MXPA01009812A - Variantes de alfa-amilasa. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una variante de una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, cuyas variantes exhiben propiedades alteradas, en particular capacidad reducida de escindir o desdoblar un substrato cerca al punto de ramificacion, y especificidad mejorada del substrato y/o actividad mejorada especifica relativa a la alfa-amilasa progenitora.

Description

^ » VARIANTES DE ALFA-AMILASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, inter alia, a las nuevas variantes, de las alfa-amilasas similares al **. termamilo, progenituras, especialmente variantes que exhiben propiedades alteradas, en particular patrones de escisión alterados (relativos a los progenitores) las cuales tienen ventajas con respecto a las aplicaciones de las variantes, en particular, la elaboración industrial de almidón (por ejemplo, licuefacción de almidón o sacarificación) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN L Ja,s alfa-amilasas (alfa-l, 4-glucan~4- glucanohidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacápdos y polisacáridos 1, 4-glucosidicos lineales y ramificados Existe un amplio cuerpo extensivo de patentes y literatura Icientifica que se relaciona a esta clase de enzimas muy importante industrialmente . Un número de alfa** amilasas taíes como las variantes de alfa-amilasas similares al termamilo son conocidas de por ejemplo, WO 90/11352, WO REF: 132767 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874 y WO 97/41213. Entre las recientes descripciones que se relacionan 'a las alfa-amilasas, la WO 96/23874 proporciona datos estructurales de los cristal por rayos X, en tres dimensiones para una alfa-amilasa similar al termamilo, referida como BA2, que consiste de los 300 residuos de aminoácido | N-terminal de la alfa-amilasa de B. amyl oliquefaciens que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada aqui en la SEC ID NO: 6 y los aminoácidos 301-483 del extremo C terminal de la alfa-amilasa de B. li cheniformis que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada aqfui en la SEC ID NO: 4 (la mas reciente esta comercialmente disponible bajo la marca comercial Termamyl™) , | y que se relaciona cercanamente a las alfa- amilasas de Bacill us importantes industrialmente (las cuales en di contexto presente están abarcadas dentro del significado I del término "alfa-amilasas similares al termamilo" ¡las cuales incluyen a inter alia , las alfa - amilasas de \ la B . li cheniformi s, B. amyloliquefaci ens y B. lichenif orm^s) . La WO 96/23874 describe además la metodología | para diseñar, con base en un análisis de la estructura de una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora,! variantes de la alfa-amilasa similar al termamilo, progenituras que exhibe propiedades alteradas relativas a la progenitora. La WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) describe l|as variantes de alfa-amilasa similares al termamilo con un patrón de escisión alterado, que contiene mutaciones ¡en los residuos de aminoácido V54, D53, Y56, Q333, G57 y A52 de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 de aqui .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas variantes alfa-amiloliticas (mutantes) de una alfa-amilasa similar al I termamilo, en particular las variantes que exhiben pat|rones de escisión alterados (relativas a la progenitora), las cuales tienen ventajas en conexión con la elaboración industrial de almidón (licuefacción de almidón, sacarificación y similares) . Los inventores han encontrado sorprendentemente variantes con propiedades alteradas, en particular patrones de escisión alterados que tienen capacidad reducida mejorada de escindir ?un substrato cerca del punto de ramificación, y adicionalmente tiene una especificidad de substrato mejorada y/o actividad especifica mejorada, en comparación a la WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) describe variantes alfa-amilasás similares al termamilo con un patrón de escisión alterado que contienen mutaciones en los residuos de aminoácido V54, D53, Y56, Q333, G57 y A52 de la secuencia se muestra áqui en la SEC ID NO: 4. La invención además se refiere a la construcción de ADN que codifica variantes de la invención, a una composición ' que comprende variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de variantes y composiciones de la invención, y al uso de variantes y composiciones de la invención, solo o en combinación , con otras enzimas alfa-amiloliticas en varios procesos industriales, tales como lavandería, lavado de platos y composiciones para la limpieza de superficies duras; producción de etanol, tales como combustible, bebidas y producción de etanol; desencolado de textiles, telas o prendas etc.

