CN110300523A

CN110300523A - 用于在烘焙中使用的脂肪分解酶

Info

Publication number: CN110300523A
Application number: CN201880012358.2A
Authority: CN
Inventors: H·厄斯特达尔; S·M·兰德维克; R·P·奥林斯基; E·阿加什; B·范温克尔; F·阿尔瑙特
Original assignee: Puratos NV; Novo Nordisk AS
Current assignee: Puratos NV; Novo Nordisk AS
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2018-02-19
Publication date: 2019-10-01
Also published as: JP2022136118A; JP2022136117A; RU2019128224A; MX2019009551A; ZA201905583B; CA3051770A1; EP3582619A1; US20190364912A1; WO2018150021A1; US20210321631A1; JP7340073B2; AU2018222787A1; BR112019017271A2; US11510413B2; JP2020508698A; AU2018222787B2; US11051520B2; RU2019128224A3; RU2763469C2

Abstract

一种多肽，该多肽具有脂肪分解酶活性，该多肽选自下组，该组由以下组成：(a)与SEQ ID NO:1的氨基酸21至309具有至少65％的序列同一性的多肽；(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:2的多肽编码序列杂交；(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:2的多肽编码序列具有至少65％序列同一性的多核苷酸编码；和(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有脂肪分解酶活性。

Description

用于在烘焙中使用的脂肪分解酶

序列表的引用

本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及新的脂肪分解酶；特别是用于在面团中使用的具有改进的特性的脂肪分解酶，其中它们例如可以取代通常用于在烘焙中使用的乳化剂。

背景技术

白色瓤和精细的瓤结构是消费者偏好面包的重要特征；特别是工业包装的面包，如吐司面包。通常通过在面包制作期间向面团添加乳化剂来实现精细的瓤结构。如今，消费者倾向于避免食用含有乳化剂的烘焙产品。

多年来已知脂肪分解酶在烘焙中的用途。

WO 98/26057披露了来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的脂肪酶/磷脂酶及其在烘焙中的用途。

WO 2004/099400披露了各种脂肪分解酶及其在烘焙中用于降低面团粘性的用途。

WO 1999/053769披露了产麦芽糖α-淀粉酶和磷脂酶用于在烘焙后的初始时间段改进烘焙产品的柔软度的用途。

脂肪分解酶在烘焙中的使用会提供由于游离链脂肪酸的形成导致的不想要的异味。

本发明涉及能够提供白色瓤和精细的瓤结构而不会引起异味的新的脂肪分解酶。

发明内容

诸位发明人已经发现一种新的脂肪分解酶，该脂肪分解酶令人惊讶地提供了白色瓤和精细的瓤结构，并且同时当在烘焙中使用时，脂肪分解酶不提供异味，因此我们要求保护：

一种多肽，该多肽具有脂肪分解酶活性，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:1的氨基酸21至309具有至少65％的序列同一性的多肽；

(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:2的多肽编码序列杂交；

(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:2的多肽编码序列具有至少65％序列同一性的多核苷酸编码；和

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有脂肪分解酶活性。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸21至309具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶包含氨基酸序列G-H-S-L-G的催化区段。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶具有脂肪酶、磷脂酶和/或半乳糖脂酶活性；特别是该脂肪分解酶具有脂肪酶和磷脂酶活性。

在一个实施例中，我们要求保护编码根据本发明的脂肪分解酶的分离的多核苷酸。

在一个实施例中，我们要求保护一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含编码根据本发明的脂肪分解酶的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

在一个实施例中，我们要求保护一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码根据本发明的脂肪分解酶的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

在一个实施例中，我们要求保护一种产生根据本发明的脂肪分解酶的方法，该方法包括在有益于多肽的产生的条件下培养宿主细胞。

在一个实施例中，我们要求保护包含根据本发明的脂肪分解酶的颗粒或稳定化液体。

在一个实施例中，我们要求保护包含根据本发明的脂肪分解酶和一种或多种选自下组的酶的组合物，该组由以下组成：氨肽酶、淀粉酶、α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳聚糖酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶；特别是包含根据本发明的脂肪分解酶和一种或多种选自下组的酶的组合物，该组由以下组成：产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶；特别地是包含根据本发明的脂肪分解酶和产麦芽糖α-淀粉酶的组合物。

在一个实施例中，我们要求保护一种用于制备烘焙产品的方法，该方法包括在烘焙之前将根据本发明的脂肪分解酶、根据本发明的颗粒或稳定化液体或根据本发明的组合物添加到面团中的步骤。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶的量为在面团或面糊中在0.01和100mg之间，优选地在0.05和50mg之间，更优选地在0.1和25mg之间，甚至更优选地在0.1和15mg酶蛋白每kg面粉之间。

在一个实施例中，我们要求保护根据本发明的脂肪分解酶在烘焙和/或糕点应用中的用途。

在一个实施例中，我们要求保护包含根据本发明的脂肪分解酶的颗粒或稳定化液体在烘焙和/或糕点应用中的用途。

在一个实施例中，我们要求保护包含根据本发明的脂肪分解酶和一种或多种另外的酶在的组合物在烘焙和糕点应用中的用途。

在一个实施例中，我们要求保护根据本发明的脂肪分解酶在面包改进剂和/或在糕点混合物或预混物中的用途。

具体实施方式

定义

脂肪分解酶：术语“脂肪分解酶”包括具有脂肪酶、磷脂酶和/或半乳糖脂酶活性的酶(EC 3.1.1)；特别是具有脂肪酶和磷脂酶活性的酶。脂肪分解酶也可具有其他活性。术语“脂肪分解酶”可与术语“具有脂肪分解酶活性的多肽”互换使用。

根据本发明，脂肪酶活性可通过以下方法测量：

可以使用三丁酸甘油酯作为底物确定脂肪酶活性。该方法是基于三丁酸甘油酯通过该酶的水解，并且将在水解期间维持pH恒定的碱消耗登记为时间的函数。

一个脂肪酶单位(LU)定义为在标准条件(即在30℃；pH 7.0；具有0.1％w/v阿拉伯胶作为乳化剂和0.16M三丁酸甘油酯作为底物)下，每分钟释放1微摩尔可滴定丁酸的酶量。

