ES2337131T3 - Polipeptidos con actividad proteasa y acidos nucleicos que codifican los mismos. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido aislado que tiene una actividad de proteasa, seleccionado en el grupo que consiste en: (a)un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con respecto a los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2 de al menos 80%; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con (i) la proteasa madura codificante de una parte del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 14652, (ii) los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii); y (c) un fragmento de (a) o (b) que tiene una actividad de proteasa.
Description
Polipéptidos con actividad proteasa y ácidos
nucleicos que codifican los mismos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
aislados que tienen una actividad de proteasa y secuencias de ácidos
nucleicos aisladas codificante de polipéptidos. La invención se
refiere también a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y
células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos
así como métodos de producción y de uso de los polipéptidos.
La clonación del gen de penicilolisina (plnC) a
partir de una cepa de Penicillium citrinum está descrita por
Matsumoto et al en Biochim. Biophys. Acta 1218:469 (1994). La
secuencia fue expuesta en la base de datos EMBL como D25535.
WO 97/46689 expone las secuencias (codificantes)
de proteasa siguientes a partir de cepas de Aspergillus
específicas:
SEC N.º ID:1 de WO 97/46689 es un gen parcial de
Aspergillus niger pepH;
SEC N.º ID:2 de WO 97/46689 es un ADNc parcial
de Aspergillus niger pepH;
SEC N.º ID:3 de WO 97/46689 es una secuencia
parcial de aminoácidos de Aspergillus niger PEPH;
SEC N.º ID:4 de WO 97/46689 es un gen de
Aspergillus nidulans pepI;
SEC N.º ID:5 de WO 97/46689 es un ADNc de
Aspergillus nidulans pepI; y
SEC N.º ID:6 de WO 97/46689 es una secuencia de
aminoácidos de Aspergillus nidulans PEPI.
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In Gene 165(1): 121-125
(1995), Ramesh et al revelan la clonación y la
caracterización de los genes codificantes de proteasas a partir de
una cepa de Aspergillus flavus y una cepa de Aspergillus
fumigatus. Estas secuencias fueron expuestas en EMBL como L7524
y U24146, respectivamente.
La secuencia de una proteasa neutra variante
basada en la proteasa neutra II de una cepa de Aspergillus
oryzae está descrita en JP 05-168479. La
clonación de la proteasa neutral madre de Aspergillus oryzae
II está descrita en Mol. Gen, Genet. (1991), 228, p.
97-103 por Hiroki Tatsumi et al.
Las partes del péptido maduro de las proteasas
mencionadas más arriba tienen un grado de identidad en la parte de
péptido maduro de una proteasa Thermoascus de la presente
invención del 75,7% o inferior.
Las secuencias de nucleótidos correspondientes a
las partes del péptido maduro de las proteasas mencionadas más
arriba tienen un grado de identidad en la secuencia de nucleótidos
correspondiente a la parte del péptido maduro de una proteasa
Thermoascus de la presente invención del 68,4% o
inferior.
WO99/34003 revela una metaloproteasa y su uso en
alimentos para animales.
Un objeto de la presente invención consiste en
proveer proteasas alternativas con un potencial para su uso en
alimentos para animales.
La presente invención se refiere a polipéptidos
aislados que tienen una actividad de proteasa seleccionados en el
grupo que consiste en:
- (a)
- un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2;
- (b)
- un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia bajas con
- (i)
- la parte que codifica la proteasa madura del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 14652,
- (ii)
- los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1,
- (iii)
- una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o
- (iv)
- una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii);
- (c)
- una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2 comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos;
- (d)
- una variante alélica de (a) o (b);
- (e)
- un fragmento de (a), (b), o (d) que tiene una actividad de proteasa.
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La SEC N.º ID:1 es una secuencia de ADNc de una
proteasa de Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670 (SEC N.º
ID:1); y la SEC N.º ID:2 es su secuencia de aminoácidos
deducida.
La presente invención se refiere también a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de los
polipéptidos y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y
células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos
así como a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos,
en particular en la alimentación para animales.
La figura 1 muestra los resultados de una prueba
de inhibición en una proteasa de Thermoascus aurantiacus
CGMCC n.º 0670;
La figura 2 muestra el perfil de temperatura de
ésta;
La figura 3 muestra el perfil de pH de ésta;
La figura 4 muestra la estabilidad de pH de
ésta; y
La figura 5 muestra los resultados de una prueba
de la especificidad de sustrato de ésta.
Los inventores han identificado de manera
sorprendente una nueva clase de proteasas que pueden ser útiles en
la alimentación para animales. La mayoría de las proteasas de
alimentos conocidos son proteasas de serina, y muchas de éstas no
son suficientemente estables al ácido para sobrevivir al paso a
través del estómago ácido. Las proteasas de la invención se
relacionan con una metaloproteasa estable en ácido derivada de
Thermoascus aurantiacus. La parte de polipéptido maduro de
esta proteasa comprende aminoácidos 1-177 de SEC N.º
ID:2. Estudios in vitro que simulan la digestión en animales
monogástricos y peces han demostrado que la proteasa de
Thermoascus aurantiacus es capaz de aumentar la cantidad de
proteína soluble y digerible y de aumentar el grado de hidrólisis de
proteína. Un nuevo polipéptido homólogo fue identificado en
Aspergillus oryzae (aminoácidos 177-353 de
SEC
N.º ID:11).
N.º ID:11).
Las proteasas a veces también son peptidasas
designadas, proteinasas, hidrolasas de péptidos, o enzimas
proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidroliza
péptidos comenzando en cualquier de sus extremos, o del tipo endo
que actúan internamente en cadenas de polipéptidos (endopeptidasas).
Las endopeptidasas muestran una actividad en sustratos de péptidos
bloqueados C-terminales y
N-terminales que son relevantes para la
especificidad de la proteasa en cuestión.
El término "proteasa" es definido aquí como
una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Ésta incluye cualquier
enzima del grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una de sus trece
subclases). El número EC se refiere a Enzyme Nomenclature 1992
(nomenclatura de las enzimas) de NC-IUBBM, Academic
Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos
1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223,
1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232,
1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237,
1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250,
1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264,
610-650; respectivamente. La nomenclatura es
completada y actualizada regularmente; véase, por ejemplo la World
Wide Web (WWW) en
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htm).
Las proteasas son clasificadas en base a sus
mecanismos catalíticos en los grupos siguientes: proteasas de serina
(S), proteasas de cisteína (C), proteasas aspárticas (A),
metaloproteasas (M), y proteasas desconocidas, o no clasificadas aún
(U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes (Manual de Enzimas
Proteolíticas), A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds),
Academic Press (1998), en particular la parte de introducción
general.
En formas de realización particulares, las
proteasas de la invención son seleccionadas en el grupo que consiste
en:
- (a)
- proteasas pertenecientes a las metaloendopeptidasas EC 3.4.24;
- (b)
- metaloproteasas pertenecientes al grupo del manual mencionado más arriba;
- (c)
- metaloproteasas no asignadas aún a los clanes (designación: Clan MX), o pertenecientes a uno de los clanes, MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como definido en las páginas 989-991 del manual mencionado más arriba);
- (d)
- otras familias de metaloproteasas (como definido en las páginas 1448-1452 del manual mencionado más arriba);
- (e)
- metaloproteasas con un motivo HEXXH;
- (f)
- metaloproteasas con un motivo HEFTH;
- (g)
- metaloproteasas pertenecientes a una de las familias M3; M26; M27; M32; M34; M35; M36; M41; M43, o M47 (como definido en las páginas 1448-1452 del manual mencionado más arriba); y
- (h)
- metaloproteasas pertenecientes a la familia M35 (como definido en las páginas 1492-1495 del manual mencionado más arriba).
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En otras formas de realización particulares, las
metaloproteasas son hidrolasas en las que el ataque nucleofílico en
un enlace peptídico es mediado por una molécula de agua, la molécula
de agua siendo activada por una catión metálico divalente. Ejemplos
de cationes divalentes son el zinc, el cobalto o el manganeso. El
ión metálico puede ser sostenido por ligandos de aminoácidos. El
número de ligandos puede ser de cinco, cuatro, tres, dos, uno o
cero. En una forma de realización particular el número es de dos o
tres, preferiblemente tres.
Para determinar si una proteasa proporcionada es
una metaloproteasa o no, se hace referencia al manual mencionado
anteriormente y a los principios indicados en éste. Tal
determinación puede realizarse para todos los tipos de proteasas,
sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas
creadas genéticamente o proteasas sintéticas.
La actividad de la proteasa puede ser medida
usando cualquier ensayo, en lo que un sustrato es empleado, esto
incluye enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la
proteasa en cuestión. El pH de ensayo y la temperatura de ensayo
también deben ser adaptados a la proteasa en cuestión. Ejemplos de
pH-valores del ensayo son el pH 6, 7, 8, 9, 10, o
11. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70 o 80ºC.
Ejemplos de sustratos de proteasa son la
caseína, tal como caseína entrecruzada Azurine (caseína AZCL). Dos
ensayos de proteasa están descritos en el ejemplo 1 de la presente,
de los cuales el ensayo denominado de caseína AZCL es un ensayo
preferido para los objetivos de la presente invención.
No hay limitaciones sobre el origen de la
proteasa según la invención. Por lo tanto, el término proteasa no
sólo incluye proteasas naturales o de tipo salvaje obtenidas a
partir de microorganismos de cualquier género, sino también
cualesquiera mutantes, variantes, fragmentos etc. exhibiendo así la
actividad de la proteasa, así como proteasas sintéticas, tales como
proteasas mezcladas, y proteasas de consenso. Estas proteasas
creadas genéticamente pueden ser preparadas como es generalmente
conocido en la técnica, por ejemplo por mutagénesis dirigida, por
PCR (usando un fragmento de PCR comprendiendo la mutación deseada
como uno de los cebadores en las reacciones de PCR), o por
mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso está
descrita por ejemplo en EP 897985. El término "obtenido a partir
de" como se lo utiliza en la presente en relación con una fuente
provista indicará que el polipéptido codificado por la secuencia de
ácidos nucleicos se produce por medio de la fuente o de una célula
en la que está presente la secuencia de ácidos nucleicos de la
fuente. En una forma de realización preferida, el polipéptido es
segregado extracelularmente.
En una forma de realización específica, la
proteasa es una variante hipoalergénica, diseñada para inducir una
respuesta inmunológica reducida cuando está expuesta a animales,
incluyendo el hombre. Los términos respuesta inmunológica deben
entenderse como cualquier reacción al sistema inmunitario de un
animal expuesto a la proteasa. Un tipo de respuesta inmunológica es
una respuesta alérgica que lleva a niveles incrementados de IgE en
el animal expuesto. Variantes hipoalergénicas pueden ser preparadas
mediante el uso de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo la
proteasa puede ser conjugada con porciones de capas protectoras de
mitades de polímeros o epítopos de la proteasa implicada en una
respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar
un acoplamiento químico in vitro del polímero para la
proteasa, por ejemplo tal y como se describe en WO 96/17929,
WO98/30682, WO98/35026, y/o WO99/00489. La conjugación puede también
o alternativamente a ésta implicar el acoplamiento in vivo de
polímeros para la proteasa. Esta conjugación puede ser obtenida por
la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos de
codificación de la proteasa, mediante la inserción de secuencias de
consenso de codificación de sitios de glicosilación adicionales en
la proteasa y de expresión de la proteasa en un huésped capaz de
glicosilar la proteasa, véase por ejemplo WO00/26354. Otra forma de
suministro de variantes hipoalergénicas es la ingeniería genética de
la secuencia de nucleótidos codificante de la proteasa para provocar
la proteasa a oligomerizarse, para que los monómeros de proteasa
puedan proteger los epítopos de otros monómeros de proteasa y de
este modo reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales
productos y su preparación están descritos por ejemplo en
WO96/16177. Epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden
ser identificados por varios métodos tales como el método de
visualización de fagos descrito en WO00/26230 y WO 01/83559, o el
enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que se ha
identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos puede ser
alterada para producir propiedades inmunológicas alteradas de la
proteasa por medio de técnicas conocidas de manipulación genética
como la mutagénesis dirigida (véase por ejemplo WO 00/26230, WO
00/26354 y/o WO00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede ser
efectuada a una proximidad suficiente del epítopo para que el
polímero pueda proteger el epítopo.
La presente invención se refiere a polipéptidos
aislados comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene un
grado de identidad para los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o
preferiblemente aminoácidos 1 a 177 (el polipéptido maduro) de SEC
N.º ID:2 de al menos aproximadamente el 64%, o al menos
aproximadamente el 65%, o al menos aproximadamente el 70%, o al
menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente 76%, o al
menos aproximadamente el 77%, o al menos aproximadamente el 78%, o
al menos aproximadamente el 79%, o al menos aproximadamente el 80%,
o al menos aproximadamente el 82%, o al menos aproximadamente el
85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente
el 95%, o al menos aproximadamente el 97%; y que tienen una
actividad de proteasa (a continuación "polipéptidos
homólogos"). En formas de realización particulares, los
polipéptidos de la invención i) tienen; o ii) consisten en una
secuencia de aminoácidos con un grado de la identidad como se ha
mencionado anteriormente.
La proteasa de Thermoascus aurantiacus,
cuyo polipéptido maduro comprende los aminoácidos
1-177 de SEC N.º ID:2 es por supuesto un ejemplo de
un polipéptido de la invención.
Se describe aquí otro polipéptido derivado de
Aspergillus oryzae y éste comprende la SEC N.º ID:11, o
aminoácidos -23-353; -23-374;
-23-397, 1-353,
1-374, 1-397,
177-353, 177-374; o
177-397 del mismo, y es codificado por la SEC N.º
ID:10, o nucleótidos 2-1129, 2-1195,
2-1267, 71-1129,
71-1195, 71-1267,
599-1129, 599-1195; o
599-1267 del mismo, respectivamente.
Para los objetivos de la presente invención el
grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como el
grado de la identidad entre dos secuencias de nucleótidos, es
determinado por el programa "align" que es una alineación
Needleman-Wunsch (es decir una alineación global).
El programa es usado para la alineación de polipéptidos, así como
secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación por defecto
BLOSUM50 es usada para la alineación de polipéptidos, y la matriz de
identidad por defecto es usada para alineaciones de nucleótidos. La
penalización para el primer residuo de un espacio es -12 para
polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para otros
residuos de un espacio son -2 para polipéptidos, y -4 para
nucleótidos.
"Align" es parte de la versión del paquete
FASTA v20u6 (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved
Tools for Biologícal Sequence Analysis", PNAS
85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and
Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", "Methods
in Enzymology" alineaciones de proteínas FASTA usan el algoritmo
Smith-Waterman sin limitarse en el tamaño (véase
"Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith and M.
S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).
En una forma de realización particular, los
polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que
difiere de cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte,
o quince aminoácidos. En otra forma de realización, los polipéptidos
homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de diez, o
nueve, u ocho, o siete, o seis, o de cinco aminoácidos. En otra
forma de realización particular, los polipéptidos homólogos difieren
de cuatro, o tres, o de dos aminoácidos, o de un aminoácido de los
aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2.
