ES2319489B1 - Cepas de levadura capaces de secretar beta-galactosidasa al medio y su uso para la produccion de biomasa, etanol, beta-galactosidasa y proteinas de interes. - Google Patents

Cepas de levadura capaces de secretar beta-galactosidasa al medio y su uso para la produccion de biomasa, etanol, beta-galactosidasa y proteinas de interes. Download PDF

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Abstract

Cepas de levadura capaces de secretar \beta-galactosidasa al medio y su uso para la producción de biomasa, etanol, \beta-galactosidasa y proteínas de interés.
La invención se relaciona con cepas de S. cerevisiae capaces de secretar \beta-galactosidasa de origen heterólogo al medio de cultivo así como a métodos para la obtención de \beta-galactosidasa usando dichas cepas y métodos para la producción de glucosa/galactosa, biomasa y bioetanol mediante el cultivo de dichas cepas en medios ricos en lactosa. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la expresión de proteínas recombinantes usando una composición rica en lactosa como medio de cultivo para los microorganismos productores de dicha proteína.

Description

Cepas de levadura capaces de secretar \beta-galactosidasa al medio y su uso para la producción de biomasa, etanol, \beta-galactosidasa y proteínas de interés.
Campo técnico de la invención
La invención se relaciona con métodos para la producción de \beta-galactosidasa, biomasa, etanol y proteínas de interés usando cepas de S. cerevisiae modificadas para secretar \beta-galactosidasa de origen heterólogo.
Antecedentes de la invención
Se denomina suero de leche al líquido remanente tras la precipitación y separación de la caseína de la leche durante la elaboración del queso. Este subproducto representa aproximadamente el 85-90% del volumen de la leche y retiene el 55% de sus nutrientes. Las tendencias actuales del mercado a nivel mundial indican un incremento paulatino de la producción de queso, que genera más de 115 millones de toneladas de suero líquido.
A pesar del gran valor nutritivo y aplicaciones tecnológicas de algunos componentes de este subproducto, así como de las numerosas investigaciones realizadas al respecto, en la actualidad, todavía no se ha desarrollado ningún tratamiento capaz de rentabilizar el tratamiento de las importantes cantidades de suero que se producen y se vierten cada año, representando un importante problema medioambiental por su elevada carga orgánica (DBO = 30.000-60.000 ppm) (González Siso, M.I., 1996, Biores. Technol. 57:1-11; González Siso, M.I., 1999, Manual Universitario nº 12. Servicio de publicaciones Universidade da Coruña). Una central quesera que procese 100 Tm de leche por día produce efluentes con aproximadamente la misma carga orgánica que una ciudad de 55.000 habitantes (Sienkiewicz y Riedel, 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).
Uno de los inconvenientes para utilizar el suero como sustrato de la fermentación alcohólica radica en que el número de microorganismos capaces de metabolizar directamente la lactosa a etanol es muy reducido (Moulin, G. y Galzy, P. 1984, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1:347-374). Aunque existen cepas de levadura capaces de fermentar directamente la lactosa, por ejemplo, la cepa de Saccharomyces lactis descrita la patente rusa RU2059713, la levadura conocida de mayor capacidad fermentadora y ampliamente utilizada en la industria cervecera, S. cerevisiae, carece de lactosa permeasa (la función de este transportador de lactosa es controlar la entrada del azúcar en la célula) y de \beta-galactosidasa intracelular con lo cual es incapaz de fermentar directamente la lactosa a etanol (Russel, I., 1986, Trends Biotech. 49:107-108; Castillo, 1990 en Yeast biotechnology and biocatalysis, pp. 297-320 Ed. Hubert Veractert, René de Mot, Marcel Dekker Inc. USA). Un objetivo de especial interés en biotecnología consiste en la construcción de cepas de S. cerevisiae capaces de utilizar la lactosa y, de este modo, conseguir que la levadura se desarrolle directamente sobre el suero de leche, produciendo etanol, biomasa o algún otro producto de interés (Rubio-Texeira, M., 2006, Biotrechnol. Adv. 24:212-225) contribuyendo a la depuración y utilización de éste producto.
Una de las primeras aproximaciones para fermentar la lactosa del suero de leche consistió en la hidrólisis del disacárido mediante la \beta-galactosidasa de otros microorganismos y posterior fermentación por S. cerevisae (Champagne, C. P. y Goulet, J. 1988, Can. Ins. Food. Sci. Technol. 21:545-548). Este proceso se puede desarrollar en dos pasos o en uno sólo, con cultivos mixtos o con la enzima y la levadura coinmovilizadas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente WO8103339). No obstante, cuando S. cerevisiae usa la mezcla de glucosa y galactosa como fuente de carbono, manifiesta un crecimiento diáuxico y baja producción de etanol (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Letters, 14:1085-1088). Otra desventaja de estos procesos es el alto precio de la \beta-galactosidasa (Sienkiewicz, T. y Riedel, C.L. 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).
Con la ayuda de las técnicas de ADN recombinante se han podido construir, mediante diferentes estrategias, cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar lactosa. Así, Sreekrishna y Dickson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82:7909-7913) consiguieron cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar la lactosa al transformar dicha levadura con un plásmido integrativo que contenía los genes LAC4 (\beta-galactosidasa) y LAC12 (lactosa permeasa) de Kluyveromyces lactis, según se describe en las solicitudes de patente GB2178431 y EP0206571. Estos autores obtuvieron un transformante con varias copias en tándem de los genes en una localización inespecífica del genoma, pero este transformante presentó un crecimiento lento y un fenotipo inestable.
Muchas de las estrategias genéticas desarrolladas posteriormente se basaron en la hidrólisis extracelular de la lactosa. En la mayoría de los casos esto implica una lisis celular. Uno de estos intentos se basó en usar el gen lacZ clonado bajo el control de un promotor de S. cerevisiae inducible por galactosa (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Bioeng. 39:799-805). Las cepas superproductoras de \beta-galactosidasa intracelular fueron capaces de crecer en lactosa debido a un cierto grado de lisis celular que liberó suficiente enzima para producir la hidrólisis extracelular del azúcar. La lisis celular fue provocada por la sobreexpresión del activador transcripcional de levaduras (GAL4). En otros casos la liberación de \beta-galactosidasa intracelular fue mediante permeabilización con tolueno (Compagno, C. et al., 1993, Biotechnol. Bioeng. 42:398- 400) o mediante el uso de mutantes de S. cerevisiae que lisan a temperaturas no permisivas (Becerra, M. et al., 2004, J. Biotechnol. 109:131-137). La utilización de mutantes autolíticos es conveniente para aquellos casos en los que se necesita recuperar de las células un determinado producto al final del proceso fermentativo.
