DE69534185T2

DE69534185T2 - Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht-pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren

Info

Publication number: DE69534185T2
Application number: DE69534185T
Authority: DE
Inventors: C. John ROYER; L. Donna MOYER; Wendy Yoder; R. Jeffrey SHUSTER
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2015-06-16
Also published as: US5837847A; EP0777737B1; DE69534185D1; WO1996000787A1; CN101659926A; JP3511005B2; JP2001169791A; FI965220A; CN1151762A; ATE294871T1; JPH10500024A; AU2705895A; FI119437B; FI965220A0; EP1559776A2; EP1559776A3; JP3167729B2; EP0777737A1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen nützliche Wirtszelle. Insbesondere betrifft die Erfindung nicht-toxische, nicht-toxigene, nicht-patogene Fusarium-Pilzwirtszellen, die in einer hochgradigen Expression von rekombinanten Proteinen, insbesondere Enzymen verwendet werden können. Die Erfindung betrifft des Weiteren Promoter- und Terminator-Sequenzen, die in einem derartigen System verwendet werden können.
2. HINTERGRTUND DER ERFINDUNG
Die Verwendung von rekombinanten Wirtszellen bei der Expression von heterologen Proteinen vereinfachte in den letzten Jahren die Herstellung von kommerziell wertvollen Proteinen, die sonst nur durch Reinigung aus ihren nativen Quellen erhältlich sind. Gegenwärtig gibt es eine abwechslungsreiche Auswahl an Expressionssystemen, welche zur Herstellung eines beliebigen vorgegebenen Proteins ausgewählt werden können und prokaryotische und eukaryotische Wirte einschließen. Die Auswahl eines geeigneten Expressionssystems hängt häufig nicht nur von der Fähigkeit der Wirtszelle, adäquate Ausbeuten eines Proteins in aktivem Zustand zu erzeugen, ab, sondern kann in großem Maße auch von der beabsichtigten Endwerwendung des Proteins bestimmt werden.
Obwohl Säuger- und Hefewirtszellen am Häufigsten eukariotische Wirte verwendeten, wurde nun erkannt, dass Fadenpilze als Wirtszellen für die rekombinante Proteinherstellung sehr nützlich sind. Beispiele für gegenwärtig in solchen Verfahren verwendete oder zur Verwendung vorgeschlagene Fadenpilze sind Neurospora crassa, Acremonium chrysogenum, Tolypocladium geodes, Mucor circinelloides und Trichoderma reesei, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger und Aspergillus oryzae.
Bestimmte Spezies der Gattung Fusarium wurden nun als Modelsysteme für die Studien der Pflanzenpathogene und Genregulierung verwendet, wie Fusarium oxysporum (Diolez et al., 1993, Gene 131: 61–67; Langin et al., 1990, Curr. Genet. 17: 313–319; Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 und Kistler and Benny, 1988, Curr. Genet. 13: 145–149), Fusarium solani (Crowhurst et al., 1992, Curr. Genet. 21: 463–469) und Fusarium culmorum (Curragh et al., 1992, Mycol. Res. 97: 313–317). Diese Fusarium sp. wären auf Grund ihrer unerwünschten Eigenschaften, wie dass sie als Pflanzenpathogene vorliegen, oder auf Grund dessen, dass sie unsichere Gehalte an Mycotoxin erzeugen, für die Herstellung von heterologen Proteinen kommerziell ungeeignet. Dickman und Leslie (1992, Mol. Gen. Genet. 235: 458–462) offenbaren die Transformation von Gibberella zeae mit einem Plasmid, das nit-2 von Neurospora crassa enthält. Der in Dickman and Leslie offenbarte Stamm von Gibberella zeae ist ein Pflanzenpathogen und erzeugt Zearalenon, ein östrogenes Mycotoxin. Sanchez-Fernandez et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 231–233) offenbart die Transformation von Gibberella fujikoroi, das eine niaD-Mutation mit einem das niaD-Gen von Aspergillus niger enthaltende Plasmid trägt.
Bei einem idealen Expressionssystem handelt es sich um eines, das im Wesentlichen frei von Protease und Mycotoxin-Herstellung und auch im Wesentlichen frei von großen Mengen an anderen Endogen hergestellten sezernierten Proteinen ist und zu höheren Expressionsgraden als bekannte Wirtszellen fähig ist. Die vorliegende Erfindung stellt nun neue diese Anforderungen erfüllende Fusarium-Expressionsysteme bereit.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine rekombinante nicht-toxische, nicht-toxigene und nicht-pathogene Fusarium-Wirtszelle bereit, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein funktionsfähig an einen Promoter gebundenes heterologes Protein kodiert. Wie hier definiert bedeutet „nichttoxisch", dass die Wirtszelle für Pflanzen oder Tiere nicht als Gift wirkt. Zum Beispiel würde eine Fusarium-Wirtszelle als nicht-toxisch betrachtet werden, wenn innerhalb von etwa 14 Tagen, nachdem etwa 5 Mäusen eine Dosis von etwa 20 ml eines (1:1-verdünnten) drei Tage alten Fusarium-Kulturmediums/kg Körpergew./Maus injiziert wurden, keine der Mäuse infolge der Fusarium-Behandlung stirbt. Wie hier definiert bedeutet „nicht-toxigen", dass die Wirtszellen im Wesentlichen frei von Mycotoxin, wie bestimmt durch standardmäßige analytische Verfahren wie HPLC-Analyse, ist. Zum Beispiel kann eine Menge von Fusarium, den man in festes Nährstoffinedium enthaltenden Petrischalen mit 2 × 9 cm wachsen ließ, mit organischen Lösungsmitteln extrahiert und 0,5% des Extraktes zur Analyse in eine HPLC-Apparatur injiziert werden. Die Abwesenheit von bekannten Mycotoxinen wäre durch die Abwesenheit von nachweisbaren HPLC-Peaks an den für Mycotoxinstandard bekannten Positionen abgeleitet. Wie hier verwendet bedeutet „nicht-pathogen", dass die Wirtszellen keine nennenswerte Erkrankung in gesunden Pflanzen oder gesunden Tieren verursachen. Zum Beispiel kann ein für Pflanzen pathogener Fusarium sp. einen Pilzinbefall des Xylem-Gewebes der Pflanze zeigen und zu einem durch typische Welksymptome gekennzeichneten Krankheitszustand führen. Wie hier definiert, ist ein „heterologes Protein" ein für die Wirtszelle nicht natives Protein oder ein natives Protein, in welchem zum Abändern der nativen Sequenz Modifikationen durchgeführt wurden, oder ein natives Protein, dessen Expression infolge einer Manipulation einer für die Expression des nativen Proteins erforderlichen nativen Regulationssequenz wie eines Promoters, einer Ribosombindungsstelle usw. oder einer anderen Manipulation der Wirtszelle durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ abgeändert wird. Die Nukleinsäuresequenz ist funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz gebunden, die die Transkription der Nukleinsäuresequenz in der ausgewählten Wirtszelle leiten kann.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, wobei das Verfahren das Züchten einer Wirtszelle einer der vorstehend erwäh nen Spezies, wobei die Wirtszelle eine ein heterologes Protein kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, unter die Expression des Proteins leitenden Bedingungen und Gewinnen des Proteins aus der Kultur umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um ein Pilzprotein, besonders bevorzugt ein Pilzenzym. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden mindestens etwa 0,5 Gramm heterologes Protein/1 Wirtszelle hergestellt.
