CN1969041B - 用于生产多肽的信号肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括使用信号肽生产多肽的方法，涉及含有编码信号肽的第一核苷酸序列和相对于第一核苷酸序列是外源的编码多肽的第二核苷酸序列。另外，还涉及含有所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。
Description
发明领域
本发明涉及生产多肽的方法，包括使用相对于该多肽为外源的信号肽，含有编码该信号肽和该多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸构建体和含有所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。
发明背景
在真菌宿主细胞，特别是诸如曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌细胞或诸如酵母属(Saccharomyces)的酵母细胞中重组生产异源蛋白可提供更合适的载体用于以商品相应量生产该蛋白。
重组生产异源性蛋白一般通过构建表达盒实现，其中将编码该蛋白的DNA置于从适合于该宿主细胞的调控基因切下的启动子表达控制下。将该表达盒导入宿主细胞中。然后通过在表达盒所含的启动子正常发挥功能所必需的诱导条件下培养转化的宿主细胞实现该异源蛋白的生产。
改进蛋白质的重组生产一般需要获得适合于控制蛋白质在宿主细胞中表达的新调控序列。
本发明的目的是使用信号肽序列提供在真菌宿主细胞中生产多肽的改进方法。
本发明的概述
本发明提供了生产分泌多肽的方法，包括：
(a) 在有助于多肽生产的培养基中培养真菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码该多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码信号肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相对于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列选自如下组成的组中：
(i)编码具有与SEQ ID NO：1有至少70％同一性的氨基酸序列的信号肽的核苷酸序列；
(ii) 与SEQ ID NO：2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和
(iii) 在严格条件下与SEQ ID NO：2的核苷酸，或其互补链杂交的核苷酸序列，其中严格条件定义为在低于计算的Tm 5℃至10℃的0.9 M NaCl，0.09 MTris-HClpH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，和每ml0.2mg酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，并在低于计算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗涤15分钟一次，使用6XSSC洗涤两次各15分钟；和
(b) 从培养基中分离分泌的多肽。
另外，本发明提供了含有与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码信号肽的第一核苷酸序列的核酸构建体，其中第一核苷酸序列相对于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列选自如下组成的组中：
(i)编码具有与SEQ ID NO：1有至少70％同一性的氨基酸序列的信号肽的核苷酸序列；
(ii)与SEQ ID NO：2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和
(iii)在严格条件下与SEQIDNO：2的核苷酸，或其互补链杂交的核苷酸序列，其中严格条件定义为预杂交，杂交，和杂交后洗涤，其是在低于计算的Tm5℃至10℃的0.9 MNaCl，0.09 MTris-HClpH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40.1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mMATP，和每ml0.2mg酵母RNA中进行，并在加0.1％SDS的6X SCC中洗涤15分钟一次和使用6XSSC洗涤两次各15分钟，其是在低于计算的Tm5℃至10℃下进行。
本发明还提供了含有所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。
本发明的详细描述
定义
术语“ 变异体”当用于与另一多肽或核苷酸序列对照时在本发明的上下文中应理解为与另一多肽相比包含一个或多个氨基酸或核苷酸的取代，缺失，和/或插入的多肽或核苷酸序列(即，它是与其比较的多肽/核苷酸序列的变异体)。具体地说，该改变可以属于次要性质，例如不会明显影响多肽活性的保守氨基酸取代或导致保守氨基酸取代的核苷酸序列改变；或者依赖于发生该改变的多肽大小，一般1到大约20个氨基酸的小缺失。
保守取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的且参见，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York。最常见的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交换。
本发明的方法
本发明涉及生产分泌多肽的方法，包括：(a)在有助于多肽生产的培养基中培养真菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码该多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码信号肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列相对于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列选自如下组成的组中：(i)编码具有与SEQ ID NO：1有至少70％同一性的氨基酸序列的信号肽的核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NO：2具有至少70％同源性的核苷酸序列；和(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：2的核苷酸，或其互补链杂交的核苷酸序列，其中严格条件定义为在低于计算的Tm 5℃至10℃的0.9 M NaCl，0.09 M Tris-HClpH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，和每ml0.2mg酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤，并在低于计算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗涤15分钟一次和使用6XSSC洗涤两次各15分钟；和(b)从培养基中分离分泌的多肽。
在本发明的方法中，真菌宿主细胞在有助于生产该多肽的培养基，即，在适合于使用本领域已知的方法生产该多肽的营养培养基中培养。例如，可通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批，或固态发酵)来培养该细胞。培养可在包含碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法进行。合适的培养基可从商品供应商获得或者可根据公开的配方(例如，参见美国典型培养物保藏中心的产品目录)制备。
使用对该多肽具有特异性的本领域已知的方法可检测该多肽。该检测方法可包括使用特异性抗体，酶产物的形成，或酶底物的消失。
在本发明的方法中，该真菌宿主细胞相对于含有与编码该多肽的核苷酸序列可操作地相连的天然信号肽序列的真菌细胞在相同生产条件下培养时生产具体地说多至少大约25％，更具体地说多至少大约50％，更具体地说多至少大约75％，更具体地说多至少大约100％，甚至更具体地说多至少大约200％，最具体地说多至少大约300％，且甚至最具体地说多至少大约400％的多肽。
所得的分泌多肽可通过本领域已知的方法从培养基中直接回收。例如，该多肽可通过包括，但不限于，离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发，或沉淀的常规方法从营养培养基中回收。
该多肽可通过本领域已知的各种方法纯化，包括，但不限于，色谱法(例如，离子交换，亲和，疏水，色谱聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989)。
信号肽
本发明的第一核苷酸序列编码本发明的信号肽。术语“信号肽”或“信号肽序列”在此定义为通常存在于新合成的分泌型或膜多肽N-末端的肽序列，它指导该多肽通过或者进入该细胞的细胞膜(原核生物的质膜和真核生物的内质网膜)。它通常在随后被去掉。具体地说，该信号肽能够指导该多肽进入细胞的分泌途径。
术语“ 可操作地相连”在此定义为这样一种结构，即其中调控序列，例如信号肽序列，相对于编码序列放在合适的位置上，使得该调控序列指导生产由该编码序列编码的多肽。
