BR0214653B1 - Construção de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula de microorganismo hospedeiro recombinante, método para produzir um polipeptídeo, uso de pelo menos uma protease, método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, aditivo para ração animal, composição de ração animal, e, método para o tratamento de proteínas egetais”. - Google Patents

Description

“CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA DE MICROORGANISMO HOSPEDEIRO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, USO DE PELO MENOS UMA PROTEASE, MÉTODO PARA MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, ADITIVO PARA RAÇÃO ANIMAL, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL, E, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE PROTEÍNAS VEGETAIS.” ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e seqüências de ácido nucleico isoladas codificando os polipeptídeos. A invenção também refere-se a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo as seqüências de ácido nucleico, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da técnica Relacionada A clonagem do gene Penicillolisina (plnC) de uma cepa de Penicillium citrinum é descrita por Matsumoto et al em Biochim. Biophys. Acta 1218: 469 (1994). A seqüência foi submetida à base de dados EMBL como D25535. WO 9746689 descreve as seguintes seqüências de protease (codificando) de cepas de Aspergillus específicas: SEQ ID N° 1 de WO 97/46689 é um gene pepH parcial de Aspergillus niger\ SEQ ID N° 2 de WO 97/46689 é um cDNA pepH parcial de Aspergillus niger\ SEQ ID N° 3 de WO 97/46689 é uma seqüência de aminoácido PEPH parcial de Aspergillus niger, SEQ ID N° 4 de WO 97/46689 é um gene pepl de Aspergillus nidulans\ SEQ ID N° 5 de WO 97/46689 é um cDNA pepl de Aspergillus nidulans; e SEQ ID N° 6 de WO 97/46689 é uma seqüência de aminoácido PEPI de Aspergillus nidulans.

Em Gene 165 (1) 121-125 (1995), Ramesh et al descrevem a clonagem e caracterização dos genes codificando proteases de uma cepa de Aspergillus flavus e uma cepa de Aspergillus fumigatus. Estas seqüências foram submetidas a EMBL como L7524 e U24146, respectivamente. A sequência de uma protease neutral variante com base na protease neutral II de uma cepa de Aspergillus oryzae é descrita em JP 05-168479. A clonagem da protease neutral parental de Aspergillus oryzae é descrita em Mol. Gen. Genet. (1991) 228, p. 97-103 por Hiroki Tatsumi et al.

As partes de peptídeo maduras das proteases acima tem um grau de identidade com a parte de peptídeo madura de uma protease Thermoascus da presente invenção de 75,7% ou abaixo.

As seqüências de nucleotídeo s correspondendo às partes de peptídeo maduras das proteases acima tem um grau de identidade com a seqüência de nucleotídeos correspondendo à parte de peptídeo madura de uma protease Thermoascus da presente invenção de 68,4% ou abaixo. É um objeto da presente invenção prover proteases alternativas com um potencial para uso em rações animais.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease selecionada dentre o grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem, pelo menos, 80% de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2. (b) um polipeptídeo codificado por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de baixa estringência com (i) a parte codificando a protease madura do plasmídeo contido em Escherichia coli DSM 14652, (ii) nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, ou 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, (iii) uma sub-seqüência de (i) ou (ii) de pelo menos 100 nucleotídeos, ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii); (c) uma variante do polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (d) uma variante alélica de (a) ou (b); (e) fragmento de (a), (b) ou (d) que tem atividade de protease. SEQ ID N° 1 é uma seqüência de cDNA de uma protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (SEQ ID N° 1) e SEQ ID N° 2 é a seqüência de aminoácido deduzida da mesma. A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico isoladas codificando os polipeptídeos e para construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo as seqüências de ácido nucleico, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos, particularmente em ração animal.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 mostra os resultados de um teste de inibição de uma protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670; A Figura 2 mostra o perfil de temperatura da mesma, A Figura 3 mostra o perfil de pH da mesma, A Figura 4 mostra a estabilidade de pH da mesma, e A Figura 5 mostra os resultados de um teste de especificidade de substrato da mesma.

Descrição Detalhada Da Invenção Identificou-se, de modo surpreendente, uma nova classe de proteases que pode ser utilizável em ração animal. A maior parte das proteases para rações conhecidas são serina proteases, e muitas destas não são suficientemente estáveis em ácido para sobreviver à passagem através do estômago ácido. As proteases da invenção são relacionadas a uma metaloprotease estável em ácido derivada de Thermoascus aurantiacus. A parte de polipeptídeo madura desta protease compreende aminoácidos 1-177 de SEQ ID N° 2. Estudos in vitro simulando a digestão em animais monogástricos e peixe mostraram que a Thermoascus aurantiacus protease é capaz de aumentar a quantidade de proteína solúvel e digerível e aumentar o grau de hidrólise de proteína. Um polipeptídeo novo, homólogo foi identificado em Aspergillus oryzae (aminoácidos 177-353 de SEQ ID N° 11). Polipeptídeos tendo atividade de protease As proteases são às vezes também designadas peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases, ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo que hidrolisa peptídeos partindo em ambas as extremidades do mesmo, ou do tipo endo que atua intemamente nas cadeias polipeptídeo (endopeptidases). As endopeptidases mostram atividade em substratos de peptídeo bloqueadas N e C terminalmente que são relevantes para a especificidade da protease em questão. O termo "protease" é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações peptídeo. Ele inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzima EC 3.4 (incluindo cada uma das treze subclasses do mesmo). O número EC refere-se à Nomenclatura de Enzimas 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo suplementos 1-5, publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5, Eur. J. Biochem 1997, 250, 1-6, e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650, respectivamente. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver, por exemplo, na web mundial (WWW) em http://www.chem.Qmw.ac.uk/iubmb/enzvme/index.html")· As proteases são classificadas com base em seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: serina proteases (S), cisteína proteases (C), aspárticas proteases (A), metaloproteases (M) e desconhecidas, ou como ainda não classificadas proteases (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (ed.), Academic Press (1998) e particularmente a parte de introdução geral.

Em formas de realização particulares, as proteases da invenção são selecionadas dentre o grupo consistindo de (a) proteases pertencendo às metaloendopeptidases EC 3.4.24, (b) metaloproteases pertencendo ao grupo M do Livro acima citado; (c) metaloproteases ainda não designada para um grupo (designação: Grupo MX), ou pertencendo a um dos grupos MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como definido na pat. 989-991 do livro acima citado); (d) outras famílias de metaloproteases (como definido na pag. 1448- 1452 do livro acima); (e) metaloproteases com um motivo HEXXH; (f) metaloproteases com um motivo HEFTH; (g) metaloproteases pertencendo a uma das famílias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 ou M47 (como definido nas págs. 1448- 1452 do livro acima); e (h) metaloproteases pertencendo à família M35 (como definido nas págs. 1492- 1495 do livro acima).

Em outras formas de realização particulares, metaloproteases são hidrolases em que o ataque nucleofílico em uma ligação peptídeo é mediado por uma molécula de água, a molécula de água sendo ativada por um cátion de metal divalente. Os exemplos de cátions divalentes são zinco, cobalto ou manganês. O íon metal pode ser mantido em posição por ligandos de aminoácido. O número de ligandos pode ser cinco, quatro, três, dois, um ou zero. Em uma forma de realização particular, o número é de dois ou três, preferivelmente três.

Para a determinação de se uma dada protease é uma metaloprotease ou não, referência é feita ao livro acima citado, e os princípios indicados no mesmo. Esta determinação pode ser realizada para todos os tipos de proteases, seja de proteases de ocorrência natural ou tipo selvagem, ou proteases sintéticas ou geneticamente engenheiradas. A atividade de protease pode ser medida usando qualquer teste, em que um substrato é empregado, que inclui ligações peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do teste e a temperatura do teste devem ser, do mesmo modo, adaptados para a protease em questão. Os exemplos de valores de pH no teste são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Os exemplos de temperaturas de teste são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80°C.

Os exemplos de substratos de proteases são caseína, como caseína reticulada com azurina (AZCL-caseína). Dois testes de proteases são descritos no exemplo 1 aqui, dos quais o assim chamado teste de AZCL-caseína é um teste preferido para os fins da presente invenção. Não se tem limitações sobre a origem da protease de acordo com a invenção. Assim, o termo protease inclui não somente proteases naturais ou de tipo selvagem obtidas de microorganismos de qualquer gênero, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos etc, dos mesmos, demonstrando atividade de protease, assim como proteases sintéticas, como proteases embaralhadas, e proteases de consenso. Estas proteases geneticamente engenheiradas podem ser preparadas como é geralmente conhecido na técnica, por exemplo por mutagênese dirigida ao sítio, por PCR (usando um fragmento PCR contendo a mutação desejada como um dos iniciadores nas reações PCR) ou por mutagênese aleatória. A preparação de proteínas de consenso é descrita em por exemplo EP 897985. O termo "obtido de", como usado aqui, em conjunto com uma dada fonte, deve significar que o polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico é produzido pela fonte ou por uma célula em que a seqüência de ácido nucleico da fonte está presente. Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo é secretado extracelularmente.

Em uma forma de realização específica, a protease é uma variante alergência baixa, projetada para invocar uma resposta imunológica reduzida quando exposta a animais, incluindo o homem. O termo resposta imunológica deve ser entendido como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto à protease. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica levando a níveis aumentados de IgE no animal exposto. Os variantes alergênicos baixos podem ser preparados usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a protease pode ser conjugada com porções de polímero abrigando porções ou epítopos da protease envolvida em uma resposta imunológica. A conjugação com polímeros pode envolver copulação química in vitro de polímero para a protease, por exemplo como descrito em W096/ 17929, WO 98/30682, WO 98/35026, e/ou W099/00489. A conjugação pode, além disso, ou altemativamente ao mesmo, envolver copulação in vivo de polímeros para a protease. Esta conjugação pode ser obtida por engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a protease, inserindo seqüências de consenso codificando sítios de glicosilação adicionais na protease e expressando a protease em um hospedeiro capaz de glicosilar a protease, ver, por exemplo, WO 00/26354. Outro modo de prover variantes alergênicos baixos é por engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a protease de modo a levar a protease a auto-oligomerizar, desde que os monômeros de protease possam abrigar os epítopos de outros monômeros de protease e, assim, diminuir a antigenicidade dos oligômeros. Estes produtos e sua preparação são descritos, por exemplo, em W096/16177. Os epítopos envolvidos em uma resposta imunológica podem ser identificados por vários métodos, como o método de exibição de fagos, descritos em WO00/26230 e WOO1/83559, ou a abordagem aleatória descrita em EP 561907. Uma vez que o epítopo foi identificado, sua seqüência de aminoácido pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas da protease por técnicas de manipulação de genes conhecidas, como mutagênese dirigida ao sítio (ver, por exemplo, WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/ou conjugação de um polímero pode ser feita em proximidade suficiente para o epítopo para o polímero para abrigar o epítopo. A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou preferivelmente aminoácidos 1 a 177 (o polipeptídeo maduro) de SEQ ID N° 2, de pelo menos cerca de 64%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de 79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, e que tem atividade de protease (a seguir "polipeptídeos homólogos"). Em formas de realização particulares, os polipeptídeos da invenção i) tem; ou ii) consistem de uma seqüência de aminoácido com um grau de identidade como mencionado acima. A protease Thermoascus aurantiacus, cujo polipeptídeo maduro compreende aminoácidos 1-177 de SEQ ID N° 2 é, como evidente, um exemplo de um polipeptídeo da invenção.

Outro polipeptídeo da invenção é derivado de Aspergillus oryzae e compreende SEQ ID N° 11, ou aminoácidos -23-353; -23-374; -23-397; 1-353, 1-397 dos mesmos, e é codificado por SEQ ID N° 10 ou nucleotídeos 1-1129, 2-1195, 2-1267; 71-1129; 71-1195; 71-1267, 599-1129; 599-1195 ou 599-1267 dos mesmos, respectivamente.

Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos, assim como o grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos, é determinado pelo programa "align" que é um alinhamento Needleman-Wunsch (isto é um alinhamento global). O programa é usado para o alinhamento de polipeptídeo, assim como seqüências de nucleotídeo. O padrão da matriz de escore BLOSUM50 é usado para alinhamentos de polipeptídeos, e o padrão da matriz de identidade é usado para alinhamentos de nucleotídeos. A penalidade para o primeiro resíduo de um intervalo é de -12 para polipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para outros resíduos de um intervalo são -2 para polipeptídeos e -4 para nucleotídeos. "Align" é parte da versão do pacote FASTA v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63-98). Os alinhamentos de proteína FASTA usam o algoritmo de Smith-Waterman sem limitação do tamanho do intervalo (ver "Smith-Waterman algorithm"T.F. Smith e M.S. Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147-195-197).

Em uma forma de realização particular, os polipeptídeos homólogos tem uma seqüência de aminoácidos que difere em quarenta, trinta e cinco, trinta, vinte e cinco, vinte ou por quinze aminoácidos. Em outra forma de realização, os polipeptídeos homólogos tem uma seqüência de aminoácidos que difere em dez, ou por nove, ou por oito, ou por sete, ou por seis, ou por cinco aminoácidos. Em outra forma de realização particular, os polipeptídeos homólogos diferem em quatro, ou por três, ou por dois aminoácidos, ou por um aminoácido de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou +1 a 177 de SEQ ID N° 2.

