BR112019017271A2

BR112019017271A2 - enzima lipolítica para uso em panificação

Info

Publication number: BR112019017271A2
Application number: BR112019017271A
Authority: BR
Inventors: Van Winckel Bruno; Agache Evelien; Arnaut Filip; Oestdal Henrik; Piotr Olinski Robert; Maria Landvik Sara
Original assignee: Novozymes As; Puratos Nv/Sa
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-19
Publication date: 2020-04-14
Also published as: JP2022136118A; JP2022136117A; RU2019128224A; MX2019009551A; ZA201905583B; CA3051770A1; EP3582619A1; US20190364912A1; WO2018150021A1; US20210321631A1; JP7340073B2; CN110300523A; AU2018222787A1; US11510413B2; JP2020508698A; AU2018222787B2; US11051520B2; RU2019128224A3; RU2763469C2

Abstract

um polipeptídeo tendo atividade de enzima lipolítica, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo, pelo menos, 65% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de seq id no: 1; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência média com a sequência codificante do polipeptídeo de seq id no: 2; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo, pelo menos, 65% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo de seq id no: 2; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de enzima lipolítica.

Description

“ENZIMA LIPOLÍTICA PARA USO EM PANIFICAÇÃO” Referência a uma Listagem de Sequências [0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção se relaciona com novas enzimas lipolíticas; especialmente com enzimas lipolíticas com propriedades melhoradas para uso em massa, onde elas, p.ex., podem substituir emulsificantes normalmente usados em panificação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] Miolo branco e estrutura fina do miolo são características importantes para a preferência do consumidor pelo pão; especialmente de pão industrialmente embalado tal como pão torrado. Uma estrutura fina do miolo é normalmente alcançada por adição de um emulsificante à massa durante a fabricação de pão.

[0004] Hoje em dia, os consumidores tendem a evitar o consumo de produtos de panificação que contêm emulsificantes.

[0005] O uso de enzimas lipolíticas em panificação é conhecido desde há muitos anos.

[0006] WO 98/26057 divulga uma lipase/fosfolipase de Fusarium oxysporum e seu uso em panificação.

[0007] WO 2004/099400 divulga várias enzimas lipolíticas e seu uso em panificação para redução de viscosidade da massa.

[0008] WO 1999/053769 divulga o uso de alfa-amilase maltogênica e fosfolipase para melhor maciez do produto panificado no período inicial após panificação.

[0009] O uso de enzimas lipolíticas na panificação pode proporcionar um sabor estranho indesejado devido à formação de ácidos graxos de cadeias livres.

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2/63 [0010] A presente invenção se refere a novas enzimas lipolíticas capazes de proporcionar um miolo branco e uma estrutura fina do miolo sem induzir sabor estranho.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] Os inventores descobriram uma nova enzima lipolítica que proporciona surpreendentemente um miolo branco e uma estrutura muito fina do miolo e, ao mesmo tempo, a enzima lipolítica não proporciona sabor estranho quando usada em panificação, logo reivindicamos:

[0012] Um polipeptideo tendo atividade de enzima lipolítica, selecionado do grupo consistindo em:

(a) um polipeptideo tendo pelo menos 65% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1;

(b) um polipeptideo codificado por um polinucleotídeo que híbrida sob condições de estringência média com a sequência codificante do polipeptideo de SEQ ID NO: 2;

(c) um polipeptideo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 65% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptideo de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento do polipeptideo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de enzima lipolítica.

[0013] Em uma modalidade, a enzima lipolítica de acordo com a invenção tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1.

[0014] Em uma modalidade, a enzima lipolítica de acordo com a invenção compreende um segmento catalítico da sequência de

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3/63 aminoácidos G-H-S-L-G.

[0015] Em uma modalidade, a enzima lipolítica de acordo com a invenção tem atividade de lipase, fosfolipase e/ou galactolipase; especialmente, a enzima lipolítica tem atividade de lipase e fosfolipase.

[0016] Em uma modalidade reivindicamos um polinucleotídeo isolado codificando a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0017] Em uma modalidade reivindicamos um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando a enzima lipolítica de acordo com a invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[0018] Em uma modalidade reivindicamos uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo codificando a enzima lipolítica de acordo com a invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo.

[0019] Em uma modalidade reivindicamos um método de produção da enzima lipolítica de acordo com a invenção compreendendo cultivo de uma célula hospedeira sob condições conducentes para produção do polipeptídeo.

[0020] Em uma modalidade reivindicamos um granulado ou um líquido estabilizado compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0021] Em uma modalidade reivindicamos uma composição compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em aminopeptidase, amilase, alfa-amilase, alfa-amilase maltogênica, betaamilase, carboxipeptidase, catalase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, galactanase, glucana 1,4

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4/63 alfa-maltotetra-hidrolase, glucanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, mananase, manosidase, oxidase, enzimas pectinoliticas, peptidoglutaminase, peroxidase, fosfolipase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolitica, ribonuclease, transglutaminase e xilanase; em particular uma composição compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em alfa-amilase maltogênica, beta-amilase e glucana 1,4-alfa-maltotetra-hidrolase; especialmente uma composição compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e uma alfa-amilase maltogênica.

[0022] Em uma modalidade reivindicamos um método para preparação de um produto panificado, compreendendo o passo de adição à massa, antes da panificação, de uma enzima lipolítica de acordo com a invenção, um granulado ou um líquido estabilizado de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção.

[0023] Em uma modalidade, a quantidade de enzima lipolítica de acordo com a invenção é entre 0,01 e 100 mg, preferencialmente entre 0,05 e 50 mg, mais preferencialmente entre 0,1 e 25 mg, ainda mais preferencialmente entre 0,1 e 15 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa ou no polme.

[0024] Em uma modalidade reivindicamos o uso de uma enzima lipolítica de acordo com a invenção em aplicações de panificação e/ou pastelaria.

[0025] Em uma modalidade reivindicamos o uso de um granulado ou um líquido estabilizado compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção em aplicações de panificação e/ou pastelaria.

[0026] Em uma modalidade reivindicamos o uso de uma composição compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e uma ou mais enzimas adicionais em aplicações de panificação e pastelaria.

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5/63 [0027] Em uma modalidade reivindicamos o uso da enzima lipolítica de acordo com a invenção em melhoradores de pão e/ou em misturas ou pré-misturas de pastelaria.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições [0028] Enzima lipolítica: O termo “uma enzima lipolítica” compreende uma enzima (EC 3.1.1) tendo atividade de lipase, fosfolipase e/ou galactolipase; especialmente uma enzima tendo atividade de lipase e fosfolipase. A enzima lipolítica pode ter também outras atividades. O termo “enzima lipolítica” é usado indistintamente com o termo “polipeptídeos tendo atividade de enzima lipolítica”.

[0029] De acordo com a presente invenção, a atividade de lipase pode ser medida pelo seguinte método:

[0030] A atividade de lipase pode ser determinada usando tributirina como substrato. Este método é baseado na hidrólise de tributirina pela enzima e o consumo de alcalinos para manter o pH constante durante a hidrólise é registrado como uma função do tempo [0031] Uma Unidade de Lipase (LU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (/.e., a 30 °C; pH 7,0; com Goma-Arábica a 0,1% (p/v) como emulsificante e tributirina a 0,16 M como substrato) libera 1 micromole de ácido butírico titulável por minuto.

[0032] Um protocolo útil para identificação de atividade de lipase é o seguinte usando placas de tributirina:

Mistura de substrato de tributirina:

mL de Tributirato de glicerina (tributirina) g de goma-Arábica.

285 mL H₂O

Para uso em 2 placas:

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6/63 • 5 ml_ de mistura de tributirina, adicionar 50 ml_ Tampão universal a 0,02 M a pH 7,0 • Pré-aquecer até 60 °C • Ultra turax durante 60 segundos para se obter uma emulsão suave

Preparar uma solução de agarose a 2%:

• 2 g para 100 ml_ de H2O • Ferver e levar a solução até 60 °C (usar um banho de água) [0033] Misturar 50 ml_ solução de tributirina/tampão com 50 ml_ de agarose a 2%, adicionar 250 microlitros Violeta de cristal a 4%. Verter 50 ml_ em cada placa OmniTray Single Well no cat 242811 e Nunc TSP 96 No cat 445497. Amostras de 10 microlitros podem ser aplicadas. As placas podem ser incubadas a 30 °C durante aprox. 1 hora e 3 horas. A atividade pode ser fotografada.

[0034] Atividade de lipase: Atividade de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), i.e., atividade hidrolítica para ligações de éster carboxílico em triglicerídeos, p.ex., tributirina.