En formas de realización particulares, los
polipéptidos de la presente invención a) comprenden, o b) consisten
en
- i)
- la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2;
- ii)
- la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -23-353; -23-374; -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374, o 177-397 de SEC N.º ID:11; o
variantes alélicas, o fragmentos, de las
secuencias de i) e ii) que tienen una actividad de proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento de aminoácidos -178 a 177; -159 a
177, o +1 a 177 de SEC N.º ID.2 o de aminoácidos
-23-353; -23-374;
-23-397, 1-353,
1-374, 1-397,
177-353, 177-374, o
177-397 de SEC N.º ID:11; es un polipéptido que
tiene uno o más aminoácidos eliminados del terminal amino y/o
carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una forma de
realización un fragmento contiene al menos 75 residuos de
aminoácidos, o al menos 100 residuos de aminoácidos, o al menos 125
residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos, o
al menos 160 residuos de aminoácidos, o al menos 165 residuos de
aminoácidos, o al menos 170 residuos de aminoácidos, o al menos 175
residuos de aminoácidos.
\newpage
Una variante alélica indica cualquiera de dos o
más formas alternativas de un gen que ocupa la misma localización
cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de la
mutación, y puede resultar en el polimorfismo en poblaciones. Unas
mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambio en el
polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que poseen
secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un
polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de
un gen.
La presente invención se refiere también a
polipéptidos aislados que tienen una actividad de proteasa y que son
codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan en
condiciones de astringencia muy bajas, o bajas, o medias, o media
altas, o altas, o muy altas con una sonda de ácidos nucleicos que se
hibridiza en las mismas condiciones con (a) nucleótidos 25 a 1089, 1
a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o preferiblemente
nucleótidos 559 a 1089 de SEC N.º ID:1, (b) la secuencia de ADNc
contenida en nucleótidos 559 a 1089 de SEC N.º ID:1, (c) una
subsecuencia de (a) o (b), o (d) una cadena complementaria de (a),
(b), o (c) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
Nueva York). En una forma de realización particular la sonda de
ácidos nucleicos es seleccionada a partir de las secuencias de
ácidos nucleicos de (a), (b), (c) o (d) mencionadas más arriba.
La subsecuencia de nucleótidos 559 a 1089, 25 a
1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, o 559 a 1344 de SEC N.º ID:1
puede ser de al menos 100 nucleótidos, o en otra forma de
realización de al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia
puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene una actividad
de proteasa.
Las secuencias de ácidos nucleicos de los
nucleótidos 559 a 1089, 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, o
559 a 1344 de SEC N.º ID:1 o una subsecuencia de éstos, así como las
secuencias de aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177,
o +1 a 177 de SEC N.º ID:2 o un fragmento de éstos, pueden ser
usadas para diseñar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y
clonar el ADN codificante de polipéptidos que tienen una actividad
de proteasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos
bien conocidos en el arte de la técnica. En particular, estas sondas
pueden ser usadas para la hibridación con el genómico o ADNc del
género o especies de interés, según los procedimientos de
transferencia de Southern estándar, de manera a identificar y aislar
así el gen correspondiente. Estas sondas pueden ser
considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deben ser
de al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente
de al menos 35 nucleótidos de longitud. Las sondas más largas pueden
ser usadas también. Las dos sondas de ADN y de ARN pueden ser
usadas. Las sondas son marcadas típicamente para detectar el gen
correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S
biotina, o avidina). Tales sondas forman parte de la presente
invención.
En consecuencia, una biblioteca de ADN genómico
o de ADNc preparada a partir de tales otros organismos puede ser
seleccionada para un ADN que se hibridiza con las sondas descritas
anteriormente y que codifica un polipéptido que posee una actividad
de proteasa. El ADN genómico u otro ADN de estos otros organismos
puede ser separado por la electroforesis en gel de poliacrilamida o
de agarosa, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las
bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido hacia e
inmovilizado en nitrocelulosa u otro material de soporte adecuado.
Para identificar un clon o ADN que es homólogo a la SEC N.º ID:1 o
una subsecuencia de ésta, el material de soporte es usado en una
técnica de Southern. Para los objetivos de la presente invención, la
hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos se hibridiza
en una sonda de ácidos nucleicos marcada correspondiente a la
secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC N.º ID:1, su cadena
complementaria, o una subsecuencia de ésta, en condiciones de
astringencia muy bajas a muy altas. Las moléculas en las que la
sonda de ácidos nucleicos se hibridiza en estas condiciones son
detectadas usando una película de rayos X.
En una forma de realización particular, la sonda
de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º
ID:2, o subsecuencias de éstos. En otra forma de realización, la
sonda de ácidos nucleicos es nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a
1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o preferiblemente nucleótidos 559 a
1089 de SEC N.º ID:1 (la región codificante del polipéptido maduro
de SEC N.º ID:1). En otra forma de realización preferida, la sonda
de ácidos nucleicos es la secuencia de ácidos nucleicos, o
preferiblemente la región codificante del polipéptido maduro de
éste, que está incluido en el plásmido incluido en Escherichia
coli DSM 14652, donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica
un polipéptido que posee una actividad de proteasa.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, condiciones de astringencia muy bajas hasta muy altas
se definen como la prehibridación y la hibridación a 42ºC en 5X
SSPE, 0.3% SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y
desnaturalizado, y 25% de formamida para astringencias muy bajas y
bajas, 35% de formamida para astringencias medias y media altas, o
bien 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, según
procedimientos de transferencia de Southern estándar.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, el material de soporte es lavado finalmente tres veces
cada vez durante 15 minutos usando 2 X SSC, el 0.2% SDS
preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más
preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más
preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más
preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia media alta), aún más
preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta), y mucho más
preferiblemente al menos a 70ºC (astringencia muy alta).
Para sondas cortas de aproximadamente 15
nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las
condiciones de astringencia son definidas como la prehibridación,
hibridación, y post-hibridación de lavado a 5ºC
hasta 10ºC menos que la T_{m} calculada usando el cálculo según
Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de
Tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5%
NP-40, 1X de solución Denhardt, 1 mM de pirofosfato
de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0.1 mM de ATP, y 0.2
mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientos estándares
de la tranferencia de Southern.
Para sondas cortas de aproximadamente 15
nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el
material de soporte es lavado una vez en 6X SCC más el 0.1% de SDS
durante 15 minutos y dos veces cada vez durante 15 minutos usando 6X
SSC desde 5ºC hasta 10ºC menos que la Tm calculada.
La presente invención también se refiere a
variantes del polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos de
los aminoácidos 1 a 177; -159 a 177, o -178 a 177 de SEC N.º ID:2
comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más
aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos
de los aminoácidos 1 a 177; -159 a 177, o -178 a 177 de SEC N.º ID:2
por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos
y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos
de aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de
aminoácidos son de carácter menor, es decir que sustituciones
conservadoras de aminoácidos no afectan de forma significativa el
plegado y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas,
típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas
extensiones carboxiloterminales o aminoterminales, tales como un
residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido de enlace de
hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña
extensión que facilita la purificación mediante el cambio de la
carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un
epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras forman
parte del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e
histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido
aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina),
aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos
aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y pequeños
aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las
sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la
actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por
ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins,
Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más
frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,
Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,
Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly así como
inversamente.
La presente invención se refiere también a
polipéptidos aislados que poseen una actividad de proteasa, y éstos
son seleccionados en el grupo comprendiendo los siguientes:
(f) Polipéptidos que poseen
- (i)
- un peso molecular calculado de aproximadamente 17 a aproximadamente 22 kDa, preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 kDa, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 20 kDa; o un peso molecular experimental (por SDS-PAGE) de aproximadamente 19 a aproximadamente 27 kDa, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 kDa, o de aproximadamente 21 a aproximadamente 25 kDa, o de aproximadamente 22 a aproximadamente 24 kDa,
- (ii)
- un pl de aproximadamente pH7 a aproximadamente pH10, preferiblemente de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 9,5, o de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 9,0,
- (iii)
- un pH óptimo de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 8,0, o preferiblemente de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 7,0, o de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5, usando el ensayo de caseína de AZCL a 45ºC y el sistema de amortiguación de ácido succínico, y/o
- (iv)
- una temperatura óptima de aproximadamente 45 a aproximadamente 90ºC, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 85ºC, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 80ºC, usando el ensayo de caseína de AZCL a pH 9;
(g) polipéptidos que no son inhibidos por
- (v)
- SSI (el inhibidor de subtilisina de Streptomyces), y/o no inhibidos por
- (vi)
- EDTA,
usando el ensayo de caseína de AZCL a pH9 y
45ºC;
(h) polipéptidos que son estables en la gama de
aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 10,5, o preferiblemente
en la gama de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 9,0, o en
la gama de aproximadamente pH 4,0 a pH 5,0, después de 2 horas de
incubación a 37ºC en el sistema de tampón de ácido succínico, la
actividad residual siendo medida usando el ensayo de caseína de AZCL
a pH 9 y a 45ºC;
(k) polipéptidos que se sintetizan con un
propéptido de N-terminal; y
(l) polipéptidos que tienen un motivo HEXXH.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de polipéptidos como se referida
más arriba en (h) significa que la actividad residual es de al menos
40%, o 50%, o 60%, o 70%, o del 80% en comparación con una muestra
de control que no ha sido preíncubada durante 2 horas. Unos
polipéptidos que son estables según esta definición pueden ser
llamados polipéptidos estables en ácido.
Un polipéptido de la presente invención puede
ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser
un polipéptido de bacterias Gram positivas tal como un polipéptido
de Bacillus, o un polipéptido de Streptomyces; o un
polipéptido de bacterias Gram negativas, por ejemplo, un polipéptido
de E. coli o de especie Pseudomonas.
Un polipéptido de la presente invención puede
ser un polipéptido fúngico, y más preferiblemente un polipéptido de
levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia,
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o un polipéptido de Yarrowia; o
más preferiblemente un polipéptido fúngico filamentoso, tal como un
polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium,
Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor,
Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces,
Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus,
Thielavia, Tolypocladium, o de Trichoderma.
En otra forma de realización, el polipéptido es
un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori,
Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides,
Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum,
Fusaríum graminearum, Fusaríum graminum, Fusarium heterosporum,
Fusaríum negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium
roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium
sporotñchioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusaríum
trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola
lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora
crassa, Penicillium purpurogenum, Thermoascus aurantiacus,
Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma
longibrachiatum, Trichoderma reesei, o de Trichoderma
viride.
En otra forma de realización, el polipéptido es
un polipéptido derivado de un hongo filamentoso del filum
Ascomycota, preferiblemente de la clase
Pezizomycotina, más preferiblemente del orden
Eurotiomycetes, aún más preferiblemente de la
sub-familia Eurotiales, y lo más
preferiblemente de la familia Trichocomaceae.
En otra forma de realización también, el
polipéptido es derivado de un hongo del género Thermoascus,
por ejemplo las especies Thermoascus aurantiacus, tal como la
cepa Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670, por ejemplo, un
polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -178
a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2.
Se entenderá que para las especies mencionadas
anteriormente, la invención contiene tanto los estados perfectos
como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo,
anamorfos, sin tener en cuenta el nombre de especies por el que son
conocidas. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la
identidad de equivalentes apropiados.
Las cepas de estas especies son fácilmente
accesibles al público en una serie de colecciones de cultivo, tal
como la colección American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM),
Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research
Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center
(NRRL).
Además, tales polipéptidos pueden ser
identificados y obtenidos gracias a otras fuentes incluyendo los
microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra,
abonos, agua, etc.) usando las sondas mencionadas más arriba.
Técnicas de aislamiento de microorganismos de sus hábitats naturales
son bien conocidas en el arte. La secuencia de ácidos nucleicos
puede por lo tanto ser derivada por selecciones similares de una
biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc de otro microorganismo.
Una vez que una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un
polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la
secuencia puede ser aislada o clonada mediante el uso de técnicas
que son conocidas por los expertos habituales en el arte (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Tal y como está definido en la presente, un
polipéptido "aislado" es un polipéptido que es esencialmente
libre de otros polipéptidos sin proteasa, por ejemplo, al menos
aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente
40% puro, más preferiblemente aproximadamente 60% puro, aún más
preferiblemente aproximadamente 80% puro, mucho más preferiblemente
aproximadamente 90% puro, y aún más preferiblemente aproximadamente
95% puro, tal como determinado por SDS-PAGE.
Los polipéptidos codificados por las secuencias
de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen también los
polipéptidos fundidos o los polipéptidos de fusión divisibles en los
que otro polipéptido es fundido en el N-término o
C-término del polipéptido o del fragmento de éste.
Un polipéptido fundido es producido mediante la fusión de una
secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) codificante
de otro polipéptido en una secuencia de ácidos nucleicos (o una
parte de ésta) de la presente invención. Técnicas para producir
polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen el
ligamiento de las secuencias de codificación codificantes de los
polipéptidos de tal forma que se encuentran en el marco y que la
expresión del polipéptido fundido está bajo control del/de los
mismo(s) pro-
motor(es) y terminador.
motor(es) y terminador.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido
de la presente invención. Secuencias de ácidos nucleicos
particulares de la invención son nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1
a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, y en particular nucleótidos 559 a
1089 de SEC N.º ID:1, esta última correspondiendo a la región
codificante del polipéptido maduro. Otra secuencia de ácidos
nucleicos particular de la invención es la secuencia,
preferiblemente la región codificante del polipéptido maduro de la
misma, que está contenida en el plásmido que está contenido en el
microorganismo depositado Escherichia coli DSM 14652. La
presente invención contiene también secuencias de ácidos nucleicos
que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
de los aminoácidos 1 a 177; -159 a 177, o -178 a 177 de SEC N.º
ID:2, que difieren de las partes correspondientes de SEC N.º ID:1 en
virtud de la degeneración del código genético. La presente invención
se refiere también a las subsecuencias de SEC N.º ID:1 que codifican
los fragmentos de SEC N.º ID:2 que tienen una actividad de
proteasa.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido
de la presente invención. Secuencias de ácidos nucleicos
particulares de la invención son SEC N.º ID:10, o nucleótidos
2-1129; 2-1195,
2-1267, 71-1129,
71-1195, 71-1267,
599-1129, 599-1195; o
599-1267 de éstos, nucleótidos
71-1129 de SEC N.º ID:10 correspondientes a la
región codificante del polipéptido maduro.
Una subsecuencia de SEC N.º ID:1 es una
secuencia de ácidos nucleicos contenida por SEC N.º ID:1 con la
excepción de que uno o más nucleótidos de los extremos 5' y/o 3'
ha(n) sido eliminado(s). Preferiblemente, una
subsecuencia contiene al menos 225 nucleótidos, más preferiblemente
al menos 300 nucleótidos, aún más preferiblemente al menos 375, 450,
500, 531, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, o 1300
nucleótidos.
La presente invención se refiere también a
secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad en
nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o
preferiblemente nucleótidos 559 a 1089 de SEC N.º ID:1 de al menos
el 69, 70, 72, 74, 76 o el 80%. En una forma de realización
particular el grado de identidad es de al menos 85%, al menos 90%,
al menos 95%, o al menos 97%. Para determinar el grado de identidad
de los nucleótidos, se usa el programa "align" referido más
arriba.