Em formas de realização particulares, os polipeptídeos da presente invenção a) compreende ou b) consistem de i) a seqüência de aminoácido de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou +1 a 177 de SEQID N° 2. ii) a seqüência de aminoácido de aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374, ou 177-397 de SEQ ID N° 11, ou variantes alélicos, ou fragmentos das seqüências de i) e ii) que tem atividade de protease.

Um fragmento de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 ou de aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 ou 177-397 de SEQ ID N° 11 é um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila destas seqüências de aminoácido. Em uma forma de realização, um fragmento contém, pelo menos, 75 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 100 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 125 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 150 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 160 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 165 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 170 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 175 resíduos de aminoácidos.

Uma variante alélica denota qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfísmo dentro das populações. As mutações de genes podem ser silentes (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene. A presente invenção também refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e que são codificados por seqüências de ácido nucleico que hibridizam sob condições de estringência muita baixa, ou baixa, ou média ou média-alta, ou alta, ou muito alta, com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob as mesmas condições com (a) nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, ou preferivelmente nucleotídeos 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, (b) a seqüência de cDNA contida 5 em nucleotídeos 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, (c), uma sub-seqüência de (a) ou (b), ou (d), de um filamento complementar de (a), (b) ou (c) (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed, Cold Srping Harbor, NY). Em uma forma de realização particular, a sonda de ácido nucleico é selecionada dentre as seqüências de ácido nucleico 10 de (a), (b), (c) ou (d) acima. A sub-seqüência de nucleotídeos 559 a 1089, 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344 ou 559 a 1344 de SEQ ID N° 1 pode ser, pelo menos, de 100 nucleotídeos, ou em uma forma de realização de pelo menos 200 nucleotídeos. Além disso, a sub-seqüência pode codificar um fragmento 15 de polipeptídeo que tem atividade de protease.

As seqüências de ácido nucleico de nucleotídeos 559 a 1089, 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, ou 559 a 1344 de SEQ ID N° 1 ou uma sub-seqüência do mesmo, assim como as seqüências de aminoácido de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 ou um 20 fragmento do mesmo, podem ser usadas para projetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos codificando DNA tendo atividade de protease a partir de cepas de deferentes gêneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Particularmente, estas sondas podem ser usadas para hibridização com o cDNA ou genômico ou 25 espécie de interesse, seguindo procedimentos de blotting Southern padrões, a fim de identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Estas sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência completa, mas devem ser pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25, e mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos de comprimento. As sondas mais longas também podem ser usadas. Ambas as sondas de DNA e RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas por detecção do gene correspondente (por exemplo com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Estas sondas são englobadas pela presente invenção.

Assim, uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico preparada a partir de tais outros organismos pode ser tríada para DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e que codificam um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese de gel poliacrilamida ou agarose ou outras técnicas de separação. DNA de bibliotecas ou o DNA separado por ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material veículo apropriado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID N° 1 ou uma sub-seqüência do mesmo, o material veículo é usado em um Southern blot. Para fins da presente invenção, a hibridização indica que a seqüência de ácido nucleico hibridiza para uma sonda de ácido nucleico rotulada correspondendo à seqüência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID N° 1, seu filamento complementar, ou uma sub-seqüência do mesmo, sob condições de estringência muito baixas a muito elevadas. As moléculas para sa quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições são detectadas usando filme de raio-X.

Em uma forma de realização particular, a sonda de ácido nucleico é uma seqüência de ácido nucleico que codifica aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou +1 a 177 de SEQ ID N° 2, ou sub-seqüências das mesmas. Em outra forma de realização, a sonda de ácido nucleico é de nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, ou preferivelmente nucleotídeos 559 a 1089 de SEQ ID N° 1 (a região de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID N° 1). Em outra forma de realização preferida, a sonda de ácido nucleico é a seqüência de ácido nucleico, ou preferivelmente a região de codificação de polipeptídeo madura da mesma, que está contida no plasmídeo que está contido em Escherichia coli DSM 14652, em que a seqüência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeo de comprimento, condições de estringência muito baixas a muito elevadas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25% de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35% formamida para estringências médias e médias-altas, ou 50% formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimento de Southern Blotting padrões.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada durante 15 min usando 2 x SSC, 0,2% SDS, preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C, (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas, com cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e pós-hibridização com lavagem a 5°C a 10°C abaixo do Tmcalculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 48: 1390) em 0,9 M NaCl, 0,09 Mtris- HCI pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 X solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern Blotting padrões.

Para sondas curtas, cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% SDS durante 15 min e duas vezes cada durante 15 min usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado. A presente invenção também refere-se a variantes do polipeptídeo tendo seqüência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 177, -159a 177, ou -178 a 177 de SEQ ID N° 2, compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.

As seqüências de aminoácidos dos polipeptídeos variantes podem diferir da seqüência de aminoácido de aminoácidos 1 a 177, -159 a 177, ou -178 a 177 de SEQ ID N° 2 por uma inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por deferentes resíduos de aminoácidos. Preferivelmente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza menor, isto é, substituições de aminoácidos conservativas que não afetam, de modo significativo, a duplicação e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões amino- ou carboxila-terminal pequenas, como um resíduo metionina amino-terminal, um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra fimção, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, NY. As mudanças de ocorrência mais comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, assim como estes de modo reverso. A presente invenção também refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease, e selecionados dentre o grupo consistindo dos seguintes: (f) polipeptídeos tendo (i) um peso molecular calculado de cerca de 17 a cerca de 22 kDa, preferivelmente de cerca de 18 a cerca de 21 kDa, ou de cerca de 19 a cerca de 20 kDa, ou um peso molecular experimental (por SDS-PAGE) de cerca de 19 a cerca de 27 kDa, preferivelmente de cerca de 20 a cerca de 26 kDa, ou de cerca de 21 a cerca de 25 kDa, ou de cerca de 22 a cerca de 24 kDa, (ii) um pi de cerca de pH 7 a cerca de pH 10, preferivelmente de cerca de pH 7,5 a cerca de pH 9,5, ou de cerca de pH 8,0 a cerca de pH 9,0. (iii) um pH ótimo de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 8,0, ou preferivelmente de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 7,0, ou de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, usando o teste AZCL- caseína a 45°C e o sistema tampão de ácido succínico, e/ou (iv) uma temperatura ótima de cerca de 45 a cerca de 90°C, preferivelmente de cerca de 50 a cerca de 85°C, ou de cerca de 60 a cerca de 80°C, usando o teste de AZCL-caseína a pH 9; (g) polipeptídeos que não são inibidos por (v) SSI (o inibidor de subtilisina de Streptomyces) e/ou inibido por (vi) EDTA usando o teste de AZCL-caseína a pH 9 e 45°C; (h) polipeptídeos que são estáveis na faixa de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 10,5 ou preferivelmente na faixa de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 9,0, ou na faixa de cerca de pH 4,0 a pH 5,0, após 2 h de incubação a 37°C no sistema tampão de ácido succínico, a atividade residual sendo medida usando o teste de AZCL-caseína a pH 9 e 45°C; (k) polipeptídeos que são sintetizados com um pro-peptídeo N- terminal, e (l) polipeptídeos tendo um motivo HEXXH. A estabilidade do polipeptídeo como referida em (h) acima significa que a atividade residual é pelo menos 40%, ou 50%, ou 60% ou 70%, ou 80%, como comparada com uma amostra de controle que não foi pré-incubada durante 2 h. Os polipeptídeos que são estáveis de acordo com esta definição podem ser designados polipeptídeos estáveis em ácido.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram-positivo, como polipeptídeo de Bacillus, ou um polipeptídeo de Streptomyces, ou um polipeptídeo bacteriano gram-negativo, por exemplo um polipeptídeo de E. coli ou um de Pseudomonas sp.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo fungico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura, como Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou polipeptídeo de Yarrowia, ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso como polipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Hummicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimasíix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

Em outra forma de realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium. culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium írichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thermoascus auraníiacus, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Em outra forma de realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo derivado de um fungo filamentoso do filo Ascomycota, preferivelmente da classe Pezizomycotina, mais preferivelmente da ordem Eurotiomyceies, ainda mais preferivelmente da sub-família Eurotiales, e mais preferivelmente da família Trichocomaceae.

Em ainda outra forma de realização, o polipeptídeo é derivado de um fungo do gênero Thermoascus, por exemplo a espécie Thermoascus auraníiacus, como a cepa Thermoascus auraníiacus CGMCC No 0670, por exemplo um polipeptídeo com a seqüência de aminoácido de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 ou +1 a 177 de SEQID N° 2.

Será entendido que, para a espécie acima mencionada, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo anamorfos, qualquer que seja o nome de espécie pelo que eles são conhecidos. Os versados na técnica irão prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são prontamente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultura Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, estes polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo solo, estrumes, água, etc), usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolar os microorganismos de habitats naturais são bem conhecidas dos versados na técnica. A seqüência de ácido nucleico pode ser então derivada por triagem similarmente de uma biblioteca cDNA ou genômica de outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo foi detectada com a(s) sonda(s), a seqüência pode ser isolada ou clonada usando técnicas que são bem conhecidas dos versados na técnica (ver, por exemplo Sambrook et al, 1989, supra).

Como definido aqui, um polipeptídeo "isolado" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de outros polipeptídeos não protease, por exemplo pelo menos cerca de 20% puro, preferivelmente pelo menos cerca de 40% puro, mais preferivelmente cerca de 60% puro, ainda mais preferivelmente cerca de 80% puro, mais preferivelmente cerca de 90% puro, e ainda mais preferivelmente cerca de 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.

Os polipeptídeos codificados por seqüências de ácido nucleico da presente invenção também incluem os polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que outro polipeptídeo é fundido no N-término ou C-término do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido por fusão de uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção da mesma), codificando outro polipeptídeo para uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção da mesma) da presente invenção. As técnicas para produzir os polipeptídeos de fusão são bem conhecidas dos versados na técnica, e incluem a ligação das seqüências de codificação codificando os polipeptídeos de modo que eles estão em quadro e que a expressão do polipeptídeo fundido está sob controle do (s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Seqüências de ácido nucleico A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico isoladas que codificam um polipeptídeo da presente invenção. As seqüências de ácido nucleico particulares da invenção são nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, e particularmente nucleotídeos 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, o último correspondendo à região codificando o polipeptídeo maduro. Outra seqüência de ácido nucleico particular da invenção é a seqüência, preferivelmente a região de codificação de polipeptídeo maduro da mesma, que está contida no plasmídeo que está contido no microorganismo depositado de Escherichia coli DSM 14652. A presente invenção também engloba seqüências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de aminoácidos 1 a 177, -159 a 177, ou -178 a 177 de SEQ ID N° 2, que difere das partes correspondentes de SEQ ID N° 1 devido à degenerescência do código genético. A presente invenção também refere-se a sub-seqüências de SEQ ID N° 1 que codificam fragmentos de SEQ ID N° 2 que tem atividade de protease. A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico isoladas que codificam um polipeptídeo da presente invenção. As seqüências de ácido nucleico particulares da invenção são SEQ ID N° 10, ou nucleotídeos 2-1129, 2-1195, 2-1267; 71-1129, 71-1195; 71-1267; 599- 1129, 599-1195, ou 599-1267 dos mesmos, nucleotídeos 71-1129 de SEQ ID N° 10 correspondendo à região de codificação de polipeptídeo maduro.

Uma sub-seqüência de SEQ ID N° 1 é uma seqüência de ácido nucleico englobada por SEQ ID N° 1, exceto que um ou mais nucleotídeos de extremidade 5' e/ou 3' foram deletadas. Preferivelmente, uma sub-seqüência contém pelo menos 225 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 375,450,500, 531,600, 700, 800, 900,1000,1100, 1200 ou 1300 nucleotídeos. A presente invenção também refere-se a seqüências de nucleotídeo que tem um grau de identidade com nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344 ou preferivelmente nucleotídeos 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, ou de pelo menos 69, 70, 72, 74, 76 ou 80%. Em uma forma de realização particular, o grau de identidade é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%. Para a determinação do grau de identidade de nucleotídeos, o programa "align" é usado, que é referido acima.

Em uma forma de realização particular, a invenção refere-se a seqüências de nucleotídeo que tem um grau de identidade com nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344 ou 25 a 1344 de SEQ ID N° 1 de, pelo menos, 55, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ou 80%. Em uma forma de realização particular, o grau de identidade é de, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%. Para a determinação do grau de identidade de nucleotídeo, o programa "align" é usado que é referido acima. A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico mutantes compreendendo, pelo menos, uma mutação em nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, ou 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 ou (ii) é uma variante de qualquer uma das seqüências de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i) ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (i).