Relacionado con la utilización de mutantes de S. cerevisiae también se ha estudiado la utilidad de mutantes supersecretores y deficientes en proteasas transformados con la \beta-galactosidasa de K. lactis (Becerra, M. et al., 2001, Biotechnol. Lett. 23:33-40, Becerra et al., 2002, Biotechnol. Lett. 24:1391-1396). Una aproximación alternativa consistió en el uso del gen de la \beta-galactosidasa extracelular de Aspergillus niger expresado en S. cerevisiae (Kumar, V. et al., 1992, Bio/Technology, 10:82-85; Ramakrishnan, S. y Hartley, B.S., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:4230-4235; Domingues, L. et al., 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:645-650 y WO9010703). La levadura transformada secretó un 40% al medio de cultivo en los primeros casos y creció en permeado de lactosuero.
En una aproximación más reciente (Rubio-Texeira, M. et al., 1998, Yeast, 14:827-837; Adam, A.C. et al., 1999, Yeast, 15:1299-1305; Domingues, L. et al., 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:621-626, Domingues, L. et al., 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:692-697 y Domingues, L, et al. 2001, Biotechnol. Bioeng., 72:507-514; Jurascik, M. et al., 2006, Biotechnol. Bioeng., 94:1147-1154; Rubio-Texeira, M. et al., 2006, Biotechnol. Adv. 24:212-225) se obtuvo una cepa diploide de S. cerevisiae capaz de metabolizar la lactosa por construcción, primero, de cepas haploides con múltiples integraciones en la región codificadora del ribosómico (locus RDN1) de los genes LAC4 y LACZ bajo el control de un promotor inducible por galactosa. Las cepas resultantes se cruzaron con una cepa silvestre, seleccionando dos cepas cruzadas de mating opuesto y fusionándolas para obtener un diploide de crecimiento rápido y Lac^{+}. Sin embargo, la incorporación de la lactosa por la lactosa permeasa limita la hidrólisis intracelular de este disacárido (Rubio-Texeira, M. et al., 2000, J. Biotechnol., 84:97-106).
Otra aproximación consistió en el uso de una cepa de S. cerevisiae transformada con un plásmido que contenía el gen de la \beta-galactosidasa de Escherichia coli (lacl) fusionado a la secuencia señal de secreción del gen de la glucoamilasa II (Vanoni et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164: 1331-1338; Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Left., 14:1085-1088). A pesar de conseguir un porcentaje de secreción de la enzima de hasta un 70% en el espacio periplásmico, lo que permitía la hidrólisis de la lactosa extracelular y su utilización por las células, la velocidad de crecimiento fue muy lenta. Becerra, M. et al (Protein Engineering, 2001, 14: 379-386) han descrito cepas de S. cerevisiae transformadas con un vector que codifica para una proteína de fusión entre la secuencia señal del preprofactor \alpha y la \beta-galactosidasa de K. lactis. Sin embargo, a pesar de que la proteína se podía detectar en el espacio periplásmico, ésta no se encontraba glicosilada y no se demostró que la proteína fuese capa de hidrolizar lactosa. Pereira, A. et al. (Microbial Cell Factories, 2006, 5:1-13) han descrito dos cepas de K. lactis que son capaces de secretar \beta-galactosidasa en forma activa al medio extracelular. Para ello, las cepas se han transformado con construcciones que codifican proteínas de fusión que están formadas, en ambos casos, por la secuencia señal de la toxina killer de K. lactis y por una proteína híbrida que, en el primer caso, consta de la mitad N-terminal de la \beta-galactosidasa de A. niger y de la mitad C-terminal de la \beta-galactosidasa de K. lactis y, en el segundo caso, consta de la mitad N-terminal de la \beta-galactosidasa de K. lactis y de la mitad C-terminal de la \beta-galactosidasa de A. niger. Estas proteínas híbridas aparecen en el medio en su forma activa. Sin embargo, las proteínas híbridas muestran unos parámetros de reacción distintos a las proteínas nativas por lo que la utilización a nivel industrial de las cepas que las contienen para la obtención de biomasa o de etanol a partir de lactosa requiere de la puesta a punto de las condiciones particulares para las proteínas híbridas.
Así, existe una necesidad en la técnica de proporcionar cepas capaces de secretar \beta-galactosidasa el medio en forma nativa y activa y en donde las cepas muestren unas tasas de crecimiento similares a las cepas nativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Compendio de la invención
En un primer aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
(i)
una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos 70% con dicha secuencia y
(ii)
una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un vector plasmídico que contiene la construcción de ADN de la invención.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión codificada por la construcción de ADN de la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con una cepa de levadura que contiene la construcción de la invención, el vector de la invención o la proteína de fusión de la invención.
\newpage
En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método para producir \beta-galactosidasa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura que contiene una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la \beta-galactosidasa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos 70% con dicha secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un sexto aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener glucosa y/o galactosa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la glucosa y/o la galactosa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1,
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
En un séptimo aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar el producto de fermentación del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1,
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
En un octavo aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener biomasa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
\newpage
(ii)
recuperar la biomasa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
En un noveno aspecto, la invención se relaciona con una célula de levadura que comprende
(i)
una primera construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
a.
una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de
1.
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:l
2.
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
3.
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos 70% con dicha secuencia
b.
una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura
(ii)
una segunda construcción de ADN que codifica para una proteína de interés operativamente acoplada a un promotor que permite la expresión de dicha proteína en levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
En un décimo aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de proteínas heterólogas que comprende las etapas de
a.
cultivar al menos la célula de levadura de la invención en un medio rico en lactosa
b.
recuperar la proteína heteróloga del medio.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1: Producción de biomasa y etanol por la cepa recombinante portadora del gen LAC4 creciendo en YPL al 4%.
Figura 2: Producción de \beta-galactosidasa, biomasa y etano por la cepa recombinante portadora del gen LACA en YPL al 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han desarrollado una construcción de ADN que está compuesta por la secuencia que codifica para la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae fusionada en el mismo marco de lectura con la forma madura de la \beta-galactosidasa de A. niger y han puesto de manifiesto que las cepas de levadura que contienen dicha construcción no sólo muestra unos niveles de crecimiento similares a los de las cepa nativa sino que secretan \beta-galactosidasa al medio en su forma activa, lo que permite el uso de las cepas para la producción de bioetanol, biomasa y glucosalgalactosa a partir de un medio de cultivo rico en lactosa. Gracias a éstas características, las cepas proporcionan una solución a los problemas existentes en el estado de la técnica.
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una primera porción que consta de los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína definida por SEQ ID NO:l o una variante funcionalmente equivalente de la misma cuya secuencia muestra un mínimo de un 70% de identidad con respecto a dicha secuencia, en donde dicha secuencia se encuentra fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia señal de un organismo heterólogo en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura.