用于鉴定脂肪酶活性的有用方案如下，使用三丁酸甘油酯板：

三丁酸甘油酯底物混合物：

15ml甘油三丁酸酯(Glycerintributyrate)(三丁酸甘油酯)

2g阿拉伯胶。

285ml H₂O

用于2个板的使用：

·5ml三丁酸甘油酯混合物，添加50ml pH 7.0的0.02M通用缓冲液

·预热至60℃

·Ultra turax运行60秒以获得光滑乳液

制作2％琼脂糖溶液：

·2g用于100ml H₂O

·煮沸并使溶液到60℃(使用水浴)

将50ml三丁酸甘油酯/缓冲溶液与50ml 2％琼脂糖混合，添加250微升4％结晶紫。向每个板(OmniTray Single Well目录号242811和Nunc TSP 96目录号445497)倾倒50ml。可以施用10微升样品。可以将板在30℃孵育约1小时和3小时。可以将活性拍照。

脂肪酶活性：三酰基甘油脂肪酶活性(EC 3.1.1.3)，即对甘油三酯(例如三丁酸甘油脂)中羧酸酯键的水解活性。

磷脂酶活性：磷脂酶活性(A1或A2，EC 3.1.1.32或3.1.1.4)，即对磷脂如卵磷脂中一个或两个羧酸酯键的水解活性。

半乳糖脂酶活性：半乳糖脂酶活性(EC 3.1.1.26)，即对半乳糖脂如DGDG(二半乳糖甘油二酯)中羧酸酯键的水解活性。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪分解酶活性。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是意指编码具有脂肪分解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

序列同一性：两个氨基酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

根据本发明的具有脂肪分解酶活性的多肽可以在一个或多个(例如若干个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

改进的特性：当根据本发明的脂肪分解酶以有效量掺入面团中时，面团或由其获得的烘焙产品的一种或多种特性可以改进。

术语“改进的特性”在本文中定义为相对于从其中未掺入根据本发明的脂肪分解酶的面团获得的面团或产品，通过根据本发明的脂肪分解酶的作用而得到改进的面团和/或从该面团获得的产品(特别是烘焙产品)的任何特性。

改进的性质可包括但不限于烘焙产品的瓤改进的白度、烘焙产品的改进的瓤结构、烘焙产品的改进的瓤柔软度、改进的烘焙产品的风味、和/或改进的烘焙产品的抗老化特性。

该改进的特性可以通过比较添加和不添加根据本发明的脂肪分解酶制备的面团和/或烘焙产品来确定。感官品质可以使用在烘焙行业中已很好地确立的程序来评估，并且可以包括例如感官小组的使用。

烘焙产品的改进的瓤结构：术语“烘焙产品的改进的瓤结构”在本文中定义为具有更精细的瓤的烘焙产品。改进的瓤细度与更小的孔室和/或瓤中更薄的孔室壁，和/或瓤中更均匀/均一的孔室分布相关，并且其通常通过面包师/感官小组从视觉上或通过如本领域已知的数字图像分析(例如，C-孔室(C-cell)，国际精密控制有限公司(Calibre ControlInternational Ltd)，沃灵顿(Warrington)，英国，如本发明的实例2-3中示出的)评估。

瓤的改进的白度：经常通过测量面包瓤的白度来评估瓤的细度，因为更精细的瓤结构以使瓤看起来更白的方式反射光。可以如本领域已知的去测量瓤的白度，例如通过使用用彩色扫描仪测量的HunterLab L值。

烘焙产品的改进的瓤柔软度：术语“烘焙产品的改进的瓤柔软度”与“硬度”相反，并且在本文中定义为如下烘焙产品的特性，其更容易被压缩，并且由熟练的测试面包师或感官小组(sensory panel)依靠经验评估或使用如本领域已知的质地分析器(例如，来自英国萨里(Surrey)的稳定微系统公司(Stable Micro Systems Ltd)的TAXT2或TA-XT Plus)来测量。

烘焙产品的改进的风味：术语“烘焙产品的改进的风味”由受过训练的测试小组和/或化学分析(例如，顶空GC-MS分析)评估。烘焙产品的改进的风味包括减少烘焙产品的一种或多种异味。

烘焙产品的改进的抗老化：术语“烘焙产品的改进的抗老化”在本文中定义为如下烘焙产品的特性，其在储存期间具有质量参数(例如柔软度和/或弹性)的降低的劣化率。

烘焙产品的体积：术语“烘焙产品的体积”如对给定一条面包的体积进行测量。可以通过油菜种子置换法确定体积。

异味：通过本领域已知的经过训练的测试小组/化学分析评估烘焙产品是否具有异味的术语。

根据本发明的脂肪分解酶

适用于本发明的脂肪分解酶包括具有脂肪分解酶活性的选自下组的多肽，该组由以下组成：

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有脂肪分解酶活性。

出于本发明的目的，将SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽用以确定另一种脂肪分解酶中的对应的氨基酸残基。

将另一种脂肪分解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸21至309具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

在一个实施例中，根据本发明的脂肪分解酶包含氨基酸序列G-H-S-L-G的催化三联体。

本发明的脂肪分解酶优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸21至309或其等位基因变体或由其组成；或是其具有脂肪分解酶活性的片段。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有脂肪分解酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆实验指南],第2版,冷泉港,纽约)。

SEQ ID NO:2的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:1的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或物种的菌株的、编码具有脂肪分解酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上文描述的探针杂交并编码具有脂肪分解酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:2或其子序列杂交的克隆或DNA，可以在DNA印迹中使用该载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在另一个实施例中，本发明涉及具有脂肪分解酶活性的分离的多肽，该多肽由与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:1的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press),纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在所述分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的脂肪分解酶活性进行测试以鉴定对于所述分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。

也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

具有脂肪分解酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得本发明的具有脂肪分解酶活性的多肽。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

在一方面，该多肽是从Valsaria属获得，例如但不限于红聚颈腔菌(Valsariarubricosa)。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:AGuide to Methods and ApplicationA Guide to Methods andApplication[PCR：方法和应用指南],学术出版社(Academic Press),纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自Valsaria属的菌株，例如红聚颈腔菌或相关生物体。