[0035] Atividade de fosfolipase: Atividade de fosfolipase (A1 ou A2, EC 3.1.1.32 ou 3.1.1.4), i.e., atividade hidrolítica na direção de uma das ou ambas as ligações de éster carboxílico em fosfolipídeos tais como lecitina.

[0036] Atividade de galactolipase: Atividade de galactolipase (EC 3.1.1.26), i.e., atividade hidrolítica em ligações de éster carboxílico em galactolipídeos tais como DGDG (diglicerídeo de galactosila).

[0037] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptideo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinados por uma grelha de leitura aberta,

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7/63 que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0038] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de enzima lipolítica.

[0039] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

[0040] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0041] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo

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8/63 maduro” significa um polipeptideo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento Nterminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[0042] Sequência codificante do polipeptideo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptideo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo maduro tendo atividade de enzima lipolítica.

[0043] Condições de estringência média: O termo “condições de estringência média” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnatado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes - cada durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55 °C.

[0044] Condições de estringência média-elevada: O termo “condições de estringência média-elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnatado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes - cada durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0045] Condições de estringência elevada: O termo “condições de estringência muito elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnatado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas.

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9/63 material transportador é finalmente lavado três vezes, cada durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0046] Condições de estringência muito elevada: O termo “condições de estringência muito elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnatado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70 °C.

[0047] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”. Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Intervalos no Alinhamento).

[0048] Um polipeptideo tendo atividade de enzima lipolítica de acordo com a invenção pode compreender uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma

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10/63 posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.

[0049] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento) [0050] Propriedade melhorada: Quando incorporada em massa em quantidades eficazes, a enzima lipolítica de acordo com a invenção pode melhorar uma ou mais propriedades da massa ou do produto panificado obtido a partir dela.

[0051] O termo “propriedade melhorada” é definido aqui como qualquer propriedade de massa e/ou um produto obtido a partir da massa, particularmente um produto panificado, que é melhorada pela ação da enzima lipolítica de acordo com a invenção em relação a massa ou ao produto obtido a partir da massa no qual a enzima lipolítica de acordo com a invenção não é incorporada.

[0052] A propriedade melhorada pode incluir, mas não está limitada a, brancura melhorada do miolo do produto panificado, estrutura

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11/63 melhorada do miolo do produto panificado, maciez melhorada do miolo do produto panificado, sabor melhorado do produto panificado e/ou propriedades preservadoras melhoradas do produto panificado.

[0053] A propriedade melhorada pode ser determinada por comparação de massas e/ou um produto panificado preparado com e sem adição da enzima lipolítica de acordo com a invenção. As qualidades organoléticas podem ser avaliadas usando procedimentos bem estabelecidos na indústria de panificação e podem incluir, por exemplo, o uso de um painel sensorial.

[0054] Estrutura melhorada do miolo do produto panificado: O termo “estrutura melhorada do miolo do produto panificado” é definido aqui como um produto panificado com um miolo mais fino. A estrutura melhorada do miolo está associada a células mais pequenas e/ou paredes celulares mais finas no miolo e/ou distribuição mais uniforme/homogênea de células no miolo e é usualmente avaliada visualmente pelo panificador/painel sensorial ou por análise de imagens digitais como conhecido na técnica (p.ex., C-cell, Calibre Control International Ltd, Warrington, RU, como mostrado nos Exemplos 2-3 da presente invenção).

[0055] Brancura melhorada do miolo: A finura do miolo é frequentemente avaliada por medição da brancura do miolo do pão, porque a estrutura mais fina do miolo reflete a luz de uma maneira fazendo com que o miolo pareça mais branco. A brancura do miolo pode ser medida como conhecido na técnica, p.ex., por uso do valor L de HunterLab medido com um rastreador de cor.

[0056] Maciez melhorada do miolo do produto panificado: O termo “maciez melhorada do miolo do produto panificado” é o oposto de “firmeza” e é definido aqui como a propriedade de um produto panificado que é mais facilmente comprimido e é avaliada empiricamente

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12/63 pelo panificador de teste perito/painel sensorial ou medida pelo uso de um analisador da textura (p.ex., TAXT2 ou TA-XT Plus da Stable Micro Systems Ltd, Surrey, RU) como conhecido na técnica.

[0057] Sabor melhorado do produto panificado: O termo “sabor melhorado do produto panificado” é avaliado por um painel de teste treinado e/ou análise química (p.ex., análise de GC-MS com espaço livre). O sabor melhorado do produto panificado compreende a redução de sabor(es) estranho(s) do produto panificado.

[0058] Preservação melhorada do produto panificado: O termo “preservação melhorada do produto panificado” é definido aqui como as propriedades de um produto panificado que têm uma taxa reduzida de deterioração de parâmetros de qualidade, p.ex., maciez e/ou elasticidade, durante o armazenamento.

[0059] Volume do produto panificado: O termo “volume do produto panificado” é medido como o volume de uma dada fatia de pão. O volume pode ser determinado pelo método de deslocalização de sementes de colza.

[0060] Sabor estranho: O termo se um produto panificado tem sabor estranho ou não é avaliado por um painel de teste treinado/análise química como conhecido na técnica.

Enzimas lipolíticas de acordo com a invenção [0061] Enzimas lipolíticas que são adequadas para uso na presente invenção incluem um polipeptídeo tendo atividade de enzima lipolítica, selecionado do grupo consistindo em:

(a) um polipeptídeo tendo pelo menos 65% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que híbrida sob condições de estringência média com a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2;

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13/63 (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 65% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de enzima lipolítica.

[0062] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 1 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra enzima catalítica.

[0063] A sequência de aminoácidos de outra enzima lipolítica é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 1 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0064] Em uma modalidade, a enzima lipolítica de acordo com a invenção tem pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO:

1.

[0065] Em uma modalidade, a enzima lipolítica de acordo com a invenção compreende uma tríade catalítica da sequência de

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14/63 aminoácidos G-H-S-L-G.

[0066] A enzima lipolítica da presente invenção preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1; ou é uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de enzima lipolítica.

[0067] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptideo isolado tendo atividade de enzima lipolítica codificado por um polinucleotídeo que híbrida sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média-elevada, condições de estringência elevada, condições de estringência muito elevada com a sequência codificante do polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 2, (Sambrook et at., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0068] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou uma sua subsequência, bem como o polipeptideo de SEQ ID NO: 1 ou urn seu fragmento, pode ser usado para conceber sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de enzima lipolítica a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos,

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15/63 pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com ³²P, ³H, ³⁵S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0069] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que híbrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de atividade lipolítica. O DNA genômico ou outro tipo de DNA de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que híbrida com SEQ ID NO: 2 ou uma sua subsequência, o material transportador pode ser usado em uma transferência de Southern.

[0070] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo híbrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo (i) a SEQ ID NO: 2; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua subsequência; sob condições de estringência muito baixa a muito elevada. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico híbrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0071] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo isolado tendo atividade de enzima lipolítica codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

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16/63 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

[0072] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 é não mais do que 20, p.ex., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19. As mudanças de aminoácidos podem ter uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservatives que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxila-terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0073] Exemplos de substituições conservatives estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle,

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Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0074] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos têm uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptideo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e similares.

[0075] Aminoácidos essenciais em um polipeptideo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de enzima lipolítica para se identificarem resíduos de aminoácidos que sejam críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et ai., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708.

[0076] O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos do local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et ai., 1992, Science 255: 306-312; Smith et ai., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptideo relacionado.

[0077] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e

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Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente dos E.LJ.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese sítio-dirigida (Derbyshire etal., 1986, Gene46:145; Ner etal., 1988, DNA 7: 127).

[0078] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de varredura automatizados, de elevada produtividade para detectar atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0079] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida no terminal N ou no terminal C a uma região de outro polipeptídeo.

[0080] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente

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19/63 (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0081] Um polipeptideo de fusão pode adicionalmente compreender um local de divagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de divagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4:35-48.

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de enzima Lipolítica [0082] Um polipeptideo tendo atividade de enzima lipolítica da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de” como usado aqui em conexão com uma dada fonte deverá significar que o polipeptideo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo a partir da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptideo obtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0083] Em um aspecto, o polipeptideo é obtido a partir de Valsaria, tal como, mas não se limitando a, Valsaria rubricosa.

[0084] As estirpes destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von

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Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0085] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que tenha sido detectado um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica.

Polinucleotídeos [0086] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, como descrito aqui.

[0087] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p.ex., por uso da reação em cadeia da polimerase (POR) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, p.ex., Innis et ai., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e

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21/63 amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma estirpe de Valsaria, p.ex., Valsaria rubricosa, ou um organismo relacionado.

