CN116438309A

CN116438309A - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN116438309A
Application number: CN202180074223.0A
Authority: CN
Inventors: 仓方悠马; 富木亚纪
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2023-07-14
Also published as: WO2022090564A1; EP4237555A1; AR123983A1; JP2023547457A; CA3199315A1; MX2023004938A; BR112023008361A2; AU2021370998A1; US20230399632A1

Abstract

本发明涉及具有改善的热稳定性的葡糖淀粉酶变体以及包含此类变体的组合物。本发明进一步涉及编码此类变体的多核苷酸，和包含编码此类变体的基因的载体和宿主细胞，其中这些载体和宿主细胞也能够产生此类变体。本发明还涉及使用或应用这些变体或组合物液化含淀粉材料的方法，以及从而通过该方法产生的糖化。本发明还涉及使用或应用这些变体或组合物糖化含淀粉材料的方法，以及从而通过该方法生产的糖类。本发明进一步涉及从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物的工艺，以及酶共混物或组合物、或适用于在本发明的工艺中使用的重组宿主细胞或发酵生物。

Description

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及葡糖淀粉酶变体和包含此类变体的组合物。本发明进一步涉及编码此类变体的多核苷酸，和包含编码此类变体的基因的载体和宿主细胞，其中这些载体和宿主细胞也能够产生此类变体。本发明还涉及使用或应用这些变体或组合物对含淀粉材料进行液化和/或糖化的方法。本发明进一步涉及从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物的工艺，以及酶共混物或组合物、或适用于在本发明的工艺中使用的重组宿主细胞或发酵生物。

背景技术

葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉属(Aspergillus)的那些葡糖淀粉酶在商业上最为重要。

在商业上，葡糖淀粉酶被用于将已通过α-淀粉酶部分地水解的淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)，和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；激素和其他难以合成生产的化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。

本发明的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程(例如乙醇生产过程)中提供高产率。

发明内容

本发明提供了与亲本葡糖淀粉酶相比具有改善的特性的葡糖淀粉酶变体。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，并且其中所述变体与SEQ IDNO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，并且其中所述变体与SEQ IDNO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明还涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明还涉及包含本发明的变体多肽的组合物。

本发明还涉及编码根据本发明的变体的多核苷酸、包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体、包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的表达载体、和包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的宿主细胞。

本发明还涉及产生葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括(a)在适于表达这些变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收这些变体。

本发明进一步涉及获得亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括以下步骤：在对应于以下位置的一个或多个位置处引入取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步包括在对应于以下位置的一个或多个位置处引入取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，从而所述方法提供所述亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与该亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明进一步涉及获得亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括以下步骤：在对应于以下位置的一个或多个位置处引入取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，从而所述方法提供所述亲本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与该亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明涉及使用发酵生物，从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物(例如乙醇)的工艺。

在一方面，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

i)使用产碳水化合物源的酶，在低于初始糊化温度的温度下，将含淀粉材料糖化；

ii)使用发酵生物进行发酵；

其中本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加。

i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；

ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在液化步骤i)、糖化步骤ii)、发酵步骤iii)、或同时糖化和发酵(“SSF”)期间存在或添加。

在一方面，本发明涉及从含纤维素材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

i)任选地预处理含纤维素材料；

ii)使用产碳水化合物源的酶将含纤维素材料和/或预处理的含纤维素材料糖化；以及

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在糖化步骤ii)或发酵步骤iii)期间存在或添加。

在一方面，本发明涉及包含本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体的酶共混物或组合物。

在一方面，本发明涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸。

在一方面，本发明涉及组合物(例如，发酵中的或经发酵的醪组合物)，该组合物包含：(i)重组宿主细胞或发酵生物，该重组宿主细胞或发酵生物包含编码α-淀粉酶和/或蛋白酶的异源多核苷酸、以及本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体。

附图说明

图1示出了以下的成熟蛋白质的氨基酸序列的多重比对：

-来自SEQ ID NO:6的草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)(PoAMG)的野生型AMG；

-表示为SEQ ID NO:8的‘AMG NL’的PoAMG变体；

-表示为SEQ ID NO:4的‘AMG anPAV498’的PoAMG变体；

-表示为SEQ ID NO:1的‘AMG JPO001’的PoAMG变体；

-来自SEQ ID NO:13的密钦斯基青霉菌(Penicillium miczynskii)(PmAMG)的野生型AMG；

-来自SEQ ID NO:12的罗素青霉(Penicillium russellii)(PrAMG)的野生型AMG；以及

-来自SEQ ID NO:9的格拉青霉菌(Penicillium glabrum)(PgAMG)的野生型AMG。

具体实施方式

定义

根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

在整个本文件中，以范围形式表达的值应以灵活的方式解释为不仅包括明确列举为范围界限的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有单独数值或子范围，如同明确列举每个数值和子范围。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且还包括在所示范围内的单独值(例如1％、2％、3％和4％)和子范围(例如0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另有说明，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，陈述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义，除非另有说明。

除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

醛糖还原酶：术语“醛糖还原酶”或“AR”被分类为E.C.1.1.1.21，并且意指催化L-阿拉伯糖转化为L-阿拉伯糖醇的酶。一些醛糖还原酶基因可以是非特异性的并且对D-木糖具有产生木糖醇的活性(AKA，D-木糖还原酶；分类为E.C.1.1.1.307)。可以使用本领域已知的方法(例如，Kuhn,等人,1995,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]61(4),1580-1585)来确定醛糖还原酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

L-阿拉伯糖醇脱氢酶：术语“L-阿拉伯糖醇脱氢酶”或“LAD”被分类为E.C.1.1.1.12，并且意指催化L-阿拉伯糖醇转化为L-木酮糖的酶。可以使用本领域已知的方法(例如，如在美国专利7,527,951中所述的)来确定L-阿拉伯糖醇脱氢酶活性。

α-淀粉酶：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。

辅助活性9多肽(早先命名为GH61)：术语“辅助活性9多肽”或“AA9多肽”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人,2011,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)。根据Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316以及Henrissat和Bairoch,1996,Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。

AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中与不具有纤维素分解增强活性的相等的总蛋白加载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)相比，总蛋白由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w AA9多肽蛋白组成，在适合的温度(例如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(例如，4-9，例如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续1-7天。

可以使用CELLUCLAST^TM1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S)，巴格斯瓦德

丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来确定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一个方面，β-葡糖苷酶是米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(例如，根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一方面，β-葡糖苷酶是烟曲霉(Aspergillusfumigatus)β-葡糖苷酶(例如，如WO 02/095014中所述的，在米曲霉中重组产生的)。

AA9多肽增强活性还可以通过以下来确定：在40℃，将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO₄、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶，以及0.01％

X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小时，随后确定从PASC释放的葡萄糖。

还可以根据WO 2013/028928确定高温组合物的AA9多肽增强活性。

AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

根据WO 2008/151043或WO 2012/122518，AA9多肽也可以在可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。

该AA9多肽可以在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料或半纤维素材料(如预处理的玉米秸杆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。

家族61糖苷水解酶(现在称为AA9)：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases[更新糖基水解酶的基于序列的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。

β-葡聚糖酶：术语“β-葡聚糖酶”涵盖需要使用内切β-葡聚糖酶(例如EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(例如EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(例如EC 3.2.1.21)将纤维素水解为葡萄糖的多肽。β-葡聚糖酶的亚组(也称为地衣多糖酶(或地衣聚糖酶)(EC3.2.1.73)可用于催化β-1,4-糖苷键的水解以产生β-葡聚糖。地衣多糖酶(或地衣聚糖酶)(例如EC 3.2.1.73)水解含有(1,3)-和(1,4)-键的β-D-葡聚糖中的(1,4)-β-D-糖苷键，并且可以作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含有1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。其他β-葡聚糖酶(例如EC 3.2.1.4)可以例如在纤维素、地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖中进行(1,4)-β-D-糖苷键的内水解，并且还将水解在含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包括50％-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度(例如，50℃、55℃、或60℃)以及pH(例如，5.0或5.5)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白加载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)相比较。在一方面，将在2％-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，重组产生于米曲霉中)或2％-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所描述中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白加载的存在下的

1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦德/>

丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据Venturi等人,2002,Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties[来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：生产、纯化和一些生化特性],J.Basic Microbiol[基础微生物学杂志].42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％

20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。可以在含有0.01％

20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％/>

20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

结合模块：术语“碳水化合物结合模块”意指提供碳水化合物结合活性的碳水化合物活性酶内的区域(Boraston等人,2004,Biochem.J.[生物化学杂志]383:769-781)。大多数已知的碳水化合物结合模块(CBM)是具有离散折叠的连续氨基酸序列。碳水化合物结合模块(CBM)典型地发现于酶的N-末端处或C-末端的端点处。已知一些CBM具有针对纤维素的特异性。本发明的碳水化合物结合模块具有纤维素结合(A型)特异性。

过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6)，该酶催化2H₂O₂转化为O₂+2H₂O。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025确定过氧化氢酶活性。一个单位的过氧化氢酶活性等于在测定条件下催化1微摩尔的过氧化氢氧化的酶的量。

催化结构域：术语“催化结构域”意指含有酶的催化机构的该酶的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含有β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases[结晶纤维素降解:纤维生物水解酶功能的新见解],Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？[里氏木霉纤维生物水解酶:为什么对结晶纤维素如此有效],Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会学报]26:173-178)。

根据以下文献描述的程序测定纤维二糖水解酶活性：Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；van Tilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],170:575-581。在本发明中，Tomme等人的方法可以用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶、纤维素分解组合物、或纤维素酶：纤维素分解酶、纤维素分解组合物、或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”、“纤维素分解组合物”、或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略],2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将Whatman№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure andApplied Chemistry)(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities[纤维素酶活性的测量],Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)确立的。

通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(“PCS”)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过

HPX-87H柱(美国加州赫拉克勒斯伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA))进行糖分析。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG、或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG、或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

对应于：如本文所用的术语“对应于”是指确定序列中的特定氨基酸(其中参考了特定氨基酸序列)的方式。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如SEQ ID NO:3所示的序列或本文列出的任何其他序列的比对。可使用可替代的比对方法，并且这些方法为本领域技术人员所熟知。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材(wood)中。纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑),第105-118页,Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区；Wyman,1994,Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人,1999,Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics[木质纤维素的生物转化的最近进展],Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展],T.Scheper主编,第65卷,第23-40页,Springer-Verlag,New York[纽约斯普林格出版社])。在本文中应理解的是，纤维素可为任何形式的木质纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一方面，纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包含纤维素、半纤维素、以及木质素。

破坏：术语“破坏”意指参照基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术来测量破坏的效果，例如使用本文引用的无细胞提取物测量来检测酶活性的缺乏或降低；或通过相应的mRNA的缺失或降低(例如降低至少25％、降低至少50％、降低至少60％、降低至少70％、降低至少80％、或降低至少90％)；具有酶活性的相应多肽的量的缺失或降低(例如降低至少25％、降低至少50％、降低至少60％、降低至少70％、降低至少80％、或降低至少90％)；或具有酶活性的相应多肽的特定活性的缺失或降低(例如降低至少25％、降低至少50％、降低至少60％、降低至少70％、降低至少80％、或降低至少90％)。可以通过本领域已知的方法破坏特定的目的基因，例如通过定向同源重组(参见Methods in Yeast Genetics[酵母遗传学方法](1997版),Adams,Gottschling,Kaiser,和Stems,冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press)(1998))。

内源基因：术语“内源基因”意指对参考宿主细胞而言天然的基因。“内源基因表达”意指内源基因的表达。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。

可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接到提供用于其表达的控制序列。

片段：如本文所用的术语“片段”是指在本文披露的任何一个亲本序列(如SEQ IDNO:1-13)的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO:1-13的至少200个连续氨基酸残基，例如SEQ ID NO:1-13的至少300个连续氨基酸残基、或至少350个连续氨基酸残基、或至少400个连续氨基酸残基、或至少450个连续氨基酸残基。

可发酵的培养基：术语“可发酵的培养基”或“发酵培养基”是指包含一种或多种(例如，两种、几种)糖的培养基，如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖，其中该培养基能够部分地被宿主细胞转化(发酵)为希望的产物，如乙醇。在某些情况下，发酵培养基衍生自天然来源，如甘蔗、淀粉、或纤维素。术语发酵培养基在本文理解为指在添加发酵生物之前的介质，例如，由糖化过程产生的介质，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的介质。

融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端融合的多肽。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的酶。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃、pH 4.3、底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种酶。参见例如，Shallom和Shoham,2003,CurrentOpinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、和木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和直链多糖的异质性组，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，从而将它们交联成稳健的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性，可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步分组为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最详实和最新的分类。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.[理论与应用化学]59:1739-1752，在适宜温度例如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃，以及适宜pH例如4-9，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0。

异源：对于宿主细胞，术语“异源的”意指多肽或核酸不是天然存在于宿主细胞中。对于多肽或核酸，术语“异源”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子或结构域)不与该多肽或核酸天然地相关联，即，控制序列是来自编码变体的基因以外的基因。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指其中引入了包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的任何微生物或植物细胞。引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导。在一些实施例中，宿主细胞是分离的重组宿主细胞，其与至少一种其他组分(包括但不限于蛋白质、核酸、细胞等)部分或完全分离。

异源多核苷酸：术语“异源多核苷酸”在本文定义为对宿主细胞不是天然的多核苷酸；天然多核苷酸，其中对编码区已进行了结构修饰；天然多核苷酸，其表达由于通过重组DNA技术(例如不同的(外源)启动子)操纵DNA而被定量改变；或宿主细胞中的天然多核苷酸，该宿主细胞具有该多核苷酸的一个或多个额外拷贝以定量改变表达。“异源基因”是包含异源多核苷酸的基因。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

杂合多肽：术语“杂合多肽”意指包含来自两个或更多个多肽的结构域的多肽，例如，来自一个多肽的结合模块和来自另一个多肽的催化结构域。结构域可以在N-末端或C-末端融合。

杂交：术语“杂交”意指使用标准DNA印迹程序将核酸的基本上互补的链配对。杂交可以在中、中-高、高或非常高严格条件下进行。中严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在55℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件意指在42℃，于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在60℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。高严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在65℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。非常高严格条件意指在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在70℃使用0.2X SSC、0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关联的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因天然相关联的启动子强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵培养液样品中。

改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于改进的热稳定性。

非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPN)：本文将术语“非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶”、“NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶”或“GAPN”定义为催化甘油醛-3-磷酸和NADP+至3-磷酸甘油酸和NADPH的化学反应的酶(例如，EC 1.2.1.9)。可以从如在本领域所述的无细胞提取物中确定GAPN活性，例如，如在Tamoi等人1996,Biochem.J.[生物化学杂志]316,685-690中描述的。例如，可以通过在反应混合物中监测在NADPH氧化后340nm处的吸光度变化而用分光光度计测量GAPN活性，该反应混合物含有100mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)、10mM MgCl₂、10mM GSH、5mM ATP、0.2mM NADPH、2个单位的3-磷酸甘油酸磷酸激酶、2mM 3-磷酸甘油酸以及酶。

磷脂酶：术语“磷脂酶”是指催化磷脂转化为脂肪酸和其他亲脂性物质的酶，例如磷脂酶A(EC号3.1.1.4、3.1.1.5和3.1.1.32)或磷脂酶C(EC号3.1.4.3和3.1.4.11)。磷脂酶活性可以使用本领域已知的活性测定来确定。

普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性的淀粉去分支酶(EC 3.2.1.41)，其催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，普鲁兰酶活性可以根据WO 2016/087237中所述的PHADEBAS测定或甘薯淀粉测定来测定。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有生物学活性的多肽，其在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式。成熟多肽序列缺乏信号序列，其可以使用本领域已知的技术来测定(参见，例如Zhang和Henzel,2004,Protein Science[蛋白质科学]13:2819-2824)。术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

天然的：术语“天然的”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经过密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，组合物富集了分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

