CN113490740A - 适合用于液化中的具有普鲁兰酶活性的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的变体普鲁兰酶，该变体普鲁兰酶包含在选自对应于SEQ ID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804、811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。本发明的另外的方面涉及使用α‑淀粉酶和本发明的热稳定普鲁兰酶用于在高于初始糊化温度的温度下液化含淀粉材料的方法。

Description

适合用于液化中的具有普鲁兰酶活性的多肽
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及热稳定普鲁兰酶变体在由含淀粉材料生产发酵产物的方法中的用途，并且涉及具有普鲁兰酶活性的变体多肽。
发明背景
淀粉通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是其中的直链α-1,4D-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接的分支多糖。支链淀粉被水解1,4-α-糖苷键以产生支链和直链寡糖的α-淀粉酶部分地降解。支链淀粉被α-淀粉酶的延长降解导致所谓的α-极限糊精的形成，α-极限糊精不易被α-淀粉酶进一步水解。支链寡糖可以被去分支酶水解为直链寡糖。剩余的支链寡糖可以被葡糖淀粉酶解聚为D-葡萄糖，葡糖淀粉酶将直链寡糖水解为D-葡萄糖。
将可以攻击支链淀粉的去分支酶分成两类：分别为异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)和普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰的特性以及通过它们对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。
本领域熟知在淀粉转化过程中添加异淀粉酶或普鲁兰酶。普鲁兰酶是具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(EC3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。通常，普鲁兰酶与α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合使用。
普鲁兰酶在本领域是已知的。US 6,074,854和US 5,817,498披露了来自脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的普鲁兰酶。WO 2009/075682披露了源自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的普鲁兰酶。
WO 2015/007639披露了通过将来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶的N-末端片段与来自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶的C-末端片段融合而获得的杂合普鲁兰酶。源自芽孢杆菌属物种的现有技术普鲁兰酶到目前为止尚不足够热稳定，无法在常规淀粉转化过程中的液化中使用。
WO 2015/110473和WO 2017/014974披露了热稳定的普鲁兰酶变体。
本发明的目的在于提供具有增加的热稳定性和/或热活性以适合在含淀粉材料的液化中使用的普鲁兰酶变体。
发明内容
本发明涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的变体普鲁兰酶，该变体普鲁兰酶包含在选自对应于SEQ ID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804、811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
本发明的另外的方面涉及使用α-淀粉酶和本发明的热稳定普鲁兰酶用于在高于初始糊化温度的温度下液化含淀粉材料的方法。
因此，在第二方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。
在第三方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
c)使用发酵生物进行发酵。
在第四方面，本发明涉及包含本发明的变体普鲁兰酶和稳定剂的组合物。
本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
此外，本发明涉及本发明的变体普鲁兰酶在含淀粉材料的液化中的用途。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
催化结构域：术语“催化结构域”意指含有该酶的催化机构的酶的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的一个或多个控制序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中片段具有普鲁兰酶活性。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰，例如N-末端加工和C-末端截短，之后处于其最终形式的多肽。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有普鲁兰酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性的淀粉去分支酶(EC 3.2.1.41)，其催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序可以确定普鲁兰酶活性。在本发明的上下文中，变体普鲁兰酶具有增加的热活性和/或增加的热稳定性。如实例所述，将普鲁兰酶活性确定(使用PHADEBAS测定)为在60℃-90℃(例如70℃-87℃)范围的两个不同温度下进行30min高温胁迫/热休克后的相对活性，并且在60℃-80℃范围(例如70℃)的温度下进行测定，取决于变体的热稳定性(热稳定性)；或确定为在两个不同温度(70℃-86℃)下确定的相对活性(热谱(thermoprofile)/热活性)。还使用TSA测定对增加的热稳定性进行测量以便确定变体多肽的解链/变性温度。
野生型普鲁兰酶：术语“野生型”普鲁兰酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母、或丝状真菌)表达的普鲁兰酶。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选地5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。]
子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有普鲁兰酶活性的片段。
S8A蛋白酶：术语“S8A蛋白酶”意指属于亚家族A的S8蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)是亚家族S8A中的一个亚组。
变体：术语“变体”意指具有普鲁兰酶活性的、在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。在描述变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
在本发明的上下文中，变体普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性。
如实例所述，热稳定性可以(使用PHADEBAS测定)确定为在60℃-90℃(例如70℃-87℃)范围的两个不同温度下进行30min高温胁迫/热休克后的相对活性，并且在60℃-80℃范围(例如70℃)的温度下进行测定，取决于变体的热稳定性(热稳定性)；或确定为在两个不同温度(70℃-86℃)下确定的相对活性(热谱/热活性)。还可使用TSA测定对增加的热稳定性进行测量以便确定变体多肽的解链/变性温度。在一个实施例中，本发明的普鲁兰酶变体的热稳定性增加，使用TSA测定，该热稳定性增加被确定为与披露于SEQ ID NO:3中的亲本普鲁兰酶相比解链(变性)温度增加至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.8℃、至少1.0℃、至少1.2℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃、至少3.0℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃、至少5.0℃。
如实例中所述，使用PHADEBAS测定，通过在70℃-87℃范围的温度下进行例如30min热休克来测量增加的热稳定性，然后在例如70℃或80℃下测定活性。然后将热稳定性确定为在较高温度下经热休克的样品活性相比于在较低温度下经热休克的样品活性的相对活性。例如，对于变体P609(实例2的表1a)而言，当在81.5℃和80℃下进行热休克时，相对活性为58％，意味着在81.5℃下孵育后活性为在80℃下孵育的样品的58％。然后将活性计算为与亲本普鲁兰酶JPUL604(SEQ ID NO:3)相比的相对活性。本领域技术人员将知道用于热休克/高温胁迫和用于活性测定的适合温度是多少，因为这将取决于亲本普鲁兰酶和所得变体的热稳定性。
使用PHADEBAS测定，将增加的热活性(热谱)确定为通过在两个不同温度下(例如在70℃-86℃范围)进行活性测定并且计算出较高温度下活性相比于较低温度下活性的活性％的相对活性。在一些实例中，热活性是通过与底物麦芽糊精/普鲁兰糖(DE3)在高温下进行酶促反应(例如85℃下进行2小时或91℃下进行30min)而确定的。随后，在55℃下通过PAHBAH测定来测量麦芽糖糊精的普鲁兰酶消化级分。
在一个实施例中，在85℃下进行2小时或在91℃下进行30min麦芽糖糊精的酶促反应，并且随后在55℃下通过PAHBAH测定来确定消化的麦芽糖糊精级分后，本发明的普鲁兰酶变体的热活性相对于亲本普鲁兰酶、例如披露为SEQ ID NO:3的普鲁兰酶增加了至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将披露为SEQ ID NO:1的成熟杂合普鲁兰酶多肽用于确定另一种普鲁兰酶中对应的氨基酸残基。将另一种普鲁兰酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。
可以通过使用几种计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种普鲁兰酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；3.5版本或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(6.857版本或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
贯穿本说明书，在一些实施例中，通过给出存在于SEQ ID NO:1中的指明位置的氨基酸以及取代后存在的氨基酸已经对本发明的变体进行了描述。这并不意味着指明位置的起始氨基酸不能是不同的氨基酸。特定位置的起始氨基酸当然取决于亲本普鲁兰酶的选择，因此在本披露中有时将起始氨基酸表示为“X”，意味着这可能是任一氨基酸。本发明的本质特征是取代后存在的所得氨基酸。
具体实施方式
本发明涉及衍生自杂合亲本普鲁兰酶的变体普鲁兰酶。将杂合普鲁兰酶(在本文披露为SEQ ID NO:1)用作亲本普鲁兰酶。编码亲本普鲁兰酶的多核苷酸序列在本文被包括为SEQ ID NO:2，其中核苷酸1-99编码信号肽，并且核苷酸100-2583编码SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽。在其他实施例中，亲本普鲁兰酶选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、和SEQ IDNO:5中披露的普鲁兰酶。
与亲本相比，根据本发明的变体具有改善的特性。该改善的特性选自增加的热活性(热谱)和/或增加的热稳定性。普鲁兰酶活性可以通过任何合适的普鲁兰酶测定来确定，比如像通过PHADEBAS测定，或通过本文在普鲁兰酶测定部分和实例部分所述的PAHBAH-普鲁兰糖测定。
特别地，本发明涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的普鲁兰酶变体，该普鲁兰酶变体包含在选自对应于SEQ ID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804、811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
特别地，这些取代选自由以下组成的组：K370S、F17Y、D77G、S103K、Q106W、A107D、A190I、V196T,C、T197I、T262V、Q279R、N283F、H321V、D367G,N、S375H、N382T、Q399N、N401D、S402Q、N411L、Y412F、F432V、Q434E、L435A、R443G、I446V、G459E、V460E、H479N、T486A,V、I490L、Q498R、V514A、T529L、S531R、A533I、N541D、A545I、L581F、N583D、Q595R、D649A、V665I、D688A、F700L、P709I、E804S、和G811R。
在一方面，本发明因此涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的普鲁兰酶变体，该普鲁兰酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置370的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置370处包含丝氨酸，特别是K370S取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
在另一方面，本发明因此涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的普鲁兰酶变体，该普鲁兰酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置432的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置432处包含缬氨酸，特别是F432V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
在另一方面，本发明因此涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的普鲁兰酶变体，该普鲁兰酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置486的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置486处包含丙氨酸或缬氨酸，特别是T486A,V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
在一个实施例中，可以使用PHADEBAS测定，将热稳定性的增加确定为在选自60℃-90℃(例如70℃-87℃)范围的两个不同温度下进行30min高温胁迫的相对活性，并且随后在60℃-80℃(例如70℃)下进行测定。可替代地，使用TSA测定，可以将热稳定性确定为相比于亲本普鲁兰酶的增加的解链(变性)温度。
在一个实施例中，使用PHADEBAS测定，可以将热活性(热谱)的增加确定为在选自70℃-86℃范围的两个不同温度下确定的相对活性。