Los aminoácidos 20 a 1006 de la secuencia identificada por SEQ ID NO:1 se corresponden esencialmente con la forma madura de la \beta-galactosidasa de A. niger. Por variante funcionalmente equivalente de la secuencia formada por los aminoácidos 20 a 1006 de la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1 se entiende cualquier otra secuencia resultante de la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos que mantiene la actividad \beta-galactosidasa. Métodos para la determinación de la actividad \beta-galactosidasa son suficientemente conocidos en el estado de la técnica. Dichos métodos se basan en determinar la capacidad de la enzima de hidrolizar un conjugado cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente que consta de galactosa conjugado a un compuesto cromóforo/fluoruro/quimioluminis-
cente mediante un enlace \beta-glicosídico en donde la liberación de dicho compuesto se puede detectar mediante medición de la fluorescencia liberada, de la densidad óptica a una longitud de onda determinada o de la quimioluminscencia. Compuestos cromogénicos que pueden usarse como sustratos de la \beta-galactosidasa para determinar su actividad incluyen el orto-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido (ONPG) que, al ser hidrolizado, produce un compuesto de color amarillo intenso, y el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido (X-Gal) que, al ser hidrolizado, produce un compuesto que, en contacto con el aire, forma un compuesto de color azul, N-metilindolil-\beta-D-galactopiranosido) ((3-Gal verde), 5-iodo-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido (morado-\beta-D-Gal), 5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido (Rojo-\beta-D-Gal), 6-cloro-3-indoxil-\beta-D-galactopiranosido (Rosa-\beta-D-Gal). Compuestos fluorogénicos que pueden usarse como sustratos de la \beta-galactosidasa para determinar su actividad incluyen resorufin \beta-D-Galactopiranosido, 4-Metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranosido, fluoresceina di-\beta-D-galactopiranosido (FDG). Condiciones adecuadas para la realización del ensayo \beta-galactosidasa son ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, en Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Una variante de una secuencia particular de ácidos nucleicos es una secuencia que muestra al menos un 70% de identidad con la secuencia de referencia a lo largo de toda la secuencia calculado usando la herramienta "BLAST 2 Sequences" Version 2.0.9 (07-May-1999) con sus parámetros por defecto. Así, la secuencia variante puede mostrar un grado de identidad con la secuencia de referencia de por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o más identidad a lo largo de toda la secuencia. Una variante se puede describir como alélica, de procesamiento, de especie o polimórfica.
La secuencia que codifica para la forma madura de la \beta-galactosidasa o para una forma funcionalmente equivalente de la misma debe estar fusionada a una secuencia señal heteróloga que permita la secreción de dicha \beta-galactosidasa al medio extracelular. Por secuencia señal heteróloga, según se usa en el contexto de la presente invención, se entiende todo polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia señal que se encuentra de forma natural asociada a una proteína distinta a la \beta-galactosidasa que se desea expresar. Así, la presente invención contempla el uso de secuencias señal derivadas de cualquier péptido secretado, incluyendo tanto aquellas secuencias señal pertenecientes al mismo organismo cuya BG queremos expresar pero cuya función es promover la secreción al medio de proteínas distintas a la BG, así como de secuencias señal que derivan de otros microorganismos y que se encargan de promover la secreción al medio de cualquier enzima. Así, ejemplos ilustrativos pero no limitativos de secuencias señal que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que contienen o que consisten en la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae y de otras especies de los géneros Kluyveromyces, Pichia, y Hansenula, la secuencia señal de la toxina killer de K. lactis, la secuencia señal de la glucoamilasa II de S. diastaticus, la secuencia señal de la glucoamilasa de C. albicans, la secuencia señal de la fosfatasa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la toxina killer de 128 kDa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la invertasa de S. cerevisiae, así como secuencias aleatorias que son conocidas por su capacidad por reemplazar funcionalmente secuencias señales nativas de E. coli, tal y como han sido descritas por Kaiser, C. et al. (Science, 1987, 235:312-317) y secuencias señal que pueden ser identificadas usando los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo por Gallicioti, G. et al. J. Membrane Biology, 183:175-182). En una forma de realización preferida, la construcción de ADN comprende una secuencia que codifica para un polipéptido (SEQ ID NO:3) que comprende la secuencia señal del pre-profactor \alpha de S. cerevisae fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo marco de lectura con la secuencia que codifica para la \beta-galactosidasa de A. niger.
En una forma de realización preferida, la secuencia de ADN objeto de la invención comprende una secuencia que codifica un polipéptido (SEQ ID NO: 3) que contiene la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae fusionada a través de su extremo 3' con una secuencia que codifica, en el mismo marco de lectura, la \beta-galactosidasa de A. niger (SEQ ID NO: 1).
En otra forma de realización, la secuencia se encuentra bajo el control de un promotor que regula la expresión de la proteína de fusión. Promotores adecuados en el contexto de la presente invención incluyen promotores constitituvos que promueven la expresión de las secuencias asociadas a ellas de forma constante y promotores inducibles, que requieren de un estímulo externo para promover la transcripción de las secuencias asociadas a ellos.
Promotores útiles para la realización de la presente invención incluyen:
-
Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1), el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor MRP7 y el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1).
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Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneina (CUP 1) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor \alpha) según se describen en US5063154, el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1-10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de la fosfatasa (PHO5) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.
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Promotores reprimibles como por ejemplo el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S. cerevisiae cuya expresión se puede reprimir cuando se hace crecer el microorganismo en una fuente de carbono no fermentable así como promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión de la \beta-galactosidasa se verá reprimida cuando parte de la lactosa se ha hidrolizado y comienza a aumentar la concentración de glucosa en el medio, el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae y el promotor de la galactoquinasa (GAL1). Preferiblemente, el promotor que es reprimible por glucosa es el promotor del gen ADH2.
La invención también contempla el uso de aumentadores de la expresión específicos de levaduras (los denominados UAS o "upstream activating sequences") con el fin de regular la expresión de la \beta-galactosidasa. Alternativamente, se pueden utilizar promotores sintéticos híbridos que resultan de la unión de un UAS con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura. Ejemplos de promotores híbridos incluyen la región reguladora del gen ADH unido a la región de activación del promotor del gen GAP, así como promotores que comprenden las secuencias reguladoras de los promotores de los genes ADH2, GAL4, GAL10, y PHO5 combinadas con las regiones de activación de la transcripción de genes que codifican enzimas glicolíticos, tales como GAP o piruvato quinasa. Adicionalmente, promotores de levadura pueden contener promotores de otros orígenes que tienen la habilidad de unirse al RNA de levadura y de iniciar la transcripción.
En otra forma de realización, la construcción de ADN que codifica para la proteína de fusión incorpora un terminador transcripcional en dirección 3' de la secuencia que codifica para la proteína de fusión. Terminadores transcripcionales preferidos que pueden ser incorporados en la construcción que es objeto de la invención incluyen los terminadores que se encuentran en el gen de la enolasa de S. cerevisiae, en el gen CYC1 de S. cerevisiae y en el gen gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. En una forma de realización preferida, el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.