亲本或亲本葡糖淀粉酶：如本文所用的术语“亲本”葡糖淀粉酶意指进行修饰以产生本发明的变体葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶。该术语还指本发明的变体与之进行比较的多肽。亲本可以是天然存在(野生型)多肽，或者它可以甚至是通过任何适合的手段制备的其变体。例如，亲本蛋白质可以是在氨基酸序列方面已经进行过修饰或改变的天然存在多肽的变体。因此，亲本葡糖淀粉酶可具有一个或多个(或一个或几个)氨基酸取代、缺失和/或插入。因此，亲本葡糖淀粉酶可以是亲本葡糖淀粉酶的变体。亲本也可以是等位基因变体，其是由占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种编码的多肽。如本文所用的术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”是指SEQ ID NO:SEQ ID NO:1-13的α-淀粉酶，或与SEQ ID NO:1-13中的任一多肽具有至少60％序列同一性的任何α-淀粉酶。亲本淀粉酶也可以是包含SEQ ID NO:1-13的片段的多肽。亲本可以是细菌或真菌葡糖淀粉酶，优选地真菌葡糖淀粉酶。在一个方面，亲本真菌葡糖淀粉酶可以是青霉属葡糖淀粉酶，例如像，草酸青霉菌葡糖淀粉酶，格拉青霉菌(Penicillium glabrum)葡糖淀粉酶，巴西青霉(Penicillium brasilianum)葡糖淀粉酶，罗素青霉葡糖淀粉酶，密钦斯基青霉菌葡糖淀粉酶。

活性戊糖发酵途径：如本文所用，具有“活性戊糖发酵途径”的宿主细胞或发酵生物以足够从戊糖生产发酵产物(例如，乙醇)的量生产催化代谢途径的每个反应所必需的活性酶，并且因此当在戊糖的存在下、在发酵条件下培养时，该宿主细胞或发酵生物能够以可测量的产率生产发酵产物。具有活性戊糖发酵途径的宿主细胞或发酵生物包含一种或多种活性戊糖发酵途径基因。如本文所用的“戊糖发酵途径基因”是指编码涉及活性戊糖发酵途径的酶的基因。在一些实施例中，活性戊糖发酵途径是“活性木糖发酵途径”(即，从木糖生产发酵产物，如乙醇)或“活性阿拉伯糖发酵途径(即，从阿拉伯糖生产发酵产物，如乙醇)。

如本文更加详细地描述，催化活性戊糖发酵途径中的每个反应所必需的活性酶可以来自内源基因表达的活性、异源基因表达的活性、或来自内源基因和异源基因表达的活性的组合。

预处理的玉米秸秆：术语“预处理的玉米秸秆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸秆得到的含纤维素材料。

蛋白酶：术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，包括分别出版于以下中的增刊1-5：Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]223:1-5(1994)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]232:1-6(1995)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]237:1-5(1996)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]250:1-6(1997)；和Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]264:610-650(1999)。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,1991,Protein Engng.[蛋白质工程]4:719-737和Siezen等人,1997,ProteinScience[蛋白质科学]6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶(外肽酶)或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。

在特定实施例中，用于在本发明的方法中使用的蛋白酶选自由以下组成的组：

(a)属于EC 3.4.24金属内肽酶的蛋白酶；

(b)属于上述手册的M组的金属蛋白酶；

(c)尚未指定宗族的金属蛋白酶(指定：宗族MX)，或属于宗族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中任一种的金属蛋白酶(如上述手册的第989-991页所定义的)；

(d)其他家族的金属蛋白酶(如上述手册的第1448-1452页所定义的)；

(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；

(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；

(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中任一种的金属蛋白酶(如上述手册的第1448-1452页所定义的)；以及

(h)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册的第1492-1495页所定义的)。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC 3.4)。存在几种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的Anson和Mirsky方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶进行测定孵育后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量作为蛋白酶活性的量度(Anson,M.L.和Mirsky,A.E.，1932，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]16:59以及Anson,M.L.，1938，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]22:79)。

重组：当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”意指已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白与天然序列的差异可以在于一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。

淀粉结合结构域：术语“淀粉结合结构域(SBD)或碳水化合物结合模块(CBM)”在本文中可互换使用。SBD可分为九个CBM家族。作为能源来源，淀粉被大量各种淀粉分解酶降解。然而，这些淀粉分解酶中只有约10％能够结合和降解生淀粉。这些酶通常具有称为淀粉结合结构域的独特序列结构模块，该淀粉结合结构域介导与淀粉颗粒的附接。SBD是指优先与淀粉(多糖)底物或麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精等结合的氨基酸序列。它们通常是在约10％的微生物淀粉分解酶中发现的约100个氨基酸残基的基序。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德勒曼–翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用–nobrief选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德勒曼–翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用–nobrief选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的片段。

信号肽：术语“信号肽”在本文中定义为以符合阅读框的方式连接(融合)至具有生物活性的多肽的氨基末端且指导该多肽进入细胞的分泌途径的肽。信号序列可以使用本领域已知的技术来测定(参见，例如，Zhang和Henzel,2004,Protein Science[蛋白质科学]13:2819-2824)。

海藻糖酶：术语“海藻糖酶”意指将海藻糖降解成其单元单糖(即，葡萄糖)的酶。将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC。3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(Nomenclature Committee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”上。海藻糖酶是催化如下反应的酶：

EC 3.2.1.28：

EC 3.2.1.93:

出于本发明的目的，海藻糖酶活性可根据以下所述的海藻糖酶测定程序测定。

原理：

T＝37℃,pH＝5.7,A340nm,光路＝1cm

光度法停止率测定(Spectrophotometric Stop Rate Determination)

单位定义：

在pH 5.7，在37℃，一个单位每分钟将1.0毫摩尔的海藻糖转化为2.0毫摩尔的葡萄糖(在pH 7.5，测定的释放的葡萄糖)。

(参见Dahlqvist,A.(1968)Analytical Biochemistry 22,99-107)

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃，于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

变体：术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，几个)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1-13的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的葡糖淀粉酶活性。

野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由在自然界中发现的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的葡糖淀粉酶。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％

X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。

木糖醇脱氢酶：术语“木糖醇脱氢酶”或“XDH”(AKA D-木酮糖还原酶)被分类为E.C.1.1.1.9，并且意指催化木糖醇转化为D-木酮糖的酶。可以使用本领域已知的方法(例如，Richard等人,1999,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]457,135-138)来确定木糖醇脱氢酶活性。

木糖异构酶：术语“木糖异构酶”或“XI”意指可以在体内将D-木糖催化为D-木酮糖，并且在体外将D-葡萄糖转化为D-果糖的酶。木糖异构酶也称为“葡萄糖异构酶”，并且被分类为E.C.5.3.1.5。由于该酶的结构非常稳定，因此木糖异构酶是研究蛋白质结构和功能之间关系的良好模型(Karimaki等人,Protein Eng Des Sel[蛋白质工程、设计与选择],12004,17(12):861-869)。木糖异构酶活性可以使用本领域已知的技术来测定(例如，使用D-山梨醇脱氢酶的偶联酶测定法，如Verhoeven等人,2017,Sci Rep[科学报告]7,46155所述)。

木酮糖激酶：术语“木酮糖激酶”或“XK”被分类为E.C.2.7.1.17，并且意指催化D-木酮糖转化为D-木酮糖5-磷酸的酶。可以使用本领域已知的方法(例如，Richard等人,2000,FEBS Microbiol.Letters[欧洲微生物学会联合会微生物学快报]190,39-43)来确定木酮糖激酶活性。

L-木酮糖还原酶：术语“L-木酮糖还原酶”或“LXR”被分类为E.D.1.1.1.10，并且意指催化L-木酮糖转化为木糖醇的酶。可以使用本领域已知的方法(例如，如在美国专利7,527,951中所述的)来确定L-木酮糖还原酶活性。

本文提及“约”值或参数包括指向该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括实施例“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该特定数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。

同样，提及“衍生自”另一个基因或多肽X的基因或多肽包括该基因或多肽X。

如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一种/个(a/an)”、“或”以及“该/这些(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚表明。

应该理解的是本文所述的实施例包括“由……实施例组成”和/或“基本由……实施例组成”。如本文所用，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除各种实施例中存在或加入了其他特征。

命名法

出于本发明的目的，命名[Y/F]意指在此位置的氨基酸可以是酪氨酸(Try，Y)或苯丙氨酸(Phe，F)。同样，命名法[V/G/A/I]意指在此位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如本文所述的其他组合，依次类推。除非另外指出，否则氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。

变体命名惯例

出于本发明的目的，在SEQ ID NO:1中披露的多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中对应的氨基酸残基。因此，所有提及的位置和特定取代均指SEQ ID NO:1中使用的编号。然而，本领域技术人员将认识到，也可以使用在本文披露的任何其他序列的序列来确定另一种葡糖淀粉酶多肽中的相应氨基酸残基。另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德勒曼–翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于在SEQ ID No:1中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS包(EMBOSS：The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序诸如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、^*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多个改变.包含多个改变的变体通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170处和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同改变通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

葡糖淀粉酶变体

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，并且其中所述变体与SEQ IDNO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，并且其中所述变体与SEQID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、568、594，并且其中所述变体与SEQ IDNO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

在一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的亲本葡糖淀粉酶相比，该葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性。

本发明涉及具有一个或多个取代的葡糖淀粉酶变体，这些变体具有改善的特性，例如改善的(增加的)热稳定性。

在另一个实施例中，变体与亲本多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，取代的氨基酸残基与该位置处天然存在的氨基酸残基不同。在一个实施例中，取代选自由以下组成的组：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y，条件是该取代的氨基酸残基与该位置处天然存在的氨基酸残基不同。

在一个方面，取代的数目是1-50，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个取代。

上面提及的具有取代的变体应该被理解为涵盖在指定的位置的一个或多个取代的所有可能的组合。

本发明提供了葡糖淀粉酶变体，这些变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的两个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的三个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的四个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的五个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的六个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的七个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的八个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的九个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十一个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十二个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十三个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十四个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十五个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十六个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十七个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的十八个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于以下位置的每个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置6的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置6的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代G6S，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置7的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置7的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Thr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代G7T，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置11的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置11的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Phe取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P11F，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置31的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置31的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Phe取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代R31F，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置34的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置34的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Tyr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代K34Y，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置50的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置50的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Arg取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代E50R，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置75的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置75的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Asn或Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代D75N或D75S，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置77的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置77的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Asp或Gly取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代R77D或R77G，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置78的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置78的位置处的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Gln或Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代A78Q或A78W，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置79的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置79的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，优选地被Asp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代V79D，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置80的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置80的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Tyr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F80Y，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置103的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置103的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Asn取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代S103N，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置105的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置105的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Glu或Leu取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代S105E或S105L，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置107的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置107的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Leu取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P107L，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置110的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置110的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，优选地被Trp取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代T110W，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置132的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置132的位置处的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Pro或Arg取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代A132P或A132R，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置135的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置135的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代R135S，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置138的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置138的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Gly或Leu或Pro取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代R138G或R138L或R138P，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置379的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置379的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代S379P，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置445的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置445的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Asn取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代D445N，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置447的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置447的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，优选地被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代V447S，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置481的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置481的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代S481P，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置484的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代T484P，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置501的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置501的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Ala或Leu或Val取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代E501A或E501L或E501V，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置504的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置504的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，优选地被Thr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代Y504T，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置539的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置539的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代N539P，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置566的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置566的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Thr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代D566T，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置568的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置568的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val，优选地被Val取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代T568V，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置592的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置592的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，优选地被Thr取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代V592T，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置594的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置594的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Arg取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代Q594R，或由其组成。

在另一方面，变体在对应于SEQ ID NO:1的位置595的位置处包含取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置595的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选地被Ser取代。在另一方面，变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F595S，或由其组成。

变体可以进一步在一个或多个(例如，几个)其他位置处包含一个或多个另外的取代。

在一个方面，变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个方面，本发明的葡糖淀粉酶变体相对于亲本多肽具有改善的特性，其中该改善的特性选自由以下组成的组：增加的催化效率、增加的催化速率、增加的化学稳定性、增加的氧化稳定性、增加的pH活性、增加的pH稳定性、增加的比活性、储存条件下增加的稳定性、增加的底物结合、增加的底物切割、增加的底物特异性、增加的底物稳定性、增加的表面特性、增加的热活性和增加的热稳定性。

在一个方面，本发明的葡糖淀粉酶变体相对于所述亲本多肽具有改善的特性。

在一个方面，本发明的葡糖淀粉酶变体相对于所述亲本多肽具有改善的特性，并且其中所述改善的特性是增加的热稳定性。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体相对于亲本葡糖淀粉酶具有改善的(增加的)热稳定性。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4具有改善的(增加的)热稳定性。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体具有增加的热稳定性，该增加的热稳定性使用TSA测量为增加的解链温度。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体相对于SEQ ID NO:4具有增加的热稳定性，该增加的热稳定性使用TSA测量为至少0.1℃、至少0.2℃、至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.7℃、至少0.8℃、至少0.9℃、至少1℃、至少1.5℃、至少2℃、至少2.5℃、至少3℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃或至少5℃或至少5.5℃或至少6℃、或至少6.5℃或至少7℃或至少7.5℃、或至少8℃、或至少8.5℃、或至少9℃、或至少9.5℃或至少9.9℃的增加的解链温度。

在一个方面，与所述亲本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶变体在91℃下具有至少150，优选地至少200，更优选地至少250，最优选地至少300的相对活性。

在一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

i.D75N+R77D+A78Q；

ii.D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y；

iii.K34Y+S103N；

iv.K34Y+D445N+V447S；

v.K34Y+Y504T；

vi.S103N+D445N+V447S；

vii.S103N+Y504T；

viii.D445N+V447S+Y504T；

ix.K34Y+S103N+D445N+V447S；

x.K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T；

xi.K34Y+S103N+Y504T；

xii.K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T；

xiii.K34Y+S103N+Q594R+F595S；

xiv.K34Y+S103N+Y504T+Q594R+F595S；

xv.K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

xvi.S105L；

xvii.S105E；

xviii.A132R；

xix.K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

xx.K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

xxi.K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

xxii.K34Y+S103N+S105L+Y504T D566T Q594R F595S；

xxiii.K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxiv.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxv.K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S；

xxvi.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxvii.K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxviii.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T；

xxix.G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxx.K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxxi.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxxii.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S；

xxxiii.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxxiv.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xxxv.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xxxvi.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

xxxvii.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xxxviii.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xxxix.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xl.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xli.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T；

xlii.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xliii.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xliv.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xlv.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xlvi.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xlvii.K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

xlviii.G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

xlix.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

l.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

li.R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

lii.K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

liii.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S；

liv.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lv.K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

lvi.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

lvii.R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

lviii.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

lix.R135S；

lx.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxi.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxii.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxiii.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxiv.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxv.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxvi.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

lxvii.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；+G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

氨基酸改变可以是具有微小性质的，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

替代性地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学特性改变的这样一种性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

亲本葡糖淀粉酶

亲本葡糖淀粉酶可以是多肽，其中所述变体与SEQ ID No:1-13中的任一种多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:1的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:1的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:2的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:2的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:3的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:3的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:4的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:4的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:5的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:5的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:6的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:6的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:7的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:7的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:8的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:8的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:9的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:9的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:10的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:10的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:11的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:11的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:12的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:12的多肽的等位基因变体。

在一个实施例中，亲本与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％序列同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个实施例中，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:13的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施例中，亲本包含SEQ ID NO:13的多肽，或由其组成。在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:13的多肽的等位基因变体。

在另一方面，亲本由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)成熟多肽编码序列、或(ii)(i)或(ii)的全长互补序列杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约)。

可以使用多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:1的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的亲本的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与亲本或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用运载体材料。

多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

在一个特定实施例中，这一杂交多肽包括融合到一个接头和一个碳水化合物结合域上的变体葡糖淀粉酶催化域。

亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文中与给定来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，亲本是胞外分泌的。

在一个方面，亲本真菌葡糖淀粉酶可以是青霉属葡糖淀粉酶，例如像，草酸青霉菌葡糖淀粉酶，格拉青霉菌葡糖淀粉酶，巴西青霉葡糖淀粉酶，罗素青霉葡糖淀粉酶，密钦斯基青霉菌葡糖淀粉酶。

在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:1的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:4的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:5的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:6的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:7的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是草酸青霉菌，例如，SEQ ID NO:8的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是格拉青霉菌，例如，SEQ ID NO:9的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是巴西青霉，例如，SEQ ID NO:10的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是罗素青霉，例如，SEQID NO:11的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是罗素青霉，例如，SEQ ID NO:12的葡糖淀粉酶。在另一方面，亲本是密钦斯基青霉，例如，SEQ ID NO:13的葡糖淀粉酶。

应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段以及其他分类学等同物，例如无性型，而与它们已知的物种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上探针，从其他来源(包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得的DNA样品)中鉴定亲本并获得亲本。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备葡糖淀粉酶变体。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，几个)突变的技术。

通过涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。

可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序做出单氨基酸或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的多核苷酸。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。多核苷酸可从木霉属、蜡蚧菌属、拟青霉属、曲霉属、棒囊菌属、端梗孢属、枝霉属、碳垫菌属、篮状菌属、Collariella、硬孔菌属和/或Loramyces的菌株或相关生物体中克隆，因此，例如，可以是多核苷酸的多肽编码区的种类变体。

