CN103348005A - 突变体纤维二糖水解酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变体纤维二糖水解酶，其是SEQ ID NO:1的突变体、在SEQ ID NO:1的N247(I,F,H,W)位置处具有替换，其中所述突变体纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:1具有至少50%序列同一性，且其中所述突变体纤维二糖水解酶具有CBHI活性。

Description

突变体纤维二糖水解酶

技术领域

本发明涉及具有改进的CBHI活性的新颖的突变体纤维二糖水解酶和包含纤维二糖水解酶的组合物。具体地，本发明涉及来自真菌和细菌的纤维二糖水解酶家族，所述纤维二糖水解酶涉及具有某些突变的由Talaromyces emersonii产生的CBH-I。

发明背景

纤维素酶是能水解纤维素中的β-D-葡糖苷键的酶。纤维素水解酶在传统上已被分为三个主要种类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶(Knowles,J.et al.,(1987),TIBTECH5,255-261)；并且已知由许多细菌、酵母和真菌产生。

已针对纤维素水解酶的用途开发的应用中主要是下述应用：包括将（木材）纤维素浆料降解成糖，用于（生物）乙醇生产、纺织品处理，比如“石洗”和“生物抛光”和用在去污剂组合物中的那些。

因此，已显示纤维素酶在许多工业过程中是有效的。因而，本领域中有一种趋势，寻找就一种或多种具体应用而言，具有特别有效的性能状况的具体的纤维素酶组合物或组分。在这种情况下，真菌和细菌中产生的(表达的)纤维素酶已成为关注的对象。例如，已对通过某些真菌比如Trichoderma spp.(尤其是Trichoderma longibrachiatum)产生的纤维素酶给予许多关注，因为能降解结晶形式的纤维素的完整纤维素酶体系容易通过发酵程序大量产生。已广泛地分析了这种具体的纤维素酶复合物，以测定其具体组分的特性和这些组分在工业过程中发挥作用的能力。例如，Wood et al.,"Methods in Enzymology",160,25,pages234et seq.(1988)公开了完整的真菌纤维素酶体系包含若干不同的酶种类，包括鉴定为外切-纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)("CBH")、内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)("EG")和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)("BG")的那些。可进一步扩展CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类，以在每个分类中包括多种组分。已提出了一些对CBH-I的遗传修饰。S.P.Voutilainen,P.G.Murray,M.G.Tuohy and A.Koivula,Protein Engineering,Design and Selection,pp.1-11,2009公开了Talaromyces emersonii纤维二糖水解酶CEL7A在Saccharomyces cerevisiae中的表达，以及改进其热稳定性和活性的合理诱变。在该公开中，突变体N54C/P191C显示了增加的热稳定性和改进的活性k_cat35.9min-1(表II)。但是，该活性仍然相对是低的。

WO2010/122141公开了来自Talararomyces emersonii的CBH-I和编码CBH-I的多核苷酸，以及并入这些多核苷酸的细胞。WO2010/122141中的CBH-I的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:1给出。

尽管本领域中有涉及在一些或所有上述领域中具有应用的许多纤维素酶组合物的知识，但是持续需求在木质纤维素转化条件下具有改进的活性的新颖的纤维素酶组合物。因此，需要改进单独的或与其他纤维素酶组合的现有的CBH-I活性。

发明内容

本发明的一个目的是提供具有改进的CBHI活性的新颖变体CBH-I或CBH-I-样纤维素酶组合物。

如实施例中所述测量CBHI活性。本发明的另一目的是提供在热应力条件下具有改进的性能的新颖变体CBH-I或CBH-I-样纤维素酶组合物。

本发明的另一目的是提供含新颖变体CBH-I或CBH-I-样纤维素酶的组合物，其在生物材料，比如木质纤维素的降解中提供优良性能。

本发明的另一目的是提供对生物质减少而言具有改进特征的新颖变体CBH-I或CBH-I-样纤维素酶组合物，其在动物饲料、淀粉处理和烘焙应用中作为添加剂。

根据本发明实现了这些目的的一个或多个。根据本发明，提供了突变体纤维二糖水解酶，其是SEQ ID NO:1的突变体、在SEQ ID NO:1的N247(I,F,H,W)位置处有替换，其中所述突变体纤维二糖水解酶与SEQ IDNO:1具有至少50%序列同一性，并且其中突变体纤维二糖水解酶具有CBHI活性。

在一种实施方式中，突变体具有替换N247F。在另一种实施方式中，突变体具有替换N247H。

序列表简述

SEQ ID NO:1SEQ ID NO:1展示了来自Talaromyces emersonii的CBH-I的氨基酸序列，在WO2010/122141中命名为SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO:2SEQ ID NO:2展示了SEQ ID NO:1的纤维二糖水解酶的信号序列。

SEQ ID NO:3SEQ ID NO:3展示了CBH-I(EBA205)的DNA序列。

发明详述

在本说明书和所附权利要求书的通篇中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”（"comprises","comprising"）、“包括”（"includes"and"including"）应被解释为开放性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素或成分。冠词“一个”（“a”和“an”）在本文中被用于表示一个或多于一个（即一个或至少一个）所述冠词的语法客体。例如，“一个要素”可表示一个要素或多于一个要素。

根据本发明的突变体纤维二糖水解酶，是SEQ ID NO:1的突变体、在SEQ ID NO:1的N247(I,F,H,W)位置处具有替换，其中突变体纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:1具有至少50%序列同一性，并且其中所述突变体纤维二糖水解酶具有CBHI活性。

在一种实施方式中，突变体具有替换N247F。在另一种实施方式中，突变体具有替换N247H。

在另一实施方式中，CBH-I单独地或与先前提到的突变组合地在对应于一个或多个残基F445、K163、G357、S36、D77和/或Q232的位置处具有替换或缺失。在这些位置处的突变可以是C、P、G、A、V、L、I、M、F、W、Y、H、S、T、N、Q、D、E、K、R的替换或缺失。在其他实施方式中，突变体具有一个或多个下述替换：F445I、K163N、G357R、S36E、D77M和/或Q232A。

在另一种实施方式中，纤维二糖水解酶突变体具有单独的或与先前提到的突变组合的对应于SEQ ID NO:1的一个或多个残基T52、V101、S192、T198、T344、D346、A375或A376的位置处的替换或缺失。在这些位置处的突变可以是C、P、G、A、V、L、I、M、F、W、Y、H、S、T、N、Q、D、E、K、R的替换或缺失。在其他实施方式中，突变体具有一个或多个下述替换：T52(G,M,Y,D,H,K,R)、V101(T,I,F,H)、S192(A,I,F,Q,H)、T198(A,C,V,P,D,H)、T246(G,A,Y,N,H)、N247(I,F,W)、T344(A,S,C,L,I,Y,W)、D346(P,F,G,R)、A375(G,I,W,Y,H,K,R)和/或A376(T,V,L,Y,W,D)。在一种实施方式中，突变体具有一个或多个下述替换：T52(M,D,R)、V101(I,F)、S192F、T198A、N247F、T344(C,L)、A375(Y,H)，优选A375H和/或A376D。

在另一种实施方式中，纤维二糖水解酶突变体单独地或与先前提到的突变组合地在对应于一个或多个下述残基的位置处具有替换或缺失：A6、T7、L34、V41、Y47、T48、S99、V144、S171、L177、N194、N195、A196、I200、S205、T243、Y244、S245、Y249、P255、Q337、D343、H350、V367、D372、T393和/或V396。

本文中，纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)是能催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-葡糖苷键水解，从链的非还原末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶（1,4-β-cellobiosidase），1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶（avicelase），外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。“纤维二糖水解酶”在本文中被缩写为“CBH”。纤维二糖水解酶-I在本文中被缩写为“CBH-I”。“突变体纤维二糖水解酶”被缩写为“突变体CBH”或突变体。“突变体CBH多核苷酸”在本文中是编码突变体CBH的多核苷酸。

