CN101528931A - 改进的用于产生多肽的α因子信号肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生多肽的方法，包括使用变体α因子信号肽，其在位置9中具有取代，导致将A取代为T、S、H、I、F、E或。本发明还涉及核酸构建体，其包含编码所述变体信号肽的第一核苷酸序列和编码多肽的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列对于第一核苷酸序列是外源的。此外，本发明还涉及包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。

Description

改进的用于产生多肽的α因子信号肽
对序列表的涉及
本发明包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入。
发明领域
本发明涉及产生和分泌多肽的方法，还涉及包含编码信号肽和所述多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸构建体，以及包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。
发明背景
在真菌宿主细胞中，尤其是丝状真菌细胞如曲霉属(Aspergillus)或酵母细胞如酵母属(Saccharomyces)中重组产生异源蛋白可以为产生商业相关量的所述蛋白提供更理想的手段。
异源蛋白的重组产生通常通过构建表达盒来实现，在所述表达盒中将编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下，所述启动子自受调节的基因切下，适合于所述宿主细胞。将所述表达盒引入宿主细胞。然后通过在所述表达盒上包含的启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现所述异源蛋白的产生。
改进蛋白质的重组产生通常需要可用的新调节序列，该调节序列适合于调控宿主细胞中所述蛋白质的表达。一种这样的调节序列包括编码酵母α因子信号肽的序列，其最先记载于Kurjan和Herskowitz(Cell，vol.30：933-943，1982)中。随后证明了这种信号肽可以作为常规分泌信号应用，用于异源多肽在酵母中的产生(EP 0 116 201 B1)。
Allison和Young(Molecular and Cellular Biology，1989，vol：9(11)p.4977-4985)描述了α因子信号序列中突变的作用。描述的所有突变均导致了α因子降低至1/2-1/12。
本发明的目的是提供改进的用于在真菌宿主细胞中产生多肽的方法，所述方法使用酵母α因子信号肽的衍生物。
发明内容
本发明提供用于提高分泌性多肽的产生的方法，包括：(a)在有益于所述多肽产生的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码信号肽的第一核苷酸序列，其与编码所述多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于所述第二核苷酸序列是外源的，所述第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列是选自编码α因子信号肽的核苷酸序列，其中所述α因子信号肽具有至少一个在位置9对丙氨酸进行的取代；和(b)从所述培养基分离所述分泌性多肽。
在第二个方面，本发明涉及所述α因子信号肽的分离的变体，其中所述位置9的氨基酸，或通过与野生型序列比对确定的相应位置的氨基酸，经过修饰而包括一个选自下组的取代：A9T、A9S、A9H、A9I、A9F和A9G。
另外，本发明提供核酸构建体，其包含编码信号肽的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于所述第二核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列选自编码本发明的信号肽的核苷酸序列。
本发明还提供包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞。
在最后的方面，本发明涉及改进的信号肽用于产生多肽的用途，其中所述信号肽由第一核苷酸序列编码，并且所述多肽由第二核苷酸序列编码，所述第二核苷酸序列对于所述第一核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且其中所述第一核苷酸序列选自编码α因子信号肽的核苷酸序列，其中所述α因子信号肽具有至少一个在位置9对丙氨酸进行的取代。
发明详述
定义
术语“变体”在本发明的上下文中当涉及另一种多肽或核苷酸序列使用时应该被理解为与另一种多肽相比包含一个或几个氨基酸或核苷酸的取代、缺失和/或插入的多肽或核苷酸序列(即，它是与它进行比较的多肽/核苷酸序列的变体)。具体而言，所述改变可以是性质上较不重要的(of minor nature)，如：不显著影响多肽活性的保守氨基酸取代，或就核苷酸序列而言导致保守氨基酸取代的取代；或小缺失，通常为1至约20个氨基酸，其依赖于进行改变的多肽的大小。在目前的情况下，所述信号肽仅19个氨基酸。因此小缺失的范围是1-3个氨基酸。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，以及这些的相反情况。
所述第一核苷酸序列编码本发明的信号肽。术语“信号肽”或“信号肽序列”在本文定义为通常存在于新合成的分泌性或膜多肽N末端的肽序列，该序列指导所述多肽跨过或进入细胞的细胞膜(原核生物的质膜和真核生物的内质网膜)。随后通常将其去除。具体而言，所述信号肽可能能够指导所述多肽进入细胞的分泌途径。
根据本发明的α因子信号肽是源于酵母的信号肽，并且在Kurjan和Herskowitz(Cell，vol.30：933-943)中有描述。野生型α因子氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。
术语“可操作地连接”在本文定义为这样一种构型，其中将调控序列例如信号肽序列适当地置于与编码序列相关的位置，由此使所述调控序列指导由所述编码序列编码的多肽的产生。
术语“编码序列”在本文定义为当置于适当调控序列的控制下时翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界通常由位于开读框开始处(5’端)的起始密码子和位于开读框3′端的终止密码子确定。编码序列可以包括，但不限于，基因组DNA、cDNA、RNA、半合成、合成和重组核苷酸序列。
两个氨基酸序列之间的相关度由参数“同一性”描述。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序来确定。Needle程序执行总体比对算法，所述算法描述于Needleman S.B.和Wunsch C.D.(1970)，J.Mol.Biol.48，443-453中。所使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口产生罚分(gap opening penalty)是10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
本发明的氨基酸序列(“本发明序列”，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸1至19)和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度，是以两种序列的比对中精确匹配的数目除以“本发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个而计算的。结果以百分比同一性表示。
当“本发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配(在下文的比对实例中以“|”表示)。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如，SEQ ID NO：2的长度是19)。
在下文纯假设性的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口用“-”表示。
假设性比对实例：
序列1：ACMSHTWGER-NL         SEQ ID NO：15
           | |||  ||
序列2：    HGWGEDANLAMNPS    SEQ ID NO：16
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80：726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，其中使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分为10，并且缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，和窗口(windows)＝20。