编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以如下构建变体：基于作为成熟多肽编码序列(例如，其子序列)所提出的多核苷酸，和/或通过引入核苷酸取代，这些核苷酸取代不导致多肽的氨基酸序列变化，但是对应于旨在用于产生酶的宿主生物的密码子使用，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,1991,Protein Expression and Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。

可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是期望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即多核苷酸，其由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于以下文献中：Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明多核苷酸的转录的适合的启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。

酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，该前导序列是对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下的基因中获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对于该编码序列是异源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要异源信号肽编码序列。可替代地，异源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiol.Rev.[微生物评论]57:109-137描述。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可能希望的是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节序列的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是使基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。替代性地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。替代性地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于在木霉属(Trichoderma)细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。替代性地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在一种或多种葡糖淀粉酶变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

在一些实施例中，多肽与重组宿主细胞是异源的。

在一些实施例中，一个或多个控制序列中的至少一个与编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的多核苷酸是异源的。

在一些实施例中，重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个或五个。

宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何微生物或植物细胞，例如原核细胞或真菌细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶状微生物学(布拉格)]49：399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171：3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]98：6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉胞菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管霉(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑根毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括(a)在有益于产生该一种或多种葡糖淀粉酶变体的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该一种或多种葡糖淀粉酶变体；以及任选地，(b)回收该一种或多种葡糖淀粉酶变体。

在一个方面，细胞是木霉属、蜡蚧菌属、拟青霉属、曲霉属、棒囊菌属、端梗孢属、枝霉属、碳垫菌属、篮状菌属、Collariella、硬孔菌属、Loramyces、镰孢属、壁孔孢属、粘鞭霉属、Albifimbria、Rasamsonia、半内果菌属和/或枝顶孢属细胞。在另一方面，细胞是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、里氏木霉、长孢木霉(Trichoderma longipile)、拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、弯梗木霉(Trichoderma sinuosum)、Lecanicilliumprimulinum、Simplicillium lameillicola、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、文氏曲霉(Aspergillus wentii)、Cornyascus sepedonium、梭孢端梗孢(Acrophialophorafusispora)、喙枝孢属(Rhinocladiella sp.)、Nemania serpens、雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)、Collariella virescens、硬孔菌属物种(Rhinocladiellasp.)74222、和/或Loramyces macrosporus、茄病镰孢菌(Fusarium solani)、土生孔球孢(Gilmaniella humicola)、Gliomastix murorum、疣孢漆斑菌(Albifimbria verrucaria)、丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、膨半内果菌(Hamigera inflata)和/或小枝顶孢(Acremonium exiguum)细胞。

本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该多肽。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养使用本领域中已知的程序，在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中发生。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对变体特异的方法检测该变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。

可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水作用色谱法、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版社],纽约,1989)。

在替代性的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

葡糖淀粉酶变体颗粒

本发明还涉及包含本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的酶颗粒/粒子。在实施例中，颗粒包含核心以及任选地包围该核心的一种或多种包衣(外层)。

核心的直径(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

在实施例中，核心包含本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体。在实施例中，核心包含一种或多种具有本发明的葡糖淀粉酶变体的多肽。在实施例中，核心包含一种或多种具有葡糖淀粉酶变体的多肽和/或一种或多种具有本发明的葡糖淀粉酶变体的多肽。

核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。

核心可以包括黏合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。

核心典型地作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。

核心可以包括惰性粒子，其中酶被吸附到该惰性粒子之内，或者被施加(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。

该核心的直径可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

核心可以被至少一种包衣包围，例如以改善储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。一个或多个任选的包衣可以包括盐包衣、或其他合适的包衣材料，如聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)以及聚乙烯醇(PVA)。

可以将包衣按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％或至少15％)的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。

包衣优选地是至少0.1μm厚，特别是至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在一些实施例中，包衣的厚度低于100μm，例如低于60μm或低于40μm。

包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封/封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。

包衣可以进一步含有其他本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或黏合剂，如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

盐包衣可以包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

为了提供可接受的保护，盐包衣优选地是至少0.1μm厚，例如至少0.5μm、至少1μm、至少2μm、至少4μm、至少5μm或至少8μm。在特定的实施例中，盐包衣的厚度低于100μm，例如低于60μm或低于40μm。

盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中这些细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。

盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。

盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(小于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，特别是超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。盐包衣可以如WO00/01793或WO 2006/034710中所述。

合适的盐的特定实例是NaCl(CH_20℃＝76％)、Na₂CO₃(CH_20℃＝92％)、NaNO₃(CH_20℃＝73％)、Na₂HPO₄(CH_20℃＝95％)、Na₃PO₄(CH_25℃＝92％)、NH₄Cl(CH_20℃＝79.5％)、(NH₄)₂HPO₄(CH_20℃＝93,0％)、NH₄H₂PO₄(CH_20℃＝93.1％)、(NH₄)₂SO₄(CH_20℃＝81.1％)、KCl(CH_20℃＝85％)、K₂HPO₄(CH_20℃＝92％)、KH₂PO₄(CH_20℃＝96.5％)、KNO₃(CH_20℃＝93.5％)、Na₂SO₄(CH_20℃＝93％)、K₂SO₄(CH_20℃＝98％)、KHSO₄(CH_20℃＝86％)、MgSO₄(CH_20℃＝90％)、ZnSO₄(CH_20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH_25℃＝86％)。其他实例包括NaH₂PO₄、(NH₄)H₂PO₄、CuSO₄、Mg(NO₃)₂和乙酸镁。

盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。特定实例包括无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)、七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)、七水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)、六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂(6H₂O))、二水柠檬酸钠和四水乙酸镁。

优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。

包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。合适的用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。

颗粒可以任选地具有一种或多种另外的包衣。适合的包衣材料的实例是聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)以及聚乙烯醇(PVA)。具有多种包衣的酶颗粒的实例描述于WO 93/07263和WO 97/23606中。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。

用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：

(a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含酶的微粒状材料。非常小的粒子可以通过这种方式产生(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant ScienceSeries[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司])。

(b)层状产品，其中酶在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液典型地在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有希望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有希望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于，例如，WO 97/23606中。

(c)吸收的核心粒子，其中不是将该酶在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。

(d)挤出或丸粒化的产品，其中将含酶糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些丸粒。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司])。

(e)颗粒化的产品，其中含酶粉末悬浮于熔化的蜡中并且例如通过转盘喷雾器将悬浮液喷洒到冷却室中，在此液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdereddetergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司])。所获得的产品是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产品。美国专利号4,016,040和4,713,245描述了这项技术。

(f)混合器造粒产品，其中将含酶液体添加至常用造粒组分的干燥粉末组合物中。将液体和粉末以适合的比例混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。这样的方法描述于美国专利号4,106,991和相关文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在此方法的特定产品中，各种高剪切混合器可以用作造粒机。将由酶、填料和黏合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granulate)。经强化的粒子更加坚固，并释放更少的酶粉尘。

(g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小在Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]中描述。

(h)流化床造粒。流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流体化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着到其上以形成颗粒。

(i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用在饲料或酶工业中用于干燥颗粒的其他已知的方法。干燥优选地在从25℃至90℃的产品温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在用盐包衣之前含有少量的水。如果在过量水去除之前水敏性酶被盐包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心优选地含有0.1-10％w/w的水。

可以产生无粉尘颗粒，例如如美国专利号4,106,991和4,661,452中所披露，并且这些颗粒可以任选地通过本领域已知的方法来包衣。

颗粒可以进一步一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com公开内容IPCOM000200739D中。

通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露于WO 2013/188331中。

本发明还涉及根据EP 238,216中披露的方法制备的受保护的酶。

在实施例中，颗粒进一步包含一种或多种另外的酶，例如，水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。该一种或多种另外的酶优选地选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

液体配制品

本发明还涉及包含本发明的葡糖淀粉酶变体的液体组合物。该组合物可包含酶稳定剂(酶稳定剂的实例包括多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸))。

在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种运载体材料以增加此类组合物的体积。适合的填料或运载体材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的适合的填料或运载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5％至约90％的此类材料。

在一个方面，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；以及

(B)水。

在一个方面，本发明涉及液体配制品，其包含：

(B)水。

在一个方面，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的一种或多种葡糖淀粉酶变体和/或一种或多种具有本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的多肽；以及

(B)水。

在另一个实施例中，该液体配制品包含20％至80％w/w的多元醇。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；

(B)20％至80％w/w的多元醇；

(C)任选地0.001％至2.0％w/w的防腐剂；以及

(D)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；

(B)20％至80％w/w的多元醇；

(C)任选地0.001％至2.0％w/w的防腐剂；以及

(D)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的一种或多种葡糖淀粉酶变体和/或本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；

(B)20％至80％w/w的多元醇；

(C)任选地0.001％至2.0％w/w的防腐剂；以及

(D)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；

(B)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；

(C)任选地20％至80％w/w的多元醇；以及

(D)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(A)0.001％至25％w/w的本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体；

(B)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；

(C)任选地20％至80％w/w的多元醇；以及

(D)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(B)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；

(C)任选地20％至80％w/w的多元醇；以及

(D)水。

在另一个实施例中，液体配制品包含一种或多种配制剂，例如选自下组的配制剂，该组由以下组成：多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自由以下组成的组：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。在一个实施例中，多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。

在另一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。

在另一个实施例中，防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，例如，0.05％至1.0％w/w防腐剂、或0.1％至0.5％w/w防腐剂。在一个实施例中，液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，例如，0.02％至1.5％w/w防腐剂、0.05％至1.0％w/w防腐剂、或0.1％至0.5％w/w防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

在另一个实施例中，液体配制品还包含一种或多种另外的酶，例如，水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。该一种或多种另外的酶优选地选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液配制品或细胞组合物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文所用的术语“发酵液”是指由细胞发酵生产的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，生产发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一些实施例中，发酵液配制品或细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一些实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一个方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一些实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)在蛋白质合成的碳限制条件下孵育生长到饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

用途

本发明的一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于使用发酵生物如酵母(例如，酵母属的菌株，如酿酒酵母)从糊化的含淀粉材料生产发酵产物如乙醇的用途。

本发明的一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于使用发酵生物如酵母(例如，酵母属的菌株，如酿酒酵母)从未糊化的含淀粉材料生产发酵产物如乙醇的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于使用发酵生物如酵母(例如，酵母属的菌株，如酿酒酵母)从含纤维素材料生产发酵产物如乙醇的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于液化含淀粉材料的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于糖化含淀粉材料的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的葡糖淀粉酶变体用于糖化含纤维素材料的用途。

本发明的工艺

用于从未糊化的含淀粉材料生产发酵产物的工艺。

本发明涉及用于在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的工艺(通常被称为“生淀粉水解”工艺)。可在不使包括含淀粉材料和水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物(例如乙醇)。在一个实施例中，本发明的工艺包括在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和一种或多种产碳水化合物源的酶的存在下将(例如，研磨的)含淀粉材料(例如，颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的糖。在这一实施例中，所需发酵产物(例如，乙醇)是从未糊化的(即，未蒸煮的)、优选经碾磨的谷粒(例如玉米)中产生的。

用于从含淀粉材料生产发酵产物的工艺可包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物，在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，在本发明的α-淀粉酶的存在下将所述含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。

在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物(优选乙醇)的工艺，这些工艺包括以下步骤：

i)使用产碳水化合物源的酶，在低于初始糊化温度的温度下，将含淀粉材料糖化；以及

ii)使用发酵生物进行发酵；

其中至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加。

在一些实施例中，至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种葡糖淀粉酶变体在糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。

在用于从含淀粉材料生产发酵产物的上述工艺中存在或添加的一种或多种葡糖淀粉酶变体可以在糖化、发酵或同时糖化和发酵期间作为单组分、作为包含一种或多种葡糖淀粉酶变体的酶共混物或组合物外源地添加，和/或通过发酵生物、例如本文所述的重组宿主细胞或发酵生物(例如酵母，如来自酵母属，优选酿酒酵母)原位表达和分泌一种或多种葡糖淀粉酶变体。

从含糊化淀粉的材料生产发酵产物的工艺

在这一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的工艺，这些工艺包括液化步骤，以及依次或同时进行的糖化和发酵步骤。

因此，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，这些工艺包括以下步骤：

ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物进行发酵；

用于从含纤维素材料生产发酵产物的工艺

在这一方面，本发明涉及用于从含纤维素材料生产发酵产物、尤其是乙醇的工艺，这些工艺可包括预处理步骤，以及依次或同时进行的糖化和发酵步骤。

因此，本发明涉及用于从含纤维素材料生产发酵产物的工艺，这些工艺包括以下步骤：

i)任选地预处理含纤维素材料；

iii)使用发酵生物进行发酵；

其中至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在糖化步骤ii)或发酵步骤iii)期间存在或添加。

在一些实施例中，至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种葡糖淀粉酶变体在糖化步骤ii)或发酵步骤iii)期间存在和/或添加。

在用于从含纤维素材料生产发酵产物的上述工艺中存在或添加的一种或多种葡糖淀粉酶变体可以在糖化、发酵或同时糖化和发酵期间作为单组分、作为包含一种或多种葡糖淀粉酶变体的酶共混物或组合物外源地添加，和/或通过发酵生物、例如本文所述的重组宿主细胞或发酵生物(例如酵母，如来自酵母属，优选酿酒酵母)原位表达和分泌一种或多种葡糖淀粉酶变体。

步骤ii)和iii)可依次或同时进行。在优选的实施例中，步骤ii)和iii)同时进行。可以在液化步骤i)之前和/或期间添加α-淀粉酶、任选地热稳定性蛋白酶。

本发明的组合物可以适当地用于本发明的工艺中。本发明的重组宿主细胞或发酵生物可以适当地用于本发明的工艺中。然而，也可以分开添加这些酶。

无论本发明的工艺包括或不包括液化步骤或预处理步骤，本发明的基本特征是在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加一种或多种葡糖淀粉酶变体。在一个实施例中，本发明的至少一种葡糖淀粉酶变体在液化期间存在或添加。在一个实施例中，本发明的至少一种葡糖淀粉酶变体在发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加。如上所述，一种或多种葡糖淀粉酶变体可以作为独立式(standalone)酶或包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种葡糖淀粉酶变体的酶共混物或组合物外源地添加，或通过包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种葡糖淀粉酶变体的本发明的重组宿主细胞或发酵生物原位表达和分泌。

除了本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体之外，在糖化/发酵/SSF期间可以添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分的其他酶的实例包括但不限于α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、磷脂酶、海藻糖酶和/或蛋白酶。特别地，在至少一种纤维素酶/纤维素分解组合物的存在下进行糖化和/或发酵或同时糖化和发酵。更特别地，纤维素酶/纤维素分解组合物衍生自木霉属的菌株、特别是里氏木霉，或衍生自腐质霉属的菌株、特别是特异腐质霉，或衍生自金孢子菌属的菌株、特别是卢克诺文思金孢子菌。纤维素酶/纤维素分解组合物应至少包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；

-纤维二糖水解酶II；

或其两种、三种、或四种的混合物。

在实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶I和内切葡聚糖酶I。

纤维素酶是本领域熟知的，并且许多衍生自丝状真菌。特别地，根据本发明，纤维素酶/纤维素分解组合物包含以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同系物。

在一个实施例中，更特别地，纤维素酶/纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含在SEQ ID NO:15中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、或与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的多肽以及在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性。在一个实施例中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI、或与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的CBHI。

在一个实施例中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；例如披露为SEQ ID NO:18的CBHII，或与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的CBH II。

在另一个实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含内切葡聚糖酶I(EGI)，例如衍生自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的内切葡聚糖酶I，例如披露为SEQ ID NO:19的EGI、或与SEQID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的EGI。

适合的纤维素酶的实例可以发现于“在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解组合物”中。

α-淀粉酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。热稳定性蛋白酶的实例可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”-部分中。适合的任选的产碳水化合物源的酶、优选地热稳定性产碳水化合物源的酶、特别地热稳定性葡糖淀粉酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中。

液化期间的pH可以在4-7之间。在实施例中，液化期间的pH为4.5-5.0，如在4.5-4.8之间。在另一个实施例中，液化在pH高于5.0-6.5、如高于5.0-6.0、如高于5.0-5.5、如在5.2-6.2之间、如约5.2、如约5.4、如约5.6、如约5.8下进行。