[0088] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, p.ex., variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo ou similares As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultem em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondam ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, p.ex., Ford etal., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construtos de Ácido Nucleico [0089] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0090] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar a expressão do polipeptídeo. A

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22/63 manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0091] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Vetores de Expressão [0092] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.

[0093] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser

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23/63 convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0094] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma,

i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no qual foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[0095] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e similares.

Células Hospedeiras [0096] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico

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24/63 autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula original que não seja idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.

[0097] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[0098] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0099] A célula hospediera bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[0100] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0101] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces

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25/63 coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[0102] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, vegetal ou fúngica.

[0103] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usados aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definidos por Hawksworth et a!., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8^a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[0104] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usada aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos Fungi Imperfect! (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode variar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0105] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.

[0106] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose,

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26/63 glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetative é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetative por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[0107] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[0108] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola

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27/63 insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride; em particular uma célula de Aspergillus oryzae.

[0109] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/TechnologyQ: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier etal., 1989, Gene 78:147156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon,

M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito etal., 1983, J. Bacteriol. 153:163; e Hinnen etal., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção [0110] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptideo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptideo, sob condições conducentes à produção do polipeptideo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptideo.

[0111] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptideo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da

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28/63 presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptideo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptideo.

[0112] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptideo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptideo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptideo for secretado para o meio nutriente, o polipeptideo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptideo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.

[0113] O polipeptideo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos de enzimas lipolíticas. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptideo.

[0114] O polipeptideo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptideo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é

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29/63 recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptideo.

[0115] O polipeptideo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.

[0116] Em um aspecto alternativo, o polipeptideo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptideo é usada como uma fonte do polipeptideo.

Plantas [0117] A presente invenção se relaciona também com plantas isoladas, p.ex., uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem um polipeptideo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptideo ou domínio pode ser recuperado a partir da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptideo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.

[0118] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras, tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, p.ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e mais (milho).

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30/63 [0119] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo ou domínio da presente invenção compreendendo (a) cultivo de uma planta ou uma célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperação do polipeptídeo ou domínio.

Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células [0120] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[0121] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando culturas microbianas são cultivadas até a saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (p.ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos tanto não fracionados como fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e

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31/63 detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p.ex., por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[0122] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbenes e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[0123] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos a partir de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que esteja isenta destes componentes.

[0124] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem adicionalmente compreender um agente conservante e/ou antimicrobiano (p.ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbate de potássio e outros conhecidos na técnica.

[0125] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou

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32/63 composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldou inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[0126] Um caldo integral ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionarem uma composição líquida clarificada.

[0127] As formulações de caldo integral e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

Composições compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção [0128] A presente invenção se relaciona com composições compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0129] A composição pode adicionalmente compreender uma ou mais enzimas adicionais, em particular uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em aminopeptidase, amilase, alfaamilase, alfa-amilase maltogênica, beta-amilase, carboxipeptidase, catalase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, galactanase, glucanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase,

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33/63 lacase, mananase, manosidase, oxidase, enzimas pectinoliticas, peptidoglutaminase, peroxidase, fosfolipase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolitica, ribonuclease, transglutaminase e xilanase; especialmente uma alfa-amilase maltogênica.

[0130] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem ter qualquer aparência física tal como líquido, pasta ou sólido. Por exemplo, a composição pode ser formulada usando métodos conhecidos na técnica de formulação de enzimas e/ou produtos farmacêuticos, p.ex., em grânulos ou microgrânulos revestidos ou não revestidos.

[0131] A enzima lipolítica de acordo com a invenção e opcionalmente quaisquer enzimas adicionais a serem incluídas na composição podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, p.ex., por estabilização do polipeptídeo na composição por adição de um antioxidante ou agente redutor para limitar a oxidação do polipeptídeo ou podem ser estabilizadas por adição de polímeros tais como PVP, PVA, PEG ou outros polímeros adequados conhecidos como sendo benéficos para a estabilidade de polipeptídeos em composições sólidas ou líquidas.

[0132] Quando se formula a enzima lipolítica de acordo com a invenção como um granulado ou um pó aglomerado, as partículas têm tipicamente uma distribuição estreita do tamanho das partículas com mais do que 95% (em peso) das partículas na gama de 25 a 500 micrômetros.

[0133] Os granulados e pós aglomerados podem ser preparados por métodos convencionais, p.ex., por pulverização da enzima lipolítica em um transportador em um granulador de leito fluidizado. O transportador pode consistir em núcleos particulados tendo um tamanho das partículas adequado. O transportador pode ser solúvel ou insolúvel, p.ex., um sal (tal como NaCI ou sulfato de sódio), um açúcar (tal como sacarose ou lactose), um álcool de açúcar (tal como sorbitol), amido, arroz, grãos de milho

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34/63 ou soja. A composição está preferencialmente na forma de um pó seco ou um granulado, em particular um granulado não pulverulento.

[0134] Consequentemente, a invenção também proporciona um granulado ou um líquido estabilizado compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção.

Enzimas adicionais [0135] Opcionalmente, uma ou mais enzimas adicionais tais como aminopeptidase, amilase, alfa-amilase, alfa-amilase maltogênica, beta-amilase, carboxipeptidase, catalase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, galactanase, glucana 1,4alfa-maltotetra-hidrolase, glucanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, mananase, manosidase, oxidase, enzimas pectinolíticas, peptidoglutaminase, peroxidase, fosfolipase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase e/ou xilanase podem ser usadas em conjunto com a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção.

[0136] A glucoamilase para uso na presente invenção inclui glucoamilases tendo uma identidade de sequências de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a sequência de aminoácidos da glucoamilase G1 ou G2 de A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921 ou a glucoamilase de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949).

[0137] A amilase pode ser fúngica ou bacteriana, p.ex., uma alfa-amilase maltogênica de B. stearothermophilus ou uma alfa-amilase de Bacillus, p.ex., B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens, uma betaamilase, p.ex., de planta (p.ex., soja) ou de fontes microbianas (p.ex.,

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Bacillus), ou uma alfa-amilase fúngica, p.ex., de A. oryzae.

[0138] A alfa-amilase maltogênica pode ser também uma alfa-amilase maltogênica como divulgado em, p.ex., WO1999/043794; W02006/032281; ou W02008/148845.

[0139] Alfa-amilases maltogênicas comerciais adequadas incluem NOVAMYL, OPTICAKE 50 BG e OPTICAKE 3D (disponíveis a partir da Novozymes A/S). Composições de alfa-amilases fúngicas comerciais adequadas incluem, p.ex., BAKEZYME P 300 (disponível a partir da DSM) e FUNGAMYL 2500 SG, FUNGAMYL 4000 BG, FUNGAMYL 800 L, FUNGAMYL ULTRA BG e FUNGAMYL ULTRA SG (disponíveis a partir da Novozymes A/S).

[0140] Uma amilase preservadora pode ser também uma amilase (glucana 1,4-alfa-maltotetra-hidrolase (EC 3.2.1.60)) de, p.ex., Pseudomonas, tal como qualquer uma das amilases divulgadas em WO1999/050399, WG2004/111217 ou WG2005/003339.

[0141] A glucose oxidase pode ser uma glucose oxidase fúngica, em particular uma glucose oxidase de Aspergillus niger (tal como GLUZYME®, disponível a partir da Novozymes A/S).

[0142]A hemicelulase pode ser uma pentosanase, p.ex., uma xilanase que pode ter origem microbiana, p.ex., derivada a partir de uma bactéria ou fungo, tal como uma estirpe de Aspergillus, em particular de A. aculeatus, A. niger, A. awamori ou A. tubigensis, a partir de uma estirpe de Trichoderma, p.ex., T. reesei, ou a partir de uma estirpe de Humicola, p.ex., H. insolens.

[0143] Preparações de xilanases comercialmente disponíveis adequadas para uso na presente invenção incluem PANZEA BG, PENTOPAN MONO BG e PENTOPAN 500 BG (disponíveis a partir da Novozymes A/S), GRINDAMYL POWERBAKE (disponível a partir da DuPont) e BAKEZYME BXP 5000 e BAKEZYME BXP 5001 (disponíveis a

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36/63 partir da DSM).

[0144] A protease pode ser de Bacillus, p.ex., B. amyloliquefaciens ou de Thermus aquaticus.