在具体的实施方案中，多肽的氨基酸序列与或对于SEQ ID NO：2的氨基酸1-19的同一性百分比通过如下确定，通过i)使用Needle程序比对所述两个氨基酸序列，其中使用BLOSUM62取代矩阵，缺口产生罚分为10，并且缺口延伸罚分为0.5；ii)计数比对中的精确匹配数目；iii)用精确匹配的数目除以两个氨基酸序列中较短者的长度，和iv)将iii)中除法的结果转化成百分数。与或对于本发明其它序列(例如SEQ ID NO：3的氨基酸1-19)的同一性百分比以类似方式计算。
本发明的方法
本发明涉及用于增加分泌性多肽产生的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码信号肽的第一核苷酸序列，该序列与编码所述多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于第二核苷酸序列是外源的，所述第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列选自编码α因子信号肽的核苷酸序列，其中所述α因子信号肽具有至少一个在位置9对丙氨酸进行的取代；和(b)从培养基中分离所述分泌性多肽。
在本发明的方法中，使用本领域已知的方法将真菌宿主细胞培养在有益于所述多肽产生的培养基中，即培养在适合于所述多肽产生的营养培养基中。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法，在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。
在本发明的方法中，当在相同的产生条件下培养时，相对于含有与编码所述多肽的核苷酸序列可操作地连接的天然信号肽序列的真菌细胞，所述真菌宿主细胞具体而言可以产生多至少约25％的多肽，更特别是多至少约50％，更特别是多至少约75％，更特别是多至少约100％，甚至更特别是多至少约200％，最特别是多至少约300％，甚至更特别是多至少约400％，甚至更特别是多至少约500％，并且甚至最特别是多至少约700％的多肽。
所得分泌性多肽可以通过本领域已知的方法直接从培养基回收。例如，可以通过常规方法，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基回收多肽。
所述多肽可以通过多种本领域已知的多种方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
信号肽
多肽编码序列的5′端可以包含编码信号肽的天然核苷酸序列，该序列与编码多肽成熟形式(或前肽形式(pro-form))的核苷酸序列区段天然相连。本发明的信号肽可以取代所述天然信号肽。
在本发明的方法中，所述信号肽序列对于编码感兴趣的多肽的核苷酸序列是外源的，但是所述信号肽序列或核苷酸序列对于真菌宿主细胞可以是天然的。在本上下文中，术语“外源的”应该理解为非所述多肽固有的信号肽，即，所述信号肽源自所述多肽之外的另一个基因。
在一个实施方案中，所述第一核苷酸序列可以编码改进的信号肽，所述改进的信号肽具有SEQ ID NO：1的变体的氨基酸序列，并且能够指导多肽进入或跨过细胞膜(下文的“同源信号肽”)，例如进入细胞分泌途径。SEQ IDNO：1显示了与来自酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子连接(associated)的正常信号肽，如Kurjan和Herskowitz(Cell vol.30：933-943，1982)中所述。在具体的方面，根据本发明的信号肽变体可以具有与SEQ ID NO：1有一个氨基酸不同的氨基酸序列。具体而言，所述第一核苷酸序列可以编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的信号肽，或编码该信号肽的能够指导多肽进入或跨过细胞膜(例如进入细胞的分泌途径)的片段，并且其中已经将位置9的丙氨酸(A9A)用另一种氨基酸取代。在更具体的方面，位置9的这种取代包括选自下组的取代：A9T、A9S、A9H、A9I、A9F、A9E、A9G。这些具体的取代将导致表达至少2倍的改进(按照分泌产物测量)，在一些情况下观察到高达8倍的改进。改进的水平将在某种程度上依赖于由第二核苷酸序列编码的感兴趣的多肽，还依赖于宿主细胞。因此在具体的实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：2具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：2位置9的位置中的T是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：2的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：3具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：3位置9的位置中的S是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：3的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：4具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：4位置9的位置中的H是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：4的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：5具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：5位置9的位置中的I是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：5的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：6具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：6位置9的位置中的F是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：6的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：7具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：7位置9的位置中的E是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：7的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。在另一个具体实施方案中，本发明涉及分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：8具有至少84％，更优选至少89％，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：8位置9的位置中的G是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：8的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
在具体的方面，本发明涉及如上所述与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7或8有关的本发明的分离的信号肽，其具有这样的氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7或8的氨基酸1-19具有至少84％，优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，甚至更优选至少90％，最偶选至少94％，最优选至少95％，最优选至少96％，最优选至少97％，并且甚至最优选至少98％的同一性程度，并且所述信号肽保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力。
SEQ ID NO：1的变体也包含片段，片段在本上下文中意指从这种氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。具体而言片段包含至少10个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基或至少13个氨基酸残基或至少14个氨基酸残基或至少15个氨基酸残基或至少16个氨基酸残基或至少17个氨基酸残基，或至少18个氨基酸残基。根据本发明的变体也可以是一个或多个氨基酸的取代或插入。在经修饰的α因子信号肽包含额外的取代、插入或缺失的情况下，这些额外的修饰不影响所述经修饰的α因子信号肽指导多肽进入或跨过细胞膜(例如进入细胞的分泌途径)的能力。然而在SEQ ID NO：1中位置9或对应于位置9的位置的特定修饰始终应该存在。当然，在经修饰信号肽中的实际位置将依赖于所述经修饰的信号肽相较于野生型的长度，并且可以通过比对所述经修饰的信号与野生型信号得到。