突变体CBH与SEQ ID NO:1具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

本文中，突变由单字母的氨基酸和这些氨基酸的位置表示。例如，本文中A6表示SEQ ID NO:1的某位置处的氨基酸(单字母代码)，这里A(丙氨酸)在蛋白质的第6位处。本文中A6(L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K)表示在某一位置处的氨基酸突变，这里蛋白质的第6位处的A(丙氨酸)被(亮氨酸)、N(天冬酰胺)、Q(谷酰胺)、G(甘氨酸)、V(缬氨酸)、I(异亮氨酸)、Y(酪氨酸)、S(丝氨酸)、E(谷氨酸)或K(赖氨酸)之任一个交换。

本发明的突变体CBH可具有除了纤维二糖水解酶活性之外的一种或多种替代性的和/或额外的活性，例如下文提到的其他纤维素酶活性之一。

根据本发明的突变体CBH可通过使碳水化合物材料化学改性或物理改性来改性碳水化合物材料。碳水化合物材料的化学改性可导致此类材料降解，这例如通过水解、氧化或其他化学改性，比如通过裂合酶的作用来实现。物理改性可伴有化学改性或可不伴有化学改性。

突变体可具有一种或多种下述酶活性或包含根据本发明的突变体CBH酶的酶组合物可包含一种或多种下述酶：

内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)和外切-纤维二糖水解酶(CBH，例如CBH-I或CBH-II)催化不溶性纤维素水解成为纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡萄糖苷酶(BG)将寡糖（主要是纤维二糖和纤维三糖）转化为葡萄糖。EG、CBH、BG、木聚糖酶和果胶酶酶活性可以是突变体CBH的活性或在包含突变体CBH的肽组合物的其他组分中存在的活性。

木聚糖酶与其他辅助酶（例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶）一起，催化半纤维素水解。

果胶酶例如为内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂合酶，果胶酸裂合酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶，α-阿拉伯呋喃糖苷酶。

如上文所述，本发明的突变体CBH典型地具有纤维二糖水解酶活性。然而，除了所述活性之外或替代所述活性，本发明的突变体CBH可具有一种或多种上文公开的活性。除了由具有纤维二糖水解酶活性的本发明纤维二糖水解酶突变体所提供的活性以外，本文所述的本发明的突变体CBH组合物还可具有一种或多种上文所述的活性，或者这些活性可在包含本发明的突变体CBH酶的酶组合物中存在。

多核苷酸序列

用本文中公开的突变体CBH及其氨基酸序列，技术人员可确定编码突变体CBH的合适的多核苷酸。

本发明因而提供了包含编码突变体CBH的基因及其编码序列的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是经分离的或合成的。合成的多核苷酸可使用市售的自动多核苷酸合成仪来制备。

本文中突变体CBH多肽和突变体CBH多核苷酸可以分别是合成的多肽、多核苷酸。优选地根据WO2006/077258和/或PCT/EP2007/055943中所述的方法，可在密码子使用中优化合成的多核苷酸，所述文献通过引用并入本文。PCT/EP2007/055943教导了密码子对优化。

术语提及多核苷酸分子，是指单链或双链的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)分子。多核苷酸可以以经分离的形式存在或可包含在重组核酸分子或载体中，或包含在宿主细胞中。

词语“多肽”在本文中使用表示含有多于七个氨基酸残基的链。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中以从左到右和从氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的氨基酸的单字母代码是本领域普遍已知的。

“分离的”多肽或蛋白质表示被从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，与通过任何合适的技术已基本纯化的天然或重组多肽一样，所述合适的技术例如Smith and Johnson,Gene67:31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。

可使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息，分离或合成本发明的多核苷酸，比如编码突变体CBH的多核苷酸。

可以使用cDNA、mRNA或者替代性地使用基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增编码本发明的突变体CBH的多核苷酸。可以将藉此扩增的核酸克隆进适当的载体中，并通过DNA序列分析来表征。

转化

根据本发明的多核苷酸可在合适的宿主中表达。因而可使用标准转化技术。

本发明还涉及包含如上面所述的多核苷酸的核酸构建体，例如载体。

本发明的另一方面因而涉及包含编码CBH蛋白质或其功能等同物的本发明的多核苷酸的载体，包括克隆载体和表达载体，还涉及在例如本发明CBH-I发生表达的条件下，在合适的宿主细胞中培养、转化或转染这类载体的方法。本文使用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

本发明的多核苷酸可以被掺入重组的可复制载体中，例如克隆或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中被回收。合适的宿主细胞在下文讨论。

本领域技术人员应当知道：对表达载体的设计可以以下述因素为基础，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。本发明的载体（例如表达载体）可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽（例如CBH蛋白质，CBH蛋白质的突变体形式，其片段、变体或功能等同物）。本发明的载体（例如重组表达载体）可以被设计用于在原核细胞和真核细胞中表达CBH蛋白质。

例如，CBH蛋白质可以在细菌细胞如E.coli、昆虫细胞（使用杆状病毒表达载体）、丝状真菌、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,Gene Expression Technology:methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中进一步讨论。适当宿主的代表性例子在下文中描述。

用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。

对大部分丝状真菌和酵母而言，载体或表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言还可获得合适的附加体载体，可以向其中并入表达构建体进行稳定和高水平的表达，其例子包括分别源自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKD1质粒的载体，或含有AMA序列（例如来自Aspergillus的AMA1）的载体。将表达构建体整合进宿主细胞基因组中的情况下，所述构建体被整合进基因组中随机基因座处，或者使用同源重组整合进预定的目标基因座处，在这种情况下目标基因座优选地包含高度表达的基因。

因此，可用于本发明的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒（如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒）的载体和来自其组合的载体，如来自质粒和噬菌体遗传元件（如粘粒和噬菌粒）的载体。

当根据本发明的多肽要从宿主细胞分泌进培养基时，可以对多肽添加适当的信号序列，从而将从新合成的多肽导向宿主细胞的分泌途径。本领域技术人员已知针对特定的宿主细胞选择适当的信号序列。

载体可还包含产生RNA的多核苷酸侧翼的序列，所述侧翼的序列包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这会允许将本发明的多核苷酸引入宿主细胞的基因组中。

整合型克隆载体可在要整合它的宿主细胞染色体中随机整合或在预定的靶基因座处整合。

载体系统可以是单个载体例如单个质粒，或两个或更多个载体，例如两个或更多个质粒，它们一起含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。

载体可以反义方向含有本发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。

可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸（例如DNA）的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook,et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd,ed.ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)，Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其它实验室手册中。

如上所示的，本发明提供了下述经分离的多肽，所述经分离的多肽具有带有如权利要求1中所示的突变的根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

根据本发明的突变体CBH可以通过本领域已知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化。最优选地，使用液相色谱，比如高效液相色谱（“HPLC”）进行纯化，所述纯化可包括但不限于使用离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱和尺寸排阻色谱，将目标CBH与大量蛋白质进一步分离，以使得目标CBH能以高度纯化的状态回收。

本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或未糖基化的。另外，本发明的多肽也可以包含最初被修饰的甲硫氨酸残基或焦谷氨酸盐，在一些情况下这由宿主介导的过程产生。焦谷氨酸(也称为5-氧脯氨酸，氧脯氨酸（pidolic acid）或其碱形式为焦谷氨酸盐)是一种不常用的氨基酸衍生物，其中谷氨酸的游离氨基环化形成内酰胺。其在包括细菌视紫红质的许多蛋白质中找到。

本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。

本发明还提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述多核苷酸对宿主细胞的基因组可以是异源的。通常涉及宿主细胞的术语“异源的”表示多核苷酸不天然存在于宿主细胞的基因组中，或者多肽不由所述细胞天然地生产。