Nomenclatural En' la presente descripción y reivindicaciones, son usados los códigos convencionales de una letra y tres letras para los residuos de aminoácido. Para facilitar la referencia, las variantes de alfa-amilasa de la invención son descritas mediante el uso de la siguiente nomenclatura: Los aminoácidos originales: posiciones: aminoácidos substituidos . 5 De acuerdo a esta nomenclatura, por ejemplo la substitución de alanina por asparagina en la posición 30 se conoce como: Ala30Asn o A30N Una supresión de alanina en la misma posición se conoce 10 como : Ala30* o A30* e inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como la lisina, se conoce como: *30 aLis o *30aK 15 una supresión de un extensión consecutiva de residuos de aminoácido, 'tales como los residuos de aminoácido 30-33, se indica como (30-33)* o ? (A30-N33) o delta (A30-N33) . En donde una alfa-amilasa especifica contiene una "supresión" en comparación con otras alfa-amilasas y una 20 inserción se elabora en una posición tal como se indica como : *3,6Asp o *36aD para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36 ajÉ, ^ Í ? Las mutaciones múltiples son separadas mediante signos más, es decir; : Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S Representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 5 substituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparagina y serina respectivamente. Las mutaciones múltiples también pueden ser separadas como sigue, es decir., significa el mismo como el signo más: Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S 10 Cuando uno o mas residuos de aminoácido alternativos1 pueden ser insertados en una posición dada esto se indica como A30N, E o A30N o A30E 15 Adicionalmente, cuando una posición adecuada por modificación se identifica aqui sin cualquier modificación especifica que se sugiere, o A30X, se entiende que cualquier residuo de aminoácido puede ser substituido por el residuo de aminoácido presente en la posición. Asi, por ejemplo, 20 cuando una modificación de una alanina en la posición 30 se menciona, pero no se especifica, o se especifica como "X" se entiende que la alanina puede ser suprimida o substituida por cualquier otro aminoácido, es decir., cualesquiera de uno de: R,N,¡D, C, Q,E,G,H, I, L,K,M, F, P, S, T, W, Y, V.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las alfa-amilasas similares al termamilo Se conoce que un número de alfa-amilasas producidas por bacill us spp . son altamente homologas en el nivel del aminoácido. De hecho, la alfa-amilasa de B . Li cheniformis que comprenden la secuencia de aminoácido se muestra en la SEC ID NO: 4 (comercialmente disponible como Termamilo™) se ha encontrado que es aproximadamente 89% homologo con la alfa-amilasa de B. amyl oliquefaci ens que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 6 y aproximadamente 79% homólogo con la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que comprenden la secuencia de aminoácido mostrados en la SEC ID NO: 8. Además las alfa-amilasas homologas incluyen una alfa-amilasa derivada de una cadena de la Bacill us sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales son descritas en detalle en WA 95/26397, y el #707 alfa-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.

