CN105073986A - 碳水化合物降解多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有半纤维素酶活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的氨基酸序列；或者SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71，SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或者它们的变体多肽或变体多核苷酸，其中所述变体多肽与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的序列具有至少75％的序列同一性或者所述变体多核苷酸编码与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的序列具有至少75％的序列同一性的多肽。本发明的特征为：新基因的全长编码序列和全长功能蛋白质的氨基酸序列、以及所述基因或所述氨基酸序列的功能等价物。本发明还涉及在工业方法中使用这些多肽的方法。本发明还包括经根据本发明的多核苷酸转化的、适合生产这些蛋白质的细胞。

Description

碳水化合物降解多肽及其用途
发明领域
本发明涉及如下序列，所述序列包含编码具有木质纤维素材料降解活性的多肽的基因。本发明的特征为：新基因的全长编码序列和全长功能蛋白质的氨基酸序列、以及所述基因或氨基酸序列的变体和片段。本发明还涉及在工业过程中使用这些蛋白质的方法。本发明还包括经根据本发明的多核苷酸转化的、适合生产这些蛋白质的细胞。本发明还涉及编码具有木质纤维素材料降解活性的多肽的基因在宿主生物体例如Aspergillusniger和/或Rasamsoniaemersonii中的成功表达。
发明背景
碳水化合物构成地球上最丰富的有机化合物。然而，许多这类碳水化合物隐蔽在复杂聚合物中，包括淀粉(种子和谷物中的主要贮存碳水化合物)和被称为木质纤维素的碳水化合物与木质素的集合。木质纤维素的主要碳水化合物组分是纤维素、半纤维素和果胶。这些复杂的聚合物通常被统称为木质纤维素。
从由于OPEC减少石油输出而导致石油危机爆发的70年代开始，可再生木质纤维素生物质生物转化为可发酵糖吸引了研究人员强烈的注意力，所述可发酵糖随后被发酵以产生作为液体燃料的替代品的醇(例如乙醇)。在过去二十年间，乙醇在美国作为与汽油的10％的掺合物或在巴西作为车辆的纯燃料已被广泛使用。更近期，实现了E85(85％乙醇掺合物)的使用，特别是用于清洁城市应用。燃料生物乙醇的重要性将会随着油价的提高及油来源的逐渐耗尽而提高。另外，可发酵的糖被用于生产塑料、聚合物和其它基于生物的产品，并且预期这一工业将大幅增长，从而提高了对丰富的低成本的可发酵糖的需求，所述可发酵糖可以被用作原料来代替基于石油的原料。
这种大量碳水化合物在植物生物质中的储集提供了糖(五碳糖以及六碳糖)形式的大量潜在的能量来源，所述糖能够被用于大量工业和农业过程。然而，这些碳水化合物的大量能源潜力目前利用不足，因为糖被封闭在复杂聚合物中并因此对于发酵而言不容易接近。从植物生物质产生糖的方法会提供大量的、经济上有竞争性的原料，用于发酵成化学品、塑料例如琥珀酸和(生物)燃料包括乙醇、甲醇、丁醇合成液体燃料和沼气。
无论何种纤维素原料，酶的成本和水解效率是限制生物质生物转化方法商业化的主要因素。微生物生产的酶的生产成本与产酶菌株的生产力和发酵液中最终活性产率密切相关。
尽管过去几十年为了理解酶促木质纤维素生物质降解和纤维素酶生产而进行了持续的研究，但是仍然期望发现或者改造新的有高度活性的纤维素酶和半纤维素酶。还高度期望构建能够进行迅速和有效的木质纤维素材料生物降解的高效酶组合物，特别是具有提高的热稳定性的那些纤维素酶和半纤维素酶。
此类酶可被用来生产糖以用于发酵为化学品、塑料例如琥珀酸和(生物)燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液体燃料和沼气；用于青贮；并在其它工业方法例如食品或饲料、纺织、制浆或造纸或洗涤剂工业和其它工业中用作酶。
发明概述
本发明提供具有半纤维素酶活性或根据表1的活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示氨基酸序列；或者SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71，SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或者它们的变体多肽或变体多核苷酸，其中所述变体多肽与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示序列具有至少75％的序列同一性或者所述变体多核苷酸编码与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示序列具有至少75％的序列同一性的多肽。
表1：本发明蛋白质的Temer编号及其活性
Temer编号 活性 活性
1 Temer00088 β-木糖苷酶 GH3
2 Temer09484 β-木糖苷酶 GH3
3 Temer08028 α-半乳糖苷酶 GH27
4 Temer02362 α-半乳糖苷酶 GH27
5 Temer08862 α-半乳糖苷酶 GH27
6 Temer04790 木葡聚糖酶 GH12
7 Temer05249 α-阿拉伯呋喃糖苷酶 GH51
8 Temer06848 α-阿拉伯呋喃糖苷酶 GH51
9 Temer02056 α-阿拉伯呋喃糖苷酶 GH51
10 Temer03124 内切-木聚糖酶 GH43
11 Temer09491 甘露糖苷酶/木糖苷酶 GH31
12 Temer06400 阿魏酸酯酶 CE1
13 Temer08570 内切-木聚糖酶 GH39
14 Temer08163 内切-外切-木聚糖酶 GH30
15 Temer07305 α-葡糖醛酸酶 GH115
本发明的多肽优选地具有β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、木葡聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切-木聚糖酶、甘露糖苷酶/木糖苷酶、阿魏酸酯酶、木糖苷酶、内切-外切-木聚糖酶或α-葡糖醛酸酶活性。
此外，本发明提供编码半纤维素酶的核酸序列，其中所述核酸序列选自：
(a)与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71，SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核酸序列具有至少70％同一性的核酸序列；
(b)与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71，SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核酸序列的互补物杂交的核酸序列；
(c)编码以下的核酸序列：(i)SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸不同的氨基酸序列；
(d)核苷酸序列，其是(a)、(b)或(c)中所限定核苷酸序列的反向互补物。
本发明还提供包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或载体和包含本发明的多肽或本发明的核酸构建体或载体的细胞。
根据本发明的一个方面，所述细胞是真菌细胞，优选地是选自以下的真菌细胞：Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma属。根据本发明的另一方面，本发明的细胞中的一个或多个基因被完全或部分缺失、敲除或破坏，其中任选地，所述基因编码蛋白酶。
本发明还提供制备根据本发明的多肽的方法，所述多肽具有半纤维素酶或根据表1的活性，所述方法包括：在允许所述多肽表达的条件下培养本发明的细胞，和任选地，回收所表达的多肽。此外，本发明提供组合物，其包含：(i)本发明的多肽和；(ii)纤维素酶和/或额外的半纤维素酶和/或果胶酶，优选地，纤维素酶是GH61、纤维二糖水解酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶，和/或半纤维素酶是内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
此外，本发明提供处理包含半纤维素的底物(任选地是植物材料)的方法，所述方法包括：使所述底物与本发明的多肽和/或本发明的组合物接触。
本发明的另一方面涉及本发明的多肽和/或本发明的组合物用于从木质纤维素材料生产糖的用途。
本发明还提供：
制备具有碳水化合物材料降解活性或碳水化合物水解活性的多肽的方法，所述方法包括：在允许所述多肽表达的条件下培养本发明的细胞，和，任选地，回收所表达的多肽；
通过所述方法能够获得的多肽；和
组合物，其包含：(i)本发明的多肽；和(ii)纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。
具有碳水化合物材料降解活性或碳水化合物水解活性的本发明多肽可用于工业过程中。因此，本发明提供处理包含碳水化合物材料的底物的方法，所述方法包括：使所述底物与本发明的多肽或组合物接触。
特别地，本发明提供从木质纤维素材料生产一种或多种糖的方法，所述方法包括：使所述木质纤维素材料与本发明的多肽或组合物接触。
以这种方式产生的糖可用于发酵方法中。因此，本发明提供生产发酵产物的方法，所述方法包括：利用上述生产可发酵糖；和发酵所得的可发酵糖，从而产生发酵产物。
本发明的多肽或组合物还可用于，例如，制备食品、制备清洁剂、制备动物饲料、处理浆料(pulp)、造纸、或制备织物(fabric)或纺织品(textile)或其清洁中。
本发明还提供：
经加工的材料，其能够通过使植物材料或木质纤维素材料与本发明的多肽或组合物接触而获得；
食品或饲料，其包含本发明的多肽或组合物；和
植物或其部分，其包含根据本发明的多核苷酸、多肽、载体或细胞。
附图简介
图1：用于在A.niger中表达基因的pGBTOP的图谱。示出的是从葡糖淀粉酶启动子(PglaA)表达的目的基因(geneofinterest，GOI)。此外，示出了表达盒的葡糖淀粉酶侧翼(3’glaA)。在本申请中，目的基因是如下文所限定的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的编码序列。
图2显示了质粒Tepep.bbn的示意图，其是R.emersonii中靶向RePepA位点的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305过表达构建体的基础。该载体包含：用于靶向RePepA位点的在RePepAORF上游1.5kb的1500bp5’侧翼区域、lox66位点、由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码区域的无功能的5’部分(5’ble)，和ccdB基因。
图3显示了质粒pEBA1006的示意图，它和包含Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的pEBA表达载体联合用于二重基因靶向方法(bipartitegene-targetingmethod)中，目的是在Rasamsoniaemersonii中用Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的表达盒替代RePepAORF和起始ATG密码子上游的约1500个核苷酸。该载体包含ble编码区的3’部分、A.nidulanstrpC终止子、lox71位点、RePepAORF的2500bp3’侧翼区、和pUC19骨架(Invitrogen,Breda,荷兰)。在转化R.emersonii菌株之前，通过用限制性酶NotI消化除去E.coliDNA。
图4显示了pEBA表达质粒的示意图，其包含Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305，它和pEBA1006载体联合用于二重基因靶向方法中，目的是在Rasamsoniaemersonii中用Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305表达盒替代RePepAORF和起始ATG密码子上游约1500个核苷酸。该载体包含用于靶向RePepA位点的在RePepAORF上游1.5kb的1500bp5’侧翼区域；由R.emersonii启动子2，Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305编码区和A.nidulansamdS终止子(TamdS)组成的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305表达盒；lox66位点；由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码区域的无功能的5’部分(5’ble)。在转化R.emersonii菌株之前，通过用限制性酶NotI消化除去E.coliDNA。
图5：通过高效阴离子交换色谱法获得的色谱图，其显示了：在pH4.5和60℃下在木葡聚糖上孵育24小时之后，通过RasamsoniaemersoniiTemer04790形成的寡聚物与通过商业化纤维素酶混合物形成的寡聚物的比较。
序列表简介
表2显示了本发明的经密码对优化的编码序列SEQIDNO、氨基酸序列SEQIDNO、信号序列SEQIDNO、基因组DNA序列SEQIDNO和野生型编码序列SEQIDNO。
SEQIDNO:76R.emersoniiRePepA(包含侧翼的基因组序列)
SEQIDNO:77R.emersoniiRePepA(cDNA)
SEQIDNO:78R.emersoniiRePepA(蛋白质)
SEQIDNO:79A.nidulansgpdA启动子和ble编码区的5’部分
SEQIDNO:80ble编码区的3’部分和A.nidulansTrpC终止子
SEQIDNO:81R.emersonii启动子2
SEQIDNO:82A.nidulansAmdS终止子
发明详述
在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包括”、“包含”和“具有”应被解释为包含性的。换言之，在语境允许时，这些词语意欲表达可能包括未明确指出的其它要素或整体。
不使用数量词时表示一个或多于一个(即一个或至少一个)的客体。例如，“要素”可表示一个要素或多于一个要素。
本发明提供编码多肽的多核苷酸，所述多肽例如，具有改变(例如，降解)碳水化合物材料的能力的酶。碳水化合物材料是包含一种或多种碳水化合物、由或基本上由一种或多种碳水化合物组成的材料。酶在本文中是多肽的子类别。
底物(也被称为原料)在本文中用于指包含碳水化合物材料的物质，可用根据本发明的酶对其进行处理以使其中的碳水化合物材料被改变。除了碳水化合物材料之外，底物可包含任何其它组分，包括但不限于非碳水化合物材料和淀粉。
本发明提供编码多肽的多核苷酸，所述多肽例如，具有改变(例如，降解)碳水化合物材料的能力的酶。碳水化合物材料是包含一种或多种碳水化合物、由或基本上由一种或多种碳水化合物组成的材料。酶在本文中是多肽的子类别。
TEMER09484
典型地，本发明的多肽编码至少具有β-木糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER09484)，其具有根据SEQIDNO:2的氨基酸序列、或为SEQIDNO:2变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:2的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解以从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于β-木糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER00088
典型地，本发明的多肽编码至少具有β-木糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER00088)，其具有根据SEQIDNO:7的氨基酸序列、或为SEQIDNO:7变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:7的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解以从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于β-木糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER08028
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-半乳糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER08028)，其具有根据SEQIDNO:12的氨基酸序列、或为SEQIDNO:12变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:12的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22；GH27)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-半乳糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER02362
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-半乳糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER02362)，其具有根据SEQIDNO:17的氨基酸序列、或为SEQIDNO:17变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:17的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22；GH27)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-半乳糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER08862
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-半乳糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER08862)，其具有根据SEQIDNO:22的氨基酸序列、或为SEQIDNO:22变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:22的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22；GH27)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-半乳糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER04790
典型地，本发明的多肽编码至少具有木葡聚糖酶活性的多肽(暂时称为TEMER04790)，其具有根据SEQIDNO:27的氨基酸序列、作为SEQIDNO:27变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:27的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，木葡聚糖酶是木葡聚糖特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶，其催化木葡聚糖的切割，木葡聚糖是β-1→4-连接的葡萄糖残基骨架，其中大部分被1-6连接的木糖侧链取代。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于木葡聚糖酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER05249
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER05249)，其具有根据SEQIDNO:32的氨基酸序列、为SEQIDNO:32变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:32的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER06848
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER06848)，其具有根据SEQIDNO:37的氨基酸序列、为SEQIDNO:37变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:37的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER02056
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER02056)，其具有根据SEQIDNO:42的氨基酸序列、为SEQIDNO:42变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:42的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER03124
典型地，本发明的多肽编码至少具有内切-木聚糖酶活性的多肽(暂时称为TEMER03124)，其具有根据SEQIDNO:47的氨基酸序列、为SEQIDNO:47变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:47的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶，能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键的酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于内切-木聚糖酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER09491
典型地，本发明的多肽编码至少具有甘露糖苷酶和/或木糖苷酶活性的多肽(暂时称为TEMER09491)，其具有根据SEQIDNO:52的氨基酸序列、为SEQIDNO:52变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:52的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解以从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本文中，β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于甘露糖苷酶和/或木糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER06400
典型地，本发明的多肽编码至少具有阿魏酸酯酶活性的多肽(暂时称为TEMER06400)，其具有根据SEQIDNO:57的氨基酸序列、为SEQIDNO:57变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:57的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73；CE1)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸-糖+H(2)O＝阿魏酸根(ferulate)+糖。所述糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，其中糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸的酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。它也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于阿魏酸酯酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER08570
典型地，本发明的多肽编码至少具有内切-木聚糖酶活性的多肽(暂时称为TEMER08570)，其具有根据SEQIDNO:62的氨基酸序列、为SEQIDNO:62变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:62的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，β-木糖苷酶(EC3.2.1.37；GH39)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解以从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于木糖苷酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER08163
典型地，本发明的多肽编码至少具有内切-和/或外切-木聚糖酶活性的多肽(暂时称为TEMER08163)，其具有根据SEQIDNO:67的氨基酸序列、为SEQIDNO:67变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:67的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。TEMER08163有利地产生木二糖作为主要产物。
本文中，内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶，能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键的酶。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于内切-和/或外切-木聚糖酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
TEMER07305
典型地，本发明的多肽编码至少具有α-葡糖醛酸酶活性的多肽(暂时称为TEMER07305)，其具有根据SEQIDNO:72的氨基酸序列、为SEQIDNO:72变体的序列(典型地，与具有SEQIDNO:72的序列的多肽在功能上等同)、或为它们之一的片段的序列。
本文中，α-D-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139；GH115)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸根(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酰基连接的水解。
本发明的多肽可具有一种或多种不同于α-葡糖醛酸酶活性的替代的和/或额外的碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性，例如本文中所提及的其它碳水化合物降解和/或碳水化合物水解活性中的一种。
在该语境中，碳水化合物包括所有糖类，例如多糖、寡糖、二糖或单糖。
根据本发明的多肽可通过化学降解或物理降解碳水化合物材料或水解碳水化合物来改变碳水化合物材料。碳水化合物材料的化学修饰可例如通过水解、氧化或其它化学修饰(例如通过裂合酶的作用)而导致这种材料降解。物理修饰可伴随或可不伴随化学修饰。
合适的碳水化合物材料
木质纤维素分解材料或木质纤维素材料或生物质在自然中很丰富且作为替代能源具有巨大价值。第二代生物燃料(也被称为高级生物燃料)是能够从多种类型的生物质制造的燃料。生物质是广泛性的术语，其表示：作为碳循环的一部分迅速更新的有机碳的任何来源。生物质来源于植物材料但也可包括动物材料。木质纤维素生物质的组成不同，主要组分是纤维素(35-50％)，接着是木聚糖(20-35％，半纤维素的一种)和木质素(10-25％)，此外，次要组分(例如蛋白质、油和灰分)构成了木质纤维素生物质的剩余部分。木质纤维素生物质包含多种碳水化合物。术语碳水化合物在生物化学中最为常见，它是糖(saccharide)的同义词。碳水化合物(糖)被分成4个化学分组：单糖、二糖、寡糖和多糖。一般来说，单糖和二糖是较小的(分子量较低的)碳水化合物，它们通常被称为糖(sugar)。