在另一个特定实施例中，本发明的变体普鲁兰酶涉及相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的普鲁兰酶变体，该普鲁兰酶变体包含在选自对应于SEQID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804、811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性，并且其中该变体包含选自由以下组成的组的取代和/或缺失的组合：
Q279R+K370S；
H321E+K370S；
K370S+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N；
K370S+N401D；
K370S+F432V；
V196T+K370S；
V196C+K370S；
T197I+K370S；
K370S+V460E；
K370S+T486A；
K370S+T486V；
K370S+I490L；
K370S+V514A；
K370S+T529L；
K370S+S531R；
K370S+Q595R；
H321E+K370S+F432V；
K370S+F432V+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N+F432V；
K370S+N401D+F432V；
V196T+K370S+F432V；
V196C+K370S+F432V；
T197I+K370S+F432V；
K370S+F432V+G459E；
K370S+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486V；
V196T+K370S+F432V+T486A；
T197I+K370S+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+F432V+T486A；
K370S+Q399N+F432V+T486A；
K370S+N401D+F432V+T486A；
K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
K370S+S531R+F432V+T486A；
K370S+Q595R+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
S103K+T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486V+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
D77G+T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+Q106W+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+A107D+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+V196C+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N583D+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367G+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367N+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+S375H+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N382T+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+N411L+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+Y412F+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+Q434E+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+R443G+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+I446V+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+Q498R+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A533I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N541D+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A545I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+L581F+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
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F17Y D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RE804S V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RG811R V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G A190I T197I N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I T262V N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；以及
D77G A190I T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412FF432V Q434E L435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*。
以上的具体变体可以进一步包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C，以及任选地L432F。特别地，以上的具体变体可以进一步包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R，以及任选地L432F。
更特别地，这些变体普鲁兰酶可以进一步包含缺失P30*+V31*+N32*，以及任选地Q29G。
甚至更特别地，以上的具体变体可以进一步包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E++N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R+Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+F456W+E560R，以及任选地L432F、N197T、M402S、N479H、I460V、I514V中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
最优选地，这些变体包含取代X370S+X432V，特别是K370S+L,F432V，以及任选地X492A,S。
根据本发明的普鲁兰酶变体相比于亲本普鲁兰酶具有改善的特性。特别地，增加的热稳定性和/或增加的热活性。在具体实施例中，在85℃下进行2小时或在91℃下进行30min麦芽糖糊精底物的酶促反应，并且随后在55℃下通过PAHBAH测定来确定消化的麦芽糖糊精级分后，变体普鲁兰酶的热稳定性相对于亲本普鲁兰酶、例如披露于SEQ ID NO:3中的亲本增加了至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。可替代地，变体普鲁兰酶相对于亲本普鲁兰酶、例如披露于SEQ ID NO:3中的亲本具有增加的热稳定性，使用TSA测定，该增加的热稳定性被确定为与披露于SEQ ID NO:3中的亲本普鲁兰酶相比解链(变性)温度增加了至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.8℃、至少1.0℃、至少1.2℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃、至少3.0℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃、至少5.0℃。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即多核苷酸，其由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加到转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、以及脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合用于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合用于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
变体可以使用本领域已知的方法检测。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。参见适合的普鲁兰酶活性测定的测定部分。
可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCHPublishers[纽约VCH出版社],1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。在具体实施例中，本发明的普鲁兰酶变体产生于酵母宿主细胞中，该酵母宿主细胞还可在本发明的方法(例如，SSF)中用作发酵生物。特别地，酵母是酿酒酵母。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基、和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”意指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的普鲁兰酶变体和适合的稳定剂的组合物。
组合物可以包含普鲁兰酶变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，几种)酶，该组由以下各项组成：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。
下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。在具体实施例中，组合物进一步包含α-淀粉酶。
α-淀粉酶优选地是细菌酸稳定的α-淀粉酶。特别地，α-淀粉酶来自微小杆菌属物种或芽孢杆菌属物种(例如像嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)。
在实施例中，α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:6中所示的α-淀粉酶。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更特别地在位置I181+G182、R179+G180、G180+I181、R179+I181或G180+G182(优选I181+G182)处的双缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242处具有取代，优选S242Q取代。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188处具有取代，优选E188P取代。
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体组成的组，这些变体除在从位置179至位置182的区域中的双缺失(特别是I181*+G182*)和任选地N193F之外还具有以下突变。
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体具有以下突变：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQID NO:6进行编号)。
在实施例中，α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少75％的同一性，优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，并且甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可以为这样使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:6中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短以优选地具有约490个氨基酸，如从482-493个氨基酸。优选地，嗜热脂肪芽孢杆菌变体α-淀粉酶优选地在SEQ IDNO:6的位置484之后，特别地在位置485之后、特别地在位置486之后、特别地在位置487之后、特别地在位置488之后、特别地在位置489之后、特别地在位置490之后、特别地在位置491之后、特别地在位置492之后，更特别地在位置493之后被截短。
液化期间存在的和/或添加的蛋白酶
在优选实施例中，本发明的酶组合物进一步包含蛋白酶。
根据本发明，热稳定蛋白酶可以任选地在液化期间与本发明的变体普鲁兰酶和α-淀粉酶(如热稳定的α-淀粉酶)一起存在和/或添加。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如S8丝氨酸蛋白酶。
在优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶，优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。
在实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定确定的，热稳定的蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。
对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。在优选实施例中，热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的真菌金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。
在实施例中，热稳定的蛋白酶是披露为以下项的金属蛋白酶的变体：披露于WO2003/048353中的SEQ ID NO:2的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:7，该变体具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L，并且其中该蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:7的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
热稳定蛋白酶还可以源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本说明书定义的热稳定性特性。
在实施例中，热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。