En una forma de realización particular, la
invención se refiere a las secuencias de nucleótidos que tienen un
grado de identidad para los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a
1344, o 25 a 1344 de SEC N.º ID:1 de al menos 55, 60, 62, 64, 66,
68, 70, 72, 74, 76 o el 80%. En una forma de realización particular,
el grado de identidad es de al menos 85%, al menos 90%, al menos
95%, o al menos 97%. Para determinar el grado de identidad de los
nucleótidos, se usa el programa "align" indicado más
arriba.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos mutantes comprendiendo al menos una
mutación en los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a
1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1, donde la secuencia
de ácidos nucleicos muíante codifica un polipéptido que (i) consiste
en aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2, o
(ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde
la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de
uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera
de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento de cualquiera de
las secuencias de (i).
Las técnicas usadas para aislar o clonar una
secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido son
conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento del ADN genómico,
la preparación a partir de ADNc, o una combinación de éstos. La
clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente
invención a partir de tal ADN genómico puede ser efectuada, por
ejemplo, por medio del uso de la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) bien conocida o la selección de anticuerpos de bibliotecas de
expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con
características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis
et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application,
Academic Press, Nueva York. Otros procedimientos de amplificación
del ácidos nucleicos, tal como la reacción en cadena de la ligasa
(LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación
basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), pueden ser
usados. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser clonada a partir
de una cepa de Thermoascus, u otra o de un organismo
relacionado y puede ser así, por ejemplo, una vahante alélica o una
variante de especies de la región codificante del polipéptido de la
secuencia de ácidos nucleicos.
El término "secuencia de ácidos nucleicos
aislada" tal como se utiliza en este caso se refiere a una
secuencia de ácidos nucleicos que es esencialmente libre de otras
secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, al menos
aproximadamente el 20% pura, preferiblemente al menos
aproximadamente 40% pura, más preferiblemente al menos
aproximadamente 60% pura, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 80% pura, y mucho más preferiblemente al menos
aproximadamente 90% pura determinado por la electroforesis de
agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada
puede ser obtenida por medio de métodos de clonación estandáres
usados en la ingeniería genética para recolocar la secuencia de
ácidos nucleicos desde su ubicación natural hasta un sitio diferente
donde será reproducida. Los métodos de clonación pueden implicar la
escisión y el aislamiento de un fragmento de ácidos nucleicos
deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos codificante
del polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de
vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula
huésped donde se replicarán copias múltiples o clones de la
secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos
puede ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintética,
sintética, o cualquier combinación de éstos.
La presente invención también se refiere a las
secuencias de ácidos nucleicos que tienen un grado de homología para
la secuencia de codificación del polipéptido maduro de SEC N.º ID:1
(es decir, nucleótidos 559 a 1089) de al menos aproximadamente un
70%, preferiblemente aproximadamente un 75%, preferiblemente
aproximadamente un 80%, más preferiblemente aproximadamente un 90%,
aún más preferiblemente aproximadamente un 95%, y mucho más
preferiblemente aproximadamente 97% de homología, que codifican un
polipéptido activo. Para los objetivos de la presente invención, el
grado de homología entre dos secuencias de ácidos nucleicos es
determinado por el programa "align" descrito anteriormente.
La modificación de una secuencia de ácidos
nucleicos codificante de un polipéptido de la presente invención
puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente
similares al polipéptido. Los términos "sustancialmente
similar" al polipéptido se refiere a las formas no producidas
naturalmente del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en
una forma diseñada del polipéptido aislado de su fuente natural, por
ejemplo, variantes que difieren en su actividad específica,
termoestabilidad, pH óptimo, o similares. La secuencia variante
puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucleicos
presentada como la parte codificante del polipéptido de SEC N.º
ID:1, por ejemplo, una subsecuencia de ésta, y/o por la introducción
de sustituciones de nucleótidos que no producen otra secuencia de
aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos
nucleicos, pero que corresponden al uso del codón del organismo
huésped previsto para la producción de la proteasa, o por la
introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden producir una
secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de
una sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et
al., 1991, Protein Expression and Purification 2:
95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica
que estas sustituciones pueden ser efectuadas al exterior a las
regiones críticas para la función de la molécula y seguir
produciendo un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos
esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la
secuencia de ácidos nucleicos aislada de la invención, y en
consecuencia preferiblemente no expuesto a una sustitución, pueden
ser identificados según los métodos conocidos en la técnica, como la
mutagénesis dirigida en el sitio o la mutagénesis de escaneado de
alanina (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244:
1081-1085). En esta última técnica, se introducen
mutaciones en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y
las moléculas mutantes resultantes son probadas para determinar la
actividad de proteasa para identificar los residuos de aminoácidos
que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de la
interacción de proteasa-sustrato pueden ser
determinados también por el análisis de la estructura tridimensional
determinado por técnicas tales como el análisis de resonancia
magnética nuclear, la cristalografía o el marcado por fotoafinidad
(véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255:
306-312; Smith et al., 1992, Journal of
Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et
al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
La presente invención se refiere también a las
secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de un
polipéptido de la presente invención, que se hibridizan en
condiciones de astringencia muy bajas, preferiblemente condiciones
de astringencia bajas, más preferiblemente condiciones de
astringencia medias, más preferiblemente condiciones de astringencia
medio-altas, aún más preferiblemente condiciones de
astringencia altas, y mucho más preferiblemente condiciones de
astringencia muy altas con una sonda de ácidos nucleicos que se
hibridiza en las mismas condiciones con la secuencia de ácidos
nucleicos de SEC N.º ID:1 o su cadena complementaria; o variantes
alélicas y subsecuencias de éstas (Sambrook et al., 1989,
supra), tal como se define en la presente.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por (a)
hibridazión de un ADN en condiciones de astringencia muy bajas,
bajas, medias, medio-altas, altas, o muy altas con
(i) nucleótidos de los nucleótidos 559 a 1089, 25 a 1089, 1 a 1089,
1 a 1344, 25 a 1344, o 559 a 1344 de SEC N.º ID:1, (ii) la secuencia
de ADNc contenida en los nucleótidos de nucleótidos 559 a 1089, 25 a
1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, o 559 a 1344 de SEC N.º ID:1,
(iií) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena
complementaria de (i), (ii), o (iii); y por (b) aislamiento de la
secuencia de ácidos nucleicos. La subsecuencia preferiblemente es
una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que
codifica un fragmento del polipéptido que tiene una actividad de la
proteasa.
La presente invención se refiere también a los
métodos para producir una secuencia de ácidos nucleicos mutante,
comprendiendo la introducción de al menos una mutación dentro de la
secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC N.º ID:1 o una
subsecuencia de ésta, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante
codifica un polipéptido que consiste en aminoácidos 1 a 177; -159 a
177, o -178 a 177 de SEC N.º ID:2; o un fragmento de éste que tiene
una actividad de proteasa.
La introducción de una mutación en la secuencia
de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro
nucleótido puede ser realizada por la mutagénesis dirigida en el
sitio usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. El
proceso particularmente útil es el que utiliza un vector de ADN
bicatenario y superenrollado con un inserto de interés y dos
cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los
cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario de hilos
opuestos del vector, se extienden durante la variación cíclica de
temperatura por medio de la polimerasa de ADN Pfu. Después de
la incorporación de los cebadores, un plásmido mutado que contiene
cortes escalonados es generado. Después de la variación cíclica de
temperatura, el producto es tratado con Dpnl específico para
el ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental
y para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación.
Otros procedimientos conocidos en la técnica pueden ser usados
también.
La presente invención también se refiere a
constructos de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención enlazados operativamente a
una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la
secuencia codificante en una célula huésped apropiada en condiciones
compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que la
expresión implica cualquier fase implicada en la producción del
polipéptido incluyendo, pero sin limitarse a esto, la transcripción,
modificación postranscripcional, traslación, modificación
postraslacional, y la secreción.
El "constructo de ácidos nucleicos" es
definido aquí como una molécula de ácidos nucleicos, sea
monocatenaria o bicatenaria, que está aislada de un gen de origen
natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácidos
nucleicos combinados y yuxtapuestos de tal manera, en una forma no
existente en la naturaleza. El término de constructo de ácidos
nucleicos es sinónimo al término de cassette de expresión cuando el
constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de
control requeridas para la expresión de una secuencia de
codificación de la presente invención. El término "secuencia de
codificación" es definido aquí como una secuencia de ácidos
nucleicos que específica directamente la secuencia de aminoácidos de
su producto proteico. Los límites de la secuencia de codificación
son generalmente determinados por un sitio de unión del ribosoma
(procariotas) o por el codón de iniciación ATG (eucariotas)
localizados justo arriba del marco de lectura abierto en el extremo
5' del ARNm y una secuencia de terminación de transcripción situada
justo abajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm.
Una secuencia de codificación puede incluir, pero sin limitarse a
éstos, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos
recombinantes.
Una secuencia de ácidos nucleicos aislada
codificante de un polipéptido de la presente invención puede ser
manipulada en una variedad de formas para proveer una expresión del
polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos
antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria
dependiendo del vector de expresión. Las técnicas de modificación de
las secuencias de ácidos nucleicos que utilizan los métodos de ADN
recombinante son muy conocidas en la técnica.
Los términos "secuencias de control"
definen aquí el hecho de incluir todos los componentes necesarios o
ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente
invención. Cada secuencia de control puede ser de origen natural o
extranjera a la secuencia de ácidos nucleicos codificante del
polipéptido. Estas secuencias de control incluyen, pero no se
limitan a éstos, una guía, una secuencia de poliadenilación, una
secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido
señal, y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias
de control incluyen un promotor, y señales de parada
transcripcionales y traslacionales. Las secuencias de control pueden
estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de
restricción específicos facilitando la ligadura de las secuencias de
control con la región codificante de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica un polipéptido. Los términos
"operativamente enlazado" definen aquí una configuración en la
que una secuencia de control está colocada de manera apropiada en
una posición relativa a la secuencia de codificación de la secuencia
de ADN de tal modo que la secuencia de control dirige la expresión
de un polipéptido.
La secuencia de control puede ser una secuencia
promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que es
reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia
de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de
control transcripcionales que median la expresión del polipéptido.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
muestra una actividad transcripcional en la célula huésped elegida
incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede ser
obtenido a partir de genes codificantes de polipéptidos
extracelulares o intracelulares sean homólogos o heterólogos a la
célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente
invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores
obtenidos a partir de los genes para una TAKA amilasa de
Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus
niger, alfa-amilasa estable en ácido de
Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus
niger o de Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor
miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa
fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de
Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina fusarium
oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor
NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes
para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus
niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus
oryzae), y promotores mutantes, truncados e híbridos de
éstos.
La secuencia de control puede también ser una
secuencia de terminadción de transcripción adecuada, una secuencia
reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La
secuencia de terminación está enlazada operativamente al terminal 3'
de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido.
Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped elegida
puede ser usado en la presente invención.
Los terminadores preferidos para las células
huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas a partir de los genes
para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de
Aspergillus niger, sintasa de antranilato de Aspergillus
nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus
niger, y la proteasa de tipo tripsina de fusarium
oxysporum.
La secuencia de control puede ser también una
secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es
importante para la traslación por la célula huésped. La secuencia
guía está enlazada operativamente al terminal 5' de la secuencia de
ácidos nucleicos codificante del polipéptido. Cualquier secuencia
guía funcional en la célula huésped elegida puede ser usada en la
presente invención.
Unos líderes preferidos para células huéspedes
filamentosas fúngicas son obtienidos a partir de los genes para la
TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato
isomerasa de Aspergillus nidulans.
La secuencia de control puede ser también una
secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente
al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y la cual, cuando
está transcrita, es reconocida por la célula huésped en forma de
señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito.
Cualquier secuencia de poliadenilación funcional en la célula
huésped de elección puede ser usada en la presente invención.
Las secuencias de poliadenilación preferidas
para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas a partir
de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae,
glucoamilasa de Aspergillus niger, sintasa de antranilato de
Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de
fusarium oxysporum, y la alfa-glucosidasa de
Aspergillus niger.
La secuencia de control puede también ser una
región codificante del péptido señal que codifica una secuencia de
aminoácidos enlazada al amino-terminal de un
polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora
de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la
secuencia de ácidos nucleicos puede contener intrínsecamente una
región codificante del péptido señal enlazada naturalmente al marco
de lectura de traslación con el segmento de la región codificante
que codifica el polipéptido segregado. Alternativamente, el extremo
5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante
del péptido señal que es ajena a la secuencia codificante. La región
codificante del péptido señal extranjera puede ser requerida donde
la secuencia codificante no contiene naturalmente una región
codificante del péptido señal. Alternativamente, la región
codificante del péptido señal ajena puede reemplazar simplemente la
región codificante del péptido señal natural para realzar la
secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región codificante
del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía
secretora de una célula huésped elegida puede ser usada en la
presente invención.
Las regiones de codificación del péptido señal
eficaces para las células huéspedes fúngicas filamentosas son las
regiones de codificación del péptido señal obtenidas a partir de los
genes para la TAKA amilasa de la Aspergillus oryzae, amilasa
neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus
niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei,
celulasa de humicola insolens, y la lipasa Humicola
lanuginosa.
En una forma de realización preferida, la región
codificante del péptido señal son los nucleótidos 25 a 81 de SEC N.º
ID:1 que codifican los aminoácidos de 1 a 19 de SEC N.º ID:2.
La secuencia de control también puede ser una
región codificante del propéptido que codifica una secuencia de
aminoácidos situada en el amino terminal de un polipéptido. El
polipéptido resultante es conocido como una proproteasa o un
propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). En general un
propolipéptido es inactivo y puede ser convertido en un polipéptido
maduro activo por rotura catalítica o autocatalítica del propéptido
a partir del propolipéptido. La región codificante del propéptido
puede ser obtenida a partir de los genes para la proteasa alcalina
de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus
subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces
cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y la
lacasa Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
En una forma de realización preferida, la región
codificante del propéptido se define como como los nucleótidos 82 a
558 a SE Nº ID:1 que codifican los aminoácidos 20 a 178 de SEC Nº.
ID:2.
En el sitio donde las dos regiones de péptido
señal y de propéptido están presentes en el amino terminal de un
polipéptido, la región de propéptido está situada junto al amino
terminal de un polipéptido y la región de péptido señal está situada
junto al amino terminal de la región de propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias
reguladoras que permiten la regulación de la expresión del
polipéptido relativa al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos
de sistemas reguladores son los que causan la expresión del gen que
debe ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o
físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los
sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los
sistemas operadores lac, tac, y trp. En la levadura,
el sistema ADH2 o GAL1 pueden ser usados. En los hongos
filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, el
promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor
de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser usados como
secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son
las que permiten realizar una amplificación génica. En sistemas
eucarióticos, estos incluyen el gen de
dihidrofolato-reductasa que es amplificado en la
presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son
amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de
ácidos nucleicos codificante del polipéptido sería enlazada
operativamente con la secuencia reguladora.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión recombinantes comprendiendo una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y unas
señales de parada transcripcionales y traslacionales. Las diferentes
secuencias de control y de ácidos nucleicos descritas anteriormente
pueden estar unidas entre sí para producir un vector de expresión
recombinante que puede incluir un sitio de restricción adecuado o
más para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de
ácidos nucleicos codificante del polipéptido en estos sitios.
Alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente
invención puede ser expresada por medio de la inserción de la
secuencia de ácidos nucleicos o un constructo de ácidos nucleicos
comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión.
En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación
se sitúa en el vector de modo que la secuencia de codificación esté
enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas
para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede estar
expuesto de manera adecuada a procesos de ADN recombinantes y puede
provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La
elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del
vector con la célula huésped en la que se introducirá el vector. Los
vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.
El vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir, un vector que existe en forma de entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento
extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El
vector puede contener cualquier medio para garantizar la
autorreplicación. Alternativamente, el vector, cuando se introduce
en la célula huésped, puede ser integrado en el genoma y replicado
junto con el/los cromosoma(s) en los que se ha integrado.
Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más
vectores o plásmidos que contienen el ADN total que deben ser
introducidos en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
Los vectores de la presente invención contienen
preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la
selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable
es un gen cuyo producto provee una resistencia biocida o vírica,
resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y similares.
Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes
dal de Bacillus subtilis o Bacillus
licheniformis, o marcadores que confieren una resistencia
antibiótica tal como la resistencia a la ampicilina, a la
canamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Marcadores
adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2,
LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para un uso en
una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan
a éstos, amdS (acetamidasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), bar
(fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina
fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa),
pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa),
sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (sintasa de
antranilato), así como equivalentes de los mismos. Los preferidos
para su uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG
de Aspergillus nidulans o de Aspergillus oryzae y el
gen bar de Streptomyces higroscopicus.
Los vectores de la presente invención
preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que
permite(n) la integración estable del vector en el genoma de
la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula
independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula
huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos
nucleicos codificante del polipéptido o cualquier otro elemento del
vector para la integración estable del vector en el genoma por la
recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector
puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para
dirigir la integración por la recombinación homologa en el genoma de
la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales
permiten al vector de ser integrado en el genoma de la célula
huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en
el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de
integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales
deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos
nucleicos, tal como 100 a 1500 pares de bases, preferiblemente 400 a
1500 pares de bases, y más preferiblemente 800 a 1500 pares de bases
que son muy homologas a la secuencia de objetivo correspondiente
para aumentar la probabilidad de la recombinación homologa. Los
elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia homologa a
la secuencia de objetivo en el genoma de la célula huésped. Además,
los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos
nucleicos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector
puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por la
recombinación no homologa.
Para la replicación autónoma, el vector puede
comprender también un origen de replicación que permite que el
vector pueda replicarse de manera autónoma en la célula huésped en
cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los
orígenes de replicación de plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y
pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110;
pE194; pTA1060, y pAM\betal permitiendo la replicación en
Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en
una célula huésped de levadura son el origen de micrón 2 de
replicación, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la
combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser un
origen con una mutación que produce su funcionamiento sensible a la
temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 1433).
Más de una copia de una secuencia de ácidos
nucleicos de la presente invención puede ser insertada en la célula
huésped para aumentar la producción del producto genético. Un
aumento del número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos
puede ser obtenido por la integración de al menos una copia
adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o
mediante la inclusión de un gen de marcador seleccionable y
amplificable con la secuencia de ácidos nucleicos donde las células
que contienen copias amplificadas del gen de marcador seleccionable,
y por lo tanto, copias adicionales de la secuencia de ácidos
nucleicos, pueden ser seleccionadas por medio de un cultivo de las
células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procesos usados para enlazar los elementos
descritos anteriormente para construir los vectores de expresión
recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un
experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
1989, supra).
La proteasa de la invención también puede ser
coexpresada junto con al menos otra enzima de interés en los
alimentos para animales, tal como la fitasa, la xilanasa, la
galactanasa, y/o la beta-glucanasa. Las enzimas
pueden ser coexpresadas a partir de distintos vectores, de un
vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan
diferentes vectores, los vectores pueden tener diferentes marcadores
seleccionables, y diferentes orígenes de replicación. Cuando se usa
sólo un vector, los genes pueden ser expresados a partir de uno o
más promotores. Si son clonados bajo la regulación de un promotor
(di- o multicistrónico), el orden en el que los genes son clonados
puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. La proteasa
también puede ser expresada en forma de proteína de fusión, es
decir, que el gen que codifica la proteasa ha sido fundido en el
marco del gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser
otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.
La presente invención se refiere también a las
células huéspedes recombinantes comprendiendo una secuencia de
ácidos nucleicos de la invención que son usadas ventajosamente en la
producción recombinante de los polipéptidos. Un vector comprendiendo
una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención es
introducido en una célula huésped para mantener el vector en forma
de integrante cromosómico o de vector extracromosómico y
autoreplicante tal como descrito anteriormente. El término "célula
huésped" incluye cualquier progenie de una célula madre que no
sea idéntica a la célula madre debido a las mutaciones que ocurren
durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá
en gran medida del gen que codifica el polipéptido y de su
fuente.
La célula huésped puede ser un microorganismo
unicelular, por ejemplo, un microorganismo procariota, o un
microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.
Las células unicelulares útiles son células
bacterianas tales como bacterias Gram positivas incluyendo, pero sin
limitarse a éstas, una célula de Bacillus, o una célula de
Streptomyces, o células de bacterias de ácido lático; o
bacterias Gram negativas tales como especies E. coli y
Pseudomonas. Las bacterias de ácido lático incluyen, pero sin
limitarse a éstas, especies de los géneros Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, y
Enterococcus.
La introducción de un vector en una célula
huésped bacteriana puede por ejemplo, ser efectuada mediante la
transformación del protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen,
1979, Molecular General Genetics 168: 111-115)
usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin,
1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau
y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular
Biology 56: 209-221), la electroporación (véase, por
ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6:
742-751), o la conjugación (véase, por ejemplo,
Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology
169:5771-5278).
La célula huésped puede ser una eucariota, tal
como una célula animal no-humana, una célula de
insecto, una célula vegetal, o una célula fúngica.
En una forma de realización particular, la
célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza
en este caso incluye los phyla Ascomycota, Basidiomycota,
Chytridiomycota, y Zygomycota (como definidos por Hawksworth et
al., en, Ainsworth y Bisby's Dictionary ofthe Fungi,
octava edición, 1995, CAB International, University Press,
Cambridge, Reino Unido) así como el Oomycota (como citado en
Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos
los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995,
supra).
En otra forma de realización particular, la
célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura"
como se utiliza en este caso incluye la levadura ascoesporógena
(Endomicetales), la levadura basidioesporógena, y la levadura de
hongos imperfectos (Blastomicetes). Como la clasificación de la
levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta
invención, la levadura debe ser definida tal como se describe en
Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y
Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.º 9,
1980).
La célula huésped de levadura puede ser una
célula de Candida, Hansenula, Kluyveromices, Pichia,
Saccharomyces, Schizosacaromices, o de Yarrowia.
La célula huésped fúngica puede ser una célula
micótica filamentosa. "Hongos filamentosos" intuyen todas las
formas filamentosas de la subdivisión Eumycota/Ooomycota (como
definidas por Hawksworth et al., 1995, supra). Los
hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta
por la quitina, la celulosa, el glucano, el quitosano, el manano, y
otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se debe a
la elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente
aeróbico. Al contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras
tales como Saccharomyces cerevisiae se debe a la gemación de
un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser
fermentativo.
Ejemplos de células huéspedes filamentosas
fúngicas son células de especies, pero sin limitarse a éstas, de
Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor,
Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia,
Tolipocladium, o Trichoderma.
Las células fúngicas pueden ser transformadas
por un proceso que implica la formación de protoplasto, la
transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared
celular en una manera conocida per se. Los procesos adecuados
para la transformación de células huéspedes de Aspergillus
están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984,
Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 81:
1470-1474. Los métodos adecuados para transformar
los especies de Fusarium son descritos por Malardier et
al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La
levadura puede ser transformada mediante el uso de los procesos
descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I.,
editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in
Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic
Press, inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of
bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of
the National Academy of Sciences EEUU 75: 1920.
La presente invención también se refiere a
métodos de producción de un polipéptido de la presente invención
comprendiendo (a) el cultivo de una cepa, la cual, en su forma de
tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, para producir un
sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) recuperar el
polipéptido. En una forma de realización, la cepa es del género
Thermoascus, por ejemplo de las especies Thermoascus
aurantiacus, tal como la cepa Thermoascus aurantiacus
CGMCC n.º 0670.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención
comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones
conducentes a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación
del polipéptido.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención
comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones
conductoras a la producción del polipéptido, donde la célula huésped
comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante comprendiendo al
menos una mutación en los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344,
25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1, en la que la
secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que
(i) consiste en los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177
de SEC N.º ID:2, o (ii) es una variante de cualquiera de las
secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución,
deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una
variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es
un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i).
La presente invención se refiere también a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención
comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones
conducentes a la producción del polipéptido, donde la célula huésped
comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante comprendiendo al
menos una mutación en los nucleótidos SEC N.º ID:10, o nucleótidos
2-1129, 2-1195,
2-1267, 71-1129,
71-1195, 71-1267,
599-1129, 599-1195; o
599-1267 de éstos, o en la cual la secuencia de
ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste en
SEC N.º ID:11, o aminoácidos -23-353;
-23-374; -23-397,
1-353, 1-374, 1-397,
177-353, 177-374, o
177-397 de éstos.
En los métodos de producción de la presente
invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado
para la producción del polipéptido usando los métodos conocidos en
la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada mediante un
cultivo en matraz de agitación, la fermentación a pequeña escala o a
gran escala (incluyendo las fermentaciones continuas, por lotes, por
lotes alimentarios, o en estado sólido) en fermentadores de
laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y en
condiciones que permiten al polipéptido ser expresado y/o aislado.
El cultivo se realiza en un medio nutritivo adecuado comprendiendo
fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, mediante el
uso de los procesos conocidos en la técnica. Los medios adecuados
son disponibles con proveedores comerciales o pueden ser preparados
según las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la
recogida de American Type Culture Collection). Si el polipéptido es
segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado
directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, puede ser
recuperado de lisados
celulares.
celulares.
Los polipéptidos pueden ser detectados usando
los métodos conocidos en la técnica que son específicos a los
polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de
anticuerpos específicos, la formación de un producto de proteasa, o
la desaparición de un sustrato de proteasa. Por ejemplo, un ensayo
de proteasa puede ser usado para determinar la actividad del
polipéptido como se describe aquí.
El polipéptido resultante puede ser recuperado
por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido
puede ser recuperado del medio nutritivo por los procedimientos
convencionales incluyendo, pero sin limitarse a éstos, centrifugado,
filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o
precipitación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser purificados por una variedad de procesos conocidos en la técnica
incluyendo, pero sin limitarse a éstos, la cromatografía (por
ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque,
y exclusión de tamaño), procesos de electroforesis (por ejemplo,
isoelectroenfoque preparativo), la solubilidad diferencial (por
ejemplo, precipitación de sulfato amónico),
SDS-PAGE, o la extracción (véase, por ejemplo,
Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH
Publishers, Nueva York, 1989).
La presente invención también se refiere a una
planta transgénica, una parte vegetal, o una célula vegetal que ha
sido transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
un polipéptido que tiene una actividad de proteasa de la presente
invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades
recuperables. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o de
la parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta
que contiene el polipéptido recombinante puede ser usada como tal
para mejorar la calidad de un alimento o comida, por ejemplo,
mejorar el valor nutritivo, palatabilidad, y propiedades reológicas,
o para destruir un factor antinutritivo.
En una forma de realización particular, el
polipéptido está provisto para las vacuolas de almacenamiento del
endospermo en semillas. Esto puede ser obtenido por sintetización de
éste en forma de precursor con un péptido de señal adecuado, véase
Horvath et al en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, n.º 4, p.
1914-1919.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea
(una dicotiledónea) o monocotiledónea (una monocotiledónea). Unos
ejemplos de plantas monocotiledóneas son las hierbas, tales como la
poa de prados (poa azul, Poa), la hierba de forraje tal como la
hierba festuca, lolium, templada, tal como Agrostis, y los cereales,
por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y (granos
de) maíz. Ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las
leguminosas, como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante,
judía y soja, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae), tal como
la coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo relacionado de
cerca Arabidopsis thaliana. Las plantas de bajo fitato como
descritas por ejemplo en la patente estadounidense n.º 5,689,054 y
la patente estadounidense n.º 6,111,168 son ejemplos de plantas
creadas genéticamente.
Ejemplos de partes de la planta son el vástago,
callo, hojas, raíz, frutos, semillas, y tubérculos. También tejidos
de planta específicos, como el cloroplasto, apoplasto, mitocondria,
vacuola, peroxisomas, y citoplasma son considerados como una parte
de la planta. Además, cualquier célula de la planta, sea cual sea el
origen del tejido, es considerado como una parte de la planta.
También se incluyen en el campo de la presente
invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células
de planta.
La planta transgénica o la célula de planta que
expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida
según los métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o
célula de planta es construida mediante la incorporación de una o
más constructos de expresión codificante de un polipéptido de la
presente invención en el genoma del huésped de planta y por
propagación de la planta modificada resultante o de la célula
resultante de la planta en una planta transgénica o célula de la
planta.
De manera adecuada, el constructo de expresión
es un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de
ácidos nucleicos codificante de un polipéptido de la presente
invención enlazado operativamente con secuencias reguladoras
apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos
nucleicos en la planta o en la parte de la planta seleccionada.
Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador
seleccionable útil para identificar las células huéspedes en las que
el constructo de expresión ha sido integrado y secuencias de ADN
necesarias para la introducción del constructo en la planta en
cuestión (este último depende del método de introducción del ADN que
debe ser usado).
La elección de secuencias reguladoras, tal como
secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias
señales o de tránsito, son determinadas, por ejemplo, en base a
cuándo, dónde, y cómo es deseable expresar el polipéptido. Por
ejemplo, la expresión del gen codificante de un polipéptido de la
presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser
desarrollable, específica de fase o de tejido, y el producto gen
puede estar previsto para un tejido específico o una parte de planta
específica tal como las semillas o las hojas. Las secuencias
reguladoras son descritas, por ejemplo, por Tague et al.,
1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, se puede usar el
promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell
21: 285-294). Los promotores específicos de un
órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumideros de
almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas
(Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:
275-303), o de tejidos sumideros metabólicos tales
como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:
863-878), un promotor específico para la semilla
como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o de albúmina
de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:
885-889), un promotor Vicia faba de la
legúmina B4 y el gen desconocido de proteína de semilla Vicia
faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant 152:
708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de
aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell
Physiology 39: 935-941), el promotor de proteína de
almacenamiento napA de Brassica riapus, o cualquier otro
promotor específico para la semilla conocida en la técnica, por
ejemplo, tal y como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor
puede ser un promotor específico de hojas tal como el promotor rbcs
de arroz o de tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology
102: 991-1000, el promotor del gen de
metiltransferasa de adenina del virus de chlorella (Mitra e Higgins,
1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el
promotor de gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995,
Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un
promotor inducible en espiral tal como el promotor pin2 de patata
(Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22:
573-588).