适合被本发明的多肽改性的非淀粉碳水化合物是木质纤维素。可以被认为是潜在的可再生原料的、包含不同木质纤维素残基的主要的多糖是纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖变成为可溶糖(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、D-半乳糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用的不同酶的作用下。
木质素填充细胞壁中纤维素、半纤维素和果胶组分之间，尤其是木质部管胞、导管元件和石细胞中的空间。它与半纤维素共价相连，因此交联不同的植物多糖，从而赋予细胞壁机械强度并以整体延展植物。木质素是由不同的木质素单体形成的高度疏水性交联的芳族聚合材料，其可被甲氧化至不同程度。存在3种被甲氧化至不同程度的木质素单体：对-香豆醇、松柏醇和芥子醇。这些木质醇分别以对-羟苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)苯丙烷类化合物的形式掺入木质素中。木质素的生物降解是从植物原材料加工生物燃料的先决条件。木质素可通过应用不同的预处理方法或通过使用木质素酶或木质素修饰酶(LME’s)而被降解。改善木质素降解将推动来自生物燃料处理的输出至更高的收益或更好的效率因子，例如通过改善(半)纤维素组分的可及性或通过移除经由(半)纤维素酶的作用所释放的寡糖中的木质素-(半)纤维素连接。
另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
纤维素是由通过β-1,4键连接的葡萄糖残基组成的线性多糖。纤维素纤维的线性本质以及化学计量的β-连接的葡萄糖(相对于α)比淀粉的高度枝化的α-连接的结构更倾向于产生链间(interstrand)氢键合的结构。因此，纤维素聚合物与淀粉中存在的纤维相比通常溶解度更小，并且形成更紧密结合的纤维。
半纤维素是复合聚合物，并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1,4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的O-3和/或O-2处被枝化，并且可以被与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的键取代，或者被对乙酸的酯化(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化)取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和杂葡聚糖)和额外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。
与单子叶植物(monocots，即具有单个子叶或种子叶的植物，如玉米、小麦、水稻、草、大麦)相比，双子叶植物(dicot，即其种子具有两片子叶或种子叶的植物，如利马豆(limabeans)、花生、杏仁、豌豆、四季豆)中半纤维素的组成、取代性质和枝化程度差异很大。在双子叶植物中，半纤维素主要由下述木葡聚糖组成，所述木葡聚糖是具有1,6-β-连接的木糖基侧链的1,4-β-连接的葡萄糖链。在单子叶植物(包括大部分谷类作物)中，半纤维素的主要组分是杂木聚糖。这些主要由下述1,4-β-连接的木糖主链聚合物组成，所述木糖主链聚合物与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸或4-O-甲基-葡糖醛酸具有1,3-α连接以及与由酯连接的乙酸改性的木糖具有1,3-α连接。还存在由1,3-和1,4-β-连接的葡糖基链组成的β葡聚糖。在单子叶植物中，纤维素、杂木聚糖和β-葡聚糖可以大致等量地存在，各自包含约15-25％的细胞壁干物质。另外，不同的植物可包含不同量和不同组成的果胶物质。例如，甜菜含有以干重为基础约19％的果胶和约21％的阿拉伯聚糖。
因此，本发明的组合物可根据要使用的具体原料(也称作底物)来定制。也就是说，本发明组合物中的活性谱可根据考虑的原料来变化。
酶组合或物理处理可以并行或先后地施用。酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并且将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆)等等加入原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵施用原料(例如玉米秆)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。
酶活性
内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)和外切-纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成为纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BGL)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化为葡萄糖。
木聚糖酶与其他附属酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶一起，催化半纤维素的部分水解。
果胶物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们沿着一定程度上散布有L-鼠李糖的α(1,4)-连接的D-半乳糖醛酸单元核心链周围构建。在任何细胞壁中都存在符合该描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。
果胶酶包括例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂合酶，果胶酸裂合酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶，α-阿拉伯呋喃糖苷酶。
结构单元的主要类型是：聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1,4)-连接的半乳聚糖和(1,5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密结合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹菜糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。
如上文所述，本发明的多肽典型地具有根据表1的活性。然而，除了所述活性之外或替代所述活性，本发明的多肽可具有一种或多种上文公开的活性。除了具有根据表1的活性的本发明多肽所提供的活性以外，本文所述的本发明的组合物还可具有一种或多种上文所述的活性。
多核苷酸序列
本发明提供基因组多核苷酸序列，其包含编码Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的基因及其编码序列。因此，本发明涉及经分离的多核苷酸，其包含根据SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的编码核苷酸序列的基因组核苷酸序列，及其变体(例如功能等同物)，或它们中的一种。
特别地，本发明涉及经分离的多核苷酸，其能够例如在严格条件下，优选地在高度严格条件下，与包含SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示序列的多核苷酸的反向互补物选择性杂交。
更特别地，本发明涉及多核苷酸，其包含根据SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核苷酸序列或基本上由根据SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核苷酸序列组成。
本发明还涉及经分离的多核苷酸，其包含如下序列或基本上由如下序列组成，所述序列编码根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67、72的多肽或其变体(例如功能等同物)的至少一个功能结构域或它们中之一的片段。
当在本文中使用时，术语“基因”和“重组基因”指的是可从染色体DNA中分离的核酸分子，其包含编码蛋白质(例如，根据本发明的活性)的开放阅读框。
基因可包含编码序列、非编码序列、内含子和/或调控序列。此外，术语“基因”可以指如本文中所限定的经分离的核酸分子。
可利用标准的分子生物学技术和本文中所提供的序列信息来分离本发明的核酸分子，例如具有SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核苷酸序列的核酸分子或其变体(例如功能等同物)。例如，可使用SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71的全部或部分核酸序列作为杂交探针，并利用标准的杂交和克隆技术分离根据本发明的核酸分子(例如，如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)。
此外，可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基于SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71中或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74中或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所含序列信息设计的合成寡核苷酸引物来分离包含SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的全部或部分的核酸分子。
可以使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸。可以将藉此扩增的核酸克隆进适当的载体中，并通过DNA序列分析来表征。
另外，可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪，制备对应于本发明核苷酸序列或可与本发明核苷酸序列杂交的寡核苷酸。
在一个优选的实施方式中，本发明经分离的核酸分子包含SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示的核苷酸序列。
在另一优选的实施方式中，本发明经分离的核酸分子包含为SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示核苷酸序列的反向互补物的核酸分子或这类核苷酸序列任一的变体(例如功能等同物)。
与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与另一核苷酸序列充分互补、使得其能够与另一核苷酸序列杂交从而形成稳定双链体的核酸分子。
本发明的一个方面涉及编码本发明多肽或其变体(例如功能性等同物，例如生物活性片段或结构域)的经分离的核酸分子，以及足以用作鉴定编码本发明多肽的核酸分子的杂交探针的核酸分子，和适合用作用于扩增或突变核酸分子的PCR引物的、此类核酸分子的片段。
根据本发明的多核苷酸可以是“经分离的”。在本发明上下文中，“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是下述DNA或RNA，所述DNA或RNA与其来源生物天然存在的基因组中与之紧邻的一条或两条编码序列(一条在5’端，一条在3’端)不再紧邻。因此，在一个实施方式中，经分离的核酸包括与编码序列紧邻的部分或所有5’非编码(例如启动子)区。该术语因此包括例如被整合进载体中、自助复制的质粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的，或者作为独立于其他序列的单独的分子(例如通过PCR或限制性内切核酸酶处理生产的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括基本不含细胞材料、病毒材料、或培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其他化学品(化学合成时)的重组DNA，所述重组DNA是编码其他多肽的杂种基因的部分。另外，“经分离的核酸片段”是不作为片段天然存在并且在天然状态下不会被找到的核酸片段。
在本文中使用时，术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物生产的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选地是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸(phosphorothioatenucleotides))合成核酸。此类寡核苷酸可被用于例如制备具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性的核酸。
本发明的另一实施方式提供与Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305核酸分子反义的经分离的核酸分子，例如Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305核酸分子的编码链。本发明的范围中还包括本文所述核酸分子的互补链。
除非另有说明，本文通过测序DNA分子所测定的所有核苷酸序列均使用自动化DNA测序仪测定，本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列均通过上文测定的DNA序列的翻译来预测。因此，如本领域针对通过所述自动化途径测定的任何DNA序列所已知的，本文测定的任何核苷酸序列可含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列典型地与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更典型地至少约95％到至少约99.9％相同。
可以通过其他途径(包括本领域公知的手动DNA测序法)来更加精确地测定实际序列。也如本领域所已知的，与实际序列相比被测定的核苷酸序列中的单个插入或缺失会在核苷酸序列的翻译中引起移码，使得预测的由所测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列从此类插入或缺失点处开始，与被测定的DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。
本领域技术人员能够鉴定此类被错误鉴定的碱基，并且已知如何校正此类错误。
根据本发明的核酸分子可仅包含SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示核酸序列(或它们之一的变体)的部分或片段，例如能够用作探针或引物的片段或者编码Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白的部分的片段。
由Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305基因的克隆测定的核苷酸序列和cDNA允许产生被设计用于鉴定和/或克隆其它Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305家族成员，以及来自其它物种的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305同源物的探针和引物。
探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸，所述寡核苷酸通常包含如下核苷酸序列区域，所述区域优选地在高度严格条件下与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75或其变体(例如功能等同物)或它们之一所示的核苷酸序列的至少约12-约15个、优选地约18-约20个、优选地约22-约25个、更优选地约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、或约75个或更多个连续的核苷酸杂交。
基于Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305核苷酸序列的探针可用于检测例如在其它生物体中编码相同或同源蛋白质的转录本或基因组Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305序列。在一些优选的实施方式中，探针还包含与其相连的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。这样的探针还可用作鉴定表达TEMER09484蛋白的细胞的诊断测试试剂盒的一部分。
本文的多核苷酸可以是合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可以按照密码子使用被优化，优选地根据WO2006/077258和/或PCT/EP2007/055943中所述的方法被优化，所述参考文献通过引用并入本文。PCT/EP2007/055943介绍了密码子对优化。密码子对优化是这样一种方法：其中编码多肽的核苷酸序列根据其密码子使用、尤其是使用的密码子对而被修饰，以获得编码多肽的核苷酸序列经改进的表达和/或所编码的多肽的经改进的生产。密码子对被定义为编码序列中一组两个连续的三联体(密码子)。
本发明还涉及包含前文所述多核苷酸的核酸构建体。“核酸构建体”在本文中被定义为单链或双链的核酸分子，其与天然存在的基因分离，或者已被修饰为含有下述核酸区段，所述核酸区段以天然不会存在的方式组合和并置。当核酸构建体含有表达编码序列所需的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。本文定义的术语“编码序列”在本文中被定义为下述序列，所述序列被转录成mRNA并翻译成本发明的蛋白酶启动子的转录活化子。编码序列的界限通常由mRNA5’-端的ATG起始密码子和mRNA3'-端终止开放读码框的翻译终止密码子序列决定。编码序列可包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。优选地，核酸具有高GC含量。本文的GC含量是指构建体中G和C核苷酸的数量除以核苷酸的总数，以％表示。GC含量优选地为56％或更多、57％或更多、58％或更多、59％或更多、60％或更多，或者在56-70％的范围内或58-65％的范围内。优选地，DNA构建体包含启动子DNA序列、与所述启动子DNA序列可操作地连接的编码序列，和控制序列例如：
-一个选自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻译终止序列：TAAG、TAGA和TAAA，优选地TAAA，和/或
-一个选自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻译起始子编码序列：GCTACCCCC；GCTACCTCC；GCTACCCTC；GCTACCTTC；GCTCCCCCC；GCTCCCTCC；GCTCCCCTC；GCTCCCTTC；GCTGCCCCC；GCTGCCTCC；GCTGCCCTC；GCTGCCTTC；GCTTCCCCC；GCTTCCTCC；GCTTCCCTC；和GCTTCCTTC，优选地GCTTCCTTC，和/或
-选自以下序列列表的翻译起始子序列：5’-mwChkyCAAA-3’；5’-mwChkyCACA-3’或5’-mwChkyCAAG-3’，其中使用核苷酸的模糊编码：m(A/C)；w(A/T)；y(C/T)；k(G/T)；h(A/C/T)，优选地5’-CACCGTCAAA-3’或5’-CGCAGTCAAG-3’。
在本发明的上下文中，术语“翻译起始子编码序列”被定义为DNA编码序列开放读码框起始子或起始密码子紧下游的9个核苷酸。起始子或起始密码子编码AA甲硫氨酸。起始密码子典型地为ATG，但是也可以是任何功能性起始密码子如GTG。
在本发明的上下文中，术语“翻译终止序列”被定义为从开放读码框或核苷酸编码序列3’端的翻译终止密码子开始并按5’到3’方向的四个核苷酸。
在本发明的上下文中，术语“翻译起始子序列”被定义为编码多肽的DNA序列开放读码框的起始子或起始密码子紧上游的十个核苷酸。起始子或起始密码子编码AA甲硫氨酸。起始密码子典型地为ATG，但是也可以是任何功能性起始密码子如GTG。本领域公知在RNA中尿嘧啶U代替脱氧核苷酸胸腺嘧啶T。
同源性和同一性
当氨基酸序列或核苷酸序列展示某些相似性水平时，其被称为是同源的。同源的两个序列表示共同的进化来源。不论两个同源序列是密切相关的还是更远相关的，其分别由或高或低的“百分比同一性”或“百分比相似性”表示。虽然是有争论的，但为了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”通常互换使用。
术语“同源性”、“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，在本文中定义为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，就最佳比较目的而言比对全序列。为了优化两个序列之间的比对，可在被比较的两条序列的任一条中引入缺口。这类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可在更短的比较长度上进行，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。同一性是在报告的比对区域上的两条序列之间的同一性匹配的百分比。
可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。技术人员应当明白下述事实：可获得比对两条序列的若干种不同的计算机程序并测定两条序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsequencecomparisonD.Sankoff和J.B.Kruskal,(编),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,pp.1-44AddisonWesley)。可使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实施。就本发明目的而言，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.andBleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276—277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。就蛋白质序列而言，EBLOSUM62用于替换矩阵，就核苷酸序列而言，使用了EDNAFULL。可指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选的参数是缺口开放惩罚为10和缺口延伸惩罚为0.5。技术人员会意识到所有这些不同的参数会产生些微不同的结果，但是当使用不同的算法时两条序列的总百分比同一性不显著改变。
总体同源性定义
同源性或同一性是在包括任何缺口或延伸的总比对区域上的两条全序列之间的同一性匹配的百分比。两条比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两个序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以包括缺口的比对的全长。本文中定义的同一性可从NEEDLE中获得并在程序输出中被标记为“同一性”。
最长同一性定义
在两个比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两个序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以减去比对中的总缺口数目后的比对的全长。可通过使用NOBRIEF选择从NEEDLE中获得本文中定义的同一性并且所述同一性在程序输出中被标记为“最长同一性”。就本发明目的而言，根据“最长同一性”的定义计算两条序列(氨基酸或核苷酸)之间的同一性(同源性)水平，如可通过使用程序NEEDLE进行计算。
本发明的蛋白质序列还可用作“查询序列”以针对序列数据库进行搜索，例如来鉴定其他家族成员或相关序列。可使用BLAST程序进行此类搜索。进行BLAST分析的软件通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)是公众可得到的。BLASTP用于氨基酸序列，BLASTN用于核苷酸序列。BLAST程序使用下述缺省：
-开放缺口的开销：缺省＝5用于核苷酸/11用于蛋白质
-延伸缺口的开销：缺省＝2用于核苷酸/1用于蛋白质
-核苷酸错配惩罚：缺省＝-3
-核苷酸匹配奖励：缺省＝1
-期望值：缺省＝10
-字长：缺省＝11用于核苷酸/28用于megablast/3用于蛋白质
此外，通过BLAST程序，测定查询氨基酸序列或查询核酸序列与检索的同源序列之间的局部同一性(同源性)程度。但是，仅仅比较在某一阈值上给出匹配的那些序列段。从而，程序仅针对这些匹配段计算同一性。因此，以这种方式计算的同一性被称为局部同一性。
载体
本发明的另一方面涉及包含编码TEMER09484蛋白或其功能性等同物的本发明多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，还涉及在例如本发明多肽发生表达的条件下，在合适的宿主细胞中培养、转化或转染这类载体的方法。本文使用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。
本发明的多核苷酸可以被掺入重组的可复制载体中，例如克隆或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一实施方式中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中被回收。合适的宿主细胞在下文讨论。
其中插入本发明表达盒或多核苷酸的载体可以是能够便利地进行重组DNA操作的任何载体，并且所述载体的选择通常应取决于要引入它的宿主细胞。
根据本发明的载体可以是自主复制载体，即显示为染色体外实体的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者载体可以是被引入宿主细胞中后被整合进宿主细胞基因组中，并与整合了它的染色体一起复制的载体。
一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞时被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)和噬菌体载体。
根据本发明的载体可在体外使用，例如用于产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。
本发明的载体可包含两种或更多，例如三种、四种或五种本发明的多核苷酸，例如用于过表达。
本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体含有一个或多个与待表达的核酸序列可操作地连接的调节序列，以要用于表达的宿主细胞为基础选择所述调节序列。
在载体例如表达载体中，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接，即术语“可操作地连接”是指一种连接，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“可操作地连接”的调节序列如启动子、增强子或其它表达调节信号以下述方式放置：在与所述控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达；或者所述调节序列被布置为使得它们与其预期目的一致地发挥功能，例如转录在启动子处开始并通过编码多肽的DNA序列继续。
针对指定宿主细胞的载体或表达构建体因此可包含以下元件，所述元件以相对于编码第一发明的多肽的序列的编码链从5’-端到3’-端的连续顺序彼此可操作地连接：(i)能够在给定的宿主细胞中指导编码多肽的核苷酸序列转录的启动子序列；(2)任选地，能够指导多肽从给定的宿主细胞分泌进培养基中的信号序列；(3)本发明的DNA序列，其编码成熟和优选地活性形式的、具有纤维二糖水解酶活性的多肽；和优选地还有(4)能够终止编码多肽的核苷酸序列下游转录的转录终止区(终止子)。
根据本发明的核苷酸序列的下游可以是含有一个或多个转录终止位点(例如终止子)的3’非翻译区。终止子的起点较不关键。终止子可以例如对编码多肽的DNA序列而言是天然的。然而，优选地在酵母宿主细胞中使用酵母终止子并在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，终止子对宿主细胞(其中要表达编码多肽的核苷酸序列)而言是内源的。在被转录的区域中，可存在用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的成熟转录本的编码部分应当包括位于要翻译的多肽起点处的翻译起始AUG和适当地位于结尾处的终止密码子。