根据本发明，温度可以大于初始糊化温度。术语“初始糊化温度”指典型地通过加热，淀粉开始溶解的最低温度。针对不同淀粉，该温度可以变化。

在实施例中，在液化步骤i)期间的温度的范围是70℃-100℃，如在75℃-100℃之间、优选在80℃-100℃之间、如在85℃-95℃之间、如在约88℃和92℃之间。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少80℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少81℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少82℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少83℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少84℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少85℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少86℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少87℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少88℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少89℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少90℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少91℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少92℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少93℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少94℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少95℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少96℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少97℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少97℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少98℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少99℃。在实施例中，液化步骤i)期间的温度是至少100℃。

在实施例中，本发明的方法在步骤i)之前进一步包括以下步骤：

a)优选地通过干磨来减小含淀粉材料的粒度；

b)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。

该含淀粉起始材料(如全谷物)可例如通过磨制减少粒度，以打开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干式和湿式碾磨两者都是淀粉加工领域所熟知的。根据本发明，优选干磨。在实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％、优选地至少70％、更优选地至少80％、尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。

水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体(DS)，更优选30-40w/w-％干固体(DS)。

α-淀粉酶，任选热稳定性蛋白酶，任选产碳水化合物源的酶，特别地热稳定性葡糖淀粉酶可以最初添加到该水性浆料中以启动液化(稀释)。在实施例中，这些酶中仅有一部分被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分在液化步骤i)期间添加。

根据本发明，液化步骤i)进行0.5-5小时，如1-3小时，如典型地约2小时。

在实施例中，该水性浆料在步骤i)中进行液化之前可以喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。喷射蒸煮可在110℃-145℃、优选120℃-140℃、如125℃-135℃、优选约130℃的温度进行约1-15分钟、优选进行约3-10分钟、尤其是约5分钟。

糖化与发酵

一种或多种产碳水化合物源的酶、特别是葡糖淀粉酶，可以在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间存在和/或添加。该产碳水化合物源的酶优选地可以是葡糖淀粉酶，但还可以是选自由以下组成的组的酶：β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶。在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间添加的产碳水化合物源的酶典型地与任选地在液化步骤i)期间添加的任选的产碳水化合物源的酶、特别是热稳定性葡糖淀粉酶不同。在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶、特别是葡糖淀粉酶与真菌α-淀粉酶一起添加。

产碳水化合物源的酶(包括葡糖淀粉酶)的实例可以发现于下文的“在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶”部分中。

在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间可以存在和/或添加一种或多种α-淀粉酶。在实施例中，α-淀粉酶是披露为SEQ ID NO:30的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N(活性比AGU:AGU:FAU(F)：大约30:7:1)。

在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间可以存在和/或添加一种或多种海藻糖酶。在实施例中，海藻糖酶是本文披露为SEQ ID NO:31的绳状篮状菌(Talaromycesfuniculosus)海藻糖酶或与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的多肽，该多肽具有海藻糖酶活性。

在实施例中，海藻糖酶是共混物的一部分，该共混物包含在SEQ ID NO:28中披露的篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)葡糖淀粉酶或与SEQ ID NO:28具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的多肽，该多肽具有葡糖淀粉酶活性；本文披露为SEQ ID NO:31的绳状篮状菌海藻糖酶或与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的多肽，该多肽具有海藻糖酶活性；以及披露为SEQ ID NO:30具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N(活性比AGU:AGU:FAU(F)：大约30:7:1)或与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的多肽，该多肽具有α-淀粉酶活性。

当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域中熟知的条件下进行。比如，糖化步骤ii)可以持续多达从约24至约72小时。在实施例中，进行预糖化。预糖化在30℃-65℃，典型地约60℃的温度典型地进行40-90分钟。在实施例中，在同时糖化和发酵(“SSF”)中，预糖化之后是发酵期间的糖化。糖化典型地在20℃-75℃、优选40℃-70℃、典型地约60℃的温度，以及在4和5之间的pH、一般在约pH 4.5进行。

同时糖化和发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤ii)和发酵步骤iii)。不存在针对糖化的保持阶段，意指可以将发酵生物(如酵母)以及一种或多种酶一同添加。然而，还考虑了分开添加发酵生物以及一种或多种酶。根据本发明，SSF可典型地在25℃至40℃、如28℃至35℃、如30℃至34℃、优选约32℃的温度进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别地24至96小时。在实施例中，pH是在3.5至5之间，特别是在3.8和4.3之间。

使用含纤维素材料的方法

在一些方面，本文所述的方法从含纤维素材料生产发酵产物。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材(wood)中。含纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见，例如Wiselogel等人,1995,于Handbook on Bioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑),第105-118页,Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区；Wyman,1994,Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人,1999,Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics[木质纤维素的生物转化的最近进展],Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展],T.Scheper主编,第65卷,第23-40页,Springer-Verlag,New York[纽约斯普林格出版社])。在本文中应理解的是，纤维素可为任何形式的木质纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个实施例中，该含纤维素材料是任何生物质材料。在另一个实施例中，该含纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包含纤维素、半纤维素、以及木质素。

在一个实施例中，该含纤维素材料是农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、或木材(包括林业废弃物)。

在另一个实施例中，该含纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、柳枝稷或麦秸。

在另一个实施例中，该含纤维素材料是山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。

在另一个实施例中，该含纤维素材料是海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，

)、或经磷酸处理的纤维素。

在另一个实施例中，该含纤维素材料是水生生物质(aquatic biomass)。如本文所用的术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程生产的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。

在另一个实施例中，含纤维素材料是来自用于从含淀粉材料产生发酵的工艺的全酒糟副产物。

该含纤维素材料可按原样使用或可使用本领域已知的常规方法进行预处理，如本文所述的。在优选的实施例中，该含纤维素材料进行了预处理。

可以使用本领域常规的方法来完成使用含纤维素材料的方法。此外，这些方法可以使用配置为实施这些方法的任何常规生物质加工装置来执行。

纤维素预处理

在一个实施例中，在步骤(ii)中的糖化之前对含纤维素材料进行预处理。

在实践本文中所述的方法中，可以使用本领域中已知的任何预处理方法来破坏含纤维素材料的植物细胞壁组分(Chandra等人,2007,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.[生化工程/生物技术进展]108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.[生化工程/生物技术进展]108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,BioresourceTechnology[生物资源技术]100:10-18；Mosier等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Int.J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.[生物燃料、生物产品与生物精炼]2:26-40)。

该含纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理。

常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆破)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维爆破、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、离子液体、以及γ辐射预处理。

在一个实施例中，在糖化(即水解)和/或发酵之前对该含纤维素材料进行预处理。预处理优选在水解前进行。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身使得生物质有些转化为可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

在一个实施例中，将该含纤维素材料用蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热该含纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使纤维素和其他级分(例如半纤维素)可接近酶。该含纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃(例如，160℃-200℃或170℃-190℃)进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对高的固体加载量，这样使得该含纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆发放料(explosive discharge)合并，这被称为蒸汽爆炸，即，快速急骤蒸发至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology[生物资源技术]855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基基团被切割，并且所得的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。

在一个实施例中，使该含纤维素材料经受化学预处理。术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆破(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。

有时在蒸汽预处理之前添加化学催化剂(如H₂SO₄或SO₂)(典型地是0.3至5％w/w)，该化学催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改善酶水解(Ballesteros等人,2006,Appl.Biochem.Biotechnol[应用生物化学与生物技术]129-132:496-508；Varga等人,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]113-116:509-523；Sassner等人,2006,Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]39:756-762)。在稀酸预处理中，该含纤维素材料与稀酸(典型地是H₂SO₄)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology[生物资源技术]855:1-33；Schell等人,2004,Bioresource Technology[生物资源技术]91:179-188；Lee等人,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.[生物化学工程/生物技术的进展]65:93-115)。在特定的实施例中，在180℃下使用4％w/w硫酸持续5分钟来进行该含纤维素材料的稀酸预处理。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆破(AFEX)预处理。用氧化钙或氢氧化钙在85℃-150℃的温度下进行石灰预处理，并且停留时间从1小时到若干天(Wyman等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:1959-1966；Mosier等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、以及WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。

湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180-200℃下持续5-15分钟进行(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technology[生物资源技术]64:139-151；Palonen等人,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]117:1-17；Varga等人,2004,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]88:567-574；Martin等人,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.[化工技术与生物技术杂志]81:1669-1677)。预处理优选以1％-40％干物质，例如2％-30％干物质，或5％-20％干物质进行，并且由于添加碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。

被称为湿爆破(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆破中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂。然后通过闪变至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90℃-150℃和高压如17-20巴，用液体或气体氨将含纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等人,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]98:23-35；Chundawat等人,2007,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]96:219-231；Alizadeh等人,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:1133-1141；Teymouri等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:2014-2018)。在AFEX预处理期间，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被切割。

有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃提取30-60分钟而将含纤维素材料去木质素化(Pan等人,2005,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]90:473-481；Pan等人,2006,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]94:851-861；Kurabi等人,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。

适合的预处理方法的其他实例由Schell等人,2003,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]105-108:69-85，和Mosier等人,2005,BioresourceTechnology[生物资源技术]96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行了描述。

在一个实施例中，化学预处理作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸典型地是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1至5，例如1至4或1至2.5的pH范围中进行。在一个方面，酸浓度优选地在从0.01wt.％至10wt.％酸(例如，0.05wt.％至5wt.％酸或0.1wt.％至2wt.％酸)的范围内。使酸与该含纤维素材料相接触，并且保持在优选地140℃-200℃(例如165℃-190℃)范围内的温度下，持续从1至60分钟范围内的时间。

在另一个实施例中，预处理在水性浆料中进行。在优选方面，在预处理过程中该含纤维素材料以优选在10wt.％-80wt.％之间，例如20wt.％-70wt.％或30wt.％-60wt.％，如约40wt.％的量存在。预处理的含纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。

在一个实施例中，使该含纤维素材料经受机械或物理预处理。术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这样的预处理可以涉及不同类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

该含纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如，微波福射)或其组合相结合。在一个方面，高压意指在优选约100至约400psi(例如约150至约250psi)的范围内的压力。在另一方面，高温意指在约100℃至约300℃(例如约140℃至约200℃)的范围内的温度。在优选的方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统，例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。

因此，在一个实施例中，使该含纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在一个实施例中，使该含纤维素材料经受生物预处理。术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从该含纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass[生物质的预处理],于Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]中,Wyman,C.E.编辑,Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Adv.Appl.Microbiol.[应用微生物学进展]39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review[预处理木质纤维素生物质：综述],于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production[用于燃料生产的生物质的酶转化]中,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编辑,ACS Symposium Series[美国化学学会讨论会系列]566,American Chemical Society[美国化学学会],华盛顿特区,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewableresources[由可再生资源生产乙醇],于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展]中,Scheper,T.编辑,Springer-Verlag[施普林格出版公司],柏林,海德堡,德国,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Enz.Microb.Tech.[酶与微生物技术]18:312-331；以及Vallander和Eriksson,1990,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.[生物化学工程/生物技术的进展]42:63-95)。

含纤维素材料的糖化和发酵

分开的或同时的糖化(即水解)和发酵包括但不限于：分开的水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；混合的水解和发酵(HHF)；分离的水解和共发酵(SHCF)；杂合的水解和共发酵(HHCF)。

SHF使用分开的处理步骤，以首先将该含纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，该含纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(Philippidis，G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology[纤维素生物转化技术],于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]中,Wyman,C.E.编辑,Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区,DC,179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel,1999,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]15:817-827)。HHF涉及分离的水解步骤并且另外涉及同时糖化和水解步骤，其可在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，随后在发酵生物耐受的更低温度下进行SSF。本文应理解的是，本领域中已知的包含预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本文所述的方法。

常规的装置可以包括分批补料搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(de Castilhos Corazza等人.,2003,ActaScientiarum.Technology[技术学报]25:33-38；Gusakov和Sinitsyn,1985,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、磨耗反应器(Ryu和Lee,1983,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床、升流式(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。

在糖化步骤(即，水解步骤)中，该含纤维素材料和/或含淀粉材料(例如预处理的或液化的)被水解，来分解纤维素、半纤维素和/或淀粉为可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由例如纤维素分解酶组合物酶促进行。这些组合物的酶可以同时或顺序添加。

酶水解可以在易于由本领域技术人员确定的条件下，在适合的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于一种或多种酶的活性的条件，即对于这种或这些酶来说最佳条件下进行。水解能以分批补料或连续的过程进行，其中将该含纤维素材料和/或含淀粉材料逐渐补入，例如，含有酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度、和混合条件下进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度优选在约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃的范围内。pH优选在约3至约8，例如约3.5至约7、约4至约6、或约4.5至约5.5的范围内。干燥固体含量优选约5wt.％至约50wt.％，例如约10wt.％至约40wt.％，或约20wt.％至约30wt.％。

可以使用纤维素分解酶组合物进行在步骤(ii)中的糖化。这样的酶组合物在以下的“纤维素分解酶组合物”部分中进行了描述。这些纤维素分解酶组合物可包含有用于降解该含纤维素材料的任何蛋白质。在一个方面，该纤维素分解酶组合物包含或进一步包含选自下组的一种或多种(例如，两种，若干种)蛋白质，该组由以下组成：纤维素酶、AA9(GH61)多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀素。

在另一个实施例中，该纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，两种，若干种)酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

在另一个实施例中，该半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，两种，若干种)酶，该组由以下组成：乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另一个实施例中，该氧化还原酶是选自下组的一种或多种(例如，两种，若干种)酶，该组由以下组成：过氧化氢酶、漆酶、以及过氧化物酶。

在本发明的方法中使用的酶或酶组合物可以是以任何适于使用的形式存在的，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物或半纤维素分解酶组合物对于该含纤维素材料的有效量是约0.5mg至约50mg，例如，约0.5mg至约40mg、约0.5mg至约25mg、约0.75mg至约20mg、约0.75mg至约15mg、约0.5mg至约10mg、或约2.5mg至约10mg/g的该含纤维素材料。

在一个实施例中，以这样一种化合物对纤维素的葡糖基单元的以下摩尔比添加该化合物：约10^-6至约10，例如约10^-6至约7.5、约10^-6至约5、约10^-6至约2.5、约10^-6至约1、约10^-5至约1、约10^-5至约10^-1、约10^-4至约10^-1、约10^-3至约10^-1、或约10^-3至约10^-2。在另一方面，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。

术语“液体(liquor)”意指在如WO 2012/021401中所述的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合)、及其可溶性内容物。可以通过对木质纤维素或半纤维素材料(或原料)加热和/或加压进行处理，任选地是在催化剂例如酸的存在下、任选地是在有机溶剂的存在下、和任选地与材料的物理破坏相结合，然后将溶液与残余固形物分离，来产生用于加强AA9多肽(GH61多肽)纤维素分解的液体。在由纤维素分解酶制剂对纤维素底物的水解期间，从液体与AA9多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由此类条件确定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。

在一个实施例中，对于纤维素来说的液体的有效量是约10^-6至约10g/g的纤维素，例如约10^-6至约7.5g、约10^-6至约5g、约10^-6至约2.5g、约10^-6至约1g、约10^-5至约1g、约10^-5至约10^-1g、约10^-4至约10^-1g、约10^-3至约10^-1g、或约10^-3至约10^-2g/g的纤维素。

在发酵步骤中，例如作为预处理和酶水解步骤的结果由该含纤维素材料释放的糖，由发酵生物(比如本文所述的酵母)发酵为乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。

在实施本文所述的方法的发酵步骤中可以使用任何适合的经水解的含纤维素材料。这类原料包括但不限于碳水化合物(例如，木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等)。该材料通常是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。

使用含纤维素材料通过发酵生物生产乙醇是由糖(单糖)的代谢产生的。经水解的含纤维素材料的糖组成和发酵生物利用不同糖的能力对工艺产率具有直接影响。

发酵培养基的组成和发酵条件取决于发酵生物，并且可以由本领域技术人员容易地确定。典型地，发酵在已知适于产生发酵产物的条件下进行。在一些实施例中，发酵过程在有氧或微需氧条件下(即，氧气浓度小于空气中的氧气浓度)或厌氧条件下进行。在一些实施例中，发酵在厌氧条件下(即，没有可检测的氧气)或小于约5、约2.5或约1mmol/L/h的氧气中进行。在没有氧的情况下，糖酵解中产生的NADH不能通过氧化磷酸化氧化。在厌氧条件下，宿主细胞可利用丙酮酸或其衍生物作为电子和氢受体以产生NAD+。

发酵过程典型地在对重组真菌细胞最佳的温度下进行。例如，在一些实施例中，发酵过程在约25℃至约42℃的范围内的温度下进行。通常，该方法在低于约38℃，低于约35℃，低于约33℃，或低于约38℃，但至少约20℃、22℃或25℃的温度下进行。

