около 37°С и рН от около 3 до около 9. Соответствующие условия, как правило, выбираются исходя из выбора экспрессирующего хозяина и вырабатываемого белка.

После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментационной питательной среды центрифугированием или фильтрацией. После того как ферментация остановится или после удаления клеток, полипептид изобретения может быть извлечен, и если требуется, очищен и выделен обычными средствами.

Ферментные композиции.

В изобретении также предлагается ферментная композиция, содержащая один или большее количество мутантных целлобиогидролаз. В любом из воплощений ферментная композиция содержит одну или большее количество мутантных СВН, одну или несколько из числа целлюлазы и/или гемицеллюлазы и/или пектиназы.

Композиция изобретения может содержать один, два или три или большее количество классов целлюлаз, например две или все из числа эндо-1,4-в-глюканазы (ЕС), предпочтительно включая СН61, экзоцеллобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазы (ВСЬ).

Ферментная композиция изобретения может содержать полипептид, который обладает схожей ферментативной активностью, например обладает активностью схожего типа целлюлазы, гемицеллюлазы и/или пектиназы, что и активность, которая обеспечена полипептидом изобретения.

Ферментная композиция изобретения может содержать полипептид, который имеет другой тип целлюлазной активности, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, чем та, которая обеспечена полипептидом изобретения. Например, композиция изобретения может содержать один тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной полипептидом изобретения, и второй тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой.

В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы, либо частично, например, в целлодекстрины, либо полностью в глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.

В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать один или несколько из числа ксилана, глюкуроноксилана, арабиноксилана, глюкоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу, является ферментом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды, либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономеры сахара, например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация будет, как правило, проводиться путем реакции гидролиза.

В данном документе пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие единицы, либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в сахарные мономеры. Пектиназа по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с пектиназой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.

В данном документе эндо-в-1,4-глюканазой является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-в-О-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или β-Ό-глюканах зерновых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в β-Ό-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент может также называться целлюлазой, авицелазой, β-1,4эндоглюкангидролазой, бета-1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлудекстриназой, эндо-1,4-β- 9 023945

Ό-глюканазой, эндо-1,4-в-О-глюканогидролазой, эндо-1,4-в-глюканазой или эндоглюканазой. СН61 эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) изначально были классифицированы как ферменты семейства гликозидгидролаз на основании измерения очень слабой эндо-1,4-в-О-глюканазной активности у одного представителя семейства. Структура и механизм действия этих ферментов, безусловно, не является каноническим, и они не могут рассматриваться в качестве подлинных гликозидаз. Тем не менее, они хранятся в классификации ΟΆΖ на основании их способности повышать распад лигноцеллюлозы при использовании в сочетании с целлюлазой или смесью целлюлаз.

В данном документе β-глюкозидазой (ЕС 3.2.1.21) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков β-Ό-глюкозы с высвобождением βΌ-глюкозы. Такой полипептид может обладать широкой специфичностью по отношению к β-Όглюкозидам и может также гидролизовать одно или несколько из числа представленных: β-Ό-галактозид, α-Ь-арабинозид, β-Ό-ксилозид или β-Ό-фукозид. Этот фермент также может называться амигдалазой, βΌ-глюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазой.

В данном документе β-(1,3)(1,4)-глюканазой (ЕС 3.2.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз Гф-О-глюкозидных связей в β-Ό-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4связи. Такие полипептиды могут действовать на лихенин и бета-О-глюканы зерновых, но не на бета-Όглюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также называться лихениназой, 1,3-1,4-β-^-глюкан-4-глюканогидролазой, β-глюканазой, эндо-β-1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или βглюканазой смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, который описан как эндо-1,3(4)-бета-глюконаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в β-Όглюканах, когда остаток глюкозы, чья восстанавливающая группа участвует в образовании гидролизуемой связи, самозамещается по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-бетаглюканазу, ламинариназу, 1,3-(1,3;1,4)-бета-О-глюкан 3 (4) глюканогидролазу; субстраты включают ламинарин, лихенин, и бета-О-гликаны зерновых.

Соответственно композиция изобретения может содержать в дополнение к мутантной СВН одну или несколько из любых целлюлаз, например целлобиогидролазу (например, СВН-ΙΙ), и эндо-β-1,4глюканазу, β-глюкозидазу или β-(1,3)(1,4)-глюканазу.

Ферментная композиция по изобретению может содержать дополнительно одну или большее количество из числа представленных ниже ферментных активностей:

эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8), β-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), α-Ь-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55), αΌ-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139), ксилан альфа-1,2-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.131), феруоилэстераза (ЕС 3.1.1.73), кумароилэстераза (ЕС 3.1.1.73), α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22), β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23), βманнаназа (ЕС 3.2.1.78), β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25), эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15), пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11), эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89), эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10), пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2), альфа-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40), экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82), экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67), экзополигалактуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9), рамногалактуронангидролаза, рамногалактуронанлиаза, рамногалактуронан ацетил, рамногалактуронан галактуроногидролаза, ксилогалактуроназа, α-Ьарабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55), эндоарабинаназа(ЕС 3.2.1.99), протеаза (3.4), липаза, лигниназа, например лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73), гексозилтрансфераза (2.4.1-), глюкуронидаза, например β-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроноглюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозамин глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат β-глюкуронидаза (3.2.1.128) или α-Ό-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139), экспансин или экспансин-подобный белок, такой как сволленин (см. §а1йе1то с1 а1., Еиг. 1. Вюйет. 269, 42024211, 2002) или сволленин-подобный белок, скаффолдины и целлюлозоинтегрирующие белки.

Композиция изобретения может состоять из представителей каждого из упомянутых выше классов, нескольких представителей одного полипептидного класса или любой комбинации этих полипептидных классов.

Композиция изобретения может состоять из полипептидов, например ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; из (2) клонированных генов, экспрессирующих полипептиды, например ферменты; (3) сложной жидкой питательной среды (такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, где штаммы секретируют ферменты в среду); (4) клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего полипептиды, например ферменты. Различные полипептиды, например ферменты, в композиции изобретения могут быть получены из различных источников.

В любом из воплощений СВН-Ι предлагается в ферментной композиции, которая содержит ВО, ЕС и СВН-ΙΙ. В любом из ее воплощений, количества ферментов выбираются так, чтобы ВО присутствовала в количестве 2-12%, СВН-Ι - в количестве 10-65%, СВН-ΙΙ - в количестве 10-40%, ЕС - в количестве 1270% или в любом из ее воплощений, ВО присутствовала в количестве 4-12%, ЕС - 18-50%, СВН-ΙΙ - 1035%, а СВН-Ι -10-60% от общего количества белка (мас./мас.).

Применение полипептидов.