在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司)中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8所示的蛋白酶。
在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:8中的蛋白酶或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8具有至少80％的同一性，例如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的同一性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
在另一个实施例中，蛋白酶选自古球菌属物种(Palaeococcus sp.)S8蛋白酶，特别是SEQ ID NO:9所示的嗜铁古老球菌(Palaeococcus ferrophilus)S8蛋白酶，或与SEQID NO:9的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性的蛋白酶。
在实施例中，本发明的组合物包含：
i)嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体；
ii)本发明的变体普鲁兰酶；
iii)任选地蛋白酶；以及
其中α-淀粉酶与蛋白酶之间的比率(微克α-淀粉酶:微克蛋白酶)是在从1:1和1:50的范围内。
在实施例中，α-淀粉酶与蛋白酶之间的比率是在1:3和1:40之间，如大约1:4(微克α-淀粉酶:微克蛋白酶)的范围内。
在实施例中，α-淀粉酶与普鲁兰酶之间的比率(微克α-淀粉酶:微克普鲁兰酶)是在1:1和1:10之间，如大约1:2.5或1:5。
根据本发明，普鲁兰酶能以有效量添加，包括约2-100微克酶蛋白/克DS，优选5-50微克酶蛋白/克DS的优选量。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于测定部分中。
在液化期间存在的和/或添加的碳水化合物源产生酶
根据本发明，碳水化合物源产生酶(优选地热稳定的葡糖淀粉酶)在液化期间与热稳定的α-淀粉酶以及任选地热稳定的蛋白酶一起存在和/或添加。如上所述，普鲁兰酶也可以是在液化步骤i)期间存在的和/或添加的。
术语“碳水化合物源产生酶”包括产生可发酵糖的任何酶。碳水化合物源产生酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能量源，例如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的工艺中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成所希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用碳水化合物源产生酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。
在优选实施例中，碳水化合物源产生酶是热稳定的葡糖淀粉酶。碳水化合物源产生酶(特别是热稳定的葡糖淀粉酶)可以与热稳定的α-淀粉酶和任选地热稳定的蛋白酶一起或分别添加。
在实施例中，碳水化合物源产生酶(优选地是热稳定的葡糖淀粉酶)在85℃具有至少20％、至少30％、优选地至少35％的相对活性热稳定性。在实施例中，碳水化合物源产生酶是在pH 4.5时具有至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％的相对活性的葡糖淀粉酶。
在特定的实施例中，碳水化合物源产生酶是热稳定的葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2并在本文SEQ ID NO:16中所示的草酸青霉的菌株，。
在优选实施例中，碳水化合物源产生酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的以及SEQ ID NO:16所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，其具有K79V取代。在另一个优选实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有K79V取代(使用SEQ ID NO:16进行编号)，并且进一步包含以下突变中的一个：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T，并且
其中，葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
在一个实施例中，碳水化合物源产生酶能以从0.1-100微克EP/g、例如0.5-50微克EP/g、例如1-25微克EP/g、例如2-12微克EP/g DS的量添加。
本发明的方法
本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法。特别地，产物是醇，更特别是乙醇。
诸位发明人已经发现，当具有增加的热活性和/或增加的热活性的根据本发明的普鲁兰酶变体在液化期间与至少一种α-淀粉酶一起存在或添加时，可以获得增加的乙醇产率。
生产本发明的发酵产物的方法
在具体方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。
在另一个具体方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
c)使用发酵生物进行发酵。
在优选实施例中，发酵产物是在发酵之后回收，例如通过蒸馏。在实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
在液化中存在的和/或添加的α-淀粉酶
在本发明方法的液化步骤a)期间添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，其在液化中使用的温度下典型地是稳定的。
在实施例中，α-淀粉酶来自微小杆菌属或芽孢杆菌属的菌株。
在优选的实施例中，α-淀粉酶来自嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，如在WO 99/019467中所示的SEQ ID NO:3或在本文的SEQ ID NO:6中所示的序列。在实施例中，α-淀粉酶是在本文的SEQ ID NO:6中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，如与本文的SEQ ID NO:6具有至少80％，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的同一性的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选地在C-末端，优选地截短以具有约491个氨基酸，如从480至495个氨基酸。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更特别地在位置I181+G182、R179+G180、G180+I181、R179+I181或G180+G182(优选I181+G182)处的双缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242处具有取代，优选S242Q取代。
在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188处具有取代，优选E188P取代。
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体组成的组，这些变体除在从位置179至位置182的区域中的双缺失(特别是I181*+G182*)和任选地N193F之外还具有以下突变。
在优选实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQID NO:6进行编号)。
根据本发明，α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，并且甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
根据本发明，α-淀粉酶能以0.1至100微克/克DS，如0.5至50微克/克DS、如1至25微克/克DS、如1至10微克/克DS、如2至5微克/克DS的浓度存在和/或添加。
在实施例中，α-淀粉酶与普鲁兰酶之间的比率(微克α-淀粉酶:微克普鲁兰酶)是在1:1和1:10之间，如大约1:2.5或1:5。
根据本发明，普鲁兰酶能以有效量添加，包括约2-100微克酶蛋白/克DS，优选5-50微克酶蛋白/克DS的优选量。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于测定部分中。
液化期间存在的和/或添加的蛋白酶
在优选实施例中，本发明的方法进一步包括在液化中添加蛋白酶。
根据本发明，热稳定蛋白酶可以任选地在液化期间与本发明的变体普鲁兰酶和α-淀粉酶(如热稳定的α-淀粉酶)一起存在和/或添加。
关于合适的蛋白酶的更多细节，参见上面的组合物部分。
在优选实施例中，热稳定的蛋白酶是披露为以下项的金属蛋白酶的变体：披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:7，该变体具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L，并且其中该蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:7的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
热稳定蛋白酶还可以源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本说明书定义的热稳定性特性。
在实施例中，热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。
在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司)中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8所示的蛋白酶。
在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:8中的蛋白酶或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8具有至少80％的同一性，例如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的同一性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中，在糖化和/或发酵，优选同时糖化和发酵(SSF)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。
在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌(T.cingulata)；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(Nigrofomes)的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶是源自篮状菌属、如埃默森篮状菌的菌株、如示于本文的SEQ ID NO:10中的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文中SEQ ID NO:10的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是描述于WO 2011/066576中的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，如示为WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ ID NO:11的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶是源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如在WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在优选实施例中，葡糖淀粉酶是在WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:12中所示的篱边粘褶菌。
在优选实施例中，葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，如在本文的SEQ ID NO:12中所示的篱边粘褶菌。在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文中SEQ ID NO:12的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在另一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自密粘褶菌，如示于本文的SEQ ID NO:13中的菌株。在实施例中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文中SEQ ID NO:13的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶源自栓菌属的菌株，特别是披露于WO 2006/069289中的和在本文披露为SEQ ID NO:14的瓣环栓菌的菌株。
在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL和AMGTME(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自杜邦公司)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自杜邦公司)。
根据本发明的优选实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与α-淀粉酶组合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。
在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶
在实施例中，在本发明的方法中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加α-淀粉酶。在优选实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在优选实施例中，α-淀粉酶是真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。
在优选实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，如在WO 2013/006756的SEQ ID NO:3中所示的菌株，如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如在本文的SEQ ID NO:15中所示的杂合体或其变体。
在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:15的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:15的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在优选实施例中，α-淀粉酶是在SEQ ID NO:15中所示的具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:15进行编号)。