术语“编码序列”在此定义为当放在合适的调控序列控制下时翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界一般由位于阅读框开始(5’端)的起始密码子和位于阅读框3’端的终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于，基因组DNA，cDNA，RNA，半合成，合成，和重组核苷酸序列。
本发明的多肽的编码序列5’端可含有与编码该多肽的成熟(或前体形式)的核苷酸序列片断天然相连的编码信号肽的天然核苷酸序列。在这种情 况下本发明的信号肽可取代该天然信号肽。作为选择，本发明的多肽可没有天然信号肽。在本文中，术语“天然”试图理解为天然存在。
在本发明的方法中，该信号肽相对于编码目的多肽的核苷酸序列是外源的，但是该信号肽序列或核苷酸序列相对于该真菌宿主细胞可以是天然的。在本文中，术语“外源”试图理解为该信号肽相对于该多肽不是天然的，即，它来源于异于该多肽的另一基因。
在一个实施方案中，第一核苷酸序列编码具有与SEQ ID NO：1有至少70％，具体地说至少大约75％，更具体地说至少大约80％，更具体地说至少大约85％，甚至更具体地说至少大约90％，最具体地说至少大约95％，且甚至最具体地说至少大约97％同一性的氨基酸序列的信号肽，它具有指导多肽进入或通过细胞膜，例如进入细胞的分泌途径的能力(下文称为“同源信号肽”)。在一个具体方面中，该同源信号肽具有与SEQ ID NO：1有5个氨基酸，具体地说4个氨基酸，更具体地说3个氨基酸，甚至更具体地说2个氨基酸，且最具体地说1个氨基酸的差别的氨基酸序列。为达到本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性或同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表(identity table)和下列多序列对比参数：缺口罚分(gap penalty)为10和缺口长度罚分(gap length penalty)为10来确定。逐对序列对比参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5，且对角线(diagonals)＝5。
具体地说，第一核苷酸序列可编码信号肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其等位变异体；或其具有指导该多肽进入或通过细胞膜，例如，进入细胞分泌途径的能力的片断。在更具体的一个方面中，本发明的第一核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的信号肽。在另一具体的方面，第一核苷酸序列编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片断组成的信号肽，其中该信号肽片断具有指导多肽进入或通过细胞膜，例如，进入细胞分泌途径的能力。在另一更具体的方面中，本发明的核苷酸序列编码由SEQID NO：1的氨基酸序列组成的信号肽。
本发明还包含这样的第一核苷酸序列，它编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的信号肽，且它由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO：2。本发明还涉及编码具有指导多肽进入或通过细胞膜，例如，进入细胞分泌途径的能力的SEQ ID NO：1的片断的SEQ ID NO：2的子序列或片断。
SEQ ID NO：2的子序列是SEQ ID NO：2包含的核酸序列，除了从5’和/或3’端删除了一个或多个核苷酸。具体地说，子序列含有至少30个核苷酸，例如至少35个核苷酸或至少40个核苷酸或至少45个核苷酸或至少50个核苷酸或至少52个核苷酸或至少53个核苷酸。SEQ ID NO：1的片断是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或多个氨基酸的多肽。具体地说，一个片断含有至少10个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基或至少13个氨基酸残基或至少14个氨基酸残基或至少15个氨基酸残基或至少16个氨基酸残基或至少17个氨基酸残基。具体地说，如果第一和第二核苷酸序列在酵母宿主细胞中表达时，该信号肽可含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基l-16，因为本发明的发明人观察到在酵母中该信号肽在氨基酸残基16和17之间被切割(在AA↓LP)，而如果该宿主细胞是丝状真菌，该信号肽具体可包含SEQ IDNO：1的18个氨基酸残基，因为本发明的发明人观察到在米曲霉(Aspergillusoryzae)中该信号肽的切割发生在SEQ ID NO：1的氨基酸残基18后。这表明在酵母和丝状真菌之间，被识别为信号序列切割的切割位点的序列可能不同。
等位基因变异体表示占据相同染色体基因座的基因的两种或多种任选形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的信号肽中无改变)或者可编码有氨基酸序列改变的信号肽。信号肽的等位基因变异体是由基因的等位基因变异体编码的肽。
在一个具体方面，第一核苷酸序列是Humicola insolens DSM 1800中所含的角质酶(cutinase)基因的信号肽编码序列(SEQ ID NO：1)。
在第二个方面，编码信号肽的本发明的第一核苷酸序列与SEQ ID NO：2具有至少大约70％的同源性程度，具体地说至少大约75％，更具体地说至少大约80％，更具体地说至少大约85％，甚至更具体地说至少大约90％的同源性，最具体地说至少大约95％的同源性，且甚至最具体地说至少大约97％的同源性，其编码信号肽；或等位基因变异体和编码具有指导多肽进入或通过细胞膜，例如，进入细胞分泌途径的能力的信号肽片断的SEQ IDNO：2的子序列。为了达到本发明的目的，两个核酸序列之间的同源性程度可通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of theNational Academy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表和下列多序 列对比参数：缺口罚分为10且缺口长度罚分为10来测定。逐对序列对比参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，且窗口＝20。
在第三个方面，本发明的第一核苷酸序列编码信号肽，其中所述的第一核苷酸序列在严格条件下与SEQ ID NO：2，或其互补链的核苷酸杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，纽约冷泉港)。
SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片断可用于设计核酸探针以便根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码信号肽的DNA。具体地说，该探针可用于按标准Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。该探针可以比完整序列短很多，但可以具体地说长至少15，例如至少25，或更具体地说至少35个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。一般可标记该探针用于检测相应的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。本发明包含该探针。
因此，可筛选从其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中与上述探针杂交且编码信号肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离其它生物的基因组或其它DNA。文库DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ IDNO：2或其子序列同源的克隆或DNA，该载体材料可用于Southern印迹。为了达到本发明的目的，杂交表示该核酸序列在本文定义的严格条件下与相应于SEQ ID NO：2所示的核酸序列，其互补链，或其子序列的标记核酸探针杂交。使用X-射线胶片可检测在这些条件下核酸探针与其杂交的分子。
在一个具体的方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO：1的信号肽，或其子序列的核苷酸序列。在另一具体的方面，该核酸探针是SEQ ID NO：2。在另一具体方面，该核酸探针是Humicola insolens DSM 1800所含的角质酶基因的信号肽序列(WO96/13580中的SEQ ID NO：2)。
对于长度大约15个核苷酸到大约60个核苷酸的短探针，严格条件定义为：按照标准Southern印迹方法，在低于根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 48：1390)的算法计算的Tm5℃至10℃下，在0.9 MNaCl，0.09 MTris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40.1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中进行预杂交，杂交，和杂交后洗涤。