En otra forma de realización, la construcción de ADN de la invención se encuentra incorporada en un vector plasmídico. Preferentemente, la invención contempla el uso de vectores que puedan ser propagados tanto en bacteria como en levadura. Los vectores de levaduras adecuados para la presente invención pueden estar basados en los siguientes tipos de plásmidos
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Plásmidos autónomos multicopia: Estos plásmidos contienen secuencias que permiten la generación de múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser las denominadas 2 \mu, como la que aparece en los plásmidos episomales (YEp o "yeast episomal plasmids") o secuencias tipo ARS, como las que aparecen en los plásmidos de replicación (YRps o "yeast replication plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.
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Plásmidos autónomos de una única copia: Plásmidos que contienen la secuencia autónoma de replicación ARS1 y una secuencia centromérica (CEN4). Este tipo de plásmidos incluye los plásmidos centroméricos (YCps o "yeast centromere plasmids").
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Plásmidos de integración: Plásmidos que son capaces de integrarse en el genoma de la célula que los hospeda. Este tipo de plásmidos incluye plásmidos de integración (YIPs o "yeast integrating plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.
En general, todos los vectores mencionados en Sikorski ("Extrachromsomoal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae", in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G. Hardy, IRL Press, 1993) y en Ausubel et al. ("Yeast Cloning Vectors and Genes" Current Protocols in Molecular Biology, Section II, Unit 13.4, 1994) son útiles en el contexto de la presente invención.
Los vectores que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, típicamente, un origen de replicación, un gen de resistencia a antibióticos, un origen de replicación en bacterias (necesario para la propagación en bacterias), sitios múltiples de clonaje, y un marcador genético. El marcador genético es, habitualmente, un gen que confiere resistencia a un antibiótico o, alternativamente, un marcador autotrófico. En el caso de los genes de resistencia. En el caso de los marcadores autotróficos, se pueden usar los genes TRP1, URA3, LEU2, HIS3 o LYS2, que complementan defectos genéticos en las células que los portan, lo que permite a dichas células crecer en ausencia de triptófano, uracilo, leucina, histidina y lisina, respectivamente.
En otra forma de realización, la invención se relaciona con una proteína de fusión codificada por una construcción de la invención. La proteína de fusión comprende una secuencia señal y una \beta-galactosidasa heteróloga fusionadas de forma que el extremo C-terminal de la secuencia señal se encuentra fusionado con el extremo N-terminal de la \beta-galactosidasa. La secuencia señal y la \beta-galactosidasa pueden estar directamente unidas o, alternativamente, pueden estar separadas por un péptido espaciador que queda unido a la \beta-galactosidasa tras el procesamiento de la secuencia señal y que puede servir para la identificación de la \beta-galactosidasa o para su purificación del medio de cultivo. En el primero de los casos, prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. En el segundo de los casos, prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia de polihistidina, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografia de inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New Cork. Capítulo: Tagging proteins. pp. 347-377] y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. Preferiblemente, el péptido etiqueta es el epítopo FLAG (SEQ ID NO:4), y se encuentra conectado al extremo C-terminal de la secuencia señal y al extremo N-terminal de la \beta-galactosidasa, de forma que tras la eliminación de la secuencia señal, el epítopo FLAG forma el extremo N-terminal de la \beta-galactosidasa.
La invención contempla proteínas de fusión que comprenden una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 20 a 1026 de la proteína de SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 1 a 1005 de la proteína según la secuencia de SEQ ID NO:4, así como a variantes funcionalmente equivalentes de las mismas resultantes de la adición, sustitución o eliminación de uno ó mas aminoácidos contiguos o no contiguos, siempre que las variantes muestren un mínimo de de un 70% de identidad con la secuencia de referencia a lo largo de toda la secuencia calculado usando la herramienta "BLAST 2 Sequences" Version 2.0.9 (07-May-1999) con sus parámetros por defecto. Así, la secuencia variante puede mostrar un grado de identidad con la secuencia de referencia de por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% o más identidad a lo largo de toda la secuencia. Una variante se puede describir como alélica, de procesamiento, de especie o polimórfica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una cepa de levadura que contiene la construcción de ADN según la invención, el vector de la invención o la proteína de fusión según la invención. Por levadura se entiende cualquier organismo eucariota perteneciente al tipo de los ascomicetes que incluye los organismos conocidos de forma general como levaduras así como los conocidos de forma general como hongos filamentosos. Las levaduras y los hongos filamentosos incluyen Pichia sp (P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membranaefaciens, P. minuta, P. opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria, P. guercuum, P. pijperi, P. stiptis, P. methanolica), Saccharomyces (S. cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, and K. marxianus; K. yarrowia), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. oryzae), Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera, Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp. (for example, Kluyveromyces lactis), Candida albicans, Aspergillus sp (for example, Aspergillus nidulans, Aspergillum niger, Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei, Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (por ejemplo, Fusarium gramineum, Fusarium venenatwn), Physcomitrella patens.
Para la obtención de las cepas de la invención, es necesario introducir el vector que contiene la construcción en la célula de levadura. Métodos adecuados para introducir una molécula de ADN en una célula de levadura incluyen:
-
Transformación de esferoplastos, lo que implica eliminar la pared celular de la levadura y poner en contacto las esferoplastos con el plásmido en presencia de PEG.
-
Transformación con Li^{+}, que implica el tratamiento de células de levadura con cationes alcalinos monovalentes (Na^{+}, K^{+}, Rb^{+}, Cs^{+} y Li^{+}) en combinación con PEG para estimular la captación del ADN por las células intactas.
-
Electroporación, que implica la administración de pulsos electrónicos a las levaduras lo que resulta en la apertura de poros en la membrana de esferoplastos y de células de levadura intactas.
Las cepas de la invención son capaces de producir y secretar al medio \beta-galactosidasa. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir \beta-galactosidasa que comprende cultivar una cepa de levadura de acuerdo a la invención y recuperar la \beta-galactosidasa del medio de cultivo.
La proteína \beta-galactosidasa puede purificarse convenientemente en un único paso de cromatografia de afinidad mediante usando análogos de sustrato, como por ejemplo, el p-aminofenil-\beta-D-tiogalactopiranosido (Steers, E. et al, 1970, J. Biol. Chem. 246:196-200). La purificación de \beta-galactosidasa de K. lactis y sus variantes se puede realizar usando métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo, los métodos descritos por Becerra et al. (Biological Procedures Online, 1998, 1:48-58), por da Silva, M.E. y Franco, T.T. (Rev. Microbiol. 1999, 30:324-331). La purificación de la \beta-galactosidasa de A. niger se puede realizar usando métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo, los métodos descritos por Greenberg, N.A. y Mahoney, R.R. (J. Food Science, 1981, 46:684-687), por Tanaka, Y et al. (J. Biochem., 1975, 77:241-247), por van Casteren W.I-LM et al. (Carbohydrate Research, 2000, 329: 75-85), por Widmer, F y Leuba, J.L. (Eur. J. Biochem. 1979, 100:559-567) o por Lazaris-Karatzas, A. (US5821350).