在实施例中，源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选如本文的SEQ ID NO:15披露的，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:15进行编号)。
在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶变体与本文的SEQID NO:15的多肽具有至少75％的同一性，优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，并且甚至最优选地至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
在优选实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、例如从100:1至1:1、例如从100:2至100:50、例如从100:3至100:70的范围内。
本发明的方法的另外方面
液化步骤a)之前，本发明的方法可包括以下步骤：
i)优选地通过干磨来减小该含淀粉材料的粒度；
ii)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
在实施例中，至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
在实施例中，液化期间的pH是在高于4.5至6.5之间，如4.5至5.0、如约4.8，或在5.0至6.2之间的pH，如5.0至6.0，如在5.0至5.5之间，如约5.2、如约5.4、如约5.6、如约5.8。
在实施例中，液化期间的温度高于初始糊化温度，优选在从70℃至100℃的范围内，如在75℃至95℃之间、如在75℃至90℃之间，优选在80℃至90℃之间，尤其是约85℃。
在实施例中，在步骤a)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。在实施例中，喷射蒸煮是在110℃至145℃之间，优选120℃至140℃，如125℃至135℃，优选约130℃的温度进行约1至15分钟，优选约3至10分钟，尤其是约5分钟。
在优选实施例中，糖化和发酵顺序进行或同时进行。
在实施例中，糖化是在从20℃至75℃，优选从40℃至70℃，如约60℃的温度，并且在4和5之间的pH进行。
在实施例中，发酵、或同时糖化和发酵(SSF)在从25℃至40℃，如从28℃至35℃、如从30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
在优选实施例中，发酵产物是在发酵之后回收，例如通过蒸馏。
在实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
在实施例中，含淀粉起始材料是全谷物。在实施例中，含淀粉材料选自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻以及马铃薯的组。
在实施例中，发酵生物是酵母，优选酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母的菌株。
在实施例中，步骤(a)中的温度高于初始糊化温度，如在80℃至90℃之间的温度，如约85℃。
在实施例中，本发明的方法在糖化步骤b)之前进一步包括预糖化步骤，该预糖化步骤在30℃至65℃之间的温度进行40分钟至90分钟。在实施例中，糖化是在从20℃至75℃，优选从40℃至70℃，如约60℃的温度，并且在4和5之间的pH进行。在实施例中，发酵步骤c)或同时糖化和发酵(SSF)(即，步骤b)和c))在从25℃至40℃，如从28℃至35℃、如从30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在实施例中，发酵步骤c)或同时糖化和发酵(SSF)(即，步骤b)和c))进行6至120小时，特别是24至96小时。
在实施例中，发酵产物是通过蒸馏回收。
发酵培养基
进行发酵的环境通常称为“发酵培养基(fermentation media或fermentationmedium)”。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(例如乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。
在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从105至1012，优选从107至1010的范围内，尤其是约5x 107个。
可商购的酵母的实例包括例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。
含淀粉材料
根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适用于本发明的方法中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉，或谷类。还考虑了糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。在优选实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。
在以下编号的段落中进一步总结了本发明：
1.一种相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的变体普鲁兰酶，该变体普鲁兰酶包含在选自对应于SEQ ID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804和811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
2.如段落1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置432的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置432处包含缬氨酸，特别是F432V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
3.如段落1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置486的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置486处包含丙氨酸或缬氨酸，特别是T486A,V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
4.如段落1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置370的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置370处包含丝氨酸，特别是K370S取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
5.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中这些取代选自由以下组成的组：K370S、F17Y、D77G、S103K、Q106W、A107D、A190I、V196T,C、T197I、T262V、Q279R、N283F、H321V、D367G,N、S375H、N382T、Q399N、N401D、S402Q、N411L、Y412F、F432V、Q434E、L435A、R443G、I446V、G459E、V460E、H479N、T486A,V、I490L、Q498R、V514A、T529L、S531R、A533I、N541D、A545I、L581F、N583D、Q595R、D649A、V665I、D688A、F700L、P709I、E804S、和G811R。
6.如段落1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用PHADEBAS测定，将热稳定性确定为在选自60℃-90℃、例如70℃-87℃范围的两个不同温度下进行30min高温胁迫后的相对活性，并且随后在60℃-80℃、例如70℃下进行测定。
7.如段落1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用TSA测定，将热稳定性确定为相比于亲本普鲁兰酶的增加的解链(变性)温度。
8.如段落1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用PHADEBAS测定，将热活性确定为在选自70℃-86℃范围的两个不同温度下确定的相对活性。
9.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中该变体包含选自由以下组成的组的取代和/或缺失的组合：
Q279R+K370S；
H321E+K370S；
K370S+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N；
K370S+N401D；
K370S+F432V；
V196T+K370S；
V196C+K370S；
T197I+K370S；
K370S+V460E；
K370S+T486A；
K370S+T486V；
K370S+I490L；
K370S+V514A；
K370S+T529L；
K370S+S531R；
K370S+Q595R；
H321E+K370S+F432V；
K370S+F432V+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N+F432V；
K370S+N401D+F432V；
V196T+K370S+F432V；
V196C+K370S+F432V；
T197I+K370S+F432V；
K370S+F432V+G459E；
K370S+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486V；
V196T+K370S+F432V+T486A；
T197I+K370S+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+F432V+T486A；
K370S+Q399N+F432V+T486A；
K370S+N401D+F432V+T486A；
K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
K370S+S531R+F432V+T486A；
K370S+Q595R+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
S103K+T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486V+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
D77G+T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+Q106W+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+A107D+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+V196C+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N583D+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367G+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367N+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+S375H+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N382T+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+N411L+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+Y412F+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+Q434E+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+R443G+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+I446V+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+Q498R+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A533I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N541D+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A545I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+L581F+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+H479N+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367N+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+S375H+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+Y412F+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A533I+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+L581F+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q F432V L435A T486VS531R Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q Y412F F432V L435A T486VS531R Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531RA533I Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531RL581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RV665I V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RF700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RP709I V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435AT486V S531R Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q F432V L435A T486VS531R A533I Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435AT486V S531R A533I L581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432VQ434E L435A T486V S531R A533I L581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432VL435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432VL435A T486V S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432VQ434E L435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