对于长度为大约15个核苷酸到大约60个核苷酸的短探针，该载体材料在低于计算的Tm5℃至10℃下，在加0.1％SDS的6XSCC中洗涤15分钟一次并使用6XSSC洗涤两次各15分钟。
在第四方面，第一核苷酸序列可编码包含一个或多个氨基酸的取代，缺失，和/或插入的具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的信号肽的变异体。
该变异体信号肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列区别可在于一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或用不同氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。具体地说，氨基酸改变可以属于次要性质，例如不会明显影响信号肽活性的保守氨基酸取代；或者一般1到大约5个氨基酸的小缺失。
保守取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的且参见，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York。最常见的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly及其反向交换。
多肽
本发明的第二核苷酸序列编码本发明编码的多肽。所述的多肽相对于生产它的真菌宿主细胞可以是天然的或异源的。
术语“ 多肽”本文不是指特定长度的编码产物，因此，它包含肽，寡肽，和蛋白质。术语“异源多肽”在此定义为不是该真菌细胞天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然多肽，或由于通过重组DNA技术改造编码该多肽的基因而定量改变其表达的天然多肽。真菌细胞可含有一个或多个拷贝的编码该多肽的核苷酸序列。
具体地说，该多肽可以是激素或激素变异体，酶，受体或其部分，抗体或其部分，过敏原或报道分子。在一个具体方面，该多肽可以是来自Dermatophagoides pteronyssinus ，Dermatophagoides farinae，Dermatophagoides siboney，Dermatophagoidesmicroceaus，Blomiatropicalis和Euroglyphus maynei的过敏原，或后来被修饰的一种所述生物的过敏原。
更具体地说，所述过敏原可以是Der p 1，例如，来自Dermantophagoidespteronyssinus的Der p 1(SEQ ID NO：3)。具体地说，该多肽可以是SEQ ID NO：3中氨基酸19-320的序列。在一个更具体的实施方案中，该多肽可以是SEQID NO：3的氨基酸19-320的多肽序列的变异体。更具体地说，该变异体可以是S54X或N52X，其中“X”表示任何氨基酸，如所述的破坏Der p 1的N-糖基化位点，具体地说该变异体可以是S54N或N52Q。然而，Der p 1的其它变异体是可预料得到的。
在另一具体实施方案中，该多肽可以是酶，例如，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，或连接酶。在一个更具体的方面，该多肽可以是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，纤维二糖水解酶，几丁质酶，角质酶，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，内切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，变位酶(mutanase)，氧化酶，果胶降解酶，过氧化物酶，磷脂酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶，或β-木糖苷酶。有关纤维素酶的例子包括但不限于来自Mucor cicinellides，例如，M.cicinellidesIFO4554的纤维素酶(SEQ ID NO：4)。有关蛋白水解酶的例子包括但不限于半胱氨酸蛋白酶，例如，来自白车轴草(Trifolium repens L)的半胱氨酸蛋白酶5(SEQ ID NO：5)，特别是编码成熟肽的SEQ ID NO：5的氨基酸109-327，或胰蛋白酶，例如来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporium)的胰蛋白酶(SEQ IDNO：7)。有关植酸酶的例子包括但不限于来自Peniophora lycii，例如，P.lyciiCBS 686.96的植酸酶(SEQ ID NO：9)。
编码本发明的多肽的第二核苷酸序列可从任何原核生物，真核生物，或其它来源获得。为了达到本发明的目的，本文与给定来源相联系使用的术语“从...获得”是指该多肽由该来源产生或者由插入了该来源的基因的细胞产生。
用于分离或克隆编码目的多肽的核苷酸序列的技术是本领域熟知的且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。通过例如，使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)可实现从该基因组DNA克隆第二核苷酸序列。参见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。克隆方法可包括切出和分离含有编码该多肽的核苷酸序列的所需核苷酸片断，将该片断插入载体分子中，并将重组载体 纳入突变型真菌细胞中，其中可复制多个拷贝或克隆的该核苷酸序列。第二核苷酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成，合成来源，或其任意组合。
在本发明的方法中，该多肽也可以是融合或杂合多肽，其中另一多肽融合在该多肽或其片断的N-末端或C-末端。融合多肽通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到编码本发明的多肽的第二核苷酸序列(或其部分)上来产生。产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括，连接编码这些多肽的编码序列，使得它们共阅读框且该融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。杂合多肽可包括从至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种多肽对于突变型真菌细胞可以是异源的。
核酸构建体
本发明还涉及含有与编码本发明的多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码本发明的信号肽的第一核苷酸序列的核酸构建体。
“ 核酸构建体”在此定义为单链或双链的核苷酸分子，它从天然存在的基因分离或者被修饰成含有以在天然情况下不存在的方式组合和并列的核酸片断。当核酸构建体含有编码序列和表达该编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。
编码多肽的第二核苷酸序列还可以用各种方法进行操作以提供该多肽的表达。在该核苷酸序列插入载体前对其改造可能是期望的或必需的，取决于该表达载体。使用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
在本发明的方法中，该核酸构建体包含一种或多种天然调控序列或者用对于该核酸构建体的第一和/或第二核苷酸序列为外源的一种或多种调控序列取代一种或多种天然调控序列以提高编码多肽的第二核苷酸序列在宿主细胞中的表达。
术语“调控序列”在此定义为包括表达第二核苷酸序列编码的多肽必需或有利的所有元件。各调控序列相对于编码该多肽的第二核苷酸序列可以是天然的或外源的。该调控序列包括，但不限于，前导序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，本发明的信号肽序列，和转录终止子。在最少的情况下，该调控序列包括本发明的信号肽序列，和转录和翻译终止信号。调控序列 备有接头用于导入有利于将该调控序列与编码该多肽的第二核苷酸序列连接的特定限制性位点。