- 10 023945

Полипептиды и ферментные композиции по изобретению могут быть использованы в различных применениях. Например, они могут быть использованы для образования ферментируемых сахаров. Ферментируемые сахара затем могут быть преобразованы как часть процесса производства биотоплива в биогаз или этанол, бутанол, изобутанол, 2-бутанол или другие подходящие вещества. В ином случае полипептиды и их композиции могут быть использованы в качестве фермента, например, при производстве продуктов питания, в детергентных композициях, в целлюлозно-бумажной промышленности, в антибактериальных составах, в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Некоторые из применений подробно будут проиллюстрированы ниже.

В данных применениях и способах, описанных ниже, компоненты композиции, описанные выше, могут быть предоставлены одновременно (т.е. по сути, в виде отдельной композиции) или отдельно, или последовательно.

Изобретение также относится к применению целлобиогидролазы по изобретению и композиций, содержащих такой фермент, в промышленных процессах.

Несмотря на многолетний опыт, накопленный об этих процессах, целлобиогидролаза по изобретению может отличаться множеством значимых преимуществ от используемых в настоящее время ферментов. В зависимости от конкретного применения эти преимущества могут включать такие аспекты, как низкая себестоимость, высокая специфичность к субстрату, пониженная антигенность, пониженная нежелательная побочная активность, повышенный выход при продукции в соответствующем микроорганизме, более подходящие температурные и рН диапазоны, отсутствие ингибирования гидрофобными полученными из лигнина продуктами или меньшее ингибирование продуктом или в случае пищевой промышленности лучшие вкусовые качества или текстуры конечного продукта, а также пищевой и кошерный аспекты.

В принципе, целлобиогидролаза или композиция изобретения могут быть применены в любом способе, в котором требуется обработка материала, содержащего полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция изобретения могут быть применены при обработке некрахмального полисахаридного материала. В данном документе полисахаридным материалом является материал, который содержит или состоит существенным образом из одного или, что чаще, более чем одного полисахарида.

Как правило, растения и материал, полученный из них, содержат значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно полипептид изобретения может быть применен при обработке растительного или грибного материала или материала, полученного из него.

Подходящие углеводные материалы.

Некрахмальным углеводом, подходящим для модификации мутантной СВН изобретения, как правило, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлозные остатки, которые могут рассматриваться как потенциальный возобновляемый источник сырья, являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в сырье, полученном из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов на растворимые сахара, например глюкозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, И-галактоуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, происходит под действием различных ферментов, действующих совместно.

Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составить значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения (от около четверти до половины сухой массы могут быть пектинами).

Соответственно композиция изобретения может быть адаптирована с учетом определенного сырья (также называемого субстратом), которое будет использоваться. Иными словами, спектр активностей композиции изобретения может варьировать в зависимости от рассматриваемого сырья.

Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно, или последовательно, или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей, грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае сырая клеточная масса, или среда для продуцирования фермента, или растительный материал может быть обработан для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавление антимикробных средств), затем добавляют к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как, кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Также растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут добавляться в лигноцеллюлозное сырье.

Лигноцеллюлоза.

Важным компонентом растительного некрахмального полисахаридного материала является лигноцеллюлоза (которая также называется в данном документе лигноцеллюлозной биомассой). Лигноцеллюлоза является растительным материалом, который состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина.

- 11 023945

Углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином водородными и ковалентными связями. Соответственно полипептид изобретения может быть применен при обработке лигноцеллюлозного материала. В данном документе лигноцеллюлозным материалом является материал, который содержит лигноцеллюлозу или в основном состоит из лигноцеллюлозы. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида некрахмальным полисахаридом может быть лигноцеллюлозный материал/биомасса.

Соответственно в изобретении предлагается способ обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, в котором обработка включает деградацию, и/или гидролиз, и/или модификацию целлюлозы, и/или гемицеллюлозы, и/или пектинового вещества.

Деградация в данном контексте означает, что обработка в результате дает образование продуктов гидролиза целлюлозы, и/или гемицеллюлозы, и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки получаются более короткие олигосахариды, чем присутствуют в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в данном контексте может приводить к высвобождению олигосахаридов и/или сахарных мономеров.

Все растения, а также практически все полисахаридные материалы, полученные из растений, содержат некрахмальные полисахариды. Соответственно в способе изобретения для обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, указанный субстрат может быть предоставлен в виде растения или материала, полученного из растений, или материала, содержащего растения, или материала, полученного из растений, например растительную пульпу, растительный экстракт, продукт питания или его ингредиент, ткань, текстильное изделие или предмет одежды.

Лигноцеллюлозная биомасса, подходящая для применения в изобретении, может включать первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жмых сахарного тростника, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, зерна кукурузы, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница или ячмень (включая влажный и сухой способы помола), часто называемые отруби или волокна. Биомасса может также быть, без ограничения перечисленным, травянистым материалом, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, отходами целлюлозно-бумажного производства. Сельскохозяйственная биомасса включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры, листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, деревянистые структуры культур с коротким циклом, кустарники, просо, деревья, овощи, фруктовые корки, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или любой их комбинацией или смесью. Дополнительными примерами подходящей биомассы являются садовые обрезки, чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры культур с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, бородач, трипсакум, лисохвост, свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие животные отходы, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, деревья, кустарники, травы, пшеница, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы, кукурузное зерно, волокна из зерна, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые бытовые отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, твердые бытовые отходы, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, кукуруза, кукурузная шелуха, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничные отруби, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученных в ходе сельскохозяйственного процесса, древесные отходы лесного хозяйства или комбинация любого из двух или нескольких из них.

Помимо первичной биомассы или сырья уже обработанного в пищевой, кормовой или бумажной и целлюлозной отраслях, биомасса/сырье может быть дополнительно обработано тепловой, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления ферментативной деградации.

Предварительная обработка.

Перед ферментативной обработкой лигноцеллюлозный материал можно предварительно обрабо- 12 023945 тать. Предварительная обработка может включать воздействие на лигноцеллюлозный материал кислоты, основания, растворителя, нагревания, пероксида, озона, механического измельчения, дробления, перемалывания или быстрого сброса давления или комбинацией любых двух или нескольких из перечисленного. Данную химическую предварительную обработку часто объединяют с термической предварительной обработкой, например, в диапазоне 150-220°С в течение от 1 до 30 мин.

После стадии предварительной обработки может быть проведена стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания, включающая инкубацию с ферментом или ферментной смесью. Стадия предварительного осахаривания может быть осуществлена при различных температурах, но предпочтительно, если предварительное осахаривание происходит при температуре, наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или для прогнозируемого ферментного оптимума тестируемых ферментов. Температура стадии предварительного осахаривания может находиться в диапазоне от около 10 до 95°С, от около 20 до около 85°С, от 30 до около 70°С, от около 40 до около 60°С, от около 37 до около 50°С, предпочтительно от около 37 до около 80°С, более предпочтительно около 60-70°С, еще более предпочтительно приблизительно 65°С. рН смеси предварительного осахаривания может находиться в диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 7,0, более предпочтительно от около 4,0 до около 6,0, еще более предпочтительно от около 4,0 до около 5,0. Опять же, рН может быть скорректирована для максимизации активности и может быть скорректирована с добавлением фермента. Сравнение результатов анализов этого теста позволит кому-либо модифицировать способ для лучшего соответствия проходящим тестирование ферментам.

Стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 1 до около 120 ч, предпочтительно от около 2 до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение от около 2 до около 6 ч. Обработка целлюлазой может происходить в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 до около 120 ч, предпочтительно от около 12 до около 72 ч, более предпочтительно от около 24 до 48 ч.

Биомассу, таким образом, можно подвергнуть различным предварительным обработка, для того чтобы сделать целлюлозу более доступной ферментативному разрушению (гидролизу) и солюбилизировать сахара гемицеллюлозы. РсаШгск οί Ргош181ид ТссЬпо1одю8 £ог Ргс1гса1тсп1 о£ Пдиосе11и1о8ю Βίοта88, Вюгскоигсс ТссЬио1оду 96(3), 673-86. Υί Ζΐιαϊβ. 2Ьоидй Рап, РшНопд Ζ1ι;·ιη§. Оусплс\у оГ Ыота88 ргс-1гса1тсп1 Гог сс11и1о81с с(Напо1 ргобисйоп. 1п1 I Адпс & Вю1 Епд, 2009; 2(3): 51-68.

Осахаривание.

В изобретении предлагается способ получения сахара из лигноцеллюлозного материала, который включает контакт полипептида изобретения в композиции изобретения с лигноцеллюлозным материалом.

Такой способ позволяет получать свободные сахара (мономеры) и/или олигосахариды из лигноцеллюлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды с помощью полипептида или композиции изобретения.

Процесс преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара предпочтительно позволяет преобразовать в ферментируемые сахара. Такой способ может называться осахариванием. Соответственно способ изобретения может давать в результате высвобождение одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из числа глюкозы, целлобиозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы.

Соответственно другой аспект изобретения включает способы, в которых используют композицию, описанную выше, вместе с дополнительными ферментами или физическими обработками, такими как температура и рН, для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды.

Хотя композиция обсуждалась в качестве отдельной смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, при этом температура, рН и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае для ферментной смеси могут быть определены оптимальные рН и температура.

Ферменты взаимодействуют с субстратом при любых соответствующих условиях. Например, ферменты можно инкубировать при температуре около 25, около 30, около 35, около 37, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90°С или выше. То есть они могут инкубироваться при температуре от около 20 до около 95°С, например, в буферах с ионной силой от низкой до средней и/или при рН от низкого до нейтрального. Под средней ионной силой понимается буфер, который имеет концентрацию ионов около 200 мМ или менее для какого-либо одного ионного компонента. рН может быть в диапазоне от около 2,5, около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5, около 5,5, около 6, около 6,5, около 7, около 7,5, около 8,0, до около 8,5 рН. Как правило, диапазон рН будет от около 3,0 до около 7. Для получения этанола предпочтительна кислая среда, например рН 4, тогда как при выработке биогаза желательно нейтральное значение рН 7. Инкубация комбинаций ферментов в этих условиях в результате дает высвобождение или освобождение значительных количеств

- 13 023945 сахара из лигноцеллюлозного материала. Под значительным количеством понимается по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или большее количество сахаров.

Полипептиды, такие как ферменты, могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае ферменты продуцируют, но не выделяют, а ферментационную среду с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и т.п. добавляют, например, в сырье. В ином случае сырая клеточная масса, среда для продукции фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением противомикробных средств), а затем добавлены в сырье. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Также растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье.

Ферментация сахаров.

Поддающиеся ферментации сахара могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, не ограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. В частности, сахара могут быть использованы в качестве сырья для ферментации в химические вещества, пластики, такие как, например, янтарная кислота и (био)топливо, включая этанол, метанол, бутанол, синтетические жидкие топлива и биогаз.

Например, в способе изобретения фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллюлозный субстрат или на растительную биомассу, выступающую в качестве сырья, с тем чтобы преобразовать этот сложный субстрат в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или других полезных продуктов ферментации.

Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, которые включают, без ограничения перечисленным, аминокислоты, витамины, лекарства, кормовые добавки для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, этанол, включая топливный этанол.

Соответственно в изобретении предлагается способ получения продукта ферментации, который включает:

a. деградацию лигноцеллюлозы с помощью способа, описанного в данном документе; и

b. ферментации полученного материала, с получением посредством этого продукта ферментации.

Такая ферментация может быть проведена в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно, если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом.

Способ анаэробного сбраживания здесь определен как способ сбраживания, запускаемый в отсутствие кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем около 5, около 2,5 или около 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов, так и акцепторами электронов.

Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также актуальными свойствами перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет, по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.

Способ получения продукта ферментации может необязательно включать извлечение продукта ферментации.

Ферментация с одновременным осахариванием.

Также ферментация и осахаривание могут быть осуществлены в режиме ферментации с одновременным осахариванием (англ. δίιηιιΐΐαηοοιίδ §асскапйсайои Регтейайоп, δδΡ). Одно из преимуществ этого режима заключается в уменьшении ингибирования сахарами ферментативного гидролиза (ингибирование сахарами целлюлаз описано Сат1па1 В&В Уо1 XXVII Рр 1282-1290).

Продукты ферментации.

Продукты ферментации, которые могут быть получены в соответствии с изобретением, включают аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту, этанол, включая топливный этанол (под термином этанол понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды).

Конкретные ценные продукты, которые могут быть получены способами изобретения, включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту;

- 14 023945 пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидрокси-пропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропан-диол; этилен, глицерин; растворитель; добавку для питания животных, лекарство, такое как β-лактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспарагиновую кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы, и химическое сырье.

Биогаз.

В изобретении также предлагается применение описанных в данном документе полипептида или композиции в способе получения биогаза. Биогаз, как правило, относится, к газу, продуцируемому при биологическом разложении органического материала, например материала, содержащего некрахмальный углевод, в отсутствие кислорода. Биогаз образуется из биогенного материала и является типом биотоплива. Один тип биогаза вырабатывается при анаэробном расщеплении или ферментации биодеградируемых материалов, таких как биомасса, навоз, силос или сточные воды, бытовые отходы или энергетические культуры. Этот тип биогаза содержит главным образом метан и диоксид углерода. Г аз метан можно сжигать или окислять кислородом. Воздух содержит 21% кислорода. Это высвобождение энергии позволяет использовать биогаз в качестве топлива. Биогаз можно использовать в качестве дешевого топлива в любой стране для любых целей нагревания, таких как приготовление пищи. Он также может быть использован в современных предприятиях по переработке отходов, где он может быть использован для функционирования любого типа тепловых машин, для образования либо механической, либо электрической энергии.

Первая стадия при производстве микробного биогаза состоит в ферментативной деградации полимеров и сложных субстратов (например, некрахмального углевода). Соответственно в изобретении предлагается способ получения биогаза, в котором субстрат, содержащий некрахмальный углевод, контактирует с полипептидом или композицией изобретения, что приводит к получению ферментируемого материала, который может быть преобразован в биогаз организмом, таким как микроорганизм. В таком способе полипептид изобретения может быть предоставлен, к примеру, организмом, например микроорганизмом, который экспрессирует такой полипептид.