F17Y D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RE804S V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RG811R V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G A190I T197I N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I T262V N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A H479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；以及
D77G A190I T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412FF432V Q434E L435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*。
10.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C，以及任选地L432F。
11.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R，以及任选地L432F。
12.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含缺失P30*+V31*+N32*，以及任选地Q29G。
13.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含修饰Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+F456W+E560R，以及任选地N197T、M402S、I460V、N479H、I514V中的一个、两个、三个、四个或五个。
14.如前述段落中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含修饰N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E++N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R+Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+F456W+E560R，以及任选地L432F、N197T、M402S、N479H、I460V、I514V中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
15.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体包含取代X370S+X432V，特别是K370S+L,F432V，以及任选地X492A,S。
16.如权利要求1-15中任一项所述的变体，其中在85℃下进行2小时或在91℃下进行30min麦芽糖糊精的酶促反应，并且随后在55℃下通过PAHBAH测定来确定消化的麦芽糖糊精级分后，这些变体的热活性相对于亲本普鲁兰酶、例如披露为SEQ ID NO:3的普鲁兰酶增加了至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。
17.如前述段落中任一项所述的变体，其中使用TSA测定，确定为与披露于SEQ IDNO:3中的亲本普鲁兰酶相比增加的解链(变性)温度的热稳定性的增加是至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.8℃、至少1.0℃、至少1.2℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃、至少3.0℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃、至少5.0℃。
18.一种编码如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶的多核苷酸。
19.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
20.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
21.一种组合物，该组合物包含如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶和稳定剂。
22.如段落21所述的组合物，该组合物包含α-淀粉酶。
23.如段落22所述的组合物，其中该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，特别地是源自芽孢杆菌或微小杆菌物种，例如像地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶。
24.如段落22和23中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶来自嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如在SEQ ID NO:6中所示的α-淀粉酶。
25.如段落23和24中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选地截短以具有约491个氨基酸，例如480-495个氨基酸。
26.如段落23-25中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的范围内的两个位置处，如在位置I181+G182、R179+G180、G180+I181、R179+I181或G180+G182，优选I181+G182处具有缺失，和任选地N193F取代(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
27.如段落23-26中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242处具有取代，优选地S242Q取代。
28.如段落23-27中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188处具有取代，优选E188P取代。
29.如段落21-28中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体组成的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQID NO:6进行编号)。
30.如段落21-29中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，并且甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
31.如段落21-30中任一项所述的组合物，该组合物包含蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如S8丝氨酸蛋白酶。
32.如段落31所述的组合物，该组合物包含蛋白酶，优选地选自火球菌属物种(Pyrococcus sp)蛋白酶、例如SEQ ID NO:8所示的强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)蛋白酶，或与SEQ ID NO:8的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性的蛋白酶。
33.如段落31所述的组合物，该组合物包含蛋白酶，优选地选自嗜热子囊菌属物种(Thermoascus sp)的蛋白酶，例如橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)蛋白酶，特别是橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体SEQ ID NO:7，该变体包含以下特定取代组合中的一个：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L，并且其中该蛋白酶与SEQ IDNO:7的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
34.如段落31所述的组合物，该组合物包含蛋白酶，优选地选自古球菌属物种(Palaeococcus sp.)S8蛋白酶，特别是SEQ ID NO:9所示的嗜铁古老球菌(Palaeococcusferrophilus)S8蛋白酶，或与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性的蛋白酶。
35.如段落21-34中任一项所述的组合物，该组合物包含热稳定的葡糖淀粉酶，优选草酸青霉(Penicillium oxalicum)葡糖淀粉酶，更优选SEQ ID NO:16所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，该变体包含K79V取代(使用SEQ ID NO:16进行编号)，并且进一步包含以下突变中的一个：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T，
并且其中，该葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但低于100％的同一性。
36.一种产生如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落20所述的宿主细胞。
37.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。
38.一种用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
c)使用发酵生物进行发酵。
39.如段落37-38中任一项所述的方法，其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌起源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株,优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
40.如段落39所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如在本文的SEQID NO:10中所示的埃默森篮状菌。
41.如段落40所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文中SEQ ID NO:10的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
42.如段落39所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，如在SEQ ID NO:12中所示的篱边粘褶菌。
43.如段落42所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:12的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
44.如段落39所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如在SEQ ID NO:13中所示的密粘褶菌。
45.如权利要求44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:13的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
46.如段落39-45中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶与α-淀粉酶组合存在于糖化和/或发酵中。
47.如段落46所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。
48.如段落46和47所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如在SEQ ID NO:15中所示的杂合体。
49.如段落46-48中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
50.如段落49所述的方法，其中该α-淀粉酶包含以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:15进行编号)。
51.如段落39-50中任一项所述的方法，该方法在液化步骤a)之前进一步包括以下步骤：
i)优选地通过干磨来减小该含淀粉材料的粒度；
ii)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
52.如段落37-51中任一项所述的方法，其中至少50％、优选地至少70％、更优选地至少80％、尤其至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
53.如段落37-52中任一项所述的方法，其中液化中的pH在高于4.5-6.5之间，例如约4.8，或在5.0-6.2之间的pH，例如5.0-6.0，例如在5.0-5.5之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8。
54.如段落37-53中任一项所述的方法，其中液化中的温度高于初始糊化温度，例如在从70℃-100℃的范围内，例如在75℃-95℃之间，例如在75℃-90℃之间，优选在80℃-90℃之间，尤其是约85℃。
55.如段落37-54中任一项所述的方法，其中在步骤a)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。
56.如段落55所述的方法，其中该喷射蒸煮是在110℃-145℃、优选120℃-140℃、例如125℃-135℃、优选约130℃的温度下进行持续约1-15分钟，优选持续约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。
57.如段落37-56中任一项所述的方法，其中糖化是在从20℃-75℃、优选从40℃-70℃、例如约60℃的温度下，并且在4和5之间的pH下进行。
58.如段落38-57中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化和发酵(SSF)是在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行的。
59.如段落38-58中任一项所述的方法，其中该发酵产物是在发酵之后(例如通过蒸馏)回收的。
60.如段落38-59中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
61.如段落37-60中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。
62.如段落37-61中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。
63.如段落37-62中任一项所述的方法，其中在液化中添加/存在如权利要求21-35中任一项所述的组合物。