As técnicas usadas para isolar ou clonar uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação dos mesmos. A clonagem de seqüências de ácido nucleico da presente invenção a partir deste DNA genômico pode ser afetada, por exemplo, usando a reação de cadeia polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com aspectos estruturais compartilhados. Ver, por exemplo, Innis et al, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, NY. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, como reação de cadeia ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação à base de seqüência de ácido nucleico (NASBA) podem ser usados. A seqüência de ácido nucleico pode ser clonada de uma cepa de Thermoascus, ou outro organismo ou relacionado e, assim por exemplo, pode ser uma variante alélica ou espécie da região de codificação de polipeptídeo da seqüência de ácido nucleico. O termo "seqüência de ácido nucleico isolada", como usado aqui, refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que é essencialmente livre de outras seqüências de ácido nucleico por exemplo, pelo menos cerca de 20% pura, preferivelmente pelo menos cerca de 40% pura, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% pura, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% pura, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% pura como determinado por eletroforese de agarose. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico isolada pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrões usados em engenharia genética para relocar a seqüência de ácido nucleico de seu local natural para um sítio diferente, onde ela será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a seqüência de ácido nucleico compreendendo o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor, e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde cópias múltiplas ou clones da seqüência de ácido nucleico serão replicadas. A seqüência de ácido nucleico pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou quaisquer combinações das mesmas. A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico que tem um grau de homologia para seqüência de codificação de polipeptídeo madura de SEQ ID N° 1 (isto é, nucleotídeos 559 a 1089) de pelo menos cerca de 70%, preferivelmente cerca de 75%, preferivelmente cerca de 80%, mais preferivelmente cerca de 90% e ainda mais preferivelmente cerca de 95%, e mais preferivelmente cerca de 97% homologia, que codificam um polipeptídeo ativo. Para fins da presente invenção, o grau de homologia entre duas seqüências de ácido nucleico é determinado pelo programa "align" descrito acima. A modificação de uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferem de alguma forma engenheirada do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, ótimo de pH ou outros. A seqüência de variante pode ser construída com base na seqüência de ácido nucleico apresentada como a parte codificando polipeptídeo da SEQ ID N° 1, por exemplo uma sub-seqüência da mesma, e/ou introdução por substituições de nucleotídeos que não dão lugar a outrá seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico, mas que correspondem ao uso de códon do organismo hospedeiro destinado para produção da protease, ou pela introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar lugar a uma diferente seqüência de aminoácidos. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeos, ver, por exemplo, Ford et al, 1991, Protein Expression and Purification, 2: 95- 107.

Será evidente para os versados na técnica que estas substituições podem ser feitas fora das regiões críticas à função da molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico isolada da invenção e, assim, preferivelmente não submetida a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica, como mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina, (ver, por exemplo Cunningham e Wells, 1989, Science, 244; 1081- 1085). Na última técnica, mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Os sítios de interação substrato- protease também podem ser determinados por análise da estrutura tri-dimensional como determinado por estas técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação de fotoafinidade (ver, por exemplo de Vos et al, 1992, Science 255: 306- 312, Smith et al, 1992, Journal of Molecular Biology, 224: 899- 904, Wlodaver et al, 1992 FEBS Letters, 309: 59-64). A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico isoladas codificando um polipeptídeo da presente invenção, que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, preferivelmente condições de baixa estringência, mais preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média-elevada, ainda mais preferivelmente condições de estringência elevada, e mais preferivelmente condições de estringência muito alta, com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob as mesmas condições com a seqüência de ácido nucleico de SEQ ID N° 1 ou seu filamento complementar, ou variantes alélicas e sub-seqüências das mesmas (Sambrook et al, 1989, supra), como aqui definido. A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico isoladas produzidas por (a) hibridizando um DNA sob condições de estringência muito baixa, baixa, média, média elevada, alta, ou muito alta, com (i) nucleotídeos, nucleotídeos 559 a 1089, 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, ou 559 a 1344 de SEQ ID N° 1; (ii) a seqüência de cDNA contida em nucleotídeos, nucleotídeos 559 a 1089,25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344,25 a 1344, ou 559 a 1344 de SEQ ID N° 1, (iii) uma sub-seqüência de (i) ou (ii), ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) e (b) isolar a seqüência de ácido nucleico. A sub-seqüência é preferivelmente uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos, como uma seqüência que codifica um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de protease. Métodos para produzir seqüências de ácido nucleico mutantes A presente invenção ainda refere-se a métodos para produzir uma seqüência de ácido nucleico mutante, compreendendo a introdução de pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID N° 1 ou uma sub-seqüência da mesma, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que consiste de aminoácidos 1 a 177, -159 a 177, ou -178 a 177 de SEQ ID N° 2, ou um fragmento do mesmo que tem atividade de protease. A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucleico para mudar um nucleotídeo por outro nucleotídeo pode ser obtida por mutagênese dirigida ao sítio usando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica. É particularmente utilizável o procedimento que usa um vetor de DNA de duplo filamento, super-hélice, com um inserto de interesse e dois iniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeos, cada complementar aos filamentos opostos do vetor, se estendem durante a ciclagem de temperatura por meio de polimerase DNA Pfu. Na incorporação do iniciadores, mu plasmídeo mudado contendo entalhes escalonados é gerado. Após ciclagem em temperatura, o predeterminado é tratado com Dpnl que é específico para DNA metilado e hemimetilado para digerir o gabarito de DNA parental e para selecionar para DNA sintetizado contendo mutação. Outros procedimentos conhecidos na i técnica podem ser também usados.

Construções de ácido nucleico A presente invenção também refere-se a construções de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção ligada de modo operativo a uma ou mais seqüências de controle que 1 dirigem a expressão da seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada, sob condições compatíveis com as seqüências de controle. A expressão será entendida como incluindo qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não são limitados a transcrição, modificação pós transcricional, tradução, modificação pós-tradução, e secreção. "Construção de ácido nucleico" é definida aqui como uma molécula de ácido nucleico, ou de filamento único ou duplo, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que foi modificada para conter segmentos de ácido nucleico combinado e justaposto em um modo que de outra forma não iria existir na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo com o termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucleico contém todas as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção. O termo "seqüência de codificação" é definido aqui como uma seqüência de ácido nucleico que diretamente especifica a seqüência de aminoácido de seu produto de proteína. Os limites da seqüência de codificação são geralmente determinados por um sítio de ligação de ribossomas (procariotos) ou pelo códon de partida ATG (eucariotos) localizados logo a montante da matriz de leitura aberta na extremidade 5' do mRNA e uma seqüência de terminador de transcrição localizada logo a jusante da matriz de leitura aberta na extremidade 3' do mRNA. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a seqüências de DNA, cDNA e ácido nucleico recombinante.

Uma seqüência de ácido nucleico isolada codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulada de vários modos para prover a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência de ácido nucleico antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as seqüências de ácido nucleico utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas dos versados na técnica. O termo "seqüências de controle" é definido aqui para incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha para a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo. Estas seqüências de controle incluem, mas não são limitadas a um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor, seqüência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor, e sinais de parada translacionais e transcricionais. As seqüências de controle podem ser providas com ligadores para o fim de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das seqüências de controle com a região de codificação da seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo. O termo "ligado de modo operativo " é definido aqui como uma configuração em que uma seqüência de controle é colocada de modo apropriado em uma posição relativa à seqüência de codificando da seqüência de DNA como que a seqüência de controle dirige a expressão de um polipeptídeo. A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotor apropriada, uma seqüência de ácido nucleico que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão da seqüência de ácido nucleico. A seqüência de promotor contém seqüências de controle transcricional que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de ácido nucleico que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos e podem ser obtidos de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira de fungo filamentoso são promotores obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, gluoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA). Lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), assim como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutral de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae) e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de terminador de transcrição apropriado, uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência de terminador é ligada de modo operativo ao término 3' da seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional para a célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder apropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução da célula hospedeira./ A seqüência líder é ligada de modo operativo para o término 5' da seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os líderes preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para amilase taka de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência ligada de modo operativo ao término 3' da seqüência de ácido nucleico e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosina para o mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas de genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger antranilato sintase de Aspergillus nidulans, e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger. A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica para uma seqüência de aminoácido ligada ao término amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado na via secretória da célula. A extremidade 5' da seqüência de codificação da seqüência de ácido nucleico pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo sinal naturalmente ligada em matriz de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5' da seqüência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinal que é estranho à seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinal estranho pode ser requerida onde a seqüência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo de sinal. Altemativamente, a região de codificação de peptídeo de sinal estranho pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinal natural a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região de codificação de peptídeo de sinal que dirige o polipeptídeo expressado na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As regiões de codificação de peptídeo de sinal efetivas para células hospedeiras de fungo filamentoso são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, amilase neutral de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Em uma forma de realização preferida, a região de codificação de peptídeo de sinal é nucleotídeos 25 a 18 de SEQ ID N° 1 que codifica aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID N° 2. A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de propeptídeo que codifica para uma seqüência de aminoácido posicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proprotease ou um propolipeptídeo (ou um zimogene em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo maduro por divagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do propolipeptídeo. A região de codificação de propeptídeo pode ser obtida dos gens para protease alcalina de Bacillus subtilis {apr)E), protease neutral de Bacillus subtilis (nprT), alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e laccase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Em uma forma de realização preferida, a região de codificação de propeptídeo é nucleotídeos 82 a 558 de SEQ ID N° 1 que codifica aminoácidos 20 a 178 de SEQ ID N° 2.

Onde tanto as regiões de peptídeo de sinal como propeptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região de propeptídeo está posicionada próxima do término amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo de sinal está posicionada próxima do término amino da região de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências regulatórias que permitem a regulagem de expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas regulatórios são os que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac e trp. Em leveduras, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode sr usado. Em fungos filamentosos, o promotores de TAKA alfa-amilase promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como seqüências regulatórias. Outros exemplos de seqüências regulatórias são os que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estes incluem o gene dihidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo deve ser ligada de modo operativo com a seqüência regulatória.

Vetores de expressão A presente invenção também refere-se a vetores de expressão recombinantes compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção, um promotor e sinais de parda de transcrição e tradução. As várias seqüências de ácido nucleico e de controle descritas acima podem ser unidas juntas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, a seqüência de ácido nucleico da presente invenção pode ser expressa por inserção da seqüência de ácido nucleico ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetor apropriado para expressão. Na criação de um vetor de expressão, a seqüência de codificação está localizada no vetor de modo que a seqüência de codificação é ligada de modo operativo com as seqüências de controle apropriadas para expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo um plasmídeo ou vírus), que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e pode ocasionar a expressão da seqüência de ácido nucleico. A escolha do vetor irá tipicamente depender da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor de replicação autônomo, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conte quaisquer meios para assegurar a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado. Além disso, um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contém o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção contém preferivelmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção das células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, cujo produto provê resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxótrofos e outros. Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores apropriados para células hospedeiras de leveduras são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em células hospedeiras de fungo filamentoso incluem, mas não são limitados a amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hygB (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5'- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes dos mesmos. São preferidos para uso em célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém um elemento(s) que permite a integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter seqüências de ácido nucleico adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As seqüências de ácido nucleico adicionais permitem que o vetor seja integrado no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem conter preferivelmente um número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 1 500 pares de bases, preferivelmente 400 a 1500 pares de bases, e mais preferivelmente 800 a 1 500 pares de bases, que são altamente homólogos com a seqüência de marcação correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência de marcação no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de ácido nucleico de não codificação ou de codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vetor replicar de modo autônomo na célula hospedeira em questão. Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC 19, pACYC177, e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli e pUBllO, pE194, pTA 1060, e ρΑΜβΙ permitindo a replicação em Bacillus. Os exemplos de origens de replicação são para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. A origem de replicação pode ser uma tendo uma mutação que toma seu funcionamento sensível a temperatura na célula hospedeira (ver, por exemplo Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy os Sciences, USA 75 - 1433).

Mais de uma cópia de uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópia da seqüência de ácido nucleico pode ser obtido por integraço de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira, ou por inclusão de um gene marcador amplificável, selecionável, com a seqüência de ácido nucleico onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e assim cópias adicionais da seqüência de ácido nucleico, podem ser selecionadas para o cultivo das células na presença de agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos dos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al, 1989, supra). A protease da invenção pode ser também co-expressada junto com, pelo menos, uma outra enzima de interesse para ração animal, como fitase, xilanase, galactanase e/ou beta-glucanase. As enzimas podem ser co-expressadas de diferentes vetores, de um vetor, ou usando uma mistura de ambas as técnicas. Quando usando vetores diferentes, os vetores podem ter deferentes marcadores selecionáveis, e diferentes origens de replicação. Quando usando somente um vetor, os genes podem ser expressos de um ou mais promotores. Se clonados sob a regulagem de um promotor (di- ou multi-cistrônico), a ordem em que os genes são clonados pode afetar os níveis de expressão das proteínas. A protease também pode ser expressa como uma proteína de fusão, isto é, que o gene codificando a protease foi fundido na matriz no gene codificando outra proteína. Esta proteína pode ser outra enzima ou um domínio funcional de outra enzima. Células hospedeiras A presente invenção também refere-se a células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção, que são usadas com vantagem na produção recombinante dos polipeptídeo s. Um vetor compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra- cromossômico auto-replicante como descrito acima. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira irá, em uma grande extensão, depender do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte. A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo, um procarioto, ou um microorganismo não unicelular, por exemplo um eucarioto.