多肽
本发明的第二核苷酸序列编码感兴趣的多肽。所述多肽对于产生它的真菌宿主细胞可以是天然的或异源的。
术语“多肽”在本文不意指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。蛋白质可以是成熟形式或前肽(pro-peptide)的形式。术语“异源多肽”在本文定义为非所述真菌细胞固有的多肽，进行过修饰而改变了天然序列的天然多肽，或通过重组DNA技术操作编码所述多肽的基因后改变了表达量的天然多肽。所述真菌细胞可以含有一个或多个拷贝的编码所述多肽的核苷酸序列。
具体而言，所述多肽可以是激素或激素变体、酶、受体或其片段、抗体或其片段、变应原或报道分子。在具体的方面，所述多肽可以是源自尘螨属物种(Dermatophagoides sp.)的变应原。
具体而言，所述尘螨属物种选自下组：屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)、Dermatophagoides microceaus、热带无爪螨(Blomia tropicalis)和埋内宇尘螨(Euroglyphus mayne)；或来自随后经修饰的所述生物体之一的变应原。更具体而言，所述变应原可以是来自屋尘螨的Der p1(SEQ ID NO：9)或Der p 2(SEQ ID NO：10)。具体而言，所述多肽可以是SEQID NO：9的氨基酸19-320的序列。在更具体实施方案中，所述多肽可以是SEQ ID NO：9的氨基酸19-320的多肽序列的变体。更具体而言，所述变体可以是S54X或N52X，其中“X”表示任何氨基酸，如所述破坏Der p 1的N-糖基化位点，具体而言所述变体可以是S54N或N52Q。
在另一个具体实施方案中，所述多肽可以是酶，例如氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在更具体的方面，所述多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase(变构酶)、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。相关纤维素酶的实例包括但不限于来自卷枝毛霉(Mucor cicinellides)例如卷枝毛霉IFO4554的纤维素酶。相关蛋白水解酶的实例包括但不限于半胱氨酸蛋白酶(cystein protease)，例如来自白车轴草(Trifolium repens L.)的半胱氨酸蛋白酶5。相关肌醇六磷酸酶的实例包括但不限于来自隔孢伏革菌(Peniophora lycii)例如P.lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶。
编码本发明的多肽的第二核苷酸序列可以获得自任何原核、真核或其它来源。就本发明而言，用于本文与给定的来源相关的术语“获得自”，意思应为多肽由所述来源产生或由插入了来自所述来源的基因的细胞产生。
用于分离或克隆编码感兴趣的多肽的核苷酸序列的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或它们的组合。例如，从这种基因组DNA克隆所述第二核苷酸序列可以通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)来实现。参见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols：A Guide toMethods and Application，Academic Press，New York。所述克隆方法可以包括切下并分离期望的包含编码所述多肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将所述片段插入载体分子中，和将所述重组载体并入突变真菌细胞，在该细胞中所述核苷酸序列的多个拷贝或克隆将被复制。所述第二核苷酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任意组合。
在本发明的方法中，所述多肽也可以是融合或杂合多肽，其中将另一种多肽融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。融合多肽通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其片段)与编码本发明的多肽的第二核苷酸序列(或其片段)融合而产生。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括，将编码这些多肽的编码序列连接从而使它们符合读码框并且使所述融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的调控之下。杂合多肽可以包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中的一个或多个多肽对于所述突变真菌细胞可以是异源的。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含编码本发明的信号肽的第一核苷酸序列，该序列与编码本发明的多肽的第二核苷酸序列可操作地连接。更具体地，本发明涉及核酸构建体，其包含编码信号肽的第一核苷酸序列，该序列与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于第二核苷酸序列是外源的，并且所述第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列选自编码根据本发明的信号肽的核苷酸序列。
“核酸构建体”在本文定义为单链或双链的核苷酸分子，所述分子分离自天然存在的基因，或经修饰而含有以本不存在于自然界的方式组合和并置(juxtapose)的核酸区段。当核酸构建体含有编码序列和表达该编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。
编码多肽的第二核苷酸序列可以按多种方式进一步操作以提供所述多肽的表达。将核苷酸序列插入载体之前对核苷酸序列进行操作可能是理想的或必要的，这取决于所述表达载体。使用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域中公知的。
在本发明的方法中，所述核酸构建体可以包含一个或多个天然调控序列，或所述天然调控序列中的一个或多个可以用对于所述核酸构建体的第一和/或第二核苷酸序列是外源的一个或多个调控序列代替，用于改进编码多肽的第二核苷酸序列在宿主细胞中的表达。
术语“调控序列”在本文定义为包括对于由第二核苷酸序列编码的多肽的表达是必需的或有利的所有成分。每个调控序列对于编码多肽的第二核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、本发明的信号肽序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括本发明的信号肽序列，以及转录和翻译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特异性限制位点，促进调控序列与编码多肽的第二核苷酸序列的连接。
调控序列还可以是合适的启动子序列，其由宿主细胞识别用于核苷酸序列表达。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子包括但不限于获得自以下各项的基因的那些：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它对于酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
调控序列可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在所选宿主细胞中有功能的任何终止子均可以在本发明中使用。
用于丝状真菌宿主细胞的合适终止子的实例包括但不限于获得自以下各项的基因的那些：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的合适终止子的实例包括但不限于获得自以下各项的基因的那些：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其它对于酵母宿主细胞有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与编码多肽的核苷酸序列的3′端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞合适的聚腺苷酸化序列的实例包括但不限于从以下各项的基因获得的那些：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列包括但不限于由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述的那些。