本发明多核苷酸的增强的表达也可以通过对异源调节区(例如启动子、分泌前导肽和/或终止子区)的选择来实现，所述异源调节区可发挥以下作用：提高表达宿主对感兴趣的蛋白的表达水平和需要时的分泌水平，和/或提供本发明多肽表达的诱导型控制。
本领域技术人员应当知道：对表达载体的设计可以以下述因素为基础，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等。本发明的载体(例如表达载体)可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如TEMER09484蛋白、TEMER09484蛋白的突变体形式，其片段、变体或功能等同物)。本发明的载体(例如重组表达载体)可以被设计用于在原核细胞和真核细胞中表达TEMER09484蛋白。
例如，TEMER09484蛋白可以在细菌细胞如E.coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、丝状真菌、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中进一步讨论。适当宿主的代表性例子在下文中描述。
用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
可以例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶体外转录和翻译重组表达载体。
对大部分丝状真菌和酵母而言，载体或表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言还可获得合适的附加体载体，可以向其中并入表达构建体进行稳定和高水平的表达，其例子包括分别衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKDl质粒的载体、或含有AMA序列的载体(例如来自Aspergillus的AMA1)。将表达构建体整合进宿主细胞基因组中的情况下，所述构建体被整合进基因组中随机位点处，或者使用同源重组整合进预定的目标位点处，在这种情况下目标位点优选地包含高表达的基因。
因此，可用于本发明的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体和来自其组合的载体，如来自质粒和噬菌体遗传元件的载体(如粘粒和噬菌粒)。
术语“控制序列”或“调节序列”在本文中被定义为至少包括对多肽表达而言必需和/或有利地任何组件。任何控制序列对于编码多肽的本发明核酸序列而言可以是天然的或外源的。此类控制序列可包括但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870中所述)、分泌信号序列、原-肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少典型地包括启动子、转录和翻译终止信号。如上文所述，“可操作地连接”在本文中被定义为一种连接，其中控制序列相对于DNA序列的编码序列被适当地置于一定位置上，使得控制序列指导多肽的生产。
可以为了引入特定的限制性位点而对控制序列提供连接子，所述特定的限制性位点有助于将控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。术语“可操作地连接”在本文中被定义为一种连接，其中控制序列相对于DNA序列的编码序列被适当地置于一定位置上，使得控制序列指导多肽的生产。
控制序列可以是合适的启动子序列，启动子序列是被宿主细胞识别用于表达核酸序列的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂种的启动子，并且可得自编码对细胞而言同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
术语“启动子”在本文中被定义为下述DNA序列：其与RNA聚合酶结合并且将聚合酶引导至编码生物化合物的核酸序列的正确下游转录起始位点以起始转录。RNA聚合酶有效地催化与编码区的恰当DNA链互补的信使RNA的组装。术语“启动子”还可被理解为包括用于在转录成mRNA之后的翻译的5’-非编码区(启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录控制元件(如增强子)和能与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。启动子可以是适用于显示转录活性的真核或原核宿主细胞的任何适当的启动子序列，其包括突变的启动子、截短的启动子和杂合的启动子，可以从编码相对于细胞是同源的(天然的)或异源的(外源的)的胞外或胞内多肽的多核苷酸中获得启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子。
优选地，启动子是诱导型启动子。更优选地，启动子是碳水化合物诱导型启动子。优选使用的碳水化合物诱导型启动子选自淀粉诱导型启动子(即可受淀粉、其单体、其二聚物、其寡聚物诱导的启动子，例如麦芽糖诱导型启动子、异麦芽糖诱导型启动子)、纤维素诱导型启动子(即可受纤维素、其单体、其二聚物和/或其寡聚物诱导的启动子，例如纤维二糖诱导型启动子、槐糖诱导型启动子)、半纤维素诱导型启动子(即可受半纤维素、其单体、其二聚物和/或其寡聚物诱导的启动子，例如木聚糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子)、果胶诱导型启动子(即可被果胶、其单体、其二聚物和/或其寡聚物诱导的启动子，例如半乳糖醛酸诱导型启动子、鼠李糖诱导型启动子)、阿拉伯聚糖诱导型启动子(即可被阿拉伯聚糖、其单体、其二聚物和/或其寡聚物诱导的启动子，例如阿拉伯糖诱导型启动子)、葡萄糖诱导型启动子、乳糖诱导型启动子、半乳糖诱导型启动子。另一些诱导型启动子是铜-、油酸诱导型启动子。
适用于丝状真菌中的启动子可选自下述组，该组包括但不限于从编码以下的多核苷酸中获得的启动子：A.oryzaeTAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、AsperigillusgpdA启动子、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定的α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、T.reesei纤维二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂肪酶、A.oryzae碱性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、FusariumvenenatumDania(WO00/56900)、FusariumvenenatumQuinn(WO00/56900)、Fusariumoxysporum类胰蛋白酶蛋白酶(WO96/00787)、Trichodermareeseiβ-葡糖苷酶、Trichodermareesei纤维二糖水解酶I、Trichodermareesei纤维二糖水解酶II、Trichodermareesei内切葡聚糖酶I、Trichodermareesei内切葡聚糖酶II、Trichodermareesei内切葡聚糖酶III、Trichodermareesei内切葡聚糖酶IV、Trichodermareesei内切葡聚糖酶V、Trichodermareesei木聚糖酶I、Trichodermareesei木聚糖酶II、Trichodermareeseiβ-木糖苷酶，和NA2-tpi启动子(来自于编码A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物)及其突变的、截短的和杂合的启动子。启动子的另一些实例是WO2006/092396和WO2005/100573中描述的启动子，其通过引用而被并入本文。使用启动子的又一实例描述于WO2008/098933中。可用于丝状真菌中的优选的碳水化合物诱导型启动子是如上所述的A.oryzaeTAKA淀粉酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定的α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、T.、Trichodermareeseiβ-葡糖苷酶、Trichodermareesei纤维二糖水解酶I、Trichodermareesei纤维二糖水解酶II、Trichodermareesei内切葡聚糖酶I、Trichodermareesei内切葡聚糖酶II、Trichodermareesei内切葡聚糖酶III、Trichodermareesei内切葡聚糖酶IV、Trichodermareesei内切葡聚糖酶V、Trichodermareesei木聚糖酶I、Trichodermareesei木聚糖酶II、Trichodermareeseiβ-木糖苷酶，和NA2-tpi启动子(来自于编码A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物)
来自革兰氏阳性微生物的此类启动子的实例包括但不限于gnt(葡糖酸盐/酯操纵子的启动子)；来自Bacilluslicheniformis的penP；glnA(谷氨酰胺合成酶)；xylAB(木糖操纵子)；araABD(L-阿拉伯糖操纵子)和Pspac启动子(可受诱导物例如异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷[IPTG])控制的杂合SPO1/lac启动子)(YansuraD.G.,HennerD.J.ProcNatlAcadSciUSA.198481(2):439-443)。激活子也是诱导启动子活性的序列特异性DNA结合蛋白。来自革兰氏阳性微生物的此类启动子的实例包括但不限于，双组分体系(PhoP-PhoR、DegU-DegS、Spo0A-磷酸传递(Phosphorelay))、LevR、Mry和GltC。(ii)次级σ因子的产生可以主要负责来自特定启动子的转录。来自革兰氏阳性微生物的例子包括但不限于，由芽孢形成特异性σ因子(σF、σE、σG和σK)和一般性应激σ因子σB激活的启动子。σB介导的应答由能量限制和环境应激来诱导(HeckerM,U.MolMicrobiol.1998；29(5):1129-1136.)。(iii)衰减作用和抗终止作用也调控转录。来自革兰氏阳性微生物的例子包括但不限于，trp操纵子和sacB基因。(iv)表达载体中的另一些受调控的启动子基于赋予蔗糖诱导性的sacR调控体系(KlierAF,RapoportG.AnnuRevMicrobiol.1988；42:65-95)。
可用于细菌(例如Bacilli)中的合适的诱导型启动子包括：来自革兰氏阳性微生物的启动子，例如但不限于SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。来自革兰氏阴性微生物的启动子的例子包括但不限于，tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL。
可用于细菌细胞(例如Bacilli)中的启动子的额外实例包括：α-淀粉酶和SPo2启动子，以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。
合适启动子的另一个实例是获自E.colilac操纵子的启动子。另一个实例是Streptomycescoelicolor琼胶酶基因(dagA)的启动子。另一个实例是Bacilluslentus碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子。另一个实例是Bacilluslicheniformis碱性蛋白酶基因(枯草菌溶素Carlsberg基因)的启动子。另一个实例是Bacillussubtilis果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子。另一个实例是Bacillussubtilisα-淀粉酶基因(amyF)的启动子。另一个实例是Bacilluslicheniformisα-淀粉酶基因(amyL)的启动子。另一个实例是Bacillusstearothermophilus麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子。另一个实例是Bacillusamyloliquefaciensα-淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一个实例是“-35”区域具有TTGACA序列且“-10”区域具有TATAAT序列的“通用”启动子。另一个实例是Bacilluslicheniformis青霉素酶基因(penP)的启动子。另一个实例BacillussubtilisxylA和xylB基因的启动子。
优选地，启动子序列来自高表达的基因。从中可以选择启动子和/或被包含在用于整合表达构建体的优选预定靶位点中的优选的高表达基因的例子包括但不限于，编码糖酵解酶如丙糖-磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脱氢酶(ADH)的基因以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。合适的高表达的基因的具体例子包括例如来自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分别来自Hansenula与Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、来自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因以及T.reesei纤维二糖水解酶基因。
可用于酵母中的启动子包括例如，来自糖酵解基因的启动子，例如来自酵母或丝状真菌的磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于来自酵母的这些启动子的更多细节可在(WO93/03159)中找到。另一些有用的启动子是核糖体蛋白编码基因启动子、乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADHI、ADH4、等等)和烯醇酶启动子(ENO)。其它启动子(组成型和诱导型二者)和增强子或上游激活序列将是本领域技术人员已知的。如果期望，本发明宿主细胞中所使用的启动子可被修饰以影响它们的控制特征。该语境中合适的启动子包括组成型和诱导型天然启动子二者以及经改造启动子，它们是本领域技术人员众所周知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1和AOX1。另一些合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEF1和TDH3。可以使用的碳水化合物诱导型启动子的例子是GAL启动子，例如GAL1或GAL10启动子。
所有上述启动子是本领域中可容易获得的。
凭借高等真核生物的编码本发明多肽的DNA的转录可通过向载体中插入增强子序列得到增强。增强子是通常约10-300bp的DNA顺式作用元件，其作用于增强给定宿主细胞类型中启动子的转录活性。增强子的例子包括位于100-270bp的复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。
控制序列也可以是合适的转录终止子序列，这是被丝状真菌细胞识别为终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3'-端可操作地连接。本发明中可以使用在细胞中发挥功能的任何终止子。
控制序列也可以是终止子。对丝状真菌细胞而言优选的终止子得自编码以下的基因：A.oryzaeTAKA淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶(glaA)、A.nidulans邻氨基苯甲酸合酶、A.nigerα-葡糖苷酶、trpC基因和Fusariumoxysporum胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列也可以包括合适的前导序列、对丝状真菌细胞翻译而言重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5'端可操作地连接。在细胞中发挥功能的任何前导序列可用于本发明中。对丝状真菌细胞而言优选的前导序列得自编码以下的基因：A.oryzae淀粉酶和A.nidulans磷酸丙糖异构酶和A.nigerglaA。另一些优选的序列是分离的和/或公开于WO2006/077258中。
另一些控制序列可分离自PenicilliumIPNS基因，或pcbC基因，β微管蛋白基因。WO01/21779中引用的所有控制序列通过引用并入本文。
控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，这是与核酸序列3'-端可操作地连接的序列，其转录后被丝状真菌细胞识别为对所转录的mRNA添加多聚腺苷残基的信号。本发明中可以使用在细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。对丝状真菌细胞而言优选的多聚腺苷酸化序列得自编码以下的基因：A.oryzaeTAKA淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans邻氨基苯甲酸合酶、Fusariumoxysporum胰蛋白酶样蛋白酶和A.nigerα-葡糖苷酶。
当根据本发明的多肽要从宿主细胞分泌进培养基时，可以对多肽添加适当的信号序列，从而将从新合成的多肽导向宿主细胞的分泌途径。本领域技术人员已知针对特定的宿主细胞选择适当的信号序列。信号序列对宿主细胞可以是天然的，或者对宿主细胞可以是外源的。例如，可以使用来自对宿主细胞而言天然的蛋白的信号序列。优选地，所述天然的蛋白是高度分泌的蛋白，即以高于被蛋白的多肽总量10％的量被分泌的蛋白。根据本发明优选地使用的信号序列是例如pmeA。
作为信号序列的替代方式，本发明的多肽可与分泌载体蛋白或其部分融合。此类嵌合构建体借助于载体蛋白或其部分的信号序列而被导向分泌途径。另外，载体蛋白会对根据本发明的多肽提供稳定化效应，和/或可以增强溶解度。此类载体蛋白可以是任何蛋白。优选地，使用高度分泌的蛋白作为载体蛋白。载体蛋白对根据本发明的蛋白而言可以是天然的或外源的。载体蛋白对宿主细胞而言可以是天然的或可以是外源的。此类载体蛋白的例子是葡糖淀粉酶，α-交配因子的前原序列，Clostridiumcellulovorans纤维素结合蛋白A的纤维素结合结构域，谷胱甘肽-S-转移酶，Bacilluscirculans几丁质酶A1的几丁质结合结构域，E.coliK12的malE基因编码的麦芽糖结合结构域，β-半乳糖苷酶，和碱性磷酸酶。用于在Aspergillus细胞中表达此类嵌合构建体的一种优选的载体蛋白是葡糖淀粉酶。根据本发明的载体蛋白和多肽可含有特定的氨基酸基序，以便于多肽的分离；根据本发明的多肽可通过专用的释放剂被释放。释放剂可以是蛋白水解酶或化学试剂。此类氨基酸基序的一个例子是KEX蛋白酶切割位点，其是本领域技术人员公知的。
可以使用信号序列来协助本发明蛋白质或多肽的分泌和分离。信号序列的典型特征是疏水氨基酸核，其通常在分泌期间的一个或多个切割事件中从成熟蛋白质上被切割。这类信号肽含有加工位点，所述加工位点允许在经过分泌通路时从成熟蛋白质上切下信号序列。信号序列指导蛋白质如从转化了表达载体的真核宿主中分泌，并且随后或同时切割信号序列。然后可以通过已知方法，从细胞外介质中容易地纯化蛋白质。或者，可以使用简化纯化的序列(如具有GST结构域)，将信号序列与感兴趣的蛋白质连接。因此，例如编码多肽的序列可以与简化融合多肽纯化的标记序列(如编码肽的序列)融合。在本发明这一方面的某些优选的实施方式中，标记序列是六-组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen,Inc.)中提供的标签，以及其它，其中许多可商业获得。例如如Gentzetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，六-组氨酸提供了融合蛋白的便利纯化。HA标签是可用于纯化的另一种肽，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位，由例如Wilsonetal.,Cell37:767(1984)描述。
优选地，通过标准重组DNA技术生产本发明的TEMER09484融合蛋白。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段以符合读码框的方式连接在一起，所述常规技术例如通过使用平末端或交错末端(stagger-endedtermini)用于连接、使用限制性酶消化来提供适当的末端、适当时填平粘末端、使用碱性磷酸酶处理来避免不想要的接合，和酶促连接。在另一实施方式中，可以通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)合成融合基因。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两条相邻的基因片段之间产生互补性悬突，所述相邻基因片段可随后退火并被再扩增产生嵌合基因序列(参阅例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,编Ausubel等.JohnWiley&Sons:1992)。另外，可以商业获得已经编码融合片段(例如GST多肽)的许多表达载体。TEMER09484编码核酸可以被克隆进这样的表达载体中，从而使融合片段与TEMER9484蛋白以符合读码框的方式连接。
(过)表达
在一个优选的实施方式中，与其中本文所述的本发明的多核苷酸未被过表达的亲本微生物菌株相比，所述基因可以在本发明的微生物菌株中被过表达。多核苷酸序列的过表达在本文中被定义为所述序列基因的表达，所述表达导致微生物菌株中所述序列编码的酶活性是亲本微生物中酶活性的至少约1.5倍；优选地所述酶活性是亲本微生物中酶活性的至少约2倍，更优选地至少约3倍，更优选地至少约4倍，更优选地至少约5倍，进一步更优选地至少约10倍，最优选地至少约20倍。
载体可还包括产生RNA的多核苷酸侧翼的序列，所述侧翼的序列包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这会允许将本发明的多核苷酸引入宿主细胞的基因组中。
整合型克隆载体可在整合了它的宿主细胞染色体中随机整合或在预定的靶基因座处整合。在本发明的一个优选的实施方式中，整合型克隆载体可包含与宿主细胞基因组中预定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于将克隆载体的整合靶向所述预定的基因座。为了促进定向整合，在转化宿主细胞之前优选地将克隆载体线性化。优选地以下述方式进行线性化，所述方式使得克隆载体的至少一端，优选地任一端的侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少约0.1kb，例如至少约0.2kb，更优选地至少约0.5kb，进一步更优选地至少约1kb，最优选地至少约2kb。优选地，可如WO05/095624和/或WO2007/115886中所述，为了经改进的定向DNA整合频率修饰亲本宿主菌株。
本发明中提供的缺失例子使用基因的启动子作为5’-侧翼，使用基因作为3’-侧翼，从而在启动子和基因之间插入选择标记物，进而破坏(即功能性失活)基因转录。上文给出的基因序列可被用于制造类似地功能失活的基因。基因可以被一分为二，得到5’-侧翼和3’-侧翼，但是基因也可以被用于克隆含有基因启动子和终止子区的基因组DNA的大片段，所述启动子和终止子区随后可发挥5’-侧翼和3’-侧翼的功能。
载体系统可以是单个载体例如单个质粒，或两个或更多个载体，例如两个或更多个质粒，它们一起含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。
载体可以反义方向含有本发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。
可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如DNA)的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davis等,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它实验室手册中。
本领域技术人员知道怎样用一个或多个表达盒和选择标记转化细胞。例如，技术人员可使用一个或多个表达载体，其中一个或多个克隆载体包含表达盒和选择标记。
突变微生物宿主细胞的转化可通过任何合适的已知方法进行，包括例如电穿孔法、粒子轰击或微粒轰击、原生质体法和Agrobacterium介导的转化(AMT)。优选地，使用原生质体方法。转化的程序由J.R.S.Fincham,Transformationinfungi.1989,Microbiologicalreviews.53,148-170描述。
转化可涉及这样的方法，所述方法由以本身已知的方式形成原生质体、转化原生质体和再生细胞壁组成。用于Aspergillus细胞转化的合适程序在EP238023和Yelto等人,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474描述。使用Agrobacteriumtumefaciens转化Aspergillus和其它丝状真菌宿主细胞的合适程序在例如DeGroot等人,Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi.NatBiotechnol.1998,16:839-842(勘误于NatBiotechnol.1998,16:1074)中描述。转化Fusarium物种的合适的方法被Malardier等人,1989,Gene78:147156或在WO96/00787描述。可应用其它方法，例如使用如在Christiansen等人,Biolistictransformationoftheobligateplantpathogenicfungus,Erysiphegraminisf.sp.hordei.1995,CurrGenet.29:100-102中描述的基因枪转化的方法。可使用Becker和Guarente,Abelson,J.N.和Simon,M.I.,编辑,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等人,1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等人,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920描述的程序转化酵母。
为了提高编码目的化合物或编码参与通过细胞产生目的化合物的化合物的多核苷酸(基因)在突变的微生物宿主细胞中的拷贝量，可需要对宿主细胞多次转化。以这种方式，可影响通过宿主细胞产生的不同酶的比率。表达载体还可包含多个表达盒以增加将被转化的多核苷酸的拷贝量。
另一种方式可以是针对不同多核苷酸选择不同控制序列，其取决于选择，可引起期望多肽的更高或更低的生产。
基于选择标记的存在与否，可选择用选择标记转化的细胞。在转化(Aspergillus)细胞的情况下，通常在同时用所有的核酸材料转化细胞时，选择标记存在时，编码期望的多肽的多核苷酸也存在。
对于哺乳动物细胞的稳定转染而言，已知取决于使用的表达载体和转染技术，只有非常小的细胞级分可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如抗性或抗生素)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括但不限于赋予药物抗性或补足宿主细胞缺陷的可选择标记。它们包括例如可用于转化大部分丝状真菌和酵母的通用标记基因，如乙酰胺酶基因或cDNA(来自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA)，或提供抗生素抗性如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)的基因。或者，可以使用特异性选择标记，如需要相应突变体宿主菌株的营养缺陷型标记，例如URA3(来自S.cerevisiae或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger)、argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一个优选的实施方式中，在引入表达构建体后从经转化的宿主细胞中缺失选择标记，从而获得能够生产下述多肽的经转化的宿主细胞，所述多肽不含选择标记基因。
另一些标记包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(这也可在酵母中使用，但是不能在真菌中使用)、氨苄西林抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)、以及编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的E.coliuidA基因。载体可以体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。