Применение ферментов в пищевых продуктах.

Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы в способе обработки растительного материала для деградации или модификации целлюлозных и/или гемицеллюлозных или пектиновых составляющих клеточных стенок растительного или грибного материала. Такие способы могут быть полезны при получении пищевых продуктов. Соответственно в изобретении предлагается способ получения пищевого продукта, который включает введение полипептида или композиции изобретения в ходе приготовления пищевого продукта.

В изобретении также предлагается способ обработки растительного материала, который включает контакт растительного материала с полипептидом или композицией изобретения для деградации или модификации целлюлозы в (растительном) материале. Предпочтительным растительным материалом является растительная пульпа или растительный экстракт, такой как соки.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости, прозрачности и/или фильтруемости растительного экстракта, который включает контакт растительного экстракта с полипептидом или композицией изобретения в количестве, эффективном при деградации целлюлозы или гемицеллюлозы или пектиновых веществ, содержащихся в растительном экстракте.

Растительные материалы и материалы, содержащие целлюлозу/гемицеллюлозу/пектиновые вещества, включают растительную пульпу, части растений и растительные экстракты. В контексте этого изобретения экстракт из растительного материала является любым веществом, которое может быть получено из растительного материала экстракцией (механической и/или химической), обработкой или другими методами разделения. Экстрактом может быть сок, нектар, основа или концентраты, сделанные из них. Растительный материал может содержать или может быть получен из овощей, например из моркови, сельдерея, лука, бобов или растений семейства бобовых (сои, соевого боба, гороха) или фруктов, например мясистого семечкового плода или семечкового плода (например, яблока, груши, айвы и т.п.), винограда, помидора, цитрусовых (апельсина, лимона, лайма, мандарина), дыни, сливы, вишни, черной смородины, красной смородины, малины, клубники, клюквы, ананаса и других тропических фруктов, деревьев и их частей (например, пыльцы, из сосны), или зерновых (овса, ячменя, пшеницы, кукурузы, риса). Материал (подвергаемый гидролизу) также может быть отходами сельского хозяйства, такими как жом сахарной свеклы, стержни кукурузных початков, пшеничная, солома, скорлупа (земляного) ореха, или перерабатываемыми материалами, например макулатурой.

Полипептиды изобретения, таким образом, можно применять при обработке растительного материала, включая растительную пульпу и растительные экстракты. Они также могут быть использованы для обработки жидких или твердых пищевых продуктов или съедобных ингредиентов пищевых продуктов или могут быть использованы при экстракции кофе, растительных масел, крахмала или в качестве загустителя в продуктах питания.

- 15 023945

Как правило, полипептиды изобретения используют в качестве композиции/ферментного препарата как описано выше. Композиция будет, в целом, добавляться к растительной пульпе, получаемой, например, механической обработкой, такой как дробление или перемалывание растительного материала. Инкубация композиции с растением, как правило, будет проводиться в течение от 10 мин до 5 ч, например от 30 мин до 2 ч, предпочтительно в течение около 1 ч. Температура обработки предпочтительно составляет от около 10 до около 55°С, например от около 15 до около 25°С, оптимально около 20, и можно использовать от около 10 до около 300 г, предпочтительно от около 30 до около 70 г, оптимально около 50 г фермента на тонну обрабатываемого материала.

Все используемые ферменты или их композиции могут быть добавлены в растительную пульпу последовательно или одновременно. В зависимости от композиции ферментного препарата растительный материал вначале может быть мацерирован (например, до однородности) или ожижен. С помощью полипептидов изобретения могут быть улучшены параметры обработки, такие как выход экстракции, вязкость экстракта и/или качество экстракта.

В ином случае или в дополнение к вышеуказанному полипептид изобретения может быть добавлен к сырому соку, полученному прессованием или ожижением растительной пульпы. Обработка сырого сока будет проводиться так же, как и обработка растительного жома, при соответствующих дозировке, температуре и времени выдержки. С другой стороны, могут быть добавлены ферменты, такие как те, что обсуждались ранее. Типичными условиями инкубации являются те, которые описаны в предшествующих абзацах.

Для получения конечного продукта после инкубации сырого сока с полипептидами изобретения сок центрифугируют или (ультра)фильтруют.

После обработки полипептидом изобретения (конечный) продукт может быть обработан термически, например, при около 100°С в течение времени от около 1 мин до около 1 ч, в условиях частично или полностью инактивирующих полипептид(ы) изобретения.

Композиция, содержащая полипептид изобретения, также может быть использована в ходе приготовления фруктовых или овощных пюре.

Полипептид изобретения также может быть использован в пивоварении, изготовлении вина, перегонке или выпечке. Полипептид, следовательно, может быть использован при получении алкогольных напитков, таких как вино и пиво. Например, полипептид может улучшить фильтруемость или прозрачность, например, пива, сусла (например, содержащего ячменный солод и/или солод из сорго) или вина.

Более того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке использованного при пивоварении зерна, т.е. остатки изготовления пивного сусла, содержащие ячмень или осоложенный ячмень или другие зерновые, с тем чтобы улучшить утилизацию остатков, например, для животных кормов.

Белок может оказывать содействие при удалении растворенных органических веществ из питательной среды или культуральной среды, например, когда отходы перегонки органического происхождения биоконвертируют в микробную биомассу. Полипептид изобретения может улучшить фильтруемость и/или снизить вязкость сиропов глюкозы, таких как те, что получают из зерновых ожижением (например, с помощью α-амилазы).

При выпечке полипептид может улучшить структуру теста, модифицировать его липкость или податливость, улучшить объем буханки и/или структуру мякиша или придать улучшенные текстурные характеристики, такие как разлом, разрезание или качество мякиша.

Приготовление теста хорошо известно в данной области и включает смешивание указанных ингредиентов и технологических добавок в одной или в нескольких стадиях из числа стадий разделывания и, необязательно, ферментации. Приготовление замороженного теста описана Ки1р и Богеп/ в Рго/еп апб ВеГпдега1еб ИоидЬк апб Вабегк.

Некрахмальные полисахариды (англ. Ыоп-Цагсй роккассНапбек, ΝδΡ) могут повысить вязкость дигесты, которая, в свою очередь, может снизить доступность питательных веществ и ухудшить физиологическое состояние животного. Применение целлобиогидролазы настоящего изобретения может улучшить использование фосфора, а также катионов минеральных веществ и белка в ходе переваривания животным.

Добавление конкретных питательных веществ к корму улучшает пищеварение животного и, тем самым, снижает стоимость кормов. В настоящее время используется множество пищевых добавок, и постоянно разрабатываются новые концепции. Применение конкретных ферментов, подобных ферментам, деградирующим некрахмальные углеводы, может уменьшить энергию высвобождения волокон, а также увеличить перевариваемость полипептидов из-за лучшей доступности полипептида при разрушении волокон. Таким образом, стоимость корма может упасть, а также в корме могут быть снижены уровни полипептидов.