As células unicelulares utilizáveis são células bacterianas como bactérias gram-positivas, incluindo, mas não são limitadas a célula de Bacillus, ou uma célula de Síreptomyces, ou células de bactérias de ácido láctico, ou bactérias gram-negativas como E. coli e Pseudomonas sp. As bactérias de ácido láctico incluem, mas não são limitadas a espécies do gênero Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus e Enterococcus. A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology, 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology, 56: 209- 221(, eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriolory, 169: 5771-5278). A célula hospedeira pode ser um eucarioto, como uma célula animal não humana, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula de fungo.

Em uma forma de realização particular, a célula hospedeira é uma célula de fungo. "Fungo", como usado aqui, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al, in Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8a, ed, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), assim como os fungos Oomycota (como citado em Hawksworth et al, 1995, supra, pag. 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al, 1995, supra).

Em outra forma de realização particular, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedura. "Levedura", como usada aqui, inclui levedura de ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencendo a Finge Imperfecti (Blastomicetes). Porque a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os fins desta invenção, levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A. Passmore, S.M. e Davenport, R.R. Eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series, no. 9,1980). A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia. A célula hospedeira fungica pode ser uma célula fungica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da sub-divisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al, 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, mannano, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras como Saccharomyces cerevisiae é por formação de brotos a partir de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Os exemplos de células hospedeiras de fungos filamentosos são células de espécies de, mas não são limitadas a Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium ou Trichoderma.

As células fungicas podem ser transformadas por um método envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em um modo conhecido por si. Os procedimento s apropriados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus são descritos em EP 238 023 e Yelton et al, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81: 1470- 1474. Os métodos apropriados para a transformação das espécies Fusarium são descritos por Malardier et al, 1989, Gene 78: 147- 156 e WO 96/ 00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I. editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology,, volume 194, pag. 182- 187, Academic Press, Inc., NY; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology, 153: 162; e Hinnen et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75: 1920. Métodos de produção A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma cepa, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em uma forma de realização, a cepa é do gênero Thermoascus, por exemplo da espécie Thermoascus aurantiacus, como a cepa Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670. A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) uma célula hospedeira sob condições que conduzem à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições que conduzem à produção de polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico mutante compreendendo pelo menos uma mutação em nucleotídeos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344 ou 559 a 1089 de SEQ ID N° 1, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste de aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2, ou (ii) é uma variante de qualquer uma das seqüências de (i) em que a variante compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i) ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (i). A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira conduzindo à produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico mutante compreendendo, pelo menos, uma mutação em nucleotídeos SEQ ID N° 10, ou nucleotídeos 2-1129; 2-1195; 2-1267, 71-1195; 71-1267; 599-1129, 599-1195; ou 599-1267 da mesma; ou em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste de SEQ ID N° 11, ou aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 ou 177-397 da mesma.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente apropriado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivado em frasco de agitação, fermentação em escala pequena ou escala grande (incluindo fermentações contínuas, em batelada, batelada alimentada ou estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizados em um meio apropriado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos bem conhecidos na técnica. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado dos lisados de células.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto protease, ou desaparecimento de um substrato de protease. Por exemplo, um teste de protease pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como aqui descrito. O polipeptídeo resultante pode ser recuperado por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não são limitados a centrifiigação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por vários procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não são limitados a cromatografia (por exemplo troca de íons afinidade, hidrofóbicos, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação por sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, NY, 1989).

Plantas A presente invenção também refere-se a uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta que foi transformada com uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Altemativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo melhorando o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, e para destruir um fator antinutritivo.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo é marcado para os vacúolos de armazenamento de endospermas em sementes. Isto pode ser obtido por síntese do mesmo como um precursor com um peptídeo de sinal apropriado, ver Horvath et al em PNAS, 15 de fevereiro de 2000, vol. 97, pag. 1914-1919. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicótilo) ou monocotiledônea (um monocótilo). Os exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas como gramas dos prados (grama azul, Poa), gramíneas para forragem como festuca, lólio gramíneas temperadas como Agrostis, e cereais, por exemplo trigo, aveias, cevada, centeio, arroz, sorgo, e milho (milho). Os exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, leguminosas, como tremoços, batata, beterraba, ervilhas, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, semente de colza, e o organismo de modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana. As plantas com baixo teor em fitato, como descrito, por exemplo, na patente US 5 689 054 e patente US 6 111 168 são exemplos de plantas engenheiradas.

Os exemplos de partes de plantas são haste, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos. Também tecidos de plantas específicos, como cloroplasto, apoplasto, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomas, e citoplasma são considerados como parte da planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem de tecido, é considerada como sendo uma parte da planta.

Também está incluído no escopo da presente invenção a progênie destas plantas, partes de plantas e células de plantas. A planta transgênica ou célula de planta expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Brevemente, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de uma ou mais construções de expressão codificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma do hospedeiro da planta e propagando a planta modificada resultante ou célula de planta em uma célula de planta ou planta transgênica.

Convenientemente, a construção de expressão é uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção ligado de modo operativo com seqüências regulatórias apropriadas requeridas para expressão da seqüência de ácido nucleico na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável utilizável para identificação de células hospedeiras em que a construção de expressão foi integrada e seqüências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado). A escolha de seqüências regulatórias, como seqüências de promotor e terminador e opcionalmente seqüências de sinal e trânsito são determinadas, por exemplo com base de quando, onde e como o polipeptídeo é desejado a ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser de desenvolvimento, em estágios ou específica para tecidos, e o produto de gene pode ser marcado em um tecido ou parte de planta específicos como sementes ou folhas. As seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al, 1988, Plant Physiology, 86: 506.

Para expressão constitutiva, o promotor 35S-CaMV pode ser usado (Franck et al, 1980, Cell 21: 285-294). Os promotores específicos para órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de imersão de armazenamento, como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards& Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de imersão metabólicos como meristema (Ito et al, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico para semente, como promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al, 1998, Plant and Cell Physiology, 39: 885- 889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia Faba (Conrad et al, 1988, Journal of Plant Physiology, 152; 708- 711), um promotor de proteína de corpo de óleo da semente (Chen et al, 1998, Plant and Cell Physiology, 39: 935- 941), o promotor napA de proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para semente bem conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/ 14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico para folha como promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al, 1993, Plant Physiology, 102- 991-1000, o promotor do gene adenina metiltransferase de vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology, 26, 85-93) ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-6740 ou um promotor indutível de ferida como promotor pin2 de batata (Xu et al, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para obter expressão maior da protease na planta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al, 1993, supra, descrevem o uso do primeiro íntron de gene 1 de actina de arroz para melhorar a expressão.

Ainda mais, o uso de códon pode ser otimizado para a espécie de planta em questão para melhorar a expressão (ver Horvath et al, referidos acima). O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos dentre os disponíveis na técnica. A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da plana de acordo com as técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e eletroporação. (Gasser et al, 1990, Science, 244: 1293, Protrykus, 1990, Bio/Technology, 8: 535, Shimamoto et al, 1989, Nature, 338: 274).

Atualmente, a transferência mediada por Agrobacterium tumefacies é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas, (para um estudo, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology, 19: 15-38). No entanto, também pode ser usado para transformar monocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem geralmente preferidos para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA de transformação) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal, 2: 275-281, Shimamoto 1994, Current Opinion Biotechnology, 5: 158-162, Vasil et al, 1992, Bio/Tecnology, 10: 667-674). Um método alternativo de transformação de monocotiledôneas é baseado em transformação de protoplastos como descrito por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology, 21: 415-428.

Após transformação, os transformantes tendo incorporados nos mesmos a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas completas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção sob condições que conduzem à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Animais A presente invenção também refere-se a produtos e animais não humanos, transgênicos, ou elementos dos mesmos, cujos exemplos são fluidos corporais como leite e sangue, órgãos, came e células dos animais. As técnicas para expressar proteínas, por exemplo em células de mamíferos, são conhecida na técnica, ver, por exemplo, o livro de texto Protein Expression; A Practical Approach, Higgins and Hames (ed.) Oxford University Press (1999), e os três outros livros nesta série com relação a transcrição de genes, processamento de RNA e processamento pós-translacional. Em termos gerais, para preparar um animal transgênico, as células selecionadas de um animal selecionado são transformadas com uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser recuperado do animal, por exemplo do leite de animais fêmeas, ou o polipeptídeo pode ser expressado para o benefício do próprio animal, por exemplo para auxiliar na digestão do animal. Os exemplos de animais são mencionados abaixo na seção de título Ração para animais.

Para produzir um animal transgênico tendo a vista a recuperação de protease do leite do animal, um gene codificando a protease pode ser inserido nos óvulos fertilizados de um animal em questão, por exemplo por uso de um vetor de expressão transgene que compreende um promotor de proteína no leite apropriado, e o gene codificando protease. O vetor de expressão de transgene é microinjetado nos óvulos fertilizados, e preferivelmente permanentemente integrado no cromossomo. Uma vez que o óvulo começa a crescer e se dividir, o embrião em potencial é implantado em uma mãe de aluguel, e os animais transportando o transgene são identificados. O animal resultante pode ser então multiplicado por criação convencional. O polipeptídeo pode ser purificado do leite do animal, ver, por exemplo, Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animais. Gene expression Systems: Using nature for the art of expression. J.M. Femandez e J.P. Hoeffler (ed.) Academic Press.

Na alternativa, a fim de produzir um animal não humano transgênico, que transporta, no genoma de suas células somáticas e/ou germinais, uma seqüência de ácido nucleico incluindo uma construção de transgene heteróloga inlcuindo um transgene codificando a protease, o transgene pode ser ligado de modo operativo a uma primeira seqüência regulatória para expressão específica na glândula salivar da protease, como descrito em WO 2000064247.

Composições Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção.

As composições de polipeptídeos podem ser preparadas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica.

Em uma forma de realização particular, as composições de polipeptídeo da invenção são protegidas contra degradação por ácido, por exemplo tendo em vista assegurar uma melhor sobrevivência do polipeptídeo através do estômago dos animais. A proteção pode estar na forma de um revestimento estável em ácido, cujos exemplos podem ser encontrados em livros de texto farmacêutico.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos dos polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da invenção.

Ração animal A presente invenção é também dirigida a métodos para usar os polipeptídeos tendo atividade de protease em ração animal, assim como a composições de ração e aditivos para ração compreendendo os polipeptídeos da invenção. O termo animal inclui todos os animais incluindo seres humanos. Os exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes, como vacas, ovelhas e cavalos. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem animais mono-gástricos, por porcos ou suínos (incluindo mas não são limitados a leitões, porcos em crescimento, e fêmeas amamentando), aves de criação como perus e galinhas (incluindo mas não são limitados a frangos para assar, poedeiras), bezerros jovens e peixes (incluindo mas não são limitados a salmão). O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição apropriada ou destinada para ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção, a protease pode ser dada ao animal antes, após ou simultaneamente com a dieta. A última opção é preferida.

Em uma forma de realização particular, a protease, na forma em que ela é adicionada à ração, ou quando sendo incluída em um aditivo para ração, é bem definida. Bem definida significa que a preparação de protease é de pelo menos 50% pura como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (ver exemplo 12, de WO 01/58275). Em outras formas de realização particulares, a preparação de protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95% pura como determinado por este método.

Uma preparação de protease bem definida é vantajosa. Por exemplo, é bem mais fácil dosar corretamente na ração a protease que é essencialmente livre de interferência ou contaminação de outras proteases. O termo dose refere-se corretamente, particularmente, ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e a capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Para o uso em ração animal, a protease não precisa ser tão pura; ela pode, por exemplo, incluir outras enzimas, em cujo caso pode ser chamada uma preparação de protease. A preparação de protease pode ser (a) adicionada diretamente à ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas vegetais), ou (b) ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias como aditivos para ração ou pré-misturas que é subseqüentemente adicionada à ração (ou usada em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparação de protease original, seja usada de acordo com (a) ou (b) acima.

As preparações de protease com purezas desta ordem de grandeza são, particularmente, obteníveis usando métodos recombinantes de produção, enquanto elas não tão facilmente obtidas e também submetida a uma variação batelada-a-batelada bem maior quando a protease é produzida por métodos de fermentação tradicionais.

Esta preparação de protease pode, como evidente, ser misturada com outras enzimas.

Em uma outra forma de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção é capaz de: Aumentar a proteína digerida, grau de hidrólise (DH) e/ou proteína solubilizada de acordo com o modelo de digestão monogástrico in vitro completo do exemplo 6, aqui;

Aumentar a proteína digerida, DH e/ou proteína solubilizada de acordo com a parte intestinal do modelo de digestão monogástrico in vitro completo do exemplo 6, aqui;

Aumentar a solubilidade da proteína, digestibilidade da proteína e/ou DH, de acordo com o modelo de digestão in vitro de aquacultura do exemplo 7 aqui. O termo proteínas vegetais como usado aqui refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou se originando de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60% (peso/peso).

As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal como leguminosas e cereais, por exemplo materiais das plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoços e farinha de semente de colza.

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo soja, tremoço, ervilha ou feijão.

Em outra forma de realização, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo beterraba, beterraba-de-açúcar, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são semente de colza e repolho.

Soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (milho), arroz e sorgo. O tratamento de acordo com a invenção de proteínas vegetais com pelo menos uma protease da invenção resulta em uma aumentada solubilização de proteínas vegetais.