蛋白质在原核生物中的表达常在E.coli中用下述载体完成，所述载体含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体对其中编码的蛋白质、例如对重组蛋白的氨基端添加大量氨基酸。这类融合载体典型地具有三个目的：1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；3)通过在亲和层析中发挥配体作用来帮助纯化重组蛋白。通常在融合表达载体中，在融合片段和重组蛋白的接合处引入蛋白水解切割位点，使得能够在融合蛋白的纯化后将重组蛋白与融合片段分开。
如所指出的，表达载体优选地含有可选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其它细菌中培养的四环素或氨苄西林抗性。
优选用于细菌的载体例如公开于WO-A1-2004/074468中，所述文献通过引用并入本文。其它合适的载体应是技术人员容易知道的。
为了将翻译的蛋白质分泌进入内质网腔中、进入壁膜间隙中或进入细胞外环境中，可以向被表达的多肽中整合进适当的分泌信号。所述信号对多肽可以是同源的或它们可以是异源信号。
TEMER09484多肽可以以经修饰的方式(例如作为融合蛋白)被生产，并可不仅含有分泌信号而且含有额外的异源功能区。因此，例如额外氨基酸区(尤其是带电荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促进纯化期间或随后的操作和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。还可向多肽添加肽基元，以便于纯化。
本发明提供了经分离的多肽，所述多肽具有根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列，和能够通过在合适的宿主中表达SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的多核苷酸获得的氨基酸序列。包含上述多肽的变体(例如功能等同物)的肽或多肽也包括在本发明内。上述多肽集体包含在术语“本发明多肽”中。
术语“变体肽”或“变体多肽”在本文中被定义为分别在肽或多肽的一个或多个特定位置上包含一个或多个改变(例如一个或多个特定氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或截短)的肽或多肽。相应地，变体信号肽是在信号肽的一个或多个特定位置上包含一个或多个改变(例如一个或多个特定氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或截短)的信号肽。
术语“多核苷酸”与术语“核酸分子”相同，并且在本文中可互换理解。该术语是指多核苷酸分子，其为单链或双链的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)分子。多核苷酸可以分离形式存在，或者可包含在重组核酸分子或载体中，或包含在宿主细胞中。
术语“变体多核苷酸”在本文中被定义为在多核苷酸中一个或多个特定位置上包含一个或多个改变(例如一个或多个核苷酸的取代、插入、缺失和/或截短)的多核苷酸。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如其通常被认为的那样)，且当上下文需要表示通过肽键偶合的至少两个氨基酸链时，每个术语可以互换使用。词语“多肽”在本文中使用表示含有多于七个氨基酸残基的链。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中从左到右和从氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的单字母氨基酸代码是本领域普遍已知的，并可见于Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)。
“分离的”多肽或蛋白质表示被从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，与通过任何合适的技术已基本纯化的天然或重组多肽一样，所述合适的技术例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。
根据本发明的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白可以通过本领域已知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化。最优选地，使用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，可以将本发明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本发明的多肽也可以包含最初被修饰的残基(在一些情况下由宿主介导的过程产生)。
本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。
本发明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白的氨基酸序列(例如SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列)足够相同或由其衍生，所述片段包含比全长蛋白质更少的氨基酸但是显示相应的全长蛋白质的至少一种生物活性。典型地，生物活性片段包含具有Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。
本发明的蛋白质的生物活性片段可以是长度为例如约10、约25、约50、约100或更多个氨基酸，或长度至少约100个氨基酸、至少150、200、250、300、350、400个氨基酸，或长度多达本发明多肽氨基酸总数的多肽。
另外，其它生物活性部分(其中蛋白质的其它区域被缺失)可以通过重组技术被制备，并针对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性做出评价。本发明还包括编码Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质的上述生物活性片段的核酸片段。
蛋白质
在本发明的另一方面中，提供经改进的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质。经改进的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质是其中至少一种生物活性被改进的蛋白质。这类蛋白质可以如下获得：沿全部或部分Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305编码序列随机地引入突变(例如通过饱和诱变)，可以重组表达得到的突变体并针对生物活性进行筛选。例如，本领域提供用于测量本发明蛋白质的酶活性的标准试验，因此可以容易地选择经改进的蛋白质。
导致经改进的纤维二糖水解酶功能的本发明氨基酸序列的经改进变体可通过本发明的相应基因获得。此类修饰包括：
1.易错PCR以引入随机突变，之后筛选获得的变体并分离具有经改进的动力学特性的变体
2.编码纤维二糖水解酶的基因相关变体的家族改组(familyshuffling)，之后筛选获得的变体并分离具有经改进的动力学特性的变体。
导致提高的mRNA和/或蛋白质水平、导致更多根据表1的活性的本发明的基因变体可通过所述基因的多核苷酸序列获得。此类修饰包括：
1.以下述方式改进密码子使用，所述方式使得密码子(最适地)适合亲本微生物宿主
2.以下述方式改进密码子对使用，所述方式使得密码子(最适地)适合亲本微生物宿主
3.对编码纤维二糖水解酶的基因组信息添加稳定化序列，导致具有提高的半衰期的mRNA分子。
分离具有经改进的催化特性或提高的mRNA或蛋白质水平的变体的优选方法描述于WO03/010183和WO03/01311中。优化亲本微生物菌株中密码子使用的优选方法描述于PCT/EP2007/05594中。对编码本发明纤维二糖水解酶的基因添加稳定化元件的优选方法描述于W02005/059149中。
在一个优选的实施方式中，本发明蛋白质具有根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明多肽与根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列基本上同源并保留根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的多肽的至少一种生物活性，但由于所述天然变异或诱变而在氨基酸序列上存在差异。
在又一个优选的实施方式中，本发明蛋白质具有由下述经分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述经分离的核酸片段能够与根据SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核酸优选地在高度严格的杂交条件下杂交。
因此，Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质或者本发明的蛋白质优选地是包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72所示氨基酸序列至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、95％、96％、97％、98％、97％、98％、99％、99.8％、99.9％或更多同源且，典型地，保留根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的多肽的至少一种功能活性。
根据本发明的一方面，本发明的多肽可包含SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72所示氨基酸序列，或与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72所示氨基酸序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸不同的氨基酸序列且其中多肽仍然具有本发明多肽的活性或功能。本领域技术人员将意识到：本发明多肽中这些微小的氨基酸改变可存在(例如天然存在的突变)或被制造(例如，使用r-DNA技术)而不丢失蛋白质的功能或活性。如果这些突变存在于多肽的结合结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的一种性质可改变(例如，其热稳定性)，但多肽可保持其半纤维素酶活性。如果突变不出现在活性位点、结合结构域或其它功能结构域附近，则可预期较少影响。
也可以如下文所述来鉴定根据本发明蛋白质的功能等同物：例如，针对根据表1的活性，筛选本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库。在一个实施方式中，通过核酸水平上的组合诱变产生有斑文库(variegatedlibrary)。可以通过例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接为基因序列来产生变体的有斑文库，从而可能的蛋白序列的简并集合(degenerateset)可作为个体多肽表达，或者作为一组更大的融合蛋白表达(例如用于噬菌体展示)。存在可用于从简并寡核苷酸生产本发明多肽的可能变体文库的多种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见例如Narang(1983)Tetrahedron39:3；ltakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；ltakura等(1984)Science198:1056；Ike等(1983)NucleicAcidRes.11:477)。
另外，本发明多肽的编码序列的片段文库可以被用于产生有斑的多肽群，用于筛选随后的变体选择。例如，可以如下产生编码序列片段的文库：在每个分子仅发生约一次切割的条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，将DNA复性形成双链DNA(其可包含来自被不同切割的产物的有义/反义对)，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体上去除单链部分，并将得到的片段文库连接进表达载体中。通过该方法，可以得到下述表达文库，所述表达文库编码感兴趣的蛋白质的不同大小的N-末端和内部片段。
本领域已知有若干种技术可用于筛选组合文库(其通过截短的点突变制造)的基因产物，和用于筛选cDNA文库以获得具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的、适用于高通量分析的、最广泛使用的技术典型地包括：将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下想要的活性的检测简化编码基因(其产物被检测)的载体的分离。循环总体诱变(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一种增强文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选实验组合使用以鉴定本发明蛋白的变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815；Delgrave等(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。
除了SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305基因序列外，对本领域技术人员显然的是给定的类群中可存在DNA序列多态性，其导致Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质的氨基酸序列中的改变。这类遗传多态性可存在于来自不同类群的细胞中或由于天然等位基因变异而存在于一个类群中。等位基因变体也可包括功能等同物。
根据本发明的多核苷酸的片段也可包括不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可作为PCR反应的探针或引物起作用。
根据本发明的核酸无论是编码功能多肽还是无功能的多肽，均可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305活性的多肽的本发明核酸分子的用途尤其包括：(1)从cDNA文库(例如，从合适的微生物)分离编码Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305蛋白质的基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如，FISH)以提供Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305基因的精确染色体定位，如Verma等人,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)所述；(3)Northern印迹分析，用于检测Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305mRNA在特定组织和/或细胞中的表达；和4)能够被用作诊断工具来分析给定的生物(例如组织)样品中核酸存在的探针和引物，所述核酸能与Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305探针杂交。
本发明还包括获得Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305基因的功能等同物的方法。这类方法需要获得被标记的含有被分离的核酸的探针，所述被分离的核酸编码根据SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的蛋白序列或其变体的全部或部分；在允许探针与文库中的核酸片段杂交从而形成核酸双链体的条件下，用被标记的探针筛选核酸片段文库，和从任何被标记的双链体中的核酸片段制备全长的基因序列，以获得与Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305基因相关的基因。
在一个实施方式中，本发明的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305核酸与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71或者SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或者SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75中所示的核酸序列或其互补物至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。
本发明进一步提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述多核苷酸对宿主细胞的基因组可以是异源的。通常涉及宿主细胞的术语“异源的”表示多核苷酸不天然存在于宿主细胞的基因组中，或者多肽不由所述细胞天然地生产。
在另一实施方式中，本发明包括细胞，例如含有本发明所包括的核酸的经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中(或其祖先中)已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等，特别优选的是来自丝状真菌(例如Aspergillusniger)的细胞。
可选用调控插入序列表达并以特异的、期望的方式加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。
多种宿主细胞具有用于翻译前加工和修饰蛋白质和基因产物的特性和特异机制。可选用分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录本、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。
如果期望，可以在根据本发明的多肽的制备中使用上述细胞。这样的方法典型地包含在提供编码多肽的编码序列(的载体)表达的条件下培养宿主细胞(例如用上述表达载体转化或转染的)，并任选地回收被表达的多肽。可以将本发明的多核苷酸并入重组可复制载体例如表达载体中。可以使用载体在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一个实施方式中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收载体。
优选地，多肽作为分泌型蛋白质被生产，在这种情况下，表达构建体中编码多肽成熟形式的核苷酸序列与编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接。优选地，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是天然的(同源的)。或者，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是外来的(异源的)，在这种情况下信号序列优选地对其中表达本发明核苷酸序列的宿主细胞而言是内源的。对酵母宿主细胞而言合适的信号序列的例子是衍生自酵母a-因子基因的信号序列。类似地，对丝状真菌宿主细胞而言合适的信号序列是例如衍生自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如A.nigerglaA基因的信号序列。这可与淀粉糖苷酶(也称作(葡糖)淀粉酶)启动子自身组合使用，以及与其它启动子组合使用。在本发明上下文中也可以使用杂种信号序列。
优选的异源分泌前导序列是来自于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自Aspergillus的18和24个氨基酸版本)、α-因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α-淀粉酶基因(Bacillus)的分泌前导序列。
可如上文所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。该方法可包括在提供编码本发明多肽的编码序列的载体表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞用如上所述的表达载体转化。
宿主细胞
本发明因此提供了用本发明多核苷酸或载体转化或转染的或包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，所述多核苷酸被包含在用于复制和表达多核苷酸的载体中。应选择与所述载体相容的细胞，并且其可以是原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
可以选择异源宿主，其中本发明的多肽以基本不含其它纤维素降解酶或半纤维素降解酶的形式被生产。这可以通过选择正常情况下不生产此类酶的宿主来实现。
本发明包括通过编码多肽的DNA序列的重组表达来生产本发明多肽的方法。就这一目的而言，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或改变表达信号如启动子、分泌信号序列，从而允许合适同源或异源宿主细胞中多肽的经济生产。同源宿主细胞是下述宿主细胞，其与DNA序列衍生自的物种是相同物种或是相同物种内的变体。
合适的宿主细胞优选地是原核微生物如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，如酵母或丝状真菌，或植物细胞。通常，酵母细胞是超过真菌细胞优选的，因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质在酵母中分泌较差，或者在一些情况下不被正确加工(例如酵母中的超糖基化)。在这些情况下，应当选择真菌宿主生物。
宿主细胞可过表达多肽，并且用于进行过表达的技术是公知的。宿主细胞因此可具有两个或更多拷贝的编码多核苷酸(因此载体可相应地具有两个或更多拷贝)。
在本发明的语境中，“亲本微生物宿主细胞”和“突变微生物宿主细胞”可以是任何类型的宿主细胞。突变微生物宿主细胞的特定实施方案在下文描述。本领域技术人员清楚地知道：除非另外指出，否则适用于突变微生物宿主细胞的实施方式也适用于亲本微生物宿主细胞。
根据本发明的突变微生物宿主细胞可以是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可选自例如Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、CaulobactertcrescentusCB15、Methylobacteriumextorquens、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Paracoccusdenitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcuscarnosus、Streptomyceslividans、Sinorhizobiummelioti和Rhizobiumradiobacter。
根据一个实施方式，根据本发明的突变微生物宿主细胞是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9或Sf21细胞及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，即酵母细胞，例如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株。更优选地，真核宿主细胞是Kluyveromyceslactis、S.cerevisiae、Hansenulapolymorpha、Yarrowialipolytica或Pichiapastoris，或丝状真菌细胞。最优选地，真核细胞是丝状真菌细胞。
丝状真菌包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢绝对好氧。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。
优选的丝状真菌细胞属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma属的物种，且最优选地Aspergillusniger、Acremoniumalabamense、Aspergillusawamori、Aspergillusfoetidus、Aspergillussojae、Aspergillusfumigatus、Talaromycesemersonii、Rasamsoniaemersonii、Aspergillusoryzae、Chrysosporiumlucknowense、Fusariumoxysporum、Myceliophthorathermophila、Trichodermareesei、Thielaviaterrestris或Penicilliumchrysogenum的物种。更优选的宿主细胞属于Aspergillus或Rasamsonia属；更优选地，宿主细胞属于Aspergillusniger或Rasamsoniaemersonii种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillusniger宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS513.88、CBS124.903或其衍生物。
丝状真菌的几种菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS))、农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter(NRRL))和俄罗斯莫斯科的俄罗斯科学院全俄罗斯微生物保藏中心(All-RussianCollectionofMicroorganismsofRussianAcademyofSciences，俄语缩略语为VKM，英语缩略语为RCM)。在本发明的语境中，有用菌株可以是AspergillusnigerCBS513.88、CBS124.903、AspergillusoryzaeATCC20423、IFO4177、ATCC1011、CBS205.89、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、P.chrysogenumCBS455.95、P.chrysogenumWisconsin54-1255(ATCC28089)、PenicilliumcitrinumATCC38065、PenicilliumchrysogenumP2、ThielaviaterrestrisNRRL8126、TalaromycesemersoniiCBS124.902、AcremoniumchrysogenumATCC36225或ATCC48272、TrichodermareeseiATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、AspergillussojaeATCC11906、MyceliophthorathermophilaC1、Garg27K、VKM-F3500D、ChrysosporiumlucknowenseC1、Garg27K、VKM-F3500D、ATCC44006和其衍生物。
根据本发明的一种实施方式，当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，突变微生物宿主细胞可在其基因组中包含一种或更多种修饰，以使得如果与亲本宿主细胞相比并在相同条件下测量，突变微生物宿主细胞中至少一种产物的产生缺陷，所述产物选自葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或烟曲霉素)、蛋白酶转录调节物prtT、PepA、由hdfA和/或hdfB基因编码的产物、非核糖体肽合酶npsE。
因此，当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，所述宿主细胞可在其基因组中包含一种或更多种修饰，以导致主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的产生缺陷。例如，根据本发明的宿主细胞还可包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的破坏。
当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，根据本发明的宿主细胞可在其基因组中额外地包含一种或更多种修饰，以导致由hdfA和/或hdfB基因编码的产物的产生缺陷。例如，根据本发明的宿主细胞还可包含hdfA和/或hdfB基因的破坏。WO2005/095624中已描述了由hdfA和/或hdfB基因编码的产物缺陷的丝状真菌宿主细胞。