Massa [0145] Em um aspecto, a invenção divulga um método para preparação de massa ou um produto panificado preparado a partir da massa, método esse que compreende incorporação na massa de uma enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0146] Em outro aspecto, a invenção proporciona massa compreendendo farinha, água e uma quantidade eficaz de uma composição de panificação ou uma pré-mistura compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0147] A presente invenção se relaciona também com métodos para preparação de uma massa ou um produto panificado compreendendo incorporação na massa de uma quantidade eficaz de uma composição de panificação da presente invenção que melhora uma ou mais propriedades da massa ou do produto panificado obtido a partir da massa em relação a uma massa ou um produto panificado no qual a enzima lipolítica não é incorporada.

[0148] A frase “incorporação na massa” é definida aqui como adição da composição de panificação de acordo com a invenção à massa, a qualquer ingrediente a partir do qual a massa é para ser produzida e/ou a qualquer mistura de ingredientes de massa a partir da qual a massa é para ser produzida. Por outras palavras, a composição de panificação da invenção pode ser adicionada em qualquer passo da preparação de massa e pode ser adicionada em um, dois ou mais passos. A composição é adicionada aos ingredientes de massa que podem ser amassados e panificado para produzir o produto panificado usando métodos bem conhecidos na técnica.

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37/63 [0149] O termo “quantidade eficaz” é definido aqui como uma quantidade de composição de panificação de acordo com a invenção que é suficiente para proporcionar um efeito mensurável em pelo menos uma propriedade de interesse da massa e/ou produto panificado.

[0150] O termo “massa” é definido aqui como uma mistura de farinha e outros ingredientes firme o suficiente para amassar ou rolar. No contexto da presente invenção, polmes são englobados no termo “massa”.

[0151] A massa da invenção pode compreender farinha derivada a partir de qualquer grão de cereal ou outras fontes, incluindo trigo, farro, espelta, einkorn, cevada, centeio, aveia, milho, sorgo, arroz, milheto, amaranto, quinoa e mandioca.

[0152] A massa pode também compreender outros ingredientes de massa convencional, p.ex., proteínas, tais como um leite em pó, glúten e soja; ovos (ovos inteiros, gemas de ovo ou claras de ovo); um oxidante tal como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou persulfato de amônio; um aminoácido tal como L-cisteína; um açúcar; um sal tal como cloreto de sódio, acetato de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio e/ou um emulsificante.

[0153] A massa pode compreender gordura (triglicerídeo) tal como gordura granulada ou gordura vegetal.

[0154] A massa da invenção pode ser fresca, congelada ou semipanificada (pré-panificada).

[0155] A massa da invenção é normalmente massa levedada ou massa a ser sujeita a levedação.

[0156] A massa pode ser levedada de várias formas, tal como por adição de agentes levedantes químicos, p.ex., fermento em pó, bicarbonate de sódio ou por adição de um levedante (massa de fermentação), mas é preferencial levedar a massa por adição de uma cultura de levedura adequado, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae

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38/63 (levedura de panificação), p.ex., uma estirpe comercialmente disponível de

S. cerevisiae.

[0157] A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode não mudar o volume do produto panificado, em particular o volume do pão, significativamente; tipicamente, o volume pode ser aumentado ou diminuído em 0-5%.

[0158] A quantidade de enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser entre 0,01 -100 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa, em particular 0,05-50 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa, em particular 0,1-25 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa, em particular 0,1-15 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa.

Emulsificantes [0159] Para algumas aplicações, um emulsificante não é necessário; para algumas aplicações, um emulsificante pode ser necessário.

[0160] Um emulsificante adequado para uso na presente invenção é preferencialmente um emulsificante selecionado do grupo consistindo em ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicerídeos (DATEM), estearoíl lactilato de sódio (SSL), estearoíl lactilato de sódio (CSL), mono- e diglicerídeos etoxilados (EMG), monoglicerídeos destilados (DMG), polissorbatos (PS) e monoglicerídeos succinilados (SMG).

[0161] Em algumas aplicações, a enzima lipolítica de acordo com a presente invençãio substitui todo(s) o(s) emulsificante(s) usualmente presente(s) na receita da massa.

Melhoradores de pão e misturas ou pré-misturas de pastelaria [0162] A enzima lipolítica da presente invenção pode ser vantajosamente parte de um melhorador de pão ou uma mistura ou uma prémistura de pastelaria.

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39/63 [0163] “Melhoradores de pão” (também referidos como “condicionadores de massa” ou “melhoradores de massa” ou “agentes melhoradores” ou “agentes de tratamento de farinha”) são tipicamente adicionados à massa de modo a melhorar a textura, estrutura, volume, sabor e frescura do produto panificado bem como para melhorar a maquinabilidade e estabilidade da massa.

[0164] Tipicamente, um melhorador de pão compreende ou consiste em: uma ou mais enzima(s) (tais como, p.ex., amilases (alfaamilases, beta-amilases, glucoamilases, amilases que degradam amido em bruto), xilanases (hemicelulases), celulases, pectinases, proteases, pectato liases, oxidases (peroxidases, glucose oxidase, piranose oxidases, hexose oxidases, L-aminoácido oxidases, carboidrato oxidases, sulfuridrila oxidases), lipoxigenases, desidrogenases, lacases, transglutaminases, aciltransferases, proteína dissulfeto isomerases), um ou mais agente(s) oxidante(s) ou redutor(es) (tais como, p.ex., ácido ascórbico, glutationa, cisteína), um ou mais emulsificante(s) (tais como, p.ex., ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicerídeos (DATEM), estearoíl lactilato de sódio (SSL), estearoíl lactilato de cálcio (CSL), monoestearato de glicerol (GMS), ramnolipídeos, lecitinas, sucroésteres, sais biliares), urn ou mais material(ais) de lipídeo (tais como, p.ex., manteiga, óleo, óleo vegetal), um ou mais açúcar(es), uma ou mais farinhas ou fração(ões) de farinha, uma ou mais vitamina(s) (tais como, p.ex., ácido pantotênico e vitamina E), uma ou mais goma(s) e/ou uma ou mais fonte(s) de fibra (tais como, p.ex., fibra de aveia).

[0165] As misturas de bolo (pastelaria) compreendem tipicamente todos os ingredientes de uma receita de bolo com a exceção de água, gordura (óleo, manteiga, margarina) e ovos. Os ovos podem ser adicionados em uma mistura de bolo (pastelaria) em uma forma de pó. As pré-misturas de bolo (pastelaria) são tipicamente misturas de volo onde toda a ou parte da farinha e açúcar foi removida.

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Produto panificado [0166] O processo da invenção pode ser usado para qualquer tipo de produto panificado preparado a partir de massa, em particular de um caráter macio, de um tipo branco, claro ou escuro. Exemplos são pão (em particular pão branco, integral ou de centeio), tipicamente na forma de pães ou pãezinhos, pão, pão pita, tortilhas, bolos, panquecas, biscoitos, wafers, bolachas, crostas de tartes, pão cozido a vapor, piza e similares.

[0167] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Clonagem, expressão e fermentação da enzima lipolítica de acordo com a invenção [0168] DNA genômico foi extraído a partir de uma estirpe de Valsaria rubricosa, usando Estojo Fast DNA Spin for Soil (No. cat 6560200 da MP Biochemicals) seguindo o protocolo do fornecedor.

[0169] A estirpe de Valsaria rubricosa foi isolada a partir do solo em Hunan, China, em 2002.

[0170] Como conhecido na técnica, SEQ ID NO. 1 e 2 foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico usando um iniciador direto e reverso (SEQ ID NO. 3 e 4).