调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。前肽编码区的实例包括但不限于从以下各项的基因获得的那些：屋尘螨Der p 1，或其它从尘螨属获得的基因，尖镰孢胰蛋白酶，酿酒酵母α因子，曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)。
当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。如果存在前肽，在一个实施方案中，可切割位点可以存在于所述前肽和成熟多肽之间。术语“可切割位点”应理解为由能够在该位点切割多肽的蛋白水解酶识别的氨基酸序列。这种位点的实例包括kex位点，尤其是kex-II位点。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组表达载体。除了包含本发明分别编码信号肽和多肽的第一和第二核苷酸序列，所述表达载体可以特别包含转录和翻译停止信号。上文描述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代启动子和/或编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以将核酸构建体插入载体中，所述载体对于由第二核苷酸序列编码的多肽的表达是适合的。在制备表达载体的过程中，将编码多肽的第二核苷酸序列置于载体中，从而将所述序列与本发明的信号肽序列和一个或多个适当的用于表达的调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
本发明的载体可以特别含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)(orotidine-5′-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))，以及它们的等价物。特别用于曲霉属(Aspergillus)细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体可以特别含有元件，其允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或允许载体在所述细胞中独立于基因组自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的第二核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组。所述额外的核苷酸序列可以使载体能够整合入宿主细胞基因组内染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应特别含有足够数量的核苷酸，如100至1,500碱基对，优选400至1,500碱基对，并且最优选800至1,500碱基对，其与相应的目标序列高度同源以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述宿主细胞中自主地复制。复制的起点可以是任何在细胞中有功能的介导自主复制的质粒复制子(plasmid replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。复制的起点可以是一种具有突变的复制起点，所述突变使该复制起点能够在宿主细胞中发挥温度敏感性的功能(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75：1433)。
可用于丝状真菌宿主细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据WO 00/24883中公开的方法完成。
可以将多于一个拷贝的编码多肽的核苷酸序列插入宿主细胞以增加该基因产物的产生。核苷酸序列拷贝数的增加可如下获得：通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或者通过包括可与所述核苷酸序列一起扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有所述选择性标记基因的扩增拷贝、并由此含有所述核苷酸序列的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明涉及在真菌宿主细胞中产生多肽的方法，和包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞。
将包含与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地连接的、编码本发明的信号肽的第一核苷酸序列的载体导入真菌宿主细胞，从而使所述载体作为染色体整合体或作为如先前所述的自复制染色体外载体保留。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与所述亲本细胞不同。宿主细胞的选择将很大程度上依赖于编码所述多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是任何可以用于本发明的方法的真菌细胞。“真菌”用于本文包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等，In，Ainsworthand Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上文，第171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上文)。
在具体的方面，所述真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用于本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。鉴于酵母的分类在将来可能变化，就本发明而言，酵母应该限定为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。
在更具体的方面，所述酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
在最具体的方面，所述酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(例如酿酒酵母YNG318)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个具体的方面，所述真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，见上文所定义)。丝状真菌的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖(mannan)和其它复杂多糖所组成的菌丝体壁。营养生长通过菌丝延长进行，并且碳分解代谢是专性需氧的。与此相反，酵母如酿酒酵母的营养生长则通过单细胞菌体(unicellular thallus)的芽殖(budding)进行，碳分解代谢可以是发酵的。
在更具体的方面，所述丝状真菌宿主细胞是(但不限于)以下物种的细胞：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)。
在甚至更具体的方面，所述丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个甚至更具体的方面，所述丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、或镶片镰孢细胞。在另一个甚至更具体的方面，所述丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、土生羧孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在最具体的方面，所述镶片镰孢细胞是镶片镰孢A3/5，其最初作为禾本科镰孢ATCC 20334保藏，并在最近由Yoder和Christianson，1998，Fungal Geneticsand Biology 23：62-80以及O′Donnell等，1998，Fungal Genetics and Biology 23：57-67重新分类为镶片镰孢；以及镶片镰孢的分类学等价物，而不考虑它们目前已知的物种名。在另一个具体方面，所述镶片镰孢细胞是镶片镰孢A3/5或镶片镰孢ATCC 20334的形态学突变体，如WO 97/26330中所公开的。
在另一个最具体的方面，木霉属细胞是里氏木霉ATCC 56765、里氏木霉ATCC 13631、里氏木霉CBS 526.94、里氏木霉CBS 529.94、长枝木霉CBS528.94、长枝木霉ATCC 2106、长枝木霉CBS 592.94、绿色木霉NRRL 3652、绿色木霉CBS 517.94、或绿色木霉NIBH FERM/BP 447。