\newpage
Un elemento estimulador del promotor puede ser
usado también para conseguir una expresión más elevada de la
proteasa en la planta. Por ejemplo, el elemento estimulador del
promotor puede ser un intrón que está dispuesto entre el promotor y
la secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido de la
presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993,
supra divulgan el uso del primer intrón del gen 1 de actina
de arroz para realzar la expresión.
Además, el uso del codón puede ser optimizado
para las especies de plantas en cuestión para mejorar la expresión
(véase Horvath et al. indicado más arriba).
El gen de marcador seleccionable y cualquier
otra parte del constructo de expresión pueden ser elegidos a partir
de los que están disponibles en la técnica.
El constructo de ácidos nucleicos es incorporado
dentro del genoma de la planta según las técnicas convencionales
conocidas en el arte, incluyendo la transformación mediada por
Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección,
bombardeo de la partícula, transformación biolística, y la
electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293;
Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al.,
1989, Nature-338: 274).
Actualmente, la transferencia de gen mediada por
Agrobacterium tumefaciens es el método elegido para generar
dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y
Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19:
15-38). Sin embargo, ésta puede ser usada también
para transformar monocotiledóneas, aunque otros métodos de
transformación son generalmente preferidos para estas plantas.
Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas
transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas
de oro o de tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de
callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant
Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión
Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992,
Bio/Technology 10: 667.674). Un método alternativo para la
transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación del
protoplasto tal como descrito por Omirulleh et al., 1993,
Plant Molecular
Biology-21:415-428.
Después de la transformación, los transformantes
en los que se ha incorporado el constructo de expresión son
seleccionados y regenerados en plantas enteras según los métodos
bien conocidos en la técnica.
La presente invención también se refiere a los
métodos para producir un polipéptido de la presente invención
comprendiendo (a) el cultivo de una planta transgénica o de una
célula de planta comprendiendoo una secuencia de ácidos nucleicos
que codifica un polipéptido que tiene una actividad de proteasa de
la presente invención en condiciones conducentes para la producción
del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
La presente invención se refiere también a un
animal transgénico, no humano y a productos o elementos de los
mismos, cuyos ejemplos son fluidos corporales como la leche y la
sangre, órganos, carne, y células animales. Las técnicas para
expresar proteínas, por ejemplo en células mamíferas; son conocidas
en el arte, véase por ejemplo el manual Protein Expression: A
Practical Approach, Higgins y Hames, (eds) Oxford University Press
(1999), y los otros tres manuales de esta serie que se refieren a la
transcripción del gen, el procesamiento de ARN, y la recesión
postraslacional. En términos generales, para preparar un animal
transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado son
transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos codificante de
un polipéptido que tiene una actividad de proteasa de la presente
invención para expresar y producir el polipéptido. El polipéptido
puede ser recuperado a partir del animal, por ejemplo de la leche de
animales hembras, o el polipéptido puede ser expresado para el
beneficio del propio animal, por ejemplo para ayudar a la digestión
del animal. Ejemplos de animales son mencionados en la sección
titulada Alimentación para animales.
Para producir un animal no humano transgénico
con el fin de recuperar la proteasa de la leche del animal, un gen
que codifica la proteasa puede ser insertado en los huevos
fertilizados del animal en cuestión, por ejemplo mediante el uso de
un vector de expresión del transgén que comprende un promotor de
proteínas de leche adecuado, y el gen que codifica la proteasa. El
vector de expresión del transgén es microinyectado en los huevos
fertilizados, e integrado preferiblemente de forma permanente en el
cromosoma. Una vez que el huevo empieza a crecer y a dividirse, el
embrión potencial es implantado en una madre portadora, y los
animales que llevan el transgén son identificados. El animal
resultante puede entonces ser multiplicado mediante una reproducción
convencional. El polipéptido puede ser purificado a partir de la
leche del animal, véase por ejemplo Meade, H.M. et al (1999):
Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic
animals, Gene expression systems: Using nature for the art of
expression J. M. Fernandez y J. P. Hoeffler (eds.), Academic
Press.
En la alternativa, para producir un animal
transgénico no humano que lleva en el genoma de sus células
somáticas y/o germinales una secuencia de ácidos nucleicos
incluyendo un constructo de transgén heterólogo incluyendo un
transgén que codifica la proteasa, el transgén puede ser enlazado
operativamente a una primera secuencia reguladora para la expresión
específica de la glándula salival de la proteasa, tal como indicado
en WO 2000064247.
En otro aspecto también, la presente invención
se refiere a composiciones comprendiendo un polipéptido de la
presente invención.
Las composiciones del polipéptido pueden ser
preparadas según los métodos conocidos en la técnica y pueden estar
en forma de líquido o de composición seca. Por ejemplo, la
composición del polipéptido puede estar en forma de granulado o de
microgranulado. El polipéptido que debe ser incluido en la
composición puede ser estabilizado según los métodos conocidos en la
técnica.
En una forma de realización particular, las
composiciones de polipéptido de la invención son protegidas contra
la degradación ácida, por ejemplo con el fin de asegurar una mejor
supervivencia del polipéptido a través del estómago de los animales.
La protección puede tener la forma de un recubrimiento estable al
ácido, cuyos ejemplos pueden encontrarse en manuales
farmacéuticos.
Se proporcionan más abajo ejemplos de usos
preferidos de los polipéptidos o composiciones de polipéptidos de la
invención.
La presente invención también está dirigida a
métodos de uso de los polipéptidos que tienen una actividad de
proteasa en la alimentación para animales, así como a composiciones
alimentarias y a aditivos alimentarios comprendiendo los
polipéptidos de la invención.
El término animal incluye todos los animales,
incluyendo seres humanos. Ejemplos de animales son los no rumiantes,
y los rumiantes, como vacas, ovejas y caballos. En una forma de
realización particular, el animal es un animal no rumiante. Animales
no ruminantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o
puercos (incluyendo, pero sin limitarse a éstos, lechones, cerdos de
crecimiento, y cerdas); aves como pavos y gallinas (incluyendo, pero
sin limitarse a éstos, pollos de engorde, gallinas ponedoras);
terneros jóvenes; y peces (incluyendo, pero sin limitarse a éste, el
salmón).
El término alimento o composiciones alimentarias
define cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición
adecuada para, o destinado a ser ingerido por un animal.
En el uso según la invención la proteasa puede
ser provista en el alimentos del animal antes, después, o
simultáneamente en la dieta. Se prefiere esa última posibilidad.
En una forma de realización particular, la
proteasa, en la forma en la que se ha añadido al alimento, o cuando
se ha incluido en un aditivo alimentario, está bien definida. Bien
definida significa que la preparación de la proteasa es al menos 50%
pura tal como se ha determinado por la cromatografía de exclusión de
tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de
realización particulares la preparación de la proteasa es de al
menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos 95% pura tal como
se ha determinado por este método.
Una preparación de proteasa bien definida es
ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente
una proteasa en un alimento que está esencialmente libre de
proteasas que puedan interferir o contaminar otras proteasas. Los
términos dosificar correctamente se refieren en particular al
objetivo que consiste en obtener resultados consistentes y
constantes, y en la capacidad de optimizar la dosificación en base
al efecto deseado.
Para el uso en alimentos para animales, no
obstante, la proteasa no necesita ser tan pura; por ejemplo puede
incluir otras enzimas, en cual caso se podría llamar preparación de
proteasa.
La preparación de la proteasa puede ser (a)
añadida directamente al alimento (o usada directamente en un proceso
de tratamiento de proteínas vegetales), o (b) puede ser usada en la
producción de una o más composiciones intermedias tales como
aditivos o premezclas alimentarios que es añadida posteriormente al
alimento (o usada en un proceso de tratamiento). El grado de pureza
descrito anteriormente se refiere a la pureza de la preparación de
la proteasa original, sin tener en cuenta el hecho de ser usado
conforme a (a) o (b) más arriba.
Las preparaciones de proteasa con unas purezas
de tal magnitud pueden ser obtenidas en particular usando métodos
recombinantes de producción, mientras que éstas no son obtenidas tan
fácilmente y son expuestas también a una variación entre lotes mucho
más alta cuando la proteasa es producida por métodos de fermentación
tradicionales.
Esta preparación de proteasa, por supuesto,
puede ser mezclada con otras enzimas.
En otra forma de realización particular, la
proteasa usada según la invención es capaz de:
- \quad
- aumentar la proteína digerida, el grado de hidrólisis (DH) y/o la proteína solubilizada según el modelo completo de digestión monogástrica in vitro del ejemplo 6 de la presente;
- \quad
- aumentar la proteína digerida, DH y/o la proteína solubilizada según la parte intestinal del modelo de digestión monogástrica in vitro del ejemplo 6 de la presente; y/o
- \quad
- aumentar la solubilidad de la proteína, la digestibilidad de la proteína y/o DH, según el modelo de digestión de acuicultura in vitro del ejemplo 7 de la presente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos proteínas vegetales como se
utilizan en este caso se refieren a cualquier compuesto,
composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína
derivada de o de origen vegetal, incluyendo las proteínas
modificadas y los derivados de proteína. En formas de realización
particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es
de al menos 10, 20, 30, 40, 50, o el 60% (p/p).
Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de
las fuentes de proteína vegetal, tal como leguminosas y cereales,
por ejemplo los materias de plantas de las familias Fabaceae
(Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y
Poaceae, tal como la harina de soja, la harina de lupino y la
harina de colza.
En una forma de realización particular, la
fuente de proteína vegetal es una materia de una o más plantas de la
familia Fabaceae, por ejemplo soja, lupino, guisante, o
judía.
En otra forma de realización particular, la
fuente de proteína vegetal es la materia de una o más plantas de la
familia Chenopodiaceae, por ejemplo remolacha, remolacha
azucarera, espinaca o quinoa.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal
son la semilla de colza, y la col.
La soja es una fuente de proteína vegetal
preferida.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal
son los cereales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena,
(granos de) maíz, el arroz, y el sorgo.
El tratamiento según la invención de las
proteínas vegetales con al menos una proteasa de la invención
produce una solubilización incrementada de las proteínas
vegetales.
A continuación se dan ejemplos del % de proteína
solubilizada obtenible usando las proteasas de la invención: al
menos 100,0%, o 100,1, 100,2, 100,2, 100,4, 100,5, 100,6, 100,7,
100,8, 100,9, 101,0, 101,1, 101,2, 101,3, o al menos 101,4%, con
respecto a una muestra en blanco, y en referencia a la digestión
monogástrica completa in vitro del ejemplo 6 de la
presente.
A continuación se dan ejemplos del % de proteína
digerible obtenible usando las proteasas de la invención: de al
menos 100%, o 101, 102, 103, o al menos 104%, con respecto a una
muestra en blanco, y en referencia al modelo de digestión
monogástrica completo in vitro del ejemplo 6 de la
presente.
A continuación se dan ejemplos del i) % de la
proteína solubilizada; y del ii) % de la proteína digerida obtenible
usando las proteasas de la invención: de al menos 100%, o 101, 102,
o de al menos 103%, con respecto a una muestra en blanco, y en
referencia a la parte intestinal del modelo de digestión
monogástrica in vitro del ejemplo 6 de la presente.
A continuación se dan ejemplos del % del grado
de hidrólisis (DH) obtenible usando las proteasas de la invención:
de al menos 100%, o 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,
110, 111, o de al menos 112%, con respecto a una muestra en blanco,
y en referencia al modelo de digestión de la acuicultura in
vitro del ejemplo 7 de la presente.
A continuación se dan ejemplos del i) % de la
proteína solubilizada; y del ii) % de proteína digerida obtenible
usando las proteasas de la invención: de al menos el 100%, o 101,
102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, o de al menos
el 113%, con respecto a una muestra en blanco, y en referencia al
modelo de digestión de la acuicultura in vitro del ejemplo 7
de la presente.
Los términos solubilización de proteínas
significan básicamente el hecho de introducir la(s)
proteína(s) en la solución. Esta solubilización puede ser
debida a la liberación de la proteína mediada por proteasa de otros
componentes de las composiciones naturales normalmente complejas
como los alimentos. La solubilización puede ser medida en forma de
aumento de la cantidad de proteínas solubilizadas, en referencia a
las muestras de ensayos en blanco tratadas sólo con pepsina y
pancreatina (véase los ejemplos 6 y 7 en la presente).
Los términos digestión de proteínas significan
básicamente la hidrólisis proteolítica de las proteínas
solubilizadas por la acción de las proteasas de tal modo que se
forman los péptidos de bajo peso molecular y los aminoácidos. La
digestión de proteínas solubilizadas puede ser medida en forma de
cantidad incrementada de péptidos solubilizados y de aminoácidos con
un peso molecular igual a o menor que 1500 dalton, en referencia a
las muestras de ensayos en blanco tratadas sólo con pepsina y
pancreatina (véanse los ejemplos 6 y 7 en la presente).
En una forma de realización particular de un
proceso del tratamiento, la(s) proteasa(s) en cuestión
está(n) afectando (o actuando, o ejerciendo su influencia de
solubilización sobre) las proteínas vegetales o las fuentes de
proteína. Para conseguirlo, la proteína vegetal o fuente de proteína
es suspendida típicamente en un solvente, por ejemplo un solvente
acuoso como el agua, y los valores del pH y de la temperatura son
ajustados con especial atención a las características de la enzima
en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede ser realizado con un
valor de pH en el que la actividad de proteasa real es de al menos
50, o 60, o 70, o 80 o 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento
puede ser realizado a una temperatura en la que la actividad de
proteasa real es de al menos 50, o 60, o 70, o 80 o 90%. Las
indicaciones del porcentaje de actividad más arriba se refieren a
las actividades máximas. La reacción enzimática continúa hasta que
se consiga el resultado deseado, después de la cual se puede o no se
puede detener mediante la inactivación de la enzima, por ejemplo
mediante una fase de tratamiento térmico.
En otra forma de realización particular de un
proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa es
sostenida, lo que significa por ejemplo que la proteasa es añadida a
las proteínas vegetales o fuentes de proteína, pero que su
influencia en cuanto a la solubilización es, por decirlo así, no
activada hasta más tarde cuando sea deseable, una vez que se han
establecido las condiciones de solubilización adecuadas, o que
cualquiera de los inhibidores enzimáticos son inactivados, o
cualquier otro medio que pueda aplicarse para posponer la acción de
la enzima.
En una forma de realización el tratamiento es un
pretratamiento para alimentos para animales o proteínas vegetales
para un uso en alimentos para animales, es decir que las proteínas
son solubilizadas antes de la ingesta.
Los términos mejorar el valor nutritivo de un
alimento para animales significa mejorar la disponibilidad de las
proteínas, de tal forma que implica la extracción incrementada de
proteína, rendimientos más elevados de proteína, y/o utilización
mejorada de proteína. El valor nutritivo del alimento es en
consecuencia incrementado, y el índice del crecimiento y/o el
aumento de peso y/o la conversión de los alimentos (es decir, el
peso del alimento ingerido en relación con el aumento de peso) del
animal es/son mejorado(s).