[0171]

SEQ IP NO. 1 (peptídeo sinal: 1-20):

MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAAAAY CPDNNDSPDTKLTCSVGNCPLVEADTTSTVTEFENSLETDVTGYVATDSTRELIVV AFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWTSWTEARTGVLAAVASAAAAN

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P S YTVAVT G H S L G GAVAALAAGAL RNAG Y TVAL YSFGAPRVGDETLSEYITAQAG G NYRITHLNDPVPKLPPLLLGYRHISPEYYISSGNNVTVTADDVEEYTGTINLSGNT GDLTFDTDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV

SEQ ID NO. 2

ATGAAGTCCGCTTCGATCTTACTCAGGGTAGCTGCCCTCCTCCTCCC TGCTGTATCTGCACTGCCACTTGAAAGAAGAGGTATGGACGAACTATCCTAGCGAT CAGTGTGTCTATTTTGCCTAACCTAGCAAAGCTATATCCGCGGATCTCCTGGCAAC CTTCAGCCTCTTCGAGCAGTTCGCAGCCGCAGCATATTGTCCGGATAACAACGACA GTCCCGACACCAAGCTTACTTGCTCTGTCGGAAACTGCCCGCTTGTCGAAGCTGAC AC GAG CAG GAG G G T GAG T GAAT T C GAAAAG TAGAT C T TACAC GAG C C C G T T CAC C T ACAGACAAAGTCCCAGCTAACGTCCACCTCTATCTCTGTCCCTTTAGCTCGCTCGA AACCGACGTCACTGGCTACGTCGCGACTGACAGCACACGAGAGCTCATCGTTGTGG CATTCCGCGGGAGTTCCTCGATCCGGAACTGGATCGCCGACATCGACTTTCCCTTC ACCGACACCGACCTCTGCGATGGCTGCCAGGCAGCCTCGGGCTTCTGGACGTCCTG GACGGAGGCACGGACAGGGGTGCTGGCGGCGGTGGCGAGCGCTGCCGCGGCCAACC CGTCCTATACCGTTGCCGTGACGGGCCACAGCCTCGGCGGGGCCGTGGCCGCGCTG GCCGCTGGCGCCCTCCGGAACGCGGGCTACACGGTCGCGCTATACAGCTTCGGAGC GCCTCGCGTGGGTGACGAGACCCTCAGCGAGTACATCACTGCGCAGGCGGGTGGAA ACTACCGCATCACGCACCTCAACGACCCAGTGCCGAAGCTGCCCCCGCTGCTCCTG GGGTATCGC CACAT CAG C C C G GAATAC TACAT CAG CAG C G G GAACAAC G T GAC C G T GACGGCGGATGACGTGGAGGAGTACACCGGCACGATCAACCTGAGTGGGAACACGG GCGATCTGACGTTCGACACGGATGCGCACAGTTGGTACTTCAACGAGATCGGGGCA TGCGATGATGGTGAGGCTTTGGAGTGGAAGAAGCGGGGGGTAGAAGTTCAGTGGGT TTAA

SEQ ID NO: 3 (Iniciador):

5'

ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTCCGCTTCGATCTTACTCAGG -3'

SEQ ID NO: 4 (Iniciador):

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5'

AGATCTCGAGAAGCTTAAACCCACTGAACTTCTACCCCCC -3' [0172] O produto de PCR foi purificado usando um Estojo GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerod, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR purificado, correspondendo a SEQ ID NO:2, foi clonado no vetor de expressão pDAu109 (WO 2005/042735) previamente linearizado com Bam HI e Hind\\\, usando um Estojo IN-FUSION™ PCR Cloning (BD Biosciences, Paio Alto, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[0173] Um volume de 1 μΙ_ da mistura de ligação não diluída foi usado para transformar Células Competentes Multi shot TOP 10 Chemical No. parte 44-0091 da Invitrogen. Uma colônia foi selecionada em uma placa de ágar LB contendo 100 pg de ampicilina por mL e cultivada durante a noite em 2 mL de meio LB suplementado com 100 pg de ampicilina por mL. DNA de plasmídeo foi purificado usando um Estojo Jetquick Plasmid Miniprep Spin (Genomed GmbH, Lohne, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência SEQ ID NO:2 foi verificada por sequenciamento de Sanger antes da expressão heteróloga. Um plasmídeo (contendo gene SEQ ID NO: 2) foi selecionado para expressão heteróloga em células hospedeiras de Aspergillus oryzae.

[0174] A célula hospedeira de A. oryzae é um derivado do gene destruído amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por destruição do gene da acetamidase (amdS) de A. oryzae com o gene pyrG. Protoplastos de Aspergillus oryzae foram preparados de acordo com WO 95/002043.

[0175] Cem pL de protoplastos de Aspergillus oryzae foram misturados com 1-2 pg do vetor de expressão de Aspergillus com o gene SEQ ID: 2 clonado, e 250 pL de PEG 4000 a 60% (Applichem,

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Darmstadt, Alemanha) (polietilenoglicol, peso molecular 4.000), CaCh a 10 mM e Tris-HCI a 10 mM pH 7,5 foram gentilmente misturados. Após 30 min de incubação a 37 °C, 4 ml_ de ágar de topo (temp. 40 °C) foram adicionados, e os protoplastos foram espalhados em placas COVE para seleção. Após incubação durante 4-7 dias a 37 °C, esporos de quatro transformantes foram inoculados em 0,5 ml_ de meio DAP-4C-01 em placas com 96 poços profundos. Após 4-5 dias de cultivo a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para se identificarem os transformantes produzindo a maior quantidade de proteína recombinante a partir de Valsaria rubricosa.

[0176] Os esporos do melhor transformante com o gene SEQ ID NO:2 foram espalhados em placas COVE contendo TRITON® X-100 a 0,01 % de modo a isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido uma vez mais antes da preservação dos clones.

Fermentação para purificação [0177] Um transformante de Aspergillus oryzae construído como descrito acima foi fermentado em 150 ml_ de meio DAP-4C-01 em frascos de agitação canelados de 500 ml_ incubados a 30 °C em um incubador com plataforma de agitação rodando a 150 RPM durante 3-5 dias e adicionalmente usado para ensaios como descrito em baixo.

Meios usados [0178] As placas LB eram compostas por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto e água desionizada até 1 litro.

[0179] O meio LB era composto por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio e água desionizada até 1 litro.

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44/63 [0180]

DAP-4C-1 g de MgSO4.7H2O g de KH2PO4 g de CeHeOz.FhO g de Dextrose g de Maltrose

5,2 g de K3PO4.H2O

0,5 g de Extrato de Levedura

0,5 mL de Sol. de metais vestigiais KLJ6 (AMG) (MSA-SUB-FS-0042) Misturar até completamente dissolvidos mL de Dowfax 63N10 é adicionado

Ajustar volume com água Milli-Q até 1000 mL

Comp. de CaCOs de 0,5 g (adicionar 1 comp./200 mL) [0181 ] Antes da inoculação, cada frasco de agitação de 150 mL foi adicionado 3,5 mL de Hidrogenofosfato de diamônio (NH4)2HPO4 a 50% e 5,0 mL de Ácido láctico a 20%.

Sol. de metais vestigiais KU6 (AMG) (MSA-SUB-FS-0042)

6,8 g de ZnCh

2,5 g de CUSO4.5H2O

0,13 g de Cloreto de Níquel anidro

13,9 g de FeSO4.7H2O

8,45 g de MnSO4.H2O g de CeHeOz.FhO

Água com permuta iônica até 1000 mL [0182] As placas de sacarose COVE eram compostas por 342 g de sacarose, 20 g de pó de ágar, 20 mL de solução de sais COVE e

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45/63 água desionizada até 1 litro. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8- Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C e foram adicionados acetamida a 10 mM, Triton X-100 (50 μΙ_/500 ml_).

[0183] A solução de sais COVE era composta por 26 g de MgSO4-7H2O, 26 g de KCI, 26 g de KH2PO4, 50 ml_ de solução de metais vestigiais COVE e água desionizada até 1 litro.

[0184] A solução de metais vestigiais COVE era composta por 0,04 g de Na2B40y 10H2O, 0,4 g de CuSO4-5H2O, 1,2 g de FeSO4-7H2O, 0,7 g de MnSO4-H2O, 0,8 g de Na2MoO4-2H2O, 10 g de ZnSO4-7H2O e água desionizada até 1 litro.

Características de SEQ IP NO:1:

[0185] A enzima lipolítica (SEQ ID NO:1) possui uma caixa de enzima lipolítica típica com tríade catalítica apresentada no pentapeptídeo: G-H-S-L-G.

[0186] A enzima lipolítica (SEQ ID NO:1) de acordo com a invenção mostrou atividade em tributirina, MGDG (monogalactosildiacilglicerol), DGDG (digalactosildiacilglicerol), APE (etanolamina de fosfatidila de N-acila) e ALPE (etanolamida de liso-fosfatidila de N-acila), 0 que mostra que a enzima tem atividade de lipase (tributirina), atividade de fosfolipase (APE/ALPE) e atividade de galactolipase (MGDG/DGDG).

Perfil de atividade de pH de SEQ IP NO:1:

[0187] SEQ ID NO:1 purificada foi diluída até 0,5, 0,125, 0,031 e 0,0078 mg proteína enzima/mL com Triton X-100 a 0,01%.

[0188] 20 pl_ das amostras de enzima diluídas foram misturados com 40 μΙ_ de tampão de pH (acetato de sódio a 0,1 M, fosfato de sódio a 0,1 M, CaCh a 1 mM, ajustado até pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 usando NaOH/HCI) e 40 μΙ_ de solução de substrato de azeite (azeite a 12,5 mg/mL,

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46/63 goma-Arábica a 0,1%, CaCha 1,5 mM, homogenizada por Ultra Turrax) nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços.