Die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung sezerniert unerwarteterweise nur geringe Mengen an Protease, wie bestimmt durch den im nachstehenden Abschnitt 6.1. beschriebenen Caseinbeseitigungstest; insbesondere werden nur geringe oder keine Hydrolysezonen nachgewiesen. Die Wirtszellen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind unerwarteterweise bei der rekombinanten Herstellung von bestimmten Pilzenzymen wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, oder Fusarium oxysporum effizienter als andere bekannte Pilzspezies.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein SDS-Gel von sezernierten Proteinen in Fusarium graminearum (Bahn 1); Aspergillus niger (Bahn 2); und Aspergillus oryzae (Bahn 3). Bahn 4 zeigt Molekulargewichtsmarker.
2 zeigt die Ergebnisse eines Proteasetests der folgenden Proben: Aspergillus oryzae (Mulde 1); Aspergillus niger (Mulde 2); Fusarium graminearum (Mulde 3); leere Muldenkontrollen (Mulden 4–6).
3 zeigt die Konstruktion von Plasmid pJRoy6.
4 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der Sezernierung einer trypsinartigen Protease (SP387) in einem Transformant von F. graminearum 20334. Bahn 1: Molekulargrößenmarker; Bahn 2: blind; Bahn 3: gereinigter trypsinartiger Proteaseproteinstandard; Bahn 4: blind; Bahn 5: untransformierter Stamm 20334 von F. graminearum; Bahn 6: blind; Bahn 7: mit Plasmid pJRoy6 transformierter Stamm 20334 von F. graminearum; Bahn 8: blind; Bahn 9: Molekülgrößenmarker.
5 zeigt eine Restrektionsabbildung von pJRoy20.
6 zeigt eine Restrektionsabbildung von pDM151.
7 zeigt eine Restrektionsabbildung von pDM155.
Die 8A und 8B zeigen den Expressionsgrad von Carezyme^® in Fusarium graminearum, wenn DSM 151-4 für eine Dauer von 20–160 Std. in Fusarium graminearum fermentiert wird. 8A zeigt die Ergebnisse eines Tests für Carezyme^®. 8B zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Herstellung von Carezyme^® in Fusarium graminearum. Bahn 1: Molekulargrößenmarker; Bahn 2: 20 Std.; Bahn 3: 50 Std.; Bahn 4: 70 Std.; Bahn 5: 90 Std.; Bahn 6: 120 Std.; Bahn 7: 140 Std.; Bahn 8: 160 Std.
Die 9A und 9B zeigen den Expressionsgrad von Lipolase^®, wenn DSM 155-10 für eine Dauer von 20–160 Std. in Fusarium graminearum fermentiert wird. 9A zeigt die Ergebnisse eines Tests für Lipolase^®. 9B zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Herstellung von Lipolase^® im Fusarium graminearum. Bahn 1: Molekulargrößenmarker; Bahn 2: 20 Std.; Bahn 3: 50 Std.; Bahn 4: 60 Std.; Bahn 5: 90 Std.; Bahn 6: 120 Std.; Bahn 7: 140 Std.; Bahn 8: 160 Std.
10 zeigt eine Restrektionsabbildung von pCaHj418.
11 zeigt eine Restrektionsabbildung von pDM148.
12 zeigt eine Restrektionsabbildung von pDM149.
13 zeigt eine Restrektionsabbildung von pMHan37.
14 zeigt eine Restrektionsabbildung von pDM154.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Fusarium sind durch ein Mycelium gekennzeichnet, das in der Kultur großflächig und baumwollartig ist und häufig eine rosa-, violett- oder gelbfarbige Tönung im Mycelium auf festen Medium aufweist. Conidiophore sind variierbar schlank und einfach oder stark, kurz, verzweigt unregelmäßig oder tragen eine Windung aus einzeln oder in Sporodochien kopierten Phialiden. Bei Conidien handelt es sich grundsätzlich um zwei Arten, die häufig in kleinen feuchten Köpfen gehalten werden: Macroconidien: mehrzellig, leicht gekrümmt oder an den punktierten Enden gebunden, typischerweise kanuförmig; und Microconidien, die häufig einzellig, oval oder länglich, einzeln getragen oder in Ketten vorliegen. Einige Conidien sind dazwischenliegend, 2- oder 3-zellig, länglich oder leicht gekrümmt.
In einer spezifischen Ausführungsform handelt es sich bei den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung um die Spezies Fusarium graminearum, die durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist. Conidien: Microconidien fehlen. Macroconidien sind deutlich getrennt, dickwandig, gerad- bis mäßig sichelförmig, ungleichmäßig gekrümmt mit einer nahezu geraden Bauchfläche und einer glatt bogenförmigen Rückenfläche. Die Basalzelle ist deutlich fußförmig. Die Apicalzelle ist kegelförmig oder rüsselförmig eingeschränkt. Conidiophore: unverzweigte und verzweigte Monophialiden. Chlamydosporen: werden im Allgemeinen sehr langsam in der Kultur gebildet: wenn sie vorkommen, bilden sie sich am häufigsten in den Macroconidien, jedoch auch im Mycelium. Koloniemorphologie: auf PDA ist das Wachstum mit einem dichten Aerialmycelium, das das Rohr nahezu füllen kann, schnell und häufig gelb bis bräunlich, wobei die Seitenränder weiß bis karminrot sind. Rotbraune bis orangefarbene Sporodochien, sind, falls sie vorliegen, spärlich und kommen häufig nur vor, wenn die Kulturen älter als 30 Tage sind. Die Unterfläche ist gewöhnlich karminrot. Dieser Pilz erzeugt die meisten zylinderförmigen (parallele Rücken- und Bauchflächen) Macroconidien jeglicher Spezies der Sektion Discolor.