编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,1991,ProteinExpression and Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单孢菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)以及浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby氏真菌字典],第8版,1995,国际应用生物科学中心(CAB International),英国剑桥大学出版社(UniversityPress,Cambridge,UK))。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(见上文)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Saccharomyces oviformis)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtorulosum)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞；特别是米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。

真菌细胞可以通过以下过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适的程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和任选地(b)回收该多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于脂肪分解酶是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多肽，从而以可回收的量表达和产生多肽或结构域。可以从该植物或植物部分回收该多肽或结构域。可替代地，含有该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物通常是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

包含根据本发明的脂肪分解酶的组合物

本发明涉及包含根据本发明的脂肪分解酶的组合物。

该组合物可以进一步包含一种或多种另外的酶，特别是一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：氨肽酶、淀粉酶、α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳聚糖酶、葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶；特别是产麦芽糖α-淀粉酶。

组合物可以根据本领域已知的方法制备并且可以具有任何物理外观，如液体、糊状或固体。例如，可以使用本领域已知的配制酶和/或药物产品的方法配制组合物，例如配制成包衣或未包衣的颗粒或微颗粒。

可以依据本领域中已知的方法来稳定化要纳入组合物中的根据本发明的脂肪分解酶和任选地任何另外的酶，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化来稳定化组合物中的多肽，或可以通过添加聚合物如PVP、PVA、PEG或已知有益于多肽在固体或液体组合物中的稳定性的适合的其他聚合物来稳定化多肽。

当将根据本发明的脂肪分解酶配制为颗粒或附聚的粉末时，粒子典型地具有窄的粒度分布，其中超过95％(重量)的粒子在从25至500微米的范围内。

颗粒和附聚的粉末可通过常规方法制备，例如通过在流化床制粒机中将脂肪分解酶喷雾到运载体上来制备。该运载体可以由具有适合的粒度的微粒核组成。载体可以是可溶性的或者不溶性的，例如盐(如NaCl或者硫酸钠)、糖(如蔗糖或者乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、大米、粗磨玉米粉或者大豆。组合物优选处于干粉或颗粒的形式，特别是无尘颗粒的形式。

因此，本发明还提供了包含根据本发明的脂肪分解酶的颗粒或稳定化液体。

另外的酶

任选地，一种或多种另外的酶如氨肽酶、淀粉酶、α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳聚糖酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和/或木聚糖酶可以与根据本发明的脂肪分解酶一起使用。

用于本发明的葡糖淀粉酶包括与黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),1097-1102页)，披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶或米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),941-949页)。

淀粉酶可以是真菌或细菌，例如来自嗜热脂肪芽孢杆菌的产麦芽糖α-淀粉酶或来自芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌)的α-淀粉酶，例如来自植物(例如大豆)或来自微生物来源(例如芽孢杆菌)的β-淀粉酶，或例如来自米曲霉的真菌α-淀粉酶。

该产麦芽糖α-淀粉酶还可以是在如例如WO 1999/043794；WO 2006/032281；或WO2008/148845中所披露的产麦芽糖α-淀粉酶。

适合的商业产麦芽糖α-淀粉酶包括NOVAMYL、OPTICAKE 50BG和OPTICAKE 3D(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))。适合的商业真菌α-淀粉酶组合物包括例如BAKEZYME P300(可获得自DSM公司)和FUNGAMYL 2500SG、FUNGAMYL 4000BG、FUNGAMYL 800L、FUNGAMYLULTRA BG和FUNGAMYL ULTRA SG(可获得自诺维信公司)。

抗老化淀粉酶还可以是来自例如假单胞菌属(Pseudomonas)的淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60))，如WO 1999/050399、WO 2004/111217或WO 2005/003339中披露的任何淀粉酶。

葡糖氧化酶可以是真菌葡糖氧化酶，具体地是黑曲霉葡糖氧化酶(例如可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))。

半纤维素酶可以是戊聚糖酶，例如可为微生物来源的木聚糖酶，例如衍生自细菌或真菌，例如曲霉属(特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)或塔宾曲霉(A.tubigensis))的菌株，衍生自木霉属(例如，里氏木霉(T.reesei))的菌株，或衍生自腐质霉属(例如，特异腐质霉(H.insolens))的菌株。

用于本发明的适合的可商购的木聚糖酶制剂包括PANZEA BG、PENTOPAN MONO BG和PENTOPAN 500BG(可获得自诺维信公司)、GRINDAMYL POWERBAKE(可获得自杜邦公司(DuPont))、以及BAKEZYME BXP 5000和BAKEZYME BXP 5001(可获得自DSM公司)。

蛋白酶可以来自芽孢杆菌属，例如解淀粉芽孢杆菌或来自水生栖热菌(Thermusaquaticus)。

面团

在一方面，本发明披露了一种用于制备面团或从该面团制备的烘焙产品的方法，该方法包括向该面团中掺入根据本发明的脂肪分解酶。

在另一方面，本发明提供了包含面粉、水和有效量的包含根据本发明的脂肪分解酶的烘焙组合物的面团或预混物。

本发明还涉及用于制备面团或烘焙产品的方法，这些方法包括向该面团中掺入有效量的本发明的烘焙组合物，该烘焙组合物相对于其中未掺入脂肪分解酶的面团或烘焙产品改进面团或从面团获得的烘焙产品的一种或多种特性。

短语“掺入面团中/向面团中掺入”在本文中定义为将根据本发明的烘焙组合物添加到面团中、添加到待制作面团的任何成分中、和/或添加到待制作面团中面团成分的任何混合物中。换言之，本发明的烘焙组合物可以在面团制备的任何步骤中添加，并且可以在一个、两个或多个步骤中添加。使用本领域熟知的方法将组合物添加到可以揉捏和烘焙的面团成分中以制成烘焙产品。

术语“有效量”在本文中定义为如下根据本发明的烘焙组合物的量，其足以对面团和/或烘焙产品的至少一种感兴趣的特性提供可测量的影响。

术语“面团”在本文中定义为面粉和其他成分的混合物，其足够硬以揉捏或滚压。在本发明的上下文中，面糊涵盖在术语“面团”中。

本发明的面团可以包含衍生自任何谷粒或其它来源的面粉，包括小麦、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、单粒小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、稻、粟、苋菜、奎奴亚藜和木薯。