[0189] Após incubação a 37 °C durante 30 min em um Termomisturador Eppendorf, a reação foi parada por adição de 10 pL de reagente de paragem (ácido fosfórico a 1 M, Triton X-100 a 10%) e mistura.

[0190] A concentração de ácidos graxos livres liberados a partir do substrato de azeite foi depois quantificada usando um estojo NEFA (Wako Diagnostics): 100 μΙ_ de reagente de estojo R1 (Wako NEFA-HR (2) R1 SET, 434-91795) foram misturados com 25 μΙ_ de volume de reação, e a absorvância a 546 nm foi lida em um leitor de placas SpectraMax Plus. Depois, 50 μΙ_ de reagente de estojo R2 (Wako NEFA-HR (2) R2 SET, 43691995) foram adicionados e, após 20 min de incubação à temperatura ambiente (com agitação), a absorvância a 546 nm foi lida novamente. A partir da diferença entre as duas leituras, a concentração de ácido graxo livre foi calculada usando resultados com curva padrão de ácido oleico (ácido oleico a 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125 e 0 mM). Concentrações de lipase dando respostas dentro da gama linear foram usadas para calcular a atividade a cada pH. Na Tabela 4, as atividades em relação à atividade a pH 4 (pH ótimo) são dadas.

Tabela A: Perfil de atividade de pH de SEQ ID NO:1

PH	Atividade de SEQ ID NO:1___em relação à atividade a pH 4 (%)
2	0,8
3	9,4
4	100

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5	60,6
6	4,7
7	0,3
8	0,0
9	0,1

Exemplo 2 [0191] Amostras de pão foram preparadas de acordo com uma receita de massa direta padrão por mistura dos seguintes ingredientes (a quantidade de massa foi escalonada para se ajustar ao requisito de ensaio de panificação):

Farinha de trigo

(farinha Crousti, Dossche Mills, Deinze, Bélgica) 1000 g

Água da torneira 570 g

Sacarose 60 g

Levedura 30 g

Óleo de colza 20 g

Sal 19 g

Propionato de cálcio 5 g

Ácido ascórbico 40 ppm

Novamyl 10.000BG™ (Novozymes A/S) 40 ppm

Panzea Dual™ (Novozymes A/S) 25 ppm

[0192] As seguintes amostras de massa foram produzidas,

e três amostras de pão foram preparadas a partir de cada massa. Soft'r Silk é um produto DMG comercial da Puratos NV (Groot-Bijgaarden, Bélgica) e usado como referência para o efeito de produtos DMG comerciais. Soft'r Silk foi doseado em relação ao conteúdo de farinha.

Tabela 1: Dosagem de enzima:

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Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)
Controle
Soft'r Silk a 1%	-
SEQ ID NO:1	0,4
SEQ ID NO:1	1,0

[0193] Massa foi preparada por mistura de ingredientes em um misturador em espiral (Diosna SP12, Dierks & Sôhne, Osnabrück, Alemanha) durante 2 min a velocidade baixa (17 rpm) e 7 min a velocidade elevada (35 rpm). Após mistura, a massa foi avaliada antes do escalonamento (600 g). A massa escalonada foi deixada a repousar durante outros 15 min antes de a massa ter sido coberta. A massa coberta foi colocada em panelas de aço de 2200 mL abertas (medidas do topo: 260 mm (L) x 125 mm (W) x 80 mm (H)) e provada durante 90 min a 35 °C, umidade relativa a 86%.

[0194] Após prova, a massa foi panificada em um forno (Wachtel Piccolo, Wachtel GmbH, Hilden, Alemanha) durante 25 min a 230 °C. O forno empregou uma curta explosão de vapor no início do passo de panificação. A massa panificada foi removida a partir das panelas e deixada a resfriar à temperatura ambiente durante 2 horas. O volume das amostras de pão foi determinado usando um rastreador com laser Volscan Profiler 600 (Stable Micro Systems, Surrey, RU). Subsequentemente, as amostras de pão foram embaladas com nitrogênio em sacos de plástico selados (PA/PE, 90 μΠΊ).

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49/63 [0195] Após dois dias de armazenamento à temperatura ambiente, duas fatias foram cortadas a partir do meio de cada pão com um cortador elétrico (Cortador Graef Master M182, Graef & Co GmbH, Arnsberg, Alemanha). Cada fatia foi medida uma vez usando o instrumento C-cell empregando o software C-Cell Image Analysis System Versão 2.0 (Calibre Control International Ltd, Warrington, RU).

[0196] A C-cell usa visualização de elevada definição e iluminação controlada da amostra para assegurar qualidade ótima da imagem. A fatia inteira é analisada para proporcionar 48 valores de dados e 5 imagens processadas mostrando características da amostra. A brancura do miolo pode ser avaliada usando o parâmetro “Brilho da fatia”. A medição do brilho é o nível cinza médio de todos os pixéis na fatia.

[0197] Uma estrutura mais fina do miolo dará um valor de “Brilho da fatia” mais elevado.

Tabela 2: Dados de volume de pão

Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)	Volume de pão (mL/g)
Controle	-	5,45
Soft'r Silk a 1%		5,18
SEQ ID NO:1	0,4	5,64
SEQ ID NO:1	1,0	5,28

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Tabela 3: Valores de “Brilho da fatia” para as amostras testadas.

Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)	Parâmetro de C-cell “brilho das fatias”
Controle	-	144
Soft'r Silk a 1%		148,6
SEQ ID NO:1	0,4	147,4
SEQ ID NO:1	1,0	149,7

[0198] Pode ser visto a partir da Tabela 3 que, por uso da enzima lipolítica de acordo com a invenção, o brilho das fatias é melhor do que o controle e também melhor do que Soft'r Silk a 1 % quando se usa 1 mg de enzima lipolítica por kg de farinha.

Exemplo 3 [0199] Foram preparadas amostras de pão idênticas ao Exemplo 2, exceto que Farinha especial King Midas (Ardent Mills Corp. Denver, CO, EUA) foi usada em vez de farinha Crousti, e 600 g de água foram adicionados em vez dos 570 g de água adicionados no Exemplo 2. Igualmente, este ensaio não incluiu um Controle, mas somente a referência com Soft'r Silk a 1%.

Tabela 4: Dosagem de enzima

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Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)
Soft'r Silk a 1%	-
SEQ ID NO:1	0,4
SEQ ID NO:1	1,0

Tabela 5: Dados de volume de pão

Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)	Volume de pão (mL/g)
Soft'r Silk 1%	a		5,42
SEQ NO:1	ID	0,4	5,27
SEQ NO:1	ID	1,0	5,68

Tabela 6: Valores de “Brilho da fatia” para as amostras testadas.

Amostra

Dosagem de Parâmetro enzima de C-cell

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	lipolítica (mg de EP/kg de farinha)	“brilho das fatias”
Soft'r 1%	Silk a	-	151,1
SEQ NO:1	ID	0,4	152,0
SEQ NO:1	ID	1,0	153,6

[0200] Pode ser visto a partir da Tabela 6 que, por uso da enzima lipolítica de acordo com a invenção, o brilho das fatias é melhor do que Soft'r Silk a 1% (tanto a 0,4 como 1,0 mg de enzima lipolítica por kg de farinha).

Exemplo 4

Construção de variantes [0201] SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 foram construídas do seguinte modo: Um alinhamento com SEQ ID NO:1 foi feito com as 100 lipases mais homogêneas. Com base no alinhamento, várias posições foram escolhidas, onde SEQ ID NO:1 se desviava da média das outras lipases. Uma dada posição foi mutada para os aminoácidos mais comumente encontrados nas outras lipases. Quatro genes sintéticos codificando as variantes de lipase foram concebidos e os genes foram expressos em Aspergillus oryzae.