当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，根据本发明的宿主细胞可在其基因组中额外地包含修饰，所述修饰导致非核糖体肽合酶npsE的产生缺陷。WO2012/001169中已描述了非核糖体肽合酶npsE的产生存在缺陷的此类宿主细胞(npsE具有如WO2012/001169的SEQIDNO:35中所示的基因组序列、SEQIDNO:36中所示的编码序列、SEQIDNO:37中所示的mRNA和SEQIDNO:38中所示的nrps蛋白质)。
当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，所述宿主细胞可额外地包含至少两个基本同源的DNA结构域，其适合整合一个或更多个拷贝的编码目的化合物的多核苷酸，其中所述至少两个基本同源的DNA结构域中的至少一个被改造为相比其所来源的基本同源的DNA结构域对编码目的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性，并且其中经改造的基本同源的DNA结构域所来源的基本同源的DNA结构域与所述至少两个基本同源的DNA结构域中的另一个相比具有至少高10％的基因转化频率。这些细胞在WO2011/009700有描述。含有两个或更多个拷贝的这些基本同源的DNA域的菌株在下文中也称为含有两个或更多个扩增子的菌株。包含这样的扩增子的宿主细胞的实例为例如在vanDijck等人,2003,RegulatoryToxicologyandPharmacology28；27-35:OnthesafetyofanewgenerationofDSMAspergillusnigerenzymeproductionstrains中所描述的。在vanDijck等人中，描述的Aspergillusniger菌株包含7个扩增的葡糖淀粉酶基因位点，即7个扩增子。在该语境中，优选的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，优选A.niger宿主细胞，其包含两个或更多个扩增子，优选地两个或更多个ΔglaA扩增子(优选包含3、4、5、6、7个ΔglaA扩增子)，其中具有最高基因转化频率的扩增子已经被改造为相比于与其所源自的扩增子对编码目的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性。扩增子的改造可以根据WO2011/009700(在此处通过引用完全并入)描述的任意一种的方法来进行。WO2011/009700中所述的这些宿主细胞的一个实例是这样的宿主细胞：其包含三个ΔglaA扩增子(为BamHI截短扩增子、SalI截短扩增子和BglII截短扩增子)，并且其中BamHI扩增子已经被改造为相比于其所来源的BamHI扩增子对编码目的化合物的多核苷酸有增强的整合偏好性。包含两个或更多个扩增子且其中一个扩增子已被改造为与其所来源的扩增子相比对编码目的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性的宿主细胞在下文中被称为包含经改造扩增子的宿主细胞。
当根据本发明的突变微生物宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，根据本发明的宿主细胞可额外包含Sec61的修饰。优选的SEC61修饰是产生SEC61的单向突变体的修饰；即其中从头合成的蛋白能通过SEC61进入ER但是蛋白不能通过SEC61离开ER的突变体。这样的修饰在WO2005/123763中详尽的描述。最优选地，SEC61修饰是S376W突变，其中第376位丝氨酸被色氨酸替代。
根据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明扩展至含有一个或多个本发明细胞的转基因生物，如植物及其部分。所述细胞可异源表达本发明的多肽，或可异源地含有一个或多个本发明的多核苷酸。转基因(或经遗传修饰的)植物可因此在其基因组中(例如稳定地)插入了编码一个或多个本发明多肽的序列。可以使用已知技术，例如使用来自Agrobacteriumtumefaciens的Ti或Ri质粒，进行植物细胞的转化。质粒(或载体)可因此含有感染植物必需的序列，并且可以使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。
或者，可进行植物部分例如叶、根或茎的直接感染。在该技术中，例如如下对要被感染的植物造成创伤：用刀片切割植物、或用针穿刺植物或用磨蚀剂摩擦植物。然后用Agrobacterium接种伤口。然后可在合适的培养基上培养植物或植物部分，并允许其发育成为成熟的植物。可通过已知技术实现经转化的细胞成为经遗传修饰的植物的再生，例如通过使用抗生素选择经转化的枝条，并将枝条接种在含有适当营养素、植物激素等等的培养基上来实现。
本发明因此还包括被修饰为表达本发明的纤维二糖水解酶或其变体的细胞。这类细胞包括经瞬时修饰的，或优选地经稳定修饰的高级真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低级真核细胞，例如酵母和(例如丝状)真菌细胞，或原核细胞例如细菌细胞。
还可以的是本发明的蛋白在细胞系中或膜上(例如在杆状病毒表达系统中)被瞬时表达。适合表达根据本发明的蛋白的此类系统也包括在本发明的范围内。
根据本发明，本发明多肽的生产可以通过在便利的营养发酵培养基中培养微生物表达宿主来实现，所述微生物表达宿主已用一种或多种本发明的多核苷酸转化。
多肽/酶生产
可使用本领域已知的步骤培养根据本发明的重组宿主细胞。对启动子和宿主细胞的每种组合而言，可以获得有助于编码多肽的DNA序列表达的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽滴度后，停止培养并使用已知的步骤回收多肽。
发酵培养基可含有已知的培养基，所述培养基含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素、木聚糖、果胶、木质纤维素生物质水解产物等等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等等)和无机氮源(例如磷酸镁、磷酸钾、磷酸锌、磷酸铁等等)。任选地可以包括诱导剂(例如纤维素、果胶、木聚糖、麦芽糖、麦芽糖糊精或聚木糖半乳糖醛酸(xylogalacturonan))。
对合适培养基的选择可基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体的调节需求来进行。这类培养基是本领域技术人员已知的。如期望，培养基可含有额外的组分，所述额外的组分对经转化的表达宿主的偏好优于其它可能的污染微生物。
可经从约0.5到约30天的时间进行发酵。发酵可以是分批、连续或补料分批的过程，合适地在0-100℃或0-80℃温度范围内，例如从约0℃到约50℃，和/或在例如从约2到约10pH下。优选的发酵条件是从约20℃到约45℃之间范围内的温度和/或从约3到约9之间的pH。适当的条件通常基于表达宿主的选择和要表达的蛋白质来选择。
发酵后，如果必须的话，可通过离心或过滤从发酵液中去除细胞。发酵停止或去除细胞后，可随后回收本发明的多肽，并且需要时通过常规手段纯化和分离。
多肽/酶组合物
本发明提供了包含本发明的多肽和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶和/或木质素酶或木质素-改性酶的组合物。
当本发明的多肽是纤维素酶时，除了本发明的多肽以外，本发明的组合物会典型地包含半纤维素酶和/或果胶酶和/或木质素酶或木质素-改性酶。
当本发明的多肽是半纤维素酶时，除了本发明的多肽以外，本发明的组合物会典型地包含纤维素酶和/或果胶酶和/或木质素酶或木质素-改性酶。
当本发明的多肽是果胶酶时，除了本发明的多肽以外，本发明的组合物会典型地包含纤维素酶和/或半纤维素酶和/或木质素酶或木质素-改性酶。
当本发明的多肽是木质素酶或木质素-改性酶时，除了本发明的多肽以外，本发明的组合物将典型地包含纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。
本发明的组合物可包含一类、两类或三类或更多类的纤维素酶，例如GH61、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)、外切-纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BGL)中的一种、两种或所有。
本发明的组合物可包含具有相同酶活性的多肽，例如与本发明多肽提供的活性相同类型的纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶活性。
本发明的组合物可包含与本发明的多肽提供的活性不同类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，本发明的组合物可包含本发明多肽提供的一种类型的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性和其他半纤维素酶/果胶酶提供的另一种类型的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在本文中，纤维素酶是能够降解纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，例如部分地降解成纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可得到纤维素糊精与葡萄糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。
本文中，半纤维素是能够降解半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。
本文中，果胶酶是能够降解果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。
本文中，木质素酶或木质素-改性酶是能够降解或改性木质素或其降解组分的任何多肽。能够降解或改性木质素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将木质素降解成更小的单元，或者部分地降解成例如单酚类化合物。与木质素接触时，根据本发明的木质素酶或木质素-改性酶可产生酚类化合物的混合类群。此类降解将典型地通过氧化反应而发生。本文中，木质素酶或木质素-改性酶还可以是能够降解木质素的酚类降解产物的任何多肽。能够降解木质素的酚类降解产物的多肽是能够催化下述过程的多肽：将木质素的酚类降解产物降解成更小的单元，例如通过催化酚环的开环反应。与木质素的酚类降解产物接触时，根据本发明的木质素酶或木质素-改性酶可产生酚类化合物的开环降解产物的混合类群。此类降解将典型地通过氧化反应而发生。木质素酶或木质素-改性酶还可以能够破坏纤维素或半纤维素和木质素或其降解产物之间的连接。能够降解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶、以及本领域所述的已知能够解聚或以其它方式破坏木质素聚合物的其它酶。还包括能够水解半纤维素糖(尤其是阿拉伯糖)和木质素之间所形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下酶的组：木质素过氧化物酶(EC1.11.14)、锰过氧化物酶(EC1.11.13)、漆酶(EC1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
因此，本发明的组合物可包含任何纤维素酶，例如GH61、纤维二糖水解酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
根据最新文献，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s)。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性的测量值，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。本文所使用的术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有被归类到广泛确认的CAZYGH分类系统(http://www.cazy.org/GH61.html)的家族61中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC3.2.1家族的成员。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。
本文中，纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链非还原末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。其可以具有EC代码EC.3.2.1.191。
本文中，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。内切-葡聚糖酶还可催化木葡聚糖的切割，木葡聚糖是β1→4-连接的葡萄糖残基骨架，其中大部分被1-6连接的木糖侧链取代，因而该酶因而被称为木葡聚糖特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶或木葡聚糖酶。
本文中，β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。所述酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这类酶的替代方案是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC3.2.1.6。当下述葡萄糖残基在C-3处被自身取代时，这类酶水解β-D-葡聚糖酶中的1,3-键或1,4-键，所述葡萄糖残基的还原基团涉及要水解的键。替代性的名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。
本发明的组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、纤维二糖水解酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
本文中，内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylanendoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键。
本文中，β-木糖苷酶(EC3.2.1.37；GH3)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本文中，α-D-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。
本文中，乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。此类多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三酰甘油的乙酰基水解。此类多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。
本文中，阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素附属酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
本文中，香豆酰基酯酶(EC3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H2O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。所述酶也落入EC3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
本文中，β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这样的多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。所述酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
本文中，β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
本文中，β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本发明的组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂合酶，果胶酸裂合酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
本文中，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
在本文中，果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸酯。所述酶也已知为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果酰基水解酶(pectinpectylhydrolase)。
在本文中，内切-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。所述酶也已知为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷键，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处乙酰基的脱乙酰基作用的乙酰基酯酶活性。
本文中，内切-果胶裂合酶(EC4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖。所述酶也可已知为果胶裂合酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂合酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶酶(pectolyase)，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。
本文中，果胶酸裂合酶(EC4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基的任何酶。该酶也可以已知为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果胶酸裂合酶，果胶裂合酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂合酶，PGA裂合酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂合酶，多聚半乳糖醛酸裂合酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。
本文中，α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以已知为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸、释放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶(EC4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱脂化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知为果胶酸二糖裂合酶，果胶酸外切裂合酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂合酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂合酶。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖结构由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替出现的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式、从严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
本文中，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
本文中，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被称作α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本文中，内切阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。所述酶也已知为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
本发明的组合物将一般包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶和/或至少一种果胶酶(所述酶之一是根据本发明的多肽)。本发明的组合物可包含纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。此类组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。
本发明的组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶葡糖醛酸糖苷酶中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分如糖之间键的酶(糖肽酶)。许多肽酶根据EC3.4表征，适合在本发明中使用并且通过引用并入本文。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够转移糖基、更特定地转移几糖基的酶。除了将糖基从含糖基的供体转移至另一含糖基的化合物受体以外，所述酶还能够将糖基转移至作为受体的水。所述反应也已知为水解反应而不是转移反应。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
本发明的组合物可包含扩展蛋白多肽或扩展蛋白样多肽，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimoetal.,Eur.J.Biochem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样多肽。
扩展蛋白涉及植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白——膨胀因子，含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。就本发明的目的而言，扩展蛋白样蛋白或膨胀因子样蛋白可包含此类结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
本发明的组合物可包含纤维素整合蛋白、支架蛋白或支架样蛋白的多肽产物，例如分别来自Clostridiumthermocellum或Clostridiumcellulolyticum的CipA或CipC。
支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将分解纤维素的亚基组合进多酶复合物中。这通过两类互补的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesiondomain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerindomain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。就本发明的目的而言，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一种或两种。
本发明的组合物可包含纤维素诱导的蛋白或调节蛋白，例如由来自Trichodermareesei/Hypocreajacorina的cipl或cip2基因或类似基因所编码的蛋白(见Foremanetal.,J.Biol.Chem.278(34).31988-31997,2003)。这些基因的多肽产物是双模块蛋白，其含有纤维素结合模块和其功能或活性不与已知的糖基水解酶家族相关的结构域。而纤维素结合模块的存在和这些基因的表达与纤维素酶元件的共同调节表明在生物质降解中具有潜在作用的先前未被认识的活性。
本发明的组合物可包含上文提到的多肽种类的任一成员、一个多肽种类的若干成员、或这些多肽种类的任何组合。
在本发明的组合物可以由来自以下的多肽(例如酶)组成：(1)供应商；(2)克隆基因表达的多肽，例如酶；(3)复合发酵液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白和酶)；(4)如(3)中生长的菌株的细胞裂解物；和/或(5)植物材料表达的多肽，例如酶。本发明组合物中不同的多肽，例如酶可得自不同的来源。
多肽的用途
根据本发明的多肽和多肽组合物可用于许多不同的应用中。例如，它们可被用于生产可发酵的糖。可发酵的糖随后可(作为生物燃料方法的部分)被转化成沼气或乙醇、丁醇、异丁醇、2丁醇或其他合适的物质。或者，多肽及其组合物可(例如在食物制品的生产中，在洗涤剂组合物中，在造纸工业和制浆工业中，和在抗菌配制物中，在药物制品例如润喉片、牙膏和漱口水中)用作酶。这些用途中的一些将在下文中更详细地阐述。
在下文所述地用途和方法中，上述组合物的组分可共同(即本身作为单一组合物)或单独或先后提供。
本发明还涉及根据本发明的纤维二糖水解酶和包含此类酶的组合物在工业方法中的用途。
尽管用这些方法获得了长期的经验，但是根据本发明的纤维二糖水解酶可具有优于目前所使用的酶的大量显著优点。根据具体的应用，这些优点可包括下述方面，例如更低的生产成本，更高的底物特异性，降低的抗原性，更少的不想要的副活性，在合适的微生物、更合适的pH和温度范围中生产时更高的产量，不受疏水的、来自木质素的产物抑制，或更少的产物抑制，或在食品工业情况下最终产物更好的口味或质地，以及食品级别和犹太教戒律方面。
原则上，纤维二糖水解酶或本发明的组合物可以在任何下述方法中使用，所述方法需要处理包含多糖的材料。因此，本发明的多肽或组合物可以在多糖材料的处理中使用。本文中，多糖材料是下述材料，所述材料包含一种或更典型地包含多于一种多糖或者基本由所述多糖组成。
典型地，植物和源自它们的材料包含大量非淀粉的多糖材料。因此，本发明的多肽可以用于植物或真菌材料或源自它们的材料的处理。
木质纤维素
植物非淀粉多糖材料的一个重要的组分是木质纤维素(在本文中也称作木质纤维素生物质)。木质纤维素是包含纤维素和半纤维素和木质素的植物材料。碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)与木质素通过氢键和共价键紧密结合。因此，本发明的多肽可以用于木质纤维素材料的处理。本文中，木质纤维素材料是包含木质纤维素或基本由木质纤维素组成的材料。因此，在用于处理非淀粉的多糖的本发明方法中，非淀粉的多糖可以是木质纤维素材料/生物质。
因此，本发明提供了用于处理包含非淀粉多糖的底物的方法，其中所述处理包括纤维素和/或半纤维素和/或果胶物质的降解和/或水解和/或改性。
降解在本文上下文中表示导致产生纤维素和/或半纤维素和/或果胶物质的水解产物(即与类似的未经处理的非淀粉多糖中存在的相比，由于处理而存在更短链的糖)的处理。因此，降解在本文上下文中可以导致寡糖和/或糖单体的释放。
所有植物都含有非淀粉的多糖，同样，基本上所有来自植物的多糖材料也含有非淀粉的多糖。因此，在本发明的用于处理包含非淀粉多糖的底物的方法中，所述底物可以以植物或源自植物的材料或包含植物或源自植物的材料的形式提供，例如以植物浆体、植物提取物、食品或其成分、织物、纺织品或衣物。
适合在本发明的方法中使用的木质纤维素生物质包括生物质，并可包括原生生物质(virginbiomass)和/或非原生生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米芯(corncobs)，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作麸或纤维的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是，但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotationwoodycrops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheatmidlings)，燕麦壳，和硬木材或软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，特定地包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。合适的生物质的其他例子是果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，树木，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。