在另一实施方案中，本发明包括细胞，例如含有本发明所包括的核酸的经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中（或其祖先中）已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等，特别优选的是来自丝状真菌（例如Aspergillus niger）的细胞。

可选用调控插入序列表达，或以特异的、期望的方式加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这类修饰（例如糖基化）和加工（例如切割）可促进蛋白质发挥最佳功能。

多种宿主细胞具有用于翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征性和特异性机制。可选用分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录本、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。

如果需要的话，可以在根据本发明的多肽的制备中使用上述细胞。这样的方法典型地包含在提供编码多肽的编码序列（的载体）表达的条件下培养宿主细胞（例如用上述表达载体转化或转染的），并任选地回收被表达的多肽。可以将本发明的多核苷酸并入重组可复制载体例如表达载体中。可以使用载体在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一个实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收载体。

优选地，多肽作为分泌型蛋白质被生产，在这种情况下，表达构建体中编码多肽成熟形式的核苷酸序列与编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接。优选地，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是天然的（同源的）。或者，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是外来的（异源的），在这种情况下信号序列优选地对其中表达本发明核苷酸序列的宿主细胞而言是内源的。对酵母宿主细胞而言合适的信号序列的例子是源自酵母a-因子基因的信号序列。类似地，对丝状真菌宿主细胞而言合适的信号序列是例如源自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如A.niger glaA基因的信号序列。这可与淀粉糖苷酶（也称作（葡糖）淀粉酶）启动子自身组合使用，以及与其它启动子组合使用。在本发明上下文中也可以使用杂种信号序列。

优选的异源分泌前导序列是来自于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因（glaA-例如来自Aspergillus的18和24个氨基酸版本）、α-因子基因（酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces）或α-淀粉酶基因（Bacillus）的分泌前导序列。

可如上文所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。该方法可包括在提供编码本发明多肽的编码序列的载体表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞用如上所述的表达载体转化。

本文中使用了标准分离、杂交、转化和克隆技术(例如，如在Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A LaboratoryManual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所描述的)。

同源性&同一性

当氨基酸序列或核苷酸序列展示某些相似性水平时，其被称为是同源的。同源的两个序列表示共同的进化来源。两个同源序列是密切相关的还是更远相关的，这分别由或高或低的“百分比同一性”或“百分比相似性”表示。虽然是有争论的，但为了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”通常互换使用。

可以使用数学算法实现两条序列之间的序列比较和同一性百分比测定。技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序来比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal,(ed.),Time warps,stringedits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,pp.1-44Addison Wesley)。可使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实施。就本发明目的而言，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.Trends in Genetics16,(6)pp276—277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。就蛋白质序列而言，EBLOSUM62用于替换矩阵，就核苷酸序列而言，使用了EDNAFULL。可指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选的参数是缺口开放惩罚为10和缺口延伸惩罚为0.5。技术人员会意识到所有这些不同的参数会产生些微不同的结果，但是当使用不同的算法时两条序列的总百分比同一性不显著改变。

总体同源性定义

同源性或同一性是在包括任何缺口或延伸的总比对区域上的两条全序列之间的相同匹配的百分比。两条比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两个序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以包括缺口的比对的全长。本文中定义的同一性可从NEEDLE中获得并在程序输出中被标记为“同一性”。

最长的同一性定义

在两个比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两条序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以减去比对中的总缺口数目后的比对的全长。可通过使用NOBRIEF选择从NEEDLE中获得本文中定义的同一性并且所述同一性在程序输出中被标记为“最长同一性”。优选地使用最长同一性来计算同一性。

宿主细胞

本发明因此提供了用本发明多核苷酸或载体转化或转染的或包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，所述多核苷酸被包含在用于复制和表达多核苷酸的载体中。应选择与所述载体相容的细胞，其例如可以是原核（例如细菌）、真菌、酵母或植物细胞。

可以选择异源宿主，其中本发明的多肽以基本不含其它纤维素降解酶或半纤维素降解酶的形式被生产。这可以通过选择正常情况下不生产此类酶的宿主来实现。

本发明包括通过编码多肽的DNA序列的重组表达来生产本发明多肽的方法。就这一目的而言，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或改变表达信号如启动子、分泌信号序列，从而允许合适同源或异源宿主细胞中多肽的经济生产。同源宿主细胞是下述宿主细胞，其与DNA序列来源的物种是相同物种或是相同物种内的变体。

合适的宿主细胞优选地是原核微生物如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，如酵母或丝状真菌，或植物细胞。通常，酵母细胞比真菌细胞是优选的，因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质在酵母中分泌较差，或者在一些情况下不被正确加工（例如酵母中的超糖基化）。在这些情况下，应当选择真菌宿主生物。

宿主细胞可过表达多肽，并且用于进行过表达的技术是公知的。宿主细胞因此可具有两个或更多拷贝的编码多核苷酸（因此载体可相应地具有两个或更多拷贝）。

来自Bacillus属的细菌非常适合作为异源宿主，因为它们能够将蛋白质分泌进培养基中。适合作为宿主的其它细菌是来自Streptomyces和Pseudomonas属的细菌。用于表达编码多肽的DNA序列的一种优选的酵母宿主细胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia和Schizosaccharomyces的属。

更优选地，酵母宿主细胞选自由Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis（也已知为Kluyveromycesmarxianus var.lactis）、Hansenulapolymorpha、Pichia pastoris、Yarrowia lipolytica和Schizosaccharomyces pombe物种组成的组。

然而，最优选的是（例如丝状）真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自由Aspergillus、Trichoderma/Hypocrea、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora、Sporotrichum、Thielavia、Chryosporium、Fusarium、Humicola、Neurospora和Talaromyces属组成的组。

更优选地，丝状真菌宿主细胞是Aspergillus oryzae、Aspergillussojae、Aspergillus nidulans物种或来自Aspergillus niger组的物种。这些包括但不限于Aspergillus niger、Aspergillusawamori、Aspergillustubingensis、Aspergillus aculeatus、Aspergillus foetidus、Aspergillusnidulans、Aspergillus japonicus、Aspergillus oryzae和Aspergillus ficuum，和其他的由Trichoderma reesei/Hypocrea jacorina、Fusariumgraminearum、Talaromyces emersonii、Penicillium decumbens、Acremoniumalabamense、Neurospora crassa、Myceliophtora thernaophilurri、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum、Talaromycesemersonii、Talaromyces stipitatus和Thielavia terrestris物种组成的组。

本发明范围内的优选的表达宿主的例子是真菌，比如Aspergillus物种、Penicillium物种和Trichoderma物种；细菌，比如Bacillus物种，例如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas物种；和酵母，比如Kluyveromyces物种，例如Kluyveromyces lactis和Saccharomyces物种，例如Saccharomycescerevisiae。

根据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明扩展至含有一个或多个本发明细胞的转基因生物，如植物及其部分。所述细胞可异源表达本发明的多肽，或可异源地含有一个或多个本发明的多核苷酸。转基因（或经遗传修饰的）植物可因此在其基因组中（例如稳定地）插入了编码一个或多个本发明多肽的序列。可以使用已知技术，例如使用来自Agrobacterium tumefaciens的Ti或Ri质粒，进行植物细胞的转化。质粒（或载体）可因此含有感染植物必需的序列，并且可以使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。

或者，可进行植物部分例如叶、根或茎的直接感染。在该技术中，例如如下对要被感染的植物造成创伤：用刀片切割植物、或用针穿刺植物或用磨蚀剂摩擦植物。然后用Agrobacterium接种伤口。然后可在合适的培养基上培养植物或植物部分，并允许其发育成为成熟的植物。可通过已知技术实现经转化的细胞再生成为经遗传修饰的植物，例如通过使用抗生素选择经转化的枝条，并将枝条接种在含有适当营养素、植物激素等等的培养基上来实现。