In einer besonders spezifischen Ausführungsform handelt es sich bei dem Fusarium graminearum um Fusarium graminearum Schwabe IMI 145425, der bei der American Type Culture Collection hinterlegt und mit der Nummer ATCC 20334 (US-Patent Nr. 4,041,189) bezeichnet ist, sowie um gleichermaßen nicht-toxische, nicht-toxigene und nicht-pathogene Derivate und Mutanten, z.B. diejenigen, die in US-Patent Nr. 4,041,189 gelehrt sind.
Es ist klar, dass innerhalb der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen die Verwendung des Begriffs „Fusarium graminearum" nicht nur in dieser Spezies eingebundene Organismen bedeutet, sondern auch diejenigen Spezies einschließt, die früher oder gegenwärtig als andere Spezies in anderen Klassifizierungsschemata bezeichnet wurden, jedoch dieselben vorstehend morphologischen und kulturellen Eigenschaften aufweisen und mit F. graminearum gleichbedeutend sein können. Diese schließen Fusarium roseum, F. roseum var. graminearum, Gibberella zeae oder Gibberella roseum, Gibberella roseum f. sp. cerealis ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Fachmann erkennt auch, dass die erfolgreiche Transformation der hier beschriebenen Wirtsspezies nicht auf die Verwendung der veranschaulichten Vektoren, Promoter und Selektionsmarker beschränkt ist. Allgemein ausgedrückt, sind auch diejenigen Techniken, die bei der Transformation von F. oxysporum, F. solani und F. culmorum nützlich sind, mit den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung nützlich. Obwohl der amdS-Selektionsmarker bevorzugt ist, schließen z.B. andere nützliche Selektionsmarker die Marker argB (A. nidulans oder A. niger), trpC (A. niger oder A. nidulans), pyrG (A. niger, A. oryzae oder A. nidulans), niaD (A. nidulans, A. niger oder F. oxysporum) und hygB (E. coli) ein. Bei den Promotern kann es sich um eine beliebige in diesen Spezies eine starke Transkriptionsaktivität zeigende DNA-Sequenz handeln, und sie können von Genen abgeleitet werden, die sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine wie Amylasen, Glucoamylasns, Proteasen, Lipasen, Cellulasen und glycolytische Enzyme kodieren. Beispiele für solche Promoter schließen amdS-Promoter von A. nidulans oder Promoter von Genen für glycolytische Enzyme, z.B. TPI, ADH, GAPDH und PGK ein. Bei dem Promoter kann es sich auch um einen heterologen Promoter, d.h. den Promoter für ein für den zu verwendenden Wirtsstamm natives Gen handeln. Die Promotersequenz kann zum Zwecke des Einbringens von spezifischen die Bindung der Promotersequenz mit dem Gen der Wahl oder mit einem selektierten Signalpeptid oder einer selektierten Präregion erleichternden Restriktionsstellen auch mit Linkern bereitgestellt sein.
Die Promotersequenz kann von einem Gen abgeleitet sein, das eine trypsinartige Protease von Fusarium oxysporum oder ein Fragment davon mit im Wesentlichen derselben Promoteraktivität wie die Sequenz kodiert. Die Sequenz des Promoters ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt. Die Erfindung umfasst des Weiteren Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 dargestellten Promotersequenz unter den folgenden Bedingungen hybridisieren: Vortauchen in 5 × SSC und Vorhybridisieren für eine Dauer von einer Stunde bei etwa 40°C in einer Lösung aus 20% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter beschallter Kalbthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung derselben Lösung, ergänzt mit 100 μM ATP, für eine Dauer von 18 Std. bei etwa 40°C, gefolgt von einer Waschung in 0,4 × SSC bei einer Temperatur von etwa 45°C, oder die eine mindestens 90% Homologie und vorzugsweise eine etwa 95%ige Homologie zu SEQ ID NO: 5, jedoch im Wesentlichen die gleiche Promoteraktivität wie die Sequenz aufweisen. In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem Promoter um eine Sequenz handeln, die einen großen Anteil an Bindungsstellen AreA, ein positiver Regulator von während der Stickstoffbeschränkung exprimierten Genen, umfassen; diese Stellen werden als nit-2 in Neurospora crassa (Fu and Marzlus, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 5331–5335) bezeichnet. Die Promotersequenz kann durch Addition oder Subtraktion solcher AreA-Stellen modifiziert werden.
Terminatoren und Polyadenylierungssequenzen können ebenso von den gleichen Quellen wie die Promoter abgeleitet werden. In einer spezifischen Ausführungsform kann die Terminatorsequenz von einem Gen abgeleitet werden, das eine trypsinartige Protease von Fusarium oxysporum oder ein Fragment davon mit im Wesentlichen der gleichen Terminatoraktivität wie die Sequenz kodiert. Die Sequenz des Terminators ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt. Die Erfindung umfasst des Weiteren Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Terminatorsequenz unter den folgenden Bedingungen hybridisieren: Vortauchen in 5 × SSC und Vorhybridisieren für eine Dauer von 1 Stunde bei etwa 40°C in einer Lösung aus 20% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6.8, und 50 μg denaturierter beschallter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in derselben Lösung, ergänzt mit 100 μM ATP, für eine Dauer von 18 Std. bei etwa 40°C, gefolgt von einer Waschung in 0.4 × SSC bei einer Temperatur von etwa 45°C, oder eine mindestens etwa 90%ige Homologie und vorzugsweise etwa 95%ige Homologie mit SEQ ID NO: 5, jedoch im Wesentlichen dieselbe Terminatoraktivität wie die Sequenz aufweist.
Verstärkersequenzen können ebenso in das Konstrukt eingefügt werden.