发酵刺激剂可以用在本文所描述的工艺中，以进一步改善发酵，并且尤其是改善发酵生物的性能，例如速率增加和产物产率(例如乙醇产率)。“发酵刺激剂”是指用于发酵生物(尤其是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。参见，例如Alfenore等人，Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process[通过在进料分批方法过程中的维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力]，Springer-Verlag[施普林格出版社](2002)，将其通过引用特此并入。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。

发酵培养基

“发酵培养基”(Fermentation media或fermentation medium)是指其中进行发酵的环境。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源，如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。

发酵生物

术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所需发酵产物(例如乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。

在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(例如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(例如酵母)计数在10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰的范围内，尤其是约5x10⁷个。

可商购的酵母的实例包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。其他可用的酵母菌株可获得自生物保藏机构，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)或德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，如例如BY4741(例如ATCC201388)；Y108-1(ATCC PTA.10567)和NRRL YB-1952(美国农业研究菌种保藏中心(ARSCulture Collection))。还有其他适合作为宿主细胞的酿酒酵母菌株DBY746、[Alpha][Eta]22、S150-2B、GPY55-15Ba、CEN.PK、USM21、TMB3500、TMB3400、VTT-A-63015、VTT-A-85068、VTT-c-79093及其衍生物以及酵母属物种1400、424A(LNH-ST)、259A(LNH-ST)及其衍生物。

如本文所用，菌株的“衍生物”衍生自参照菌株，如通过诱变、重组DNA技术、交配、细胞融合、或在酵母菌株之间的胞导。本领域的技术人员应该理解，遗传改变(包括本文示例的代谢修饰)可以参考适合的宿主生物及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中高水平的技能，本领域的技术人员可以将本文提供的教导和指导应用于其他生物中。例如，可以通过掺入相同的或来自不同于参照物种的物种的类似编码核酸而容易地将本文示例的代谢改变应用于其他物种中。

宿主细胞或发酵生物可以是酵母属菌株，例如是使用美国专利号8,257,959-BB中描述和涉及的方法生产的酿酒酵母菌株。在一个实施例中，重组细胞是菌株酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州61604农业研究服务菌种保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)的衍生物。

该菌株也可以是酿酒酵母菌株NMI V14/004037(参见，WO 2015/143324和WO2015/143317，各自通过引用并入本文)，菌株号V15/004035、V15/004036和V15/004037(参见，WO 2016/153924，通过引用并入本文)，菌株号V15/001459、V15/001460、V15/001461(参见，WO 2016/138437，通过引用并入本文)，菌株号NRRL Y67342(参见，WO 2018/098381，通过引用并入本文)，菌株号NRRL Y67549和NRRL Y67700(参见，PCT/US2019/018249，通过引用并入本文)，或描述于WO 2017/087330(通过引用并入本文)的任何菌株的衍生物。

发酵生物可以是表达一种或多种异源葡糖淀粉酶变体(例如，本文所述的任何一种或多种葡糖淀粉酶变体)的宿主细胞。还涵盖了将考虑用于本文所述的工艺、方法、酶共混物、或组合物的任何一种或多种葡糖淀粉酶变体用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

在一个实施例中是包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体(例如，葡糖淀粉酶)(例如，本文所述的任何葡糖淀粉酶)的异源多核苷酸的重组宿主细胞(例如，酵母宿主细胞，如酵母属的菌株，例如酿酒酵母)。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:2的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:3的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:4的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:5的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:6的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:7的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:8的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:9的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:10的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:11的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:12的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，重组酵母宿主细胞包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸，其中该多核苷酸包含核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成，或为包含如下核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:13的多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，该多肽具有葡糖淀粉酶活性。

发酵生物可以是表达编码除了本发明的葡糖淀粉酶之外的酶的异源多核苷酸的宿主细胞，或者是表达除了本发明的葡糖淀粉酶之外的此类酶的宿主细胞。

在一些实施例中，宿主细胞和/或发酵生物包含一种或多种编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、GAPN(非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、磷脂酶、海藻糖酶、阿拉伯糖酶、木糖苷酶、过氧化氢酶和/或普鲁兰酶的异源多核苷酸。本文更详细描述了适合于在宿主细胞和/或发酵生物中表达的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、GAPN(非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、磷脂酶、海藻糖酶、阿拉伯糖酶、木糖苷酶、过氧化氢酶和/或普鲁兰酶的实例。因此，本发明涵盖了包含重组宿主细胞和/或发酵生物的组合物(例如，发酵中的醪组合物)，该组合物包含：(i)一种或多种编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、GAPN(非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、磷脂酶、海藻糖酶、阿拉伯糖酶、木糖苷酶、过氧化氢酶和/或普鲁兰酶的异源多核苷酸，以及(ii)本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体。

本文所述的宿主细胞和发酵生物可以利用以下表达载体，这些表达载体包含一个或多个(例如，两个、几个)异源基因的编码序列，这些编码序列被连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导在与该一个或多个控制序列相容的条件下在适合的细胞中的表达。可以在任何本文所述的细胞和方法中使用此类表达载体。本文所述的多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供希望的多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是期望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

可以将构建体或载体(或多个构建体或载体)引入细胞中，这样使得构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述；构建体或载体(或这些构建体或载体)包含一个或多个(例如，两个、几个)异源基因。

各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，两个、几个)合宜的限制位点以允许在此类位点插入或取代该多核苷酸。可替代地，可以通过将一种或多种多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该一种或多种多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。替代性地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

表达载体可以含有任何适合的启动子序列，该启动子序列可被细胞识别以表达本文所述的基因。启动子序列含有转录控制序列，这些转录控制序列介导该多肽的表达。启动子可以是在选择的细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

本文所述的每种异源多核苷酸都可以被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。例如，在一个实施例中，编码该融合蛋白的核酸构建体可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。这些启动子可以与所选的天然启动子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)。

用于指导核酸构建体在酵母细胞中的转录的适合的启动子的实例包括但不限于获得自以下的基因的启动子：烯醇酶(例如，酿酒酵母烯醇酶或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO1))、半乳糖激酶(例如，酿酒酵母半乳糖激酶或东方伊萨酵母半乳糖激酶(GAL1))、醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP))、磷酸甘油醛异构酶(例如，酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶或东方伊萨酵母磷酸甘油醛异构酶(TPI))、金属硫蛋白(例如，酿酒酵母金属硫蛋白或东方伊萨酵母金属硫蛋白(CUP1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、PDC1、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、L-(+)-乳酸-细胞色素C氧化还原酶(CYB2)、翻译延长因子-1(TEF1)、翻译延长因子-2(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、和乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)基因。其他合适的启动子可以获自啤酒酵母TDH3、HXT7、PGK1、RPL18B和CCW12基因。酵母宿主细胞的另外的有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。终止子序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何终止子。终止子可以与所选的天然终止子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)。

酵母宿主细胞的适合的终止子可以获得自以下的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶)、细胞色素C(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母细胞色素(CYC1))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd))、PDC1、XR、XDH、转醛酶(TAL)、转酮酶(TKL)、核糖5-磷酸-酮醇异构酶(RKI)、CYB2、以及半乳糖基因家族(尤其是GAL10终止子)。其他合适的终止子可以获自啤酒酵母ENO2或TEF1基因。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人，1992,同上描述。

适合的mRNA稳定子区域的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是适合的前导序列，其中转录时，该前导序列是对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何前导子序列。

酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO-1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶)、α-因子(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母α-因子)、以及醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH2/GAP))。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列；与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。对于酵母细胞而言可用的多腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。替代性地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

还可能希望的是添加调节序列，这些调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。

这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、几个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。

这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、几个)允许将该载体整合进宿主细胞的基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。替代性地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。潜在整合位点包括本领域所描述的那些(例如，参见US 2012/0135481)。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在酵母细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

可以将本文所述的多核苷酸的超过一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到酵母细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本文所述的重组表达载体的程序是本领域技术人员所熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,Molecular Cloning，A LaboratoryManual[分子克隆：实验手册],第2版,冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约)。

本领域已知的用于制备用于乙醇发酵的重组细胞的另外的程序和技术描述于例如WO 2016/045569中，将其内容通过引用特此并入。

该宿主细胞或发酵生物可以呈组合物的形式，该组合物包含宿主细胞或发酵生物(例如，本文所述的酵母菌株)和天然存在和/或非天然存在的组分。

本文所述的宿主细胞或发酵生物可以是任何活的形式，包括粉碎的、干燥的，包括活性干燥和速溶的、压缩的、膏状(液体)形式等。在一个实施例中，该宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是干酵母，例如活性干酵母或速溶酵母。在一个实施例中，该宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是粉碎酵母。在一个实施例中，该宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是压缩酵母。在一个实施例中，该宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是膏状酵母。

在一个实施例中是组合物，该组合物包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和选自由以下组成的组的一种或多种组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、以及抗氧化剂和其他加工助剂。

本文所述的组合物可包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的表面活性剂。在一个实施例中，一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。

本文所述的组合物可以包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的乳化剂。在一个实施例中，乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，乳化剂选自下组：山梨聚糖单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。

在一个实施例中，该组合物包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(将其通过引用特此并入)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从奥地利的布塞蒂公司(Bussetti)商购获得。

本文所述的组合物可包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的胶。在一个实施例中，树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶、黄原胶和阿拉伯树胶，尤其地针对膏状、压缩和干酵母。

本文所述的组合物可以包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的溶胀剂。在一个实施例中，溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。

本文所述的组合物可以包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的抗氧化剂。在一个实施例中，抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，尤其地针对活性干酵母。

本文所述的组合物可包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酵母属酵母菌株)和任何适合的发酵酶(例如，α-淀粉酶(例如，真菌α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶和/或纤维素酶)。

本文所述的组合物可包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如，酵母属酵母菌株)和至少一种本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体。

本文所述的组合物可包含本文所述的宿主细胞或发酵生物(例如酵母属酵母菌株)、至少一种本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体以及任何适合的发酵酶(例如，α-淀粉酶(例如，真菌α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶和/或纤维素酶)。

本文所述的宿主细胞和发酵生物还可以包含一个或多个(例如，两个、几个)基因破坏，例如以将糖代谢从不希望的产物转移至乙醇。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不含这一个或多个破坏的细胞相比，该重组宿主细胞产生更大量的乙醇。在一些实施例中，使被破坏的内源基因中的一个或多个失活。

在某些实施例中，本文提供的宿主细胞或发酵生物包含一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在生产替代发酵产物(如甘油)或其他副产物(如乙酸或二醇)中涉及的酶。例如，本文提供的细胞可以包含以下一个或多个中的破坏：甘油3-磷酸脱氢酶(GPD，催化二羟丙酮磷酸反应为甘油3-磷酸)、甘油3-磷酸酶(GPP，催化甘油-3磷酸转化为甘油)、甘油激酶(催化甘油3-磷酸转化为甘油)、二羟丙酮激酶(催化二羟丙酮磷酸转化为二羟丙酮)、甘油脱氢酶(催化二羟丙酮转化为甘油)、和醛脱氢酶(ALD，例如，将乙醛转化为乙酸)。

可以使用模型分析来设计另外的优化途径利用的基因破坏。用于鉴定并设计有利于生物合成希望的产物的代谢改变的一种示例性计算方法是OptKnock计算框架(OptKnockcomputational framework)，Burgard等人,2003,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]84:647-657。

可以使用本领域熟知的方法(包括本文描述的那些方法)构建包含基因破坏的宿主细胞或发酵生物。可以破坏该基因的一部分，如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样一种控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。

可以通过基因缺失技术来构建包含基因破坏的宿主细胞和发酵生物，以消除或减少该基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除其表达。这类方法中，使用已经构建为邻接地含有侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。

还可以通过引入、取代和/或除去该基因中的或为其转录或翻译所需的其控制序列中的一个或多个(例如，两个、几个)核苷酸来构建包含基因破坏的宿主细胞或发酵生物。例如，可以插入或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码可读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如Botstein和Shortle,1985,Science[科学]229:4719；Lo等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:2285；Higuchi等人,1988,NucleicAcids Res[核酸研究]16:7351；Shimada,1996,Meth.Mol.Biol.[分子生物学方法]57:157；Ho等人,1989,Gene[基因]77:61；Horton等人,1989,Gene[基因]77:61；以及Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques[生物技术]8:404。

还可以通过将破坏性核酸构建体插入该基因中而构建包含基因破坏的宿主细胞和发酵生物，该破坏性核酸构建体包含与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体DNA。此类基因破坏可以消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定含有破坏的基因的转化体。

还可以通过基因转化过程构建包含基因破坏的宿主细胞和发酵生物(参见，例如Iglesias和Trautner,1983,Molecular General Genetics[分子普通遗传学]189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进重组菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包含用于选择含有缺陷基因的转化体的标记可以是令人希望的。

可以使用本领域熟知的方法，通过随机或特异诱变进一步构建包含基因破坏的宿主细胞和发酵生物，这些方法包括但不限于化学诱变(参见，例如Hopwood,The Isolationof Mutants in Methods in Microbiology[微生物学方法中的突变体分离](J.R.Norris和D.W.Ribbons,编辑)第363-433页,Academic Press[学术出版社],纽约,1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。

适合本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的减少表达或无表达的突变体来进行的。

可以使用来自其他微生物来源的与本文所述的基因同源或互补的核苷酸序列来破坏所选的重组菌株中的对应基因。

在一实施例中，重组细胞中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因含有侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入核酸片段，该核酸片段包含缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在反向选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，含有该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领域已知的其他方法。

含淀粉材料

根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所需发酵产物来选择起始材料。适合在本发明的工艺中使用的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆类、或甘薯、或其混合物、或者由其衍生的淀粉、或谷类。还考虑了糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。在优选的实施例中，用于生产发酵产物的方法中的含淀粉材料，其中该发酵产物是乙醇，是玉米或小麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的工艺生产的产物。发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是但不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。

在一个实施例中，发酵产物是一种醇。术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。该醇可以是但不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、阿拉伯糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油、丙三醇、1,3-丙二醇、山梨醇、木糖醇。参见，例如，Gong等人,1999,Ethanol productionfrom renewable resources[由可再生资源生产乙醇],在Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]中,Scheper,T.,编辑,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany[施普林格出版社柏林海德堡，德国],65:207-241；Silveira和Jonas,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh,1995,Process Biochemistry[生物化学方法]30(2):117-124；Ezeji等人,2003,World Journal of Microbiology and Biotechnology[世界微生物学和生物技术杂志]19(6):595-603。在一个实施例中，发酵产物是乙醇。

在另一个实施例中，发酵产物是烷烃。烷烃可以是非支链或支链烷烃。烷烃可以是但不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷或十二烷。在另一个实施例中，发酵产物是环烷烃。环烷烃可以是但不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。在另一方面，发酵产物是烯烃。烯烃可以是非支链或支链烯烃。烯烃可以是但不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。

在另一方面，发酵产物是氨基酸。氨基酸可以是但不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。参见，例如Richard和Margaritis,2004,Biotechnology andBioengineering[生物技术和生物工程]87(4):501-515。

在另一个实施例中，发酵产物是气体。气体可以是但不限于：甲烷、H₂、CO₂或CO。参见，例如Kataoka等人，1997,Water Science and Technology[水科学与技术]36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源]13(1-2):83-114。

在另一个实施例中，发酵产物是抗生素(例如，青霉素和四环素)。

在另一个实施例中，发酵产物是异戊二烯。

在另一个实施例中，发酵产物是酶。

在另一个实施例中，发酵产物是激素。

在另一个实施例中，发酵产物是酮。术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。酮可以是但不限于：丙酮。

在另一个实施例中，发酵产物是有机酸。有机酸可以是但不限于：乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸或木糖酸。参见，例如Chen和Lee,1997,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]63-65:435-448。

在另一个实施例中，发酵产物是聚酮化合物。

在优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的工艺用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。

回收

可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收发酵产物(例如，乙醇)，该方法包括但不限于：层析法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从经发酵的纤维素材料或经发酵的含淀粉材料分离并纯化醇。作为另一个实例，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。

在这些方法的一些实施例中，回收后的发酵产物是基本上纯的。关于本文的这些方法，“基本上纯的”意指回收的制剂包含不超过15％的杂质，其中杂质意指除发酵产物(例如，乙醇)以外的化合物。在一种变体中，提供了基本上纯的制剂，其中该制剂包含不超过25％的杂质、或不超过20％的杂质、或不超过10％的杂质、或不超过5％的杂质、或不超过3％的杂质、或不超过1％的杂质、或不超过0.5％的杂质。