SEQ IP NO: 6 (peptídeo sinal: 1-20, 13 mutações em comparação com SEQ IP NO: 1 em sequência madura):

MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAA AAYCPNNNNSPDTKLTCSQGNCPLVEAATTSTVTEFENSLSTDVTGYVAV DSTRELIVVAFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWTEA

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53/63

RTGVTAAVASAAAQNPSYTVVVTGHSLGGAVAALAAGALRNQGYTVALYS

FGAPRVGNETLSEYITAQAGGNYRITHLNDPVPKLPPLLLGYRHISPEYYIS

SGNNVTVTANDVEEYTGTINLSGNTGDLTFDTDAHSWYFNEIGACDDGEA

LEWKKRGVEVQWV

SEQ ID NO: 7 (peptídeo sinal: 1-20, 27 mutações em comparação com SEQ IP NO:1 em sequência madura):

MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAA

AAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVEAATTNTVTEFENSLSTDVTGYVAV

DSTNELIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWTEA

RTTVTAAVAQAAAQNPSYQVVVTGHSLGGAIAALAAGALRNQGYTVDLYS

FGAPRVGNETLSEYITNQAGGNYRITHLNDPVPKLPPLLMGYRHISPEYYIS

SGNNVTVTANDVQEYTGTINLQGNTGDLTFDIDAHSWYFNEIGACDDGEA

LEWKKRGVEVQWV

SEQ IP NO: 8 (peptídeo sinal: 1-20, 41 mutações em comparação com SEQ IP NO:1 em sequência madura):

MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFQFFEQYAA

AAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVQAATTNTVYEFENSLSTDVTGYVAV

DSTNKLIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWLEA

RTTVTPAVAQARAQNPDYQVVVTGHSLGGAIAALAAGDLRNQGYTVDLYT

FGAPRVGNETLSEYITNQAGGNYRITHWNDPVPKLPPLLMGYVHISPEYYI

SSGNNVTVTANDVQEYTGTINLQGNTGDLTFDIDAHSWYFNEIGACDDGE ALEWKKRGVEVQWV

SEQ IP NO: 9 (peptídeo sinal: 1-20, 56 mutações em comparação com SEQ IP NO:1 em sequência madura):

MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLDTFQFFEQYAA

AAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVQAADTNTVYEFENSLSTDVTGYVA

VDHTNKLIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWLE

ARDTVTPAVYQARAQKPDYQVVVTGHSLGGAIAALAAGDLRNQGYTVDLY

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TFGAPRVGNSTLSEYITNQPGGNYRVTHWNDPVPKLPPLLMGYVHISPEY YISSPNNVTVTANDVQVYEGVINLQGNEGDLTTDIDAHSWYFNEIGACDDG EALEWKKRGVEVQWV

Exemplo 5

Panificacão em tosta americana com várias enzimas lipolíticas [0202] Foi produzido pão como descrito no Exemplo 2.

[0203] As enzimas lipolíticas SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 foram adicionadas à massa em uma quantidade de 0,4, 1 e 2 mg de proteína de enzima (EP)/kg de farinha. As enzimas lipolíticas foram testadas como descrito no Exemplo 4.

[0204] O volume de pão e parâmetro de C-cell “brilho das fatias” foram medidos.

Os seguintes resultados foram obtidos Tabela 7:

Amostra	Dosagem de enzima lipolítica (mg de EP/kg de farinha)	Volume de pão (mL/g)	Parâmetro de C-cell “brilho das fatias”
Controle		5,08	138,2
Soft'r Silk a 1%		4,85	149,5
SEQ ID NO:6	0,4	4,24	145,7
SEQ ID NO:6	1	5,09	144,8
SEQ ID NO:6	2	5,11	139,8
SEQ ID NO:7	0,4	5,07	141,0
SEQ ID NO:7	1	5,23	147,5
SEQ ID NO:7	2	5,10	148,3

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55/63 [0205] Pode ser visto a partir da Tabela 7 que, por uso das enzimas lipolíticas (SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7) de acordo com a invenção, o brilho das fatias é mais elevado do que o controle, e SEQ ID NO:7 é quase igual a Soft'r Silk a 1%.

Exemplo 6

Panificação em tosta americana com várias enzimas lipolíticas [0206] Foi produzido pão como descrito no Exemplo 2.

As enzimas lipolíticas SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 foram adicionadas à massa em uma quantidade de 0,4, 1 e 2 mg de proteína de enzima (EP)/kg de farinha (SEQ ID NO:8) e 0,4 mg de proteína enzima (EP)/kg de farinha (SEQ ID NO:9). As enzimas lipolíticas foram testadas como descrito no Exemplo 4.

[0207] O volume de pão, valor L de HunterLab e parâmetro de C-cell “brilho das fatias” foram medidos.

[0208] HunterLab é um método Espectrofotométrico Colorimétrico usando uma fonte de luz para iluminar a amostra, medindo a quantidade de luz a diferentes comprimentos de onda. A luz refletida pela amostra passa para uma grade que a quebra em seus componentes espectrais. O espaço de cor Hunter L a b é um espaço colorido retangular a 3 dimensões, onde eixo de L (luminosidade): 0 é preto e 100 é branco. O valor numérico se correlaciona com o que se vê.

[0209] 2 fatias de cada pão foram usadas, e cada fatia foi medida uma vez usando o HunterLab.

Os seguintes resultados foram obtidos Tabela 8:

Amostra

Dosagem de enzima lipolítica (mg

Volume de pão (mL/g)

Valor L de HunterLab

Parâmetro de C-cell “brilho das fatias”

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	de EP/kg de farinha)
Controle		5,17	79,6	134,7
Soft'r Silk a 1%		5,15	82,3	145,8
SEQ ID NO:8	0,4	5,36	80,2	140,6
SEQ ID NO:8	1	5,25	81,3	143,2
SEQ ID NO:8	2	5,24	80,3	140,6
SEQ ID NO:9	0,4	5,38	81,3	141,1

[0210] Pode ser visto a partir da Tabela 8 que, por uso das enzimas lipolíticas (SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9) de acordo com a invenção, o brilho das fatias e valores L de HunterLab são mais elevados do que o controle. Em conclusão, tanto SEQ ID NO:8 como SEQ ID NO:9 introduziram brancura do miolo.

Exemplo 7

Bolachas sem sabor estranho [0211] Foram preparadas bolachas usando os ingredientes da Tabela 9.

Tabela 9: ingredientes de bolachas

Receita (g)	A	B	C
Tegral Patacrout* (Puratos, Bélgica)	400	400	400
Ovos	40	40	40
Manteiga	160	160	160
Lipopan 50 (Novozymes A/S)		0,04

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SEQ ID NO:1 (mg de EP)**

0,92

* Contém farinha de trigo, açúcar, glúten de trigo, levedante químico (difosfato dissódico) ** 0,92 mg (proteína de enzima SEQ ID NO:1) foram adicionados por 400 g de Tegral Patacrout

Processo:

[0212] Os ingredientes foram combinados em um misturador Hobart durante 2 min à velocidade 1. A massa foi embalada em um filme de plástico e repousou durante a noite a 25 °C.

[0213] No dia seguinte, a massa foi rolada entre 2 folhas de papel de panificação até uma espessura de 2 mm. Bocados com diâmetro de 6,5 cm foram cortados.

[0214] Os bocados de massa foram panificados em um forno Miwe Condo durante 11 min a 180 °C. Nenhum vapor foi adicionado durante a panificação.

Análise das bolachas:

[0215] Os voláteis de uma amostra foram determinados usando uma técnica HS-SPME-GC-MS. Uma fibra de Divinilbenzeno/Carboxeno/Polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) foi usada para a extração dos componentes voláteis.

[0216] As amostras foram em primeiro lugar pré-aquecidas durante 10 min a 80 °C com uma velocidade de mistura de 250 rpm e depois a extração foi levada a cabo durante 30 min a 80 °C sob a mesma velocidade de mistura.

[0217] As análises de GC/MS foram realizadas com um cromatógrafo gasoso Agilent 5890A equipado com um espectrômetro de massa 5975C inerte MSD com Detector de Eixo Triplo e um autoamostrador

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Gerstel MPS configurado para análise SPME automatizada. A separação dos analitos foi realizada em uma coluna capilar RESTEK Stabilwax, espessura de filme de 30 m x 0,25 mm x 0,50 pm. O forno da coluna foi programado como se segue: temperatura inicial 80 °C durante 10 min, com rampa a 16 °C/min até 220 °C, que foi mantida a 220 °C durante 8 min. Hélio foi usado como gás transportador com um caudal constante de 1 mL/min. Os compostos voláteis foram identificados por comparação com os espectros de massa da biblioteca NIST MS Search 2.0.

[0218] Os componentes voláteis: ácidos butanoico, hexanoico, octanoico e decanoico, são responsáveis por sabor estranho forte. A Tabela 8 mostra as concentrações de ácidos butanoico, hexanoico, octanoico e decanoico.

Tabela 10: Concentração relativa (área do pico) de componentes voláteis identificados nas amostras de bolachas

	A	B	C
Ácido butanoico	151,000,000	1191,000,000	243,000,000
Ácido hexanoico	398,000,000	2050,000,000	580,000,000
Ácido octanoico	210,000,000	2650,000,000	200,000,000
Ácido decanoico	Não detectável	989,000,000	28,100,000

[0219] A Tabela 10 mostra que as bolachas produzidas com uma lipase comercial têm um conteúdo muito mais elevado de ácidos butanoico, hexanoico, octanoico e decanoico em comparação com as bolachas produzidas com a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0220] Adicionalmente, o pessoal panificador treinado não conseguiu percecionar qualquer sabor estranho nas bolachas produzidas com a enzima de acordo com a invenção, mas conseguiram percecionar um sabor estranho forte nas bolachas produzidas com a lipase comercial.