本发明因此还包括被修饰为表达本发明的纤维二糖水解酶或其变体的细胞。这类细胞包括经瞬时修饰的，或优选地经稳定修饰的高级真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低级真核细胞，例如酵母和（例如丝状）真菌细胞，或原核细胞例如细菌细胞。

还可能在细胞系中或膜上（例如在杆状病毒表达系统中）瞬时表达本发明的蛋白质。被改造为表达根据本发明的蛋白质的此类系统也包括在本发明的范围内。

根据本发明，本发明多肽的生产可以通过在常规的营养发酵培养基中培养微生物表达宿主来实现，所述微生物表达宿主已用一种或多种本发明的多核苷酸转化。

本发明还涉及生产突变体CBH的方法，其包括下述步骤：

(a)在产生突变体CBH的合适的条件下，在合适的培养基中培养根据本发明的宿主细胞；

(b)获得所述产生的突变体CBH；并任选地

(c)纯化所述突变体CBH以提供纯化的突变体CBH产物。

本发明还涉及包含根据本发明的和/或根据本发明的方法产生的一种或多种突变体CBH的酶组合物。

另外，本发明涉及用于降解木质纤维素或半纤维素材料的方法，其中木质纤维素或半纤维素材料与根据本发明的酶组合物接触。在一种实施方式中，在本发明的这种方法中，产生了一种或多种糖。在一种实施方式中，发酵产生的糖，以产生发酵产物。在一种实施方式中，发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料的一种或多种。

多肽/酶生产

可使用本领域已知的步骤培养根据本发明的重组宿主细胞。对启动子和宿主细胞的每种组合而言，可以获得有助于编码多肽的DNA序列表达的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽滴度后，停止培养并使用已知的步骤回收多肽。

发酵培养基可包括已知的培养基，所述培养基含有碳源（例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素、木聚糖、果胶、木质纤维素生物质水解产物等等）、氮源（例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等等）、有机氮源（例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等等）和无机营养物来源（例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等等）。任选地可以包括诱导剂（例如纤维素、果胶、木聚糖、麦芽糖、麦芽糖糊精或聚木糖半乳糖醛酸(xylogalacturonan)）。

对合适培养基的选择可基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体的调节需求来进行。这类培养基是本领域技术人员已知的。需要时，培养基可含有额外的组分，所述额外的组分对经转化的表达宿主的偏好优于其它可能的污染微生物。

发酵可在从约0.5到约30天的周期上进行。发酵可以是分批、连续或补料分批的过程，在例如从约0℃到约45℃的合适温度下，和/或例如在从约2到约10的pH下。优选的发酵条件是从约20℃到约37℃之间范围内的温度和/或从约3到约9之间的pH。适当的条件通常基于表达宿主的选择和要表达的蛋白质来选择。

发酵后，如果需要的话，可通过离心或过滤从发酵液中去除细胞。发酵停止后或去除细胞后，接着可回收本发明的多肽，并且需要时通过常规手段纯化和分离。

酶组合物

本发明还提供了包含一种或多种突变体纤维二糖水解酶的酶组合物。在一种实施方式中，酶组合物包含一种或多种突变体CBH、一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶

本发明的酶组合物可包含一类、两类或三类或更多类的纤维素酶，例如内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)（包括优选地GH61）、外切-纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BGL)中的一种、两种或所有。

本发明的酶组合物可包含具有相同酶活性的多肽，例如与本发明多肽提供的活性相同类型的纤维素、半纤维素酶和/或果胶酶活性。

本发明的酶组合物可包含与本发明的多肽提供的活性不同类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，本发明的组合物可包含本发明多肽提供的一种类型的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性和其他半纤维素酶/果胶酶提供的另一种类型的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。

在本文中，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，或者部分地降解成例如纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可得到纤维素糊精与葡萄糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，或者部分地降解成例如寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，或者部分地降解成例如寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解还含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。所述酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。基于一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-b-D-葡聚糖酶活性的测量，GH61内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)最初被归类为糖苷水解酶家族。当然这些酶的结构和作用模式不是典型的，因而它们不能被认作为真正的糖苷酶。但是，当与纤维素酶或纤维素酶的混合物连起来使用时，基于其增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy种类中。

本文中，β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。

本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。所述酶也可以被称作地衣淀粉酶（licheninase），1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶（lichenase）或混合键β-葡聚糖酶。这类酶的替代方案是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC3.2.1.6。当下述葡萄糖残基在C-3处被自身取代时，这类酶水解β-D-葡聚糖酶中的1,3-键或1,4-键，所述葡萄糖残基的还原基团涉及要水解的键。替代性的名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。

因此，除了突变体CBH之外，本发明的组合物可包含一种或多种任何纤维素酶，例如纤维二糖水解酶（例如，CBH-II）、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。

此外，根据本发明的酶组合可包含一种或多种下述酶活性：

内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、、α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)、木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.131)、阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)、香豆酰基酯酶(EC3.1.1.73)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、内切-多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）、果胶甲基酯酶（EC3.1.1.11）、内切-半乳聚糖酶（EC3.2.1.89）、内切-果胶裂合酶（EC4.2.2.10）、果胶酸裂合酶（EC4.2.2.2）、α-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）、外切-半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.82）、外切-半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.67）、外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶(EC4.2.2.9)、鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶、木半乳糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、内切阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、蛋白酶(3.4)、脂肪酶、木质酶例如木质素过氧化物酶(EC1.11.1)、锰过氧化物酶(EC1.11.1.13)、漆酶(EC1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)、己糖基转移酶(2.4.1-)。葡糖醛酸糖苷酶，例如β-葡糖醛酸糖苷酶（EC3.2.1.31），透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)、扩展因子或扩展因子样蛋白质，如膨胀因子（swollenin）（见Salheimo et al.,Eur.J.Biohem.269,4202-4211,2002）或膨胀因子样蛋白质、支架因子（scaffoldin）和纤维素整合蛋白。

本发明的组合物可由上文提到的每个多肽种类的一名成员、一个多肽种类的若干成员、或这些多肽种类的任何组合组成。

本发明的组合物可以由来自以下的多肽（例如酶）组成：（1）供应商；（2）表达多肽例如酶的克隆基因；（3）复合发酵液（例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶）；（4）如（3）中生长的菌株的细胞裂解物；和/或（5）表达多肽例如酶的植物材料。本发明组合物中不同的多肽（例如酶）可得自不同的来源。

在一种实施方式中，在包含BG、EG和CBHII的酶组合物中提供CBHI。在其中一种实施方式中，选择酶的量使得BG以总蛋白质用量的2-12%存在，CBHI以总蛋白质用量的10-65%存在，CBHII以总蛋白质用量的10-40%存在和EG以总蛋白质用量的12-70%存在，或在其一种实施方式中，BG以总蛋白质用量的4-12%存在，EG以总蛋白质用量的18-50%存在，CBHII以总蛋白质用量的10-35%存在和CBHI以总蛋白质用量的10-60%存在。

多肽的用途

根据本发明的多肽和酶组合物可用于许多不同的应用中。例如，它们可被用于生产可发酵的糖。可发酵的糖随后可（作为生物燃料方法的部分）被转化成沼气或乙醇、丁醇、异丁醇、2丁醇或其他合适的物质。或者，多肽及其组合物可（例如在食物制品的生产中，在洗涤剂组合物中，在造纸工业和制浆工业中，和在抗菌配制物中，在药物制品例如润喉片、牙膏和漱口水中）用作酶。这些用途中的一些将在下文中更详细地阐述。