La determinación del grado de pureza de la \beta-galactosidasa se puede estimar mediante el valor de la actividad enzimática específica que se calcula dividiendo el número de unidades de actividad enzimática entre la cantidad de mg de proteína en un volumen determinado. Preferiblemente, la actividad enzimática se determina mediante el método de Guarente, L. (Methods Enzymol. 1983, 101:181-191).
A la vista de que las cepas de la invención son capaces de crecer en un medio con lactosa como única fuente de carbono, las cepas son útiles para la obtención de los monosacáridos integrantes de la lactosa, esto es, glucosa y galactosa a partir de un medio de cultivo rico en lactosa. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener glucosa y/o galactosa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la glucosa y/o la galactosa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína consistente en los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína consistente en los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma preferida de realización, la secuencia señal heteróloga que se usa para permitir la secreción de la \beta-galactosidasa en el método de producción de glucosa y/o galactosa de acuerdo a la invención es la secuencia señal del preprofactor alfa de S. cerevisiae, correspondiente al polipéptido definido por SEQ ID NO:3.
Según la presente invención, por medio rico en lactosa se entienden medios que contienen al menos 0,5% (p/v) de lactosa, preferiblemente más al menos 1,0% (p/v). Los medios ricos en lactosa que pueden ser utilizados como fuente de carbono en el contexto de la presente invención incluyen tantos medios sintéticos como productos naturales y sus derivados.
Medios sintéticos o semisintéticos que pueden ser usados en el contexto de la presente invención incluyen YPL;
que contiene 1% extracto de levadura, 2% bactopeptona y una cantidad de lactosa que varia entre el 0,5% y
el 6%.
Productos naturales ricos en lactosa que se pueden usar como medio de cultivo para las cepas de la presente invención incluyen la leche y derivados de la misma, tales como leche desnatada, el suero resultante de la preparación de mantequilla (buttermilk), el suero resultante después de la precipitación de la caseína o el permeado de un producto lácteo, que puede ser un permeado de leche o un permeado de suero. La presente invención contempla el uso de leche de prácticamente cualquier origen, incluyendo, sin estar limitado, la leche de vaca, humana, de cabra, de oveja, de camello, de búfala y similares. Preferiblemente, la leche es sometida a tratamiento con cuajo de origen animal (extracto obtenido del cuajar del estómago de rumiantes), de origen vegetal o recombinante y a temperaturas de entre 30 a 40ºC, lo que resulta en la coagulación de la caseína de la leche que arrastra la mayor parte de la fracción grasa de la misma. Tras la eliminación del coágulo, se obtiene el suero, que puede ser usado tal cual como (el llamado "suero dulce") o puede ser sometido a un proceso de deproteinización adicional, por ejemplo, mediante ultrafiltración u otras técnicas de separación basadas en membranas porosas con un límite de separación de 17-20 kDa. Asimismo, la invención contempla el uso del llamado suero ácido, resultante de la precipitación de las proteínas de la leche en medio ácido, así como el suero resultante de la eliminación de la fracción grasa de la leche (el denominado en inglés "buttermilk").
El suero de la leche puede ser concentrado mediante pulverización en aerosol para dar lugar a fracciones con un mayor contenido en materia sólida seca que el suero original, incluyendo un producto sólido denominado permeado de suero. Contenidos típicos en materia sólida seca varían desde un 5 a 6% en el suero, pasando por valores superiores a 30%, en particular, entre 50 y 60% de los concentrados. La concentración de lactosa varia entre 70 y 75% del total de materia sólida seca en el caso del suero dulce y llega hasta valores de entre 82 y 86% en el caso de los permeados de suero.
La glucosa y/o galactosa que se forman como resultado de la hidrólisis de la lactosa se pueden recuperar del medio de cultivo usando técnicas ampliamente conocidas por el experto en la materia. Preferiblemente, la glucosa y galactosa se purifican mediante adsorción con preparaciones de carbón activo con distintas propiedades o usando membranas de cerámica.
\newpage
La lactosa del medio de cultivo es digerida por las cepas de la invención para dar glucosa y galactosa que, a su vez, son sustratos adecuados para la fermentación alcohólica produciéndose etanol u otros compuestos. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar el producto de fermentación del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína consistente en los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína consistente en los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma preferida de realización, la secuencia señal heteróloga que se usa para permitir la secreción de la \beta-galactosidasa en el método de producción de un producto de fermentación de acuerdo a la invención es la secuencia señal del preprofactor alfa de S. cerevisiae, correspondiente al polipéptido definido por SEQ ID NO:3.
Por producto de fermentación se entiende en el contexto de la presente invención que pueda ser obtenido a partir de una levadura a partir de un azúcar en condiciones anaerobias. Productos de fermentación que pueden ser obtenidos usando las cepas y métodos de la presente invención incluyen alcoholes (etanol, metanol, butanol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico), cetonas (por ejemplo, acetona), aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico), gases (H_{2} y CO_{2}), antibióticos (penicilina, tetraciclina), etc. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación es etanol, que puede ser usado como combustible, en bebidas o a nivel industrial. Típicamente, la fermentación alcohólica para dar lugar a etanol se lleva a cabo durante 30-60 h a una temperatura de en tomo a 32ºC.
Las condiciones de cultivo para la producción de productos de fermentación son esencialmente las mismas que las usadas en la producción de glucosa/galactosa, en lo que se refiere a los medios de cultivo ricos en lactosa que pueden ser usados como fuente de carbono. Sin embargo, con objeto de mejorar el rendimiento de la reacción, es importante que las condiciones de cultivo sean aquellas que favorecen la fermentación de los monosacáridos. Así, la invención contempla el crecimiento de las cepas en condiciones de baja concentración de oxígeno, con el fin de proporcionar los requerimientos oxidativos mínimos para permitir la viabilidad de las levaduras y, a la vez, favorecer al máximo la conversión anaerobia del azúcar en alcohol. Típicamente, la fermentación se lleva cabo en un medio de cultivo que contiene O_{2} en solución a una concentración inferior a 500 ppb, preferiblemente menos de 250 ppb y, más preferiblemente, menos de 50 ppb. Preferiblemente, la fermentación se deja transcurrir hasta que la concentración de etanol
en el medio sea de al menos 0.01 g/l, preferiblemente de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ó 1 g/l.