64.如段落38-63中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母，优选酵母属菌株，尤其是酿酒酵母菌株。
65.如段落20所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母宿主细胞，特别是酵母属的菌株，更特别是酿酒酵母。
66.如段落20或65所述的宿主细胞在对水解的淀粉进行发酵中的用途。
67.如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在酿造过程中的用途。
68.如段落1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在含淀粉材料的液化中的用途。
69.一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向醪液中添加如段落1-17中任一项所述的普鲁兰酶。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
酶
蛋白酶PfuS：源自强烈火球菌的蛋白酶，示于SEQ ID NO:8中。
α-淀粉酶BE369(AA369)：本文中披露为SEQ ID NO:5并且其进一步具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
Ms-海藻糖酶：瘤孢毁丝霉(Myceliophthora sepedonium)海藻糖酶(WO 2016/205127中的SEQ ID NO:30)以及本文的SEQ ID NO:17。
α-淀粉酶共混物AA：包括以下项的共混物：α-淀粉酶AA369和蛋白酶PfuS(剂量：2.1μg EP/g DS AA369，3.0μg EP/g DS PfuS，其中EP是酶蛋白并且DS是总干固体)。
葡糖淀粉酶A共混物：共混物包含：在WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(Te AMG)、在WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶(Tc AMG)以及披露于本文SEQ ID NO:15中的具有以下取代G128D+D143N(使用SEQ IDNO:15进行编号)的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)(Rp AA)的微小根毛霉α-淀粉酶(AGU:AGU:FAU-F中活度比为约29:8:1)。
葡糖淀粉酶B共混物：与葡糖淀粉酶共混物A相同，进一步具有含有里氏木霉纤维素酶制剂、瘤孢毁丝霉的海藻糖酶(WO 2016/205127中的SEQ ID NO:30)和本文的SEQ IDNO:17的纤维素酶组合物，该制剂含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)、以及青霉属物种(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)(剂量：Te AMG 60μg EP/gDS；Tc AMG20μg EP/gDS；Rp AA 11μg EP/gDS；纤维素酶组合物30μg EP/gDS，Ms海藻糖酶1μg EP/gDS)。
酵母：来自美国Fermentis公司的ETHANOL REDTM
测定
蛋白酶测定
1)动力学Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、和11.0。
将20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
2)端点Suc-AAPF-pNAAK测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 7.0。
将200μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用测定缓冲液稀释45倍)用移液管移至Eppendorf管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％TritonX-100中)。通过将Eppendorf管转移至设置为测定温度的Eppendorf热混器中来启动测定。将管在Eppendorf热混器上在最高振荡速率(1400rpm)下孵育持续15分钟。通过转移管返回至冰浴并添加600μl 500mM琥珀酸/NaOH(pH 3.5)来停止孵育。通过涡旋混合Eppendorf管后，将200μl混合物转移至微量滴定板中。读取OD405作为蛋白酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(代替酶)。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
能以葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
诺维信葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性地反应，形成NADH，使用光度计在340nm下测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
<u>AMG孵育：</u>
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1℃
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
<u>显色反应：</u>
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1℃
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α淀粉酶活性测定
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下将淀粉酶活性确定为淀粉浓度的降低。
Figure BDA0003231125690000731
λ＝590nm
蓝色/紫色 t＝23sec. 脱色
标准条件/反应条件：
Figure BDA0003231125690000732
温度：
反应时间： 23秒
波长： 590nm
酶 0.025AFAU/mL
浓度：
酶工作 0.01-0.04AFAU/mL
范围：
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
FAU-F的确定
相对于具有声明强度的酶标准品测量FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungal Alpha-Amylase Units(Fungamyl))。
Figure BDA0003231125690000741
更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解期间蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
1个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)下，糊精化5260mg淀粉干物质默克公司(Merck)可溶性淀粉的酶量。
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0009.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。
pNP-G7测定法
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-□,D-麦芽庚糖苷的缩写的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶例如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解的底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可以通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)下测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、≥4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mM CaCl2，pH 8.0。
程序：
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至其中斜率为0.4吸光度单位/分钟以下的水平。
Figure BDA0003231125690000751
测定法：
为了确定残余淀粉酶活性，可以使用
Figure BDA0003231125690000752
Ultr淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州，美国)。
底物是玉米淀粉衍生物DQTM淀粉，它是用
Figure BDA0003231125690000753
FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。将含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升的50mM乙酸钠(pH4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下在黑暗中放置，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升的100mM乙酸盐、0.01％(w/v)
Figure BDA0003231125690000761
X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5，充分涡旋并在室温下在黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)
Figure BDA0003231125690000762
X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(W/v)
Figure BDA0003231125690000763
X100、0.125mM CaCl2，pH5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。
为了测定，在黑色384孔微量滴定板中，将25微升的底物工作溶液与25微升稀释的酶混合10秒。在每个孔中在25℃下于15分钟内每分钟测量一次荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并计算荧光强度相对于时间的曲线的斜率作为Vmax。曲线应是线性的，并且调节了残余活性测定使得稀释的参考酶溶液在活性测定的线性范围内。
普鲁兰酶测定
普鲁兰酶活性(NPUN)测定
相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量NPUN中的内切-普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)下每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
将1mL稀释的样品或标准品在40℃孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的OD并使用标准曲线计算活性。
Phadebas热稳定性测定
将含有所希望的酶的培养物上清液与相同体积的pH 5.0 400mM NaOAc缓冲液混合。将20微升此混合物分配于96孔板或8带PCR管中，然后在多种温度下通过热循环仪加热30min。将那些样品与含有2％(w/v)phadebas[麦戈尔生命科学公司(magle lifescience)]的100μl底物溶液于pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合，并且在70℃下孵育30min以进行酶促反应。反应后，添加50μl的18％乙酸以停止反应。取出80微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD600值以评估酶活性。
Phadebas热谱测定
将含有所希望的酶的培养物上清液与相同体积的pH 5.0 400mM NaOAc缓冲液混合。将20微升此混合物分配于96孔板或8带PCR管中，然后与含有2％(w/v)phadebas[麦戈尔生命科学公司]的100μl底物溶液于pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合。将那些样品在多种温度下孵育30min以进行酶促反应。反应后，添加50μl的18％乙酸以停止反应。取出80微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD600值以评估酶活性。
实例1：普鲁兰酶文库的构建
如下构建普鲁兰酶文库。
设计在一个或多个靶位点处具有NNK或一个或多个所希望的突变的正向或反向引物，这些靶位点彼此具有15bp的重叠。通过以下条件使用适当的模板质粒DNA(例如含有P604编码基因的质粒DNA)进行反向PCR，即通过反向定向引物来扩增整个质粒DNA序列。通过QIAquick凝胶提取试剂盒[凯杰公司(QIAGEN)]来纯化所得PCR片段，然后将其引入大肠杆菌DH5α(Competent HIGH)[东洋公司(TOYOBO)]。通过MagExtractor质粒提取试剂盒[东洋公司(TOYOBO)]从大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，然后将其引入枯草芽孢杆菌感受态细胞中。
PCR反应混合物：
PrimeSTAR Max DNA聚合酶[宝生物公司(TaKaRa)]
总计25μl
Figure BDA0003231125690000771
Figure BDA0003231125690000781
PCR程序：
98℃/2min
25x(98℃/10sec，60℃/15sec，72℃/2min)
10℃/保持
实例2：筛选更好的热稳定性
将如实例1中构建的枯草芽孢杆菌文库在800rpm、37℃下于96孔或24孔MTP(含有10R-av-30C培养基(6.0g/L(NH4)2HPO4、26g/L细菌蛋白胨(Bacto pepton)、1.2g/LMgSO4.7H2O、12g/L KH2PO4、5.0g/L Na2HPO4、1.8g/L K2SO4、0.1g/L CaCl2.2H2O、33g/L葡萄糖、4.9mg/L MnSO4.5H2O、19.7mg/L FeSO4.7H2O、1.0mg/L CuSO4.5H2O、3.0mg/L ZnCl2、196mg/L柠檬酸)以及8.0mg/L氯霉素)中发酵过夜。然后，在几种温度下通过如下所述的Phadebas测定来测量培养物上清液中的普鲁兰酶活性。
Phadebas热稳定性测定
将含有所希望的酶的培养物上清液与相同体积的pH 5.0 400mM NaOAc缓冲液混合。将20微升此混合物分配于96孔板或8带PCR管中，然后在多种温度下通过热循环仪加热30min。将那些样品与含有2％(w/v)phadebas[麦戈尔生命科学公司(magle lifescience)]的100μl底物溶液于pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合，并且在70℃下孵育30min以进行酶促反应。反应后，添加50μl的18％乙酸以停止反应。取出80微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD600值以评估酶活性。
Phadebas热谱测定