No obstante, además las alfa-amilasas homologas incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa B. Li cheniformi s descritas en EP 0252666 (ATCC 27811), y la alfa-amilasa identificada en WA 91/00353 y WA 94/18314. Otras alfa-amilasas similares al termamilo comerciales son Optitherm™ y takatherm™ (disponibles por Solvay) , Maxamyl™ (disponible por Gist-brocades/genencor) , Spezym AA™ y Spezym Delta AA™ (disponible por Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) . Debido a la homología substancial encontrada entre estas alfa-amilasas, son consideradas que pertenecen a la misma clase de alfa-amilasas, particularmente la clase de "alfa-amilasas similares al termamilo". Por consiguiente, en el contexto presente, el término "alfa-amilasas similares al termamilo" se entiende como alfa-amilasas que en el nivel del aminoácido exhiben una homología substancial al Termamyl™, es decir, las alfa-amilasas de B. li cheniformis que tienen la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. En otras palabras, una alfa-amilasa similar al termamilo es una alfa-amilasa la cual tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID NO: 2, 4„ 6 u 8 en la presente y que tiene la secuencia de aminoácido mostrados en la SEC ID NO: 1 o 2 de WO 95/26397 o en Tsukamoto et al., 1988, o i) que exhibe al menos 60%, se prefiere al menos 70%, se prefiere mas al menos 75%, aún mas se prefiere al menos 90%, aún mas se prefiere especialmente al menos 95% de homología, más se prefiere al menos 97%, se prefiere mas al menos 99% con al menos uno de dichas secuencias de aminoácido y/o ii) exhibe una reactividad cruzada inmunológica con un anticuerpo generado contra al menos una de dicha alfa-amilasa, y/o iii) se codifica mediante una secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican las alfa-amilasas arriba especificadas las cuales son aparentes de la SEC ID NOS: 1, 3, 5 y 7 de la presente solicitud y la SEC ID NOS: 4 y 5 de WO 95/26397 respectivamente. En conexión con la propiedad i) , la "homología" puede ser determinada mediante el uso de cualquier algoritmo convencional, preferiblemente mediante el uso del programa GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio de 1993) usando valores por omisión para las penalidades GAP (intervalo), la cual es una penalidad por creación del intervalo de 3.0 y la penalidad por extensión del intervalo de 0.1, (Genetic Computer Group (1991) Programa Manual para el paquete GCG versión 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin USA 53711) .

Uria alineación estructural entre el termamilo y una alfa-amilasa similar al termamilo puede ser usada para identificar las posiciones equivalentes/correspondientes en otras alfa-amilasas similares al termamilo. Un método para obtener dicha alineación estructural es usar el programa Pile Up del paquete GCG usando los valores por omisión de las penalidades por intervalo (GAP) , es decir, una penalidad de creación del intervalo de 3.0 y la penalidad por extensión del intervalo de 0.1. Otros métodos de alineación estructural incluyen el análisis de los cúmulos hidrofóbicos (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp . 149-155) y (Huber, T; torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1988). La propiedad ii) de la alfa-amilasa, es decir, la reactividad cruzada inmunológica, puede ser ensayada usando un anticuerpo generado contra, o reactivo con, al menos un epitope de la alfa-amilasa similar al termamilo, relevante. El anticuerpo que puede ser ya sea monoclonal o policlonal, puede ser producido mediante métodos conocidos en la técnica, por ej emplo . , como se describe por Hudson et al., Practical Immunology, tercera edición (1989), Black ell Scientific Publications . La reactividad cruzada inmunológica puede ser determinada usando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son ensayos de manchado Western o de inmunodifusión radial, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., 1989. A este respecto, se ha encontrado la reactividad cruzada inmunológica entre las alfa-amilasas que tienen las secuencias de aminoácido SEC ID NOS: 2, 4, 6 u 8, respectivamente. La prueba o sonda de oligonucleótido usada en la caracterización de las alfa-amilasas similares al termamilo