Os seguintes são exemplos de % proteína solubilizada obtenível usando as proteases da invenção: pelo menos 100,0%, ou 100,1, 100,2, 100,2, 100,4, 100,5, 100,6, 100,7, 100,8, 100,9, 101,0, 101,1, 101,2, 101,3 ou pelo menos 101,4%, com relação a um controle em branco, e referência sendo a para o modelo de digestão monogátrico in viíro completo do exemplo 6 aqui.

Os seguintes são exemplos de % de proteína digerível obtenível usando as proteases da invenção: pelo menos 100% ou 101, 102, 103 ou pelo menos 104% com relação ao controle em branco, e referência sendo a para o modelo de digestão monogátrico in vitro completo do exemplo 6 aqui.

Os seguintes são exemplos de i) % solubilizado e ii) proteína digerida obtenível usando as proteases da invenção: pelo menos 100% ou 101, 102, ou pelo menos 103% com relação a um controle em branco, e referência sendo a para a parte intestinal do modelo de digestão monogátrico in vitro completo do exemplo 6 aqui.

Os seguintes são exemplos de % de grau de hidrólise (DH) obtenível usando as proteases da invenção: pelo menos 100%, ou 101, 102, 103, 104, 105,106, 107,108, 109,110, 111 ou pelo menos 112% com relação a um controle em branco, e referência sendo a para a aquacultura do modelo de digestão in vitro do exemplo 7 aqui.

Os seguintes são exemplos de i) solubilizado e ii) % de proteína digerida obtenível usando as proteases da invenção: pelo menos 100%, ou 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ou pelo menos 113%, com relação a um controle em branco, e referência sendo a para a aquacultura do modelo de digestão in vitro do exemplo 7 aqui. O termo solubilização de proteínas basicamente significa levar (a) proteína(s) para solução. Esta solubilização pode ser devido a liberação mediada por protease de proteína de outros componentes das composições naturais geralmente complexas, como ração. A solubilização pode ser medida como um aumento na quantidade de proteínas solubilizadas, por referência a amostras de controle em branco tratadas com pepsina e pancreativa apenas (ver exemplos 6 e 7 aqui). O termo digestão de proteínas significa basicamente hidrólise proteolítica de proteínas solubilizadas pela ação de proteases de modo que peptídeos e aminoácidos de baixa massa molecular são formados. A digestão de proteínas solubilizadas pode ser medida como uma quantidade aumentada de peptídeos solubilizados e aminoácidos com uma massa molecular igual a ou menor do que 1500 daltons, por referência às amostras de controle em branco tratadas com pepsina e pancreatina somente (ver exemplos 6 e 7 aqui).

Em uma forma de realização particular de um processo de tratamento, a(s) protease(s) em questão está (estão) afetando (ou agindo em, ou exercendo sua influência solubilizante sobre) as proteínas vegetais ou fontes de proteínas. Para obter isto, a proteína vegetal ou fonte de proteína é tipicamente colocada em suspensão em um solvente, por exemplo, um solvente aquoso como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados em consideração às características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ser realizado em um valor de pH em que a atividade da protease atual é pelo menos de 50, ou 60, ou 70, ou 80 ou 90%. Do mesmo modo, por exemplo, o tratamento pode se realizar em uma temperatura em que a atividade da protease atual é pelo menos 50, ou 60, ou 70, ou 80 ou 90%. As indicações de atividade percentual acima são relativas às atividades máximas. A reação enzimática continua até o resultado desejado ser obtido, após o que ela pode ou não pode ser interrompida inativando-se a enzima, por exemplo, por uma etapa de tratamento com calor.

Em outra forma de realização particular de um processo de tratamento da invenção, a ação da protease é sustentada, significando, por exemplo, que a protease é adicionada às proteínas vegetais ou fontes de proteínas, mas sua influência solubilizante é, por assim dizer, não comutada ou até depois quando desejado, uma vez que condições solubilizantes apropriadas são estabelecidas, ou uma vez que quaisquer inibidores de enzima são inativados, ou quaisquer outros meios podem ter sido aplicados para retardar a ação da enzima.

Em uma forma de realização, o tratamento é um pré-tratamento de ração animal ou proteínas vegetais para uso em ração animal, isto é, as proteínas são solubilizadas antes da ingestão. O termo melhorando o valor nutricional de uma ração animal significa melhorar a disponibilidade de proteínas, levando assim à extração de proteínas aumentada, rendimentos de proteínas mais elevados e/ou utilização melhorada de proteínas. O valor nutricional da ração é, conseqüentemente, aumentado, e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão de ração (isto é, o peso da ração ingerida relativo ao ganho de peso) do animal é/são melhorado(s). A protease pode ser adicionada à ração de qualquer forma, seja como uma protease relativamente pura, ou em uma mistura com outros componentes destinados para adição à ração animal, isto é, na forma de aditivos de ração animal, como as denominadas pré-misturas para ração animal.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a composições para uso em ração animal, como ração animal e aditivos de ração animal, por exemplo, pré-misturas.

Além da protease da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço, e/ou pelo menos um macro mineral.

Além disso, os ingredientes de aditivos de ração opcionais são agentes colorantes, compostos aromatizantes, estabilizadores, peptídeos antimicrobianos, e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre fitases EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26; xilanases EC 3.2.1.8; galactanases EC 3.2.1.89; e/ou beta-glucanases RC 3.2.1.4.

Em uma forma de realização particular, estas outras enzimas são bem definidas (como definido acima para preparações de protease).

Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina-1, tanatina, defensina e ovispirina como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas, e estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos descritos em PCT/DK02/00781 e PCT/DK02/00812, bem como variantes ou fragmentos dos acima que retêm atividade antimicrobiana.

Exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP’s) são os peptídeos Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como variantes e fragmentos dos mesmos que retêm atividade antifungica em WO 94/01459 e WO 02/090384.

Geralmente, vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traços fazem parte de uma assim denominada pré-mistura destinada para adição à ração, enquanto os macro minerais são geralmente adicionados separadamente à ração. Qualquer um destes tipos de composição, quando enriquecidos com uma protease da invenção, é um aditivo de ração animal da invenção.

Em uma forma de realização particular, o aditivo de ração animal da invenção é destinado para ser incluído (ou prescrito como devendo ser incluído) em rações ou dietas animais em níveis de 0,01 a 10,0%, mais particularmente 0,05 a 5,0%, ou 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é, assim, em particular para pré-misturas.

Apresenta-se abaixo listas não exclusivas de exemplos destes compostos: Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E e vitamina K., por exemplo, vitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

Exemplos de minerais traços são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificados com aves de criação e leitões/ porcos) são listados na tabela A de WO 01.58275. Requisito nutricional significa que estes componentes devem ser providos na dieta na concentração indicada.

Na alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa tanto de um ou mais de um, como dois, ou três, ou quatro, e assim por diante, até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma quantidade tal de modo a prover uma concentração na alimentação na faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da tabela A. A presente invenção refere-se também a composições de ração animal. As composições de ração animal ou dietas têm um teor relativamente elevado de proteína. Dietas de animais de criação e de porcos podem ser caracterizadas como indicado na tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. Dietas de peixe podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 da tabela B. Além disso, as dietas de peixe têm, geralmente, um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.

Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg, e, além disso, compreende pelo menos uma protease, como aqui reivindicado.

Além disso, ou altemativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

Nas formas de realização particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está em qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).

Proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, 14a. ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revisada, 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12.5. O teor dietético de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas de animais completas é calculado com base nas tabelas de rações como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90- 72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteína como definido acima.

Ainda em outras formas de realização particulares, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% de milho; e/ou 0-80% de sorgo; e/ou 0-70% de trigo; e/ou 0-70% de cevada; e/ou 0-30% de aveia; e/ou 0-40% de farinha de soja; e/ou 0-10% de farinha de peixe; e/ou 0-20% de soro de leite.

Dietas de animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração em purê (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, as rações moídas são misturadas e quantidades suficientes de minerais e vitaminas essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para as espécies em questão. Enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas líquidas ou sólidas. Por exemplo, uma formulação de enzima sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa de misturação; e uma preparação de enzima líquida é tipicamente adicionada após a etapa de pelotização. A enzima pode ser incorporada em uma pré-mistura ou aditivo de ração. A concentração de enzimas final na dieta está na faixa de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por exemplo, na faixa de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal. Nas formas de realização particulares, a concentração de enzimas na dieta é 0,1-180; 0,1-160; 0,1-150; 0,2-125; 0,2-100; 1-180; 2-160; 5-150; 10-100; 10-90; 10-80; 10-70; ou 10-50 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.

Nas formas de realização particulares do método da invenção para tratar proteínas de vegetal, uma outra etapa de adição de fitase também é incluída. E em outras formas de realização, além do tratamento combinado com fitase e protease, outras enzimas também podem ser adicionadas, em que estas enzimas são selecionadas dentre o grupo compreendendo outras proteases, fitases, enzimas lipolíticas e enzimas glucosidase/ carboidrase. Exemplos destas enzimas são indicados em WO 95/28850. A protease deve, naturalmente, ser aplicada em uma quantidade eficaz, isto é, em uma quantidade adequada para melhorar solubilização e/ou melhorar o valor nutricional da ração. Contempla-se atualmente que a enzima é administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagens): 0,01-200; ou 0,01-100; ou 0,05-100; ou 0,05-50; ou 0,10-10 - todas estas fixas sendo em mg de proteína protease por kg de ração (ppm).

Para determinar mg de proteína protease por kg de ração, a protease é purificada da composição de ração, e a atividade específica de protease purificada é determinada usando um teste relevante (ver sob atividade de protease, substratos, e testes). A atividade de protease da composição de ração como tal também é determinada usando o mesmo teste, e, na base destas duas determinações, a dosagem em mg de proteína protease por kg de ração é calculada.

Os mesmos princípios aplicam-se para determinar mg de proteína protease em aditivos de ração. Naturalmente, se uma amostra está disponível da protease usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada desta amostra (sem necessidade de purificar a protease da composição de alimentação ou o aditivo). A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitando o escopo da mesma.

Exemplos Reagentes, Meios e Equipamento Reaeentes: Salvo indicado em contrário, os químicos versados usaram produtos comerciais de pelo menos um tipo de reagente. AZCL-caseína (Megazyme número do catálogo I-AZCAS). Caseína reticulada com azurina é preparada tingindo e reticulando caseína altamente purificada e usada para teste de endoprotease. Ela é fornecida como um pó fino que é insolúvel em solução tamponada, mas hidrata rapidamente para formar partículas de gel que são prontamente e rapidamente hidrolisadas por endo-proteases, liberando, assim, o fragmento rotulado com corante solúvel.

Substratos de pNA: (AAPF) Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Sigma S-7388) (GGF) Gly-Gly-Phe-pNA (Sigma S-1899) (FGL) Phe-Gly-Leu-pNA (Sigma S-6768) BA-pNA (Sigma B-4875) (AAPE) Ala-Ala-Pro-Glu-pNA (BACHEM C-1710) SSI (Inibidor de Streptomyces subtilisina): SSI foi purificado de um sobrenadante de fermentação de Streptomyces albogriseolys FERM P-1205 (S-3253) por cromatografia. A preparação de SSI tinha uma pureza acima de 95% como determinado por SDS-PAGE. Altemativamente, SSI pode ser obtido de Wako no Japão, número do catálogo 303-05201, fabricado por Daiwa Kasei K.K. (ver, por exemplo: http://search.wako.chem.co.ip/lifedb e/44834.asnh EDTA (Gibco BRL, número do catálogo 15576-028) IPTG (Promega, número do catálogo V3951) X-gal (Promega, número do catálogo V3941) Sal de sódio de ampicilina (GIBCOL., número do catálogo 11593-019) LMP agarose (Promega, número do catálogo V2111) Tripsina designa uma protease semelhante a tripsina derivada de uma cepa de Fusarium oxysporum. Sua preparação é descrita em EP 471265, exemplos 1 e 2 (“protease II”). SAVINASE® é uma subtilisina protease derivada de Bacillus clausii (anteriormente Bacillus lentus NCIB 10309), comercialmente disponível de Novozymes A/S, Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca. Sua preparação é descrita na patente US 3723250.

Pepsina (Sigma P-7000; 539 U/mg, sólida) Pancreatina (Sigma P-7545; 8xU.S.P. (US Pharmacopeia)) Cytochrome C (12500 daltons, Boehringer Mannheim 103870) Aprotinina (6500 daltons, Sigma A-l 153) Gastrina I (2126 daltons, Sigma G-1276) Substância P (1348 daltons, Sigma S-6883) Meios: Sistema de tampão (pH 3 a pH 11): ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2 1 mM, KC1 150 mM, 0,01% de Triton® X-100 ajustado em valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4.0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou 11,0 com HC1 ou NaOH (aqui, abreviando, designado “o sistema de tampão de ácido succínico”). Bórax/NaH2P04, pH 9. Preparado misturando-se 8,25 ml de bórax 0,05M com 1,75 ml de NaH2P04 0,1M.

Tampão 1 x TAE: Tris-acetato 0,04M; EDTA 0,001 M. Tampão 0,5 x RBE: Tris-borato 0,045 M; EDTA 0,001 M. Substratos de pNA 1 mM: Pesar 5 mg de pNA e dissolver em 100 μΐ de DMSO, então diluir com 10 ml de tampão de bórax/ NaH2P04, pH 9.0.