Una vez se haya alcanzado la concentración adecuada de producto de fermentación en el medio, es necesario recuperar dicho producto del medio. La forma de recuperar el producto dependerá de la naturaleza química del producto. En el caso de que el producto de fermentación sea etanol, éste se recupera usando técnicas convencionales entre las que se incluyen, por ejemplo, la destilación.
Las cepas de la invención son capaces de crecer en medios que contienen lactosa como única fuente de carbono. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener biomasa a partir de una composición rica en lactosa que comprende
a.
cultivar una cepa de levadura que comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende la forma madura de una \beta-galactosidasa fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
b.
recuperar la biomasa del medio de cultivo
\vskip1.000000\baselineskip
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
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Las condiciones de cultivo y los medios ricos en lactosa preferidos son los descritos anteriormente.
La biomasa se puede recuperar del medio de cultivo mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia incluyendo, sin estar limitado, centrifugación, depósito o filtración. Preferiblemente, la técnica empleada debe minimizar al máximo el daño a las células. En caso de que el mismo cultivo se use para la preparación de biomasa y de etanol, la separación de la biomasa de células de levaduras debe minimizar al máximo la pérdida de etanol.
Típicamente, la levadura recuperada del medio de cultivo es lavada con una solución acuosa para eliminar materiales indeseados que pudiesen estar asociados a la levadura. Preferiblemente, el contenido de proteína en la levadura es de entre 35 y 65%. La biomasa de levadura recuperada se puede utilizar como ingrediente en productos alimenticios sin necesidad de procesamiento adicional. La biomasa recuperada también se puede lisar y, opcionalmente, separar las células intactas. Las células de levadura lisadas pueden ser usadas en medios de cultivo como extracto de levadura o pueden ser procesadas adicionalmente para separar sus distintos componentes, tales como péptidos, nucleótidos, aminoácidos o componentes específicos de la pared celular tales como quitina, glucanos, mananos y oligosacáridos.
En una forma preferida de realización, la secuencia señal heteróloga que se usa para permitir la secreción de la \beta-galactosidasa en el método de producción de biomasa de acuerdo a la invención es la secuencia señal del preprofactor alfa de S. cerevisiae correspondiente al polipéptido definido por SEQ ID NO:3.
Los métodos de producción de glucosa y/o galactosa, de producción de biomasa y de producción de un producto de fermentación de acuerdo a la invención pueden llevarse a cabo usando una construcción de ADN que contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión, preferiblemente, un promotor que está sujeto a represión en presencia de glucosa y, más preferiblemente, el promotor del gen ADH2. Adicional o alternativamente, la construcción de ADN que se usa en el contexto de la invención contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional, preferiblemente, el terminador del gen CYC1. Como medio de cultivo rico en lactosa para llevar a cabo los métodos anteriormente mencionados, la invención contempla el uso de suero de leche o permeado de suero de leche.
Las cepas de la presente invención pueden ser usadas no sólo para la obtención de productos derivados de la lactosa y de los monosacáridos que la integran, sino que también pueden ser transformadas con un segundo vector de expresión que contiene un gen que codifica una proteína de interés y así ser utilizadas para la producción de proteínas de interés mediante el cultivo de dichas cepas doblemente transformadas en un medio de cultivo que contiene lactosa como única fuente de carbono.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una cepa de levadura que comprende
(i)
una primera construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
a.
una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de
1.
una proteína consistente en los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
2.
una proteína consistente en los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
3.
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias
b.
una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura (ii) una segunda construcción de ADN que codifica para una proteína de interés operativamente acoplada a un promotor que permite la expresión de dicha proteína en levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida, la secuencia señal heteróloga es la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae. Los vectores de expresión en levaduras que pueden ser usados para la expresión de las proteínas heterólogas son esencialmente los mismos que se pueden usar para la expresión de la proteína de fusión con la \beta-galactosidasa. Así, en una forma preferida, el promotor que regula la transcripción de la proteína de fusión es un promotor que esta sujeto a represión en presencia de glucosa, preferiblemente, el promotor del gen ADH. Sin embargo, es conveniente que los dos vectores tengan marcadores de selección diferentes para asegurarse que ambos permanecen de forma estable en las levaduras. Adicionalmente, los promotores que regulan la expresión de la proteína heteróloga pueden ser los mismos que se usan para regular la expresión de las proteínas de fusión, según se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, se usan promotores distintos en las dos construcciones de forma que se pueda regular independientemente la expresión de la \beta-galactosidasa y de la proteína heteróloga. Preferiblemente, en aquellos casos en los que se sospeche que la proteína heteróloga pudiese ser tóxica para la célula hospedadora, el promotor usado para regular su expresión es convenientemente un promotor regulable, de forma que se pueda retrasar la expresión de la proteína de interés hasta que se han alcanzado niveles suficientes de biomasa. Adicional o alternativamente, la construcción de ADN que codifica las proteínas de fusión y la construcción de ADN que codifican la proteína de interés contienen, adicionalmente, un terminador transcripcional, preferiblemente, el terminador del gen CYC1. Como medio de cultivo rico en lactosa para llevar a cabo los métodos anteriormente mencionados, la invención contempla el uso de suero de leche o permeado de suero de leche.
Las proteínas de interés pueden carecer de secuencia señal o, alternativamente, pueden sintetizarse con una secuencia señal con el fin de provocar su liberación al medio de cultivo y así facilitar su recuperación. Secuencias señales que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen esencialmente las mismas que se pueden usar para promover la secreción la \beta-galactosidasa.
Las cepas doblemente transformadas pueden ser utilizadas convenientemente para la producción de proteínas de interés usando lactosa como fuente principal de carbono. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de una proteína de interés que comprende las etapas de
a.
cultivar una cepa de levadura doblemente transformada de acuerdo a la invención en un medio rico en lactosa y
b.
recuperar la proteína de interés del medio.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida, el medio rico en lactosa es suero de leche o permeado de suero de leche.
Prácticamente no existe limitación con respecto a la proteína de interés que puede ser expresada usando las cepas y métodos de la presente invención. Estas incluyen tanto proteínas humanas y de mamíferos de interés terapéutico como enzimas de distintos orígenes que permitan reconstituir vías metabólicas en levadura y la consiguiente producción de compuestos de interés.
Ejemplos de proteínas de interés terapéutico que pueden ser producidas por las células que forman parte de las microcápsulas objeto de la invención son eritropoietin (EPO), hormona liberadora de hormona adrenocorticotropa (CRH), hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina (PIH), somatostatina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina, colecistoquinina (CCK), secretina, factor de crecimiento de tipo insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento de tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH), insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP), leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II, factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X, trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleuquina 1 (IL-1), factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-\alpha), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8 y quemoquinas), interleuquina 12 (IL-12), interleuquina 16 (IL-16), interferones \alpha, \beta, gamma, factor de crecimento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta), proteínas morfogenéticas del Hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y relacionados), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento glial, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial, antitripsina 1 alfa, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF), ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina, superoxide dismutasa y imiglucerasa.