真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和以本身已知的方式再生细胞壁的方法来转化。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA81：1470-1474中描述。用于转化里氏木霉宿主细胞的合适方法是Penttila等，1987，Gene 61：155-164和Gruber等，1990，Curr Genet.18(1)：71-6中所述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO96/00787描述。酵母可以使用由Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920描述的方法来转化。
材料和方法
菌株和质粒
菌株
使用大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒挽救(plasmidrescue)。
酿酒酵母YNG318：MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539在J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997中描述。
质粒
全部酵母表达载体均为在TPI启动子调控下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，其构建自WO 00/10038中描述的pJC039。
基因
来自屋尘螨的Der p 1：NCBI登录号：P08176，氨基酸序列示于SEQ ID NO：9
来自屋尘螨的Der p 2：NCBI登录号：P49278，氨基酸序列示于SEQ ID NO：10
培养基和底物
RS-25：40g/L大豆粉、40g/L葡萄糖、10g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4、0.01g/L FeSO4、2.5g/L NH4NO3；pH 6
YPD：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物
10X基础溶液(basal solution)：66.8g/l不含氨基酸的酵母含氮碱基(Yeastnitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)、100g/l琥珀酸盐和60g/l NaOH。
SC-葡萄糖(或SC-培养基)：100ml/l 20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)、4ml/l 5％苏氨酸、10ml/l 1％色氨酸、25ml/l 20％酪蛋白氨基酸和100ml/l 10X基础溶液。将此溶液使用孔径为0.20微米(Microm)的滤器灭菌。将琼脂和H2O(约761ml)一起高压灭菌，再将单独灭菌的SC-葡萄糖溶液加至琼脂溶液。
PEG/LiAc溶液：50ml 40％ PEG4000(通过高压灭菌来除菌)和1ml 5M醋酸锂(通过高压灭菌来除菌)。
方法
酵母转化
本方法在实施例1和2中使用。
为了转化酵母利用了体内重组机制，通过这种机制，如果载体序列和PCR片段二者具有相同的侧翼区，那么酵母有可能在体内重组所述载体序列和PCR片段以产生表达载体。
DNA混合物通过混合0.5微升载体(经EcoRI-NotI消化的)和1微升PCR片段来制备。将酿酒酵母YNG318感受态细胞在冰上解冻。在12ml聚丙烯试管(Falcon 2059)中将100微升的所述细胞与所述DNA混合物和10微升载体DNA(Clontech)混合。向其中添加0.6ml PEG/LiAc溶液并轻轻混合，然后在30℃和200rpm温育30分钟。之后将其在42℃温育30分钟(热休克(heatshock))，然后将其转移至Eppendorf管并离心5秒。去除上清，并再溶解于3ml YPD中。然后将细胞悬液在30℃以200rpm温育45分钟，然后将其倾倒至SC-葡萄糖平板上。
PCR反应
除非另有说明，否则在以下条件下进行PCR反应：
所述PCR反应含有38.9微升H2O、5微升10x反应缓冲液、1微升KlenTaq LA(Clontech)、4微升10mM dNTPs、0.3微升x2100pmol/微升引物和0.5微升模板DNA，并且在以下条件下进行：30个循环的98℃ 10秒和68℃90秒，以及最终的68℃ 10分钟。
夹心ELISA
将免疫平板(Nunc Maxisorb；Nunc-Nalgene)分别用合适剂量的Der p 1或Der p 2测定用多克隆兔抗Der p 1或Der p 2免疫球蛋白在4℃过夜包被。然后将所述平板用含0.05％ Tween 20的0.15M磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBST)彻底清洗，并且用含有2％脱脂乳粉的PBS封闭剩余的结合位点，在室温进行1小时。以合适剂量或剂量范围添加样品，所述样品可以是纯化的、半纯化的重组螨多肽变应原或含有感兴趣的蛋白质的粗制培养液。然后用0.15MPBST彻底清洗平板，再通过分别与生物素酰化的抗Der p 1或Der p 2抗体一起在室温温育1小时来检测变应原。然后再次在0.15M PBST中清洗平板，之后与链霉抗生物素：辣根过氧化物酶(Kierkegaard & Perry)的复合物在室温缀合(conjugate)1小时。重复清洗步骤，再通过添加3，3’，5，5’-四甲基联苯胺过氧化氢(TMB Plus，Kem-En-Tec)来使平板显影(develop)，其后通过添加0.2M H2SO4停止反应。450nm的光密度(OD)反映了与免疫球蛋白结合的变应原，那么通过与针对以已知浓度剂量范围包括在ELISA中的天然Der p 1或Der p 2(可从InDoor biotechnologies获得)获得的数据进行比较，可以检测、也可以确定结合的变应原的量。
其它方法
挽救酵母质粒的大肠杆菌转化通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser(基因脉冲仪))进行。
用
Figure A20078003908400251
Plasmid Kit(质粒试剂盒)制备了DNA质粒。通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收了DNA片段。
PCR通过PTC-200DNA Engine进行。
使用ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer(基因分析仪)用于全部DNA序列的测定。酵母总DNA通过Robzyk和Kassir的方法提取，该方法在Nucleic Acids Research vol.20，No.14(1992)3790中描述。
实施例
实施例1 Der p 1在酿酒酵母中的表达
使用本发明的经改进α因子信号的感兴趣多肽的表达水平能够通过例如Der p 1的表达水平来阐明。任何适用于在酵母中表达多肽的表达载体均可使用。在以下内容中，描述了合适的表达构建体的实例，该构建体基于酵母pYES2载体。使用PWO聚合酶通过标准PCR反应从酿酒酵母基因组DNA扩增了TPI启动子。
引物：
正向引物：5’TACTGACACCGGTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG 3’(SEQ ID NO：11)
反向引物：5’TAAGTAAAGCTTTCTTTTAATCGTTTATATTGTGTATG 3’(SEQ ID NO：12)
将扩增的产物经Qiaquick Spin Column(旋转柱)纯化。将纯化的产物和载体pYes2用HinDIII/AgeI在Nebuffer 2(New England Biolabs)中消化。此消化过程将Gal1启动子从所述载体中去除。将所述载体和插入片段使用QIAquick方法(Qiagen)由1.5％制备型琼脂糖凝胶纯化。将载体和插入片段通过T4-DNA连接酶连接，转化入通过CaCl2制成感受态的DH10B细胞，并且涂布在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。通过DNA测序验证了克隆，并命名为pYES-TPI。
设计了用于引入氨基酸序列为MRFPSIFTAVLFAASSALA的α信号和用于扩增Der p 1的寡聚物(oligo)：正向DNA寡聚物从5’端序列起具有与质粒中HinDIII位点上游的pYES-TPI序列的重叠(1-42)，及编码α信号的序列(43-99)，以及与编码前肽N-末端的Der p 1基因重叠的序列(100-132)：
5’GAGTGTTGTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAAAGCTTATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCTGCTTCCTCCGCTTTAGCTCGCCCGAGCAGCATTAAAACCTTCGAAGAATAT 3’(SEQ ID NO：13)