在下文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可共同（即本身作为单一组合物）或单独或先后提供。

本发明还涉及根据本发明的纤维二糖水解酶和包含此类酶的组合物在工业方法中的用途。

尽管用这些方法获得了长期的经验，但是根据本发明的纤维二糖水解酶可具有优于目前所使用的酶的大量显著优点。根据具体的应用，这些优点可包括下述方面，例如更低的生产成本，更高的底物特异性，降低的抗原性，更少的不想要的副活性，在合适的微生物、更合适的pH和温度范围中生产时更高的产量，不受疏水的、来自木质素的产物抑制，或更少的产物抑制，或在食品工业情况下最终产物更好的口味或质地，以及食品级别和犹太教戒律方面的优点。

原则上，本发明的纤维二糖水解酶或组合物可以在任何下述方法中使用，所述方法需要处理包含多糖的材料。因此，本发明的多肽或组合物可以在多糖材料的处理中使用。本文中，多糖材料是下述材料，所述材料包含一种多糖或更典型地包含多于一种多糖，或者基本由所述多糖组成。

典型地，植物和源自它们的材料包含大量非淀粉的多糖材料。因此，本发明的多肽可以用于植物或真菌材料或源自它们的材料的处理。

合适的碳水化合物材料

适于被本发明的突变体CBH改性的非淀粉碳水化合物是木质纤维素。可以被认为是潜在的可再生原料的、包含不同木质纤维素残基的主要的多糖是纤维素（葡聚糖）、半纤维素（木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans)）。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖（例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、D-半乳糖醛酸和其他己糖和戊糖）的酶促水解发生于共同作用（acting inconcert）的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例（约四分之一到一半的干物质可以是果胶）。

因此，本发明的组合物可根据要使用的具体原料（也称作底物）来定制。也就是说，本发明组合物中的活性谱可根据考虑的原料来变化。

酶组合或物理处理可以并发或先后地施用。酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并且将粗制细胞群发酵液或植物材料（如玉米秆）等等加入原料中。或者，可以（例如通过加热或添加抗微生物剂）处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长，然后添加至原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用原料（例如玉米秆）对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。

木质纤维素

植物非淀粉多糖材料的一个重要的组分是木质纤维素（在本文中也称作木质纤维素生物质）。木质纤维素是包含纤维素和半纤维素和木质素的植物材料。碳水化合物聚合物（纤维素和半纤维素）与木质素通过氢键和共价键紧密结合。因此，本发明的多肽可以用于木质纤维素材料的处理。本文中，木质纤维素材料是包含木质纤维素或基本由木质纤维素组成的材料。因此，在用于处理非淀粉的多糖的本发明方法中，非淀粉的多糖可以是木质纤维素材料/生物质。

因此，本发明提供了用于处理包含非淀粉多糖的底物的方法，其中所述处理包括纤维素和/或半纤维素和/或果胶物质的降解和/或水解和/或改性。

降解在本文上下文中表示导致产生纤维素和/或半纤维素和/或果胶物质的水解产物的处理，即与类似的未经处理的非淀粉多糖中存在的相比，由于处理而存在更短链的糖。因此，降解在本文上下文中可以导致寡糖和/或糖单体的释放。

所有植物都含有非淀粉的多糖，同样，基本上所有来自植物的多糖材料也含有非淀粉的多糖。因此，在本发明的用于处理包含非淀粉多糖的底物的方法中，所述底物可以以下述形式提供：植物，或源自植物的材料，或包含植物或源自植物的材料的材料，例如植物浆体、植物提取物、食品或其成分、织物、纺织品或衣物。

适合在本发明中使用的木质纤维素水解生物质（Lignocellulolyticbiomass）包括生物质，并可包括原生生物质（virgin biomass）和/或非原生生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛（shrubs）和草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米芯（corn cobs），玉米粒（包括来自玉米粒的纤维），来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨（包括湿磨和干磨）的通常称作“麸或纤维“的产物和副产物。生物质也可以是，但不限于草本材料，农业生物质，林业残余物，废纸，和纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木（bushes），藤蔓（canes），玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物（short-rotationwoody crops），灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤（vines），甜菜浆，小麦麸皮（wheat midlings），燕麦壳，和硬木材或软木材（不包括带有有害材料的木材）。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，特定地包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。合适的生物质的其他例子是果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，树木，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。

除了已经在食物和饲料或造纸和制浆工业中加工的原生生物质或原料以外，生物质/原料可额外地用热、机械和/或化学改性或此类方法的任何组合预处理，从而增强酶降解。

预处理

在酶处理之前，可对木质纤维素材料预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多的组合。所述化学预处理通常与热预处理（例如150-220℃之间1到30分钟）组合。

预处理步骤后，可以使用涉及用酶或酶混合物孵育的液化/水解或预糖化步骤。预糖化步骤可以在许多不同的温度下进行，但是优选预糖化在最适合要测试的酶混合物的温度下，或针对要测试的酶预测的酶最适度下进行。预糖化的温度范围可以是从约10℃到约95℃，约20℃到约85℃，约30℃到约70℃，约40℃到约60℃，约37℃到约50℃，优选地约37℃到约80℃，更优选地约60-70℃，进一步更优选地在65℃左右。预糖化混合物的pH可以在从约2.0到约10.0，但是优选地约3.0到约7.0，更优选地约4.0到约6.0，进一步更优选地约4.0到约5.0。另外，pH可以被调节以最大化酶活性，并且可以通过添加酶来调节。来自该测试的检验结果的结果比较将允许人们改进方法，以最好地适合要测试的酶。

液化/水解或预糖化步骤反应可以进行数分钟到数小时，例如从约1小时到约120小时，优选地从约2小时到约48小时，更优选地从约2小时到约24小时，最优选地从约2小时到约6小时。纤维素酶处理可进行数分钟到数小时，例如从约6小时到约120小时，优选地约12小时到约72小时，更优选地约24小时到48小时。

生物质可因而经历多种预处理，以使得纤维素更易于酶促裂解（水解）并使半纤维素糖溶化。“Features of Promising Technologies forPretreatment of Lignocellulosic Biomass,”Bioresource Technology96(3),673–86.Yi Zheng,Zhongli Pan,Ruihong Zhang,Overview of biomass pre-treatmentfor cellulosic ethanol production.Int J Agric&Biol Eng,2009;2(3):51-68。

糖化

本发明提供了由木质纤维素材料生产糖的方法，所述方法包括将本发明的多肽到本发明的组合物与木质纤维素材料接触。

此类方法允许由木质纤维素生物质生产游离的糖（单体）和/或寡糖。这些方法涉及用本发明的多肽或组合物将木质纤维素生物质转化成游离糖和小寡糖。

将复合碳水化合物如木质纤维素转化为糖的方法优选地允许转化成可发酵的糖。此类方法可以被称作“糖化”。因此，本发明的方法可导致一种或多种己糖和/或戊糖（如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、核糖和果糖中的一种或多种）的释放。

因此，本发明的另一方面包括下述方法，所述方法与其它酶或物理处理（例如温度和pH）一起利用上文所述本发明的组合物的多肽，将木质纤维素植物生物质转化成糖和寡糖。

尽管组合物已作为单一混合物被讨论，但是认为多种酶可以先后添加，其中温度、pH和其他条件可以被改变，以提高每种个体酶的活性。或者，可以针对酶混合物测定最适pH和温度。

酶在任何适当的条件下与底物反应。例如，酶可以在约25℃，约30℃，约35℃，约37℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，约80℃，约85℃，约90℃或更高下孵育。也就是说，它们可以在从约20℃到约95℃下，例如在低到中等离子强度的缓冲液中和/或从低到中性pH下孵育。“中等离子强度”表示对任何单个离子组分而言，缓冲液具有约200毫摩尔(mM)或更少的离子浓度。pH可在从约pH2.5，约pH3.0，约pH3.5，约pH4.0，约pH4.5，约pH5，约pH5.5，约pH6，约pH6.5，约pH7，约pH7.5，约pH8.0，到约pH8.5的范围内。通常，pH范围会从约pH3.0到约pH7。为了生产乙醇，优选酸性介质，例如pH=4，而为了生产沼气，期望中性pH例如pH=7。在这些条件下孵育酶组合导致大量糖从木质纤维素释放或解离。大量表示可利用的糖的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。