La proteasa puede ser añadida al alimento en
cualquier forma, sea como una proteasa relativamente pura, o en una
mezcla con otros componentes destinados a la adición en alimentos
para animales, es decir, en forma de aditivos alimentarios para
animales, tal como las denominadas premezclas de alimentos para
animales.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a composiciones usadas en alimentos para animales, tales
como alimentos para animales, y aditivos alimentarios, por ejemplo
premezclas.
Además de la proteasa de la invención, los
aditivos alimentarios de la invención contienen al menos una
vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o
al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.
Otros ingredientes opcionales de aditivos
alimentarios son agentes colorantes, compuestos aromáticos,
estabilizadores, péptidos antimicrobianos, y/o al menos otra enzima
seleccionada a partir de las fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26;
xilanasas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o
beta-glucanasas EC 3.2.1.4.
En una forma de realización particular estas
otras enzimas están bien definidas (tal como definidas más arriba
para las preparaciones de proteasa).
Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP) son
CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina-1,
thanatina, defensina, y ovispirina tal como novispirina (Robert
Lehrer, 2000), plectasinas, y estatinas, incluyendo los compuestos y
los polipéptidos revelados en PCT/DK02/00781 y PCT/DK02/00812, así
como variantes o fragmentos de lo anterior que retienen la actividad
antimicrobiana.
Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (AFP) son
los péptidos de Aspergillus giganteus, y de Aspergillus
niger, asó como variantes y fragmentos de los mismos que
retienen la actividad antifúngica, tal como expuesto en WO 94/01459
y WO 02/090384.
Habitualmente, las vitaminas solubles en grasa y
en agua, así como los oligoelementos, forman parte de una denominada
premezcla destinada a ser añadida al alimento, mientras que los
macrominerales son añadidos habitualmente de forma separada al
alimento. Cualquiera de estos tipos de composiciones, cuando son
enriquecidas con una proteasa de la invención, son un aditivo
alimentario de la invención.
En una forma de realización particular, el
aditivo de alimentos para animales de la invención está provisto
para ser incluido (o formulado para ser incluido) en las dietas para
animales o alimentos en niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente
de 0,05 a 5,0%; o de 0,2 a 1,0% (donde el % indica un gramo de
aditivo por 100 g de alimentos). Este es el caso, en particular en
premezclas.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se dan listas no exclusivas de
ejemplos de estos componentes:
- \quad
- Ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, la vitamina D3, la vitamina E, y la vitamina K, por ejemplo la vitamina K3.
- \quad
- Ejemplos de vitaminas solubles en agua son la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, por ejemplo el Ca-D-pantotenato.
- \quad
- Ejemplos de oligoelementos son el manganeso, el zinc, el hierro, el cobre, la yodina, el selenio, y el cobalto.
- \quad
- Ejemplos de macrominerales son el calcio, el fósforo y el sodio.
\newpage
Los requisitos nutritivos de estos componentes
(ejemplificados con aves y lechones/cerdos) son registrados en la
tabla A de WO 01/58275. Requisitos nutritivos significan que estos
componentes deberían estar provistos en la dieta en las
concentraciones indicadas.
En una alternativa, el aditivo de alimentos para
animales de la invención comprende al menos uno de los componentes
individuales específicos de la Tabla A de WO 01/58275. Al menos uno
define cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro y
hasta todos trece, o hasta los quince componentes totales
individuales. Más específicamente, al menos un componente individual
es incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal para
proporcionar una concentración en el alimento comprendida en la gama
indicada en la columna cuatro, o en la columna cinco, o en la
columna seis de la Tabla A.
La presente invención se refiere también a
composiciones de alimentos para animales. Las composiciones de
alimentos o dietas para animales tienen un contenido proteico
relativamente alto. Las dietas de las aves y de los cerdos pueden
ser caracterizadas tal como indicado en la Tabla B de WO 01/58275,
en las columnas 2-3. Las dietas de los peces pueden
ser caracterizadas tal como indicado en la columna 4 de dicha Tabla
B. Además, estas dietas para peces tienen normalmente un contenido
de grasa bruta de 200-310 g/kg.
Una composición de alimentos para animales según
la invención tiene un contenido de proteína bruta de
50-800 g/kg, y comprende además al menos una
proteasa tal como reivindicado en la presente.
Además, o en alternativamente (al contenido de
proteína bruta indicada anteriormente), la composición de los
alimentos para animales de la invención tiene un contenido de
energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un
contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un
contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o
un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un
contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg;
y/o un contenido de lisina de
0,5-50 g/kg.
0,5-50 g/kg.
En formas de realización particulares, el
contenido de energía metabolizable, de proteína bruta, de calcio, de
fósforo, de metionina, de metionina más cisteína, y/o de lisina se
incluye en cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO
01/58275 (R. 2-5).
La proteína bruta es calculada como un nitrógeno
(N) multiplicado por un factor 6.25, es decir, proteína bruta (g/kg)
= N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno es determinado por el
método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis
14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington
DC).
La energía metabolizable puede ser calculada
basándose en la publicación de NRC Nutrient requirements in swine,
ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition,
committee on animal nutrition, board of agriculture, national
research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp.
2-6, y European Table of Energy Valúes for Poultry
Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research
and extensión, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf
Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN
90-71463-12-5.
El contenido dietético de calcio, de fósforo
disponible y de aminoácidos en las dietas completas de animales se
calcula basándose en las tablas alimentarias tales como
Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling,
verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central
Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN
90-72839-13-7.
En una forma de realización particular, la
composición de los alimentos para animales de la invención contiene
al menos una proteína vegetal o una fuente de proteína tal como se
ha definido anteriormente.
En otras formas de realización particulares, la
composición de los alimentos para animales de la invención contiene
0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo;
y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de
cebada; y/o 0-30% de avena; y/o
0-40% de harina de soja; y/o 0-10%
de harina de pescado; y/o 0-20% de lactosuero.
Las dietas de animales pueden por ejemplo ser
fabricadas en forma de alimentos triturados (no granulados) o de
alimentos granulados. Típicamente, los alimentos molidos son
mezclados y unas cantidades suficientes de vitaminas esenciales y de
minerales son añadidas según las especificaciones de las especies en
cuestión. Las enzimas pueden ser añadidas en forma de formulaciones
de enzimas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de
enzima sólida es añadida típicamente antes de o durante la fase de
mezcla; y una preparación enzimática líquida es añadida típicamente
después de la fase de granulación. La enzima también puede ser
incorporada en un aditivo alimentario o en una premezcla.
La concentración final de enzima en la dieta se
sitúa en la gama de 0,01-200 mg de proteína
enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de
5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta de
los animales. En formas de realización particulares, la
concentración de la enzima en la dieta es de
0,1-180, 0,1-160,
0,1-150, 0,2-125,
0,2-100, 1-180,
2-160, 5-150,
10-100, 10-90,
10-80, 10-70; o de
10-50 mg de proteína enzimática por kg de dieta de
animales.
En formas de realización particulares del método
de la invención para tratar las proteínas vegetales, se incluye
también otra fase de adicción de fitasa. Y en otras formas de
realización particulares, además del tratamiento combinado con
fitasa y proteasa, otras enzimas pueden ser añadidas también, donde
estas enzimas son seleccionadas en el grupo comprendiendo otras
proteasas, fitasas, enzimas lipolíticas, y enzimas de
glucosidasa/carbohidrasa. Ejemplos de estas enzimas se indican en
WO95/28850.
La proteasa debería ser aplicada obviamente, en
una cantidad efectiva, es decir, en una cantidad adecuada para
mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutritivo del
alimento. Actualmente se contempla el hecho de que la enzima es
administrada en una o más de las siguientes cantidades (gamas de
dosificación): 0,01-200; o 0,01-100;
o 0,05-100; o 0,05-50; o
0,10-10 - todas estas gamas siendo en mg de proteína
de la proteasa por kg (ppm) de
alimento.
alimento.
Para determinar los mg de proteína de la
proteasa por kg de alimento, la proteasa es purificada a partir de
la composición alimentaria, y la actividad específica de la proteasa
purificada es determinada usando un ensayo pertinente (véase en
actividad de proteasa, sustratos, y ensayos). La actividad de
proteasa de la composición alimentaria es determinada también
mediante el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones,
se calcula la dosificación en mg de la proteína de proteasa por kg
de alimento.
Los mismos principios sirven para determinar los
mg de proteína de proteasa en los aditivos alimentarios. Por
supuesto, si una muestra está disponible de la proteasa usada para
preparar el aditivo alimentario o el alimento, la actividad
específica es determinada a partir de esta muestra (sin necesidad de
purificar la proteasa de la composición alimentaria o del
aditivo).
La presente invención está descrita
posteriormente por los ejemplos siguientes que no deben ser
interpretados como limitativos del objetivo de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se especifique lo contrario, los
productos químicos usados eran productos comerciales de al menos un
nivel reactivo.
Caseína AZCL (Megazyme Cat. N.º
I-AZCAS). La caseína reticulada de azurina es
preparada mediante teñido y reticulación de la caseína altamente
purificada y es usada para el ensayo de
endo-proteasa. Es suministrada en forma de polvo
fino insoluble en solución tamponada, pero se hidrata rápidamente
para formar partículas de gel que son hidrolizadas fácilmente y
rápidamente por las endo-proteasas, liberando así el
fragmento soluble marcado con colorante.
Sustratos pNA:
- (AAPF) Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Sigma S-7388)
- (GGF) Gly-Gly-Phe-pNA (Sigma S-1899)
- (FGL) Phe-Gly-Leu-pNA (Sigma S-6768)
- BA-pNA (Sigma B-4875)
- (AAPE) Ala-Ala-Pro-Glu-pNA (BACHEM C-1710)
\vskip1.000000\baselineskip
SSI (inhibidor de subtilisina de streptomyces):
El SSI fue purificado a partir de un sobrenadante de fermentación de
Streptomyces albogríseolus FERM P-1205
(S-3253) por cromatografía. La preparación de SSI
tenía una pureza superior al 95% tal como determinada por
SDS-PAGE. Alternativamente, el SSI puede ser
obtenido en Wako en Japón, catálogo n.º 303-05201,
fabricado por Daiwa Kasei K.K. (véase por ejemplo:
http://search.wako-chem.co.jp/lifedb_e/)
ifedocs_e/44834.asp).
ifedocs_e/44834.asp).
- EDTA (Gibco BRL Cat.N? 15576-028)
- IPTG (Promega, Cat. N.º V3951)
- X-gal (Promega, Cat. N.º V3941)
- Sal sódica de ampicilina (GIBCOL., Cat.N.º 11593-019)
- LMP-agarosa (Promega, Cat. N.º V2111)
\vskip1.000000\baselineskip
La tripsina designa una proteasa de tipo
tripsina derivada de una cepa de Fusaríum oxysporum. Su
preparación está descrita en EP 471265, Ejemplos 1 y 2 ("proteasa
II").
SAVINASE^{TM} es una proteasa de subtilisina
derivada de Bacillus Clausii (previamente Bacillus
lentus NCIB 10309), disponible comercialmente de Novozymes A/S,
Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca. Su
preparación esté descrita en la patente estadounidense n.º
3723250.
- Pepsina (Sigma P-7000, 539 U/mg, sólido)
- Pancreatina (Sigma P-7545, 8 x U.S.P. (US Pharmacopeia)
- Citocromo C (12500 dalton, Boehringer Mannheim 103870)
- Aprotinina (6500 dalton, Sigma A-1153)
- Gastrina I (2126 dalton, Sigma G-1276)
- Sustancia P (1348 dalton, Sigma S-6883)
\vskip1.000000\baselineskip
Sistema de tampón (pH 3 a pH 11): 100 mM de
ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1
mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, el 0,01% de Tritón®
X-100 ajustado a valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5,
4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 o 11,0 con el HCl o el NaOH
(aquí con una designación corta "el sistema de tampón de ácido
succínico").
Borax/NaH_{2}PO_{4}, pH9: preparado por
mezcla de 8,25 ml de 0,05 M de Bórax con 1,75 ml de 0,1 M de
NaH_{2}PO_{4}.
- 1 x TAE de tampón: 0,04 M de tris-acetato; 0,001 m de EDTA.
- 0,5 x TBE de tampón: 0,045 M de tris-borato; 0,001 m de EDTA.
- 1 mM de sustratos de pNA: Pesar 5 mg de sustrato pNA y disolver en 100 \mul de DMSO, después diluir con 10 ml de Borax/NaH_{2}PO_{4} pH 9,0 de tampón
80 ml en un matraz de 500 ml Erlenmeyer, en
autoclave 20 minutos a 121ºC.
Medio de líquido LB: en 950 ml de H_{2}O
desionizado, añadir: 10 g de bacto-triptona, 5 g de
extracto de la bacto-levadura, 10 g de NaCl. Agitar
hasta disolver los solutos. Ajustar el pH a 7,0 con 5N NaOH
(\sim0,2 ml). Ajustar el volumen de la solución a 1 litro con el
H_{2}O desíonizado. Esterilizar por autoclave durante 20 minutos a
15 lb/sq. in. en ciclo líquido.
Placas de LB con
ampicilina/IPTG/X-Gal: se añade 15 g de agar a 1
litro de medio LB. Se añade ampicilina a una concentración final de
100 \mug/ml, después se añade un suplemento de 0,5 mM de IPTG y
80 \mug/ml de X-gal y se vierte sobre las
placas.
1% de gel de agarosa LMP: se añade 1 g de
agarosa LMP en 100 ml 1 x de tampón TAE.
Solución de almacenamiento IPTG (0,1 M):
- Añadir agua destilada a 1.2 g de IPTG en 50 ml de volumen final, filtrar esterilizar y almacenar a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Dieta maíz/-SBM (SBM = harina de soja): la
proporción de maíz/-SBM es de 6:4 (p/p), el contenido de proteína de
43% (p/p) en la SBM y de 8,2% (p/p) en la harina de maíz. La
cantidad total de la proteína en 10 g de la dieta de
maíz-SBM es de 2,21 g.
SBM extruida: el contenido de la proteína es de
45%. La cantidad total proteína en 10 g de SBM extruida es así de
4,5 g.
- Membrana 5K (Millipore BIOMAX-5, 13442AM)
- Filtro 0,45 \mum (Nalgene 190-2545)
- Columna Q sefarosa FF (Amersham Pharmacia 17-0510-01)
- Columna Superdex75 (Amersham Pharmacia 17-1047-01)
- Gel IEF (Amersham Pharmacia 80-1124-80)
- Termomezclador comfort (Eppendorf)
- RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Cat. N.º 74904)
- 3' RACE Kit (GIBCO, Cat. N.º 18373-019) incluyendo el cebador adaptador, y AUAP
- Mezcla dNTP (100 mM, Promega, Cat. N.º U1330)
- Sistema de TaqDNA polimerasa (Promega, Cat. N.º M1661) incluyendo el tampón PCR (200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl)
- Sistema PCR Preps DNA Purification System (Promega, Cat. N.º A7170)
- Sistema de vector pGEM-T (Promega, Cat. N.º A3600) incluyendo el tampón 2X de ligasa de ADN T4
- Células competentes JM109 de eficiencia alta (Promega, Cat. N.º L1001)
- Sistema PCR Preps DNA Purification System (Promega, Cat. N.º A7100)
- BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems, Cat. N.º 4303149)
- Secuenciador de ADN ABI Prism 377 (PE)
- Sistema 5'RACE (GIBCO, CAT. N.º 18374-058) incluyendo el cebador Abridged Anchor Primer
- Sistema de polimerasa de ADN pfu (Promega, Cat. N.º M7741)
- 0,45 \muM filtros de policarbonato (Sartorius)
- Péptido Superdex PE (7,5 x 300 mM) columna de filtración en gel (Global)
- Espectrofotómetro DU7500 (Beckman)
- Sistema PCR GeneAmp 9700(PE)
- Vac-Man Jr. Laboratory Vacuum Manifold (Promega, Cat. N.º A7660).