de acuerdo con la propiedad iii) de arriba, puede ser preparada adecuadamente con la base del nucleótido total o parcial o secuencia de aminoácido de las alfa-amilasas en cuestión. Las condiciones adecuadas para una experimentación de hibridización implica el pre-humedecimiento en 5xSSC y pre-hibridización durante 1 hora a ~40°C en una solución de 20% de formamida, solución de 5xDenhardt, fosfato de sodio 50mM, pH 6.8 y 50 mg de ADN del timo de ternero sonicado, desnaturalizado, seguido por la hibridización en la misma solución suplementada con lOOmM ATP durante 18 horas a ~40°C, seguido por tres veces del lavado del filtro en 2xSSC, 0.2% de SDS a 40°C durante 30 minutos (baja severidad) , preferido a 50°C (severidad media) , mas preferiblemente a 65°C (severidad alta) , aún mas preferiblemente a ~75°C (severidad muy alta) . Pueden encontrarse mas detalles acerca del método de hibridización en Sambrook et al., Molécular_Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989. En la presente contexto, "derivado de" se entiende no solo porque indica una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término pretende indicar una alfa-amilasa, el cual se codifica mediante una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que tiene las características de identificación de la alfa-amilasa en cuestión. El término también pretende indicar que la alfa-amilasa progenitora puede ser una variante de una alfa-amilasa que se presenta naturalmente, es decir, una variante, el cual es el resultado de una modificación (inserción, substitución, supresión) de uno o mas residuos de aminoácidos de la alfa-amilasa que se presenta naturalmente . Alfa-amilasa hibrida progenitora La alfa-amilasa progenitora puede ser un alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa que comprende una combinación de secuencias parciales de aminoácido derivado de al menos dos alfa-amilasas. La alfa-amilasa híbrida progenitora puede ser una, que en base a la homología del aminoácido y/o reactividad cruzada y/o inmunológica y/o hibridización de ADN (como se definió arriba) se puede determinar que pertenece a la familia de las alfa-amilasas similares al termamilo. En este caso, la alfa-amilasa híbrida se compone típicamente de al menos una parte de una alfa-amilasas similar al termamilo y parte (s) de una o mas de otras alfa-amilasas seleccionadas del alfa-amilasas similares al termamilo o alfa-amilasas no similares al termamilo de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero. Así, la alfa-amilasa híbrida progenitora puede comprender una combinación de secuencias de aminoácido parciales derivados de al menos dos alfa-amilasas similares al termamilo, o de al menos una similar al termamilo y al menos una alfa-amilasa bacteriana no similar al termamilo, o de al menos una similar al termamilo y al menos una alfa-amilasa fúngica. La alfa-amilasa similar al termamilo de la cual la secuencia parcial de aminoácidos se deriva puede, por ejemplo ser cualesquiera de aquellas alfa-amilasas similares al termamilo, específicas, referidas aquí.

Por ejemplo, la alfa-amilasa progenitora puede comprender una parte C terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. lincheniformis, y una parte N terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B . stearothermophil us . Por ejemplo, la alfa-amilasa progenitora puede comprender al menos 430 residuos de aminoácido de la parte C terminal de la alfa-amilasa de B. licheniformis, y puede por ejemplo, comprender: a) un segmento de aminoácido correspondiente a los 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa de B. amyl oliquef aci ens que tienen la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 6 y un segmento de aminoácido correspondiente a los 445 residuos de aminoácido C terminales de la alfa-amilasa de B. li cheniformis que tienen la secuencia de aminoácido mostrados en la SEC ID NO: 4, o b) un segmento de aminoácido correspondiente a los 68 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tienen la secuencia de aminoácido mostrados en la SEC ID NO: 8 y un segmento de aminoácido correspondiente a los 415 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa de B. licheniformi s que tienen la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4.