面团还可以包含其他常规的面团成分，例如蛋白质，如奶粉、面筋和大豆；鸡蛋(全蛋、蛋黄或蛋白)；氧化剂，如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，如L-半胱氨酸；糖；盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠、或硫酸钙、和/或乳化剂。

面团可以包含脂肪(甘油三酯)，例如颗粒状的脂肪或起酥油。

本发明的面团可以是新鲜的、冷冻的或部分烘焙的(预烘焙的)。

本发明的面团通常是经发酵的面团或将要经受发酵的面团。

该面团可以各种方式来发酵，例如通过添加化学发酵剂(例如焙粉、碳酸氢钠)或通过添加发酵剂(发酵面团)，但优选的是通过添加适合的酵母培养物如酿酒酵母(面包酵母)的培养物(例如可商购的酿酒酵母菌株)来发酵该面团。

根据本发明的脂肪分解酶可以不显著改变烘焙产品体积，特别是面包体积；典型地，体积可以增加或减少0-5％。

根据本发明的脂肪分解酶的量可以是在面团中在0.01-100mg酶蛋白每kg面粉之间，特别是在0.05-50mg酶蛋白每kg面粉之间，特别是在0.1-25mg酶蛋白每kg面粉之间，特别是在面团中在0.1-15mg酶蛋白每kg面粉之间。

乳化剂

对于一些应用，不需要乳化剂；对于一些应用，可能需要乳化剂。

适用于本发明的乳化剂优选为选自由以下组成的组的乳化剂：甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、乙氧基化甘油单酯和甘油二酯(EMG)、蒸馏的甘油单酯(DMG)、聚山梨醇酯(PS)、和琥珀酰化的甘油单酯(SMG)。

在一些应用中，根据本发明的脂肪分解酶替换了通常存在于面团配方中的所有一种或多种乳化剂。

面包改进剂和糕点混合物或预混物

本发明的脂肪分解酶可以有利地是面包改进剂或糕点混合物或预混物的一部分。

典型地将“面包改进剂”(也称为“面团调理剂”或“面团改进剂”或“改进剂”或“面粉处理剂”)添加到面团中以改进烘焙产品的质地、结构、体积、风味和新鲜度，以及改进面团的机械操作性和稳定性。

典型地，面包改进剂包括或由以下组成：一种或多种酶(例如像淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉降解淀粉酶)、木聚糖酶(半纤维素酶)、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、果胶裂解酶、氧化酶(过氧化物酶、葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、硫氢基氧化酶)、脂加氧酶、脱氢酶、漆酶、转谷氨酰胺酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶)、一种或多种氧化剂或还原剂(例如像抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸)、一种或多种乳化剂(例如像甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、单硬脂酸甘油酯(GMS)、鼠李糖脂、卵磷脂、蔗糖酯、胆盐)、一种或多种脂质材料(例如像黄油、油、起酥油)、一种或多种糖、一种或多种面粉或面粉级分、一种或多种维生素(例如像泛酸和维生素E)、一种或多种胶、和/或一种或多种纤维源(例如像燕麦纤维)。

蛋糕(糕点)混合物典型地包含蛋糕配方的所有成分，除了水、脂肪(油、黄油、人造黄油)和鸡蛋之外。鸡蛋可以以粉末形式添加到蛋糕(糕点)混合物中。蛋糕(糕点)预混物典型地是蛋糕混合物，其中全部或部分面粉和糖已被去除。

烘焙产品

本发明的工艺可用于任何种类的从面团制备的烘焙产品，特别是软性的，无论是白色、浅色或深色类型。实例是面包(具体地是白色的、全麦或黑麦面包)，典型地处于面包或面包卷、面包、皮塔饼、墨西哥玉米粉圆饼(tortillas)、蛋糕、薄煎饼、饼干、薄饼、曲奇、馅饼皮、馒头、比萨等的形式。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

实例1

根据本发明的脂肪分解酶的克隆、表达和发酵

使用土壤用Fast DNA Spin试剂盒(Fast DNA Spin for Soil Kit)(目录号6560-200，来自MP生物医疗公司(MP Biochemicals))，依照供应商的方案从红聚颈腔菌菌株提取基因组DNA。

该红聚颈腔菌菌株于2002年分离自中国湖南的土壤。

如本领域已知，SEQ ID NO.1和2使用正向和反向引物(SEQ ID NO.3和4)通过PCR从基因组DNA扩增。

SEQ ID NO.1(信号肽：1-20)：

SEQ ID NO.2：

SEQ ID NO:3(引物)：

5’ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTCCGCTTCGATCTTACTCAGG-3’

SEQ ID NO:4(引物)：

5’AGATCTCGAGAAGCTTAAACCCACTGAACTTCTACCCCCC-3’

根据制造商的说明书，使用PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE医疗集团(GE Healthcare)，希勒勒丹麦)纯化PCR产物。根据制造商的说明书，使用IN-FUSION^TM PCR克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将对应于SEQ ID NO:2的纯化的PCR产物克隆入表达载体pDAu109(WO2005/042735)，该表达载体之前用Bam HI和Hind III线性化。

将1μl体积的未稀释连接混合物用于转化来自英杰公司(Invitrogen)的Multishot TOP 10化学感受态细胞(货号44-0091)。在含有100μg的氨苄青霉素每ml的LB琼脂板上选择1个菌落并在补充有100μg的氨苄青霉素每ml的2ml LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明书，使用Jetquick质粒小量制备旋转试剂盒(Jetquick Plasmid Miniprep SpinKit)(Genomed有限公司(Genomed GmbH)，洛纳德国)纯化质粒DNA。在异源表达之前，通过桑格测序(Sanger sequencing)验证SEQ ID NO:2序列。选择一种质粒(含有基因SEQ ID NO:2)用于在米曲霉宿主细胞中异源表达。

米曲霉宿主细胞是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。米曲霉的原生质体是根据WO 95/002043制备的。