Alternativamente, las cepas de la invención pueden ser modificadas para expresar enzimas implicadas en la síntesis de compuestos de interés como, por ejemplo, el ácido ascórbico, resveratrol, ácido docosahexanoico, ácidos grasos poliinsaturados, ácido láctico, S-adenosil metionina, riboflavina, esteroides, ácido gamma-linolénico, ácidos dicarboxílicos, eritritol, poliquétidos, ergosterol, astaxantina, inositol, estreptomicina y similares, tal y como se describe en WO 2006/134374, WO2006/089898, WO/2006/064317, WO2006/012326, WO 2003/102152, WO 2002/079381, WO1994/011515, US7033779, WO2006033723, GB1300455, US2002034795, US2002142400, RU2235777,
US5972642 y US5529912.
Las cepas de la invención pueden ser humanizadas de forma que expresen proteínas de interés cuyo patrón de glicosilación sea lo mas parecido posible al humano o eucariota superior. La humanización se puede conseguir mediante la eliminación de enzimas de glicosilación endógenas a la levadura y/o administrando enzimas exógenos. Así, una cepa de levadura de acuerdo a la invención se puede modificar adicionalmente para que exprese una o más enzimas de glicosilación, de forma que se obtenga una alta proporción de los N-glucanos de interés. Estos enzimas pueden ser dirigidos a un orgánulo particular de forma que la enzima muestra una actividad óptima. Adicionalmente, las células se pueden modificar de forma que expresen transportadores de azúcar y nucleótido difosfatasas, que aumentan la eficiencia de las reacciones de glicosilación mediante la aportación de los substratos adecuados. Por ejemplo, las cepas de levadura de la invención pueden ser modificadas o seleccionadas de forma que carezcan de actividad 1,6-manosil transferasa, que añadirían restos de manosa a los N-glucanos de las proteínas, y de forma que incluyan un ácido nucleico heterólogo que codifique una \alpha-1,2-manosidasa, lo que permite la producción de glucoproteínas recombinantes con una alta proporción de N-glucanos del tipo Man_{5}GlcNAc_{2} típicos de células eucariotas superiores. Adicionalmente, las células pueden incorporar un ácido nucleico exógeno que codifique una alfa-1,2-manosidasa, lo que permite la producción de proteínas glicosiladas con un alto porcentaje en N-glicanos del tipo GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Adicionalmente, la célula puede contener un ácido nucleico ectópico que codifique una manosidasa II, lo que permite la producción de glucoproteínas con N-glicanos del tipo GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}. Adicionalmente, las cepas de la invención pueden contener un ácido nucleico heterólogo que codifique una proteína con actividad GlcNAc transferasa H, de forma que los N-glucanos mayoritarios de las glicoproteínas sean del tipo GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}. Adicionalmente, las cepas de la invención pueden contener una o más actividades que modifican los N-glucanos de las células de forma que se obtengan N-glucanos híbridos o complejos semejantes a los que aparecen en proteínas humanas. En particular, las cepas de la invención pueden ser modificadas para expresar, por ejemplo, enzimas con actividad sialiltransferasa, manosidases de clase II y III, GlcNac transferasa, galactosa transferasa, UDP difosfatasa, GDP difosfatasa y transportador de UDP-GlcNAc.
Prácticamente cualquier método conocido en la técnica puede ser utilizado para la recuperación de la proteína de interés del interior celular o del medio de cultivo. Si la proteína se produce en el interior de la célula de levadura, es necesario lisar las células para liberar las proteínas de interés. Convencionalmente, las células de levaduras, se lisan mediante lisis hipotónica de esferoplastos formados previamente mediante tratamiento con glucanasas, mediante sonicación o mediante agitación en presencia de bolas de vidrio. Una vez que la proteína de interés se encuentra en el medio, bien mediante liberación del interior celular bien porque la proteína es secretada por la propia maquinaria de secreción de la levadura, se emplean métodos convencionales para la purificación de dicha proteína, incluyendo, sin estar limitado, cromatografia (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrofóbica, de filtración en gel, HPLC), métodos electroforéticos (isoelectroenfoque preparativo, electroforesis preparativa en geles de poliacrilamida-SDS), solubilidad diferencial (precipitación con sulfato amónico), ultracentrifugación preparativa en gradiente de sacarosa. Una vez que se ha alcanzado el grado deseado de pureza, lo que puede requerir más de un paso cromatográfico, es frecuente que sea necesario concentrar la proteína o eliminar sales e iones que puedan ser perjudiciales para su posterior uso. En ese caso, se recurre a técnicas conocidas, tales como liofilización o ultrafiltración.