将含有所希望的酶的培养物上清液与相同体积的pH 5.0 400mM NaOAc缓冲液混合。将20微升此混合物分配于96孔板或8带PCR管中，然后与含有2％(w/v)phadebas[麦戈尔生命科学公司]的100μl底物溶液于pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合。将那些样品在多种温度下孵育30min以进行酶促反应。反应后，添加50μl的18％乙酸以停止反应。取出80微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD600值以评估酶活性。
PAHBAH-麦芽糖糊精(DE3)测定
底物溶液
1g麦芽糖糊精(来自松谷化学工业公司(MATSUTANI chemical industry Co.,Ltd.)的pindex100)
5ml 50mM乙酸钠缓冲液，pH 5
PAHBAH溶液
0.0552g乙酸铋(III)
0.2g PAHBAH
0.5g酒石酸钠钾，四水合物
10ml 500mM NaOH
将10μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度下孵育2小时(85℃)或30min(91℃)。添加10μl的0.5N NaOH以终止反应，并且将管冷却至55℃。用50mM的乙酸钠缓冲液pH 5将反应混合物稀释40倍。将40μl的PAHBAH溶液添加至120μl稀释的混合物中，在55℃下再孵育20min并且在A405处读取吸光度。
表1a.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P604或P609)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000791
Figure BDA0003231125690000792
Figure BDA0003231125690000801
Figure BDA0003231125690000802
Figure BDA0003231125690000803
Figure BDA0003231125690000804
Figure BDA0003231125690000811
Figure BDA0003231125690000812
表1b.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P632)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000813
表1c.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P656)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000821
Figure BDA0003231125690000822
表1d.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P685或P698)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000823
Figure BDA0003231125690000831
Figure BDA0003231125690000832
表1e.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P719)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000833
Figure BDA0003231125690000834
Figure BDA0003231125690000835
Figure BDA0003231125690000841
表1f.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P781)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000842
表1g.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P797)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000843
Figure BDA0003231125690000851
Figure BDA0003231125690000852
Figure BDA0003231125690000853
Figure BDA0003231125690000861
Figure BDA0003231125690000862
Figure BDA0003231125690000863
Figure BDA0003231125690000864
表1h.普鲁兰酶变体相比于其亲本(P944或P993)的相对活性列表
Figure BDA0003231125690000865
Figure BDA0003231125690000871
Figure BDA0003231125690000872
Figure BDA0003231125690000873
表2.热稳定变体对P604的取代
Figure BDA0003231125690000874
Figure BDA0003231125690000881
Figure BDA0003231125690000891
Figure BDA0003231125690000901
Figure BDA0003231125690000911
Figure BDA0003231125690000921
Figure BDA0003231125690000931
Figure BDA0003231125690000941
Figure BDA0003231125690000951
实例3：芽孢杆菌属菌株的发酵
将枯草芽孢杆菌菌株在200rpm、37℃下于回转式摇床上的500ml带挡板烧瓶中发酵，这些烧瓶含有100ml 10R-av-30C以及8mg/L氯霉素。将培养液离心(10,000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开。
实例4：普鲁兰酶的纯化
通过以下两个步骤对普鲁兰酶变体进行纯化：硫酸铵沉淀和阳离子交换层析法。最终，使用离心过滤装置(Vivaspin Turbo 15，赛多利斯公司(Sartorius))将样品脱盐并用20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5进行缓冲液交换。通过A280值确定酶浓度。
实例5：热稳定性测定(TSA)
将纯化的酶用50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司)混合。将18μl的混合物溶液转移至LightCycler480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。
TSA的设备参数：
仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))
扫描速率：0.02℃/sec
扫描范围：37℃-96℃
积分时间：1.0sec
激发波长465nm
发射波长580nm
将获得的荧光信号归一化到0和1的范围内。将Td2定义为最大信号强度时的温度。
热稳定性改善列于表3中，JPUL604的Td2为0。
实例6：普鲁兰酶测定
PAHBAH-麦芽糖糊精(DE3)测定
底物溶液
1g麦芽糖糊精(来自松谷化学工业公司(MATSUTANI chemical industry Co.,Ltd.)的pindex100)
5ml 50mM乙酸钠缓冲液，pH 5
PAHBAH溶液
0.0552g乙酸铋(III)
0.2g PAHBAH
0.5g酒石酸钠钾，四水合物
10ml 500mM NaOH
将10μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度下孵育2小时(85℃)或30min(91℃)。添加10μl的0.5N NaOH以终止反应，并且将管冷却至55℃。用50mM的乙酸钠缓冲液pH 5将反应混合物稀释40倍。将40μl的PAHBAH溶液添加至120μl稀释的混合物中，在55℃下再孵育20min并且在A405处读取吸光度。
将活性作为相比于JPUL604活性的相对活性列于表3中。
表3
Figure BDA0003231125690000961
Figure BDA0003231125690000971
Figure BDA0003231125690000981
Figure BDA0003231125690000991
Figure BDA0003231125690001001
实例7：所选变体在淀粉至乙醇过程中的应用
在液化过程中添加JPUL604、JPUL609、JPUL719变体酶对在同时糖化和发酵过程中增加乙醇滴度的作用。
使用Labomat BFA-24(北卡罗来纳州康科德市马西斯公司(Mathis,Concord,NC))在金属罐中进行液化。在罐中添加37.2g工业生产的磨碎的玉米(88.7％干固体)和62.7g自来水，并充分混合。目标干固体为约33％DS。将pH调节至pH 5.0并使用水分天平(Mettler-Toledo)测量干固体。将α-淀粉酶BE369以0.016％(w/w)加入到玉米浆料中，该玉米浆料含有或不含有如下表中所示的适当量的JPUL变体酶。玉米浆料混合物的总重量为100g。作为对照，仅添加α-淀粉酶BE369，并且不添加JPUL酶。液化在Labomat室中于85℃下进行2小时。液化后，将罐在冰浴中冷却至室温，然后将液化的醪液转移到各自的容器中，随后补充3ppm的青霉素和1000ppm的尿素。使用Ethanol RedTM酵母经由小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将大约5g每种上述液化的玉米醪液添加至15ml管制瓶中。向每个瓶中加入0.6AGU/gDS的商业葡糖淀粉酶，葡糖淀粉酶B共混物，随后每5g浆料添加100微升的水合酵母。实际葡糖淀粉酶剂量是基于每个瓶中液化的玉米醪液的精确重量。将小瓶在32℃下孵育。使用四次重复以进行52小时时间点发酵。通过添加50微升的40％H2SO4来终止发酵，随后离心，并且通过0.2微米过滤器来过滤。使用HPLC确定乙醇和低聚糖浓度。
表4
Figure BDA0003231125690001011
Figure BDA0003231125690001021
结果
如下表结果所示，与对照相比，在液化中一起添加JPUL变体酶和α-淀粉酶BE369增加了乙醇产率。
表
Figure BDA0003231125690001022
Figure IDA0003231125720000011
Figure IDA0003231125720000021
Figure IDA0003231125720000031
Figure IDA0003231125720000041
Figure IDA0003231125720000051
Figure IDA0003231125720000061
Figure IDA0003231125720000071
Figure IDA0003231125720000081
Figure IDA0003231125720000091
Figure IDA0003231125720000101
Figure IDA0003231125720000111
Figure IDA0003231125720000121
Figure IDA0003231125720000131
Figure IDA0003231125720000141
Figure IDA0003231125720000151
Figure IDA0003231125720000161
Figure IDA0003231125720000171
Figure IDA0003231125720000181
Figure IDA0003231125720000191
Figure IDA0003231125720000201
Figure IDA0003231125720000211
Figure IDA0003231125720000221
Figure IDA0003231125720000231
Figure IDA0003231125720000241
Figure IDA0003231125720000251
Figure IDA0003231125720000261
Figure IDA0003231125720000271
Figure IDA0003231125720000281
Figure IDA0003231125720000291
Figure IDA0003231125720000301
Figure IDA0003231125720000311
Figure IDA0003231125720000321
Figure IDA0003231125720000331
Figure IDA0003231125720000341
Figure IDA0003231125720000351

Claims (28)

1.一种相比于亲本普鲁兰酶具有增加的热稳定性和/或增加的热活性的变体普鲁兰酶，该变体普鲁兰酶包含在选自对应于SEQ ID NO:1的位置432、486、370、17、77、103、106、107、190、196、197、262、279、283、321、367、375、382、399、401、402、411、412、434、435、443、446、459、460、479、490、498、514、529、531、533、541、545、581、583、595、649、665、688、700、709、804和811的位置的至少一个位置处的取代，以及任选地在位置821、822、823、824、825、826、827和828处的一个或多个、例如所有氨基酸的缺失，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置432的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置432处包含缬氨酸，特别是F432V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
3.如权利要求1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置486的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置486处包含丙氨酸或缬氨酸，特别是T486A,V取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
4.如权利要求1所述的变体普鲁兰酶，其包含在对应于SEQ ID NO:1的位置370的位置处的取代，其中该变体普鲁兰酶在使用SEQ ID NO:1进行编号的位置370处包含丝氨酸，特别是K370S取代，其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中该变体与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5组成的组的亲本α淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但低于100％的序列同一性。
5.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中这些取代选自由以下组成的组：K370S、F17Y、D77G、S103K、Q106W、A107D、A190I、V196T,C、T197I、T262V、Q279R、N283F、H321V、D367G,N、S375H、N382T、Q399N、N401D、S402Q、N411L、Y412F、F432V、Q434E、L435A、R443G、I446V、G459E、V460E、H479N、T486A,V、I490L、Q498R、V514A、T529L、S531R、A533I、N541D、A545I、L581F、N583D、Q595R、D649A、V665I、D688A、F700L、P709I、E804S、和G811R。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用PHADEBAS测定，将热稳定性确定为在选自60℃-90℃、例如70℃-87℃范围的两个不同温度下进行30min高温胁迫后的相对活性，并且随后在60℃-80℃、例如70℃下进行测定。