Zum Vermeiden der Notwendigkeit des Unterbrechens der Zelle zum Erhalt des exprimierten Produkts und zum Minimieren des Grades des möglichen Abbaus des exprimierten Produkts in der Zelle, ist es bevorzugt, dass das Produkt außerhalb der Zelle sezerniert wird. Dazu wird in einer bevorzugten Ausführungsform das Gen von Interesse an eine Präregion wie ein Signal- oder Leaderpeptid gebunden, das das exprimierte Produkt in den Sezernierungsweg der Zelle leiten kann. Die Präregion kann von Gegen für ein beliebiges sezerniertes Protein von einem beliebigen Organismus abgeleitet oder die native Präregion sein. Unter nützlichen erhältlichen Quellen für eine derartige Präregion befinden sich ein Glucoamylase- oder ein Amylasegen von einer Aspergillus-Spezies, ein Amylasegen von einer Bacillus-Spezies, ein Lipase- oder Proteinasegen von Rhizomucor miehei, das Gen für den α-Faktor von Saccharomyces cerevisiae oder das Kalbsprochymosingen. Die Präregion kann dem Gen für die TAKA-Amylase von A. oryzae, die neutrale α-Amylase von A. niger, die säurestabile α-Amylase von A. niger, die α-Amylase von B. licheniformis, die maltogene Amylase von Bacillus NCIB 11837, die α-Amylase von B. stearothermophilus oder Subtilisin von B. licheniformis. abgeleitet werden. Bei einer wirksamen Signalsequenz handelt es sich um das TAKA-Amylasesignal von A. oryzae, das Aspartamproteinasesignal von Rhizomucor miehei und das Lipasesignal von Rhizomucor miehei. Als Alternative kann z.B. in SEQ ID NO: 4 zwischen den Aminosäuren –24 und –5 auch die für das zu exprimierende Gen native Präregion verwendet werden.
Das funktionsfähig an Promoter- und Terminator-Sequenzen gebundene Gen für das gewünschte Produkt kann in einen den Selektionsmarker enthaltenden Vektor eingebracht oder auf einem separaten Vektor oder ein separates Plasmid angeordnet werden, der/das in das Genom des Wirtstamms integriert werden kann. In einer anderen Ausführungsform können die verwendeten Vektoren als lineare oder kreisförmige extrachromosomale Elemente in die Wirtszelle replizieren. Diese Vektortypen schließen z.B. Plasmide und Minichromosome ein. Bei dem Vektorsystem kann es sich um einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide handeln, die miteinander die gesamte, in das Genom zu integrierende DNA enthalten. Bei Vektoren und Plasmiden kann es sich um lineare oder geschlossen kreisförmige Moleküle handeln.
Die Wirtszelle kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie Transformation und Elektroporation mit der das heterologe Protein kodierenden Nukleinsäure transformiert werden (siehe z.B. Fincham, 1989, Microbial Rev. 53: 148–170).
Die rekombinante Wirtszelle der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gezüchtet werden. Kurz gesagt, werden die Wirtszellen auf Standardwachstumsmedium wie dasjenige, das eine Kombination aus anorganischen Salzen, Vitaminen, einer geeigneten organischen Kohlenstoffquelle, wie Glucose oder Stärke, einer beliebigen einer Vielzahl von Komplexnährstoffquellen (Hefeextrakt, hydrolisiertes Kasein, Sojabohnenmehl usw.) enthält, gezüchtet. Ein Beispiel ist FP-1-Medium (5% Sojabohnenmehl, 5% Glucose, 2% K₂HPO₄, 0,2% CaCl₂, 0,2% MgSO₄·7 H₂O and 0,1% Pluronsäure (BASF)). Die Fermentation wird bei einem pH-Wert von etwa 4,5–8,0 und bei einer Temperatur von etwa 20–37°C für eine Dauer von 2–7 Tagen durchgeführt.
Die vorliegende Wirtszellenspezies kann zum Exprimieren eines beliebigen prokaryotischen oder eukaryotischen heterologen Proteins von Interesse verwendet werden und wird vorzugsweise zum Exprimieren von eukaryotischen Proteinen verwendet. Von besonderem Interesse für diese Spezies ist deren Verwendung bei der Expression von heterologen Proteinen, insbesondere Pilzenzymen. Die neuen Expressionssysteme können zum Exprimieren von Enzymen wie Catalase, Laccase, Phenoloxidase, Oxidase, Oxidoreduktase, Cellulase, Xylanase, Peroxidase, Lipase, Hydrolase, Esterase, Cutinase, Protease und anderen proteolytischen Enzymen, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Phytase, Lyase, Pektinase und anderen pektinolytischen Enzymen, Amylase, Glucoamylase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase, Mannosidase, Isomerase, Invertase, Transferase, Ribonuklease, Chitinase, Mutanase und Deoxyribonuklease verwendet werden.
In einer spezifischen Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um eine alkalische Protease, z.B. ein Prä-Pro-Trypsin-Gen von Fusarium oxysporum. In einer besonders spezifischen Ausführungsform ist die Genomsequenz in SEQ ID NO: 3 und die Proteinsequenz in SEQ ID NO: 4 dargestellt.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um eine alkalische Endoglucanase, die mit einem Antikörper gegen hochgereinigte Endoglucanase mit ≈43 kD, abgeleitet von Humicola insolens DSM 1800 immunologisch reaktiv ist, oder ein Zellulaseaktivität zeigendes Derivat der Edoglucanase mit ≈43 kD (vergleiche WO 91/17243). Die Endoglucanase hier nachstehend als „Carezyme^®" bezeichnet, kann durch ein in SEQ ID NO: 7 gezeigtes Gen kodiert werden und eine in SEQ ID NO: 8 gezeigte Proteinsequenz aufweisen. Das Enzym kann auch eine Carezyme^®-Variante sein.
In noch einer anderen spezifischen Ausführungsform ist das Enzym eine 1,3-spezifische Lipase, nachstehend als Lipolase^® bezeichnet. Das Enzym kann durch eine in SEQ ID NO: 9 gezeigte DNA-Sequenz kodiert werden und eine in SEQ ID NO: 10 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen. Bei dem Enzym kann es sich auch um eine Lipolase^®-Variante, z.B. D96L, E210K, E210L (siehe WO 92/05249) handeln.
Es ist dem Fachmann klar, dass der Begriff „Pilzenzyme" nicht nur native Pilzenzyme sondern auch diejenigen Pilzenzyme, die durch Aminosäurenubstitutionen, -deletionen, -additionen oder andere Modifikationen, die zum Verbessern der Aktivität, Wärmestabilität, pH-Toleranz und dergleichen durchgeführt werden können, modifiziert wurden, einschließt. Die vorliegende Wirtszellenspezies kann auch zum Exprimieren von heterologen Proteinen von pharmazeutischem Interesse wie Hormonen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
6. BEISPIELE
6.1. Fusarium graminearum 20334 sezerniert nur einen geringen Proteingehalt
Conidiale Sporensuspensionen des Stamms 20334 von Fusarium graminearum, eines A. oryzae, und A. nigers werden in 25 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bactopepton (Difco), 2% Glucose) in Schüttelkolben mit einem Volumen von 125 ml eingeimpft und bei 30°C mit 300 UpM für eine Dauer von 5 Tagen inkubiert. Überstandsbrühen von den Kulturen werden durch Zentrifugation geerntet. Insgesamt 10 μl jeder Probe werden mit 10 μl 0,1 M Dithiothreitol (Sigma) und 10 μl Beschwerungspuffer (40 mM Trisbase, 6% Natriumdodecylsulfat, 2,5 mM EDTA, 15% Glycerin, 2 mg/ml Bromcresol-Violett) gemischt. Die Proben werden für eine Dauer von 5 Minuten gekocht, und man lässt sie über ein 4–12%iges Polyacrylamidgel (Novex) laufen. Die Proteine werden durch Färben mit Coomassie-Blue sichtbar gemacht. Die Ergebnisse (1) zeigen, dass der Stamm 20334 von Fusarium graminearum sehr wenig sezerniertes Protein erzeugt.