可以使用本领域已知的方法实施适合的测定来测试乙醇和污染物的产生以及糖消耗。例如，可以通过方法(如HPLC(高效液相层析法)、GC-MS(气相层析-质谱法)和LC-MS(液相层析-质谱法))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对乙醇产物以及其他有机化合物进行分析。还可以用培养上清液测试发酵液中的乙醇的释放。可以使用例如针对葡萄糖和醇类的折光率检测器、以及针对有机酸的UV检测器通过HPLC(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]90:775 -779(2005))、或使用本领域熟知的其他适合的测定和检测方法量化在发酵培养基中的副产物和残余的糖(例如，葡萄糖或木糖)。

在液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，α-淀粉酶连同至少一种本发明的葡糖淀粉酶变体以及任选地热稳定性蛋白酶、热稳定性普鲁兰酶、热稳定性植酸酶、热稳定性脂肪酶、热稳定性木聚糖酶和/或热稳定性内切葡聚糖酶在液化期间存在和/或添加。

在液化步骤i)期间添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选地是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度下典型地是稳定的。

还涵盖了将考虑在液化期间存在和/或添加的本文任何α-淀粉酶用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如衍生自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在实施例中，芽孢杆菌属α-淀粉酶衍生自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可衍生自其他芽孢杆菌属菌种。

细菌α-淀粉酶的特定实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过引用特此并入)。在实施例中，α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的同一性程度的酶。

在实施例中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ IDNO:20所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的同一性程度的酶。

在优选的实施例中，α-淀粉酶衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以在重组产生过程中是天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较)。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文件通过引用特此并入)。特定的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体，这些变体在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:20所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文件通过引用特此并入)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:20用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:20所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ IDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:30中的S239的位置处具有取代。

在实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:20进行编号)。

在实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的位置E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:20进行编号)。

在实施例中，细菌α-淀粉酶可为截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:20中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。

最重要的是，用于在液化中使用的合适α-淀粉酶必须具有足够的热稳定性，因此可以使用在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂)下T1/2(min)至少为10、如至少15、如至少20、如至少25、如至少30、如至少40、如至少50、如至少60、如10-70之间、如在15-70之间、如在20-70之间、如在25-70之间、如在30-70之间、如在40-70之间、如在50-70之间、如在60-70之间的任何α-淀粉酶。

根据本发明，α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶，如热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在实施例中，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下具有至少10的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少15的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少20的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少25的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少30的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少40的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少50的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少60的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在10-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在15-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在20-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在25-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在30-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在40-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在50-70之间的T1/2(min)。

在实施例中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在60-70之间的T1/2(min)。

在本发明的实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选衍生自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如WO 99/019467中作为SEQ ID NO:3(本文的SEQ ID NO:20)披露的嗜热脂肪芽孢杆菌，其在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有以下突变列表中的突变。

在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变。

在优选的实施例中，α-淀粉酶选自以下嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组(使用SEQ ID NO:20进行编号)：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179S+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+S173N+E188P+H208Y+S242Y+K279I；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+W115D+D117Q+T133P；以及

其中该变体与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。

应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可以是这样的，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:20中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。

在优选的实施例中，α-淀粉酶变体可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:20所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％同一性程度的酶。

在优选的实施例中，α-淀粉酶变体可以是与WO 09/061380的SEQ ID NO:2、或本文的SEQ ID NO:37具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％同一性程度的酶。

在优选的实施例中，α-淀粉酶变体可以是与WO 08/153815)的SEQ ID NO:2、或本文的SEQ ID NO:38具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％同一性程度的酶。

在优选的实施例中，α-淀粉酶变体可以是与WO 08/153815)的SEQ ID NO:2、或本文的SEQ ID NO:39具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％同一性程度的酶。

液化期间存在的和/或添加的蛋白酶

根据本发明，热稳定性蛋白酶连同至少一种本发明的葡糖淀粉酶变体以及任选地热稳定性普鲁兰酶、热稳定性植酸酶、热稳定性脂肪酶、热稳定性木聚糖酶和/或热稳定性内切葡聚糖酶在液化期间任选地存在和/或添加。

还涵盖了将考虑在液化期间存在和/或添加的本文任何蛋白酶用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

在优选的实施例中，根据本发明所用的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；或者基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。

在实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定确定的，热稳定性蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。

对于在本发明的工艺中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。

蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。

在特定实施例中，热稳定性蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的工艺中所用的热稳定性蛋白酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如衍生自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的真菌金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。

在实施例中，热稳定性蛋白酶是以下的变体：在WO 2003/048353中披露的SEQ IDNO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1以及本文显示为SEQ ID NO:21的成熟部分，该变体进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161 C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D 142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

在优选的实施例中，热稳定性蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：在WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:21的成熟部分，该变体进一步具有选自以下列表的突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在实施例中，蛋白酶变体与在WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或在WO 2010/008841中披露的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:21的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％同一性。

热稳定性蛋白酶还可衍生自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，特别是S8蛋白酶。优选的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，特别是以下的S8丝氨酸蛋白酶：衍生自火球菌属(Pyrococcus)的菌株，优选地强烈火球菌的菌株，或衍生自热球菌属(Thermococcus)的菌株，优选地减硫高温球菌(Themococcus thioreducens)，或衍生自古球菌属(Palaeococcus)的菌株，优选地嗜铁古球菌(Palaeococcus ferrophilus)。

在实施例中，热稳定性蛋白酶衍生自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。

在实施例中，蛋白酶是显示为美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))中的SEQ ID NO:1、本文的SEQ ID NO:22的蛋白酶。

在另一个实施例中，热稳定性蛋白酶是在本文的SEQ ID NO:22中披露的蛋白酶或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:22具有至少80％同一性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。

强烈火球菌蛋白酶是根据本发明的热稳定性蛋白酶。发现激烈火球菌蛋白酶(PfuS)在pH 4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性。

在实施例中，热稳定性蛋白酶衍生自细菌古球菌属的菌株，例如嗜铁古球菌的菌株。在实施例中，蛋白酶是显示为本文的SEQ ID NO:23的蛋白酶。在另一个实施例中，热稳定性蛋白酶是在本文的SEQ ID NO:23中披露的蛋白酶或与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。

在一个实施例中，在本发明的工艺中使用的热稳定性蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的、超过10％的热稳定性值。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

在实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。

在实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃下的残余活性；和/或

在实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃下的残余活性。

在实施例中，蛋白酶在85℃下可以具有高于90，例如高于100的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

在实施例中，蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

在实施例中，蛋白酶在85℃下具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

在实施例中，通过AZCL-酪蛋白测定法确定的，热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的活性。

在实施例中，蛋白酶衍生自嗜热裂孢菌属的菌株，例如本文SEQ ID NO:33中所示的解纤维素嗜热裂孢菌(Thermobifida cellulosytica)蛋白酶或与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶衍生自嗜热裂孢菌属的菌株，例如本文SEQ ID NO:34中所示的褐色嗜热裂孢菌蛋白酶(在WO 2018/118815 A1中称为SEQ ID NO:8，其通过引用以其全文并入本文)或与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶衍生自嗜热裂孢菌属的菌株，例如本文SEQ ID NO:35中所示的耐盐嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)蛋白酶(在WO 2018/118815 A1中称为SEQ ID NO:10，其通过引用以其全文并入本文)或与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶衍生自高温球菌属的菌株，例如本文SEQ ID NO:36中所示的诺蒂利高温球菌(Thermococcus nautili)蛋白酶(在WO 2018/169780A1中称为SEQ ID NO:3，其通过引用以其全文并入本文)或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在液化期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，产碳水化合物源的酶，特别地葡糖淀粉酶，优选地本发明的热稳定性葡糖淀粉酶变体，连同α-淀粉酶，任选地热稳定性蛋白酶、热稳定普鲁兰酶、热稳定植酸酶、热稳定脂肪酶、热稳定性木聚糖酶和/或热稳定内切葡聚糖酶可以在液化期间存在和/或添加。

还涵盖了将考虑在液化期间存在和/或添加的本文任何产碳水化合物源的酶(例如，葡糖淀粉酶)用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能量源，比如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成所希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。特定实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。

在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定的。产碳水化合物源的酶、特别是热稳定性葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或分开添加。

在实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，例如来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌的菌株，特别是在公开为WO 2011/127802(其通过引用特此并入)的PCT/CN10/071753中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQID NO:24中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。

在实施例中，热稳定性葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:24中所示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性。

在实施例中，产碳水化合物源的酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:24的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代(使用SEQ IDNO:34中所示的成熟序列进行编号)。

在实施例中，产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶衍生自草酸青霉菌。

在实施例中，热稳定性葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:24中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体。在优选的实施例中，草酸青霉菌葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:24中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其在位置79处具有Val(V)(使用SEQ ID NO:34进行编号)。

在实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。

在实施例中，这些变体与亲本相比具有改善的热稳定性。

在实施例中，葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用SEQ ID NO:24进行编号)，并且进一步包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

P11F+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。

在实施例中，葡糖淀粉酶具有P2N+P4S+P11F+T65A+K79V+Q327F取代(使用SEQ IDNO:24进行编号)，并且进一步包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

D75N+R77D+A78Q；

D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y；

K34Y+S103N；

K34Y+D445N+V447S；

K34Y+Y504T；

S103N+D445N+V447S；

S103N+Y504T；

D445N+V447S+Y504T；

K34Y+S103N+D445N+V447S；

K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T；

K34Y+S103N+Y504T；

K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T；

K34Y+S103N+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

S105L；

S105E；

A132R；

K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+Y504T D566T Q594R F595S；

K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T；

G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S 103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

R135S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S。

特别地，产碳水化合物源的酶能以从0.1-100微克EP/g，例如0.5-50微克EP/g，例如1-25微克EP/g，例如2-12微克EP/g DS的量添加。

在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶可以是糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的。

在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株；或黑层孔属的菌株。

还涵盖了将考虑在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的任何葡糖淀粉酶用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

葡糖淀粉酶

根据本发明，在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的本发明的葡糖淀粉酶变体可以衍生自任何适合的来源，例如，衍生自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自由以下组成的组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如在WO92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自诺维信公司(Novozymes)，丹麦)；在WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.[生物化学杂志]301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Eng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在优选的实施例中，糖化和/或发酵期间使用的葡糖淀粉酶是在WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。

涵盖的真菌葡糖淀粉酶特别地包括衍生自篮状菌属，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株；或黑层孔属的菌株的葡糖淀粉酶。

在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自栓菌属的菌株，特别是在WO 2006/069289以及本文的SEQ ID NO:25中披露的瓣环栓菌的菌株。在一个实施例中，葡糖淀粉酶衍生自篮状菌属的菌株，特别是在本文的SEQ ID NO:26中披露的埃默森篮状菌的菌株。

在另一个实施例中，葡糖淀粉酶衍生自密孔菌属的菌株，特别是如WO 2011/066576(SEQ ID NO 2、4或6)或本文的SEQ ID NO:27所述的血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)的菌株，或源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如WO 2011/068803(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)所述的粘褶菌属的菌株。在优选的实施例中，葡糖淀粉酶是本文的SEQ ID NO:28。在另一个实施例中，葡糖淀粉酶是本文的SEQID NO:29。在实施例中，葡糖淀粉酶衍生自黑层孔属的菌株，特别是在WO 2012/064351中披露为SEQ ID NO:2的黑层孔属物种的菌株。还涵盖如下葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶与上述葡糖淀粉酶中的任一种展现高同一性，即与上述酶序列的成熟部分中的任一个，如本文的SEQ ID NO:131、132、133、134或135中的任一个展现至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。

在实施例中，葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性。

在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含在WO 99/28448中披露为SEQ IDNO:7或本文的SEQ ID NO:26的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中和本文的SEQID NO:25中披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。

在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含披露为SEQ ID NO:26的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露为SEQ ID NO:25的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039和本文中披露为SEQ ID NO:30的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶，其优选地具有以下取代：G128D+D143N。

在实施例中，葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含在WO 2011/068803中显示为SEQID NO:2(本文的SEQ ID NO:28)的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及在WO 2013/006756中披露为SEQ ID NO:3(本文的SEQ ID NO:30)的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉葡糖淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N。

在实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一项：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQID NO:3进行编号)。

包含葡糖淀粉酶的可商购的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TMSUPER、SAN^TMEXTRA L、SPIRIZYME^TMPLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TMB4U、SPIRIZYME^TMULTRA、SPIRIZYME^TMEXCEL、SPIRIZYME ACHIEVE以及AMG^TME(来自诺维信公司)；OPTIDEX^TM300,GC480,GC417(来自杜邦-杰能科公司(DuPont-Genencor))；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自帝斯曼公司)；G-ZYME^TMG900、G-ZYME^TM和G990 ZR(来自杜邦-杰能科公司(DuPont-Genencor))。

糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的纤维素分解组合物

根据本发明，在发酵或同时糖化发酵(SSF)过程中存在纤维素分解组合物。

该纤维素分解组合物可以是任何纤维素分解组合物，包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶。

还涵盖了将考虑在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的本文所述的任何纤维素酶用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

适合的纤维素分解组合物的实例可以发现于WO 2008/151079和共同未决的专利申请PCT/US12/052163(公开为WO 2013/028928)中，将其通过引用并入。

在优选的实施例中，纤维素分解组合物衍生自木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。

在实施例中，纤维素分解组合物衍生自里氏木霉、特异腐质霉、和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。

在实施例中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，优选地衍生自曲霉属的菌株的β-葡糖苷酶，例如米曲霉，例如在WO 2002/095014中披露的米曲霉β-葡糖苷酶，或在WO2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如在WO 2005/047499或本文的SEQ ID NO:27中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或在WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(诺维信公司)，例如具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在实施例中，纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如衍生自嗜热子囊菌属(如金黄色嗜热子囊菌的菌株)的多肽，例如，在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的多肽；或衍生自梭孢壳属(如土生梭孢壳霉的菌株)的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所描述的多肽；或衍生自曲霉属的菌株(如烟曲霉的菌株)的多肽，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所描述的多肽；或衍生自青霉属的菌株(如埃默森青霉的菌株)的多肽，如在WO 2011/041397中披露的或本文的SEQ ID NO:15的多肽。

在实施例中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:17中披露的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在实施例中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉或本文的SEQ ID NO:18的菌株；或源自木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。

在实施例中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I、以及CBH II。

在实施例中，该纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在实施例中，纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:16。

在实施例中，纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:16或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在实施例中，纤维素分解组合物，例如里氏木霉纤维素分解酶组合物，包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；以及

-内切葡聚糖酶I，或其两种或三种的混合物。

在实施例中，纤维素分解组合物，例如里氏木霉纤维素分解酶组合物，包含以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶I；以及

(iii)里氏木霉内切葡聚糖酶I。

在实施例中，纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含：

(i)在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性；

(ii)纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI，或与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBHI；以及

(iii)内切葡聚糖酶I(EGI)，例如衍生自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的内切葡聚糖酶I，例如披露为SEQ ID NO:19的EGI，或与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的EGI。

在优选的实施例中，纤维素分解组合物包括以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及

在优选的实施例中，纤维素分解组合物衍生自里氏木霉，其包含衍生自埃默森青霉的菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15)、在WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:27)变体F100D、S283G、N456E、F512Y)；在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:6(本文的SEQ ID NO:17)的烟曲霉Cel7A CBH1以及在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18(本文的SEQ ID NO:18)的烟曲霉CBH II。

在实施例中，纤维素分解组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/gDS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/gDS剂量添加。

酶共混物或组合物

本发明的方面涉及包含至少一种本发明的葡糖淀粉酶变体的酶共混物或组合物。在一些方面，酶共混物或组合物包含热稳定酶，并且适合于在本文所述的工艺的液化步骤中使用。在其他方面，酶共混物或组合物包含适合于在本文所述的工艺的糖化、发酵、或同时糖化和发酵步骤中使用的酶。

组合物可以包含一种或多种葡糖淀粉酶变体作为主要酶组分，例如，单组分组合物。

酶共混物或组合物可以进一步包含另外的酶活性，例如一种或多种(例如，几种)选自由以下组成的组的酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

在实施例中，本发明的酶共混物或组合物包含葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且具有热稳定性α-淀粉酶，优选地细菌α-淀粉酶。

在实施例中，本发明的酶共混物或组合物包含葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且具有热稳定性α-淀粉酶，优选地细菌α-淀粉酶。

在实施例中，本发明的酶共混物或组合物包含葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568 592、594、595，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且具有热稳定性木聚糖酶。