多肽（例如酶）可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并且将粗制细胞群发酵液或植物材料（如玉米秆）等等可被加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长（例如通过加热或添加抗微生物剂），然后添加至例如原料中。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用原料（例如玉米秆）对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。

糖的发酵

可发酵的糖可以被转化成有用的增值的（value-added）发酵产物，其非限制性例子包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品（specialty chemicals）、化学品原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇。糖尤其可被用作用于原料，用于发酵成化学品、塑料、例如琥珀酸和（生物燃料），包括乙醇、甲醇、丁醇合成液体燃料和沼气。

例如，在本发明的方法中，酶或酶的组合作用于发挥原料作用的木质纤维素底物或植物生物质上，从而将所述复合底物转化成简单的糖和寡糖，用于生产乙醇或其它有用的发酵产物。

从生物量释放的糖可被转化成有用的发酵产物，例如包括但不限于，氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品，化学品原料，塑料，和乙醇，包括燃料乙醇。

因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：

a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；以及

b.对得到的材料进行发酵；

由此制备发酵产物。

发酵可在需氧或厌氧条件下进行。优选地，所述方法在微需氧或氧受限的条件下进行。

厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，其在不存在氧时运行，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗约5或更少、约2.5或更少、或约1mmol/L/h或更少氧，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体的。

氧受限的发酵方法是其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物料转移性质决定。优选地，在氧受限条件下进行的方法中，氧消耗速率至少约5.5，更优选地至少约6，进一步更优选地至少约7mmol/L/h。

用于制备发酵产物的方法可任选地包括发酵产物的回收。

SSF

发酵和糖化也可以按照同时糖化和发酵（SSF）的模式进行。这种模式的优点之一是减少对酶促水解的糖抑制（对纤维素酶的糖抑制由Caminal B&B Vol XXVII Pp1282-1290描述）。

发酵产物

可以根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇（术语“乙醇”被理解为包括乙醇或乙醇和水的混合物）。

可以通过本发明的方法生产的特定的增值产物包括但不限于生物燃料（包括乙醇和丁醇和沼气）；乳酸；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、衣康酸和顺丁烯二酸；3-羟基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；丙三醇；溶剂；动物饲料补充剂；药物，如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，如赖氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，苏氨酸和天冬氨酸；工业酶，如蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化还原酶，转移酶或木聚糖酶；和化学原料。

沼气

本发明还提供了本文所述的多肽或组合物在用于制备沼气的方法中的用途。沼气典型地表示由有机物质（例如含有非淀粉碳水化合物的材料）在不存在氧时生物降解而生产的气体。沼气源自生物源材料，并且是一种生物燃料。一种沼气由可生物降解的材料（例如生物质、粪便或污水、市政废弃物和能源作物）的厌氧消化或发酵生产。这种沼气主要由甲烷和二氧化碳组成。气体甲烷可以用氧燃烧或氧化。空气含有21%的氧。该能量释放允许沼气被用作燃料。在许多国家中沼气可被用作低成本燃料，用于任何加热目的，例如烹饪。其也可以被用在现代废弃物管理设备中，在那里其可以被用于运行任何类型的热引擎，从而产生机械力或电力。

微生物沼气生产的第一步由聚合物和复合底物（例如非淀粉碳水化合物）的酶促降解组成。因此，本发明提供了用于制备沼气的方法，其中包含非淀粉碳水化合物的底物与本发明的多肽或组合物接触，从而产生可发酵的材料，所述可发酵的材料可由生物（例如微生物）转化成沼气。在此类方法中，本发明的多肽可由生物提供，所述生物例如是表达此类多肽的微生物。

酶在食物制品中的用途

本发明的多肽和组合物可在下述方法中使用，所述方法加工植物材料，从而降解或改性植物或真菌材料细胞壁的纤维素或半纤维素或果胶物质组分。此类方法可用于制备食物制品。因此，本发明提供了制备食物制品的方法，所述方法包括在食物制品的制备期间掺入本发明的多肽或组合物。

本发明还提供了加工植物材料的方法，所述方法包括将植物材料与本发明的多肽或组合物接触，从而降解或改性（植物）材料中的纤维素。优选地，植物材料是植物浆体或植物提取物，例如汁液。

本发明还提供了用于降低植物提取物的粘性、透明度和/或过滤性的方法。所述方法包括使植物提取物与本发明的多肽或组合物接触，所述多肽或组合物的量能有效降解含在植物提取物中的纤维素或半纤维素或果胶物质。

植物和含有纤维素/半纤维素/果胶物质的材料包括植物浆体、植物部分和植物提取物。在本发明的上下文中，来自植物材料的提取物是可通过提取（机械和/或化学）、加工或其他分离技术源自植物材料的任何物质。提取物可以是汁液、花蜜、碱或由其制成的浓缩物。植物材料可包含或源自蔬菜，例如胡萝卜、芹菜、洋葱、豆类或豆科植物（大豆、黄豆、豌豆）或水果，例如梨果（pome）或带种子的水果（seed fruit）（苹果、梨、榅桲等）、葡萄、西红柿、柑橘（橙、柠檬、枸橼、蜜桔）、甜瓜、洋李、樱桃、黑醋栗、红醋栗、覆盆子、草莓、蔓越莓、菠萝和其他热带水果，树及其部分（例如花粉，来自松树），或谷物（燕麦、大麦、小麦、玉米、水稻）。（要被水解的）材料也可以是农业残余物，例如甜菜浆、玉米芯（com cobs）、小麦秸、（粉碎的）坚果壳，或可再生材料，例如（废）纸。

本发明的多肽因此可被用于处理植物材料，包括植物浆体和植物提取物。它们也可以被用于处理液体或固体食品或可食用的食品成分，或在咖啡、植物油、淀粉的提取中使用，或被用作食物中的增稠剂。

典型地，本发明的多肽被用作上文所述的组合物/酶制剂。所述组合物通常会被添加至可通过例如机械加工（如挤压或研磨）植物材料获得的植物浆体中。组合物与植物的孵育会典型地进行从10分钟到5小时、例如30分钟到2小时、优选地约1小时的时间。加工温度优选地从约10℃到约55℃，例如从约15℃到约25℃，任选地约20℃，每吨要处理的材料可以使用从约10g到约300g，优选地从约30g到约70g，任选地约50g的酶。

使用的所有酶或它们的组合物可以被先后或同时添加至植物浆体中。根据酶制剂的组成，植物材料可首先被浸渍（例如至纯净）或液化。使用本发明的多肽，可以改进加工参数，例如提取产率、提取物粘度和/或提取物品质。

或者，或除上文以外，本发明的多肽可以被添加至通过压榨或液化植物浆体而获得的粗制汁液中。在剂量、温度和持续时间方面，粗制汁液的处理应与植物浆体以类似的方式进行。另外，可以包括其他酶，例如先前讨论的酶。典型的孵育条件如前一段中所述。

一旦用本发明的多肽孵育了粗制汁液，则随后可以离心或过滤（超滤）汁液以生产最终产物。

用本发明的多肽处理后，可以对（终）产物进行热处理，例如在约100℃下进行约1分钟到约1小时，在使本发明多肽部分或完全失活的条件下进行。

含有本发明多肽的组合物也可以在水果泥或蔬菜泥的制备期间使用。

本发明的多肽还可用在酿造、葡萄酒制造、蒸馏或烘焙中。其因而可用在醇类饮料，比如葡萄酒和啤酒中。例如，其可改进例如啤酒、麦芽汁（例如含大麦和/或高粱麦芽）或葡萄酒的过滤性或透明度。