\newpage
Se usaron los ensayos siguientes para determinar
la actividad de proteasa:
Una solución del 0,2% de caseína AZCL de
sustrato azul es suspendida en un tampón Borax/NaH_{2}PC_{4} de
pH 9 durante la agitación. (Para la parte de perfil del pH del
Ejemplo 4, se usó más bien el sistema de tampón de pH 3 a pH 11). La
solución es distribuida durante la agitación en una placa de
microtitulación (100 \mul en cada pozo), 30 \mul de muestra de
enzima son añadidos y las placas son incubadas en un termomezclador
Eppendorf durante 30 minutos a 45ºC y 600 rpm. Se usó una muestra de
enzima desnaturalizada (hirviendo a 100ºC durante 20 min) en forma
de muestra en blanco. Después de la incubación, la reacción fue
detenida mediante una tranferencia a la placa de microtitulación en
hielo y la solución coloreada es separada del sólido por
centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. 60 \mul de
sobrenadante son transferidos a una placa de microtitulación y la
absorbencia a 595 nm es medida usando un lector de microplacas
BioRad.
50 \mul de muestra que contiene la proteasa
es añadida a una placa de microtitulación y el ensayo es iniciado
mediante la adición de 100 \mul de 1 mM de sustrato pNA (5 mg
disueltos en 100 \mul de DMSO y diluido además en 10 ml con un
tampón Borax/NaH_{2}PC_{4} de pH 9,0). El aumento en OD_{405}
a temperatura ambiente es controlado como una medida de la actividad
de proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670
fue cultivada a 45ºC durante 60 horas en frascos de agitación con el
medio CBH1. El caldo de cultivo fue recuperado por centrifugación
(7000 rpm durante 20 minutos a 4ºC). Se obtuvo un total de 1500 ml
de caldo de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
1500 ml de sobrenadante del Ejemplo 2 fueron
precipitados con sulfato de amonio (80% de saturación) y disueltos
otra vez en un tampón de 40 ml de 25 mM Tris-HCl, pH
7,4. La solución obtenida fue ultrafiltrada con una membrana de 5K
para eliminar las sales y cambiar el tampón a 25 mM
Tris-HCl, pH 7,4, después de lo cual, ésta fue
filtrada a través de un filtro de 0,45 \mum. El volumen final fue
de 30 ml. La solución fue aplicada a una columna
Q-sefarosa FF de 20 mi equilibrada en 25 mM
Tris-HCl, pH 7,4, y las proteínas fueron eluidas con
un gradiente lineal de NaCl (0-0,4 M). Unas
fracciones de la columna fueron analizadas para la actividad de
proteasa en caseína AZCL a pH 9,0, con o sin SSI. Se agruparon las
fracciones con la actividad de proteasa no inhibida por SSI. La
solución combinada fue aplicada a una columna Superdex75 equilibrada
con 25 mM Tris-HCl, pH 7,4, y las proteínas fueron
eluidas con el mismo tampón. Las fracciones que contienen la
proteasa fueron analizadas por SDS-PAGE y las
fracciones puras fueron combinadas.
La pureza de la proteasa purificada fue
controlada por SDS-PAGE y en un gel IEF. La muestra
contenía sólo una proteasa designada AP025. El peso molecular es de
aproximadamente 23 kDa y el pl es pH 8,5.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteasa purificada AP025 fue probada para
determinar la inhibición por varios inhibidores, incluyendo SSI y
EDTA. La proteasa fue incubada con 1,12 mg/ml de SSI, o 0,5 M de
EDTA durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la actividad
residual fue determinada usando el ensayo de caseína AZCL del
Ejemplo 1 (pH 9, 45ºC). La tripsina y SAVINASE^{TM} fueron
incluidas en forma de controles. Como se puede ver de manera
evidente con los resultados mostrados en la Fig. 1, la actividad de
AP025 no parece ser inhibida ni por el SSI ni por el EDTA.
La relación entre temperatura y actividad de
proteasa fue evaluada usando el ensayo de caseína AZCL (20 minutos
en agitación en un termomezclador). El perfil de la temperatura
obtenida aparece en la Fig. 2.
La proteasa AP025 es activa en una gama amplia
de temperaturas de 20-90ºC y parece tener una
temperatura óptima de aproximadamente 70ºC. Pero incluso a 90ºC. La
actividad es de al menos el 60%, en relación con la actividad a
55ºC.
La relación entre pH y actividad de proteasa fue
evaluada usando el ensayo de caseína AZCL del Ejemplo 1 (y el
sistema de tampón de pH 3 a pH 11). El perfil de pH resultante
aparece en la Fig. 3.
La proteasa AP025 parece tener una actividad en
una gama amplia de pH de pH 5-10. El pH óptimo es de
aproximadamente 6.
Para medidas de estabilidad de pH, una mezcla de
15 ml de la muestra de enzima y de 200 ml del tampón pH
3,4,5,6,7,8,9,10,11 fue incubada a 37ºC durante 2 horas, y la
actividad enzimática residual fue entonces probada usando la caseína
AZCL del Ejemplo 1 (adición de 900 ul de caseína AZCL en un tampón
Borax/NaH_{2} PO_{4}, pH 9,0, incubación de la mezcla a 45ºC,
1200 rpm durante 10 min; el OD fue medido así a 595 nm). Los
resultados aparecen en la Fig. 4. La proteasa parece ser estable en
una gama muy amplía de pH de pH 4-10, pero es
óptimamente estable alrededor de pH 4.
La especificidad de sustrato de AP025 fue
evaluada usando unos sustratos pNA incluyendo AAPF, AAPE, GGF, BA y
FGL, con SAVINASE^{TM} y tripsina como referencias.
Según los resultados mostrados en la Fig. 5,
parece ser que AP025 no presenta ninguna actividad sustancial en
cualquiera de estos sustratos.
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteasa AP025 fue:
| QRISSCSGSRQSALTTALRN | (SEC N.º ID:3). |
\vskip1.000000\baselineskip
La Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670
fue cultivada a 45ºC, 165 rpm durante 3 días en un medio CBH1. El
micelio fue recogido por centrifugación a 7000 rpm durante 30
minutos. El micelio recogido fue almacenado a -80ºC antes del uso
para una extracción de ARN.
El ARN total fue extraído de 100 mg de micelio
usando el RNeas Mini Kit y.
Los siguientes cebadores degenerados fueron
diseñados en base a una parte de la secuencia de aminoácidos
N-terminal, QSALTTA:
| T025-3 | 5' CA(A/G) TC(T/C/A/G) GC(T/C/A/G) CT(T/C/A/G) AC(T/C) AC(A/G) GC 3' | (SEC N.º ID:4) |
| T025-12 | 5' CA(A/G) AG(T/C) GC(T/C/A/G) CT(T/C/A/G) AC(A/G) AC(A/G) GC 3' | (SEC N.º ID:5) |
\vskip1.000000\baselineskip
El 3' RACE kit fue usado para sintetizar el ADNc
de AP025. Aproximadamente 5 mg del ARN total fue usado en forma de
cadena de ADN-molde y el cebador adaptador fue usado
para sintetizar la primera cepa de ADNc. El ADNc de AP025 fue
entonces amplificado por PCR usando los cebadores degenerados
mencionados más arriba.
El sistema y condiciones de reacción por PCR
fueron los siguientes:
El análisis en gel del producto PCR ha revelado
una banda específica correspondiente a un fragmento de
aproximadamente 800bp, usando los cebadores AP025-3
y AP025-12. Los productos fueron recuperados a
partir del 1% de gel de agarosa LMP, purificados por incubación en
un baño a 70ºC, seguido del uso del sistema PCR Preps DNA
Purification System. Las concentraciones de productos purificados
fueron determinadas midiendo la absorbencia de A_{260} y A_{280}
en un espectrofotómetro. Estos fragmentos purificados fueron
entonces ligados al vector pGEM-T usando el
correspondiente Promega Kit:
Las reacciones fueron incubadas durante toda la
noche a 4ºC.
2-4 \mul de los productos de
ligadura fueron transformados en 50 \mul de células competentes
JM109 de eficiencia alta por el método de "choque térmico" (J.
Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis (1989) Molecular Cloning 1,74,
1,84).
Unos cultivos de transformación fueron colocados
en placas LB con ampicilina/IPTG/X-Gal, y estas
placas fueron incubadas durante toda la noche a 37ºC. Unos clones
recombinantes fueron identificados medante la selección de color en
placas indicadoras y la selección de colonia por PCR de la siguiente
manera:
Se sumerge una colonia blanca con una boquilla y
se pipeta la colonia en la mezcla de PCR en forma de cadena de
ADN-molde.
Los clones positivos fueron inoculados en 3 ml
de medio líquido LB e incubados durante toda la noche a 37ºC en
agitación (aproximadamente 250 rpm). El granulado de célula fue
separado por centrifugación durante 5 min a 10,000 x g, y muestras
de plásmidos fueron preparadas a partir del granulado de célula
usando el sistema PCR Preps DNA Purification System. Finalmente, los
plásmidos fueron secuencionados usando el BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit y el secuenciador AB1377. La reacción
de secuenciación fue la siguiente:
] Los resultados de la secuenciación mostraron
que la banda de PCR obtenida usando el cebador
AP025-3, así como el cebador
AP025-12, es la secuencia extrema 3' de AP025.
En base a la secuencia extrema 3' de AP025,
hemos diseñado tres cebadores específicos que fueron usados para
clonar el extremo 5' de la secuencia.
| AP025-5'-1 | 5' AAG GTATAT GGC ATT CGC AT 3' | (SEC N.º ID:6) |
| AP025-5'-2 | 5' GCA GCC TGG TAG CCA TAC 3' | (SEC N.º ID:7) |
| AP025-5'-3 | 5' TTG ATC CTG AGC GTG ACA G 3' | (SEC N.º ID:8) |
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema 5'RACE fue usado para sintetizar el
fragmento de extremo 5' de AP025. El 5 \mug de ARN total y el
cebador 5'-1 fueron añadidos a la síntesis de la
primera cadena. El ADNc fue entonces purificado con el sistema de
purificación de ADN (provisto por el sistema 5'RACE) y una cola
polyC fue añadida al extremo 3' del ADNc. El cebador
5'-2 fue usado para la segunda síntesis de
cadena.
El sistema y las condiciones siguientes de PCR
del ADNc de cola dC fueron usados:
Para obtener un producto específico hemos
amplificado el extremo 5' usando el cebador
AP025-5'-3 por PCR anidada (Frohman,
M.A. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications
(Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., y White, T.J., eds.) p.
28, Academic Press, San Diego.
Usando el cebador
AP025-5'-3 en el sistema 5'RACE, una
banda específica fue obtenida con el tamaño de un fragmento de 1000
bp. Los productos de PCR fueron purificados, ligados en el vector
pGEM-T, y transformados en células competentes
JM109, y secuenciados. La secuenciación confirmó que el fragmento de
extremo 5' de AP025 había sido clonado.
Un cebador para la clonación de longitud total
fue diseñado basándose en las secuencias de los extremos 3' y 5'
mencionadas anteriormente:
| AP025-CDS-2 | 5' AAG TCT ACC CAG TAT CCT GT 3' | (SEC N.º ID:9) |
Los cebadores
AP025-CDS-2 y AUAP fueron usados
para amplificar el gen de longitud total del ADNc de AP025. El
sistema de reacción PCR y las condiciones siguientes fueron
usados:
Una banda específica con el tamaño de
aproximadamente 1,4 kb fue el resultado de esta amplificación. Una
cola polyA fue añadida usando la polimerasa de ADN Taq y la
incubación a 72ºC durante 30 min. El fragmento de cola dA fue
recuperado del gel con el sistema PCR Preps DNA Purification System.
El fragmento purificado fue entonces ligado en el vector
pGEM-T, y transformado en las células competentes
(JM109). Algunos clones positivos fueron seleccionados por colonia
PCR.
Se sumerge una colonia blanca con una boquilla y
se pipeta la colonia en la mezcla de PCR en forma de cadena de
ADN-molde.
El plásmido fue extraído así de estos clones con
el sistema Minipreps DNA Purification System. El plásmido fue
secuenciado usando el BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit, y la secuencia de longitud total fue obtenida.
El análisis de secuencia del clon de ADNc ha
mostrado que la secuencia contiene una región codificante de 1065
nucleótidos. El producto de traslación de la región codificante es
un péptido de 355 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida
de este gen, con un péptido señal (de aa 1-19), un
propéptido (20-178) y un péptido maduro (de aa
179-335) aparece en las figuras 6 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteasa AP025 fue expresada en y excretada a
partir de Aspergillus oryzae. La proteasa purificada tenía un
A_{280} de 1,15 y un A_{260} de 0,52. El rendimiento de la
proteasa purificada fue probado en un modelo in vitro de
simulación de la digestión en animales monogástricos. En particular,
la proteasa fue probada para determinar su capacidad para mejorar la
solubilización y la digestión de proteínas de maíz/-SBM (harina de
maíz/-de soja).
El sistema in vitro consistía en 10
matraces en los que un sustrato de maíz/-SBM fue incubado
inicialmente con HCl/pepsina - simulando una digestión gástrica - y
posteriormente con pancreatina - simulando la digestión intestinal.
Cinco de los matraces fueron dosificados con la proteasa AP025 al
principio de la fase gástrica mientras que los matraces restantes
sirvieron de muestras en blanco. Al final de la fase de incubación
intestinal, las muestras de digestión in vitro fueron
eliminadas y analizadas para determinar la proteína solubilizada y
digerida.
- Sustrato:
- 4 g SBM, 6 g maíz (premezclado)
- pH:
- 3,1 fase estomacal/6,8-7,0 fase intestinal
- HCl:
- 0,105 M durante 1,5 horas (es decir, premezcla de sustrato HCl de 30 min)
- pepsina:
- 3000 U/g dieta durante 1 hora
- pancreatina:
- 8 mg/g dieta durante 4 horas
- temperatura:
- 40ºC.
- Replicados:
- 5
\vskip1.000000\baselineskip
0,39 M NaOH
0,105 M HCl
0,105 M HCl comprendiendo 6000 U de pepsina por
5 ml
1 M NaHCO_{3} comprendiendo 16 mg de
pancreatina por ml
125 mM NaAc-tampón, pH 6,0
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de proteína de la enzima de proteasa
es calculada en base a los valores de A_{280} y a las secuencias
de aminoácidos (composiciones de aminoácidos) usando los principios
perfilados en S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical
Biochemistry 182, 319-326; (1989).