在一个方面，热稳定性木聚糖酶具有大于80℃、优选地大于85℃、尤其大于90℃、特别地大于95℃的熔点(DSC)。

适合的热稳定性木聚糖酶的实例，特别是来自热袍菌属(Thermotoga)的木聚糖酶，包括本文SEQ ID NO:40中所示的木聚糖酶，例如衍生自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的菌株；本文SEQ ID NO:41中所示的木聚糖酶，例如衍生自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的菌株；本文SEQ ID NO:42中所示的木聚糖酶，例如衍生自嗜萘热袍菌(Thermotoga naphthophila)的菌株；或分别与本文SEQ ID NO:40、41和42的任何多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性的多肽。

在实施例中，本发明的酶共混物或组合物包含葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，并且具有与SEQ ID NO:40、41和42的多肽中的任一个的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性，优选地至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性，更优选地至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少91％同一性，更优选地至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、或至少95％同一性，例如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性，例如100％同一性的热稳定性木聚糖酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶和蛋白酶，优选地细菌或古菌蛋白酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、T65A、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶和木聚糖酶，优选地细菌木聚糖酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶和植酸酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶和植酸酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和植酸酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体具有热稳定性α-淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶和磷脂酶。

在实施例中，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化期间或用作本发明的酶共混物或组合物的组分时与选自由以下组成的组的至少一个、至少两个、或至少三个热稳定性酶组合：热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、植酸酶、磷脂酶、内切葡聚糖酶、和/或普鲁兰酶。

在实施例中，酶共混物或组合物包含一种或多种纤维素酶，例如，β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。

在另一方面，本发明涉及包含一种或多种葡糖淀粉酶变体、和/或纤维素分解组合物的组合物，以及包含至少一种异源多核苷酸的重组宿主细胞或发酵生物(例如，重组酵母宿主细胞或发酵生物，被工程化以优化用于生产发酵产物的工艺中发酵产物或副产物或联产物的产生)。

如本章节所用，“组合物”涵盖在用于从含淀粉材料或含纤维素材料(如发酵中的醪或经发酵的醪组合物)生产发酵产物(如乙醇)的过程中的工艺流。

如本文所用，“发酵中的醪或经发酵的醪组合物”是指由发酵期间存在的醪的组成部分(发酵中的醪组合物)或发酵后(经发酵的醪组合物)形成的组合物，该组合物包含被外源地添加到用于生产发酵产物的工艺流中的任何化合物(例如，酶)或微生物(例如，发酵生物，如包含至少一种异源多核苷酸的重组酵母宿主细胞)(例如，在发酵步骤上游添加的酶，例如在用于从含淀粉材料生产发酵产物的常规工艺的液化步骤期间、在从含纤维素材料生产发酵产物的工艺的预处理步骤期间、或在用于生产发酵产物的任何工艺(如从含淀粉材料生产发酵产物的工艺、生淀粉水解(RSH)工艺、以及从含纤维素材料、化学输入物(例如尿素)等生产发酵产物的工艺)的糖化步骤期间)，以及在生产发酵产物的工艺流中原位生成的任何化合物或微生物(例如，醪中的酶及其底物的反应产物、发酵生物分泌的酶等)。

至少一种异源多核苷酸可以编码在细胞内表达以增强酵母或发酵生物本身的性能的多肽，分泌到发酵中的或经发酵的醪组合物中以对醪或醪的组分发挥作用以改善发酵结果的多肽，或两者。

在一些实施例中，重组酵母宿主细胞或发酵生物包含编码本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的核苷酸序列，以及优化用于生产发酵产物的工艺中发酵产物或副产物或联产物的产生的至少一种其他异源多核苷酸。

因此，在一个方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含：

(a)重组酵母宿主细胞或发酵生物；和/或

(b)本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体,

其中该酵母宿主细胞或发酵生物包含编码葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的异源多核苷酸。

本发明涵盖了在本文所述的组合物中使用任何活的重组酵母宿主细胞或发酵生物。适合的重组酵母宿主细胞或发酵生物的实例可以在本文“发酵生物”章节中找到。

本发明涵盖了任何葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的用途。适合的此类酶的实例可以在标题“酶”下找到。

在实施例中，发酵中的或经发酵的醪组合物或全酒糟组合物包含：

(i)重组酵母宿主细胞或发酵生物，其中该酵母宿主细胞或发酵生物包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或本发明的一种或多种葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。

经发酵的或发酵中的醪组合物以及全酒糟组合物可以进一步包含含有β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维素酶/纤维素分解组合物。在一个实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；

-纤维二糖水解酶II；

或其两种、三种、或四种的混合物。

在另一个实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；

-纤维二糖水解酶II；

或其两种、三种、或四种的混合物。

在另一个实施例中，纤维素酶/纤维素分解组合物包含以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及

(i)重组酵母宿主细胞或发酵生物，其中该酵母宿主细胞或发酵生物包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或纤维素酶的异源多核苷酸；以及

(ii)里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含：

-在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性；

-纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI，或与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBHI；以及

-内切葡聚糖酶I(EGI)，例如衍生自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的内切葡聚糖酶I，例如披露为SEQ ID NO:19的EGI，或与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的EGI。

(ii)里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含在SEQ ID NO:15中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽，或与SEQ ID NO:15具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的多肽，在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性，纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI，或与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBHI，以及纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；例如披露为SEQ ID NO:18的CBH II，或与SEQ ID NO:18具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBH II。

(i)重组酵母宿主细胞或发酵生物，其中该酵母宿主细胞或发酵生物包含编码一种或多种葡糖淀粉酶变体、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或纤维素酶的异源多核苷酸；

(ii)里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含：

-内切葡聚糖酶I(EGI)，例如衍生自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的内切葡聚糖酶I，例如披露为SEQ ID NO:19的EGI，或与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的EGI；

(iii)具有海藻糖酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

-与SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性并且具有海藻糖酶活性的多肽；以及

-与SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性并且具有海藻糖酶活性的多肽；以及

(iv)选自由以下组成的组的葡糖淀粉酶共混物：

-共混物，该共混物包含显示为SEQ ID NO:28的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，或与SEQID NO:28具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，以及披露为SEQ ID NO:30的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N，并且该α-淀粉酶与SEQ ID NO:136具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性；以及

-共混物，该共混物包含SEQ ID NO:26的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶，或与SEQ IDNO:26具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，SEQ ID NO:25的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:25具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，以及SEQ ID NO:30的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，并且该α-淀粉酶包含以下取代：G128D+D143N，并且该α-淀粉酶与SEQ ID NO:136具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以呈液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。

组合物可以用于本发明的工艺中，例如，在糖化、发酵期间，或生产发酵产物(例如，从玉米生产燃料乙醇)的工艺的SSF步骤，例如像通过使含淀粉材料与组合物接触降解含淀粉材料。

在本发明的工艺、酶共混物或组合物中使用的葡糖淀粉酶变体

本发明的方面涉及包括一种或多种酶。组合物可以包含一种或多种酶，例如蛋白酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、植酸酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、海藻糖酶、或木聚糖酶。

在一个实施例中，将本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体与一种或多种酶，例如至少两种酶，更优选地至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如，蛋白水解活性、淀粉分解活性、半纤维素分解活性或纤维素分解活性。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与工艺条件相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

本发明的方面涉及在本发明的工艺、酶共混物、或组合物中包括本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体。本披露涵盖了包含一种或多种葡糖淀粉酶变体的工艺和酶共混物或组合物，与缺乏一种或多种葡糖淀粉酶变体的相似工艺和/或酶共混物或组合物相比，当其单独使用、或相互组合或与本文所述的其他酶或组合物(例如，纤维素酶/纤维素分解组合物)组合时导致发酵产物产率(例如，乙醇产率)的提高。还涵盖了将本文所述的任何一种或多种葡糖淀粉酶变体用于通过发酵生物或宿主细胞表达。

在一个实施例中，关于根据本发明设想的剂量范围，一种或多种葡糖淀粉酶变体的剂量范围是0.1–1000微克EP/g DS；0.5–500微克EP/g DS；1–100微克EP/g DS；例如5–50微克EP/g DS。

根据本发明，至少葡糖淀粉酶变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加，或用作本发明的酶共混物或组合物的组分，然而，优选的实施例还可以包括在液化/糖化/发酵/SSF期间添加其他酶类，或添加作为本发明的酶共混物或组合物的组分的其他酶类。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，葡糖淀粉酶变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID No:1-13具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的S105L、S105E、A132R、R135S，并且其中所述变体与SEQID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N、K34Y+Y504T、S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q、K34Y+D445N+V447S、S103N+D445N+V447S、D445N+V447S+Y504T、K34Y+S103N+Y504T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S、K34Y+S103N+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y、K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T、K34Y+S103N+Y504T+Q594R F595S、K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+Y504T+D566T+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S、K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S、K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S、R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S、G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

在一个方面，一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于选自由以下组成的组的位置的位置处包含取代：SEQ ID NO:1的G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％序列同一性，所述变体在液化、糖化、发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分。

除了本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体之外，在液化期间可以添加或用作本发明的酶共混物或组合物的组分的其他酶的实例包括但不限于热稳定性α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶、脂肪酶(例如，磷脂酶)、普鲁兰酶和/或蛋白酶。

在以下段落中进一步定义本发明：

1.一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

2.根据段落1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、594。

3.根据段落1-2所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

4.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体相对于该亲本具有改善的特性，其中该改善的特性是增加的热稳定性。

5.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，所述改善的特性是增加的热稳定性，该增加的热稳定性使用TSA测量为至少0.1℃、至少0.2℃、至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.7℃、至少0.8℃、至少0.9℃、至少1℃、至少1.5℃、至少2℃、至少2.5℃、至少3℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃，或至少1℃、至少1.5℃、至少2℃、至少2.5℃、至少3℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃或至少5℃或至少5.5℃或至少6℃或至少6.5℃或至少7℃或至少7.5℃或至少8℃或至少8.5℃或至少9℃或至少9.5℃或至少10℃的增加的解链温度。

6.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，所述变体在91℃下具有至少150，优选地至少200，更优选地至少250，最优选地至少300的相对活性。

7.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

8.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:1的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

9.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

10.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

11.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

12.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

13.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

14.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

15.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

16.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:9的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

17.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:10的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

18.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:11的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

19.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:12的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

20.根据前述段落中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

21.根据前述段落中任一项所述的变体，其中取代的数目为1-20个，例如1-10和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。

22.根据前述段落中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

SEQ ID NO:1的1.D75N+R77D+A78Q；

2.D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y；

3.K34Y+S103N；

4.K34Y+D445N+V447S；

5.K34Y+Y504T；

6.S103N+D445N+V447S；

7.S103N+Y504T；

8.D445N+V447S+Y504T；

9.K34Y+S103N+D445N+V447S；

10.K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T；

11.K34Y+S103N+Y504T；

12.K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T；

13.K34Y+S103N+Q594R+F595S；

14.K34Y+S103N+Y504T+Q594R+F595S；

15.K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

16.S105L；

17.S105E；

18.A132R；

19.K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

20.K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

21.K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

22.K34Y+S103N+S105L+Y504T D566T Q594R F595S；

23.K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

24.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

25.K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S；

26.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

27.K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

28.K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T；

29.G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

30.K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

31.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

32.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S；

33.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

34.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

35.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

36.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

37.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

38.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S；

39.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+T110W+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

40.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

41.G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T；

42.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

43.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

44.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

45.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+E501V+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

46.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+P 107L+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

47.K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

48.G6S+G7T+R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

49.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

50.G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

51.R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

52.K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

53.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S；

54.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

55.K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

56.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

57.R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

58.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+Q594R+F595S；

59.R135S；

60.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501L+D566T+T568V+Q594R+F595S；

61.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138G+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

62.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138L+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

63.G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+R138P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

64.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

65.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

66.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

67.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+S379P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+D566T+T568V+Q594R+F595S；

68.G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

23.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

24.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据段落23所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

25.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据段落23所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

26.根据段落25所述的重组宿主细胞，其中该多肽与该重组宿主细胞是异源的。

27.根据段落25或26所述的重组宿主细胞，其中该一个或多个控制序列中的至少一个与编码该多肽的多核苷酸是异源的。

28.根据段落25至27中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含至少两个拷贝，例如，三个、四个或五个根据段落23所述的多核苷酸。

29.根据段落25-28中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是酵母重组宿主细胞，例如，假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。

30.根据段落25-29中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是丝状真菌重组宿主细胞，例如，枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞，特别是，泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管霉、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑根毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、埃默森篮状菌、土生梭孢霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

31.根据段落25-30中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是原核重组宿主细胞，例如，选自由以下组成的组的革兰氏阳性细胞：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属细胞，或者选自下组的革兰氏阴性细菌，该组由以下组成：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

32.一种产生根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该葡糖淀粉酶变体。

33.根据段落32所述的方法，该方法进一步包括回收这些葡糖淀粉酶变体。

34.一种产生葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括在有益于产生这些葡糖淀粉酶变体的条件下培养根据段落25-31中任一项所述的重组宿主细胞。

35.根据段落34所述的方法，该方法进一步包括回收这些葡糖淀粉酶变体。

36.一种产生根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括在有益于产生该变体的条件下培养该重组宿主细胞，以及任选地，回收该变体。

37.一种从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；

(b)使该液化的材料糖化；以及

(c)用发酵生物进行发酵；

其中使用至少一种根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)、步骤(b)、和/或步骤(c)。

38.一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，使所述含淀粉材料糖化；以及

(b)用发酵生物进行发酵，其中使用至少一种根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)和/或步骤(b)。

39.一种从含纤维素材料产生发酵产物的工艺，该工艺包括：

a.任选地预处理含纤维素材料；

b.使用产碳水化合物源的酶将含纤维素材料和/或预处理的含纤维素材料糖化；以及

c.使用发酵生物进行发酵；

其中本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在糖化步骤(b)和/或发酵步骤c)期间存在或添加。

40.根据段落37-39中任一项所述的工艺，其中糖化步骤ii)和发酵步骤iii)在同时糖化和发酵中同时进行。

41.根据段落37-40中任一项所述的工艺，其中至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加。

42.根据段落37-41中任一项所述的工艺，其中至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在发酵或同时糖化和发酵期间存在或添加。

43.根据段落37-42中任一项所述的工艺，其中该至少一种或多种葡糖淀粉酶变体的剂量范围是0.1–1000微克EP/g DS；0.5–500微克EP/g DS；1–100微克EP/g DS；例如5–50微克EP/g DS。

44.根据段落37-43中任一项所述的工艺，其中在存在至少一种纤维素酶/纤维素分解组合物的情况下进行糖化。

45.根据段落44所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物衍生自木霉属的菌株、特别是里氏木霉，或衍生自腐质霉属的菌株、特别是特异腐质霉，或衍生自金孢子菌属的菌株、特别是卢克诺文思金孢子菌。

46.根据段落44或45所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。

47.根据段落44-46中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；以及

-内切葡聚糖酶I，或其两种或三种的混合物。

48.根据段落44-47中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；

d.(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶I；以及

e.(iii)里氏木霉内切葡聚糖酶I。

49.根据段落44-48中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解组合物，该里氏木霉纤维素分解组合物进一步包含：

(i)在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性；(ii)纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI，或与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBHI；以及

f.(iii)内切葡聚糖酶I(EGI)，例如衍生自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的内切葡聚糖酶I，例如披露为SEQ ID NO:19的EGI，或与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的EGI。

50.根据段落44-49中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。

51.根据段落44-50中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；

-纤维二糖水解酶II；

或其两种、三种、或四种的混合物。

52.根据段落44-51中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：

-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；

-β-葡糖苷酶；

-纤维二糖水解酶I；

-纤维二糖水解酶II；

或其两种、三种、或四种的混合物。

53.根据段落44-52中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物包含以下组分中的一种或多种：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

g.(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

h.(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及

i.(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同系物。

54.根据段落44-53中任一项所述的工艺，其中该纤维素酶/纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含在SEQ ID NO:121中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽，或与SEQ ID NO:121具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的多肽，以及在SEQ ID NO:16中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，该变体与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

55.根据段落44-54中任一项所述的工艺，其中该纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露为SEQ ID NO:17的CBHI，或与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBH I。

56.根据段落44-55中任一项所述的工艺，其中该纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如衍生自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；例如披露为SEQ ID NO:18的CBH II，或与SEQ ID NO:18具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的CBH II。

57.根据段落44-56中任一项所述的工艺，其中在存在具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值的蛋白酶的情况下进行液化。