除了已经在食物和饲料或造纸和制浆工业中加工的原生生物质或原料以外，生物质/原料可额外地用热、机械和/或化学改性或此类方法的任何组合预处理，从而增强酶降解。
预处理
为了以任何本领域已知的方式增强底物对酶水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或溶解半纤维素和/或纤维素和/或木质素，在酶处理之前，任选地可用热、机械、和/或化学改性或此类方法的任何组合对原料预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于(热)水、蒸汽(蒸汽爆破)酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多的组合。所述化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。
预糖化
预处理步骤后，可以使用涉及用酶或酶混合物孵育的液化/水解或预糖化步骤。预糖化步骤可以在许多不同的温度下进行，但是优选预糖化在最适合要测试的酶混合物的温度下，或针对要测试的酶预测的酶最适度下进行。预糖化步骤的温度范围可以是从约10℃到约95℃，约20℃到约85℃，约30℃到约70℃，约40℃到约60℃，约37℃到约50℃，优选地约37℃到约80℃，更优选地约60-70℃，进一步更优选地在65℃左右。预糖化混合物的pH可以在从约2.0到约10.0，但是优选地约3.0到约7.0，更优选地约4.0到约6.0，进一步更优选地约4.0到约5.0。另外，pH可以被调节以最大化酶活性，并且可以通过添加酶来调节。源自该检验的试验结果的比较将允许人们更改方法以最适合被测试的酶。
液化/水解或预糖化步骤反应可以进行数分钟到数小时，例如从约1小时到约120小时，优选地从约2小时到约48小时，更优选地从约2小时到约24小时，最优选地从约2小时到约6小时。纤维素酶处理可进行数分钟到数小时，例如从约6小时到约120小时，优选地约12小时到约72小时，更优选地约24小时到48小时。
糖化
本发明提供了由木质纤维素材料生产糖的方法，所述方法包括将本发明的多肽与木质纤维素材料接触。
此类方法允许由木质纤维素生物质生产游离的糖(单体)和/或寡糖。这些方法涉及用本发明的多肽或组合物将木质纤维素生物质转化成游离糖和小寡糖。
将复合碳水化合物如木质纤维素转化为糖的方法优选地允许转化成可发酵的糖。此类方法可以被称作“糖化”。因此，本发明的方法可导致一种或多种己糖和/或戊糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、核糖和果糖中的一种或多种)的释放。
因此，本发明的另一方面包括下述方法，所述方法与其它酶或物理处理(例如温度和pH)一起利用上文所述本发明的组合物的多肽，将木质纤维素植物生物质转化成糖和寡糖。
尽管组合物已作为单一混合物被讨论，但是认为酶可以先后添加，其中温度、pH和其他条件可以被改变，以提高每种个体酶的活性。或者，可以针对酶混合物测定最适pH和温度。
酶在任何适当的条件下与底物反应。例如，酶可以在约25℃，约30℃，约35℃，约37℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，约80℃，约85℃，约90℃或更高下孵育。也就是说，它们可以在从约20℃到约95℃下，例如在低到中等离子强度的缓冲液中和/或从低到中性pH下孵育。“中等离子强度”表示对任何单个离子组分而言，缓冲液具有约200毫摩尔(mM)或更少的离子浓度。pH可在从约pH2.5，约pH3.0，约pH3.5，约pH4.0，约pH4.5，约pH5，约pH5.5，约pH6，约pH6.5，约pH7，约pH7.5，约pH8.0，到约pH8.5的范围内。通常，pH范围会从约pH3.0到约pH7。为了生产乙醇，优选酸性介质，例如pH＝4，而为了生产沼气，期望中性pH例如pH＝7。在这些条件下孵育酶组合导致大量糖从木质纤维素释放或解离。大量表示可利用的糖的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
多肽(例如酶)可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并且将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆)等等可被加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至例如原料中。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵施用原料(例如玉米秆)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。
糖的发酵
可发酵的糖可以被转化成有用的增值的(value-added)发酵产物，其非限制性例子包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品(specialtychemicals)、化学品原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇。糖尤其可被用作用于原料，用于发酵成化学品、塑料、例如琥珀酸和(生物燃料)，包括乙醇、甲醇、丁醇合成液体燃料和沼气。
例如，在本发明的方法中，酶或酶的组合作用于发挥原料作用的木质纤维素底物或植物生物质上，从而将所述复合底物转化成简单的糖和寡糖，用于生产乙醇或其它有用的发酵产物。
从生物量释放的糖可被转化成有用的发酵产物，例如包括但不限于，氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品，化学品原料，塑料，和乙醇，包括燃料乙醇。
因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：
a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；以及
b.对得到的材料进行发酵；
由此制备发酵产物。
发酵可在需氧或厌氧条件下进行。优选地，所述方法在微需氧或氧受限的条件下进行。
厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗约5或更少、约2.5或更少、或约1mmol/L/h或更少氧，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体的发酵方法。
氧受限的发酵方法是其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物料转移性质决定。优选地，在氧受限条件下进行的方法中，氧消耗速率至少约5.5，更优选地至少约6，进一步更优选地至少约7mmol/L/h。
用于制备发酵产物的方法可任选地包括发酵产物的回收。
SSF
发酵和糖化也可以按照同时糖化和发酵(SSF)的模式进行。这种模式的优点之一是减少对酶促水解的糖抑制(对纤维素酶的糖抑制由CaminalB&BVolXXVIIPp1282-1290描述)。
发酵产物
可以根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇(术语“乙醇”被理解为包括乙醇或乙醇和水的混合物)。
可以通过本发明的方法生产的特定的增值产物包括但不限于生物燃料(包括乙醇和丁醇和沼气)；乳酸；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、衣康酸和顺丁烯二酸；3-羟基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；丙三醇；溶剂；动物饲料补充剂；药物，如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，如赖氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，苏氨酸和天冬氨酸；工业酶，如蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化还原酶，转移酶或木聚糖酶；和化学原料。
沼气
本发明还提供了本文所述的多肽或组合物在用于制备沼气的方法中的用途。沼气典型地表示由有机物质(例如含有非淀粉碳水化合物的材料)在不存在氧时生物降解而生产的气体。沼气源自生物源材料，并且是一种生物燃料。一种沼气由可生物降解的材料(例如生物质、粪便或污水、市政废弃物和能源作物)的厌氧消化或发酵生产。这种沼气主要由甲烷和二氧化碳组成。气体甲烷可以用氧燃烧或氧化。空气含有21％的氧。该能量释放允许沼气被用作燃料。在许多国家中沼气可被用作低成本燃料，用于任何加热目的，例如烹饪。其也可以被用在现代废弃物管理设备中，在那里其可以被用于运行任何类型的热引擎，从而产生机械力或电力。
微生物沼气生产的第一步由聚合物和复合底物(例如非淀粉碳水化合物)的酶促降解组成。因此，本发明提供了用于制备沼气的方法，其中包含非淀粉碳水化合物的底物与本发明的多肽或组合物接触，从而产生可发酵的材料，所述可发酵的材料可由生物(例如微生物)转化成沼气。在此类方法中，本发明的多肽可由生物提供，所述生物例如是表达此类多肽的微生物。
酶在食物制品中的用途
本发明的多肽和组合物可在下述方法中使用，所述方法加工植物材料，从而降解或改性植物或真菌材料细胞壁的纤维素或半纤维素或果胶物质组分。此类方法可用于制备食物制品。因此，本发明提供了制备食物制品的方法，所述方法包括在食物制品的制备期间掺入本发明的多肽或组合物。
本发明还提供了加工植物材料的方法，所述方法包括将植物材料与本发明的多肽或组合物接触，从而降解或改性(植物)材料中的纤维素。优选地，植物材料是植物浆体或植物提取物，例如汁液。
本发明还提供降低植物提取物的粘度、澄清度和/或过滤性的方法，所述方法包括将植物提取物与一定量的本发明的多肽或组合物接触，所述量有效降解植物提取物中所含的纤维素或半纤维素或果胶物质。
植物和含有纤维素/半纤维素/果胶物质的材料包括植物浆体、植物部分和植物提取物。在本发明的上下文中，来自植物材料的提取物是可通过提取(机械和/或化学)、加工或其他分离技术源自植物材料的任何物质。提取物可以是汁液、花蜜、碱或由其制成的浓缩物。植物材料可包含或源自蔬菜，例如胡萝卜、芹菜、洋葱、豆类或豆科植物(大豆、黄豆、豌豆)或水果，例如梨果或带种子的水果(seedfruit)(苹果、梨、柑橘等)、葡萄、西红柿、柑橘(橙、柠檬、枸橼、蜜桔)、甜瓜、洋李、樱桃、黑醋栗、红醋栗、覆盆子、草莓、蔓越莓、菠萝和其他热带水果，树及其部分(例如花粉，来自松树)，或谷物(燕麦、大麦、小麦、玉米、水稻)。(要被水解的)材料也可以是农业残余物，例如甜菜浆、玉米芯(comcobs)、小麦秸、(粉碎的)坚果壳，或可再生材料，例如(废)纸。
本发明的多肽因此可被用于处理植物材料，包括植物浆体和植物提取物。它们也可以被用于处理液体或固体食品或可食用的食品成分，或在植物油、淀粉的提取中使用，或被用作食物中的增稠剂。
典型地，本发明的多肽被用作上文所述的组合物/酶制剂。所述组合物通常会被添加至可通过例如机械加工(如挤压或研磨)植物材料获得的植物浆体中。组合物与植物的孵育会典型地进行从10分钟到5小时、例如30分钟到2小时、优选地约1小时的时间。加工温度优选地从约10℃到约55℃，例如从约15℃到约25℃，任选地约20℃，每吨要处理的材料可以使用从约10g到约300g，优选地从约30g到约70g，任选地约50g的酶。
使用的所有酶或它们的组合物可以被先后或同时添加至植物浆体中。根据酶制剂的组成，植物材料可首先被浸渍(例如至纯净)或液化。使用本发明的多肽，可以改进加工参数，例如提取产率、提取物粘度和/或提取物品质。
或者，或除上文以外，本发明的多肽可以被添加至通过压榨或液化植物浆体而获得的粗制汁液中。在剂量、温度和持续时间方面，粗制汁液的处理应与植物浆体以类似的方式进行。另外，可以包括其他酶，例如先前讨论的酶。典型的孵育条件如前一段中所述。
一旦用本发明的多肽孵育了粗制汁液，则随后可以离心或过滤(超滤)汁液以生产最终产物。
用本发明的多肽处理后，可以对(终)产物进行热处理，例如在约100℃下进行约1分钟到约1小时，在使本发明多肽部分或完全失活的条件下进行。
含有本发明多肽的组合物也可以在水果泥或蔬菜泥的制备期间使用。
本发明的多肽还可用于酿造、制果酒、蒸馏或烘焙中。因此，它可用于制备醇类饮料，例如果酒和啤酒。例如，它可改进例如啤酒、麦芽汁(例如含有大麦和/或高粱麦芽)或果酒的过滤性或澄清度。
此外，本发明的多肽或组合物可用于啤酒糟(brewersspentgrain，即来自啤酒麦芽汁生产的、含有大麦或发芽的大麦或其它谷物的残余物)的处理，以改进残余物的利用，例如用于动物饲料。
蛋白质可帮助从发酵液或培养基中去除溶解的有机物质，例如其中来自有机来源的蒸馏废弃物被生物转化为微生物生物质。本发明的多肽可改进比如来自由(例如用α-淀粉酶)液化产生的谷物的葡萄糖浆的过滤性和/或降低其粘度。
在烘焙中，多肽可改善面团结构，修饰其粘性或柔韧性，改进面包体积和/或碎屑结构，或赋予更好的质地特征，例如断裂品质、成条品质或碎屑品质。
本发明因此涉及用于制备面团或基于谷物的食物制品的方法，所述方法包括向面团中掺入本发明的多肽或组合物。相对于其中未掺入多肽的面团或基于谷物的食物制品而言，这可以改进面团或得自面团的基于谷物的食物制品的一种或多种特性。
根据本发明的基于谷物的食物制品的制备可包括本领域中已知的步骤，例如煮沸、干燥、油炸、蒸或烘焙获得的面团。
由煮过的面团制成的制品是例如煮过的面条、饺子，由炸过的面团制成的制品是例如面包圈、贝奈特饼、油炸面条，由蒸过的面团制成的制品是例如蒸馒头和蒸面，由干燥的面团制成的制品是意大利面和干面条，由烘焙的面团制成的制品是面包、饼干和蛋糕。
术语“经改进的特性”在本文中被定义为相对于其中未掺入根据本发明的多肽的面团或制品而言，被根据本发明的多肽作用改进的面团和/或由面团获得的制品、尤其是基于谷物的食物制品的任何特性。经改进的特性可包括但不限于，提高的面团强度，提高的面团弹性，提高的面团稳定性，经改进的面团可加工性，经改进的面团醒发抗性，降低的面团粘度，经改进的面团延伸性，提高的基于谷物的食物制品体积，降低的基于谷物的食物制品发泡性，经改进的烘焙制品碎屑结构，经改进的基于谷物的食物制品的柔软性，经改进的基于谷物的食物制品的风味，经改进的基于谷物的食物制品的抗老化性(anti-staling)。与意大利面和面条类型的基于谷物的制品相关的经改进的特性是例如经改进的硬度，降低的粘度，经改进的凝聚性和降低的烹调损失。
经改进的特性可通过添加或不添加本发明的多肽而制备的面团和/或基于谷物的食物制品的比较来确定。感官品质可以使用烘焙工业中公认的程序来评价，并且可包括使用例如受过训练的口味测试者小组。
术语“面团”在本文中被定义为足够坚硬到揉捏或滚动的谷物粉和其他成分的混合物。谷物的例子是小麦、黑麦、玉米、玉蜀黍、大麦、水稻、米粒(groats)、荞麦和燕麦。小麦在此处和下文中旨在包括Triticum属的所有种，例如aestivum、durum和/或spelta。合适的其他成分的例子是：根据本发明的纤维二糖水解酶，额外的酶，化学添加剂和/或加工助剂。面团可以是新鲜的、冷冻的、预制备的或预烘焙的。来自上述成分的面团的制备是本领域公知的，并且包括将所述成分与加工助剂混合，和一个或多个塑型(moulding)和任选的发酵步骤。冻面团的制备由KulpandLorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。
术语“基于谷物的食物制品”在本文中被定义为由面团制备的任何制品，无论具有软的特征还是具有易碎的特征。可有利地通过本发明生产的基于谷物的食物制品的例子(无论是白色、浅色或深色类型)是面包(尤其是白面包、全麦面包或黑麦面包)，典型地是面包片或面包卷的形式，法棍型面包，意大利面，面条，面包圈，百吉饼，蛋糕，皮塔饼(pitabread)，玉米饼(tortillas)，墨西哥卷饼(tacos)，蛋糕，煎饼，饼干，曲奇，派皮(piecrusts)，蒸面包(steamedbread)和脆面包(crispbread)等等。
术语“烘焙制品”在本文中被定义为通过烘焙面团制备的任何基于谷物的食物制品。
非淀粉多糖(NSP)能够提高食糜(digesta)的粘度，这可进而降低营养可用度和动物表现。本发明的纤维二糖水解酶的使用能够提高磷利用，以及动物食糜期间的阳离子矿物质和蛋白质。
对饲料添加特定的养分会改进动物消化并从而降低饲料成本。目前正在使用大量饲料添加剂，并且持续开发出新的概念。使用特定的酶(例如非淀粉碳水化合物降解酶)能够分解纤维，释放能量，以及提高蛋白质可消化性，因为纤维分解时有更好的蛋白质可达性。藉此，饲料成本能够降低，并且饲料中的蛋白质水平也能降低。
非淀粉多糖(NSP)事实上也存在于植物来源的所有饲料成分中。NSP利用较差，并且在溶解时能够显示对消化的不良影响。外源酶能够有助于更好地利用这些NSP，并因此降低任何抗营养效应。本发明的非淀粉碳水化合物降解酶可在基于谷物的家禽膳食中被用于该目的，或者在更小的程度上用于猪和其他物种。
本发明的非淀粉碳水化合物降解多肽/酶(包含本发明多肽/酶的组合物)可在洗涤剂工业中使用，例如用于从洗衣房中去除基于碳水化合物的污点。洗涤剂组合物可包含本发明的多肽/酶，另外包含一种或多种纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，蛋白酶，脂肪酶，角质酶，淀粉酶或碳水化合物酶。
酶在洗涤剂组合物中的用途
包含本发明多肽或组合物的洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如糊剂、凝胶、粉末或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有最多约70％的水和从约0到约30％的有机溶剂或非水性材料。
此类洗涤剂组合物可例如被配制为手洗洗涤剂组合物或机洗洗涤剂组合物，包括适用于预处理脏污织物的洗衣添加组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或被配制成用于一般居家硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或被配制用于手洗或机洗的洗碗操作。
通常，酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容(例如pH-最适度，与其他酶和/或非酶成分的相容性等等)，并且酶应当以有效量存在。
洗涤剂组合物可包含表面活性剂，例如阴离子或非离子型表面活性剂，洗涤剂增量组分或复合剂，一种或多种聚合物，漂白系统(例如H2O2源)或酶稳定剂。洗涤剂组合物也可包含任何其他常规的洗涤剂成分，例如护理剂包括粘土，泡沫加强剂，sud抑制剂，抗腐蚀剂，土壤悬浮剂，土壤再沉淀剂，染料，杀菌剂，光学增亮剂，助水溶物，晦暗抑制剂(tarnishinhibitor)或香料。
酶在造纸和浆体加工中的用途
本发明的多肽可用于造纸和制浆工业，尤其是漂白过程中，以增强被漂白的浆体的亮度，从而可以降低漂白阶段中使用的氯，并且提高浆体在再循环造纸方法中的自由度(Eriksson,K.E.L.,WoodScienceandTechnology24(1990):79-101；Paice,etal.,Biotechnol.andBioeng.32(1988):235-239andPommieretal.,TappiJournal(1989):187-191)。另外，本发明的多肽或组合物可被用于处理木质纤维素浆体，从而改进其可漂白性。因此可以降低获得令人满意的浆体漂白所需要的氯量。
本发明的多肽或组合物可被用于下述方法中，所述方法降低含纤维素的织物变得粗糙的速率，或降低含纤维素的织物的粗糙度，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理含纤维素的织物。本发明还涉及为有色的含纤维素的织物提供色彩澄清的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理有色的含有纤维素的织物，和在有色的含纤维素的织物中提供局部变化的方法，所述方法包括用上文所述的多肽或组合物处理有色的含纤维素的织物。本发明的方法可以通过在洗涤期间处理含纤维素的织物来进行。然而，需要时织物的处理也可以在浸泡或漂洗期间进行，或简单地通过将上文所述的多肽或组合物添加至浸渍或要浸渍织物的水中来进行。
其他酶用途
另外，本发明的多肽或组合物也可以被用于抗菌配制物中以及药物制品例如润喉糖、牙膏和漱口水中。
以下实施例示例本发明：
实施例
实验信息
菌株和酶组合物
Aspergillusniger菌株被保藏在CBS机构，保藏号为CBS513.88。
Rasamsonia(Talaromyces)emersonii菌株TEC-142在2009年7月1日被保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(CENTRAALBUREAUVOORSCHIMMELCULTURES),乌普萨兰8号,邮箱85167,NL-3508AD乌特勒支,荷兰，其具有登录号CBS124902。TEC-142S是TEC-142的单一分离物。
Rasamsonia(Talaromyces)emersonii菌株在1964年12月被保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(CENTRAALBUREAUVOORSCHIMMELCULTURES),乌普萨兰8号,邮箱85167,NL-3508AD乌特勒支,荷兰，其具有登录号CBS393.64。其它合适的菌株可被同样用于本发明的实施例中以展示本发明的效果和优点。例如，WO2011/000949中所述的TEC-101,TEC-147,TEC-192,TEC-201或TEC-210是合适的Rasamsonia菌株。
根据如WO2011/000949中所述的程序(例如接种和发酵)来生产包含TEC-210纤维素酶的组合物。
如下生产β-葡糖苷酶(BG)：如WO2011/098577中所述在Aspergillusniger中过表达EBA4，随后发酵Aspergillusniger转化体。EBA4是Rasamsoniaemersonii(Talaromycesemersonii)BG，其在WO2011/098577中被鉴定为T.emersoniiβ-葡糖苷酶(BG)并在WO2011/098577中用SEQIDNO:5来代表。
Celluclast(Trichoderma纤维素酶)获自Sigma。
分子生物学技术
在这些菌株中，使用技术人员已知的分子生物学技术(参见：Sambrook&Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，CSHLPress，ColdSpringHarbor，NY，2001)，一些基因被过表达且另一些基因被下调(如下所述)。过表达基因的表达载体和用于下调的破坏载体的一般设计、转化、标记和选择培养基的使用的实例可在WO199846772、WO199932617、WO2001121779、WO2005095624、WO2006040312、EP635574B、WO2005100573、WO2011009700、WO2012001169和WO2011054899中找到。所有基因置换载体包含各个ORF序列的约1-2kb侧翼区以在预定的基因组位点靶向同源重组。此外，A.niger载体在直接重复之间含有A.nidulans双向amdS选择标记用于转化。本文的所有实施例中实施基因缺失的方法都使用线型DNA，其通过双交换在侧翼序列的同源位点整合至基因组，从而用amdS基因替换待被缺失的基因。转化后，通过(第二)同源重组事件，直接重复允许除去选择性标记。通过涂布在荧光乙酰胺培养基上可以实现除去amdS标记，导致筛选无标记基因菌株。利用这种转化和随后的反选择(在EP0635574中也被称为"无标记基因(MARKER-GENEFREE)"方法)策略，可以在菌株修饰程序中无限使用amdS标记。
培养基和溶液：
马铃薯右旋糖琼脂，PDA，(Fluka,货号70139)：每升：4g马铃薯提取物；20g右旋糖；15g细菌琼脂；pH5.4；在120℃下灭菌20分钟。
Rasamsonia琼脂培养基：每升：15g3号盐级分；30g纤维素；7.5g细菌蛋白胨；15g谷物面粉；5gKH2PO4；1gCaCl2.2H2O；20g细菌琼脂；pH6.0；在120℃下灭菌20分钟。
盐级分组合物：“3号盐级分”与WO98/37179中表1的公开内容相符。与这个表中组合物的差异是：1.0g/l的CaCl2.2H2O、1.8g/L的KCl和0.45g/L的一水柠檬酸(螯合剂)。
Rasamsonia摇瓶培养基
Rasamsonia培养基1：每升：20g葡萄糖；20g酵母提取物(Difco)；4滴ClerolFBA3107(AF)；pH6.0；在120℃下灭菌20分钟。
Rasamsonia培养基2：每升：15g3号盐级分；20g纤维素；4g细菌蛋白胨；7.5g谷物面粉；10gKH2PO4；0.5gCaCl2.2H2O；0.4mlClerolFBA3107(AF)；pH5；在120℃下灭菌20分钟。
Rasamsonia培养基3：每升：15g3号盐级分；50g葡萄糖；7.5g细菌蛋白胨；10gKH2PO4；0.5gCaCl2.2H2O；0.4mlClerolFBA3107(AF)；pH5；在120℃下灭菌20分钟。
Rasamsonia孢子批量制备
使来自储备的菌株在10cm直径培养皿中的Rasamsonia琼脂培养基上在40℃下生长5-7天。对于MTP发酵，菌株生长于含有Rasamsonia琼脂培养基的96孔板中。菌株储备在-80℃下存储于10％甘油中。
染色体DNA分离
使菌株在42℃、250rpm的条件下于YGG培养基(每升：8gKCl、16g葡萄糖.H2O、20ml10％酵母提取物、10ml100×青霉素/链霉素、6.66gYNB+氨基酸、1.5g柠檬酸和6gK2HPO4)中生长16小时，然后使用DNeasy植物小提试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离染色体DNA。
Rasamsonia的MTP发酵
含有形成孢子的R.emersonii菌株的96孔微量滴定板(MTP)被用于收获MTP发酵的孢子。为此，向每个孔中加入200μl10倍稀释的Rasamsonia培养基1，重悬混合物，然后在44℃、550rpm和80％湿度下在湿度瓶(Infors)中孵育100μl孢子悬浮液16小时。随后，使用50μl预培养物接种至MTP板中的250μlRasamsonia培养基2。在44℃，550rpm和80％湿度的条件下，在湿度瓶(Infors)中孵育96孔板6天。离心板并收获上清液。
Rasamsonia的摇瓶生长流程
将孢子直接接种到含100mlRasamsonia培养基2或3的500ml摇瓶中并在45℃、250rpm下在震荡培养箱中孵育3-4天。或者，将孢子接种到含Rasamsonia培养基1的100ml摇瓶中并在45℃、250rpm下在震荡培养箱中孵育1天(预培养)，随后将5ml或10ml来自预培养物的生物质转移至含100mlRasamsonia培养基2或3的500ml摇瓶中并在如上所述条件下生长。
蛋白分析
在还原条件下，在NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Breda，荷兰)上分离蛋白样品并染色。根据制造商的说明，用InstantBlue(Expedeon，Cambridge，英国)、SimplyBluesafestain(Invitrogen，Breda，荷兰)或SyproRuby(Invitrogen，Breda，荷兰)将凝胶染色。
总蛋白含量
根据Bradford法测定回收上清液的蛋白含量。利用Bradford蛋白试验、使用Coomassie蛋白试剂来测定酶样品中蛋白的量。将25μl经恰当稀释的酶样品与1.2mlCoomassie试剂混合。10分钟后，在室温下使用分光光度计(UvikonXL)测定混合物在595nm处的吸光度。相较于BSA标准品来计算蛋白含量。
从酸预处理的玉米秆原料的糖-释放活性试验
对于每种(半-)纤维素酶试验条件，根据以下程序一式两份地分析酶培养上清液：将5mg蛋白质/g干物质原料的酶培养上清液转移至合适的小瓶中，该小瓶含有800μl在50mM柠檬酸缓冲液(缓冲为pH3.5或pH4.5或5.0)中的2.5％(w/w)干物质的弱酸预处理的玉米秆底物。此外，作为空白样品，将相同量的酶培养上清液加入另一个小瓶中，其中用缓冲为pH4.5的800μl50mM柠檬酸缓冲液代替800μl在50mM柠檬酸缓冲液中的2.5％(w/w)干物质的弱酸预处理的玉米秆底物。使缓冲为pH3.5的试验样品在65℃下孵育72小时。使缓冲为pH5.0的试验样品在50℃下孵育72小时。使缓冲为pH4.5的试验样品、用于校正酶上清液中单体糖含量的空白样品在65℃下孵育72小时。此外，使缓冲为pH4.5的试验样品在75℃下孵育72小时。