Некрахмальные полисахариды (англ. №п-к1агсН ро1укассйапбек, ΝδΡ) также присутствуют практически во всех ингредиентах корма растительного происхождения. ΝδΡ являются плохо усваиваемыми и могут при солюбилизации проявлять при переваривании побочные эффекты. Экзогенные ферменты могут внести вклад в улучшенную утилизацию этих ΝδΡ и, как следствие, могут уменьшить любые антипи- 16 023945 тательные эффекты. Ферменты настоящего изобретения, деградирующие некрахмальные углеводы, могут быть использованы для этой цели в диетах на основе дробленого зерна для домашней птицы и в меньшей степени для свиней и других видов.

Полипетид/фермент изобретения, деградирующий некрахмальные углеводы (композиция, содержащая полипептид/фермент изобретения), может быть использован в промышленности при изготовлении детергентов, например для удаления пятен на основе углеводов с белья при стирке. Детергентная композиция может содержать полипептид/фермент изобретения и, кроме того, одну или несколько целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ, протеаз, липаз, кутиназ, амилаз или карбогидраз.

Применение ферментов в детергентных композициях.

Детергентная композиция, содержащая полипептид или композицию изобретения, может находиться в любом обычном виде, например в виде пасты, геля, порошка или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, как правило, содержать вплоть до около 70% воды и от около 0 до около 30% органического растворителя или неводного материала.

Такая детергентная композиция, может быть, например, составлена в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, включая композицию для добавок для стирки, подходящую для предварительной обработки окрашенной ткани и отмывки добавленной композиции смягчителя ткани, или может быть составлена в качестве детергентой композиции для применения в обычных операциях бытовой очистки твердых поверхностей, или составлена для операций ручной или машинной мойки посуды. В целом, свойства фермента должны быть сравнимыми со свойствами выбранного детергента (например, оптимум рН, совместимость с другими ферментными и/или неферментными ингредиентами и т.п.), и фермент(ы) должен присутствовать в эффективном количестве.

Детергентная композиция может содержать поверхностно-активное вещество, например анионное или неионное поверхностно-активное вещество, детергентный наполнитель или комплексообразующий агент, один или несколько полимеров, отбеливающую систему (например, источник Н₂О₂) или стабилизатор ферментов. Детергентная композиция также может содержать любой обычный детергентный ингредиент, такой как, например, кондиционер, включая глину, пенообразователь, супрессор стойкой пены, антикоррозийное средство, средство, суспендирующее почву, средство против повторного осаждения почвы, краску, бактерицид, оптический отбеливатель, гидротропы, ингибитор потускнения или отдушку.

Применение ферментов при обработке пульпы и бумаги.

Полипептид или композиция настоящего изобретения могут быть использованы в целлюлознобумажной промышленности, помимо прочего в процессе отбеливания для усиления белизны отбеленной пульпы, в связи с чем может быть снижено количество хлора, используемого в стадиях отбеливания, и для увеличения садкости пульпы в способе получения бумаги вторичной переработки (Епк^оп, К. Е. Ь., \Уооб 8с1епсе апб Тес1по1оду 24 (1990):79-101; Раюе, е! а1., Бю1есЬпо1. апб Вюепд. 32 (1988):235-239 и Ротписг е! а1., Тарр1 1оигпа1 (1989): 187-191). Кроме того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке лигноцеллюлозной пульпы для улучшения ее белимости. Таким образом, количество хлора, необходимого для получения удовлетворительного отбеливания пульпы, может быть снижено.

Полипептид или композиция изобретения могут быть использованы в способе уменьшения скорости, при которой целлюлозосодержащая ткань становится шершавой, или уменьшения шероховатости целлюлозосодержащей ткани, способ включающий обработку целлюлозосодержащей ткани с полипептидом или композицией, как описано выше. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обеспечения осветления окраски окрашенной целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку окрашенной целлюлозосодержащей ткани полипептидом или композицией, как описано выше, и к способу локального изменения цвета окрашенной целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку окрашенной целлюлозосодержащей ткани полипептидом или композицией, как описано выше. Способы изобретения могут быть осуществлены путем обработки целлюлозосодержащей ткани в ходе отмывки. Однако, при необходимости обработка ткани также может быть проведена в ходе замачивания или полоскания или просто путем добавления полипептида или композиции, описанных выше, к воде, в которую погружена или будет погружена ткань.

Другие применения ферментов.

Кроме того, полипептид или композиция настоящего изобретения также могут быть использованы в противобактериальном составе, а также в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Примеры.

Материалы и методы.

Манипуляции с ДНК.

Стандартные процедуры с ДНК проводили как описано в других источниках (8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг с1отпд: а 1аЬога!огу тапиа1, 2^пб Еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, Со1б 8рппд НагЬог, №\ν Уогк), если не указано иное. ДНК амплифицировали с помощью фермента с корректирующей активностью Р1ш5юп ро1утега8е (Етп/утеМ Ферменты рестрикции были приобретены у Тпубтодеп или

- 17 023945

Νονν Епд1ап4 Вю1аЪ8.

Были разработаны мутанты, содержащие мутации в положениях 6, 7, 34, 36, 41, 47, 48, 52, 77, 99, 101, 144, 171, 177, 192, 194, 195, 196, 198, 200, 205, 232, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 337, 343, 344, 346, 350, 367, 372, 375, 376, 393 и 396 в СВН-Ι. Соответствующие гены с оптимизированными кодонами, которые экспрессируют мутантную СВН, были получены синтетически.

С помощью стандартных процедур работы с ДНК для каждого из положений, указанных выше, кодон был рандомизирован и было протестировано около 96 клонов, покрывая около 15-17 различных аминокислот. Гены, соответствующие мутантам СВН, трансформировали в А. шдег. В целях получения экспрессии мутантов настолько однообразно, насколько это возможно, как вектор, так и протоколы трансформации оптимизировали, для того чтобы направить интеграцию в предпочтительные локусы, которые минимизируют шанс случайной интеграции, а также внедрения множества генов.

Способ определения белка СВН-Ι.

Количество СВН-Ι оценивали с помощью ЖХ-МС с использованием экспериментальной процедуры, адаптированной из способа АЪ8о1и!е Оиапййсайоп (АОИА) (СегЪег М.ТО. е1 а1. 2003, АЪ8о1и!е циапййсайоп ой рго1еи15 ап4 рйо8рЬорго1еш8 йот се11 1у§а1е8 Ъу 1ап4ет М8, ΡΝΛ8 100, р 6940-6945). Синтетический внутренний стандарт ΕΥΕΕΟΌΌΕΤΥΟΙ*ΡΚ.ΕΕΝΚ, содержащий стабильные тяжелые изотопы, использовали для количественной оценки и разработки способа. Стандарт был приведен к масштабу количественной оценки ЯМР перед экспериментами для гарантии того, что было добавлено корректное абсолютное количество внутреннего стандарта. Оптимизацию способа осуществляли с помощью надосадочной жидкости штамма, экспрессирующего СВН-Ι дикого типа, в которую был внесен внутренний стандарт. Протокол гидролиза оптимизировали, основываясь на участке расщепления трипсином, включенном во внутренний стандарт, отслеживая негидролизованную и гидролизованную версии внутреннего стандарта.