6.2. Fusarium graminearum 20334 sezerniert nur einen geringen Proteasegehalt
Insgesamt 40 μl Kulturbrühe des Stamms 20334 von Fusarium graminearum, eines A. oryzae und A. nigers (siehe Abschnitt 6.1., vorstehend) werden in Mulden pipettiert, die in eine Caseinagarplatte (2% Mager-Trockenmilch (Lucerne), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% Edelagar (Difco)) eingeschnitten sind. Die Platten werden bei 37°C für eine Dauer von 5 Std. inkubiert und die Proteinhydrolysezonen betrachtet. Die Ergebnisse (2) zeigen, dass die Brühe des Stamms 20334 von Fusarium graminearum sehr wenig prtoeolytische Aktivität enthielt.
6.3. Klonen des genomischen Prä-Pro-Trypsin-Gens von Fusarium oxysporum
Eine genomische DNA-Genbank in Lamdaphagen wird unter Verwendung von Verfahren wie denjenigen, beschrieben in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, aus genomischer DNA von F. oxysporum hergestellt. Insgesamt 50 μg genomische DNA werden in einem Volumen von 200 μl, enthaltend 10 mM Tris (pH = 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl₂, 7 mM 2-Mercaptoethanol und 4 Einheiten Restriktionsenzym Sau3A für eine Dauer von 1 Minute bei 37°C verdaut. Teilweise verdaute DNA mit einer Molekülgröße von 10–20 kb wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert, gefolgt von Elektroelution in Dialysemembran und Konzentration unter Verwendung einer Elutip-D-Säule (Schleicher und Schuell). Ein μg Lambdaphagenzweige von EMBL4, die mit Restriktionsenzymen BamH1 geschnitten und mit Phosphatase (Clonetech) behandelt sind, wird mit 300–400 μg mit Sau3A geschnittener genomischer DNA unter Standardbedingungen (siehe Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) in ein Volumen von 25 μl gebunden. Lambdaphagen werden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Gigapack Gold II, Stratagene) nach den Anweisungen des Herstellers aus diesem Bindungsgemisch hergestellt.
Das Abscheiden von ca. 15.000 recombinanten Lambdaphagen und die Herstellung von Filterlifts (auf Hybond-N⁺-Filter, Amersham) wird unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) durchgeführt. Die Filter werden zur Hybridisierung mit einem Genius-Kit für nicht radioaktiven Nukleinsäurennachweis (Boehringer Mannheim) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) verarbeitet. Die als Sonde verwendete DNA ist ein mit Digoxygenin (DIG) markiertes PCR-Fragment mit 0,75 kb der gesamten Kodierungsregion des in Plasmid pSX233 vorliegenden trypsinartigen Proteasegens von F. oxysporum (hier nachstehend als SP387 bezeichnet), das bei der NRRL unter der Zugangsnummer NRRL B-21241 hinterlegt ist. Bei den Primern der PCR-Reaktion handelt es sich um 5'-tgcggatccATGGTCAAGTTCGCTTCCGTC (Vorwärts-Primer; SEQ ID NO: 1) und 5'-gacctcgagTTAAGCATAGGTGTCAATGAA (Rückwärts-Primer; SEQ ID NO: 2). In beiden Primern stellen die kleinen Buchstaben Linkersequenzen dar und entsprechen die Großbuchstaben der Kodierungsregion des SP387-Gens. Zur Durchführung der PCR werden 25 ng eines das SP387-Gen von Plasmid pSX233 enthaltenden BamH1/Xba1-DNA-Fragments mit 907 by mit 68 pmol jedes Vorwärts- und Rückwärts-Primers gemischt.
Das Gemisch des DNA-Fragments und der Primer wird in 1 × Taq Buffer-/1 × DIG-Marker-Gemisch/5 Einheiten Taq (Boehringer Mannheim) auf ein Volumen von 80 μl gebracht. Die Reaktionsbedingungen lauten 95°C, 3 Minuten, dann 35 Zyklen von [95°C 30 Sekunden, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute]. Die durch PCR abgeleitete DNA-Sequenz der trypsinartigen Protease von F. oxysporum ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Die Phagenplaques werden mit der DIG-markierten Probe unter Verwendung einer Modifikation (Engler und Blum, 1993, Anal. Biochem. 210: 235–244) des Gen-Kits (Boehringer Mannheim) durchgemustert. Positive Klone werden isoliert und durch eine zweite Runde des Abscheidens und der Hybridisierung gereinigt. Rekombinante Lambdaphagen, die das trypsinartige Proteasegen von F. oxysporum enthalten, werden hergestellt, und die DNA wird unter Verwendung des Lambda-Midi-Präparation-Kits von Quiagen (Quiagen) aus den Phagen isoliert.
6.4. Konstruktion des Expressionsplasmids pJRoy6
Restriktionsabbilden, Southern-Blotten und Hybridisierungstechniken (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) werden zum Identifizieren eines Pst1-Restriktionsenzymfragments mit 5,5 kb eines der rekonbinanten Phagen, der das trypsinartige Proteasekodierungsgen von F. oxysporum und die angrenzenden DNA-Sequenzen enthält, verwendet. Dieses Pst1-Fragment mit 5,5 kb wird in mit Pst1-verdautem pUC118 subgeklont und das Plasmid als pJRoy4 bezeichnet (siehe 3). Plasmid pJRoy4 wird mit Restriktionsenzym EcoR1 verdaut und ein EcoR1-Fragment mit 3,5 kb, das das SP387-Gen und die EcoR1/Pst1-Region mit 43 by des pUC118 Polylinkers enthält, wird isoliert und unter Bildung von Plasmid pJRoy6 (3) in den Vektor pToC90 subgeklont.