Petição 870190080608, de 19/08/2019, pág. 68/123

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Exemplo 8

Brioches sem sabor estranho [0221] Foram preparados brioches usando os ingredientes da Tabela 11.

Tabela 11: ingredientes de brioches

Receita (g)	D	E	F
Farinha (farinha Crousti, Dossche Mills, Deinze, Bélgica) a 7 °C	1500	1500	1500
Água a 4 °C	450	450	450
Levedura (levedura instantânea Bruggeman Brown)	30	30	30
Sal	24	24	24
Açúcar S1	270	270	270
Manteiga	225	225	225
Ovos	300	300	300
Brioche AML (Puratos, Bélgica)*	30	30	30
Lipopan 50 (Novozymes A/S)		1,15
SEQ ID NO:1 (mg de EP)**			3,47

* Contém farinha de trigo, glúten de trigo hidrolisado, antioxidante (ácido ascórbico) & enzimas.

** 3,47 mg (proteína de enzima SEQ ID NO:1) foram adicionados por 1500 g de farinha

Petição 870190080608, de 19/08/2019, pág. 69/123

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Processo:

Foi usado o seguinte processo:

[0222] Misturar os diferentes ingredientes em um Diosna SP24 durante 6 min a velocidade lenta e durante 11 min a velocidade rápida (somente adicionar a gordura após 4 min mistura rápida). A temperatura final da massa é em torno de 27 °C.

[0223] Realizar uma fermentação a granel durante 10 min à temperatura ambiente a 25 °C.

Escalonar até massa de 500 g.

Moldar manualmente o pão.

Realizar um tempo de prova intermediário de 20 min a 25 °C.

Moldar em um Jac Unic com R4.5 e L16.

Provar durante 165 min a 28 °C e RH a 95% em uma câmara de fermentação Koma.

[0224] Panificar durante 30 minutos a 200 °C em um forno Miwe Condo.

Deixar os brioches resfriar durante 90 minutos e embalar o pão em sacos de plástico.

Análise dos brioches:

[0225] A análise dos voláteis (mesmos voláteis como descrito no Exemplo 4) foi realizada nos brioches.

[0226] A Tabela 12 mostra as concentrações de ácidos butanoico, hexanoico, octanoico e decanoico.

Tabela 12: Concentração relativa (área do pico) de componentes voláteis identificados nas amostras de brioches

	D	E	F
Ácido butanoico	69,700,000	74,800,000	65,400,000
Ácido hexanoico	101,000,000	513,000,000	187,000,000

Petição 870190080608, de 19/08/2019, pág. 70/123

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Ácido octanoico	93,800,000	625,000,000	151,000,000
Ácido decanoico	Não detectável	140,000,000	Não detectável

[0227] A Tabela 12 mostra que os brioches produzidos com uma lipase comercial têm um conteúdo mais elevado de ácidos butanoico, hexanoico, octanoico e decanoico em comparação com os brioches produzidos com a enzima lipolítica de acordo com a invenção.

[0228] Adicionalmente, o pessoal panificador treinado não conseguiu percecionar qualquer sabor estranho nos brioches produzidos com a enzima de acordo com a invenção, mas conseguiram percecionar um sabor estranho forte nos brioches produzidos com a lipase comercial.

[0229] É para ser notado que os brioches produzidos com as enzimas (E & F) dão um miolo mais fino do que os brioches somente com manteiga (avaliado pelo pessoal panificador treinado).

Exemplo 9

Pão produzido com a enzima de acordo com a invenção Foi preparado pão usando os ingredientes da Tabela 13. Tabela 13: Ingredientes do pão

Receita (g)	G	H	I	J
Farinha (farinha Crousti, Dossche Mills, Deinze, Bélgica) a 7 °C	1500	1500	1500	1500
Água a 12 °C	810	810	810	810
Levedura Fresca	45	45	45	45
Sal	28,5	28,5	28,5	28,5
Açúcar (sacarose)	90	90	90	90
Óleo de colza	30	30	30	30

Petição 870190080608, de 19/08/2019, pág. 71/123

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Propionato de cálcio	7,5	7,5	7,5	7,5
Melhorador de Pão (Puratos, Bélgica)*	15	15	15	15
SEQ ID NO:1 (mg de EP)**		3,47
Bakezyme L80000 (DSM, Holanda) (mg)			4,2
Amanolipase DF15 (Amano, Japão) (mg)				22,5

* Contém farinha de trigo, antioxidante (ácido ascórbico) & enzimas (amilase, xilanase).

Processo:

[0230] Foi usado o seguinte processo:

Misturar os diferentes ingredientes em um Diosna SP24 durante 2 min a velocidade lenta e durante 7 min a velocidade rápida. A temperatura final da massa é em torno de 26 °C.

[0231] Realizar uma fermentação a granel durante 5 min à temperatura ambiente a 25 °C.

[0232] Escalonar para massa de 600 g.

[0233] Moldar manualmente o pão.

[0234] Realizar um tempo de prova intermediário de 15 min a 25 °C.

[0235] Moldar em um Jac Unic com R4.5 e L15.

[0236] Provar durante 110 min a 35 °C e RH a 95% em uma câmara de fermentação Koma.

[0237] Panificar durante 25 minutos a 220/230 °C (acima/abaixo) em um forno Miwe Condo.

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63/63 [0238] Deixar o pão resfriar durante 120 minutos e embalar o pão em sacos de plástico.

Medição da textura do pão:

[0239] Para a medição da dureza, um TA.XT da Stable Micro Systems (TA.XT plus) foi usado. 10 repetições (pão diferente) foram medidas com uma sonda de diâmetro 25 mm com uma velocidade de 2 mm/s e comprimidas com uma força de 25% da altura total no miolo do pão.

[0240] As medições da dureza são mostradas na tabela

14.

Tabela 14: Medições da dureza em amostras de pão, medidas ao dia 2

	G	H	I	J
Dureza (média) (g)	211	161	200	195
stdev	21	14	12	15

[0241] Os resultados mostram que o pão produzido com a enzima de acordo com a invenção é significativamente mais macio do que a referência. Os pães produzidos com lipase comercial são similares na maciez à referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptideo tendo atividade de enzima lipolítica, selecionado do grupo consistindo em:

(a) um polipeptideo tendo, pelo menos, 65% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1;

(b) um polipeptideo codificado por um polinucleotídeo que híbrida sob condições de estringência média com a sequência codificante do polipeptideo de SEQ ID NO: 2;

(c) um polipeptideo codificado por um polinucleotídeo tendo, pelo menos, 65% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptideo de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento do polipeptideo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de enzima lipolítica.
2. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1, tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 21 a 309 de SEQ ID NO: 1.
3. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo um segmento catalítico da sequência de aminoácidos GH-S-L-G.
4. Polipeptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1,2 ou 3, em que o polipeptideo tem atividade de lipase e fosfolipase.
5. Polinucleotídeo isolado codificando o polipeptideo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4.
6. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 5, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptideo em um hospedeiro de expressão.

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7. Célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 5, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo.
8. Método de produção de um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, compreendendo cultivo de uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 7, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo.
9. Granulado ou um líquido estabilizado compreendendo o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou

4.
10. Composição compreendendo a enzima lipolítica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, e uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em aminopeptidase, amilase, alfa-amilase, alfa-amilase maltogênica, beta-amilase, carboxipeptidase, catalase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, galactanase, glucana 1,4-alfa-maltotetra-hidrolase, glucanase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, mananase, manosidase, oxidase, enzimas pectinolíticas, peptidoglutaminase, peroxidase, enzima fosfolipolítica, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase e xilanase.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas do grupo consistindo em alfa-amilase maltogênica, beta-amilase e glucana 1,4-alfa-maltotetra-hidrolase.
12. Método para preparação de um produto panificado, compreendendo o passo de adição à massa, antes da panificação, de uma enzima lipolítica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, um granulado ou um líquido estabilizado, conforme definido na reivindicação 9, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 ou 11.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a quantidade de enzima lipolítica é entre 0,01 e 100 mg, preferencialmente entre 0,05 e 50 mg, mais preferencialmente entre 0,1 e 25 mg, ainda mais preferencialmente entre 0,1 e 15 mg de proteína de enzima por kg de farinha na massa ou no polme.

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14. Uso de uma enzima lipolítica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, um granulado ou um líquido estabilizado, conforme definido na reivindicação 9, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, em aplicações de panificação e/ou pastelaria.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, em melhoradores de pão e/ou em misturas ou pré-misturas de pastelaria.