另外，本发明的多肽或组合物可用于酿酒者啤酒糟（即来自啤酒麦芽汁生产的、含有大麦或发芽的大麦或其他谷物的残余物）的处理，以改进例如动物饲料的残余物的利用。

蛋白质可帮助从发酵液或培养基中去除溶解的有机物质，例如其中来自有机来源的蒸馏废弃物被生物转化为微生物生物质。本发明的多肽可改进比如来自由（例如用α-淀粉酶）液化产生的谷物的葡萄糖浆的过滤性和/或降低粘度。

在烘焙中，多肽可改善面团结构，修饰其粘性或柔韧性，改进面包体积和/或碎屑结构，或赋予更好的质地特征，例如断裂品质、成条品质或碎屑品质。

面团的制备是本领域公知的，并且包括将所述成分与加工助剂混合，和一个或多个塑型（moulding）和任选的发酵步骤。冻面团的制备由Kulpand Lorenz在Frozen and Refrigerated Doughs and Batters中描述。

非淀粉多糖（NSP）能够提高食糜（digesta）的粘度，这可进而降低营养可用度和动物表现。本发明的突变体纤维二糖水解酶的使用能够提高磷利用，以及动物食糜期间的阳离子矿物质和蛋白质。

对饲料添加特定的养分会改进动物消化并从而降低饲料成本。目前正在使用大量饲料添加剂，并且持续开发出新的概念。使用特定的酶（例如非淀粉碳水化合物降解酶）能够分解纤维，释放能量，以及提高蛋白质可消化性，因为纤维分解时有更好的蛋白质可达性。藉此，饲料成本能够降低，并且饲料中的蛋白质水平也能降低。

非淀粉多糖（NSP）事实上也存在于植物来源的所有饲料成分中。NSP利用较差，并且在溶解时能够显示对消化的不良影响。外源酶能够有助于更好地利用这些NSP，并因此降低任何抗营养效应。本发明的非淀粉碳水化合物降解酶可在基于谷物的家禽膳食中被用于该目的，或者在更小的程度上用于猪和其他物种。

本发明的非淀粉碳水化合物降解多肽/酶（包含本发明多肽/酶的组合物）可在洗涤剂工业中使用，例如用于从洗衣房中去除基于碳水化合物的污点。洗涤剂组合物可包含本发明的多肽/酶，另外包含一种或多种纤维素，半纤维素酶，果胶酶，蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶或碳水化合物酶。

酶在洗涤剂组合物中的用途

包含本发明多肽或组合物的洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如糊剂、凝胶、粉末或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有多达约70%的水和从约0到约30%的有机溶剂或非水性材料。

此类洗涤剂组合物可例如被配制为手洗洗涤剂组合物或机洗洗涤剂组合物，包括适用于预处理脏污织物的洗衣添加组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或被配制成用于一般居家硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或被配制用于手洗或机洗的洗碗操作。

通常，酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容（例如pH-最适度，与其他酶和/或非酶成分的相容性等等），并且酶应当以有效量存在。

洗涤剂组合物可包含表面活性剂，例如阴离子或非离子型表面活性剂，洗涤剂增量组分或复合剂，一种或多种聚合物，漂白系统（例如H₂O₂源）或酶稳定剂。洗涤剂组合物也可包含任何其他常规的洗涤剂成分，例如护理剂包括粘土，泡沫加强剂，sud抑制剂，抗腐蚀剂，土壤悬浮剂，土壤再沉淀剂，染料，杀菌剂，光学增亮剂，助水溶物，晦暗抑制剂（tarnish inhibitor）或香料。

酶在造纸和浆体加工中的用途

本发明的多肽可用于造纸和制浆工业，尤其是漂白过程中，以增强被漂白的浆体的亮度，从而可以降低漂白阶段中使用的氯，并且提高浆体在再循环造纸方法中的自由度（Eriksson,K.E.L.,Wood Science andTechnology24(1990):79-101;Paice,et al.,Biotechnol.and Bioeng.32(1988):235-239and Pommier et al.,Tappi Journal(1989):187-191）。另外，本发明的多肽或组合物可被用于处理木质纤维素浆体，从而改进其可漂白性。因此可以降低获得令人满意的浆体漂白所需要的氯量。

本发明的多肽或组合物可被用于下述方法中，所述方法降低含纤维素的织物变得粗糙的速率，或降低含纤维素的织物的粗糙度，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理含纤维素的织物。本发明还涉及为有色的含纤维素的织物提供色彩澄清的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理有色的含有纤维素的织物，本发明还涉及在有色的含纤维素的织物中提供局部变化的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理有色的含纤维素的织物。本发明的方法可以通过在洗涤期间处理含纤维素的织物来进行。然而，需要时织物的处理也可以在浸泡或漂洗期间进行，或简单地通过将上文所述的多肽或组合物添加至浸渍或要浸渍织物的水中来进行。

其他酶用途

另外，本发明的多肽或组合物也可以被用于抗菌配制物中以及药物制品例如润喉糖、牙膏和漱口水中。

下述实施例阐释本发明：

实施例

材料和方法

DNA程序

除非另有说明，如别处所述进行标准DNA程序（Sambrook et al.,1989,Molecular cloning:a laboratory manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York）。使用校正读码酶Physion聚合酶(Finnzymes)扩增DNA。限制性酶来自Invitrogen或NewEngland Biolabs。

设计在CBH-I的第6、7、34、36、41、47、48、52、77、99、101、144、171、177、192、194、195、196、198、200、205、232、243、244、245、246、247、249、255、337、343、344、346、350、367、372、375、376、393和396位处具有突变的突变体。合成生产表达突变体CBH的相应的密码子优化的基因。

使用标准DNA程序，对于本文前面所示的每一位置，随机化密码子，并测试覆盖约15-17个不同氨基酸的约96个克隆。将对应于CBH突变体的基因转化进A.niger。为了获得尽可能均匀的突变体表达，优化载体和转化方案二者，以使整合靶向优选的基因座，这使随即整合以及引入多个基因的可能性最小化。

CBHI蛋白质测定的方法

使用改自Absolute Quantification(AQUA)方法的实验程序，用LC-MS量化CBHI(Gerber,M.W.et al.2003,Absolute quantification of proteins andphosphoproteins from cell lysates by tandem MS,PNAS100,p6940-6945)。含有稳定的重同位素的合成内标物LYLLQDDETYQI*FK.LLNR用于量化和方法改进。实验之前，通过NMR量化对标准物分级，以确保添加了正确的绝对量的内标物。使用表达具有峰值内标物的WT CBHI的菌株的上清液，进行方法优化。基于包含在内标物中的胰蛋白酶切割位点优化消化方案，监测内标物的未切割部分和切割部分。

在新鲜的lo-bind MTP中处理CBHI突变体样品。进行针对蛋白质纯化的TCA沉淀。添加BSA，用于改进的蛋白质沉淀。通过离心收集沉淀的蛋白质并去除上清液。使蛋白质球团溶解在含有内标物的8M尿素中。用NH₄HCO₃将样品稀释至<2M尿素，并且添加胰蛋白酶，用于蛋白水解消化。

使用Accela-LTQ-Orbitrap分析样品。通过测定来自CBHI或CBHI突变体的肽的LC-MS面积和内标物的LC-MS面积的比率，进行量化。

CBHI活性测定方法

在pH4.5的乙酸盐缓冲液中以2%的dm，针对与固定量的β-葡萄糖苷酶组合对经洗涤的酸预处理的小麦秸的活性，筛选所有CBH突变体。在混合物中使用的β-葡萄糖苷酶源自Talaromyces emersonii，并在Aspergillus niger中表达。如WO2004/030468中所述产生酶的浓缩过滤物。培养含有合适表达质粒的Aspergillus niger之后，通过以5000x g在4℃下对发酵液离心30分钟制备无细胞的上清液。任选的，用4N KOH将上清液调至pH=5，并用抽吸在2μm（瓶顶）过滤器上无菌过滤，以去除任何真菌材料。此外，上清液可在GF/A Whatmann玻璃微纤维滤器(150mm