调控序列可以是被宿主细胞识别以表达该核苷酸序列的合适启动子序列。该启动子序列含有介导该多肽表达的转录调控序列。该启动子可以是在选定宿主细胞中表现出转录活性的任何序列，包括突变的，截短的和杂合的启动子，且可从与该宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的例子是从米曲霉TAKA淀粉酶，米赫毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米赫毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶，构巢曲霉乙酰胺酶，Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，Trichodermareesei纤维二糖水解酶I，Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II，Trichodermareesei内切葡聚糖酶I，Trichoderma reesei内切葡聚糖酶II，Trichoderma reesei内切葡聚糖酶III，Trichoderma reesei内切葡聚糖酶IV，Trichoderma reesei内切葡聚糖酶V，Trichoderma reesei木聚糖酶I，Trichoderma reesei木聚糖酶II和Trichoderma reeseiβ-木糖苷酶的基因获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；或其突变型，截短型，和杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子包括但不限于从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)，酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)，酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)，和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的那些启动子。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子参见Romanos等，1992，Yeast 8：423-488的描述。
调控序列可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。该终止子序列可操作地连接到编码该多肽的核苷酸序列的3′端。在选定宿主细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的合适终止子的例子包括但不限于从米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的那些终止子。
用于酵母宿主细胞的合适终止子的例子包括但不限于从酿酒酵母烯醇化酶，酿酒酵母细胞色素C(CYC1)，和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的那些终止子。用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子参见Romanos等，1992，出处同上的描述。
该调控序列也可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导序列一般可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的5′端。在选定宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的前导序列的例子包括但不限于从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的那些前导序列。
用于酵母宿主细胞的合适的前导序列包括但不限于从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶，酿酒酵母α-因子，和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的那些前导序列。
该调控序列也可以是多聚腺苷化序列，它与编码多肽的核苷酸序列的3′端可操作地连接且转录时作为给转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号被宿主细胞识别。在选定宿主细胞中起作用的任何多聚腺苷化序列都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的合适多聚腺苷化序列的例子包括但不限于从米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的那些多聚腺苷化序列。
用于酵母宿主细胞的有用多聚腺苷化序列包括但不限于Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990所述的那些序列。
调控序列也可以是编码位于多肽氨基末端的一个氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原一般无活性，而且通过从多肽原催化或自体催化切割前肽，多肽原可以转变为成熟的活性多肽。前肽编码区的例子包括但不限于可从Dermantophagoides pteronyssinus Der p 1的基因，或者从Dermantophagoides获得的其它基因，尖孢镰孢胰蛋白酶，酿酒酵母α-因子，米赫毛霉天冬氨酸蛋白酶，和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)的基因获得的那些前肽。
如果信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端，则该前肽区紧接着多肽的氨基末端且信号肽区紧接着该前肽区的氨基末端。如果存在前肽，则 在一个实施方案中在前肽和成熟多肽之间可存在一个切割位点。术语“切割位点”应理解为被能够在该位点切割该多肽的蛋白水解酶识别的氨基酸序列。该位点的例子包括kex-位点，特别是kex-II位点。
也可能需要添加允许调节与宿主细胞生长相关的多肽表达的调节序列。调节系统的例子是与化学或物理刺激，包括调控化合物的存在反应引起基因表达打开或关闭的那些系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子，和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它例子是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，它们包括在氨甲蝶呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因，和重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的核苷酸序列可与该调控序列可操作地相连。
表达载体
本发明还涉及含有本发明的核酸构建体的重组表达载体。除了包含分别编码本发明的信号肽和多肽的第一和第二核苷酸序列外，所述的表达载体可具体包含转录和翻译终止信号。上述各种核苷酸和调控序列可连接起来以产生重组表达载体，它可包括一个或多个方便的限制性位点以允许在该位点插入或取代该启动子和/或编码该多肽的核苷酸序列。作为选择，该核酸构建体可插入合适的载体以表达由第二核苷酸序列编码的多肽。在构建的表达载体中，编码本发明多肽的第二核苷酸序列位于该载体中以便所述的序列与本发明的信号肽序列和一个或多个合适的表达调控序列可操作地相连。
重组表达载体可以是可按常规进行重组DNA操作且可导致该核苷酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择一般依赖于载体与该载体所导入的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合环状质粒。
本发明的载体可具体含有允许转化细胞容易选择的一个或多个可选择的标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性，重金属抗性，营养缺陷型原养化等的基因。酵母宿主细胞的合适标记包括，但不限于，ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸盐还原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺苷酰转移酶)，trpC(邻氨基苯甲 酸合酶)，及其等同物。具体用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
该载体可以是自主复制型载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒，染色体外因子，微型染色体，或人工染色体。该载体可含有保证自我复制的任何工具。作为选择，该载体可以是在导入宿主细胞时整合进基因组并与其整合进的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或一起含有需要导入宿主细胞基因组的总DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体可具体含有允许该载体稳定整合进宿主细胞基因组或该载体在细胞中不依赖于基因组自主复制的元件。
为了整合进宿主细胞基因组，该载体可依靠编码该多肽的第二核苷酸序列或该载体的任何其它元件来通过同源或非同源重组将该载体稳定整合进基因组的。作为选择，该载体可含有指导通过同源重组整合进宿主细胞基因组的额外核苷酸序列。该额外核苷酸序列可使得该载体能够在染色体的精确位置整合进宿主细胞基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，该整合元件应具体包含与相应靶序列高度同源的足够数量的核苷酸，例如100至1,500个碱基对，优选400到1,500个碱基对，且最优选800到 1,500个碱基对以提高同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。在另一方面，该载体可通过非同源重组整合进宿主细胞基因组。
对于自主复制，该载体可进一步包含使得该载体在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”本文定义为使得质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。