反向寡聚物从5’端序列起具有与质粒中HinDIII位点下游的pYES-TPI重叠的序列(1-40)，和与Der p 1基因的编码C末端重叠的序列(41-68)：
5’ACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATCTCGACTCATTACAGGATAACAACGTACGGGTATTCTTCG 3’(SEQ ID NO：14)
通过标准反应PCR扩增了α-信号-proDer p 1基因，并进行了DNA纯化。
将pYES-TPI表达载体用HinDIII(New England Biolabs)消化，将线性化的载体纯化并用于与α-信号-proDer p 1扩增基因一起转化酿酒酵母(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor，1989)。所述载体片段和扩增基因通过缺口修复在酵母细胞中重组(Orr-Weaver and Szostak，PNAS，1983，vol.80，p.4417-4421)。转化之后，将转化体涂布在含2％葡萄糖的SC琼脂上。在30℃温育3-4天之后，将菌落培养在含2％葡萄糖的SC培养基中进行质粒挽救，并且对α-信号-pro Der p 1基因进行DNA测序。
以相同的方式构建了α信号变体，除了将正向引物中的第67-69位(编码从Met起第9位的Ala)变为编码Thr的密码子选择或任何其它相关取代。
其它表达构建体也可以应用。在一组数据中，使用了pSteD212载体，其源自酵母表达载体pYES 2.0(Invitrogen，UK和Kofod等1994 J.Biol.Chem.269：29182-29189)。这种质粒可在大肠杆菌中和酿酒酵母中复制，并且在酿酒酵母中，从这种质粒表达了Der p 1。
pSteD212是附加型(episomal)表达载体，其含有尿嘧啶合成途径的基因URA3，该基因编码允许在基本培养基上进行选择的乳清酸核苷5’-脱羧酶。所述载体还含有2my起点，其是在酵母和大肠杆菌二者中保证该质粒的多拷贝的DNA复制起点。TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子保证感兴趣的基因的组成型表达，可以将所述基因克隆至位于该启动子下游的多克隆位点(mcs)中。酵母转录终止子存在于所述mcs的下游。同样由pSteD212携带的氨苄青霉素抗性基因用于在大肠杆菌中进行选择。因此pSteD212载体在功能和结构上非常类似于pYES2。
对上述用于基因表达载体的元件更详细的描述可以参见Romanos等，1992，Yeast，8，423-488和Sambrook等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)。
重组Der p 1与Der p 1前肽一起表达，并且具有突变S54N，该突变破坏了成熟序列中仅有的N-糖基化基序。
为了筛选表达Der p 1的酵母转化体，将转化溶液涂布在SC琼脂平板上在30℃进行3天的菌落形成。将菌落接种在50ml无菌塑料管中，每个管含有10mL SC培养基。在含有100ml SC培养基的500ml带挡板的锥形瓶(baffled Erlenmeyer flask)中使试管培养物在30℃，250rpm发酵4天。将来自这些发酵的培养液用于夹心ELISA实验以确定表达的蛋白质的浓度。
如上文方法部分中所述通过夹心ELISA确定了通过野生型α信号或通过A9Tα信号表达的Der p 1 S54N的表达水平。使用A9Tα信号的Der p 1S54N表达与使用野生型α信号的相同蛋白的表达相比增加到约5倍。
实施例2 Der p 2在酿酒酵母中的表达
作为根据本发明的另一个说明性实施例，对使用本发明信号肽的不同变体的Der p 2表达进行描述。
在以下内容中，描述的是基于酵母pYES2载体的合适的表达构建体的实例。
将来自屋尘螨的Der p 2(SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列)编码基因置于载体pYES-TPI中，所述载体如实施例1中所述源自酵母表达载体pYES2(Invitrogen)。
这种质粒可在大肠杆菌和酿酒酵母二者中复制。在酿酒酵母中，可以从这种质粒表达Der p 2。
使用pSteD212作为表达载体获得了一组实验数据。
为了在酵母中分泌，通过将不同α信号肽变体引入编码Der p 2基因的上游而测试了它们的表达效率。一个α信号是氨基酸序列为MRFPSIFTAVLFAASSALA的野生型信号，其它信号除了位置A9的氨基酸不同之外是同样的氨基酸序列。将位置9中的丙氨酸取代为S、H、I、F、E、G或T，其中通过如实施例1中所述的标准寡聚物和PCR技术，但是使用与Der p 2序列具有重叠的引物。通过克隆同样在上文所述的DNA片段制备了具有不同信号肽的表达构建体。将构建体转化入酿酒酵母。为了筛选表达Der p 2的酵母转化体，将转化溶液涂布在SC琼脂平板上用于在30℃进行3天的菌落形成。将菌落接种在50ml无菌塑料管中，每个管含有10mL SC培养基。在含有100ml SC培养基的500ml带挡板的锥形瓶中使试管培养物在30℃，250rpm发酵4天。如上所述将来自这些发酵的培养液用于夹心ELISA实验以确定表达的蛋白质的浓度。
通过夹心ELISA确定了藉由不同α信号突变体的Der p 2表达水平，并且与使用野生型α信号(A9A)的Der p 2表达进行了比较。在下表中给出了与野生型α信号(A9A)相比成倍改进的表达：
 前导序列取代  与野生型信号(A9A)相比Der p 2的表达倍数
 MRFPSIFTAVLFAASSALA(A9A)(SEQ ID NO：1)  1X
 MRFPSIFTTVLFAASSALA(A9T)(SEQ ID NO：2)  7X
 MRFPSIFTSVLFAASSALA(A9S)(SEQ ID NO：3)  7X
 MRFPSIFTHVLFAASSALA(A9H)(SEQ ID NO：4)  7X
 MRFPSIFTIVLFAASSALA(A9I)(SEQ ID NO：5)  8X
 MRFPSIFTFVLFAASSALA(A9F)(SEQ ID NO：6)  5X
 MRFPSIFTEVLFAASSALA(A9E)(SEQ ID NO：7)  2X
 MRFPSIFTGVLFAASSALA(A9G)(SEQ ID NO：8)  3X
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>改进的用于产生多肽的α因子信号肽
<130>10831.204-WO
<160>16
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>2
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>2
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Thr Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>3
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>3
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ser Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>4
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>4
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr His Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>5
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>5
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ile Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>6
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>6
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Phe Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>7
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>7
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Glu Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>α因子信号变体
<400>8
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala
<210>9
<211>302
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<220>
<221>前肽
<222>(1)..(80)
<400>9
Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala Phe Asn
1               5                   10                  15
Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg Lys Asn Phe
            20                  25                  30
Leu Glu Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile Asn His
        35                  40                  45
Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu Met Ser
    50                  55                  60
Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu
65                  70                  75                  80
Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu
                85                  90                  95
Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly
            100                 105                 110
Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu
        115                 120                 125
Ala Tyr Arg Asn Gln Asn Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp
    130                 135                 140
Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile
145                 150                 155                 160
Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr
                165                 170                 175
Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly
            180                 185                 190
Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg
        195                 200                 205
Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile
    210                 215                 220
Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln
225                 230                 235                 240
Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly
                245                 250                 255
Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp
            260                 265                 270
Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile
        275                 280                 285
Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu
    290                 295                 300
<210>10
<211>129
<212>PRT
<213>屋尘螨
<400>10
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val
1               5                   10                  15
Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
            20                  25                  30
Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys
        35                  40                  45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp
    50                  55                  60
Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu
65                  70                  75                  80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
                85                  90                  95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly
            100                 105                 110
Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
        115                 120                 125
Asp
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
tactgacacc ggtgcatgcc tgcaggtcga ctctag                              36
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>12
taagtaaagc tttcttttaa tcgtttatat tgtgtatg                            38
<210>13
<211>132
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>13
gagtgttgtt catacacaat ataaacgatt aaaagaaagc ttatgagatt tccttctatt    60
tttactgctg ttttattcgc tgcttcctcc gctttagctc gcccgagcag cattaaaacc    120
ttcgaagaat at                                                        132
<210>14
<211>68
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>14
actaattaca tgatgcggcc ctctagatct cgactcatta caggataaca acgtacgggt    60
att cttcg                                                            68