Образцы мутантной СВН-Ι обрабатывали в новых микротитрационных планшетах с низким связыванием. Для очистки белка осуществляли осаждение ТХУ. БСА добавляли для улучшения осаждения белка. Осажденный белок собирали центрифугированием и удаляли надосадочную жидкость. Осадки белка солюбилизировали в 8М мочевине, содержащей внутренний стандарт. Образцы разводили <2М мочевиной с NН₄НСΟз и добавляли трипсин для протеолитического гидролиза.

Образцы анализировали с помощью АссеЛ-ЬТО-ОгЪйгар. Количественную оценку осуществляли путем определения соотношения ЖХ-МС-площади пептида СВН-Ι или мутантов СВН-Ι и ЖХ-МСплощади внутреннего стандарта.

Способ определения активности СВН-Ι.

Все мутанты СВН подвергали скринингу на активность на отмытой предварительно обработанной кислотой пшеничной соломе при 2% сух. вещ. в ацетатном буфере при рН 4,5, в комбинации с фиксированным количеством бета-глюкозидазы. Бета-глюкозидаза, которая была использована в смеси, происходит из Та1аготусе8 етегкоий и была экспрессирована в АкрегдШик шдег. Концентрированные фильтраты ферментов получали как описано в ТОО 2004/030468. После выращивания АкрегдШик шдег, содержащего соответствующие экспрессирующие плазмиды, центрифугированием ферментационной питательной среды при 5000/д в течение 30 мин при 4°С были получены бесклеточные надосадочные жидкости. Необязательно надосадочная жидкость может быть скорректирована до рН 5 с помощью 4Ν КОН и может быть отфильтрована стерильно через 2цт (Ьо111е-1ор) фильтр аспирацией для удаления какого-либо материала грибов. Кроме того, надосадочные жидкости могут быть отфильтрованы через фильтр СР/А ТОИаНпапп С1а88 тюгойЪег (150 мм 0) для удаления частиц любого рода. Надосадочные жидкости можно концентрировать и хранить до использования при 4°С или замораживать при -20°С.

Количество ВС и СВН-Ι в этом анализе скрининга составляло 2-3 мг бета-глюкозидазы на г сухого вещества пшеничной соломы и 1-2 г СВН-Ι на г сухого вещества пшеничной соломы. Инкубации проводили при 65°С в течение периода времени от 4 до 96 ч.

Альтернативный способ мог бы заключаться в тестировании СВН-Ι в смеси с ВС, ЕС и СВН-ΙΙ, где диапазоны различных ферментов могут быть выбраны следующим образом: ВС 4-12%, ЕС 18-50%, СВН-ΙΙ 10-35%, а СВН-Ι 10-60% от общего количества белка 10 мг на грамм сухого вещества пшеничной соломы. Инкубации проводили в период времени в диапазоне от 4 до 96 ч и сравнивались с холостой пробой в начале инкубации. Реакции останавливали в заданный период времени путем осаждения остатка, пипетирования надосадочной жидкости и замораживания образца до анализа. Способ скрининга улучшенных вариантов не ограничен анализами, представленными выше. Субстрат может быть различного происхождения. Способ проводимой предварительной обработки может отличаться. Условия анализов могут варьировать, например осахаривание при различных рН или при другой температуре. Кроме того, природа ВС, ЕС и СВН-ΙΙ может быть изменена, также как анализ может содержать один, два или три класса целлюлаз, например одну, две или все из числа эндо-1,4-β-глюканазы (ЕС), экзоцеллобиогидролазы (СВН) и β -глюкозидазы (ВС). Кроме того, могут быть добавлены дополнительные вспомогательные ферменты, такие как, например, гемицеллюлазы и/или пектиназы. Анализ устроен таким образом, чтобы целевой фермент для улучшения являлся ограничивающим фактором по отношению

- 18 023945 к эффективности.

Анализ осуществляли с помощью проточного ЯМР. ¹Н ЯМР-спектры записывали на ЯМРспектрофотометре Вгикег ЛУЛЫСЕ II ВЕ8Т ΝΜΚ зуз1еш, работающем при протонной частоте 500 МГц и температуре зонда 27°С.

Мутанты, демонстрирующие наиболее высокое значение высвобождения глюкозы и/или целлобиозы, отбирали для дальнейшего описания.

Альтернативный способ скрининга мутантов заключался в инкубации надосадочных жидкостей с искусственным субстратом, таким как пара-интрофенол-бета-целлобиозид, как описано в Ктейс рагате!егз апб шобе о!' асйоп о!' 1йе се11оЫойу0го1азез ргобисеб Ьу Та1атотусез ешетзопп, ВюсЫшюа е! ВюрЬузюа Лс!а 1596 (2002):366-380.

Пример 1. Активность мутантов СВН-1 на ρΝΡ-целлобиозиде.

Количество белка СВН-1 в фильтрованной надосадочной жидкости ферментаций в перемешиваемых колбах трансформантов, экспрессирующих СВН-1 (ЕВА205 и мутанты), определяли с помощью ЖХ-МС.

Инкубировали образцы, содержащие 0,02 мг/мл белка СВН-1, 3 мМ ρΝΡ-целлобиозид и 1 мМ глюконолактон, при 65°С, рН 4,5 в течение 10 и 30 мин.

Из таблицы ясно, что активность мутантов СВН-1 была выше как при измерении через 10 мин, так и при измерении через 30 мин.

Таблица 1

Активность мутантов СВН-1 на ρΝΡ-целлобиозиде (ед./мг).

ед. является количеством фермента, способного высвободить 1 мкмоль ρΝΡ в мин/мл в условиях анализа

	Активность СВН1 (Ед./мг) 10 мин.	Активность СВН1 (Ед./мг) 30 мин.
ЕВА205	0,47	100	0,45	100
Ν247Ρ	0,58	123	0,52	116
Ό77Μ	0,60	128	0,52	116
Ν247Η	0,82	174	0,68	151
О357Е.	0,58	123	0,52	111
О232А	0,57	121	0,51	113
536Е	0,70	149	0,61	136
Κ163Ν	0,58	123	0,51	113
Ρ427Ι	0,61	130	0,57	127

Пример 2. Активность мутантов СВН-1 на предварительно обработанной пшеничной соломе.

Количество белка СВН-1 в фильтрованной надосадочной жидкости, полученной ферментацией трансформантов, экспрессирующих СВН-1 (ЕВА205 и мутанты), в перемешиваемых колбах определяли с помощью ЖХ-МС.

Инкубировали образцы, содержащие 1,0 мг/мл белка СВН-1 при 65°С, рН 4.5 в течение 17 и 70 ч. Результаты в табл. 2 ясно демонстрируют, что мутанты СВН-1 лучше высвобождают глюкозу из предварительно обработанной пшеничной соломы.