用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4与CEN6的组合。复制起点可以是具有突变使其在宿主细胞中起作用的能力具有温度敏感性的复制起点(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433)。
用于丝状真菌宿主细胞的复制起点的例子是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research15：9163-9175；
WO00/24883)。AMA1基因的分离和含有该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883公开的方法完成。
可将超过1拷贝的编码多肽的核苷酸序列插入宿主细胞中以增加该基因产物的产量。核苷酸序列拷贝数的增加可以这样实现：将至少一个额外拷贝的序列整合进宿主细胞基因组；或者通过将该核苷酸序列与可扩增的选择标记基因包含在一起，通过在合适的选择剂存下下培养细胞，可以选择含有扩增拷贝的选择标记基因，从而也就含有增加拷贝的该核苷酸序列的细胞，。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，出处同上)。
宿主细胞
本发明涉及在真菌宿主细胞中生产多肽的方法和含有本发明的核酸构建体的重组宿主细胞。
将含有与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码本发明的信号肽的第一核苷酸序列的载体导入真菌宿主细胞使得该载体如前所述作为染色体整合体或者作为自我复制型染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包含由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是用于本发明方法的任何真菌细胞。本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Acomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(由Hawksworth等定义，参见，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌门(Oomycota)(参见Hawksworth等，1995，出处同上，第171页)或所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出处同上)。
在一个具体方面，该真菌宿主细胞是酵母细胞。本文使用的“酵母”包括包括产子囊(ascosporogenous)酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于不完全真菌(Fungi Imperfecti)的酵母(芽生菌纲Blastomycetes)。由于酵母的分类在今后可能改变，为了本发明的目的，酵母将定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980)中所述。
在一个更具体的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，毕赤氏酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia属细胞。
在一个最具体的方面，酵母宿主细胞是卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母例如S. cerevisiae YNG318、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺第酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)或Yarrowia lipolytica细胞。
在另一具体方面，该真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚门(定义参见Hawksworth等，1995，出处同上)的所有丝状类型。丝状真菌的特征在于菌丝壁由几丁质，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，甘露聚糖，和其它复合多糖组成。无性生长是通过菌丝伸长且碳代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母的酵母无性生长是通过单细胞菌体出芽，且碳代谢可以是发酵性的。
在一个更具体的方面，丝状真菌宿主细胞是，但不限于是，支顶孢属(Acremonium)，曲霉属，镰孢属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，毛霉属(Mucor)，毁丝霉属(Myceliophthora)，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属，Thielavia，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)。
在甚至更具体的一个方面，该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉或米曲霉细胞。在一个更具体的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporium)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在另一个更具体的方面，丝状真 菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Magnaporthe grisea、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一个最具体的方面，该Fusarium venenatum细胞是FusariumvenenatumA3/5，它最初作为Fusarium graminearum ATCC20334保藏，且最近由Yoder和Christianson，1998，Fungal Genetics and Biology 23：62-80和O′Donnell等，1998，Fungal Genetics and Biology 23：57-67重新分类为Fusarium venenatum；以及Fusarium venenatum的分类学等同物，不管它们目前已知为何种名。在另一具体方面，该Fusarium venenatum细胞是如WO97/26330中公开的Fusarium venenatumA3/5或Fusarium venenatumATCC20334的形态学突变体。
在另一最具体的方面，该木霉属细胞是Trichoderma reeseiATCC56765，Trichoderma reeseiATCC 13631，Trichoderma reeseiCBS 526.94，Trichoderma reeseiCBS 529.94，Trichoderma longibrachiatumCBS 528.94，Trichoderma longibrachiarum ATCC 2106，Trichoderma longibrachiatumCBS592.94，绿色木霉NRRL 3652，绿色木霉CBS 517.94，或绿色木霉NIBHFERM / BP 447。
真菌细胞可以通过包含原生质体形成，原生质体转化和细胞壁再生的方法转化，方式本身是已知的。用于曲霉属宿主细胞转化的合适方法在EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings ofthe National Academy of SciencesUSA81：1470-1474中描述。用于转化Trichoderma reesei宿主细胞的合适方法在Penttila等，1987，Gene 61：155-164，和Gruber等，1990，Curr Genet.18(1)：71-6中描述。用于转化镰孢菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78：147-156和WO96/00787描述。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，第182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920所述的方法转化。
材料和方法
菌株和质粒
菌株
大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。
酿酒酵母YNG318：MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539在J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)中描述。
质粒
所有酵母表达载体都是从WO00/10038所述的pJC039构建的，在TPI启动子控制下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体。
基因