7.如权利要求1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用TSA测定，将热稳定性确定为相比于亲本普鲁兰酶的增加的解链(变性)温度。
8.如权利要求1-5中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中使用PHADEBAS测定，将热活性确定为在选自70℃-86℃范围的两个不同温度下确定的相对活性。
9.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其中该变体包含选自由以下组成的组的取代和/或缺失的组合：
Q279R+K370S；
H321E+K370S；
K370S+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N；
K370S+N401D；
K370S+F432V；
V196T+K370S；
V196C+K370S；
T197I+K370S；
K370S+V460E；
K370S+T486A；
K370S+T486V；
K370S+I490L；
K370S+V514A；
K370S+T529L；
K370S+S531R；
K370S+Q595R；
H321E+K370S+F432V；
K370S+F432V+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
K370S+Q399N+F432V；
K370S+N401D+F432V；
V196T+K370S+F432V；
V196C+K370S+F432V；
T197I+K370S+F432V；
K370S+F432V+G459E；
K370S+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486V；
V196T+K370S+F432V+T486A；
T197I+K370S+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+F432V+T486A；
K370S+Q399N+F432V+T486A；
K370S+N401D+F432V+T486A；
K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
K370S+S531R+F432V+T486A；
K370S+Q595R+F432V+T486A；
K370S+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+Q595R；
S103K+T197I+K370S+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486V+Q595R；
T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
V196T+T197I+K370S+Q399N+N401D+F432V+T486A+S531R+Q595R；
D77G+T197I+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D649A；
D77G+Q106W+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+A107D+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+V196C+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N583D+Q595R；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367G+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367N+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+S375H+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N382T+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+N411L+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+Y412F+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+Q434E+L435A+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+R443G+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+I446V+T486V+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+Q498R+S531R+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A533I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+N541D+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A545I+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+L581F+Q595R+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+H479N+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+D367N+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+S375H+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+Y412F+F432V+L435A+T486V+S531R+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+A533I+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G+T197I+N283F+K370S+N401D+S402Q+F432V+L435A+T486V+S531R+L581F+Q595R+D688A+V821*+S822*+P823*+D824*+H825*+G826*+K827*+K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q F432V L435A T486V S531RQ595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q Y412F F432V L435A T486V S531RQ595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R A533IQ595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R L581FQ595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RV665IV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595R F700LV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RP709IV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435A T486VS531R Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q F432V L435A T486V S531RA533I Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435A T486VS531R A533IL581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A T486V S531R A533I L581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435AT486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V L435AT486V S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434EL435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
F17Y D77G T197IN283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595RV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595R E804SV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F K370S N401D S402Q F432V L435A T486V S531R Q595R G811RV821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I N283F H321V K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434E L435AH479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G A190I T197I N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434E L435AH479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；
D77G T197I T262V N283F K370S S375H N401D S402Q Y412F F432V Q434E L435AH479N T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*；以及
D77G A190I T197I N283F H321V D367N K370S S375H N401D S402Q Y412F F432VQ434E L435A T486V Q498R S531R A533I L581F Q595R D688A F700L V821*S822*P823*D824*H825*G826*K827*K828*。
10.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C，以及任选地L432F。
11.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含取代N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E+N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R，以及任选地L432F。
12.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含缺失P30*+V31*+N32*，以及任选地Q29G。
13.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含修饰Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+F456W+E560R，以及任选地N197T、M402S、I460V、N479H、I514V中的一个、两个、三个、四个或五个。
14.如前述权利要求中任一项所述的变体普鲁兰酶，其包含修饰N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431E++N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R+Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+F456W+E560R，以及任选地L432F、N197T、M402S、N479H、I460V、I514V中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
15.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含取代X370S+X432V，特别是K370S+L,F432V，以及任选地X492A,S。
16.如权利要求1-15中任一项所述的变体，其中在85℃下进行2小时或在91℃下进行30min麦芽糖糊精的酶促反应，并且随后在55℃下通过PAHBAH测定来确定消化的麦芽糖糊精级分后，这些变体的热活性相对于亲本普鲁兰酶、例如披露为SEQ ID NO:3的普鲁兰酶增加了至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。
17.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中使用TSA测定，确定为与披露于SEQ IDNO:3中的亲本普鲁兰酶相比增加的解链(变性)温度的热稳定性的增加是至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.8℃、至少1.0℃、至少1.2℃、至少1.5℃、至少2.0℃、至少2.5℃、至少3.0℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃、至少5.0℃。
18.一种编码如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶的多核苷酸。
19.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
20.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
21.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶和稳定剂。
22.一种生产如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求20所述的宿主细胞。
23.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。
24.一种用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用α-淀粉酶和如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
c)使用发酵生物进行发酵。
25.如权利要求20所述的宿主细胞在对水解的淀粉进行发酵中的用途。
26.如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在酿造过程中的用途。
27.如权利要求1-17中任一项所述的变体普鲁兰酶在含淀粉材料的液化中的用途。
28.一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向醪液中添加如权利要求1-17中任一项所述的普鲁兰酶。
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