Meio CBH1: Avicel 25 g (NH4)2S04 1,4 g KH2P04 2 g Uréia 0,3 g CaCl2.2H20 0,3 g MgS04.H20 0,3 g FeS04.7H20 5 mg Extrato de 1,6 mg Peptona 1 g levedura 10 g TWEEN 80 1 ml Glucose 5 g H20 1000 ml 80 ml em frasco Erlenmeyer de 500 ml, 20 min de autoclave a 121°C.

Meio líquido: A 950 ml de H20 deionizado, adicionar: 10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato de bacto-levedura, 10 g de NaCl. Agitar até os solutos dissolverem. Ajustar o pH em 7,0 com NaOH 5N (~ 0,2 ml). Ajustar o volume da solução em 1 1 com H20 deionizado. Esterilizar por autoclavagem durante 20 min a 15 1,05 kg/cm2 em ciclo líquido.

Placas LB com ampicilina/ IPTG/ X-Gal: Adicionar 15 g de ágar a 1 1 de meio LB. Adicionar ampicilina em uma concentração final de 100 pg/ml, então suplementar com IPTG 0,5 mM e 80 pg/ml de X-gal e despejar as placas. 1% de gel agarose LMP: Adicionar 1 g de agarose LMP em 100 ml 1 x tampão TAE.

Solução de carga de IPTG (0,1 M): Adicionar água destilada em 1,2 g de IPTG em volume final de 50 ml, filtrar-esterilizar e armazenar a 4°C.

Dieta de milho/-SBM (SBM = farinha de soja): A relação milho/-SBM é 6:4 (ρ/ρ), o teor de proteína 43% (p/p) em SBM e 8,2% (p/p) em farinha de milho. A quantidade total de proteína em 10 g da dieta milho-SBM é 2,21 g. SBM extrusado: O teor de proteína é 45%. A quantidade total de proteína em 10 g de SBM extrusado é, assim, de 4,5 g.

Equipamento, incluindo vários Kits: Membrana de 5K (Millipore BIOMAX-5, 13442AM) Filtro de 0,45 pm (Nalgene 190-2545) Coluna FF Q Sepharose (Amersham Pharmacia 17-0510-01) Coluna Superdex75 (Amersham Pharmacia 17-1047-01) Gel IEF (Amersham Pharmacia 80-1124-80) Thermomixer comfort (Eppendorf) Mini Kit Rneasy (QIAGEN, número do catálogo 74904) Kit 3’ RACE (GIBCO, número do catálogo 18373-019) incluindo iniciador Adapter e mistura AUAP dNTP (100 mM, Promega, número do catálogo UI 330) Sistema de polimerase de DNA Taq (Promega, número do catálogo Ml661) incluindo tampão PCR (200 mM Tris-HCl (pH 8,4), KC1 500 mM) Sistema de purificação de DNA Preps PCR (Promega, número do catálogo A7170) Sistema de vetor pGEM-T (Promega, número do catálogo A3600) incluindo ligase de DNA T4 2 x tampão de células competentes de alta eficácia JM109 (Promega, número do catálogo LI001) Sistema de purificação de DNA minipreps (Promega, número do catálogo A7100) Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems, número do catálogo 4303149) Seqüenciador de DNA 377 ABI Prism (PE) Sistema 5’RACE (GIBO, número do catálogo 18374-058) incluindo sistema de polimerase de DNA Abridged Anchor Primer pfu (Promega, número do catálogo M7741) Filtros de policarbonato de 0,45 μτη (Sartorius) Coluna de filtragem com gel de peptídeo Superdex (7,5 x 300 mm) (Global) Espectrofotômetro DU7500 (Beckman) Sistema PCR GeneAmp 9700 (PE) Vac-Man Jr. Laboratory Vacuum Manifold (Promega, número do catálogo A7660) Exemplo 1: Testes de Protease Os seguintes testes para atividade de protease foram usados: Teste de AZCL- caseína Uma solução de 0,2% de substrato azul AZCL-caseína é colocada em suspensão em tampão de bórax/NaH2P04, pH 9, enquanto agitando. (Para a parte do perfil de pH do exemplo 4, o sistema de tampão em pH 3 a pH 11 foi usado ao contrário). A solução é distribuída enquanto agitando em placa de microtitulação (100 μΐ em cada reservatório), 30 μΐ da amostra de enzima são adicionados e as placas incubadas em um misturador térmico Eppendorf durante 30 min, a 45°C, e a 600 rpm. A amostra de enzima desnaturada (fervendo a 100°C durante 20 min) é usada como um controle em branco. Após incubação, a reação é interrompida por transferência da placa de microtitulação em gelo e a solução colorida é separada do sólido por centrifugação a 3000 rpm, durante 5 min, a 4°C. 60 μΐ do sobrenadante são transferidos para uma placa de microtitulação e a absorbância em 595 nm é medida usando uma leitora de microplaca BioRad.

Teste de pNA

Amostra contendo 50 μΐ protease é adicionada a uma placa de microtitulação e o teste é iniciado adicionando-se 100 μΐ do substrato de pNA 1 mM (5 mg dissolvidos em 100 μΐ de DMSO e ainda diluídos em 10 ml com tampão de bórax/NaH2P04 em pH 9,0). O aumento em OD405 em temperatura ambiente é monitorado como uma medida da atividade de protease.

Exemplo 2: Cultura de Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 foi cultivado a 45°C, durante 60 h, em frascos de agitação com o meio CBH1. O caldo de cultura foi coletado por centrifugação (7000 rpm, durante 20 min, a 4°C). Um total de 1500 ml de caldo de cultura foi obtido.

Exemplo 3: Purificação da protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 1500 ml do sobrenadante do exemplo 2 foram precipitados com sulfato de amônio (80% de saturação) e re-dissolvidos em 40 ml de tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,4. A solução resultante foi ultrafiltrada com uma membrana de 5K para remover os sais e trocar o tampão para Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, após o que foi filtrada através de um filtro de 0,45 pm. O volume final foi de 30 ml. A solução foi aplicada a uma coluna FF Q Sepharose equilibrada em Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, e as proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl linear (0 - 0,4M). As frações da coluna foram analisadas para atividade de protease em AZCL-caseína em pH 9,0, com ou sem SSI. As frações com atividade de protease não inibidas por SSI foram reunidas. Então, a solução reunida foi aplicada a uma coluna Superdex75 equilibrada com Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, e as proteínas foram eluídas com o mesmo tampão. As frações contendo protease foram analisadas por SDS-PAGE e as frações puras foram reunidas. A pureza da protease purificada foi verificada por SDS-PAGE e em um gel IEF. A amostra continha somente uma protease que foi designada AP025. O peso molecular é cerca de 23 kDa e o pl é pH 8,5. Exemplo 4: Caracterização da protease Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 Teste de Inibição A protease purificada AP025 foi testada para inibição por vários inibidores, incluindo SSI e EDTA. A protease foi incubada com 1,12 mg/ml de SSI ou EDTA 0,5M, durante 5 min, em temperatura ambiente, e a atividade residual foi determinada usando o teste de AZCL-caseína do exemplo 1 (pH 9, 45°C). Tripsina e SAVINASE™ foram incluídos como controles. Como é evidente dos resultados mostrados na figura 1, a atividade de AP025 parece ser nem inibida por SSI nem por EDTA.

Perfil de Temperatura A relação entre temperatura e atividade de protease foi avaliada usando o teste AZCL-caseína (20 min com agitação no misturador térmico). O perfil de temperatura resultante é mostrado na figura 2. A protease AP025 é ativa em uma ampla faixa de temperaturas de 20-90°C e parece ter sua temperatura ótima em cerca de 70°C. Mas, mesmo a 90°C, a atividade é pelo menos 60%, com relação à atividade a 55°C.

Perfil de pH A relação entre pH e atividade de protease foi avaliada usando o teste de AZCL-caseína do exemplo 1 (e o sistema de tampão em pH 3 a pH 11). O perfil de pH resultante é mostrado na figura 3. A protease AP025 parece ter atividade em uma ampla faixa de pH de pH 5-10. O pH ótimo é cerca de 6.

Estabilidade de pH

Para medições de estabilidade, uma mistura de 15 ml da amostra de enzima e 200 ml de tampão em pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 foi incubada a 37°C durante 2 h, e então a atividade enzimática residual foi testada usando o AZCL-caseína do exemplo 1 (adicionar 900 μΐ de AZCL-caseína em tampão de bórax/NaFhPO.*, pH 9,0, incubar a mistura a 45°C, a 1200 rpm, durante 10 min; então OD foi medido em 595 nm). Os resultados são mostrados na figura 4. A protease parece ser estável em uma faixa muito ampla de pH de pH 4-10, mas é otimamente estável em cerca de pH 4. Especificidade do substrato de pNA A especificidade do substrato de AP025 foi avaliada usando alguns substratos de pNA, incluindo AAPF, AAPE, GGF, BA e FGL, com SAVINASE™ e tripsina como referências.

Dos resultados mostrados na figura 5, parece que AP025 tem nenhuma atividade substancial em qualquer um destes substratos. Seaüenciamento N-terminal A seqüência de aminoácidos N-terminal da protease AP025 foi: QRISSCSGSRQSALTTALRN (SEQID NO: 3).

Exemplo 5: Clonagem do gene codificando a protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 Cepa fungica e seu crescimento Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 foi cultivado a 45°C, a 165 rpm, durante 3 dias em meio CBH1. O micélio foi coletado por centrifugação a 7000 rpm durante 30 min. O micélio coletado foi armazenado a -80°C antes do uso para extração de RNA.

Extração de RNA total RNA total foi extraído de 100 mg de micélio usando o mini kit Rneasy.

Iniciadores Degenerados Os seguintes iniciadores degenerados foram projetados com base em parte da seqüência de aminoácidos N-terminal, QSALTTA: T025-3 5’ CA (A/G) TC (T/C/A/G) GC (T/C/A/G) CT (T/C/A/G) AC (T/C) AC (A/G) GC 3’ (SEQID NO: 4) T025-12 5’ CA (A/G) AG (T/C) GC (T/C/A/G) CT (T/C/A/G) AC (A/G) AC (A/G) GC 3’ (SEQ ID NO: 5) Clonagem da extremidade 3’ de AP025 O kit 3’ RACE foi usado para sintetizar o cDNA de AP025. Cerca de 5 mg do RNA total foram usados como um gabarito e o iniciador Adapter foi usado para sintetizar o primeiro filamento de cDNA. Então, o cDNA de AP025 foi amplificado por PCR usando os iniciadores degenerados acima.

As condições e sistema de reação PCR foram como a seguir: 10 x tampão PCR 5 μΐ MgCb 25 mM 3 μΐ Mistura de dNTP 10 mM 1 μΐ Iniciador 3’ (T025-3, T025-12; 10 μΜ) 1 μΐ AUAP (10 μΜ) 1 μΐ Polimerase de DNA Taq 0,5 μΐ Reação de síntese de cDNA 2 μΐ Adicionar água destilada autoclavada a 50 μΐ Condições 94°C 3 min 94°C 40 s 55°C 40 s 30 ciclos 72°C 1 min 72°C 10 min Análise de gel do produto PCR revelou uma banda específica correspondente a um fragmento de cerca de 800 bp, usando iniciadores AP025-3 e AP025-12. Os produtos foram recuperados de 1% de gel agarose LMP, purificados por incubação em um banho a 70°C, usando depois o sistema de purificação de DNA Preps PCR. As concentrações dos produtos purificados foram determinadas medindo a absorbância de A2ôo e A28o em um espectrofotômetro. Então, os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM-T usando o kit Promega correspondente: Ligase de DNA T4 2 x Tampão 1 μΐ Vetor pGEM-T (50 ng) 1 μΐ Produto PCR 40 ng Ligase de DNA T4 (3 unidades Weiss/μΐ) 1 μΐ dH20 em um volume final de 10 μΐ As reações foram incubadas durante a noite a 4°C. 2-4 μΐ dos produtos de ligação foram transformados em 50 μΐ de células competentes de alta eficácia JM109 pelo método de “choque térmico” (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989) Molecular Cloning 1.74, 1.84).

Culturas de transformação foram depositadas em placas LB com ampicilina/ IPTG/ X-Gal e estas placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Clones recombinantes foram identificados triando as cores nas placas indicadoras e triando PCR nas colônias como a seguir: Sistema de PCR de colônias: 10 x tampão PCR 5 μΐ MgCl2 25 mM 3 μΐ Mistura de dNTP 10 mM 1 μΐ Iniciador 3’ (10 μΜ, T025-3 ou T025-12) 2 μΐ AUAP (10 μΜ) 2 μΐ Polimerase de DNA Taq 0,5 μΐ Adicionar água destilada autoclavada a 50 μΐ Molhar uma ponta em uma colônia branca e pipetar a colônia em mistura PCR como um gabarito.