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>比对实例序列1
<400>15
Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu
1               5                   10
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>比对实例序列2
<400>16
His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser
1               5                   10

Claims (28)

1.一种用于增加分泌性多肽产生的方法，包括：
(a)在有益于所述多肽产生的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸构建体，该构建体包含编码信号肽的第一核苷酸序列，其与编码所述多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于第二核苷酸序列是外源的，第一核苷酸序列的3’端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列选自下组：编码α因子信号肽的核苷酸序列，其中所述α因子信号肽具有至少一个在位置9对丙氨酸进行的取代；和
(b)从培养基分离所述分泌性多肽。
2.权利要求1的方法，其中在由第一核苷酸序列编码的氨基酸序列中的至少一个修饰A9Xaa选自下组：A9T、A9S、A9H、A9I、A9F、A9E和A9G。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述经修饰的α因子信号肽包含额外的取代或缺失，所述取代或缺失不影响经修饰的α因子信号肽指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，例如指导多肽进入细胞的分泌途径的能力。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二核苷酸序列编码对于所述真菌宿主细胞是天然的多肽。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第二核苷酸序列编码对于所述真菌宿主细胞是异源的多肽。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞含有多于一个拷贝的第一和第二核苷酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二核苷酸序列编码激素或激素变体、酶、受体或其片段、抗体或其片段、变应原或报道分子。
8.根据权利要求7的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。
9.根据权利要求8的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变构酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
10.根据权利要求7的方法，其中所述第二核苷酸序列编码来自尘螨属物种的变应原。
11.根据权利要求10的方法，其中所述尘螨属物种选自下组：屋尘螨、粉尘螨、丝泊尘螨、Dermatophagoides microceaus。
12.根据权利要求11的方法，其中所述变应原选自下组：来自屋尘螨的Der p 1或Der p 2，或它们的变体。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
14.根据权利要求13的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞选自下组：枝顶孢霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属。
15.根据权利要求14的方法，其中所述曲霉属宿主细胞选自下组：泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。
16根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述真菌宿主细胞是酵母细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中所述酵母细胞是酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。
19.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：2具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：2位置9的位置中的T是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：2的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
20.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：3具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：3位置9的位置中的S是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：3的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
21.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：4具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：4位置9的位置中的H是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：4的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
22.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：5具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：5位置9的位置中的I是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：5的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
23.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：6具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：6位置9的位置中的F是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：6的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
24.一种分离的信号肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：8具有至少84％同一性，更优选至少89％同一性，更优选至少94％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在对应于SEQ ID NO：8位置9的位置中的G是保守的；和(b)变体，该变体保留指导多肽进入或跨过细胞膜的能力，所述变体包含对SEQ ID NO：8的氨基酸在不同于位置9的位置的一个或几个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。
25.一种核酸构建体，其包含编码信号肽的第一核苷酸序列，该序列与编码多肽的第二核苷酸序列可操作地连接，其中所述第一核苷酸序列对于第二核苷酸序列是外源的，并且第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且所述第一核苷酸序列选自下组：编码根据权利要求19-24中任一项的信号肽的核苷酸序列。
26.一种重组表达载体，其包含权利要求25的核酸构建体。
27.一种重组宿主细胞，其包含权利要求25的核酸构建体或权利要求26的表达载体。
28.改进的信号肽用于产生多肽的用途，其中所述信号肽由第一核苷酸序列编码，并且所述多肽由第二核苷酸编码，第二核苷酸序列对于第一核苷酸序列是外源的，并且第一核苷酸序列的3′端在第二核苷酸序列的上游，并且其中所述第一核苷酸序列选自下组：编码α因子信号肽的核苷酸序列，其中所述α因子信号肽具有至少一个在位置9对丙氨酸进行的取代。
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