将100μl的米曲霉原生质体与具有克隆的SEQ ID:2基因的1-2μg曲霉属表达载体混合，并且将250μl的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl₂以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)轻轻混合。在37℃下孵育30min后，添加4ml的顶层琼脂(温度40℃)，并且将原生质体涂布到COVE板上用于选择。在37℃下孵育4-7天后，将四个转化体的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的DAP-4C-01培养基中。在30℃下培养4-5天后，通过SDS-PAGE分析培养液，以鉴定从红聚颈腔菌产生最大量的重组蛋白的转化体。

将具有SEQ ID NO:2基因的最好的转化体的孢子涂布于含有0.01％X-100的COVE板上，以便分离单个菌落。在保存克隆之前重复涂布一次。

用于纯化的发酵

将如上所述构建的米曲霉转化体在振荡平台恒温箱中的于30℃下孵育的500ml有凹槽的摇瓶中的150ml DAP-4C-01培养基中在150RPM旋转下发酵3-5天并且进一步用于如下所述的测定。

使用的培养基

LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。

LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、和10g的氯化钠及补足至1升的去离子水构成。

DAP-4C-1

11g MgSO4，7H2O

1g KH2PO4

2g C6H8O7，H2O

20g右旋糖

10g麦芽糖

5.2g K3PO4，H2O

0.5g酵母提取物

0.5ml KU6痕量金属溶液(AMG)(MSA-SUB-FS-0042)

混合直至完全溶解

添加1ml Dowfax 63N10

用Milli-Q-水将体积调整至1000ml

0.5g的CaCO3片(添加1片/200ml)

在接种之前，向每个150ml的摇瓶添加3.5ml磷酸氢二铵(NH4)2HPO450％，和5.0ml20％乳酸。

KU6痕量金属溶液(AMG)(MSA-SUB-FS-0042)

6.8g ZnCl₂

2.5g CuSO₄.5H₂O

0.13g无水氯化镍

13.9g FeSO4.7H₂O

8.45g MnSO₄.H₂O

3g C₆H₈O₇.H₂O

离子交换水至1000ml

COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(BacteriologicalAnalytical Manual[细菌学分析手册]，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、以及曲通(Triton)X-100(50μl/500ml)。

COVE盐溶液由26g的MgSO₄·7H₂O、26g的KCL、26g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水构成。

COVE痕量金属溶液由0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₄·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O、以及补足至1升的去离子水构成。

SEQ ID NO:1的特征：

脂肪分解酶(SEQ ID NO:1)具有典型的脂肪分解酶盒，该盒具有在五肽：G-H-S-L-G中表征的催化三联体。

根据本发明的脂肪分解酶(SEQ ID NO:1)显示对三丁酸甘油酯、MGDG(单半乳糖甘油二酯)、DGDG(双半乳糖甘油二酯)、APE(N-酰基磷脂酰乙醇胺)和ALPE(N-酰基溶血磷脂酰乙醇胺)的活性，这显示该酶具有脂肪酶活性(三丁酸甘油酯)、磷脂酶活性(APE/ALPE)和半乳糖脂酶活性(MGDG/DGDG)。

SEQ ID NO:1的pH活性曲线：

用0.01％曲通(Triton)X-100将纯化的SEQ ID NO:1稀释至0.5、0.125、0.031和0.0078mg酶蛋白/ml。

将20μl稀释的酶样品与40μl pH缓冲液(0.1M乙酸钠、0.1M磷酸钠、1mM CaCl2，使用NaOH/HCl调节至pH 2、3、4、5、6、7、8和9)和40μl橄榄油底物溶液(12.5mg/ml橄榄油、0.1％阿拉伯胶、1.5mM CaCl2，用Ultra Turrax均质化)在96孔微量滴定板的孔中混合。

在艾本德恒温混匀仪(ppendorf Thermomixer)中于37℃孵育30min后，通过添加10μl终止剂(1M磷酸，10％曲通(Triton)X-100)并混合来终止反应。

然后使用NEFA试剂盒(和光诊断(Wako Diagnostics))定量来自橄榄油底物的释放的游离脂肪酸的浓度：将100μl R1试剂盒试剂(和光NEFA-HR(2)R1SET，434-91795)与25μl反应体积混合，并且在SpectraMax Plus读板器上读取546nm处的吸光度。然后添加50μlR2试剂盒试剂(和光NEFA-HR(2)R2SET，436-91995)，并且在室温下孵育20min(振荡)后，再次读取546nm处的吸光度。根据两个读数之间的差异，使用油酸标准曲线(1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0mM油酸)的结果计算游离脂肪酸的浓度。给出在线性范围内的应答的脂肪酶浓度用于计算每一pH下的活性。在表A中，给出了相对于在pH 4(最适pH)下的活性的活性。

表A：SEQ ID NO:1的pH活性曲线

实例2

根据标准的未发起面团(straight dough)配方，通过混合以下成分制备面包样品(按比例扩大面团的量以适合烘焙试验的要求)：

小麦面粉

制备以下面团样品，并从每个面团制备三个面包样品。Soft’r Silk是来自焙乐道(Puratos)NV(比利时大拜哈尔登(Groot-Bijgaarden))的商业DMG产品，并且用作商业DMG产品效果的基准。Soft’r Silk的用量与面粉含量有关。

表1：酶剂量：

通过在螺旋混合器(Diosna SP12，Dierks&公司，奥斯纳布吕克(Osnabrück)，德国)中以低速(17rpm)混合成分2min并在高速(35rpm)下混合7min来制备面团。混合后，在起鳞前评估面团(600g)。将起鳞的面团放置另外15min，然后将面团压片。将压片的面团置于开口的2200mL钢盘中(顶部尺寸：260mm(L)x 125mm(W)x 80mm(H))并在35℃，86％相对湿度下醒发90min。

在醒发后，将面团在柜式烤炉(瓦赫特尔(Wachtel)Piccolo公司，瓦赫特尔GmbH，希尔登(Hilden)，德国)中在230℃下烘焙25min。烘箱在烘焙步骤开始时采用短暂的蒸汽。将烘焙的面包从盘中取出并在室温下冷却2小时。使用食品体积测定仪(Volscanprofiler)600激光扫描仪(稳定微系统公司(Stable Micro Systems)，萨里(Surrey)，英国)确定面包样品的体积。随后，将面包样品用氮气填充在密封的塑料袋(PA/PE，90μm)中。