6.5. Konstruktion der SP387-Expressionkassette
Eine Expressionskassette (pJRoy20), die den durch eine BamH1-Stelle in pUC118 verbundenen SP387-Promoter und Terminator enthält, wird konstruiert. Ein pJRoy20 enthaltender Stamm von E. coli ist bei der NRRL hinterlegt. Das Promoterfragment wird durch Aufschluss des SP387-Vectors pJRoy6 mit EcoR1 (das an –1200 schneidet) und mit Nco1 (das an der Translationsstartstelle schneidet, siehe 5) gebildet. Die Terminatorsequenz (bp 2056–3107 in 5) wird durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide gebildet:
VORWÄRTS
RÜCKWÄRTS
Großbuchstaben werden als SP387-Terminator-DNA betrachtet, während Kleinbuchstaben die manipulierten Restriktionsstellen enthaltende Enden sind.
Nach dem Aufschluss mit Nco1 und Sph1 wird das erhaltene Amplifikationsprodukt, enthaltend den Terminator, eingegrenzt durch Nco1 und BamH1-Stellen am 5'-Ende und eingegrenzt durch die EcoR1-, Pme1-, Kpn1- und Sph1-Stellen am 3'-Ende, isoliert. Eine 3-Wegebindung zwischen den Promoterfragment, dem Terminatorfragment und Kpn1/Sph1-geschnittenem pUC118 wird zum Bilden von pJRoy20 durchgeführt (siehe 5).
6.6. Carezyme^®-Konstrukte
Die EcoRV-Stelle an –15 im SP387-Promoter und die an +243 in der Carezyme^®-Kodierungsregion vorliegende Nco1-Stelle werden zum Bilden einer genauen Kondensation zwischen dem SP387-Promoter und dem Carezyme-Gen verwendet. Ein PCR-Fragment, enthaltend –18 bis –1 des SP387-Promoters, direkt gefolgt von –1 bis +294 des Carezyme^®-Gens, wird unter Verwendung der folgenden Primer aus dem Carezyme^®-Vektor pCaHj418 (siehe 10) gebildet:
VORWÄRTS
RÜCKWÄRTS
Die Kleinbuchstaben im Vorwärtsprimer sind by –24 bis –1 des SP387-Promoter, während die Großbuchstaben by 1 bis 20 von Carezyme^® sind.
Die verwendeten PCR-Bedingungen lauten: 95°C, 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen [95°C, 30 Sekunden, 50°C, 1 Minute, 72°C, 1 Minute]. Das erhaltene Fragment mit 0,32 kb wird unter Verwendung des TA-Klon-Kits von Invitrogen in Vektor pCRII geklont, was zu pDM148 (siehe 11) führt. Das EcoRV/NcoI-Fragment mit 0,26 kb wird von pDM148 isoliert und an das NcoI/BglII-Fragment mit 0,69 kb von pCaHj418 gebunden und in EcoRV/BamHI verdautes pJRoy20 geklont, um pDM149 (siehe 12) zu bilden. Die EcoRI-Carezyme^®-Expressionskassette mit 3,2 kb (SP387-Promoter/Carezyme^®/SP387-Terminator) wird von pDM149 isoliert und in die EcoRI-Stelle von pToC90 geklont, um pDM151 (siehe 6) zu bilden. Das Expressionkonstrukt pDM151 enthält sowohl die Expressionskassette als auch den selektierbaren amdS-Marker. Ein pDM151 enthaltender Stamm von E. coli wurde bei der NRRL hinterlegt.
6.7. Lipolase^®-Konstrukte
Die EcoRV-Stelle an –15 im SP387-Promoter und die Sac1-Stelle an +6 in der Lipolase^®-Kodierungsregion werden zum Bilden einer genauen Kondensation zwischen dem SP387-Promoter und den Lipolase-Gen verwendet. Ein Adapter, enthaltend die letzten 15 by des SP387-Promoters, gefolgt von den ersten 6 by der Lipolase^®-Kodierungsegion, wird wie nachstehend gezeigt konstruiert.
Ein SacI/BamHI-Fragment mit 0,9 kb des Lipolase^®-cDNA-Gens wird von dem Expressionskonstrukt von A.oryzae pMHan37 (siehe 13) isoliert. Der EcoRV/SacI-Adapter und das SacI/BamHI-Lipolase^®-Fragment werden in EcoRV/BamHI-verdautes pJRoy20 gebunden und geklont, um Plasmid pDM154 (siehe 14) zu bilden. Die KpnI-Lipolase^®-Expressionskassette mit 3,2 kb (SP387-Promoter/Lipolase^®/SP387-Terminator) wird von pDM154 isoliert und in die KpnI-Stelle von pToC90 geklont, um Plasmid pDM155 (siehe 7) zu bilden. Das Expressionkonstrukt pDM155 enthält sowohl die Lipolase^®-Expressionskassette als auch den selektierbaren amdS-Marker. Ein Stamm von E. coli enthaltend pDM151 wurde bei der NRRL hinterlegt.