Condições PCR 94°C 3 min 90°C 40 s 55°C 40 s 30 ciclos 72°C 1,5 min 72°C 10 min Os clones positivos foram inoculados em 3 ml de meio líquido LB e incubados durante a noite a 37°C com agitação (cerca de 250 rpm). A pelota de células foi separada por centrifugação durante 5 min a 10.00 x g e amostras de plasmídeos foram preparadas da pelota de células usando sistema de purificação de DNA Minipreps. Finalmente, os plasmídeos foram seqüenciados usando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit e o seqüenciador ABI377. A reação de seqüenciamento foi como a seguir: Mistura Terminator Ready Reaction 8 μΐ DNA do plasmídeo 1,0 - 1,5 pg Iniciador 3,2pmol dH20 em um volume final de 10 μΐ Os resultados do seqüenciamento mostraram que a banda de PCR obtida usando o iniciador AP025-3, bem como iniciador AP025-12, é a seqüência da extremidade 3’ de AP025.

Clonagem da extremidade 5’ de AP025 Com base na seqüência da extremidade 3’ de AP025, os requerentes projetaram três iniciadores específicos que foram usados para clonar a extremidade 5’ da seqüência. AP025-5’-l 5’ AAG GTA TAT GGC ATT CGC AT 3’(SEQ ID No: 6) AP025-5’-2 5’ GCA GCC TGG TAG CCA TAC 3’(SEQ ID No: 7) AP025-5’-3 5’ TTG ATC CTG AGC GTG ACA G 3’(SEQ ID No: 8) O sistema 5’ RACE foi usado para sintetizar o fragmento da extremidade 5’ de AP025. 5 pg de RNA total e iniciador 5’-l foram adicionados para síntese do primeiro filamento. Então, o cDNA foi purificado com o sistema de purificação de DNA (provido pelo sistema 5’ RACE) e uma cauda polyC foi adicionada à extremidade 3’ do cDNA. O iniciador 5’-2 foi usado como a segunda síntese de filamento.

As seguintes condições e sistema de PCR de cDNA com cauda dC foram usadas: 10 x tampão PCR (Tris-HCl 200 mM (pH 8,4), KC1500 mM)5 μΐ MgCl2 25 mM 3 μΐ Mistura de dNTP 20 mM 1 μΐ Iniciador 5’ (10 μΜ) (AP025-5M/2/3) 2 μΐ Iniciador Abridged Anchor 2 μΐ Polimerase de DNA Taq 0,5 μΐ CDNA com cauda dC 5 μΐ Adicionar água destilada autoclavada a 50 μΐ Condições PCR 94°C 2 min 94°C 40 s 55°C 40 s 30 ciclos 72°C 1 min 72°C 10 min Para obter um produto específico, os requerentes amplificaram a extremidade 5’ usando iniciador AP025-5’-3 por PCR aninhado (Frohman, M.A. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. e White, T.J., eds.) p. 28, Academic Press, San Diego. Água destilada esterilizada 33,5 μΐ 10 x tampão PCR 5,0 μΐ MgCl2 25 mM 3,0 μΐ Mistura dNTP 10 mM 1,0 μΐ Iniciador AP025 5’-3 (10 μΜ) 1,0 μΐ AUAP (10 mM, provido pelo sistema 5’RACE 1,0 μΐ Diluição do produto PCR primário (1:100) 5,0 μΐ Polimerase de DNA Taq (2 a 5 unidades/μΐ) 0,5 μΐ Condições PCR 94°C 2 min 94°C 40 s 58°C 40 s 30 ciclos 72°C 1 min 72°C 10 min Usando o iniciador AP025-5’-3’ no sistema 5’RACE, uma banda específica foi obtida com o tamanho de um fragmento de 1000 bp. Os produtos PCR foram purificados, ligados no vetor pGEM-T e transformados em células competentes JM109, e seqüenciados. O seqüenciamento confirmou que o fragmento da extremidade 5’ de AP025 foi clonado.

Clonagem do gene AP025 total: Um iniciador para clonagem de comprimento completo foi projetado com base nas seqüências da extremidade 3’ e da extremidade 5’: AP025-CDS-2 5’ AAG TCT ACC CAG TAT CCT GT 3’ (SEQID No: 9) O iniciador AP025-CDS-2 e AUAP foi usado para amplificar o gene de comprimento completo do cDNA de AP025. As seguintes condições e sistema de reação PCR foram usados: 10 x tampão PCR 5 μΐ MgCl2 25 mM 3 μΐ Mistura dNTP 10 mM 1 μΐ Iniciador AP025-CDS-2 (10 μΜ) 1 μΐ AUAP (10 μΜ) 1 μΐ Polimerase de DNA pfu 0,5 μΐ Reação de síntese de cDNA 2 μΐ Adicionar água destilada autoclavada a 50 μΐ Condições: 95°C 2 min 95°C 40 s 59°C 30 s 30 ciclos 72°C 3,5 min 72°C 5 min Uma banda específica com o tamanho de cerca de 1,4 kb foi o resultado desta amplificação. Uma cauda polyA foi adicionada usando polimerase de DNA Taq e inoculação a 72°C durante 30 min. O fragmento com cauda dA foi recuperado do gel com o sistema de purificação de DNA Preps PCR. Então, o fragmento purificado foi ligado no vetor pGEM-T e transformado nas células competentes (JM109). Alguns clones positivos foram triados por PCR de colônias.

Sistema PCR de colônias: 10 x tampão PCR 5 μΐ MgCl2 25 mM 3 μΐ Mistura dNTP 10 mM 1 μΐ AP025-CDS-2 (10 μΜ, ΑΡ025-3 ou ΑΡ025-12) 2 μΐ AUAP (10 μΜ) 2 μΐ Polimerase de DNA Taq 0,5 μΐ Adicionar água destilada autoclavada a 50 μΐ Iniciador AP025 5’-3 (10 μΜ) 1,0 μΐ Molhar uma ponta em uma colônia branca e pipetar a colônia em mistura PCR como um gabarito.

Condições 94°C 3 min 94°C 40 s 55°C 40 s 30 ciclos 72°C 1,5 min 72°C 10 min Então, o plasmídeo foi extraído destes clones com o sistema de purificação de DNA Minipreps. O plasmídeo foi seqüenciado usando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction e a seqüência de comprimento completo foi obtida. A análise da seqüência do clone de cDNA mostrou que a seqüência contém uma região de codificação de 1065 nucleotídeos. O produto de tradução da região de codificação é um peptídeo de 355 aminoácidos. Exemplo 6: Desempenho da protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 em um modelo de digestão monogástrico in vitro A protease AP025 foi expressada em e excretada de Aspergillus orizae. A protease purificada tinha um A280 de 1,15 e um A260 de 0,52. O desempenho da protease purificada foi testado em um modelo in vitro simulando a digestão em animais mono gástricos. Em particular, a protease foi Segue-se a página 71 testada para sua capacidade de melhorar a solubilização e digestão de proteínas milho/-SBM (milho/-farinha de soja). O sistema in vitro consistia de 10 frascos em que o substrato milho/-SBM foi inicialmente incubado com HCl/pepsina - simulando digestão gástrica - e, subseqüentemente, com pancreatina - simulando digestão intestinal. Cinco dos frascos foram dosados com a protease AP025 no início da fase gástrica, enquanto os frascos restantes serviram como um controle em branco. Ao término da fase de incubação intestinal, amostras de digestos in vitro foram removidas e analisadas para proteína solubilizada e digerida.

Descrição do procedimento de digestão in vitro Condições Substrato: 4 g de SBM, 6 g de milho (pré-misturados) pH: 3,1 na etapa do estômago/ 6,8-7,0 na etapa intestinal HC1: 0,105 M durante 1,5 h (isto é, 30 min de pré-mistura de HC1- substrato Pepsina: 3000 U/g da dieta durante 1 h Pancreatina: 8 mg/g da dieta durante 4 h Temperatura: 40°C Replicatas: 5 Soluções NaOH 0,39 M HC1 0,105 M HC1 0,105 M contendo 6000 U de pepsinapor 5 ml NaHC03 1 M contendo 16 mg de pancreatina por ml Tampão de NaAc 125 mM, pH 6,0 Determinações de proteína enzimática A quantidade de proteína da enzima protease é calculada com base nos valores de A2so e as seqüências de aminoácidos (composições de aminoácidos) usando os princípios descritos em S.C. Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989).

Procedimento experimental para modelo in vitro O procedimento experimental foi de acordo com o descrito acima, o pH foi medido no período de 1, 2,5 e 5,5 h. As incubações foram combinadas após 6 h e amostras de 30 ml foram removidas e colocadas em gelo antes da centrifugação (10000 x g, 10 min, 4°C). Os sobrenadantes foram removidos e armazenados a -20°C.

Análise Todas as amostras foram analisadas para % grau de hidrólise (DH) com o método OPA, bem como teor de proteína solubilizada e digerida usando filtragem com gel.

Determinação de DH pelo método OPA O grau de hidrólise (DH) da proteína em amostras diferentes foi determinado usando uma placa de microtitulação semi-automática com base em método colorimétrico (Nielsen, P.M.; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hidrolysis. J. Food Sei. 2001, 6, 642-646). O reagente OPA foi preparado como a seguir: 7,620 g de tetraborato de di-Na decaidratado e 200 mg de dodecil sulfato de sódio (SDS) foram dissolvidos em 150 ml de água deionizada. Os reagentes foram completamente dissolvidos antes da continuação. 160 mg de o-ftal-dialdeído a 97% (OPA) foram dissolvidos em 4 ml de etanol. A solução de OPA foi transferida quantitativamente para a solução acima mencionada enxaguando com água deionizada. 176 mg de ditiotreitol a 99% (DTT) foram adicionados à solução que foi composta em 200 ml com água deionizada. Um padrão de serina (0,9516 meqv/1) foi preparado solubilizando 50 mg de serina (Merck, Alemanha) em 500 ml de água deionizada. A solução da amostra foi preparada diluindo cada amostra em uma absorbância (280 mm) de cerca de 0,5. Geralmente, os sobrenadantes foram diluídos (100 x) usando um posto de diluição Tecan automática (Mànnedorf, Suíça). Todas as outras leituras de espectrofotômetro foram realizadas a 340 nm usando água deionizada como o controle. 25 μΐ da amostra, padrão e cego foram dispensados em uma placa de microtitulação. A placa de microtitulação foi inserida em uma leitora iEMS MF (Labsystems, Finlândia) e 200 μΐ do reagente OPA foram automaticamente distribuídos. As placas foram agitadas (2 min; 700 rpm) antes de medir a absorbância. Finalmente, o DH foi calculado. Determinação em oito vezes de todas as amostras foi realizada.

Estimativa de proteína solubilizada e digerida O teor de proteína solubilizada nos sobrenadantes das amostras digeridas in vitro foi estimado quantificando-se a proteína bruta (CP), usando HPLC de filtragem com gel. Os sobrenadantes foram descongelados, filtrados através de filtros de policarbonato de 0,45 pm e diluídos (1:50, v/v) com H20. As amostras diluídas foram cromatografadas por HPLC usando uma coluna de filtração com gel PE de peptídeo PE (7,5 x 300 mm) (Global). O eluente usado para eluição isocrática foi tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 7,0) contendo NaCl 150 mM. O volume total de eluente por ciclo foi 26 ml e a taxa de fluxo foi 0,4 ml/min. Os perfis de eluição foram registrados em 214 nm e a área total sob os perfis foi determinada por integração. Os perfis de eluição foram registrados em 214 nm e a área total sob os perfis foi determinada por integração. Para estimar o teor de proteína das áreas integradas, uma curva de calibragem (R2=0,9993) foi feita a partir de uma série de diluições de uma amostra de referência de milho/-SBM digerida in vitro com teor de proteína total desconhecido. A determinação de proteína nesta amostra referência foi realizada pelo método de Kjeldahl (determinação de % de nitrogênio; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14â ed., Washington DC). O teor de proteína digerida foi estimado integrando a área de cromatograma correspondente a peptídeos e aminoácidos tendo uma massa molecular de 1500 daltons ou abaixo (Savoie, L.; Gauthier, S.F.; Dialysis Cell for the in-vitro Measurement of Protein Digestibility. J. Food Sei. 1986, 51, 494- 498; Babinszky, L.; Van, D.M.J.M.; Boer, H.; Den, H.L.A. An in-vitro Method for Prediction of the Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sei. Food Agr. 1990, 50, 173- 178; Boisen, S.; Eggum, B.O. Criticai Evaluation of in-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animais. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). Para determinar a linha divisória de 1500 daltons, a coluna de filtragem com gel foi calibrada usando citocromo C, aprotinina, gastrina I e substância P como padrões de massa molecular.

Resultados Os resultados mostrados nas tabelas 1 e 2 abaixo indicam que a protease AP025 aumentou significativamente a proteína digerível, enquanto DH e proteína solúvel foram numericamente aumentados comparados ao controle em branco.

Quando testada na parte intestinal deste modelo somente, a protease AP025 (na mesma dosagem de 100 mg de proteína de enzima por kg de substrato) aumentou significativamente o nível de ambas a proteína solubilizada e digerida (103,0 e 103,1%, respectivamente, com relação ao controle em branco), enquanto o DH não foi aumentado (96,5% com relação ao controle em branco).

Tabela 1 _______________Grau de hidrólise (DH), valores absolutos e relativos________ Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA descartável, teste de Tukey- Kramer, P < 0,05). SD = Desvio Padrão. % CV = Coeficiente de variação = (SD/ valor médio) x 100% Tabela 2 Proteína bruta solubilizada e digerida medida por HPLC ÀKTA.

Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA descartável, teste de Tukey- Kramer, P < 0,05). SD = Desvio Padrão. % CV = Coeficiente de variação = (SD/ valor médio) x 100% Exemplo 7: Desempenho de protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 em um modelo de digestão in vitro de aquacultura A mesma preparação de protease AP025 como descrito no exemplo 6 também foi testada em um modelo in vitro de aquacultura simulando digestão em peixe de água fria. Em comparação ao modelo monogástrico, o sistema de aquacultura é realizado em valores de pH levemente diferentes (pH 3,3 na fase gástrica e pH 7,2 - 7,8 na fase intestinal). A temperatura de incubação é mais baixa (15°C em vez de 40°C) e os períodos de incubação são mais longos (descritos abaixo). 10 frascos contendo SBM extrusado como o substrato foram inicialmente incubados com HCl/pepsina - simulando digestão gástrica - e, subseqüentemente, com pancreatina - simulando digestão intestinal. Cinco dos frascos foram dosados com a protease AP025 no início da fase gástrica, enquanto os frascos restantes serviram como controle em branco. Ao término da fase de incubação intestinal, amostras de digestos in vitro foram removidas e analisadas para proteína solubilizada e digerida.

Descrição do procedimento in vitro de aquacultura simulando digestão em peixes de água fria_____________________________ Condições Substrato: 10 g de SBM extrusado pH : etapa do estômago, 3,3/ etapa intestinal, 7,2 - 7,8 HC1: 0,18 M durante 6 h Pepsina: 3000 U/g extrusados durante 6 h Pancreatina: 8 mg/g de SBM extrusado durante 18 h Temperatura: 15°C

Replicatas: 5 Soluções NaOH 1,10 M HC1 0,18 M contendo 652 U de pepsina por ml NaHCC>3 1 M contendo 16 mg de pancreatina por ml Tampão de NaAc 125 mM, pH 6,0 Procedimento experimental para o modelo de digestão in vitro de aquacultura O procedimento experimental foi realizado como descrito acima. O pH foi medido após 1,5, 8 e 23 h. As incubações foram concluídas após 24 h e amostras de 30 ml foram removidas e colocadas em gelo antes de centrifugação (10000 x g, 10 min, 4°C). Os sobrenadantes foram removidos e armazenados a -20°C.

Análise Todos os sobrenadantes foram analisados com o método OPA (% grau de hidrólise) e HPLC Àkta para proteína solubilizada e digerida (ver exemplo 6).

Resultados Os resultados mostrados nas tabelas 3 e 4 abaixo indicam que a protease AP025 aumentou significativamente a solubilidade da proteína, digestibilidade da proteína e DH, com relação ao controle em branco.

Tabela 3 Resultados de OPA em % grau de hidrólise Subscritos diferentes em uma coluna indicam diferenças significativas ( ANOVA descartável, teste de Tukey- Kramer, P < 0,05).

Tabela 4 Resultados em proteína bmta digerida (%Cpdig) e solubilizada (%Cpsol) analisados por HPLC Àkta.

Subscritos diferentes em uma coluna indicam diferenças significativas ( ANOVA descartável, teste de Tukey- Kramer, P < 0,05).

Depósito de Material Biológico O seguinte material biológico foi depositado nos termos do Tratado de Budapeste junto ao DSMZ (DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmBH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha) e CGMCC (the China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Haidian, Beijing 100080, China); e designados os seguintes números de acesso: Depósito Número de Acesso Dada do depósito Escherichia coli DSM 14652 29-11-2001 Thermoascus aurantiacus CGMCC no. 0670 27-12-2001 A cepa Escherichia coli abriga um plasmídeo contendo a seqüência de ácido nucleico de Thermoascus aurantiacus (isto é, SEQID NO: 1 codificando SEQ ID NO: 2).

Estas cepas foram depositadas em condições que asseguram que o acesso às culturas estará disponível durante a pendência desta publicação de patente para um versado indicado pelo Commissioner of Patents and Trademarks a ser intitulado sob 37 C.F.R. § 1.14 e 35 U.S.C. § 122. Os depósitos representam uma cultura substancialmente pura das cepas depositadas. Os depósitos estão disponíveis como requerido pelas leis de patentes estrangeiras em países onde as contrapartes do pedido objeto, ou sua progênie, são depositadas. No entanto, deve ser compreendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em derrogação aos direitos de patente garantidos por ação governamental. A cepa Thermoascus aurantiacus no. CGMCC 0670 foi isolada de uma amostra de solo coletada em 21 de julho de 1998 na província de Yunnan, Xishuangbanna, China. A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada em seu escopo pelas formas de realização específicas aqui descritas, uma vez que estas formas de realização são pretendidas como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes são destinadas como devendo estar dentro do escopo desta invenção. Naturalmente, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui serão evidentes aos versados na técnica da descrição acima. Pretende-se também que as modificações estejam dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a resolução será dada pela presente descrição incluindo as definições. Várias referências são citadas aqui, cujas descrições são incorporadas por referência em suas totalidades.

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA <110> Novozymes A/S <120> Pioteasea <130> 10251 <160> 11 <170> Patentln Versão 3.1 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> Thermoascus aurantiacus <220> <221> Misc_aspecto <222> (25)..(1089} <223> Gene codificando SEQ ID N° 2 <400> 1 aagtctaccc agtatcctgt caacatgcgg ctcgttgctt ccctaacggc cttggtggcc 60 ttgtccgtac ctgtctttcc cgctgctgtc aacgtgaagc gtgcttcgcc ctacctggag 120 atcactctga gccaggtcag caacactctg atcaaggccg tggtccagaa cactggtagc 180 gacgagttgr ccttcgttca cctgaacttc ttcaaggacc ccgctcctgt caaaaaggta 240 tcggtctatc gcgatgggtc tgaagtgcag ttcgagggca ttttgagccg ctacaaatcg 300 actggcctct ctcgtgacgc ctttacttat ctggctcccg gagagtccgt cgaggacgtt 360 tttgatattg cttcgactta cgatctgacc agcggcggcc ctgtaactat ccgtactgag 420 ggagttgttc ççtacgccao ggçtaacagc actgatattg ccggctacat; ctcatactcg 480 tctaatgtgt tgaccattga tgtcgatggc gccgctgctg ccactgtctc caaggcaatc 540 actcctttgg accgccgcac taggatcagc tcctgctccg gcagcagaca gagcgctctt 600 actacggctc tcagaaacgc tgcttctctt gccaacgcag ctgccgacgc ggctcagtct 660 ggatcagctt caaagttcag cgagtacttc aagactactt ctagctctac ccgccagacc 720 gtggctgcgc gtcttcgggc tgttgcgcgg gaggcatctt cgtcttcttc gggagccacc 780 acgtactact gcgacgatcc ctacggctac tgttcctcca acgtcctggc ttacaccctg 840 ccttcataca acataatcgc caactgtgac attttctata cttacctgcc ggctctgacc 900 agtacctgtc acgctcagga tcaagcgacc actgcccttc acgagttcac ccatgcgcct 960 ggcgtctaca gccctggcac ggacgacctg gcgtatggct accaggctgc gatgggtctc 1020 agcagcagcc aggctgtcat gaacgctgac acctacgctc tctatgcgaa tgccatatac 1080 cttggttgcu aagcgcagag cggtccattg gcgagttggt cgcggtecag cteiagctgg 1140 gatcggccat ggatggtttg agctctgtaa atgacggtcc cgatcttgca gctttgattc 1200 catctaaacg cgcaggaagg aatattagga tgaggatgtt tctatgagac ggctgtgcgc 1260 agagttccga cgagtgacgg taactatttt tgccatagct acataatgca tctacaagtt 1320 atctaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1344 <210> 2 <211> 355 <212> PRT <2135 Thermoascus aurantiacus <220> <221> SINAL <222> (1)..(19) <223> <220> <221> mat_peptideo <222> (179)..() <223> <220> <221> PROPEP <222> (20)..(178) <223> <400> 2 Met Arg Leu Vai Ala Ser Leu Thr Ala Leu Vai Ala Leu Ser Vai -175 -170 -165 Pro Vai Phe Pro Ala Ala Vai Asn Vai Lys Arg Ala Ser Ser Tyr -160 -155 -150 Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gin Vai Ser Asn Thr Leu Ile Lys Ala -145 -140 -135 Vai Vai Gin Asn Thr Gly Ser Asp Glu Leu Ser Phe Vai His Leu -130 -125 -120 Asn Phe Phe Lys Asp Pro Ala Pro Vai Lys Lys Vai Ser Vai Tyr -115 -110 -105 Arg Asp Gly Ser Glu Vai Gin Phe Glu Gly Ile Leu Ser Arg Tyr Lys -100 -95 -90 Ser Thr Gly Leu Ser Arg Asp Ala Phe Thr Tyr Leu Ala Pro Gly Glu -85 -80 -75 Ser Vai Glu Asp Vai Phe Asp Ile Ala Ser Thr Tyr Asp Leu Thr Ser -70 -65 -60 Gly Gly Pro Vai Thr Ile Arg Thr Glu Gly Vai Vai Pro Tyr Ala Thr -55 -50 -45 -40 Ala Asn Ser Thr Asp Ile Ala Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Asr Vai -35 -30 -25 Leu Thr Ile Asp Vai Asp Gly Ala Ala Ala Ala Thr Vai Ser Lys Ala -20 " -15 -10 Ile Thr Pro Leu Asp Arg Arg Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser -5 -11 5 Arg Gin Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala 10 15 20 25 Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala Gin Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser 30 35 40 Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Gin Thr Vai Ala Ala 45 50 55 Arg Leu Arg Ala Vai Ala Arg Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala 60 65 70 Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Vai 75 80 85 Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile 90 95 100 105 Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gin Asp 110 115 120 Gin Ala Thr Thr Ala Leu His Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Vai Tyr 125 130 135 Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Gin Ala Ala Met Gly 140 145 150 Leu Ser Ser Ser Gin Ala Vai Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr 155 160 165 Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly Cys 170 175 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> MISC _ ASPECTO <223> seqüência de aminoácido N-terminal <400> 3 Gin Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gin Ser Ala Leu Thr Thr 15 10 15 Ala Leu Arg Asn 20 <210> 4 <2ll> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador degenerado <220> <221> Misc_aspecto <222> (3)..(3) <223> N na posição 3 e 18 significa A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (18)..(18) <223> N na posição 3 e 18 significa A ou G <220> <221> Misc_aspecto -í222> (6)..(6) <223> M na posição 6 significa T, C, A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (9)..(9) <223> m na posição 9 significa T, C, A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (12)..(12) <223> M na posição 12 significa T, C, A ou G <220> <221> Misc_aspecrto <222> (15)..(15) <223? Κ in position 15 means Τ or C <400> 4 cantcmgcmc traackacngc 20 <2l0> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador degenerado <220> <221> Misc_aspecto <222> (3)..(3) <223> n na posição 3 significa A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (6)..(6) <223> ^ na posição 6 significa t ou c <220> <221> Misc_aspecto <222> (9)..(9) <223> m na posição 9 significa T, C, A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (12)..(12) <223> m na posição 12 significa T, C, A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (15)..(15) <223> n na posição 15 significa A ou G <220> <221> Misc_aspecto <222> (18)..(18) <223> n na posição 18 siginfica A ou G <400> 5 canagkgcmc tmacnacngc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 6 aaggtatatg gcattcgcat 20 <210> 7 C211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 7 gcagcctggt agccatac 18 <210> θ <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <4 00> 8 ttgatcctga gcgtgacag 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 9 aagtctaccc agtatcctgt 20 <210> 10 <211> 1267 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <220>

<221> CDS <222> (1133)..(1195) <223> <220> <221> Misc_aspecto <222> (71)..() <223> <220> <221> CDS <222> (2)..(70) <223> <220>

<221> CDS <222> (1199)..(1267) <223> <220>

Claims (11)

1. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%, ligada de modo operativo a uma ou mais seqüências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão microorganismo apropriado.

2. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.

3. Célula de microorganismo hospedeiro recombinante, caracterizada pelo fato de compreender a construção de ácido nucléico como definida na reivindicação 1 ou o vetor como definido na reivindicação 2.

4. Método para produzir um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que tem um grau dc identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma célula de microorganismo hospedeiro recombinante como definida na reivindicação 3, para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo, e (b) recuperar o polipeptídeo.

5. Método para produzir um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar uma cepa do gênero Thermoascus, e (h) recuperar o polipeptídeo.

6. Uso dc pelo menos uma protease tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%, caracterizado pelo fato de ser: (i) em ração animal e/ou (ii) na preparação de uma composição para uso em ração animal.

7. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma protease tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80% é adicionada à ração.

8. Aditivo para ração animal, caracterizado pelo fato de compreender: (a) pelo menos uma protease tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura e/ou (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água e/ou (d) pelo menos um mineral em traço, e/ou (e) pelo menos um macro-mineral, o aditivo opcionalmente ainda compreendendo fitase, xilanase, galactanase e/ou beta-glucanase.

9. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de ter um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e compreendendo pelo menos uma protease tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%.

10. Método para o tratamento de proteínas vegetais, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar pelo menos uma protease tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade com aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, ou + 1 a 177 de SEQ ID N° 2 de pelo menos 80%, a pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteínas.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que soja é incluída dentre pelo menos uma das fontes de proteína vegetal.