En una modalidad preferida la alfa-amilasa similar al termamilo progenitora es un híbrido de la alfa-amilasa similar al termamilo, idéntico a la alfa-amilasa de Bacill us licheniformi s mostradas en la SEC ID NO: 4, excepto que los 35 residuos de aminoácido N-terminal (de la proteína madura) se reemplaza con los 33 residuos de aminoácido N-terminal de la proteína madura de la alfa-amilasa de Bacill us amyl oliquef aci ens (BAN) mostrada en la SEC ID NO: 6. Dicho híbrido puede además tener las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) referida como LE174. Otro híbrido de alfa-amilasa progenitora preferido es LE429 mostrado en la sEC ID NO: 2. La alfa-amilasa no similar al termamilo puede, por ejmplo, ser una alfa-amilasa fúngica, una alfa-amilasa de mamífero o una alfa-amilasa de planta o una alfa-amilasa bacteriana (diferente de una alfa-amilasa similar al termamilo). Los ejemplos específicos de tales alfa-amilasas incluyen a la alfa-amilasa TAKA de Aspergill us oryzae, la alfa-amilasa acida de A. níger, la alfa-amilasa de Bacill us subtilis, la alfa-amilasa pancreática porcina y una alfa-amilasa de cebada. Todas estas alfa-amilasas tienen estructuras elucidadas que son marcadamente diferentes de la estructura de una alfa-amilasa similar al termamilo típico como se refirió aquí. Las alfa-amilasas fúngicas mencionada arriba, es decir, derivada de A. niger y A. oryzae, son altamente homologas en el nivel y generalmente se considera que pertenecen a la misma familia de las alfa-amilasas. La alfa-amilasa fúngica derivada de la Aspergillus oryzae esta comercialmente disponible bajo el nombre comercial Fungamyl™. Adicionalmente, cuando se hace referencia a una variante particular de una alfa-amilasa similar al termamilo (variante de la invención) - de una manera convencional-mediante referencia a al modificación {por ejempl o . , supresión o substitución) de residuos de aminoácido específicos en la secuencia de aminoácido de una alfa-amilasa similar al termamilo, se entiende que las variantes de otra alfa-amilasa similar al termamilo modificado en las posición (es) equivalentes (determinadas por el mejor alineamiento posible de la secuencia de aminoácido entre las secuencias de aminoácido respectivas) están englobadas por las mismas. Una modalidad preferida de una variante de la invención es un derivado de la alfa-amilasa de B . licheniformis (como alfa-amilasas similares al termamilo progenitoras), por ejemplo, una de aquellas referidas arriba, tales como la alfa-amilasa de B . licheniformis que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID: 4.

Construcción de variantes de la invención La construcción de la variante de interés puede ser lograda mediante el cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son favorables para producir la variante. Esta variante puede entonces ser subsecuentemente recuperada de los caldos de cultivo resultante. Esto se describe adicionalmente en detalle abajo.

Propiedades Alteradas Lo siguiente discute la relación entre las mutaciones, que pueden estar presentes en variantes de la invención, y alteraciones deseables en las propiedades (relativas a aquellas de una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora), que pueden resultar de las mismas. En el primer aspecto de la invención, se refiere a un avariante de una alfa-amilasa similar al termamilo progenitora que comprende un alteración a una o mas posiciones seleccionadas del grupo de: W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, Allí, S168, M197, en donde (a) la(s) alteración (es) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en la dirección 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición o, (iii) una substitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente. (b) la variante tiene una actividad alfa-amilasa y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia del aminoácido de la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4. En una modalidad preferida, las variantes de arriba de la invención comprenden una mutación en una posición correspondiente al menos a una de las siguientes mutaciones, en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4: V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; o T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; o T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G07I, G107L, G107C. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las mutaciones siguientes en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: : W13F,L, I,V, Y, A; G48A,V,S,T, I,L; *48aD o *48aY (es decir, inserción de D o Y) ; T49X; *49aX (es decir, inserción de cualquier posible residuo de aminoácido) S50X, en particular D,Y,L,T,V, I; Q51R,K; A52X, en particular A52S, N, T, F, L, I, V; D53E,Q,Y, I,N,S,T,V,L; V54X, en particular V541, N, W, Y, F, L; G57S,A,V,L, I,F,Y,T; G107X, en particular G107A, V, S, T, I, L, C; G108X, en particular G108A, V, S, T, I, L; A111V, I,L; S168Y; M197X, en particular Y, F, L, I, T, A, G. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende las siguientes mutaciones correspondientes a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4: T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, y además comprende G108A. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación correspondiente a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. T49L+G107A; 149I+G107A; T49L+G107A+V54I; T49I+G107A+V54I; A52S+V54N+T49L+G107A; A52S+V541+T49L+G107A; A52S+T49L+G107A; A52T+T49L+G107A; A52S+V54N+T49I+G107A; A52S+V54I+T49I+G107A; A52S+T49I+G107A; T49L+G108A; T49I+G108A; T49L+G108A+V54I; T49I+G108A+V54I. Todas las variantes mencionadas arriba, de la invención, tienen propiedades alteradas (que significa aumento o disminución de las propiedades), en particular al menos una de las siguientes propiedades relativas a las alfa-amilasas análogas. Reducen la habilidad para escindir a un substrato cercano al punto de ramificación, especificidad del substrato mejorada y/o actividad específica mejorada, enlazando un substrato alterado, estabilidad térmica alterada, pH alterado/ perfil de la actividad, pH alterado/ perfil de estabilidad, estabilidad alterada hacia la oxidación, dependencia de Ca2- alterada. Estabilidad En el contexto de la presente invención, las mutaciones (incluyendo las substituciones y/o eliminaciones de aminoácidos) de importancia con respecto a lograr la estabilidad alterada, en particular la estabilidad mejorada (es decir, superior o inferior) especialmente a un pH bajo (es decir, pH de 4-6) que incluye cualquiera de las mutaciones listadas en la sección ''propiedades alteradas", de arriba y las variantes mencionadas justo abajo. Las siguientes variantes: Q360A, K; N102A, N326A, L, N190G, N190K, Y262A,K,E (usando la BAN, es decir, la SEC ID NO: 6, numerando) también se probaron para estabilidad al pH. Una alfa-amilasa progenitora preferida puede ser la BA2 descrita arriba, La estabilidad al pH se determinó como se describe en la sección 'Materials & Methods" . Estabilidad de Ca2+ La estabilidad de Ca2+ alterada significa que la estabilidad de la enzima se ha mejorado bajo la reducción de Ca2*, es decir, una estabilidad superior o inferior. En el contexto de la presente invención, las mutaciones (incluyendo las substituciones de aminoácidos) de importancia con respecto a lograr la estabilidad alterada de Ca2*, en particular la estabilidad de Ca2+ mejorada, es decir, la estabilidad superior o inferior, a especialmente pH bajo (es decir, pH de 4 a 6) incluyendo a cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades alteradas" de arriba.

Actividad Específica En un aspecto adicional de la presente invención, las mutaciones importantes con respecto a obtener variantes que exhiben actividad específica alterada, en particular la actividad específica aumentada o disminuida, especialmente a temperaturas de 60-100°C, preferiblemente de 70-95°C, especialmente de 80-90°C, incluye cualesquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades alteradas" de arriba . La actividad específica de LE174 y LE429 se determinó para 16,000 UN/mg usando los ensayos Phadebas® descritos en la sección "Materials and Methods" .