Таблица 2

Активность мутантов СВН-1 в предварительно обработанной пшеничной соломе. Активность представлена в мМ глюкозы, высвобожденной во временные точки 17 и 20 ч

Пример 3. Дозозависимые соотношения мутантов СВН-1 в смеси целлюлаз.

Активность мутантов СВН-1 в смеси целлюлаз тестировали при различных дозах. Дозу мутанта, способного высвободить такое же количество глюкозы, что ЕВА205 в дозировке 1,5 и 3,0 мг/мл, определили и представили в табл. 3 и 4 соответственно.

Активность мутантов СВН-1 тестировали с ферментной смесью, содержащей ЕО, ВО и СВН-ΙΙ в соотношении 4,1:1:2,8. Ферментную смесь дозировали в концентрации 7,0 мг/г сух. вещ., и добавляли различные дозировки СВН-Ι.

Дозировка мутантов, способных высвободить такое же количество глюкозы, что и ЕВА205 в дозировке 1,5 и 3,0 мг/мл, определена и представлена в табл. 3 и 4.

В табл. 3 и 4 ясно показано, что мутанты СВН-Ι позволяют использовать СВН-Ι в смеси целлюлаз в низкой дозировке.

- 19 023945

Таблица 3

Доза мутанта СВН-Ι для достижения высвобождения глюкозы, сходного с высвобождением глюкозы ЕВА205 в концентрации 1,5 мг/г сух. вещ. в различные временные точки (н.о. - не определено)

	5 часов 12мМО1с	22 часа 27мМО1с	46 часов 37 мМО1с	70 ч 42мМО1с
ЕВА205	1,5	1,5	1,5	1,5
Ν247Ρ	0,9	1,2	1,3	Ы
О77М	0,8	1,1	1,3	2,0
Ν247Η	0,6	0,9	1,0	Н.О.
О357К.	0,8	1,0	1,2	1,4
О232А	1,0	1,3	1,2	1,2
836Е	0,8	1,0	1,0	Н.О.
Κ163Ν	0,7	1,6	Н.О.	Н.О.
Ρ427Ι	0,7	1,4	1,4	Н.О.

Таблица 4

Доза мутанта СВН-Ι для получения высвобождения глюкозы сходного с высвобождением глюкозы ЕВА205 в концентрации 3,0 мг/г сух. вещ. в различные временные точки (н.о. - не определено)

	5 часов 15мМО1с	22 часа 29 мМ О1с	46 часов 39 мМ О1с	70 ч 45 мМ 01с
ЕВА205	3,0	3,0	3,0	3,0
Ν247Ρ	Н.О.	1,5	1,8	1,8
Б77М	2,3	1,4	1,9	2,3
Ν247Η	1,4	1,2	1,6	Н.О.
О357К.	1,7	1,3	1,6	н.о.
О232А	2,1	2,3	1,4	2,3
836Е	1,7	1,5	Н.О.	Н.О,
Κ163Ν	1,9	2,0	2,2	н.о.
Ρ427Ι	1,6	2,0	Н.О.	н.о.

Список последовательностей <110> РЗМ ΙΡ АЗЗбХЗ в.у.

<120> ΜΙΓΓΑΝΤ СЕЬЬОВЮНУОКОЬАЗЕ <130> 28004-МО-РСТ <160> 3 <170> Рагеппп νβτδίοη 3.5 <210> 1 <211> 437 <212> РКТ <213> Та!аготусез етегзоп'Н <400> 1 с1п с1п д!а с!у ТЬг А1а тЬг А1а с!и азп нтз рго рго ьеи ТЬг тгр 15 10 15

С1п С1и Суз тЬг А1а Рго С1у 5ег Суз тЬг тЬг с1п Азп с!у А1а Уа! 20 25 30

Уа1 ьеи Азр Зег азп тгр Агд тгр Уа! нтз Азп Уа1 с!у е1у Туг ТЬг 35 40 45

Азп Суз Туг тЬг с!у Азп тЬг Тгр Азп рго тЬг Туг Суз Рго Азр Азр 50 55 60

Уа! тЬг Суз А1а с!и Азп Суз А1а 1-еи Азр С1у А1а Азр Туг с1и с!у 65 70 75 80 тЬг Туг с!у Уа! тЬг Зег зег с!у 5ег с!и ьеи Агд ьеи Азп РЬе Уа1 85 90 95

ТЬг 01у зег Азп Уа1 С1у зег Агд ьеи туг ьеи ьеи е!п Азр Азр с1и 100 105 110

ТЬг Туг с!п 11е РЬе 1-уз ьеи Ьеи Азп Агд О1и РЬе тЬг РЬе Азр Уа! 115 120 125

Азр Уа1 зег Азп ьеи Рго Суз с!у Ьеи Азп с!у А1а ьеи туг РЬе Уа! 130 135 140

А1а мех Азр А1а Азр с!у е!у Уа1 зег ьуз туг Рго Азп Азп ьуз А1а 145 150 155 160 с!у А!а ьуз Туг с!у тЬг с!у Туг Суз Азр Зег е!п Суз Рго Агд Азр 165 170 175

Ьеи Ьуз РЬе 11е Азр о!у с!и С1у Азп Уа1 б!и С1у тгр 01п Рго Зег 180 185 190

Зег Азп Азп А1а Азп ТЬг С1у 11е с!у Азр Нтз с!у Зег Суз Суз А1а

195 200 205

С1и Мег Азр Уа1 тгр С1и А1а Азп зег 11е 5ег Азп А1а Уа1 тЬг Рго 210 215 220

НТ5 РГО Суз Азр тЬг РГО С1у С1п ТЬг Мег Суз Азр С1у Азр Азр Суз 225 230 235 240 б1у сТу тЬг Туг зег тЬг Азп Агд Туг А1а с1у с1и Суз Азр Рго Азр 245 250 255

С1у суз Азр РЬе Азп Рго туг Агд мет б1у Азп тЬг зег РЬе туг бТу 260 265 270

Рго С1у |_уз 11е Пе Азр тЬг тЬг с1п Рго РЬе тЬг Уа1 Уа1 тЬг С1п 275 280 285

РЬе ьеи тЬг Азр Азр С1у тЬг Азр тЬг С1у тЬг кеи Зег б!и Пе ьуз 290 295 300

Агд РЬе Туг Не С1п Азп С1у Ьуз Уа1 Пе Рго С1п Рго Азп Зег Азр 305 310 315 320

Не Зег С1у Уа1 ТКг с1у Азп Зег Пе ТЬг тЬг С1и РЬе Суз ТЬг А1а 325 330 335 с1п ьуз б!п А1а РЬе с1у Азр ТЬг Авр Азр РЬе зег с1п нтз с1у с1у 340 345 350 ьеи АТа ьуз мет с!у А1а А1а мет с1п с!п с1у мет Уа1 ьеи Уа1 мет 355 360 365