Der p 1来自Dermatophagoides pteronyssinus：NCBI登录号：P08176，氨基酸序列在SEQ ID NO：3中显示。
来自白车轴草(Trifoliumrepens L)的半胱氨酸蛋白酶基因是以EMBL：AY192363登录的序列。
α-因子(酵母接合所需的信息素)基因是来自Invitrogen的商业上可获得的pPICZαA载体中的序列。
来自尖孢镰孢的胰蛋白酶基因是以EMBL：S63827登录的序列，其cDNA序列在SEQ ID NO：6中显示。
来自Peniophora lycii菌株CBS 686.96的植酸酶基因是以EMBL：PLY310696登录的序列且其cDNA序列在SEQ ID NO：8中显示。
引物
对于卷枝毛霉(Mucor circinellides)纤维素酶的表达
对于cDNA克隆：
MCE-BC1F(44mer)：
5’-CAACTGGTGATCACCACCATGAAGTTCACCGTTGCTATTACTTC-3’
MCE-NruR(39mer)：
5’-TCTCGAGCTCGCGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCGAG-3’
对于酵母载体构建：
M61F(50mer)：
5’-CCAGCTTCCGCAAACAAAGTCGCCAACATGAAGTTCACCGTTGCTATTAC-3’
M61CutisigF(50mer)：
5’-CGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCGCCGCTTCTTGCAGCTCTGTCTATG-3’
C-term R61R(49mer)：
5’-TAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTACTTTCTTTCGCAACCTGAGCG-3’
对于白车轴草半胱氨酸蛋白酶的表达
α-信号-MunI(49mer)：
5’-ATAAACGACGGGACCCGGGGATCCAATTGATGAGATTCCCATCAATTTT-3’
α-信号-CysProR(42mer)：
5’-GCCCACGATGGAGAAATCGCGAGCTTCAGCTTCTCTTTTCTC-3’
α-信号-CysProF(42mer)：
5’-GAAAAAAGAGAAGCTGAAGCTCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3’
Spe-CysProR(50mer)：
5’-ACTAATTACATGATGCGGCCCACTAGTTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3’
Cuti-Sig-CysPro(50mer)：
5’-GCACCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCGCGATTTCTCCATCGTGGGC-3’
CysPro C-term(50mer)：
5’-TAATTACATGATGCGGCCCGCGGCCGCTCATTTCTTCTTAGTAGGATAAG-3’
对干镰孢胰蛋白酶的表达
酵母-F(43mer)：
5’-ACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTCAAGTTCGCTTCC-
酵母-R(43mer)：
5’-AACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAAGCATAGGTGTC-3’
cuti-pre(45mer)：
5’-CGTTCCTGAACTTGTTGCCCGGGTTGGTGGCACTTCTGCCAGCGC-3’
TP2-KexF(32mer)：
5’-GTTCCTGAACTTGTTCGGCGGGTTGGTGGCAC-3’
TP2-KexR(32mer)：
5’-GTGCCACCAACCCGCCGAACAAGTTCAGGAAC-3’
Cuti-preF(29mer)：
5’-GTTGCTGCTCTCCCCGTTGGTGGCACTTC-3’
Cuti-pre R(29mer)：
5’-GAAGTGCCACCAACGGGGAGAGCAGCAAC-3’
CUTIpre-TPpro F(42mer)：
5’-TCCTCAGGAGATCCCCAACATTGTTGGTGGCACTTCTGCCAG-3’
CUTIpre-TPpro R(40mer)：
5’-GTTGGGGATCTCCTGAGGAGCGGGGAGAGCAGCAACAAGG-3’
对于隔孢伏革菌(Peniophora)植酸酶的表达
PP1F(50mer)：
5’-AAACGACGGTACCCGGGGATCAAGCTTATGGTTTCTTCGGCATTCGCACC-3’
PPR(50mer)：
5’-ACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGACTATTCCGACGGAACAAAGCCGC-3’
PP 2F(50mer)：
5’-CCGCCAGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCCAGCTACCTATCCCCGCACAAAAC-3’
培养基和底物
RS-25：40g/L大豆粉，40g/L葡萄糖，10g/L KH2PO4，0.25g/L MgSO4，0.01g/LFeSO4，2.5g/L NH4NO3；pH6
YPD：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物
10X基础溶液：66.8g/l酵母氮碱基无(w/o)氨基酸(DIFCO)，100g/l琥珀酸盐和60g/l NaOH。
SC-葡萄糖(或SC-培养基)：100ml/l20％葡萄糖(即，2％的终浓度＝2g/100ml)，4ml/l5％苏氨酸，10ml/11％色氨酸，25ml/120％酪蛋白氨基酸和100ml/110X基础溶液。该溶液使用0.20微米孔径的滤膜灭菌。琼脂和H2O(大约761ml)一起高压灭菌，并将单独灭菌的SC-葡萄糖溶液加入琼脂溶液中。
PEG/LiAc溶液：50ml40％PEG4000(高压灭菌)和1ml5M醋酸锂(高压灭菌)。
方法
酵母转化
该方法在实施例2-5中使用。
为了转化酵母，使用体内重组机制，其中如果载体序列和PCR片断都具有相同的侧翼区，则酵母可能通过该机制体内重组载体序列和PCR片断以产生表达载体。
通过将0.5微升载体(EcoRI-NotI消化)与1微升PCR片断混合制备DNA混合物。酿酒酵母YNG318感受态细胞在冰上融解。将100微升该细胞与该DNA混合物和10微升载体DNA(Clontech)在12ml聚丙烯试管(Falcon 2059)中混合。向其中加入0.6ml PEG/LiAc溶液并轻轻混合，然后在30℃和200 rpm下温育30分钟。随后在42℃温育30分钟(热休克)，之后转移进eppendorf管并离心5秒。去掉上清并分散在3mlYPD中。然后将该细胞悬液以200 rpm在30℃下温育45分钟，之后倾倒在SC-葡萄糖平板上。
PCR反应
除非另有说明，在下列条件下进行PCR反应：
PCR反应包含38.9微升H2O，5微升10x反应缓冲液，1微升Klen TaqLA(Clontech)，4微升10 mM dNTPs，0.3微升× 2100pmol/微升的引物和0.5微升模板DNA且在下列条件下进行：30个循环的98℃下10秒和68℃下90秒，和最后在68℃下10分钟。
夹心ELISA
免疫平板(Nunc Maxisorb；Nunc-Nalgene)在4℃下用合适剂量的多克隆兔抗Der p 1抗体包被过夜。然后用含0.05％Tween20的0.15M磷酸盐缓冲液(PBS)(PBST)彻底洗涤平板，并用含2％脱脂奶粉的PBS在室温下封闭剩下的结合位点1小时。以合适剂量或剂量范围加入样品，它可以是纯化的，半纯化的重组1型螨多肽变异体过敏原或含有目的蛋白的粗制培养液。然后用0.15MPBST彻底洗涤平板，之后通过用生物素标记的单克隆抗Der p 1抗体(INDOOR)在室温下温育1小时检测该过敏原。然后在0.15MPBST中再次洗涤平板，之后与链霉抗生物素蛋白：辣根过氧化物酶复合物(Kierkegaard&Perry)在室温下结合1小时。重复洗涤步骤，然后平板通过加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺过氧化氢(TMB Plus，Kem-En-Tec)显色，之后通过加入0.2 MH2SO4终止反应。在450nm下的光密度(OD)反映了与免疫球蛋白结合的过敏原，然后可检测且也可通过与从ELISA中包含的已知浓度剂量范围的天然Der p 1(可从Indoor biotechnologies，NA-DP1获得)获得的数据进行比较来测定结合的过敏原的量。
其它方法
通过电穿孔(BIO-RADGenePulser)进行大肠杆菌转化以拯救酵母质粒。DNA质粒用 质粒试剂盒制备。DNA片断通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收。
PCR用PTC-200 DNA Engine进行。
ABIPRISMTM310遗传分析仪用于所有DNA序列的测定。酵母总DNA通过在Nucleic acids research vol.20，No.14(1992)3790中所述的Robzyk和Kassir’s方法提取。
酶测定法
半胱氨酸蛋白酶测定法
96孔微量滴定板测定法：