在室温下储存两天后，用电切片机(Graef主M182切片机，Graef&Co GmbH公司，埃伯斯贝格(Arnsberg)，德国)从每个面包的中间切下两片。采用C-孔室图像分析系统版本2.0软件(国际精密控制有限公司(Calibre Control International Ltd)，沃灵顿(Warrington)，英国)，使用C-孔室仪器测量每个切片一次。

C-孔室使用高清成像和受控的样品照明，以确保最佳的图像质量。分析整个切片以提供48个数据值和5个显示样品的特定特征的处理图像。可以使用参数‘切片亮度’评估瓤白度。亮度测量值是切片中所有像素的平均灰度水平。

更精细的瓤结构将给出更高的‘切片亮度’值。

表2：面包体积数据

表3：用于测试的样品的‘切片亮度’值。

从表3中可以看出，通过使用根据本发明的脂肪分解酶，当使用1mg脂肪分解酶每kg面粉时，切片亮度优于对照，并且也优于1％Soft’r Silk。

实例3

制备与实施例2同一的面包样品，除了使用国王米达斯特制面粉(King MidasSpecial flour)(美国丹佛阿登磨坊有限公司(Ardent Mills Corp.Denver,CO,US))代替Crousti面粉，并且添加600g水代替实例2中添加的570g水。此外，该试验不包括对照，但仅包含1％Soft’r Silk的基准。

表4：酶剂量

表5：面包体积数据

表6：用于测试的样品的‘切片亮度’值。

从表6中可以看出，通过使用根据本发明的脂肪分解酶，切片亮度优于1％Soft’rSilk(两者均以0.4和1.0mg脂肪分解酶每kg面粉)。

实例4

变体的构建

SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9按以下方式构建：对100个最同源的脂肪酶进行与SEQ ID NO:1的比对。基于比对，选择若干个位置，其中SEQ IDNO:1偏离其他脂肪酶的平均值。给定位置突变为在其他脂肪酶中发现最常见的氨基酸。设计了编码脂肪酶变体的四种合成基因，并且基因在米曲霉中表达。

SEQ ID NO:6(信号肽：1-20，与成熟序列中的SEQ ID NO:1相比有13个突变)：

SEQ ID NO:7(信号肽：1-20，与成熟序列中的SEQ ID NO:1相比有27个突变)：

SEQ ID NO:8(信号肽：1-20，与成熟序列中的SEQ ID NO:1相比有41个突变)：

SEQ ID NO:9(信号肽：1-20，与成熟序列中的SEQ ID 1相比有56个突变)：

实例5

用各种脂肪分解酶烘焙美国吐司

如实例2中所述制备面包。

将脂肪分解酶SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7以0.4、1和2mg酶蛋白(EP)/kg面粉的量添加到面团中。如实例4中所述生产脂肪分解酶。

测量面包体积和C-孔室参数‘切片亮度’。

获得以下结果-

表7：

从表7中可以看出，通过使用根据本发明的脂肪分解酶(SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7)，切片亮度高于对照，并且SEQ ID NO:7与1％Soft’r Silk几乎相同。

实例6

用各种脂肪分解酶烘焙美国吐司

如实例2中所述制备面包。

将脂肪分解酶SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9以0.4、1和2mg酶蛋白(EP)/kg面粉(SEQID NO:8)和0.4mg酶蛋白(EP)/kg面粉(SEQ ID NO:9)的量添加到面团中。如实例4中所述生产脂肪分解酶。

测量面包体积、HunterLab L值和C-孔室参数‘切片亮度’。

HunterLab是一种比色分光光度法，该方法使用光源照射样品，测量在不同波长下的光量。由样品反射的光传递到光栅，光栅将其分解成光谱成分。Hunter L a b色彩空间是3维矩形色彩空间，其中L(亮度)轴：0是黑色，并且100是白色。数值与你所看到的相关。

每个面包使用2片，并使用HunterLab测量每片一次。

获得以下结果-

表8：

从表8中可以看出，通过使用根据本发明的脂肪分解酶(SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9)，切片亮度和/HunterLab L值高于对照。总之，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9两者引入瓤白度。

实例7

没有异味的曲奇

使用表9的成分制备曲奇。

表9：曲奇成分

配方(g)	A	B	C
				Tegral Patacrout*(焙乐道，比利时)	400	400	400
鸡蛋	40	40	40
				黄油	160	160	160
Lipopan 50(诺维信公司)		0.04
				SEQ ID NO:1(mg EP)**			0.92

*含有小麦面粉、糖、小麦谷蛋白、膨松剂(二磷酸二钠)

**每400g Tegral Patacrout添加0.92mg(SEQ ID NO:1酶蛋白)

方法：

将成分在霍巴特(Hobart)混合器中以速度1共混2min。将面团包装在塑料薄膜中并在25℃下静置过夜。

第二天，将面团在2张烘焙纸之间滚出至2mm的厚度。切出直径为6.5cm的片。

将面团片在Miwe Condo烘箱中在180℃下烘焙11min。烘焙过程中没有添加蒸汽。

曲奇分析：

使用HS-SPME-GC-MS技术确定来自样品的挥发物。二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)纤维用于提取挥发性组分。

首先将样品在80℃下以250rpm的混合速度预热10min，并且然后在相同的混合速度下在80℃下进行提取30min。

GC/MS分析使用气相色谱仪安捷伦(Agilent)5890A进行，该仪器配备有具有三重轴检测器(Triple-Axis Detector)和被配置成用于自动SPME分析的自动采样器GerstelMPS的质谱仪5975C inert MSD。在RESTEK Stabilwax毛细管柱上进行分析物的分离，膜厚度为30m×0.25mm×0.50μm。柱烘箱程序如下：初始温度80℃持续10min，以16℃/min上升至220℃，在220℃保持8min。将1mL/min的恒定流速的氦用作承载气体。通过与NIST MS搜索2.0文库的质谱图比较鉴定挥发性化合物。