6.8. Transformation von F. graminearum
Man lässt Kulturen des Stamms ATCC 20334 von Fusarium graminearum auf 100 × 15 mm Petrischalen mit Vogelsmedium (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435–446) plus 1,5% Glucose und 1,5% Agar für eine Dauer von 3 Wochen bei 25°C wachsen. Conidien (etwa 10⁸ pro Platte) werden in 10 ml sterilem Wasser unter Verwendung einer Transferschleife entfernt und durch Filtration durch 4 Schichten Käsestoff und schließlich durch eine Schicht Miracloth gereinigt. Conidialsuspensionen werden durch Zentrifugation konzentriert. Fünfzig ml YPG (1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bactopepton (Difco), 2% Glucose) werden mit 10⁸ Conidien beimpft und für eine Dauer von 14 Std. bei 20°C, 150 UpM, inkubiert. Die erhaltenen Hyphae werden auf einem sterilen Filter mit 0,4 μm aufgefangen und nacheinander mit sterilem destilliertem Wasser und 1,0 M MgSO₄ gewaschen. Die Hyphae werden erneut in 10 ml einer Lösung des Typs Novozym^® 234 (Novo Nordisk) (2–10 mg/ml in 1,0 M MgSO₄) suspendiert und für eine Dauer von 15–30 Minuten bei 34°C unter Rühren mit 80 UpM verdaut. Nicht verdautes Hyphal-Material wird durch aufeinander folgende Filtration durch 4 Schichten Käsestoff und durch Miracloth aus der erhaltenen Protoplastsuspension entfernt. Zwanzig ml 1 M Sorbit werden durch den Käsestoff und den Miracloth geleitet und mit der Protoplastlösung kombiniert. Nach dem Mischen werden die Protoplaste (etwa 5 × 10⁸) durch Zentrifugation pelletiert und nacheinander durch erneute Suspension und Zentrifugation in 20 ml 1 M Sorbit und in 20 ml STC (0,8 m Sorbit, 50 mM Tris-HCl pH = 8.0, 50 mM CaCl₂). Die gewaschenen Protoplaste werden in 4 Teile STC und 1 Teil SPTC (0.8 M Sorbit, 40% Polyethyleneglycol 4000 (BDH), 50 mM Tris-HCl pH = 8.0, 50 mM CaCl₂) mit einer Konzentration von 1–2 × 10⁸/ml erneut suspendiert. Einhundert μl Protoplastsuspension werden zu 5 μg pJRoy6 und 5 μl Heparin (5 mg/ml in STC) in Polypropylenröhrchen (17 × 100 mm) zugesetzt und für eine Dauer von 30 Minuten auf Eis inkubiert. Ein ml SPTC wird sanft in die Protoplastsuspension gemischt und die Inkubation bei Raumtemperatur für eine Dauer von 20 Minuten fortgesetzt. Die Protoplaste werden auf Selektivmedium, bestehend aus Covesalzen (Cove, D. J., 1966, Biochem. Biophys. Acta 113: 51–56) plus 10 mM Acetamid, 15 mM CsCl₂, 2.5%-Nobelagar (Difco) und 1,0 M Saccharose unter Verwendung einer Deckschicht aus demselben Medium mit 0,6 M Saccharose und 1,0% niedrig schmelzender Agarose (Sigma) abgeschieden. Die Platten werden bei 25°C inkubiert, und die Transformanten traten innerhalb von 6–21 Tagen auf.
6.9. Expression von trypsinartiger Protease in Fusarium graminearum
Transformanten werden auf Platten mit COVE2-Medium (dasselbe wie vorstehendes COVE-Medium ohne das Cäsiumchlorid und unter Ersetzen der 1,0 M Saccharose mit einer Konzentration von 30 g/l) überführt, und man lässt sie für eine Dauer von 3 oder mehr Tagen bei 25°C wachsen. Aliquote mit fünfundzwanzig ml von FP-1-Medium (5% Sojabohnenmehl, 5% Glucose 2% K₂HPO₄, 0,2% CaCl₂, 0,2% MgSO₄·7 H₂O und 0,1% Pluronsäure (BASF)) in Kolben mit einem Volumen von 150 ml werden mit Agarstöpseln mit etwa 1 cm von COVE2-Platten-Kulturen beimpft und für eine Dauer von 6 Tagen bei 30°C unter Rühren (150 UpM) inkubiert. Überstandsbrühenproben werden nach der Zentrifugation gewonnen und wie folgt einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Dreißig μl jeder Brühe werden mit 10 μl SDS-PAGE-Probenpuffer (1 ml 0.5 M Tris pH = 6,8, 0,8 ml Glycerin, 1,6 ml 10% SDS, 0,4 ml 0,8 M Dithiothreitol, 0,2 ml 1% Bromphenol-Blau), 2 μl 2% PMSF (Sigma) in Isopropanol, und 2 μl Glycerin, gemischt. Die Proben werden für eine Dauer von 4 Minuten in ein siedendes Wasserbad gegeben, und man lässt 40 μl jeder Probe über ein 10–27%iges Polyacrylamidgel (Novex) laufen. Die Gele werden mit Coomassie gefärbt und unter Verwendung von Standardverfahren entfärbt. Der Expressionsgrad der trypsinartigen Protease wurde als ≥ 0.5 g/l bestimmt.
6.10. Enzymtests
6.10.1. Carezyme^®

Puffer: Natriumphosphat (50 mM, pH 7.0)
Substrat: AZCL-HE-Cellulose (Megazyme) mit 2 mg/ml Puffer
Enzymstandard: 100 mg Carezyme^®-Standard (10,070 ECU/g) wird in 1 ml Puffer gelöst und bei –20°C aufbewahrt. Diese Stammlösung wird unmittelbar vor der Verwendung zur Verwendung in Enzymtests auf im Puffer 1:100 verdünnt. Der Testbereich beträgt 0,5–5,0 ECU/ml. Ein Umwandlungsfalctor von 650.000 ECU/g Carezyme^® wird verwendet.

Substratlösung (990 μl) wird den Probenmulden einer Mikrotiterplatte mit 24 Mulden zugesetzt. Carezyme^®-Probe (verdünnt in Puffer zur Herstellung einer Aktivität zwischen 0.5 und 10 ECU/ml.) werden dem Substrat zugesetzt. Die Reaktionen werden für eine Dauer von 30 Minuten bei 45°C inkubiert, wobei der Überstand in eine Mikrotiterplatte mit 96 Mulden überführt und die Absorbtion bei 650 nm gemessen wird.
6.10.2. Lipolase^®-Test

Puffer: 0,1 M MOPS, pH 7,5, enthaltend 4 mM CaCl₂
Substrat: 10 mL p-Nitrophenylbutyrat (pNB) in 1 ml DMSO; Zugabe von 4 ml Puffer zum Substrat in DMSO *Konzentration der Stammlösung = 11.5 mM in 20% DMSO
Enzymstandard: Lipolase^® (23, 100 LU/g) wird mit 1000 LU/ml in 50% Glycerin gelöst und bei –20°C gelagert. Diese Stammlösung wird nmittelbar vor dem Test im Puffer auf 1:100 verdünnt. Der Testbereich beträgt 0,125 bis 3.0 LU/ml.

100 μl pNB-Stammlösung wird zu 100 μl geeignet verdünnter Enzymprobe zugesetzt. Die Aktivität (mOD/min) wird bei 405 nm für eine Dauer von 5 Minuten bei 25°C gemessen.
6.10.3. SP387-Test
L-BAPNA-Substrat wird durch Verdünnen einer 0,2 M Stammlösung von L-BAPNA (Sigma B3133) in Dimethylsulfoxid (gefroren aufbewahrt) auf 0,004 M in Puffer (0,01 M Dimethylglutarsäure (Sigma), 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH) direkt von der Verwendung hergestellt. Ein μl Kultur wird zentrifugiert (145000 × g, 10 Minuten). Ein Aliquot mit 100 μl verdünnte Kulturbrühe wird zu 100 μl Substrat in einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden zugesetzt. Die Absorbtionsveränderung bei 405 nm wird mit einem Interwall von 30 Sekunden für eine Dauer von 5 Minuten bei 25°C unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts getestet. Die Ergebnisse werden in Bezug auf einen gereinigten SP387-Standard berechnet.