向各孔中加入下列成份：10微升0.5M醋酸钠缓冲液(pH 5)，10微升2MNaCl(含有700微升巯基乙醇/100ml)，45微升D.W.(蒸馏水)和10微升酶样品。然后平板在室温下温育5-10分钟(用于肽酶的成熟)，之后加入25微升40μM的Z-Phe-Arg-MCA(0.1％DMSO)。最后，在荧光计中测量460nm下MCA(4-甲基-香豆酸酰-7-酰胺)的发射。
胰蛋白酶测定法(镰孢胰蛋白酶的PNA测定法)
底物：
将50mg N α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对-N-硝酰苯胺(Nitroanilide)(BAPNA，Sigma B-4875)溶于1mlDMSO且保存在-20℃。该溶液在即将使用前在测定缓冲液中稀释100倍。
测定缓冲液：
50mM硼酸盐-NaOH(pHl0.5)+2mM CaCl2
方法：
将20微升样品和200微升测定缓冲液在96-孔微量滴定盘中混合并在405nm下测量Delta OD/min5分钟。
植酸酶测定法
将10微升稀释的酶样品(在0.1M乙酸钠，0.01％Tween20，pH5.5中稀释)加入250微升含5mM植酸钠(Sigma)的0.1M乙酸钠，0.01％Tween20，pH5.5(溶解植酸钠后调节的pH；预热底物)中并在37℃下温育30分钟。通过加入250微升10％TCA终止反应并通过加入500微升将7.3gFeSO4溶于100ml钼酸盐试剂(2.5g(NH4)6Mo7O24.4H2O溶于8ml H2SO4中稀释至250ml)所得的溶液来测量游离磷酸盐。在96孔微量滴定板中测量200微升样品在750nm下的吸光度。包含底物和酶空白对照。也包含磷酸盐标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1U等于在给定条件下释放1微摩尔磷酸盐/分钟的酶量。
实施例
实施例1
在酿酒酵母中表达Der p 1
来自Dermantophagoides pteronyssinus的Der p 1半胱氨酸蛋白酶(具氨基酸序列在SEQ ID NO：3中描述)编码基因位于载体pSteD212中，该载体来自酵母表达载体pYES2.0(Invitrogen，Kofod等，1994 J.Biol.Chem.269：29182-29189和Christgau等，1994，Biochem.Mol.Biol.Int.33：917-925)。
该质粒在大肠杆菌和酿酒酵母中都复制。在酿酒酵母中从该质粒表达Der p 1。
重组体Der p 1以Der p 1前肽表达且具有破坏成熟序列内唯一N-糖基化基序的突变S54N或N52Q。
为了在酵母中分泌，通过将两个不同的信号肽导入编码pro-Der p 1基因的上游检测了它们的表达效率。通过克隆DNA片断制备含有信号肽的表达构建体(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，冷泉港，1989)。一个信号肽是具有氨基酸序列MKIVLAIASLLALSAVYA的天然存在的Dermantophagoides pteronyssinus Der p 1信号肽且另一信号肽来自Humicula insolens角质酶并具有氨基酸序列MKFFTTILSTASLVAALP(SEQ ID NO：1)。具有尘螨(dust mite)Der p 1信号肽的酵母菌株和构建体称为pre-pro-Der p 1且具有角质酶信号肽的酵母菌株和构建体称为cuti-pro-Der p1。
将构建体转化进酿酒酵母。为了筛选表达Der p 1的酵母转化子，将转化溶液涂布在SC-琼脂板上用于在30℃形成菌落3天。将菌落接种在50ml无菌塑料管中，每管含有10mLSC培养基。试管在含有100mlSC培养基的500ml有挡板的锥形瓶中30℃，250rpm发酵4天。发酵培养液用于夹心ELISA实验以测定表达蛋白的浓度。
通过上面方法部分所述的夹心ELISA测定pre-pro Der p1 S54N和pre-proDer p1 N52Q转化子中Der p 1的表达水平为相同的水平±8％。可推断具有pre-pro-Der p 1的两个菌株的表达水平不依赖于使用两个突变S54N和N52Q中的哪一个。
在另一实验中，4.5L pre-pro-Der p 1(N52Q)和cuti-pro-Der p 1(S54N)的培养液发酵4天，发酵期间每天取样并通过上述夹心ELISA测量Der p 1的量以追踪表达水平。cuti-pro-Der p 1和pre-pro-Der p 1表达产量之间的比率显示如下。
| 发酵天数 | 表达产量(cuti-pro Der p 1/pre-pro-Der p 1) |
| 第1天 | 8 |
| 第2天 | 10 |
| 第3天 | 8 |
| 第4天 | 6 |
发酵的每天中cuti-pro-Der p 1比pre-pro-Der p 1多表达6-10倍的Der p1，表明pro-Der p 1前面的角质酶信号肽与使用天然尘螨Der p 1信号肽比较增加了pro-Der p 1蛋白的表达水平。
实施例2
在酿酒酵母中表达卷枝毛霉的纤维素酶
卷枝毛霉IFO4554在含有RS-25+0.5％乳糖培养基的摇瓶中30℃下培养1天。收集菌丝体并用于mRNA制备，随后将该mRNA逆转录成cDNA。使用MCE-BC1 F和MCE-Nru R引物对和下列PCR条件通过PCR从该cDNA扩增大约1kb的片断：94℃下2分钟；35个循环的94℃下1分钟，45℃下1分钟和72℃下2.5分钟；最后在72℃下8分钟。将扩增的片断克隆进T-载体(Novagene)。
用引物对M61 F和C-末端R61 R，和M61Cutisig F和C-末端R61 R再扩增T-载体中的片断(毛霉纤维素酶基因)，其中前一引物对用于含原始信号序列(毛霉纤维素酶基因的信号序列)的构建体，且后一引物对用于构建含有H.insolens角质酶信号序列(SEQ ID NO：2)和毛霉纤维素酶基因的核酸序列。
通过将所得的PCR片断与用HindIII和XbaI，和PvuII与XbaI分别消化的pJC039载体一起导入酿酒酵母YNG318中转化酵母。
所得的转化子在含有YPD培养基的24孔平板中在30℃和180rpm下培养3天。将培养物上清上样到含有0.2％CMC(羧甲基纤维素)，pH8.5的琼脂板的孔中。在下表中列出了围绕含有酵母细胞培养上清的孔的晕环大小，该酵母细胞表达含H.insolens角质酶信号肽或含毛霉纤维素酶基因信号肽的毛霉纤维素酶。由于该纤维素酶能够降解CMC从而产生晕环，因此晕环的大小相关于放入特定孔中的培养上清中存在的纤维素酶的量。因此，大晕环表明纤维素酶的含量高而小晕环表明纤维素酶的含量低。
| CMC板的孔环大小 | |
| 含H.insolens角质酶信号肽的毛霉纤维素酶 | +++++ |
| 含有其自身信号肽的毛霉纤维素酶 | (+) |
该结果表明用H.insolens角质酶基因的信号肽序列表达时毛霉纤维素酶在酵母中的表达水平比用其自身信号肽序列(毛霉纤维素酶基因)表达时高得多。
实施例3
在酿酒酵母中表达白车轴草半胱氨酸蛋白酶
为了构建含有α-因子信号肽和白车轴草半胱氨酸蛋白酶的表达载体，用引物对α-信号-MunI和α-信号-CysProR再次扩增编码α-因子信号肽的DNA片断。用引物对，α-信号-CysPro F和Spe-Cys ProR并使用EMBL：AY192363序列作为模板再次扩增编码白车轴草半胱氨酸蛋白酶前体成熟区的基因。通过将这两个PCR片断与用Hind III和Xba I消化的pJC039载体混合在一起并导入酿酒酵母YNG318中转化酵母。
为了构建包含H.insolens角质酶信号肽和白车轴草半胱氨酸蛋白酶的表达载体，用引物对Cuti-Sig-CysPro和CysPro C-term再次扩增编码白车轴草半胱氨酸蛋白酶前体成熟区的基因。通过将获得的PCR片断与用Hind III和XbaI消化的pJC039载体混合并导入酿酒酵母YNG318中转化酵母。获得的转化子在含1mlYPD的24孔平板中27℃下培养3天，然后按方法部分所述检测上清的半胱氨酸蛋白酶活性。半胱氨酸蛋白酶活性的测量值在下表中显示。
| 半胱氨酸蛋白酶活性(荧光发射/分钟) | |
| 含H.insolens角质酶信号肽的半胱氨酸蛋白酶 | 4.446 x 106 |
| 含α-因子信号肽的半胱氨酸蛋白酶 | 4.073 x 105 |
结果表明当用H.insolens角质酶信号肽表达时白车轴草半胱氨酸蛋白酶在酵母中的表达水平比用α-因子信号肽高10倍。
实施例4
在酿酒酵母中表达镰孢胰蛋白酶
用引物对酵母-F和酵母-R，以及cuti-pre和酵母-R使用EMBL：S63827序列作为模板再次扩增镰孢胰蛋白酶基因，即SEQ ID NO：6所示的cDNA序列。酵母-F/酵母-R引物对用于构建包含编码胰蛋白酶基因信号肽、前肽区(pro-region)和成熟部分的核酸序列的序列，而cuti-pre/酵母-R引物对用于构 建包含H.insolens角质酶信号肽和前肽区和镰孢成熟胰蛋白酶基因的核酸序列。将所得的PCR片断与用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039载体一起导入酿酒酵母YNG318中转化酵母。
获得的转化子(pTM-TP1和pTM-TP2)在含有YPD培养基的24孔平板中在30℃，180rpm下培养3天。
pTM-TP1：镰孢胰蛋白酶信号+镰孢胰蛋白酶前肽+成熟胰蛋白酶
pTM-TP2：H.insolens角质酶信号+H.insolens角质酶前肽+成熟胰蛋白酶