58.根据段落44-57中任一项所述的工艺，其中在存在葡糖淀粉酶的情况下进行液化。

59.根据段落44-59中任一项所述的工艺，其中该一种或多种产碳水化合物源的酶是至少一种葡糖淀粉酶，并且任选地与真菌酸性α-淀粉酶组合。

60.根据段落44-59中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。

61.根据段落44-60中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。

62.根据段落44-61中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别地嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如在SEQ ID NO:20中显示的变体，或与SEQ ID NO:126具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的α-淀粉酶。

63.根据段落44-62中任一项所述的工艺，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在对应于位置179 -182的区域中包含两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:20进行编号。

66.根据段落63所述的工艺，其中该缺失选自由以下组成的组：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*以及181*+182*，特别地I181*+G182*。

67.根据段落61-63中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶包含取代N193F，使用SEQ ID NO:20进行编号。

68.根据段落61-65中任一项所述的工艺，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242处具有取代，优选地S242Q取代，使用SEQ ID NO:20进行编号。

69.根据段落61-66中任一项所述的工艺，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188处具有取代，优选地E188P取代，使用SEQ ID NO:20进行编号。

70.根据段落59-67中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂)下具有至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间的T1/2(min)。

71.根据段落59-67中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶选自以下嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组(使用SEQ ID NO:20进行编号)：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+W115D+D117Q+T133P；

并且其中该变体与SEQ ID NO:20具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

72.根据段落59-69中任一项所述的工艺，其中在液化步骤i)存在具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值的蛋白酶。

73.根据段落59-69中任一项所述的工艺，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。

74.根据段落59-71中任一项所述的工艺，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂)下具有至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间的T1/2(min)。

75.根据段落59-72中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％和30％的热稳定性。

76.根据段落59-73中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。

77.根据段落59-75中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

78.根据段落59-75中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间、例如在10％与25％之间的热稳定性。

79.根据段落59-76中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

81.根据段落73-77中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶在85℃下具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。

82.根据段落73-78中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是真菌或细菌来源的。

83.根据段落73-79中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。

84.根据段落73-80中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是衍生自嗜热子囊菌属的菌株的金属蛋白酶的变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。

85.根据段落73-81中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是披露为SEQ ID NO:20的金属蛋白酶的变体，该变体具有以下突变：

j.D79L+S87P+A112P+D142L；

k.D79L+S87P+D142L；或

l.A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+

D142L；并且其中该蛋白酶与SEQ ID NO:20具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

86.根据段落73-82中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，特别是衍生自火球菌属的菌株，优选地强烈火球菌的菌株，或衍生自热球菌属的菌株，优选地减硫高温球菌或诺蒂利高温球菌，或衍生自古球菌属的菌株，优选地嗜铁古球菌的S8丝氨酸蛋白酶。

87.根据段落73-83中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶衍生自火球菌属的菌株，优选地强烈火球菌的菌株。

88.根据段落73-84中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是在SEQ ID NO:21中显示的蛋白酶，或与SEQ ID NO:21具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的蛋白酶。

89.根据段落73-85中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶衍生自嗜热裂孢菌属的菌株，优选地解纤维素嗜热裂孢菌的菌株。

90.根据段落73-86中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是在SEQ ID NO:33中显示的蛋白酶，或与SEQ ID NO:33具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的蛋白酶。

91.根据段落73-87中任一项所述的工艺，其中葡糖淀粉酶在糖化和/或发酵期间存在和/或添加。

92.根据段落73-88所述的工艺，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的该葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株；或黑层孔属的菌株。

93.根据段落73-89中任一项所述的工艺，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含SEQ ID NO:26的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:26具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，SEQ ID NO:25的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，或与SEQ IDNO:25具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，以及SEQ ID NO:30的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，并且该α-淀粉酶包含以下取代：G128D+D143N，并且该α-淀粉酶与SEQ ID NO:30具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

94.根据段落中任一项所述的工艺73-90，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含显示为SEQ ID NO:134的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，或与SEQ ID NO:134具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的葡糖淀粉酶，以及披露为SEQ ID NO:30的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N，并且该α-淀粉酶与SEQ ID NO:30具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性。

95.根据段落73-91中任一项所述的工艺，其中海藻糖酶在糖化和/或发酵期间存在和/或添加。

96.根据段落95所述的工艺，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的该海藻糖酶是多肽，该多肽与SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性并且具有海藻糖酶活性。

97.根据段落95所述的工艺，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的该海藻糖酶是多肽，该多肽与SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少70％同一性、至少71％同一性、至少72％同一性、至少73％同一性、至少74％同一性、至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性并且具有海藻糖酶活性。

98.根据段落37-94中任一项所述的工艺，其中发酵或同时糖化和发酵(SSF)是在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行的。

99.根据段落37-98中任一项所述的工艺，其中在发酵之后例如通过蒸馏对该发酵产物进行回收。

100.根据段落37-99中任一项所述的工艺，其中该含淀粉起始材料是全谷物。

101.根据段落37-100中任一项所述的工艺，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。

102.根据段落37-101中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料选自由以下组成的组：农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、或木材(包括林业废弃物)。

103.根据段落37-102中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、柳枝稷和麦秸。

104.根据段落37-103中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料选自由以下组成的组：山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。

105.根据段落37-104中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料选自由以下组成的组：海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，

)、或经磷酸处理的纤维素。

106.根据段落37-105中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料是水生生物质。

107.根据段落37-106中任一项所述的工艺，其中该含纤维素材料是来自用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺的全酒糟副产物。

108.根据段落37-107中任一项所述的工艺，其中应用于发酵中的该生物是酵母，特别是酵母菌属物种，更特别是酿酒酵母。

109.一种酶共混物或酶组合物，其包含至少包含根据段落1-20中任一项所述的变体，以及一种或多种另外的酶。

110.根据段落109所述的共混物或组合物，其进一步包含产碳水化合物源的酶，特别地葡糖淀粉酶。

111.根据段落109-110中任一项所述的共混物或组合物，其进一步包含根据段落86-98中任一项所述的纤维素酶/纤维素分解组合物。

112.根据段落109-111所述的组合物，其中该另外的酶选自由以下组成的组：α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

113.一种组合物，该组合物包含：

(i)重组酵母宿主细胞或发酵生物，其中该酵母宿主细胞或发酵生物包含编码葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、和/或纤维素酶的异源多核苷酸；以及

m.(ii)根据段落1-22中任一项所述的一种或多种葡糖淀粉酶变体。

114.根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的用途。

115.一种颗粒，其包含：

n.含有根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的核心，和任选地，

o.由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。

116.一种颗粒，其包含：

p.核心，和

q.由包围该核心的一个或多个层组成的包衣，其中该包衣包含根据段落1-22中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

材料与方法

葡糖淀粉酶活性

可以按AGU单位来测量葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。

葡糖淀粉酶孵育：
		底物：	麦芽糖100mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
孵育温度：	37℃±1℃
		反应时间：	6分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

通过3个反应步骤描述分析原理：

步骤1是一个酶反应：

葡糖淀粉酶(AMG)EC 3.2.1.3(外切-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。

步骤2和3引起终点反应：

在由己糖激酶催化的反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab 30分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。

酸性α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，可以按AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)来测量任何酸性α-淀粉酶的活性。可替代地，可以按KNU-s(千诺维信单位((Kilo Novozymes Units(TermamylSC))))来测量酸性α-淀粉酶的活性。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

可按AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)来测量酸性α-淀粉酶活性。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下将淀粉酶活性确定为淀粉浓度的降低。

λ＝5g0nm

蓝色/紫色t＝23sec。无色

标准条件/反应条件：

实例1：葡糖淀粉酶文库的构建

如下构建葡糖淀粉酶文库：设计在一个或多个靶位点处具有NNK或一个或多个所希望的突变的正向或反向引物，这些靶位点彼此具有15bp的重叠。通过以下条件使用适当的模板质粒DNA(例如含有JPO-0001基因(SEQ ID NO:5的质粒DNA)进行反向PCR，即通过反向定向引物来扩增整个质粒DNA序列。通过QIAquick凝胶提取试剂盒[凯杰公司(QIAGEN)]来纯化所得PCR片段，然后将其引入大肠杆菌ECOS感受态大肠杆菌DH5α[日本基因株式会社(NIPPON GENE CO.,LTD.)]。通过MagExtractor质粒提取试剂盒[东洋公司(TOYOBO)]从大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，然后将其引入黑曲霉感受态细胞中。

PCR反应混合物：

PrimeSTAR Max DNA聚合酶[宝生物公司(TaKaRa)]

总计25μl

1,0μl模板DNA(1ng/μl)

9,5μl H₂O

12,5μl 2x PrimeSTAR Max预混物

1,0μl正向引物(5μM)

1,0μl反向引物(5μM)

PCR程序：98℃/2min，25x(98℃/10sec，60℃/15sec，72℃/2min)；10℃/保持

实例2：一种或多种变体与亲本相比的相对活性

将在实例1中构建的黑曲霉文库在32℃下在含有COVE液体培养基(2.0g/L蔗糖，2.0g/L异麦芽糖，2.0g/L麦芽糖，4.9mg/L、0.2ml/L 5N NaOH，10ml/L COVE盐，10ml/L 1M乙酰胺)的96孔或24孔MTP中发酵3天。然后，在几种温度下通过pNPG测定来测量培养上清液中的AMG活性。

pNPG热稳定性测定

将含有所希望的变体的培养上清液与相同体积的pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液混合。将20微升的这一混合物分配至96孔板或PCR八联排管中，然后在不同温度下通过热循环仪加热30min。将这些样品与含有0.1％(w/v)pNPG[和光株式会社(wako)]的10μl底物溶液于pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合，并且在70℃下孵育20min以进行酶促反应。反应后，添加60μl的0.1M Borax缓冲液以停止反应。取出80微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD₄₀₅值以评估酶活性。

根据本发明，所有变体都衍生自作为亲本葡糖淀粉酶并且在SEQ ID NO:1中披露的PE001。

表1a.当与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4的葡糖淀粉酶相比时变体的相对活性。

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表1b.当与JPO-022相比时JPO-AMG变体的相对活性列表

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表1c.当与JPO-063相比时JPO-AMG变体的相对活性列表

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表1d.当与JPO-096相比时JPO-AMG变体的相对活性列表

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表1e.当与JPO-129相比时JPO-AMG变体的相对活性

表1f.当与JPO-166相比时JPO-AMG变体的相对活性

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实例3：黑曲霉的发酵

将黑曲霉菌株在220rpm、30℃下于回转式摇床上的500ml带挡板烧瓶中发酵，这些烧瓶含有100ml MU1以及4ml 50％尿素。将培养液离心(10,000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开。

实例4：JPO-AMG的纯化

通过阳离子交换色谱法将PoAMG变体纯化。将峰级分合并并且用20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)透析，然后使用离心过滤装置(Vivaspin Turbo 15，赛多利斯公司(Sartorius))浓缩样品。通过A280值确定酶浓度。

实例5：热稳定性确定(TSA，热转移测定)

将纯化的变体用50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将18μl的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。

TSA的设备参数：

仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))

扫描速率：0.02℃/sec

扫描范围：37℃-96℃

积分时间：1.0sec

激发波长465nm

发射波长580nm

将获得的荧光信号归一化到0和1的范围内。将Td定义为信号强度是0.5时的温度。热稳定性改善在表3中列出，其中anPAV498的Td(SEQ ID NO:4)是0以及JPO-001(SEQ IDNO:3)是1.0。

实例6：JPO-AMG测定

通过GOD-POD方法的麦芽糖糊精(DE11)测定：底物溶液：30g麦芽糖糊精(来自松谷化学工业公司(MATSUTANI chemical industry Co.,Ltd.)的pindex#2)。100ml 120mM乙酸钠缓冲液，pH5.0。葡萄糖CII测试试剂盒(和光纯药工业株式会社(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.))。将20ul的酶样品与100ul的底物溶液混合，并且在设定温度下孵育2小时。将样品在铝块上冷却3min，然后将10ul的反应溶液与590ul的1M Tris-HCl(pH 8.0)混合以停止反应。将10ul的溶液与200ul的测试试剂盒的工作溶液混合，然后在室温静置15min。在A505处读取吸光度。将活性作为相比于anPAV498(SEQ ID NO:5)活性的相对活性列于表3中。

表3

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本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims

1.一种葡糖淀粉酶变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQID NO:1的6、7、31、34、50、132、447、481、484、501、539、568、595；并且其中所述变体与SEQID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

2.根据权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体任选地进一步在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的11、75、77、78、79、80、103、105、107、110、135、138、379、445、504、566、594。

3.根据权利要求1-2所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含取代：SEQ ID NO:1的6、7、11、31、34、50、75、77、78、79、80、103、105、107、110、132、135、138、379、445、447、481、484、501、504、539、566、568、592、594、595；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

4.根据前述权利要求中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体相对于亲本具有改善的特性，其中该改善的特性是增加的热稳定性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，所述改善的特性是增加的热稳定性，该增加的热稳定性使用TSA测量为至少0.1℃、至少0.2℃、至少0.3℃、至少0.4℃、至少0.5℃、至少0.6℃、至少0.7℃、至少0.8℃、至少0.9℃、至少1℃、至少1.5℃、至少2℃、至少2.5℃、至少3℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃，或至少1℃、至少1.5℃、至少2℃、至少2.5℃、至少3℃、至少3.5℃、至少4.0℃、至少4.5℃或至少5℃或至少5.5℃或至少6℃或至少6.5℃或至少7℃或至少7.5℃或至少8℃或至少8.5℃或至少9℃或至少9.5℃或至少10℃的增加的解链温度。

6.根据前述权利要求中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，变体在91℃下具有至少150，优选地至少200，更优选地至少250，最优选地至少300的相对活性。

7.根据前述权利要求中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中所述变体在对应于以下位置的位置处包含以下取代中的一个或多个：SEQ ID NO:1的G6S、G7T、P11F、R31F、K34Y、E50R、D75N、D75S、R77D、R77G、A78Q、A78W、V79D、F80Y、S103N、S105E、S105L、P107L、T110W、A132P、A132R、R135S、R138G、R138L、R138P、S379P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、E501L、E501V、Y504T、N539P、D566T、T568V、V592T、Q594R、F595S，并且其中所述变体与SEQID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

8.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

SEQ ID NO:1的D75N+R77D+A78Q；

D75S+R77G+A78W+V79D+F80Y；

K34Y+S103N；

K34Y+D445N+V447S；

K34Y+Y504T；

S103N+D445N+V447S；

S103N+Y504T；

D445N+V447S+Y504T；

K34Y+S103N+D445N+V447S；

K34Y+S103N+D445N+V447S+E501V+Y504T；

K34Y+S103N+Y504T；

K34Y+S103N+D445N+V447S+D566T；

K34Y+S103N+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

S105L；

S105E；

A132R；

K34Y+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+Y504T D566T Q594R F595S；

K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+D445N+V447S+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+E501V+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T；G6S+G7T+K34Y+S103N+S105L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+V592T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+Y504T+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132R+D445N+V447S+S481P+Y504T+D566T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+S103N+P107L+A132P+D445N+V447S+E501V+Y504T；

K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

G6S+G7T+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

R31F+K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Y504T+Q594R+F595S；

K34Y+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+S103N+A132P+D445N+V447S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+D566T+T568V+Q594R+F595S；

K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

R31F+K34Y+E50R+D75N+R77D+A78Q+S103N+R138L+D445N+V447S+Q594R+F595S；

R135S；

G6S+G7T+R31F+K34Y+E50R+S103N+A132P+D445N+V447S+S481P+T484P+E501A+N539P+D566T+T568V+Q594R+F595S，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1-13的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％但小于100％序列同一性。

9.一种多核苷酸或核酸构建体或表达载体，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

10.一种产生根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括在有益于产生该变体的条件下培养该重组宿主细胞，以及任选地，回收该变体。

11.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的变体，以及一种或多种另外的酶。

12.一种从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；

(b)使该液化的材料糖化；以及

(c)用发酵生物进行发酵；

其中使用至少一种根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)、步骤(b)、和/或步骤(c)。

13.一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(b)用发酵生物进行发酵，其中使用至少一种根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)和/或步骤(b)。

14.一种从含纤维素材料产生发酵产物的工艺，该工艺包括：

(a)任选地预处理含纤维素材料；

(b)使用产碳水化合物源的酶将含纤维素材料和/或预处理的含纤维素材料糖化；以及

(c)使用发酵生物进行发酵；

(d)其中本发明的至少一种或多种葡糖淀粉酶变体在糖化步骤(b)和/或发酵步骤c)期间存在或添加。

15.根据权利要求1-8中任一项所述的葡糖淀粉酶变体或根据权利要求10-11所述的组合物在乙醇生产中的用途。