除了如上所述的单独孵育之外，还检测酶培养上清液与两种不同半纤维素酶混合物的组合；向TEC-210(Rasamsoniaemersonii)中加入额外的β-葡糖苷酶(BG)(表达来自Rasamsoniaemersonii的BG的Aspergillusniger菌株)(0.08mg/g干物质)并向Celluclast(Trichodermareesei)中加入额外的BG(Novozym-188)(0.08mg/g干物质)。将混合物加入浓度为1mg蛋白质/g干物质的原料中。这些孵育在与上文所述相同的条件下进行。
对于每个程序，均进行用去离子水代替酶上清液的试验，以校正孵育后可能存在于原料中的单体糖。
孵育试验样品之后，将固定体积的内标物、马来酸(20g/L)、EDTA(40g/L)和DSS(2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸)(0.5g/L)加入到每个小瓶中。离心之后，将650μl上清液转移至新的小瓶中。
将样品的上清液过夜冻干，随后向干燥的残余物中加入50μLD2O并再次冻干。将干燥的残余物溶解在600μLD2O中。在配备有N2冷却的低温探针的BrukerAvanceIIIHD400MHz上记录1D1HNMR图谱，其中采用如下脉冲程序：无水压制、温度为17℃、90度激发脉冲，采集时间为2.0s且松弛延迟为10s。基于以下信号计算分析物浓度(δ相对于DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸))：1/2的在4.63ppm的β-葡萄糖峰(d,0.31H,J＝8Hz)，1/2的在4.56ppm的β-木糖峰(d,0.315H,J＝8Hz)，在4.45ppm的木-寡聚峰(d,1H,J＝8Hz)，1/2的在4.66ppm的纤维二糖还原末端的β异头物峰(d,0.31H,J＝8Hz)。标准品的信号使用者：在6.26ppm的马来酸峰(s,2H)。
(半-)纤维素酶溶液可含有残余糖。因此，针对孵育酶溶液后测量到的糖含量校正试验结果。
β-木糖苷酶活性测量
该试验测量通过β-木糖苷酶对对-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(PNPX)的作用而释放的对-硝基苯酚。1个β-木糖苷酶活性单位是在60℃、pH4.5下，在1分钟内释放1微摩对-硝基苯酚的酶量。如下制备醋酸缓冲液(0.1M，pH4.5)：将8.2g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中以使溶液的终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将6.0g(5.72ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)。每升缓冲溶液中加入1滴(～25μL)TritonX-100。PNPX(Sigma)被用作试验底物。
将100mgPNPX溶解在84mL0.1M醋酸缓冲液中以获得4.4mM储液。如下制备终止试剂(1M碳酸钠溶液)：将10.6g无水碳酸钠溶解在50ml蒸馏水中，并将溶液体积调节为100ml。该试剂被用来终止酶促反应。
对于与酶一起的孵育，将0.1mL4.4mMPNPX储液与0.1mL恰当稀释的酶样品混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AS。
对于底物空白，将0.1mL4.4mMPNPX储液与0.1mL0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)混合并进行与样品相同的处理：在60℃下孵育60分钟，然后将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为ASB。
测量酶空白(不添加底物)以校正源自酶的背景颜色。将0.1mL恰当稀释的酶样品与0.1mL0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AEB。
以1:1的比率与1M碳酸钠溶液混合的对-硝基苯酚(在0.1M醋酸缓冲液中恰当稀释，pH4.5)的校准曲线被用来量化通过酶的作用其从PNPX的释放。
酶与底物一起孵育之后，使用校正的吸光度(＝AS-AEB-ASB)来计算通过酶释放的对-硝基苯酚的量。
活性被表示为：在试验条件下，每分钟释放1μM对-硝基苯酚所需的酶量。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH3、GH30、GH39、GH43、GH52和GH54酶。
β-木糖苷酶活性试验2
该试验测量通过β-木糖苷酶对木二糖的作用而释放的木糖。
如下制备醋酸钠缓冲液(0.05M，pH4.5)：将4.1g无水醋酸钠或6.8g醋酸钠*3H2O溶解在蒸馏水中至终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将3.0g(2.86ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.05M醋酸钠缓冲液(pH4.5)。木二糖购自Sigma，将其溶解在pH4.5的醋酸钠缓冲液中至浓度为100μg/mL。
如下文所详述进行试验。
以1mg蛋白质/g底物和5mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入底物中，然后在62℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效阴离子交换色谱来分析木糖的释放。
底物空白
代替酶培养上清液，向底物溶液中加入相同量的缓冲液，然后在62℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效阴离子交换色谱来分析样品。使用配备有DionexCarboPacPA-1(2mmIDx250mm)柱、CarboPacPA保护柱(2mmIDx50mm)和DionexPAD-检测器(DionexCo.Sunnyvale)的DionexHPLC系统来进行分析。采用0.3mL/分的流速并采用以下在0.1MNaOH中的醋酸钠的梯度：0-20分钟，0-180mM。每次洗脱之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用0.1MNaOH的15分钟平衡步骤。
如果存在使木糖鉴定复杂化的干扰化合物，则如下进行分析：利用水等强度运行30分钟，梯度(以0.1mL/分柱后加入0.5MNaOH用于检测)之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用H2O的15分钟平衡步骤。
木糖和木二糖的标准品(Sigma)用于鉴定底物和通过酶形成的产物。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH3、GH30、GH39、GH43、GH52和GH54酶。
β-木糖苷酶活性试验3
利用木聚糖底物(如燕麦阿拉伯木聚糖、山毛榉木木聚糖和桦木木聚糖(Sigma))代替木二糖进行如上所述的相同试验以测量对聚合底物的木糖苷酶活性。
试验条件相同，例外是：将所有底物溶解为浓度为2mg/mL。以10mg/g的剂量在60℃下孵育24小时。除了木糖和木二糖之外，还对木三糖和木四糖进行定量。
α-半乳糖苷酶活性测量
该试验测量通过α-半乳糖苷酶对对-硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(PNPG)的作用而释放的对-硝基苯酚。1个α-半乳糖苷酶活性单位是在60℃、pH4.5下，在1分钟内释放1微摩对-硝基苯酚的酶量。如下制备醋酸缓冲液(0.1M，pH4.5)：将8.2g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中以使溶液的终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将6.0g(5.72ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)。每升缓冲溶液中加入1滴(～25μL)TritonX-100。PNPG(Sigma)被用作试验底物。
在0.1M醋酸缓冲液中制备4.4mMPNPG的储液。如下制备终止试剂(1M碳酸钠溶液)：将10.6g无水碳酸钠溶解在50ml蒸馏水中，并将溶液体积调节为100ml。该试剂被用来终止酶促反应。
对于与酶一起的孵育，将0.1mL4.4mMPNPG储液与0.1mL恰当稀释的酶样品混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AS。
对于底物空白，将0.1mL4.4mMPNPG储液与0.1mL0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)混合并进行与样品相同的处理：在60℃下孵育60分钟，然后将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为ASB。
测量酶空白(不添加底物)以校正源自酶的背景颜色。将0.1mL恰当稀释的酶样品与0.1mL0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AEB。
以1:1的比率与1M碳酸钠溶液混合的对-硝基苯酚(在0.1M醋酸盐缓冲液中恰当稀释，pH4.5)的校准曲线被用来量化通过酶的作用其从PNPG的释放。
酶与底物一起孵育之后，使用校正的吸光度(＝AS-AEB-ASB)来计算通过酶释放的对-硝基苯酚的量。
活性被表示为：在试验条件下，每分钟释放1μM对-硝基苯酚所需的酶量。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH4、GH27和GH36酶。
木葡聚糖酶活性试验1
如下制备醋酸钠缓冲液(0.05M，pH4.5)：将4.1g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中至终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将3.0g(2.86ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.05M醋酸盐缓冲液(pH4.5)。
将罗望子木葡聚糖溶解在醋酸钠缓冲液中至获得2.0mg/mL。以10mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入底物中，然后在60℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效阴离子交换色谱法来分析寡聚糖的释放。
作为空白样品，以相同方式处理和孵育底物但不添加酶。
作为参照，还利用来自TrichodermaReesei的商业化纤维素酶制品(Celluclast；Sigma)在相同条件下孵育底物，将所述商业化纤维素酶制品稀释50倍，然后向孵育中加入20μL。
使用配备有DionexCarboPacPA-1(2mmIDx250mm)柱、CarboPacPA保护柱(2mmIDx50mm)和DionexPAD-检测器(DionexCo.Sunnyvale)的DionexHPLC系统来进行分析。采用0.3mL/分的流速并采用以下在0.1MNaOH中的醋酸钠的梯度：0-40分钟，0-150mM。每次洗脱之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用0.1MNaOH的15分钟平衡步骤。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH5、GH12、GH16、GH44和GH74酶。
木葡聚糖酶活性试验2
以下实例阐释了测量木葡聚糖酶活性的试验。通过使用木葡聚糖作为底物和还原糖试验(PAHBAH)作为检测方法来展示此类活性。将值与标准品进行比较，所述标准品使用来自TrichodermaReesei的商业化纤维素酶制品(Celluclast；Sigma)制备而来。
试剂A：将5g对-羟基苯甲酰肼(PAHBAH)悬浮在60mL水中，然后加入4.1mL浓盐酸并将体积调节为100ml。试剂B：将24.9g柠檬酸三钠溶解在500ml水中。向该溶液中加入2.2g氯化钙和40g氢氧化钠。利用水将体积调节为2L。这两种试剂均在室温下贮存。工作试剂：将10ml试剂A加入到40ml试剂B中。该溶液每天新鲜制备并在使用之间贮存在冰上。使用以上试剂，如下文所详述来进行试验。
除了木葡聚糖之外，还使用羟甲基纤维素作为底物来测定酶的特异性。
孵育之后，将每孔的10μl与200μl工作试剂混合。在70℃下加热这些溶液持续30。冷却后，通过测量在405nm处的吸光度来分析样品。使用葡萄糖作为标准品来量化作为葡萄糖等价物形成的还原末端。
作为对照，还不添加酶培养上清液来孵育底物和不添加底物来孵育酶培养上清液。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH5、GH12、GH16、GH44和GH74酶。
木葡聚糖酶活性试验3
如下制备醋酸钠缓冲液(0.05M，pH4.5)：将4.1g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中至终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将3.0g(2.86ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.05M醋酸盐缓冲液(pH4.5)。
将罗望子木葡聚糖溶解在醋酸钠缓冲液中至获得2.0mg/mL。以10mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入底物中，然后在60℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效尺寸排阻色谱法来分析较低分子量寡糖的形成。
作为空白样品，以相同方式处理和孵育底物但不添加酶。
作为参照，还利用来自例如Aspergillusniger或TrichodermaReesei的商业化纤维素酶制品在相同条件下孵育底物(所述纤维素酶标准品处于其自身的最适温度下以防失活，在60℃下)。
使用高效尺寸-排阻色谱法(HPSEC)进行分析，其在TosohBioscience的SuperAW4000、SuperAW3000、SuperAW2500系列的3个TSK-凝胶柱(每个柱为6.0mm×15.0cm)和PWX保护柱(TosohBioscience)上进行。在55℃下，利用0.2M硝酸钠以0.6mL/分的速率进行洗脱。使用ShodexRI-101(Kawasaki)折射率(RI)检测器监测洗脱物。通过使用分子量在0.18–788kDa范围内的支链淀粉(AssociatedPolymerLabsInc.,NewYork,美国)来进行校准。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH5、GH12、GH16、GH44和GH74酶。
α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性试验
以下实例阐释了测量α-阿拉伯呋喃糖苷酶从经取代的木糖残基中移除α-L-阿拉伯呋喃基残基的能力的试验。
为了将阿拉伯木聚糖充分降解为阿拉伯糖和木糖，需要若干酶活性，包括内切-木聚糖酶和阿拉伯呋喃苷糖酶。来自小麦的阿拉伯木聚糖分子被阿拉伯糖基高度取代。这些分子可在木糖基残基的C2或C3位置被取代(单取代)，或在木糖的C2和C3两个位置被取代(双取代)。
如下制备单取代和双取代的寡糖；将在50mM醋酸盐缓冲液(pH4.5)中的小麦阿拉伯木聚糖(WAX；10mg/mL；Megazyme,Bray,爱尔兰)与恰当量的内切-木聚糖酶(来自Aspergillusawamori,KormelinkF.等人；JournalofBiotechnology(1993)27:249-265)在40℃下孵育48小时以产生足量的阿拉伯木寡糖。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。以10.000xg离心样品5分钟。上清液用于进一步的实验。阿拉伯木聚糖降解之后，通过高效阴离子交换色谱法(HPAEC)来分析形成的还原糖。
以10mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入在50mM醋酸钠缓冲液中的单取代和双取代的阿拉伯木寡糖(内切-木聚糖酶处理的WAX；2mg/mL)中，然后在65℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。以10.000xg离心样品5分钟。通过HPAEC分析来跟踪阿拉伯糖的释放。
使用配备有DionexCarboPacPA-1(2mmIDx250mm)柱、CarboPacPA保护柱(2mmIDx50mm)和DionexPAD-检测器(DionexCo.Sunnyvale)的DionexHPLC系统来进行分析。采用0.3mL/分的流速并采用以下在0.1MNaOH中的醋酸钠的梯度：0-40分钟，0-400mM。每次洗脱之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用0.1MNaOH的15分钟平衡步骤。利用标准品(Sigma)来鉴定和量化阿拉伯糖的释放。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH3、GH43、GH51、GH54和GH62酶。
内切-木聚糖酶活性试验
内切-木聚糖酶是能够水解木聚糖骨架中的β-1,4键，从而产生短木寡糖的酶。该试验测量通过木聚糖酶对小麦阿拉伯木聚糖(WAX)(Megazyme,中粘度29cSt)、燕麦阿拉伯木聚糖、山毛榉木木聚糖和桦木木聚糖(Sigma)的作用而释放的木糖和木寡糖。
如下制备醋酸钠缓冲液(0.05M，pH4.5)：将4.1g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中至终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将3.0g(2.86ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.05M醋酸钠缓冲液(pH4.5)。将每种底物溶解在醋酸钠缓冲液中至获得2.0mg/mL。以10mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入底物中，然后在60℃下孵育20小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效阴离子交换色谱法来分析木糖和木寡糖的释放。
作为空白样品，以相同方式处理和孵育底物但不添加酶。
使用配备有DionexCarboPacPA-1(2mmIDx250mm)柱、CarboPacPA保护柱(2mmIDx50mm)和DionexPAD-检测器(DionexCo.Sunnyvale)的DionexHPLC系统来进行分析。采用0.3mL/分的流速并采用以下在0.1MNaOH中的醋酸钠的梯度：0-40分钟，0-400mM。每次洗脱之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用0.1MNaOH的15分钟平衡步骤。利用木糖、木二糖和木三糖的标准品(Sigma)来鉴定通过酶的作用而释放的这些寡聚物。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH5、GH8、GH10和GH11。
α/β-木糖苷酶活性测量
该试验测量通过α/β-木糖苷酶对对-硝基苯基-α/β-D-吡喃木糖苷(PNPX)的作用而释放的对-硝基苯酚。1个β-木糖苷酶活性单位是在60℃、pH4.5下，在1分钟内释放1微摩对-硝基苯酚的酶量。如下制备醋酸盐缓冲液(0.1M，pH4.5)：将8.2g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中以使溶液的终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将6.0g(5.72ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)。每升缓冲溶液中加入1滴(～25μL)TritonX-100。PNPX(Sigma)被用作试验底物。
将100mgPNPX溶解在84mL0.1M醋酸盐缓冲液中以获得4.4mM储液。如下制备终止试剂(1M碳酸钠溶液)：将10.6g无水碳酸钠溶解在50ml蒸馏水中，并将溶液体积调节为100ml。该试剂被用来终止酶促反应。
对于与酶一起的孵育，将0.1mL4.4mMPNPX储液与0.1mL恰当稀释的酶样品混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AS。
对于底物空白，将0.1mL4.4mMPNPX储液与0.1mL0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)混合并进行与样品相同的处理：在60℃下孵育60分钟，然后将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为ASB。
测量酶空白(不添加底物)以校正源自酶的背景颜色。将0.1mL恰当稀释的酶样品与0.1mL0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AEB。
以1:1的比率与1M碳酸钠溶液混合的对-硝基苯酚(在0.1M醋酸盐缓冲液中恰当稀释，pH4.5)的校准曲线被用来量化通过酶的作用其从PNPX的释放。
酶与底物一起孵育之后，使用校正的吸光度(＝AS-AEB-ASB)来计算通过酶释放的对-硝基苯酚的量。
活性被表示为：在试验条件下，每分钟释放1μM对-硝基苯酚所需的酶量。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH3、GH30、GH31、GH39、GH43、GH52和GH54酶。
α/β-甘露糖苷酶活性测量
该试验测量通过α/β-甘露糖苷酶对对-硝基苯基-α/β-D-吡喃甘露糖苷(PNPM)的作用而释放的对-硝基苯酚。1个α/β-甘露糖苷酶活性单位是在60℃、pH4.5下，在1分钟内释放1微摩对-硝基苯酚的酶量。如下制备醋酸盐缓冲液(0.1M，pH4.5)：将8.2g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中以使溶液的终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将6.0g(5.72ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)。每升缓冲溶液中加入1滴(～25μL)TritonX-100。PNPM(Sigma)被用作试验底物。
在0.1M醋酸盐缓冲液中制备4.4mMPNPM储液。如下制备终止试剂(1M碳酸钠溶液)：将10.6g无水碳酸钠溶解在50ml蒸馏水中，并将溶液体积调节为100ml。该试剂被用来终止酶促反应。
对于与酶一起的孵育，将0.1mL4.4mMPNPM储液与0.1mL恰当稀释的酶样品混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AS。
对于底物空白，将0.1mL4.4mMPNPM储液与0.1mL0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)混合并进行与样品相同的处理：在60℃下孵育60分钟，然后将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为ASB。
测量酶空白(不添加底物)以校正源自酶的背景颜色。将0.1mL恰当稀释的酶样品与0.1mL0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)混合并在60℃下孵育60分钟。孵育60分钟之后，将0.1mL反应混合物与0.1mL1M碳酸钠溶液混合并在微量滴定板中在405nm下测量吸光度作为AEB。
以1:1的比率与1M碳酸钠溶液混合的对-硝基苯酚(在0.1M醋酸盐缓冲液中恰当稀释，pH4.5)的校准曲线被用来量化通过酶的作用其从PNPM的释放。
酶与底物一起孵育之后，使用校正的吸光度(＝AS-AEB-ASB)来计算通过酶释放的对-硝基苯酚的量。
活性被表示为：在试验条件下，每分钟释放1μM对-硝基苯酚所需的酶量。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH1、GH2、GH5、GH38、GH47、GH92和GH125酶。
阿魏酸酯酶活性测量
合成的底物：咖啡酸甲酯、香豆酸甲酯、芥子酸甲酯和阿魏酸甲酯获自ApinChemicals。通过以约5mg/gDM(pH5.0)(50mM醋酸钠缓冲液)的剂量将酶与底物一起孵育来测定对这些合成的底物的活性。反应在60℃下进行多达24小时。
在孵育结束时，将样品煮5分钟以使酶失活，然后在室温下离心(10分钟，10000×g)。如前所述(Appeldoorn等人,2010)，通过负离子模式的RP-UHPLC-MS分析在配备有HypersylGOLD柱(2.1mm×150mm,1.9μm粒径；ThermoScientific)的AccelaUHPLC系统(ThermoScientific)上测量从底物释放的羟基肉桂酸。流动相由(A)H2O+1％(v/v)乙腈+0.2％(v/v)乙酸和(B)乙腈+0.2％(v/v)乙酸构成。流速为0.4mL/分，且柱温为30℃。洗脱谱如下：前5分钟，0％B等强度；5-23分钟，从0％B至50％B线性；23-24分钟，从50％B至100％B线性；24-27分钟，在100％B等强度；27-28分钟，从100％B至0％B线性，随后使柱回复持续7分钟。从200nm到600nm收集谱图数据，并在320nm处进行量化。基于标准品来鉴定和量化阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和香豆酸的含量。
以负离子模式收集MS数据，其中喷雾电压为3.5kV，毛细管电压为-20V且毛细管温度为350C。在m/z＝150-1500的范围内进行全MS扫描，并获得了最强离子的MS2数据。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于CE1酶。
阿魏酸酯酶活性测量
天然存在的底物：以约5mg/gDM(pH5.0)(50mM醋酸钠缓冲液)的剂量将由预处理的玉米纤维(CF)(每种1mg/ml)纯化的阿拉伯木聚糖寡聚物与阿魏酸酯酶一起孵育。在60℃下持续达到24h时，将完成反应。
在孵育结束时，将样品煮5分钟以使酶失活，然后在室温下离心(10分钟，10000×g)。如前所述(Appeldoorn等人,2010)，通过负离子模式的RP-UHPLC-MS分析在配备有HypersylGOLD柱(2.1mm×150mm,1.9μm粒径；ThermoScientific)的AccelaUHPLC系统(ThermoScientific)上测量从底物释放的羟基肉桂酸。流动相由(A)H2O+1％(v/v)乙腈+0.2％(v/v)乙酸和(B)乙腈+0.2％(v/v)乙酸构成。流速为0.4mL/分，且柱温为30℃。洗脱谱如下：前5分钟，在0％B等强度；5-23分钟，从0％B至50％B线性；23-24分钟，从50％B至100％B线性；24-27分钟，在100％B等强度；27-28分钟，从100％B至0％B线性，随后使柱回复持续7分钟。从200nm到600nm收集谱图数据，并在320nm处进行量化。基于标准品来鉴定和量化阿魏酸和香豆酸的含量。
以负模式收集MS数据，其中离子喷雾电压为3.5kV，毛细管电压为-20V且毛细管温度为350C。在m/z＝150-1500的范围内进行全MS扫描，并获得了最强离子的MS2数据。
在碱解和乙醚提取之后，采用上述的UHPLC方法来测定玉米寡聚物中酯-连接的阿魏酸的总量。
参考文献：MAAIKEM.APPELDOORN等人,J.Agric.FoodChem.2010,58,11294–11301
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于CE1酶。
α-葡糖醛酸酶活性试验
下述实例阐释了测量对糖醛酸(aldouronicacid，megazyme)的α-葡糖醛酸酶活性的试验。该试验测量通过α-葡糖醛酸酶对葡糖醛酸木聚糖寡糖的作用而释放的木糖和木糖寡聚物(xylooligomer)。
如下制备醋酸钠缓冲液(0.05M，pH4.5)：将4.1g无水醋酸钠溶解在蒸馏水中至终体积为1000ml(溶液A)。在单独的烧瓶中，将3.0g(2.86ml)冰醋酸与蒸馏水混合以使总体积为1000ml(溶液B)。通过将溶液A与溶液B混合直至获得溶液的pH等于4.5来制备最终的0.05M醋酸盐缓冲液(pH4.5)。
为了测定对小的寡聚物的活性，将糖醛酸溶解在醋酸钠缓冲液中至获得1.0mg/mL。以1mg蛋白质/g底物和10mg蛋白质/g底物的剂量将酶培养上清液加入底物中，然后在60℃下孵育24小时。通过在100℃下加热样品10分钟来终止反应。通过高效阴离子交换色谱法来分析由于除去4-O-甲基葡糖醛酸而释放的木糖寡聚物。
作为空白样品，以相同方式处理和孵育底物但不添加酶。