Зег 1_еи тгр Азр Азр туг А1а А1а с1п мет 1_еи тгр |_еи Азр зег Азр 370 375 380

Туг Рго ТЬг азп А1а 5ег А1а тЬг тЬг Рго С1у уа1 А1а Агд с1у ТЬг 385 390 395 400

Суз Рго ТЬг Азр Зег С1у Уа1 Рго Зег СТп Уа1 С1и Зег с1п зег рго 405 410 415

Азп зег туг Уа1 тЬг туг 5ег Азп Пе куз РЬе с!у Рго Пе азп Зег 420 425 430 тЬг РЬе ТЬг А1а зег 435 <210> 2 <211> 18 <212> РКТ <213> таТаготусез етегзоптт <400> 2

Мет 1_еи Агд Агд А1а Ьеи Ьеи кеи Зег Зег Зег А1а Пе кеи А1а Уа1 15 10 15

Ьуз А1а <210> 3 <211> 1368 <212> ΡΝΑ <213> ΑΓΐιΐτοτβΙ зециепсе <220>

<223> Ο0ΝΑ <400> 3 атдстссдсс дтдстсттст дстдадсадс тстдссатсс тддссдтсаа ддсссадсад 60 дстддтастд ссастдстда даассассст сссттдасст ддсаддадтд састдстсст 120 ддттсстдса ссастсадаа сддтдстдтт дтссттдаса дсаастддад атдддттсас 180 аасдтсддтд дттасассаа стдстасаст ддсаасасст ддаассссас стастдсссс 240 датдатдтса сстдсдстда даастдсдст сттдасддтд ссдастасда дддтасстас 300 ддтдтсастт сттстддстс тдадстссдт стдаасттсд тсассддсад саасдтсддс 360 тстсдтстст асстсстсса ддатдасдад асстассада тсттсаадст сстсаассдт 420 дадттсасст тсдатдттда тдтстссаас сттссттдсд дтстдаасдд тдстстдтас 480 ттсдтсдсса тддатдссда сддтддтдтс тссаадтасс ссаасаасаа ддссддтдсс 540 аадтасддта стддстастд сдасадссад тдсссссдтд асстсаадтт саттдасддс 600 дадддсаасд тсдадддстд дсадссстсс тссаасаасд ссаасастдд татсддтдас 660 сасддстстт дстдсдстда датддатдтс тдддаддсса астссатстс саасдссдтс 720 ассссссасс сттдсдасас ссссддссад ассатдтдсд атддтдатда стдсддтддт 780 асстастсса ссаассдста сдссддтдад тдсдассссд атддстдсда сттсаасссс 840 тассдсатдд дсаасасстс сттстасддс сстддсаада тсаттдасас сасссадссс 900 ттсассдттд тсасссадтт сстдассдат дасддсассд асастддтас сстстссдад 960 атсаадсдст тстасатсса даасддсаад дтсатссссс адсссаастс сдасатстсс 1020 ддтдтсассд дсаастссат сассастдад ттстдсастд стсадаадса ддстттсддт 1080 дасассдатд асттстссса дсасддтддт сттдссаада тдддтдстдс сатдсадсад 1140 ддтатддтсс тддтсатдтс сстстдддат дастасдстд стсадатдст стддстсдас 1200 тссдастасс ссассаасдс стссдссасс астсстддтд ттдстсдтдд тасстдсссс 1260 ассдастстд дтдттсстад ссаддттдад адссадтссс ссаастсста сдтдасстас 1320 тссаасатса адттсддтсс сатсаастсс ассттсастд сатсдтаа 1368

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом ЗЕС) II) N0:1, содержащая замену в положении Ν247(Ι,Η,Ν,Α) согласно ЗЕР ГО N0:1, при этом целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности ЗЕС) ГО N0:1 и обладает активностью СВН-1.
2. 2. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N2471'.
3. 3. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N24711.
4. 4. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-3, в которой СВН-Ι имеет аминокислотную последовательность, приведенную в ЗЕС) ΙΟ N0:1, а указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа Р427, К163, 0357, З36, 077 и/или Р232.
5. 5. Мутантная целлобиогидролаза по п.4, которая содержит одну или несколько из следующих замен: Ρ427Ι, К163У Θ357Κ, З36Е, О77М и/или р232А.
6. 6. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-5, где СВН-Ι имеет аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕС) II) N0:1, и указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким из числа остатков Т52, У101, З192, Т198, Т246, Т344, Ώ346, А375 и/или А376.
7. 7. Мутантная целлобиогидролаза по п.6, которая содержит одну или несколько из числа следующих

   - 21 023945 замен: Т52(0,М,УЛН,К,К), V101(Т,I,Е,Н), 8192(АД,Е,р,Н), Т198(А,СА,Р,П,Н), Т246(0,Α,У,N,Н), Т344(А,8,С,ЬД,У,Ж Ό346(Ρ,Ε,0,Κ), А375(ОДЖУ,Н,К,К) и/или А376(Т/У,Ь,У,^,В).
8. 8. Мутантная целлобиогидролаза по п.7, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: Т52(МЛК), ν101(Ι,Ε), δ192Ε, Т198(А,Н), Т246Ы, Т344(У,С,Ь), Ό346(Κ,0), А375(У,Н) и/или А376(У,№).
9. 9. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: Т52П, ν101Ε, δ192Ε, Т198Н, Т246Ы, Т344У, Ό3460, А375У и/или А376У.
10. 10. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-9, которая содержит одну или несколько или делеций в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, Ь34, У41,У47, Т48, δ99, ν144, δ171, Ь177, N194, N195, А196, Ι200, δ205, Т243, У244, δ245, У249, Р255, Ц337, Ό343, Н350, ν367, Ό372, Т393 и/или ν396.
11. 11. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, содержащая замену С, Р, О, А, ν, Ь, Ι, М, Е, У, Н, δ, Т, N О- Ό, Е, К, К или делецию в любом из положений.
12. 12. Полинуклеотид, кодирующий мутантную целлобиогидролазу по любому из пп.1-11.
13. 13. Нуклеотидная конструкция, содержащая полинуклеотид по п.12.
14. 14. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеотидной конструкцией по п.13.
15. 15. Способ получения мутантной СВН, включающий стадии:

    (a) культивирования трансформированной клетки-хозяина по п.14 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для получения мутантной целлобиогидролазы;

    (b) получения указанной продуцируемой мутантной целлобиогидролазы; и при необходимости (c) очистки указанной мутантной целлобиогидролазы для получения очищенной мутантной целлобиогидролазы.
16. 16. Ферментная композиция, содержащая одну или несколько мутантных целлобиогидролаз по любому из пп.1-11 или полученная согласно способу по п.15.
17. 17. Способ деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный или гемицеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией по п.16.
18. 18. Способ по п.17, в котором вырабатывается один или несколько сахаров.
19. 19. Способ по п.18, в котором выработанный сахар ферментируют для получения продукта ферментации.
20. 20. Способ по п.19, в котором продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластика, органической кислоты, растворителя, добавки к кормам для животных, фармацевтического препарата, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.