La invención se describe a continuación mediante unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Vectores y cepas
A partir de las secuencias de los genes LAC4 (Poch et al., 1992, Gene, 118: 55-63) y LACA (Kumar et al, 1992, Bio/Technology, 10: 82-85.) que codifican para las \beta-galactosidasasa de K. lactis y de A. niger respectivamente, se diseñaron unos oligonucleótidos cebadores con el fin de amplificar los genes mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente ligarlos a un vector de expresión de levaduras obteniendo los plásmidos correspondientes. El vector contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa de levaduras (ADH2) que es regulado mediante represión por glucosa, una secuencia que codifica un polipéptido de 85 aminoácidos (SEQ ID NO:3) que comprende la secuencia señal del preprofactor \alpha de levaduras, una secuencia que codifica el péptido FLAG (SEQ ID NO: 4) y el terminador transcripcional del gen CYCI. Con las construcciones resultantes se transformó usando el método del acetato de litio de Ito et al. (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153: 163-168.) una cepa de Saccharomyces cerevisiae (pep4::HIS3 prb-\DeltaI.6R HIS3 lys2-208 trpl-\Delta101 ura3-52 ga12 can1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Medios y condiciones de cultivo
Con las cepas recombinantes obtenidas, se realizaron cultivos en un medio CM (Zitomer y Hall, 1976, J. Biol. Chem., 251: 6320-6326) sin el correspondiente aminoácido (triptófano) empleado como marcador auxotrófico. Cuando alcanzaron la fase de crecimiento estacionaria se utilizaron para inocular medios en matraces Erlenmeyer de 250 ml de capacidad conteniendo 100 ml de permeado de suero de leche o YPL (Extracto de levadura al 1%, Bactopeptona 2%) a dos concentraciones diferentes de lactosa, al 4%, concentración similar a la que se encuentra en el suero de leche, y al 6%. El suero de leche se obtuvo de una empresa láctea local (Quegalsa, Ferrol, A Coruña) y se almacenó a -20ºC. Antes de su uso, se esterilizó en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos y se eliminaron las proteínas por centrifugación (15 minutos, 10.000 rpm). La concentración de lactosa en el suero de leche empleado fue de unos 40 g/Litro. Todos los cultivos ensayados se realizaron a 30ºC, con una agitación orbital de 250 rpm y partiendo de una absorbancia a 600 nm inicial de 0,05. Se determinaron los valores de absorbancia a 600 nm, actividad \beta-galactosidasa extracelular e intracelular, consumo de lactosa y producción de etanol a diferentes intervalos de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Comprobación de la estabilidad plasmídica
Para la determinación de la estabilidad del plásmido en las levaduras transformadas se tomaron muestras a diferentes tiempos de cultivo, se hicieron diluciones dependiendo de la fase de cultivo en que se encontrase y se sembraron 100 y 1 en placas CM. Se dejaron crecer a 30ºC y se realizó una réplica en placas CM sin el aminoácido utilizado como marcador auxotrófico (triptófano), determinando la proporción de células viables.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Determinación de concentraciones de lactosa y de etanol y de la actividad \beta-galactosidasa
Para la determinación de lactosa y etanol se utilizó un test comercial (Roche) siguiendo las instrucciones del proveedor. La determinación de la actividad \beta-galactosidasa se realizó siguiendo el método de Guarente (Guarente, L., 1983, Methods in Enzymology, 101: 181-191). La Unidad Enzimática (U. E.) se definió como la cantidad de enzima que libera un \mumol de o-nitrofenol por minuto en las condiciones del ensayo. Las unidades se dan como U.E/ml de medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Producción de \beta-galactosidasa, etanol y biomasa
Se muestran en la Figura 1 los resultados de producción de etanol y biomasa de la cepa recombinante que contiene el gen LAC4 creciendo en YPL al 4%. Esta cepa secreta cantidades apreciables de \beta-galactosidasa de K. lactis al medio de cultivo (unas 0,65 U.E/ml de media) y es capaz de crecer eficientemente en medios con más de 60 gramos de lactosa por litro, sin mostrar el crecimiento diaúxico típico de las células de S. cerevisiae creciendo sobre lactosa prehidrolizada. Presentó al finalizar el tiempo de cultivo ensayado un consumo de lactosa de 29,3 g a las 143 horas para los cultivos al 4% de lactosa (Figura 1) y 22,1 g y 39,3 g a las 168 horas para los cultivos al 6% de lactosa y permeado de suero de leche, respectivamente. La enzima liberada permitió la hidrólisis de la lactosa extracelularmente y, por tanto, su consumo por las células presentó un tiempo de duplicación medio de unas 2,9 horas, superior a los tiempos de duplicación descritos para en cepas de S. cerevisiae que metabolizan la lactosa (Rubio-Texeira et al., 2006, Biotechnol, Adv., 24: 21 2-225).
La estabilidad plasmídica fue alta, un 58% a las 120 horas en YPL al 4%. Por tanto la estabilidad genética, no supondría inconvenientes para su aplicación industrial. Los rendimientos de producción de biomasa de levadura por lactosa consumida fueron superiores en permeado de suero de leche (0,42 gramos células peso seco/gramos lactosa) que en los medios YPL (0,16 gramos células peso seco/gramos lactosa en YPL al 4% y 0,3 1 gramos células peso seco/gramos lactosa en YPL al 6%). Los rendimientos de producción de etanol por lactosa consumida fueron del 2,7% en YPL al 4% (Figura 1) y 0,6% en YPL al 6%.
Se muestra en la figura 2 la producción de \beta-galactosidasa extracelular, etanol y biomasa por la cepa recombinante que contiene el gen LACA creciendo en YPL al 1%.
<110> UNIVERSIDADE DA CORUÑA
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> CEPAS DE LEVADURA CAPACES DE SECRETAR BETA-GALACTOSIDASA AL MEDIO Y SU USO PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA, ETANOL, BETA-GALACTOSIDASA Y PROTEINAS DE INTERES
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2999ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1006
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
1
2
3
4
5
6
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1025
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces lactis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
8
9
10
11
12
13
14 
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. cerevisiae 
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<400> 3
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epitopo FLAG
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<400> 4
\hskip1cm
17

Claims (35)

1. Una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
(i)
una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dicha secuencia y
(ii)
una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura.
2. La construcción de la reivindicación 1 en la que la secuencia señal comprende la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae.
3. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.
4. La construcción según la reivindicación 3 en la que el promotor que está sujeto a represión en presencia de glucosa.
5. La construcción según la reivindicación 4 en la que el promotor es el promotor del gen ADH2.
6. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un terminador transcripcional.
7. La construcción según la reivindicación 6 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.
8. Un vector plasmídico que contiene una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una proteína de fusión codificada por una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una cepa de levadura que contiene una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector según la reivindicación 8 o una proteína de fusión según la reivindicación 9.
11. Un método para producir \beta-galactosidasa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura que contiene una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la \beta-galactosidasa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dicha secuencia.
12. Un método para obtener glucosa y/o galactosa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la glucosa y/o la galactosa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
13. Un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar el producto de fermentación del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
a)
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
b)
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
c)
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
14. Un método según la reivindicación 13 en el que el producto de fermentación es etanol.
15. Un método para obtener biomasa que comprende las etapas de
(i)
cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una \beta-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la \beta-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii)
recuperar la biomasa del medio de cultivo,
\quad
en donde la \beta-galactosidasa se selecciona del grupo de
1.
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
2.
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
3.
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae.
17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.
18. Un método según la reivindicación 17 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.
19. Un método según la reivindicación 18 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.
20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.
21. Un método según la reivindicación 20 en el que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.
22. Un método según las reivindicaciones 11 a 21 en donde la composición rica en lactosa es suero de leche o permeado de suero de leche.
23. Una célula de levadura que comprende
(i)
una primera construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
a.
una \beta-galactosidasa seleccionada del grupo de
1.
una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1
2.
una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y
3.
una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.
b.
una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la \beta-galactosidasa de una célula de levadura
(ii)
una segunda construcción de ADN que codifica para una proteína de interés operativamente acoplada a un promotor que permite la expresión de dicha proteína en levadura.
24. Una célula de levadura según la reivindicación 23 en la que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae.
25. Una célula de levadura según las reivindicaciones 23 ó 24 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.
26. Una célula de levadura según la reivindicación 25 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.
27. Una célula de levadura según la reivindicación 26 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.
28. Una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.
29. Una célula de levadura según la reivindicación 28 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC 1.
30. Un método para la obtención de proteínas heterólogas que comprende las etapas de
a.
cultivar al menos una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29 en un medio rico en lactosa
b.
recuperar la proteína heteróloga del medio.
31. Un método según la reivindicación 30 en el que el medio rico en lactosa es suero de leche.
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