使用配备有DionexCarboPacPA-1(2mmIDx250mm)柱、CarboPacPA保护柱(2mmIDx50mm)和DionexPAD-检测器(DionexCo.Sunnyvale)的DionexHPLC系统来进行分析。采用0.3mL/分的流速并采用以下在0.1MNaOH中的醋酸钠的梯度：0-40分钟，0-400mM。每次洗脱之后是利用在0.1MNaOH中的1000mM醋酸钠的5分钟洗涤步骤和利用0.1MNaOH的15分钟平衡步骤。
利用木糖、木二糖和木三糖的标准品(Sigma)来鉴定通过从这些寡聚物中除去4-O-甲基葡糖醛酸的酶的作用而释放的木糖寡聚物。
该试验可被用来检验酶的活性，所述酶例如但不限于GH67和GH115酶。
实施例1：A.niger表达载体的构建
该实施例描述了用于在A.niger中过表达Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的表达构建体的构建。对Rasamsoniaemersonii菌株CBS393.64的基因组DNA进行测序并分析。鉴定如下基因：其翻译的蛋白质被注释为具有根据表1中的活性。序列表SEQIDNO:1-75中显示了R.emersoni的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163和Temer07305基因的序列，其包含经密码对优化的ORF序列、蛋白序列、信号序列、基因组序列和野生型cDNA序列。
表达质粒的构建
利用EcoRI和PacI位点将具有SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71的序列克隆入pGBTOP载体(图1)中，所述载体包含葡糖淀粉酶启动子和终止子序列。在转化A.nigerCBS513.88之前，通过NotI消化除去E.coli部分。
A.niger的转化和摇瓶发酵
根据实验信息部分所述的方法，用表达构建体和含恰当选择标记(amdS或腐草霉素)的质粒共转化A.niger菌株CBS513.88。对于重组和对照A.niger菌株，通过将孢子或菌丝体涂布在根据制造商说明制备的PDA平板(马铃薯右旋糖琼脂，Oxoid)上来产生大批孢子。在30℃下生长3-7天之后，向平板中加入0.01％TritonX-100后收集孢子。用无菌水洗涤之后，将约107个选择的转化体和对照菌株的孢子接种至含有20ml液体预培养培养基的100ml带挡板的摇瓶中，每升所述液体预培养培养基由如下组成：30g麦芽糖.H2O；5g酵母提取物；10g水解酪蛋白；1gKH2PO4；0.5gMgSO4.7H2O；0.03gZnCl2；0.02gCaCl2；0.01gMnSO4.4H2O；0.3gFeSO4.7H2O；3gTween80；10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)；pH5.5。使这些培养物在34℃下生长16-24小时。将10ml该培养物接种到含100ml发酵培养基的500ml带挡板的摇瓶中，每升所述发酵培养基由如下组成：70g葡萄糖.H2O；25g水解酪蛋白；12.5g酵母提取物；1gKH2PO4；2gK2SO4；0.5gMgSO4.7H2O；0.03gZnCl2；0.02gCaCl2；0.01gMnSO4.4H2O；0.3gFeSO4.7H2O；10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)；将pH调节至5.6。使这些培养物在34℃下生长直至耗尽所有的葡萄糖(通常在4-7天之后)。在摇摆斗式离心机(swingingbucketcentrifuge)中离心(10分钟，以5000xg)取自发酵液的样品，然后收集上清液并通过0.2μm的滤膜(Nalgene)进行过滤。
通过SDS-PAGE和总蛋白测量来分析上清液中Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163和Temer07305的表达。
实施例2：R.emersonii表达载体的构建
该实施例描述了用于在R.emersonii中过表达Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的表达构建体的构建。表达盒被靶向整合在RePepA位点。
为了将启动子-报告子(reporter)构建体靶向pepA位点，克隆表达载体用于靶向。在基因组中鉴定其翻译的蛋白质被注释为蛋白酶pepA的基因。序列表76、77和78中分别展示了Rasamsoniaemersonii的pepA(RePepA)序列，其包含ORF和约3000bp5’区域和2500bp3’侧翼区域的基因组序列、cDNA和蛋白质序列。
根据常规克隆程序构建两个载体用于靶向RePepA位点。两个载体的插入片段一起能被应用于所谓的“二重基因靶向”方法(Nielsen等人，2006，43:54-64)。这种方法使用重叠的选择标记的两个无功能DNA片段(二重方法的更多细节还参见WO2008113847)连同基因靶向序列。正确的同源重组后，选择标记通过在同源靶位点的整合变得有功能。如还在WO2008113847中详述的，设计和构建两个不同的缺失载体Tepep.bbn和pEBA1006以能够提供用于二重基因靶向的两个重叠的DNA分子。第一个载体Tepep.bbn(总体布局请参见图2)包含用于靶向RePepA位点的RePepAORF上游约1.5kb的1500bp5’侧翼区域(ORF和约1500bpRePepA启动子)、lox66位点和由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码区域的无功能5’部分(PgpdA-ble序列缺失ble的3’末端编码序列的最后104个碱基，SEQIDNO:79)。为了允许在E.coli中有效克隆启动子-报告子盒，将ccdB基因插入5’RePepA侧翼序列和lox66位点之间。第二个pEBA1006载体(总体布局请参见图3)包含ble编码区域的无功能3’部分和A.nidulanstrpC终止子(ble-TtrpC序列缺失ble的5’末端编码序列的开始12个碱基，SEQIDNO:80)、lox71位点和用于靶向RePepA位点的RePepAORF的2500bp3’侧翼区域。同源重组后，第一个和第二个无功能的片段变得有功能，其产生有功能的ble盒。RePepA上游和下游基因侧翼区都在预定的RePepA基因组位点靶向二重片段的同源重组。
根据常规克隆程序，用Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305表达盒替换Tepep.bbn载体中的ccdB基因。将SEQIDNO:81所代表的R.emersonii启动子2克隆在带有A.nidulansamdS终止子的R.emersonii的Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305编码区域的上游，从而产生构建体pEBA。A.nidulansamdS终止子序列由SEQIDNO:82表示。图4中展示了用于过表达目的基因(GOI)的pEBA的示意图，所述GOI为Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305。
实施例3：在Rasamsoniaemersonii中过表达Temer00088、Temer09484、 Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、 Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、 Temer08570、Temer08163或Temer07305基因
分离pEBA和pEBA1006的线型DNA并利用之前WO2011/054899中所述的方法用所述线型DNA转化Rasamsoniaemersonii。线型DNA可共同整合入基因组的RePepA位点，从而用Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305和ble基因置换RePepA基因。在腐草霉素培养基上选择转化体并根据WO2011/054899中所述的程序来纯化和检验菌落。使用缺失盒的gpdA启动子中的引物和针对紧邻5’靶向区域紧邻上游的基因组序列的引物通过PCR来鉴定生长菌落在RePepA位点的整合。获得了其中RePepA被Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305/ble盒置换的候选转化体。
实施例4：Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、 Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、 Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或 Temer07305过表达Rasamsoniaemersonii菌株中的酶活性
在摇瓶中的Rasamsonia培养基3中发酵Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305过表达菌株并在合适的试验中分析根据表1的活性。与野生型菌株相比，在Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305过表达菌株的上清液中观察到了活性增加，这表示：Temer00088、Temer09484、Temer08028、Temer02362、Temer08862、Temer04790、Temer05249、Temer06848、Temer02056、Temer03124、Temer09491、Temer06400、Temer08570、Temer08163或Temer07305的过表达改进了R.emersonii中的活性。
实施例5：Aspergillusniger摇瓶发酵
将约107个选择的转化体和对照菌株的孢子接种至含有20ml液体预培养培养基的100ml带挡板的摇瓶中，每升所述液体预培养培养基由如下组成：30g麦芽糖.H2O；5g酵母提取物；10g水解酪蛋白；1gKH2PO4；0.5gMgSO4.7H2O；0.03gZnCl2；0.02gCaCl2；0.01gMnSO4.4H2O；0.3gFeSO4.7H2O；3gTween80；10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)；pH5.5。使这些培养物在34℃下生长16-24小时。将10ml该培养物接种到含100ml发酵培养基的500ml带挡板的摇瓶中，每升所述发酵培养基由如下组成：70g葡萄糖.H2O；25g水解酪蛋白；12.5g酵母提取物；1gKH2PO4；2gK2SO4；0.5gMgSO4.7H2O；0.03gZnCl2；0.02gCaCl2；0.01gMnSO4.4H2O；0.3gFeSO4.7H2O；10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)；将pH调节至5.6。使这些培养物在34℃下生长直至耗尽所有的葡萄糖(通常在4-7天之后)。在摇摆斗式离心机(swingingbucketcentrifuge)中离心(10分钟，以5000xg)取自发酵液的样品，然后收集上清液并通过0.2μm的滤膜(Nalgene)进行过滤。
利用TCA-双缩脲法测定摇瓶浓度和蛋白浓度
为了获得更大量的材料用于进一步的检测，使用10kDa旋转过滤器将如上所述获得的发酵上清液(体积在75-100ml之间)浓缩至体积约为5ml。随后，通过TCA-双缩脲法测定浓缩上清液中的蛋白浓度。
用水将浓缩的蛋白样品(上清液)稀释至浓度在2-8mg/ml之间。制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0、1、2、5、8和10mg/ml)并作为样品被包括以产生校准曲线。将270μl每种经稀释的蛋白样品转移至含830μl12％(w/v)在丙酮中的三氯乙酸溶液的10ml管中并充分混合。随后，将管在冰水上孵育1小时，然后在4℃、6000rpm下离心30分钟。丢弃上清液，通过将管倒置在纸巾上并使它们在室温下持续30分钟来干燥沉淀，接下来，将3mlBioQuant双缩脲试剂混合物加入管中的沉淀中，通过混合使沉淀溶解，然后加入1ml水。使管充分混合并在室温下孵育30分钟。利用水样品作为空白测量，在546nm处测量混合物的吸光度并通过BSA校准线计算蛋白浓度。
实施例6：鉴定嗜热性RasamsoniaemersoniiTemer09484的β-木糖苷酶对木 二糖的活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer09484的β-木糖苷酶活性。浓缩Temer09484A.niger摇瓶发酵的上清液并以两种剂量分析在pH4.5、62℃下孵育24小时后从木二糖释放的木糖。如表3中所示，酶显示出了显著的从木二糖的木糖释放。这显示：Temer09484具有β-木糖苷酶活性。
表3：在pH4.5、62℃下孵育24小时后，RasamsoniaemersoniiTemer09484对从木二糖(100ug/mL)的木糖释放的影响。
蛋白质ID 剂量(mg/g DM) 木糖产物(ug/mL)
无酶 0 0
Temer09484 1 100
Temer09484 5 100
实施例7：鉴定嗜热性RasamsoniaemersoniiTemer09484的β-木糖苷酶对聚 合木聚糖底物的活性
作为第二个实验，还通过聚合木聚糖底物分析RasamsoniaemersoniiTemer09484的β-木糖苷酶活性。以10mg/g的剂量将Temer09484A.niger摇瓶发酵的上清液加入3种不同的聚合木聚糖底物中。所有3种底物均释放出木糖(表4)而不形成木糖寡聚物。这显示：除了实施例6中所示的小寡聚物之外，Temer09484还对聚合底物有β-木糖苷酶活性。
表4：在pH4.5、60℃下以10mg/gDM的剂量孵育24小时后，RasamsoniaemersoniiTemer09484对从一些木聚糖底物的木糖释放的影响。
ug/mL*
底物(2mg/mL) 木糖
山毛榉木木聚糖 320
桦木木聚糖 250
燕麦阿拉伯木聚糖 334
*当不加入酶时，所有底物含有<3.0ug/mL木糖
实施例8：通过添加用于水解木质纤维素原料的Temer09484来改进两种不 同的纤维素混合物
浓缩Temer09484A.niger摇瓶发酵的上清液并掺入上述经弱酸预处理的玉米秆原料中。如表5中所示，在72小时孵育期间采用的宽范围温度(50℃、65℃和75℃)和pH值(3.5-4.5-5.0)下，酶显示出了显著的从这种原料的木糖释放。这显示：Temer09484对木质纤维素原料的水解很重要。
表5：在不同的温度/pH条件下孵育72小时后，RasamsoniaemersoniiTemer09484对从弱酸预处理的玉米秆原料的木糖释放(g/L)的影响。
还将Temer09484A.niger摇瓶发酵的上清液与2种不同的纤维素混合物(TEC-210和Celluclast，二者均加入额外的BG)组合来进行检验。如表6中所示，在72小时孵育期间采用的宽范围温度(50℃、65℃和75℃)和pH值(3.5-4.5-5.0)下，对于两种纤维素混合物，通过添加Temer09484改进了从弱酸预处理的玉米秆的木糖释放。这显示：在用于木质纤维素原料水解的宽范围温度和pH值下，Temer09484可被用来改进纤维素混合物。
表6：将RasamsoniaemersoniiTemer09484掺入两种不同的纤维素混合物时，在不同的温度/pH条件下孵育72小时后，其对从弱酸预处理的玉米秆原料的木糖释放(g/L)的影响。
实施例9：通过木二糖鉴定嗜热性RasamsoniaemersoniiTemer00088的β-木 糖苷酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer00088的β-木糖苷酶活性。浓缩Temer09484A.niger摇瓶发酵的上清液并以两种剂量分析在pH4.5、62℃下孵育24小时后从木二糖释放的木糖。如表7中所示，酶显示出了显著的从木二糖的木糖释放。这显示：Temer00088具有β-木糖苷酶活性。
表7：在pH4.5、62℃下孵育24小时后，RasamsoniaemersoniiTemer00088对从木二糖(100ug/mL)的木糖释放的影响。
蛋白质ID 剂量(mg/g DM) 木糖产物(ug/mL)
无酶 0 0
Temer00088 1 76
Temer00088 5 99
实施例10：通过聚合木聚糖底物鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii Temer00088的β-木糖苷酶活性
作为第二个实验，还通过聚合木聚糖底物分析RasamsoniaemersoniiTemer00088的β-木糖苷酶活性。以10mg/g的剂量将Temer00088A.niger摇瓶的上清液加入3种不同的聚合木聚糖底物中。所有3种底物均释放出木糖(表8)而不形成木糖寡聚物。这显示：除了实施例9中所示的小寡聚物之外，Temer00088还对聚合底物有β-木糖苷酶活性。
表8：在pH4.5、60℃下以10mg/gDM的剂量孵育20小时后，RasamsoniaemersoniiTemer00088对从一些木聚糖底物的木糖释放的影响。
ug/mL*
底物(2mg/mL) 木糖
山毛榉木木聚糖 373
桦木木聚糖 469
燕麦阿拉伯木聚糖 298
*当不加入酶时，所有底物含有<3.0ug/mL木糖
实施例11：通过添加用于水解木质纤维素原料的Temer00088来改进两种 不同的纤维素混合物
浓缩Temer00088A.niger摇瓶发酵的上清液并掺入上述经弱酸预处理的玉米秆原料中。如表3中所示，在72小时孵育期间采用的宽范围温度(50℃、65℃和75℃)和pH值(3.5-4.5-5.0)下，酶显示出了显著的从这种原料的木糖释放。这显示：Temer00088对木质纤维素原料的水解很重要。
表9：在不同的温度/pH条件下孵育72小时后，RasamsoniaemersoniiTemer00088对从弱酸预处理的玉米秆原料的木糖释放(g/L)的影响。
还将Temer00088A.niger摇瓶发酵的上清液与2种不同的纤维素混合物(TEC-210和Celluclast，二者均加入额外的BG)组合来进行检验。如表10中所示，在72小时孵育期间采用的宽范围温度(50℃、65℃和75℃)和pH值(3.5-4.5-5.0)下，对于两种纤维素混合物，通过添加Temer00088改进了从弱酸预处理的玉米秆的木糖释放。这显示：在用于木质纤维素原料水解的宽范围温度和pH值下，Temer00088可被用来改进纤维素混合物。
表10：将RasamsoniaemersoniiTemer00088掺入两种不同的纤维素混合物时，在不同的温度/pH条件下孵育72小时后，其对从弱酸预处理的玉米秆原料的木糖释放(g/L)的影响。
实施例12：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的木葡聚糖特异性内切葡聚 糖酶
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer04790的木葡聚糖活性。浓缩Temer04790A.niger摇瓶发酵的上清液，然后加入到底物木葡聚糖中并在pH4.5、60℃下孵育24小时。如图6中所示，酶能够释放一些寡聚物。这显示：Temer04790对木葡聚糖有活性并释放与商业化的来自Trichodermareesei的纤维素酶混合物Celluclast相似的寡聚物。
为了对寡聚物的量进行定量，在孵育Temer04790和纤维素酶混合物二者之后测量所形成的还原末端。羧甲基纤维素还被用作测定酶特异性的底物，且除了60℃之外，还使用较高的温度75℃。与纤维素酶混合物相比，Temer04790对木葡聚糖是特异性的，几乎观察不到任何对CMC的活性(表11)。此外，Temer04790在75℃下仍然有活性，但纤维素混合物在75℃下对木葡聚糖几乎无活性。
表11：在pH4.5、60℃和75℃下孵育24小时后，通过还原末端形成(被表示为葡萄糖当量(ug/mL))测量到的RasamsoniaemersoniiTemer04790对木葡聚糖(罗望子)和羧甲基纤维素(CMC)(Sigma)的水解的影响。
*Celluclast来自Thrichodermareesei(Sigma)
实施例13：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的阿拉伯呋喃糖苷酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer05249的阿拉伯呋喃糖苷酶活性。浓缩Temer05249A.niger摇瓶发酵的上清液并以10mg/g加入阿拉伯糖木糖寡聚物(arabinoxylooligomer)，随后在pH4.5、65℃下孵育24小时。如表12中所示，酶显示出了显著的从阿拉伯糖木糖寡聚物的阿拉伯糖释放。这显示：Temer05249具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
表12：在pH4.5、65℃下以10mg/gDM的剂量孵育24小时后，RasamsoniaemersoniiTemer05249对从小麦阿拉伯木聚糖(用内切-木聚糖酶预孵育)的阿拉伯糖释放的影响。
蛋白质ID 阿拉伯糖(ug/mL)
无酶 4
Temer05249 111
实施例14：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的内切-木聚糖酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer03124的内切-木聚糖酶活性。浓缩Temer03124A.niger摇瓶发酵的上清液并以10mg/g加入一些木聚糖底物，随后在pH4.5、60℃下孵育20小时。如表13中所示，酶显示出了显著的木糖和一系列木糖寡聚物释放。这显示：Temer03124具有内切木聚糖酶活性。
表13：在pH4.5、60℃下以10mg/gDM的剂量孵育20小时后，RasamsoniaemersoniiTemer03124对从一些木聚糖底物的木糖和木糖寡聚物释放的影响。
*当不加入酶时，所有底物含有<3.5ug/mL测量的每种产物
实施例15：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的内切-木聚糖酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer08570的内切-木聚糖酶活性。浓缩Temer08570A.niger摇瓶发酵的上清液并以10mg/g加入一些木聚糖底物，随后在pH4.5、60℃下孵育20小时。如表14中所示，酶显示出了显著的木糖和一系列木糖寡聚物释放。这显示：Temer08570具有内切-木聚糖酶活性，其中木二糖、木三糖和木四糖作为主要产物。
表14：在pH4.5、60℃下以10mg/gDM的剂量孵育20小时后，RasamsoniaemersoniiTemer08570对从一些木聚糖底物的木糖和木糖寡聚物释放的影响。
*当不加入酶时，所有底物含有<3.5ug/mL测量的每种产物
实施例16：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的内切-木聚糖酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer08163的内切-木聚糖酶活性。浓缩Temer08163A.niger摇瓶发酵的上清液并以10mg/g加入一些木聚糖底物，随后在pH4.5、60℃下孵育20小时。如表15中所示，酶显示出了显著的木二糖和木糖释放。这显示：Temer08570具有内切-木聚糖酶活性，其中木二糖作为主要产物，木二糖为所释放木糖的量的12-25倍。
表15：在pH4.5、60℃下以10mg/gDM的剂量孵育20小时后，RasamsoniaemersoniiTemer08163对从一些木聚糖底物的木糖和木糖寡聚物释放的影响。
*所有底物含有<3.5ug/mL测量的每种产物
实施例17：鉴定嗜热性Rasamsoniaemersonii的α-葡糖醛酸酶活性
如上所述分析RasamsoniaemersoniiTemer07305的α-葡糖醛酸酶活性。浓缩Temer07305A.niger摇瓶发酵的上清液并加入1mg/g和10mg/g的糖醛酸，随后在pH4.5、60℃下孵育24小时。如表16中所示，酶能够从木糖寡聚物中移除4-O-甲基葡糖醛酸，从而导致木糖、木二糖、木三糖和木四糖的同时释放。这显示：Temer07305具有α-葡糖醛酸酶活性。
表16：在pH4.5、60℃下以1mg/g和10mg/gDM的剂量孵育24小时后，作为从这些木糖寡聚物水解4-O-甲基葡糖醛酸的结果，通过RasamsoniaemersoniiTemer07305从糖醛酸的木糖和木糖寡聚物释放。

Claims (12)

1.具有半纤维素酶活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的氨基酸序列，或者SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71、SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或者其变体多肽或变体多核苷酸，其中所述变体多肽与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的序列具有至少75％的序列同一性或者所述变体多核苷酸编码与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72中所示的序列具有至少75％的序列同一性的多肽。
2.根据权利要求1的多肽，其具有β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、木葡聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切-木聚糖酶、甘露糖苷酶/木糖苷酶、阿魏酸酯酶、木糖苷酶、内切-外切-木聚糖酶或α-葡糖醛酸酶活性。
3.编码半纤维素酶的核酸序列，其中所述核酸序列选自：
(a)与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71、SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核酸序列具有至少70％同一性的核酸序列；
(b)与SEQIDNO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66或71、SEQIDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69或74或SEQIDNO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75的核酸序列的互补物杂交的核酸序列；
(c)编码以下的核酸序列：(i)SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列，(ii)与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，(iii)与SEQIDNO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67或72的氨基酸序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸不同的氨基酸序列；或者
(d)核苷酸序列，其是(a)、(b)或(c)中所限定核苷酸序列的反向互补物。
4.核酸构建体或载体，其包含根据权利要求1或2所述的多核苷酸。
5.细胞，其包含根据权利要求1或2的多肽或根据权利要求3的核酸构建体或载体，优选地所述细胞是真菌细胞，优选地是选自以下的真菌细胞：Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma属。
6.根据权利要求5的细胞，其中一个或更多个基因被完全或部分缺失、敲除或破坏，其中任选地所述基因编码蛋白酶。
7.制备根据权利要求1或2的多肽的方法，所述多肽具有半纤维素酶活性，所述方法包括：在允许所述多肽表达的条件下培养根据权利要求4-6中任一项的细胞，和任选地，回收所表达的多肽。
8.组合物，其包含：(i)根据权利要求1或2的多肽和；(ii)纤维素酶和/或额外的半纤维素酶和/或果胶酶。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述纤维素酶是GH61、纤维二糖水解酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
10.根据权利要求8或9的组合物，其中所述额外的半纤维素酶是内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、纤维二糖水解酶、阿魏酸酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
11.一种处理包含半纤维素的底物的方法，所述底物任选地是植物材料，所述方法包括：使所述底物与根据权利要求1或2的多肽和/或根据权利要求8-10中任一项的组合物相接触。
12.根据权利要求1或2的多肽和/或根据权利要求8-10中任一项的组合物用于由木质纤维素材料生产糖的用途。
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