6.11. Expression von Carezyme^®
Dreiundzwanzig Transformanten von pDM151 werden gereinigt, in Schüttelkolben auf Soja/Glucose-Medium gezüchtet und nach 9 Tagen auf Carezyme^®-Aktivität getestet (Tabelle 1 – siehe nachstehend). Vier Transformanten exprimieren Carezyme^® mit einem Gehalt von etwa 50–100 mal. Transformant pDM151-4 wird in Fermentoren mit kleinem Maßstab unter Verwendung der für die SP387 Herstellung entwickelten Bedingungen gezüchtet (siehe Abschnitt 6.9). Etwa 6,0 g/l Carezyme^® sind nach 7 Tagen ersichtlich (8A). Carezyme^® umfasste mehr als 90% sezernierte Proteine auf der Basis von 7 Tagen (8A). Carezyme^® umfasste mehr als 90% sezernierte Enzyme auf der Basis von SDS-Gelelectrophorese (8B).
TABELLE I
6.12. Expression von Lipolase^®
Fünfzehn Transformanten von pDM155 werden gereinigt, in Schüttellcolben auf Soja/Glucose-Medium gezüchtet und nach 9 Tagen auf Lipolase^®-Aktivität getestet (Tabelle 2 – siehe nächste Seite).
TABLE II
Vier Transformanten exprimierten Lipolase^® mit einem Gehalt von etwa 100–200 mg/l (auf der Basis des pN-Tests). Transformant pDM155-10 wird in Fermentoren in kleinem Maßstab unter Verwendung der für SP387-Herstellung verwendeten Bedingungen gezüchtet (siehe Abschnitt 6.9). Etwa 2,0 g/l Lipolase sind nach 7 Tagen ersichtlich (8A). Lipolase^® umfasste mehr als 90% sezernierte Proteine auf der Basis von SDS-Gelelectrophorese (8B).
7. HINTERLEGUNG VON MICROORGANISMEN
Die folgenden biologischen Materialien wurden in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA hinterlegt.
Die Stämme wurden unter den Bedingungen hinterlegt, die gewährleisten, dass der Zugang der Kultur nur während der Gültigkeit dieser Patentanmeldung für eine durch den Beauftragten für Patente und Marken bestimmte Person mit dem Titel dafür unter 37 C. F. R. §1.14 und 35 U. S. C. §122 und unter Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt ist. Die Hinterlegung stellt eine biologisch reine Kultur jedes hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung ist wie für ausländische Patentgesetze in Ländern, in welchen Duplikate der vorliegenden Anmeldung oder ihre Nachkommen eingereicht werden, erforderlich, zur Verfügung gestellt. Jedoch sollte es klar sein, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz für die Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Beeinträchtigung der staatlich bewilligten Patentrechte bildet.
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist im Umfang durch die hier offenbarten spezifischen Ausführungsformen nicht beschränkt, da diese Ausführungsformen nur als Veranschaulichungen der verschiedenen Aspekte der Erfindungen vorgesehen sind. Alle beliebigen äquivalenten Ausführungsformen sollen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung fallen. Tatsächlich sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich denjenigen, die hier dargestellt und beschrieben sind, dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich. Solche Modifikationen sollen in den Umfang der anhängigen Ansprüche fallen.
Verschiedene Bezugnahmen sind hier genannt, wobei die Offenbarungen davon hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingebracht sind.
SEQUENZLISTE

Claims

Nicht-toxische, nicht-toxigene, nicht-pathogene rekombinante Fusarium Wirtszelle umfassend eine ein heterologes Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, die mit einem Promotor funktionsfähig verbunden ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei das Fusarium Fusarium graminearum ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei Fusarium graminearum die Identifizierungscharakteristiken von ATCC 20334 aufweist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei das heterologe Protein ein Pilzprotein ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei das heterologe Protein ein sezerniertes Protein ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei das heterologe Protein ein Pilz-Enzym ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei das Pilz-Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Catalase, Laccase, Phenoloxidase, Oxidase, Oxidoreduktase, Cellulase, Xylanase, Peroxidase, Lipase, Hydrolase, Esterase, Cutinase, einem proteolytischen Enzym, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Phytase, Lyase, einem pectinolytischen Enzymen, Amylase, Glucoamylase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase, Mannosidase, Isomerase, Invertase, Transferase, Ribonuclease, Chitinase und Deoxyribonuclease.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei das Pilz-Enzym eine Protease ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei das Pilz-Enzym eine alkalische Protease ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 9, wobei die alkalische Protease eine Trypsin-artige Protease von Fusarium oxysporum ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 10, wobei die Trypsin-artige Protease von Fusarium oxysporum eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei das Pilz-Enzym eine Endoglucanase oder Variante davon ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 12, wobei die Endoglucanase eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 8 gezeigt ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei das Pilz-Enzym eine 1,3-Lipase oder Variante davon ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 14, wobei die 1,3-Lipase eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 10 gezeigt ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei das heterologe Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Hormon, einem Wachstumsfaktor und einem Rezeptor.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor ein Pilzpromotor ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 17, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Promotoren von A nidulans amdS.
Wirtszelle gemäß Anspruch 17, wobei der Pilzpromotor abgeleitet ist von einem Gen, das eine Trypsin-artige Protease von Fusarium oxysporum kodiert, oder einem Fragment davon mit im Wesentlichen der gleichen Promotoraktivität wie die Sequenz.
Wirtszelle gemäß Anspruch 19, wobei die Promotorsequenz in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, die weiterhin einen selektierbaren Marker umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 21, wobei der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus argB, trpC pyrG, amdS, niaD und hygB.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, die weiterhin einen Terminator umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 23, wobei der Terminator abgeleitet ist von einem Gen, das eine Fusarium oxysporum trypsin-artige Protease kodiert, oder einem Fragment davon mit im Wesentlichen der gleichen Terminatoraktivität wie die Sequenz.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24, wobei die Terminatorsequenz in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist.
Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins, wobei das Verfahren die Schritte umfasst Züchten einer nicht-toxischen, nicht-toxigenen, nicht-pathogenen rekombinanten Fusarium Wirtszelle, umfassend eine das Prote in kodierende Nukleinsäuresequenz, die mit einem Promotor funktionsfähig verbunden ist, und Isolieren des Proteins.