挥发性组分：丁酸、己酸、辛酸和癸酸，是强烈异味的原因。表8显示了丁酸、己酸、辛酸和癸酸的浓度。

表10：曲奇样品中鉴定的挥发性组分的相对浓度(峰面积)

	A	B	C
				丁酸	151,000,000	1191,000,000	243,000,000
己酸	398,000,000	2050,000,000	580,000,000
				辛酸	210,000,000	2650,000,000	200,000,000
癸酸	不可检测的	989,000,000	28,100,000

表10显示，与用根据本发明的脂肪分解酶制备的曲奇相比，用商业脂肪酶制备的曲奇具有更高含量的丁酸、己酸、辛酸和癸酸。

另外，受过训练的烘焙人员不能感觉到用根据本发明的酶制备的曲奇中的任何异味，但是他们可以感觉到用商业脂肪酶制备的曲奇中的强烈异味。

实例8

没有异味的奶油蛋卷

使用表11的成分制备奶油蛋卷。

表11：奶油蛋卷成分

*含有小麦面粉、水解的小麦谷蛋白、抗氧化剂(抗坏血酸)&酶。

**每1500g面粉添加3.47mg(SEQ ID NO:1酶蛋白)

方法：

使用以下方法：

将Diosna SP24中的不同成分以低速混合6min，并且以高速混合11min(仅在快速混合4min后添加脂肪)。最终面团温度为大约27℃。

在环境温度25℃下进行大量发酵10min。

按比例扩大至500g面团。

手动模制面包。

在25℃下进行20min的中间醒发时间。

使用R4.5和L16的Jac Unic模制。

在Koma发酵室中在28℃和95％RH下醒发165min。

在Miwe Condo烘箱中在200℃烘焙30分钟。

让奶油蛋卷冷却90分钟，并且将面包装在塑料袋中。

奶油蛋卷分析：

在奶油蛋卷上进行挥发物(与实例4中所述相同的挥发物)的分析。

表12显示了丁酸、己酸、辛酸和癸酸的浓度。

表12：奶油蛋卷中鉴定的挥发性组分的相对浓度(峰面积)

	D	E	F
				丁酸	69,700,000	74,800,000	65,400,000
己酸	101,000,000	513,000,000	187,000,000
				辛酸	93,800,000	625,000,000	151,000,000
癸酸	不可检测的	140,000,000	不可检测的

表12显示，与用根据本发明的脂肪分解酶制备的奶油蛋卷相比，用商业脂肪酶制备的奶油蛋卷具有更高含量的丁酸、己酸、辛酸和癸酸。

另外，受过训练的烘焙人员不能感觉到用根据本发明的酶制备的奶油蛋卷中的任何异味，但是他们可以感觉到用商业脂肪酶制备的奶油蛋卷中的强烈异味。

值得注意的是，用酶(E&F)制备的奶油蛋卷比仅含黄油的奶油蛋卷给出更精细的瓤(由受过训练的烘焙人员判断)。

实例9

用根据本发明的酶产生的面包

使用表13的成分制备面包。

表13：面包成分

*含有小麦面粉、抗氧化剂(抗坏血酸)&酶(淀粉酶，木聚糖酶)。

**每1500g面粉添加3.47mg(SEQ ID NO:1酶蛋白)

方法：

使用以下方法：

将Diosna SP24中的不同成分以低速混合2min，并且以高速混合7min。最终面团温度为大约26℃。

在环境温度25℃下进行大量发酵5min。

按比例扩大600g面团。

手动模制面包。

在25℃下进行15min的中间醒发时间。

使用R4.5和L15的Jac Unic模制。

在Koma发酵室中在35℃和95％RH下醒发110min。

在Miwe Condo烘箱中在220℃/230℃(上/下)烘焙25分钟。

让面包冷却120分钟，并且将面包装在塑料袋中。

面包质地测量：

对于硬度测量，使用来自稳定微系统公司(Stable Micro Systems)的TA.XT(A.XTPlus)。用直径25mm的探头以2mm/s的速度测量10次重复(不同的面包)，并且用进入面包瓤总厚度25％的力压缩。

硬度测量示于表14中。

表14：对面包样品进行硬度测量，在第2天测量

	G	H	I	J
					硬度(平均)(g)	211	161	200	195
stdev	21	14	12	15

结果显示，用根据本发明的酶制备的面包比参照显著更柔软。用商业脂肪酶制备的面包的柔软度与参照相似。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

焙乐道有限责任公司（Puratos NV）

<120> 用于在烘焙中使用的脂肪分解酶

<130> 14303-WO-PCT

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 309

<212> PRT

<213> 红聚颈腔菌（Valsaria rubricosa）

<400> 1

Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Pro Asp Asn Asn Asp Ser Pro Asp Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly

50 55 60

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Asp Thr Thr Ser Thr Val Thr Glu Phe

65 70 75 80

Glu Asn Ser Leu Glu Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Thr Asp Ser

85 90 95

Thr Arg Glu Leu Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Thr Ser Trp Thr Glu Ala

130 135 140

Arg Thr Gly Val Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala Ala Ala Asn Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Thr Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Val Ala Leu