)上进一步过滤以去除任何固体。可将上清液浓缩并在4℃下存储直到使用或在-20℃下冷冻。

在该筛选检验中，BG和CBHI的量为每g小麦秸干物质2-3mgβ-葡萄糖苷酶和每g小麦秸干物质1-2mg CBHI。在65℃下孵育进行从4至96小时的时间段。

一种备选的方法将在与BG、EG和CBHII的混合物中测试CBHI，其中不同的酶的范围可如下选择：每g小麦秸干物质的10mg总蛋白质用量中4-12%的BG，18-50%的EG，10-35%的CBHII和10-60%的CBHI。孵育进行从4至96小时的时间段，并与孵育开始时的空白进行比较。在给定时间如下终止反应：旋转沉降残余物，吸取上清液并冷冻样品直到分析。筛选改进的变体的方法不限于上述给出的检验。底物可来自不同的来源。可改变进行预处理的方式。检验条件可改变，例如在不同的pH或不同的温度下糖化。另外，BG、EG和CBHII的特性可被改变，并且检验可包含一类、两类或三类纤维素，例如内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)、外切-纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BGL)中的一种、两种或所有。另外，可添加其他的辅助酶，例如半纤维素酶和/或果胶酶。检验以这样的方式设定：用于改进的目标酶是就性能而言的限制性因素。

使用flow-NMR进行分析。以质子频率500MHz和探针温度27℃操作的Bruker AVANCE II BEST NMR系统上记录¹H NMR谱。。

选择显示最高葡萄糖和/或纤维二糖释放的突变体，用于进一步表征。

筛选突变体的备选的方法是用人工底物，比如对-硝基酚-β-纤维二糖苷孵育上清液，如“Kinetic parameters and mode of action of thecellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii,Biochimica etBiophysica Acta1596(2002):366-380”中所述。

实施例1

CBHI突变体对pNP-纤维二糖苷的活性

使用LC-MS，测定表达CBHI(EBA205和突变体)的转化体摇瓶发酵的经过滤的上清液中CBHI蛋白质的量。

在65℃，pH4.5下将含有0.02mg/mL CBHI蛋白质、3mM pNP-纤维二糖苷和10mM葡萄糖内酯(gluconolacton)的样品孵育10分钟和30分钟。

从表中清楚地看出，在10和30分钟两个测量时间下，CBHI突变体的活性已被改进。

表1.突变体对pNP-纤维二糖苷(U/mg)的CBHI活性。1U是在检验条件下，每min/mL能释放1μmol pNP的酶的量。

实施例2

CBHI突变体对预处理的小麦秸的活性

使用LC-MS，测定表达CBHI(EBA205和突变体)的转化体摇瓶发酵的经过滤的上清液中CBHI蛋白质的量。

在65℃，pH4.5下将含有1.0mg/mL CBHI蛋白质的样品孵育17和70小时。

表2的结果清楚地显示了CBHI突变体从预处理的小麦秸中释放葡萄糖的改进。

表2.突变体对预处理的小麦秸的CBHI活性。活性以在17和70小时时间点处释放的葡萄糖mM数的方式给出。

实施例3

纤维素酶混合物中CBHI突变体的剂量应答关系

以不同的剂量测试了纤维素酶混合物中的CBHI突变体的活性。测定能与1.5和3.0mg/mL剂量的EBA205释放相同量的葡萄糖的突变体的剂量并分别在表3和4中列出。

用以4.1:1:2.8的比率含有EG、BG和CBHII的酶混合物测试CBHI突变体的活性。酶混合物的用量为7.0mg/g DM并且添加不同剂量的CBHI。

测定能与1.5和3.0mg/mL剂量的EBA205释放相同量的葡萄糖的突变体的剂量并分别在表3和4中列出。

表3和4清楚地显示了，CBHI突变体允许在纤维素酶混合物中较低剂量的CBHI。

表3.在不同的时间点下获得类似于1.5mg/g DM的EBA205的葡萄糖释放的CBHI突变体用量。(n.d.：未测出)

表4.在不同的时间点下获得类似于3.0mg/g DM的EBA205的葡萄糖释放的CBHI突变体用量。(n.d.：未测出)

Claims (20)

1.突变体纤维二糖水解酶，其是SEQ ID NO:1的突变体、在SEQ IDNO:1的N247(I,F,H,W)位置处具有替换，其中所述突变体纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:1具有至少50%序列同一性，并且其中所述突变体纤维二糖水解酶具有CBHI活性。

2.根据权利要求1所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有替换N247F。

3.根据权利要求1所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有替换N247H。

4.根据权利要求1至3任何一项所述的突变体纤维二糖水解酶，其中CBH-I具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述突变体在对应于一个或多个残基F427、K163、G357、S36、D77和/或Q232的位置处具有替换或缺失。

5.根据权利要求4所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有一个或多个下述替换：F427I、K163N、G357R、S36E、D77M和/或Q232A。

6.根据权利要求1至5任何一项所述的突变体纤维二糖水解酶，其中CBH-I具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述突变体在对应于一个或多个残基T52、V101、S192、T198、T246、T344、D346、A375和/或A376的位置处具有替换或缺失。

7.根据权利要求6所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有一个或多个下述替换：T52(G,M,Y,D,H,K,R)、V101(T,I,F,H)、S192(A,I,F,Q,H)、T198(A,C,V,P,D,H)、T246(G,A,Y,N,H)、T344(A,S,C,L,I,Y,W)、D346(P,F,G,R)、A375(G,I,W,Y,H,K,R)和/或A376(T,V,L,Y,W,D)。

8.根据权利要求7所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有一个或多个下述替换：T52(M,D,R)、V101(I,F)、S192F、T198(A,H)、T246N、T344(Y,C,L)、D346(R,G)、A375(Y,H)和/或A376(Y,W)。

9.根据权利要求8所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体具有一个或多个下述替换：T52D、V101F、S192F、T198H、T246N、T344Y、D346G、A375Y和/或A376Y。

10.根据权利要求1至9任何一项所述的突变体纤维二糖水解酶，其中所述突变体在对应于一个或多个残基A6、T7、L34、V41、Y47、T48、S99、V144、S171、L177、N194、N195、A196、I200、S205、T243、Y244、S245、Y249、P255、Q337、D343、H350、V367、D372、T393和/或V396的位置处具有一个或多个或缺失。

11.根据权利要求8所述的突变体纤维二糖水解酶，其在任何所述位置处包含C、P、G、A、V、L、I、M、F、W、Y、H、S、T、N、Q、D、E、K、R的替换或缺失。

12.编码根据权利要求1至11任何一项所述的突变体纤维二糖水解酶的多核苷酸。

13.包含权利要求12所述的多核苷酸的核酸构建体。

14.用权利要求13所述的核酸构建体转化的宿主细胞。

15.产生突变体CBH的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)在合适的条件下，在合适的培养基中培养根据权利要求14所述的京转化的宿主细胞，以产生突变体纤维二糖水解酶；

(b)获得所述产生的突变体纤维二糖水解酶；并任选地

(c)纯化所述突变体纤维二糖水解酶，以提供纯化的突变体纤维二糖水解酶。

16.酶组合物，其包含根据权利要求1至7任何一项所述的或根据权利要求15所述的方法产生的一种或多种突变体纤维二糖水解酶。

17.用于降解木质纤维素或半纤维素材料的方法，其中将所述木质纤维素或半纤维素材料与根据权利要求16所述的酶组合物接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中产生了一种或多种糖。

19.根据权利要求18所述的方法，其中对所述产生的糖发酵，以产生发酵产物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料的一种或多种。