\newpage
El proceso experimental se realizó según el
resumen anterior. El pH fue medido en periodos de 1, 2,5, y 5,5
horas. Las incubaciones fueron terminadas después de 6 horas y unas
muestras de 30 ml fueron eliminadas y colocadas en hielo antes de la
centrifugación (10000 x g, 10 min, 4ºC). Los sobrenadantes fueron
retirados y almacenados a -20ºC.
Todas las muestras fueron analizadas para
determinar el % del grado de hidrólisis (DH) con el método OPA así
como el contenido de proteína solubilizada y digerida mediante el
uso de una gelfiltración.
El grado de hidrólisis (DH) de la proteína en
muestras diferentes fue determinado usando un método colorimétrico
semi-automatizado basado en una placa microtitulada
(Nielsen, P.M.; Petersen. D.; Dambmann. C. Improved method for
determining food protein degree of hydrolysis. J.Food Sci. 2001, 66,
642-646). El reactivo OPA fue preparado de la manera
siguiente: 7.620 g de decahidrato tetraborato di-Na
y 200 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS) fueron disueltos en 150
ml de agua desionizada. Los reactivos fueron dísueltos completamente
antes de continuar. 160 mg de o-ftaldialdehído al
97% (OPA) fueron disueltos en 4 ml de etanol. La solución OPA fue
transferida cuantitativamente a la solución mencionada anteriormente
mediante un aclarado con agua desionizada. 176 mg de ditiotreitol al
99% (DTT) fueron añadidos a la solución producida hasta 200 ml con
agua desíonizada. Un estándar de serina (0,9516 meqv/l) fue
preparado por solubilización de 50 mg de serina (Merck, Alemania) en
500 ml de agua desionizada.
La solución de la muestra fue preparada por
dilución de cada muestra en una absorbencia (280 nm) de
aproximadamente 0,5. Generalmente, los sobrenadantes fueron diluidos
(100 x) usando una estación de dilución automatizada Tecan
(Männedorf, Suiza). Todas las otras lecturas de espectrofotómetro
fueron realizadas a 340 nm usando agua desionizada como el control.
25 \mul de muestra, estándar y ciega fueron dispensados en una
placa de microtitulación. La placa de microtitulación fue insertada
en un lector iEMS MF (Labsystems, Finlandia) y 200 \mul del
reactivo OPA fueron dispensados automáticamente. Las placas fueron
agitadas (2 min; 700 rpm) antes de medir la absorbencia. Finalmente,
se calculó el DH. La determinación óctuple de todas las muestras fue
efectuada.
El contenido de proteína solubilizada en
sobrenadantes a partir de muestras digeridas in vitro fue
estimado por cuantificación de la proteína bruta (CP) usando la
filtración en gel HPLC. Los sobrenadantes fueron descongelados,
filtrados a través de filtros de policarbonato de 0,45 \mum y
diluidos (1:50, v/v) con H_{2}O. Las muestras diluidas fueron
cromatografiadas por HPLC usando una columna de gelfiltración
Superdex Peptide PE (7,5 x 300 mm) (Global). El eluyente usado para
la elución isocrática era un tampón de fosfato sódico (pH 7,0) de 50
mM conteniendo 150 mM de NaCl. El volumen total de eluyente por
recorrido era 26 ml y la velocidad de flujo de 0,4 ml/min. Los
perfiles de elución fueron registrados a 214 nm y la superficie
total inferior a los perfiles fue determinada por la integración.
Los perfiles de elución fueron registrados a 214 nm y la superficie
total inferior a los perfiles fue determinada por integración. Para
estimar el contenido de proteína de áreas integradas, una curva de
calibración (R^{2}=0,9993) fue realizada a partir de una serie de
dilución de una muestra de maíz/-SBM de referencia digerida in
vitro con el contenido de proteína total conocido. La
determinación de la proteína en esta muestra de referencia fue
efectuada por el método Kjeldahl (determinación del % de nitrógeno;
A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14th ed., Washington
DC).
El contenido de proteína digerida fue estimado
por integración del área de cromatograma correspondiente a los
péptidos y aminoácidos que tienen una masa molecular de 1500 dalton
o inferior (Savoie,L.; Gauthier,S.F. Dialysis Cell ForThe
In-vitro Measurement Of Protein
Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498;
Babinszky.L.; Van, D.M.J.M.; Boer, H.; Den,H.L.A. An
In-vitro Method for Prediction of The
Digestible Crude Protein Content In Pig Feeds. J. Sci. Food Agr.
1990, 50, 173-178; Boisen, S.; Eggum, B.O. Critical
Evaluation of In-Vitro Methods for Estimating
Digestibility in Simple-Stomach Animáis. Nutrition
Research Reviews 1991, 4, 141-162). Para determinar
la línea divisoria de 1500 dalton, la columna de filtración en gel
fue calibrada usando el citocromo C, aprotinina, gastrina I, y
sustancia P en forma de estándares de masa molecular.
Los resultados mostrados en las tablas 1 y 2 más
abajo indican que la proteasa AP025 ha aumentado significativamente
la proteína digerible, mientras el DH y la proteína soluble han
aumentado numéricamente en comparación con la muestra en blanco.
Durante la prueba en la parte intestinal de este
modelo sólo, la proteasa AP025 (en la misma dosificación de 100 mg
de la proteína enzimática por kg del sustrato) aumentó
significativamente el nivel de la proteína solubilizada y de la
proteína digerida (103,0 y 103,1%, respectivamente, en relación con
la muestra en blanco), mientras el DH no había aumentado (96,5% en
relación con la muestra en blanco).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La misma preparación de proteasa AP025 tal como
se describe en el ejemplo 6 fue probada también en un modelo in
vitro de acuicultura que simula la digestión en un pez de agua
fría. En comparación con el modelo monogástrico, el sistema de
acuicultura se realiza con valores de pH ligeramente diferentes (pH
3,3 en la fase gástrica y pH 7,2-7,8 en la fase
intestinal). La temperatura de incubación es inferior (de 15ºC en
vez de 40ºC) y los períodos de incubación son más largos (indicados
más abajo). Los 10 matraces que contienen SBM extruido en forma de
sustrato fueron incubados inicialmente con HCl/pepsina - simulando
la digestión gástrica - y posteriormente con pancreatina - simulando
la digestión intestinal. Cinco de los matraces fueron dosificados
con la proteasa AP025 al principio de la fase gástrica mientras que
los matraces restantes servían de muestras en blanco. Al final de la
fase de incubación intestina, las muestras de la digestión in
vitro fueron eliminadas y analizadas para determinar la proteína
solubilizada y digerida.
\vskip1.000000\baselineskip
- Sustrato:
- 10 g SBM extruido
- pH:
- 3,3 fase estomacal/7,2-7,8 fase intestinal
- HCl:
- 0,18 M durante 6 horas
- pepsina:
- 3000 U/g extruido durante 6 horas
- pancreatina:
- 8 mg/g SBM extruido durante 18 horas
- Temperatura:
- 15ºC.
- Réplicas:
- 5
\vskip1.000000\baselineskip
1,10 M NaOH
0,18 M HCl con un contenido de 652 U de pepsina
por ml
1 M NaHCO_{3} con un contenido de 16 mg de
pancreatina por ml
125 mM NaAc-tampón, pH 6,0
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso experimental se efectuó tal como
mencionado anteriormente. El pH fue medido después de 1, 5, 8 y 23
horas. Las incubaciones se terminaron después de 24 horas y las
muestras de 30 ml fueron eliminadas y colocadas en hielo antes de la
centrifugación (10000 x g, 10 min, 4ºC). Los sobrenadantes fueron
retirados y almacenados a -20ºC.
Todos los sobrenadantes fueron analizados con el
método de OPA (% de grado de la hidrólisis) y el Akta HPLC para
determinar la proteína solubilizada y digerida (véase el Ejemplo
6).
Los resultados mostrados en las tablas 3 y 4
abajo indican que la proteasa AP025 aumentaba significativamente la
solubilidad de la proteína, la digestibilidad de la proteína y el
DH, en relación con la muestra en blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La materia biológica siguiente ha sido
depositada según las condiciones del Tratado de Budapest con DSMZ
(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania), y CGMCC (the China General Microbiological
Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chínese
Academy of Sciences, Haidian, Beijing 100080, China); y se proveen
los números de registro siguientes:
| Depósito | Número de acceso | Fecha de depósito |
| Escherichia coli | DSM 14652 | 2001-11-29 |
| Thermoascus aurantiacus | CGMCC N.º 0670 | 2001-12-27 |
La cepa de Escherichia coli aloja un
plásmido que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de la
proteasa de Thermoascus aurantiacus (es decir SEC N.º ID:1
codificante de SEC ID N.º:2)
Estas cepas han sido depositadas en unas
condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos será posible
durante la pendiencia de esta solicitud de patente para alguien
designado por el Comisario de Patentes y Marcas Registradas que debe
ser autorizado con este fin en 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. Los
depósitos representan un cultivo substancialmente puro de las cepas
depositadas. Los depósitos son disponibles según lo requerido por
las leyes de patentes extranjeras en países donde contrapartes de la
solicitud en cuestión, o de su progenie, son archivadas. No
obstante, debe ser entendido que la disponibilidad de un depósito no
constituye ninguna licencia para utilizar la invención objeto en
derogación de derechos de patentes concedidos por acción
gubernamental.
La cepa Thermoascus aurantiacus n.º CGMCC
0670 fue aislada a partir de una muestra de tierra recogida el 21
julio 1998 en la Provincia de Yunnan, Xishuangbanna, China.
La invención descrita y reivindicada aquí no
debe ser limitada en su campo de aplicación por las formas de
realización específicas divulgadas aquí, ya que estas formas de
realización son provistas como ilustraciones de varios aspectos de
la invención. Cualesquiera formas de realización equivalentes se
destinas a formar parte del campo de esta invención. De hecho,
varias modificaciones de la invención además de las que se han
mostrado y descrito en la presente serán evidentes para los expertos
en la técnica en la descripción anterior. Tales modificaciones
también están destinadas a incluirse en el campo de las
reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente
divulgación incluyendo las definiciones tendrán el control.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u
omisiones.
- WO 9746689 A [0003] [0003] [0003] [0003]
[0003] [0003] [0003]
- JP 5168479 A [0005]
- WO 9934003 A [0008]
- EP 897985 A [0023]
- WO 9617929 A [0024]
- WO 9830682 A [0024]
- WO 9835026 A [0024]
- WO 9900489 A [0024]
- WO 0026354 A [0024] [0024]
- WO 9616177 A [0024]
- WO 0026230 A [0024] [0024]
- WO 0183559 A [0024]
- EP 561907 A [0024]
- WO 0022103 A [0024]
- WO 9600787 A [0078] [0112]
- WO 9533836 A [0088]
- EP 238023 A [0112]
- US 5689054 A [0123]
- US 6111168 A [0123]
- WO 9114772 A [0129]
- WO 2000064247 A [0139]
- WO 0158275 A [0148] [0187] [0188] [0189]
[0192]
- DK 0200781 W [0179]
- DK 0200812 W [0179]
- WO 9401459 A [0180]
- WO 02090384 A [0180]
- WO 9528850 A [0200]
- EP 471265 A [0208]
- US 3723250 A [0209]
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232, 1-6 [0016]
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1-6 [0016]
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<110> Novozymes A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteasas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10251
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> versión de patente 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoascus aurantiacus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> miscfeature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25) .. (1089)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen codificante de SEC N.º ID:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoascus aurantiacus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (179)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PROPEP
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(178)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoascus aurantiacus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N en posición 3 y 18 significa A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N en posición 3 y 18 significa A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M en posición 6 significa T, C, A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M en posición 9 significa T, C, A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M en posición 12 significa T, C, A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> K en posición 15 significa T o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcantcmgcmc tmackacngc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N en posición 3 significa A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> K en posición 6 significa T o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M en posición 9 significa T, C, A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M en posición 12 significa T, C, A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N en posición 15 significa A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N en posición 18 significa A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcanagkgcmc tmacnacngc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtatatg gcattcgcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcctggt agccatac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatcctga gcgtgacag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtctaccc agtatcctgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1133)..(1195)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..( )
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(70)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1199)..(1267)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(1129)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (15)
1. Polipéptido aislado que tiene una actividad
de proteasa, seleccionado en el grupo que consiste en:
- (a)
- un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con respecto a los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2 de al menos 80%;
- (b)
- un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con
- (i)
- la proteasa madura codificante de una parte del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 14652,
- (ii)
- los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1,
- (iii)
- una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o
- (iv)
- una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii); y
- (c)
- un fragmento de (a) o (b) que tiene una actividad de proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que se
define como
- (i)
- una metaloendopeptidasa EC 3.4.24;
- (ii)
- una familia de metaloproteasas M tal como definido en las págs. 989-991 del "Handbook of Proteolytic Enzymes" por Barrett et al (eds), Academic Press (1998); y/o
- (iii)
- un polipéptido que posee un motivo HEFTH.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
- (a)
- comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2;
- (b)
- codifica un polipéptido que tiene una actividad de proteasa, y que se hibridiza en condiciones de astringencia media con
- (i)
- la parte madura codificante de la proteasa del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 14652,
- (ii)
- ios nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1;
- (iii)
- una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos; y/o
- (iv)
- una cadena complementaria de (i), (ii), o (iii); y/o
- (c)
- codifica un polipéptido que tiene una actividad de proteasa, y que tiene un grado de identidad con respecto a los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1 de al menos 70%.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo
la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 enlazada
operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la
producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.
5. Vector de expresión recombinante
comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la
reivindica-
ción 4.
ción 4.
6. Célula huésped recombinante comprendiendo el
constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4 o el vector
según la reivindicación 5.
\newpage
7. Método de producción de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, método
comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped recombinante
según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante
comprendiendo el polipéptido; y (b) la recuperación del
polipéptido.
8. Método de producción de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, método comprendiendo (a)
el cultivo de una cepa del género Thermoascus; y (b) la
recuperación del polipéptido.
9. Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º
0670.
10. Uso de la proteasa según la reivindicación 1
o 2
- (i)
- en un alimento para animales; y/o
- (ii)
- en la preparación de una composición para un uso en alimentos para animales.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Método para mejorar el valor nutritivo de
una alimento para animales, donde la proteasa según la
reivindicación 1 o 2 es añadida al alimento.
12. Aditivo de alimentos para animales
comprendiendo
- (a)
- la proteasa según la reivindicación 1 o 2; y
- (b)
- al menos una vitamina liposoluble, y/o
- (c)
- al menos una vitamina soluble en agua, y/o
- (d)
- al menos un oligoelemento, y/o
- (e)
- al menos un macromineral;
el aditivo comprendiendo opcionalmente también,
fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o
beta-glucanasa.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Composición de alimentos para animales con
un contenido de proteínas brutas de 50 a 800 g/kg y comprendiendo la
proteasa según la reivindicación 1 o 2.
14. Método de tratamiento de proteínas
vegetales, comprendiendo la fase de adición de la proteasa según la
reivindicación 1 o 2 por lo menos a una proteína vegetal o a una
fuente de proteína vegetal.
15. Método según la reivindicación 14, donde se
incluye la soja en dicha al menos una fuente de proteína
vegetal.
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