180 185 190

Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asp Glu Thr Leu Ser Glu Tyr

195 200 205

Ile Thr Ala Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp

210 215 220

Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Leu Gly Tyr Arg His Ile Ser

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asp

245 250 255

Asp Val Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Ser Gly Asn Thr Gly

260 265 270

Asp Leu Thr Phe Asp Thr Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile

275 280 285

Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val

290 295 300

Glu Val Gln Trp Val

305

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 红聚颈腔菌（Valsaria rubricosa）

<400> 2

atgaagtccg cttcgatctt actcagggta gctgccctcc tcctccctgc tgtatctgca 60

ctgccacttg aaagaagagg tatggacgaa ctatcctagc gatcagtgtg tctattttgc 120

ctaacctagc aaagctatat ccgcggatct cctggcaacc ttcagcctct tcgagcagtt 180

cgcagccgca gcatattgtc cggataacaa cgacagtccc gacaccaagc ttacttgctc 240

tgtcggaaac tgcccgcttg tcgaagctga cacgaccagc acggtcactg aattcgaaaa 300

gtacatctta cacgaccccg ttcacctaca gacaaagtcc cagctaacgt ccacctctat 360

ctctgtccct ttagctcgct cgaaaccgac gtcactggct acgtcgcgac tgacagcaca 420

cgagagctca tcgttgtggc attccgcggg agttcctcga tccggaactg gatcgccgac 480

atcgactttc ccttcaccga caccgacctc tgcgatggct gccaggcagc ctcgggcttc 540

tggacgtcct ggacggaggc acggacaggg gtgctggcgg cggtggcgag cgctgccgcg 600

gccaacccgt cctataccgt tgccgtgacg ggccacagcc tcggcggggc cgtggccgcg 660

ctggccgctg gcgccctccg gaacgcgggc tacacggtcg cgctatacag cttcggagcg 720

cctcgcgtgg gtgacgagac cctcagcgag tacatcactg cgcaggcggg tggaaactac 780

cgcatcacgc acctcaacga cccagtgccg aagctgcccc cgctgctcct ggggtatcgc 840

cacatcagcc cggaatacta catcagcagc gggaacaacg tgaccgtgac ggcggatgac 900

gtggaggagt acaccggcac gatcaacctg agtgggaaca cgggcgatct gacgttcgac 960

acggatgcgc acagttggta cttcaacgag atcggggcat gcgatgatgg tgaggctttg 1020

gagtggaaga agcggggggt agaagttcag tgggtttaa 1059

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

acacaactgg ggatccacca tgaagtccgc ttcgatctta ctcagg 46

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

agatctcgag aagcttaaac ccactgaact tctacccccc 40

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 催化区段

<400> 5

Gly His Ser Leu Gly

1 5

<210> 6

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Asp Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly

50 55 60

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Thr Thr Ser Thr Val Thr Glu Phe

65 70 75 80

Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser

85 90 95

Thr Arg Glu Leu Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Thr Glu Ala

130 135 140

Arg Thr Gly Val Thr Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala Ala Gln Asn Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Ala Leu

180 185 190

Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr

195 200 205

Ile Thr Ala Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp

210 215 220

Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Leu Gly Tyr Arg His Ile Ser

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn

245 250 255

Asp Val Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Ser Gly Asn Thr Gly

260 265 270

Asp Leu Thr Phe Asp Thr Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile

275 280 285

Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val

290 295 300

Glu Val Gln Trp Val

305

<210> 7

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly

50 55 60

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Thr Thr Asn Thr Val Thr Glu Phe

65 70 75 80

Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser

85 90 95

Thr Asn Glu Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Thr Glu Ala

130 135 140

Arg Thr Thr Val Thr Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Ala Gln Asn Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu

180 185 190

Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp

210 215 220

Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Arg His Ile Ser

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn

245 250 255

Asp Val Gln Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Gln Gly Asn Thr Gly

260 265 270

Asp Leu Thr Phe Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile

275 280 285

Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val

290 295 300

Glu Val Gln Trp Val

305

<210> 8

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu

20 25 30

Leu Ala Thr Phe Gln Phe Phe Glu Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly

50 55 60

Asn Cys Pro Leu Val Gln Ala Ala Thr Thr Asn Thr Val Tyr Glu Phe

65 70 75 80

Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser

85 90 95

Thr Asn Lys Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Leu Glu Ala

130 135 140

Arg Thr Thr Val Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Arg Ala Gln Asn Pro

145 150 155 160

Asp Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Ala Gly Asp Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu

180 185 190

Tyr Thr Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Trp Asn Asp

210 215 220

Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Val His Ile Ser

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn

245 250 255

Asp Val Gln Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Gln Gly Asn Thr Gly

260 265 270

Asp Leu Thr Phe Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile

275 280 285

Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val

290 295 300

Glu Val Gln Trp Val

305

<210> 9

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu

20 25 30

Leu Asp Thr Phe Gln Phe Phe Glu Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly

50 55 60

Asn Cys Pro Leu Val Gln Ala Ala Asp Thr Asn Thr Val Tyr Glu Phe

65 70 75 80

Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp His

85 90 95

Thr Asn Lys Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Leu Glu Ala

130 135 140

Arg Asp Thr Val Thr Pro Ala Val Tyr Gln Ala Arg Ala Gln Lys Pro

145 150 155 160

Asp Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Ala Gly Asp Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu

180 185 190

Tyr Thr Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Tyr

195 200 205

Ile Thr Asn Gln Pro Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His Trp Asn Asp

210 215 220

Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Val His Ile Ser

225 230 235 240

Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Pro Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn

245 250 255

Asp Val Gln Val Tyr Glu Gly Val Ile Asn Leu Gln Gly Asn Glu Gly

260 265 270

Asp Leu Thr Thr Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile

275 280 285

Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val

290 295 300

Glu Val Gln Trp Val

305

Claims

1.一种多肽，该多肽具有脂肪分解酶活性，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有脂肪分解酶活性。

2.根据权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸21至309具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

3.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列G-H-S-L-G的催化区段。

4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽具有脂肪酶和磷脂酶活性。

5.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码根据权利要求1-4中任一项所述的多肽。

6.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求5所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

7.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据权利要求5所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

8.一种产生根据权利要求1-4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有益于该多肽的产生的条件下培养根据权利要求7所述的宿主细胞。

9.一种颗粒或稳定化液体，该颗粒或稳定化液体包含根据权利要求1-4中任一项所述的多肽。

10.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的脂肪分解酶和一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：氨肽酶、淀粉酶、α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳聚糖酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷质脂肪酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中该一种或多种酶选自下组，该组由以下组成：产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、和葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶。

12.一种用于制备烘焙产品的方法，该方法包括在烘焙之前将根据权利要求1-4中所述的脂肪分解酶、根据权利要求9所述的颗粒或稳定化液体或根据权利要求10-11中所述的组合物添加到面团中的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中该脂肪分解酶的量为在面团或面糊中在0.01和100mg之间，优选地在0.05和50mg之间，更优选地在0.1和25mg之间，甚至更优选地在0.1和15mg酶蛋白每kg面粉之间。

14.根据权利要求1-4中所述的脂肪分解酶、根据权利要求9所述的颗粒或稳定化液体或根据权利要求10-11中所述的组合物在烘焙和/或糕点应用中的用途。

15.根据权利要求14所述的在面包改进剂和/或在糕点混合物或预混物中的用途。