按上文方法部分所述测量胰蛋白酶活性。即使加入Neutrase TM(作为成熟酶)在两种培养物上清中都没有观察到活性。然而，用pTM-TP2通过Western印迹检测到胰蛋白酶的前体形式(角质酶前肽+成熟胰蛋白酶)。
因此，制备下列构建体：
pTM-TP2-Kex：H.innsolens角质酶信号肽+H.insolens角质酶前肽区+KexII位点+成熟镰孢胰蛋白酶
pTM-TP2w/o pro：H.insolenns角质酶信号肽+成熟镰孢胰蛋白酶
pTM-TP2 TPpro：H.insolens角质酶信号肽+镰孢胰蛋白酶前肽区+镰孢成熟胰蛋白酶
各引物对，TP2-KexF和R，Cuti-preF和R以及CUTIpre-TPpro F和R，分别通过将它们与用EagI消化的pTM-TP2载体混合并将该混合物导入酿酒酵母YNG318中用于制备pTM-TP2-Kex，pTM-TP2w/o pro和pTM-TP2 Tppro。
获得的转化子在含有YPD培养基的24孔平板中在30℃，180rpm下培养3天。
| 构建体 | 信号肽 | 前肽区 | 活性w/oNeutrase (作为成熟酶) | 含Neutrase的活性 | 细胞提取物(细胞内)的Western印迹 | 上清(细胞外)的Western印迹 |
| pTM-TP1 | 胰蛋白酶 | 胰蛋白酶 | - | - | 前体形式 | - |
| pTM-TP1Kex | 胰蛋白酶 | 胰蛋白酶(+kex位点) | - | - | 前体形式 | - |
| pTM-TP2 | 角质酶 | 角质酶 | - | - | - | 前体形式 |
| pTM-TP2K | 角质酶 | 角质酶 | - | - | N.T. | N.T. |
| ex | (+kex位点) | |||||
| pTM-TP2w/o pro | 角质酶 | 无 | - | - | - | 比成熟酶更大 |
| pTM-TP2TPpro | 角质酶 | 胰蛋白酶 | - | + | - | 前体形式 |
其中“-”是指在Western印迹中检测不到活性或无结合带，“+”是指可检测到胰蛋白酶活性，“前体形式”是指可检测到胰蛋白酶的前体形式，“N.T.”是指“没有检测”且对于pTM-TP2 w/o pro是指可检测到比成熟酶更大的蛋白质，然而该构建体设计成不包含前肽区，因此它不是前体形式。
当向上清中加入Neutrase时(终浓度0.5AU/ml)用pTM-TP2TPpro载体检测到胰蛋白酶活性。结果表明镰孢胰蛋白酶自身信号肽在酵母中不能有效工作以表达胰蛋白酶，而H.insolens角质酶信号肽则可以。镰孢胰蛋白酶的前肽区(也称为前肽序列)(7个氨基酸)似乎对于该胰蛋白酶的正确折叠和活化是必需的。
实施例5
在酿酒酵母中表达隔孢伏革菌植酸酶
用引物对(PP1 F和PPR，PP2F和PPR)使用EMBL：PLY310696序列作为模板扩增隔孢伏革菌的植酸酶基因，即，SEQ ID NO：8所示的cDNA序列。PP1 F/PP R引物对用于构建编码隔孢伏革菌植酸酶基因信号肽和隔孢伏革菌植酸酶成熟蛋白的核酸序列，而PP2 F/PPR引物对用于构建编码H.insolens角质酶基因信号肽和成熟隔孢伏革菌植酸酶蛋白的核酸序列。通过将所得的PCR片断与用HindIII和XbaI，以及PvuII和XbaI消化的pJC039载体一起导入酿酒酵母YNG318中转化酵母。
获得的转化子在含有YPD培养基的24孔平板和500ml摇瓶中在30℃，180rpm下培养3天。
pTMPP1构建体包含隔孢伏革菌植酸酶的原有信号肽序列，而pTMPP2构建体包含H.insolens角质酶信号肽序列。按方法部分所述测量在24孔平板或摇瓶中培养的包含pTMPP1或pTMPP2构建体的转化子培养物上清中的植酸酶活性。结果如下所示。
| 24-孔 | 摇瓶 | |
| pTMPP1(植酸酶信号肽) | 1.8U/ml | 1U/ml |
| pTMPP2(角质酶信号肽) | 6.9U/ml | 13U/ml |
结果表明包含pTMPP2构建体的转化子比包含pTMPP1构建体的转化子表达更高的植酸酶活性，表明H.insolens信号肽与植酸酶自身信号肽相比增加在酵母中的植酸酶表达。
实施例6
在米曲霉中表达隔孢伏革菌的植酸酶
使用实施例5所述的包含具有其自身信号肽序列的植酸酶基因和具有H.insolens角质酶信号肽序列的植酸酶基因的构建体来构建曲霉属的表达载体并按Lassen等，(2001)，Applied and Environmental Micorbiology，67，4701-4707中所述转化曲霉。对于每个构建体，分离49个菌株，纯化并通过在摇瓶中培养所述转化子按上文方法部分所述测量植酸酶的产量。当比较来自两组构建体的表达最高水平植酸酶的菌株时，发现包含具有角质酶信号肽的构建体的菌株比包含植酸酶信号肽的菌株表达的植酸酶多大约1.4倍。同样，当比较每组中表达最大量植酸酶的5个菌株的植酸酶平均表达量时，包含具有角质酶信号肽的构建体的菌株比包含具有植酸酶信号肽的构建体的菌株表达的植酸酶多大约1.3倍。
Claims (20)
1.生产分泌多肽的方法，包括：
(a)在有助于生产多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码该多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码信号肽的第一核苷酸序列，其中所述信号肽指导该多肽进入或通过细胞膜、进入细胞分泌途径，第一核苷酸序列相对于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列选自如下组成的组中：
(i)编码以下信号肽的核苷酸序列：氨基酸序列为SEQ ID NO：1的信号肽；和
(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；和
(b)从培养基中分离分泌的多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中第二核苷酸序列编码对该真菌宿主细胞为天然的多肽。
3.根据权利要求1的方法，其中第二核苷酸序列编码对该真菌宿主细胞为异源的多肽。
4.根据权利要求1的方法，其中该真菌宿主细胞含有一个或多个拷贝的第二核苷酸序列。
5.根据权利要求1的方法，其中第二核苷酸序列编码激素，酶，受体，抗体，过敏原或报道分子。
6.根据权利要求5的方法，其中该酶是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，或连接酶。
7.根据权利要求6的方法，其中该酶是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，纤维二糖水解酶，几丁质酶，角质酶，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，内切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，变位酶，氧化酶，果胶降解酶，过氧化物酶，磷脂酶，植酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶，或β-木糖苷酶。
8.根据权利要求5的方法，其中第二核苷酸序列编码过敏原。
9.根据权利要求8的方法，其中所述过敏原来自Dermantophagoidespteronyssinus的Der p1。
10.根据权利要求9的方法，其中所述过敏原的氨基酸序列如SEQ IDNO：3中氨基酸19-320所示。
11.根据权利要求1的方法，其中该真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中该丝状真菌宿主细胞为曲霉属细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中该曲霉属细胞为米曲霉。
14.根据权利要求1的方法，其中该真菌宿主细胞是酵母细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中该真菌宿主细胞是酵母属细胞。
16.根据权利要求15的方法，其中该酵母属细胞为酿酒酵母。
17.核酸构建体，包含与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地相连的编码信号肽的第一核苷酸序列，其中所述信号肽指导该多肽进入或通过细胞膜、进入细胞分泌途径，第一核苷酸序列相对于第二核苷酸序列是外源的，且第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列选自如下组成的组中：
(i)编码以下信号肽的核苷酸序列：氨基酸序列为SEQ ID NO：1的信号肽；和
(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
18.含有权利要求17的核酸构建体的重组表达载体。
19.含有权利要求17的核酸构建体或权利要求18的表达载体的重组宿主细胞。
20.信号肽用于生产多肽的用途，其中所述信号肽指导该多肽进入或通过细胞膜、进入细胞分泌途径，该信号肽由第一核苷酸序列编码且多肽由相对于第一核苷酸序列是外源的第二核苷酸序列编码，且第一核苷酸序列的3′端紧接着第二核苷酸序列的上游，且其中第一核苷酸序列选自如下组成的组中：
(i)编码以下信号肽的核苷酸序列：氨基酸序列为SEQ ID NO：1的信号肽；和
(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
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