Patrón de escisión alterada En el proceso de licuefacción del almidón, es deseable usar una alfa-amilasa la cual es capaz de degradar las moléculas de almidón en oligosacápdos ramificados, largos, en lugar de una alfa-amilasa, la cual da lugar a una formación de oligosacáridos ramificados más cortos (como alfa-amilasas similares al termamilo convencionales) . Los oligosacáridos ramificados cortos (precursores de panosa) no son hidroliZados satisfactoriamente por pululanasas, que son usadas después del tratamiento de las alfa-amilasas en el proceso de licuefacción, o simultáneamente con una amiloglucosidasa sacarificante (glucoamilasa) , o antes de añadir una amiloglucosidasa sacarificante (glucoamilasa) . Así, en presencia de precursores de panosa, la mezcla del producto presente después del tratamiento con glucoamilasa contiene una proporción significante de la así llamada dextrina limite ramificada corta viz. El trisacárido de panosa. La presencia de panosa disminuye la producción de sacarificación significativamente y esto es indeseable. Se ha reportado previamente (Patente norteamericana 5,234,823) que cuando se sacarifica con glucoamilasa y pululanasa, la presencia de la actividad de la alfa-amilasa residual que surge del proceso de licuefacción puede llevar a rendimientos bajos de glucosa, si la alfa-amilasa no se inactivo antes de la etapa de sacarificación. Esta inactivación puede ser típicamente llevada a cabo mediante el ajuste del pH por debajo de 4.7 a 95°C, antes de disminuir la temperatura a 60°C para la sacarificación. La razón a este efecto negativo en la producción de glucosa no se entiende completamente, pero se asume que la alfa-amilasa de licuefacción (por ejemplo 120 L de termamilo de B. licheniformis) genera a las "dextrinas límite" (las cuales son substratos pobres para la pululanasa) , mediante la hidrolización de los enlaces de 1, 4-alfa-glucosídicos cercanos a y o en ambos sitios de los puntos de ramificación en amilopectina. La hidrólisis de estas dextrinas límites mediante glucoamilasa llevan a la conformación del trisacárido de panosa el cual es solo lentamente hidrolizado mediante glucoamilasa. El desarrollo de una alfa-amilasa termoestable que no sufre de esta desventaja, sería una mejora significativa, puesto que no sería requerido el paso de inactivación separado. Así, el objetivo de la presente invención es llegar a una alfa-amilasa mutante que tenga características de degradación del almidón, modificadas apropiadamente pero que retengan la termoestabilidad de la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora. Por consiguiente, la invención se refiere a una variante de una alfa-amilasa similar al termamilo, la cual tiene una capacidad mejorada reducida para escindir un substrato cercano al punto de ramificación, y adicionalmente tiene una especificidad del substrato mejorado y/o una actividad específica mejorada. De particular interés es una variante, la cual escinde un substrato de amilopectina, del extremo reductor, mas que una unidad de glucosa del punto de ramificación, preferiblemente mas de una unidad de glucosa del punto de ramificación, preferiblemente mas de dos o tres unidades de glucosa del punto de ramificación, es decir, a una distancia adicional del punto de ramificación que aquella obtenida por el uso de una alfa-amilasa de B . li cheniformis tipo silvestre . Puede ser mencionado aquí, que de acuerdo a la WO 96/23874, las variantes que comprenden al menos una de las siguientes mutaciones se espera que prevengan la escisión cercana al punto de ramificación. V54L, I,F,Y,W,R,K,H,E,Q; D53L, I,F,Y,W; Y56W; Q333W; G57, todos los residuos de aminoácido posibles; A52, residuos de aminoácido mayores que A, por ejemplo., A52W, Y,L,F, I. Las mutaciones de particular interés en relación para obtener las variantes de acuerdo a la invención que tienen una capacidad reducida mejorada para escindir un substrato cercano al punto de ramificación, y adicionalmente tienen una especificidad del substrato mejorado y/o actividad específica mejorada, incluye mutaciones en las posiciones siguientes en la alfa-amilasa de B. li cheniformis , SEC ID NO: 4: H156, A181, N190, A209, Q264 Y 1201. Debería enfatizarse que no solo pueden ser usadas las alfa-amilasas similares al termamilo mencionadas específicamente abajo. También, pueden ser usadas otras alfa-amilasas similares al termamilo, comerciales. Una exhaustiva lista de tales alfa-amilasas es la siguiente: Las alfa-amilasas producidas por la cepa B . licheniformis descrita en la EP 0252666 (ATCC 27811), y las alfa-amilasas identificadas en la WO 91/00353 y la WO 94/18314. Otras alfa-amilasas similares al termamilo de B. Licheniformis comerciales son Takatherm™ (disponible de Solvay) , Maxamyl™ (disponible de Gist-brocades/Genencor) , Spezym AA™ Spezyme Delta AA™ (disponible de Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) . Todas las alfa-amilasas similares al termamilo pueden ser usadas adecuadamente como cadena principal para preparar variantes de la invención. En una modalidad preferida de la invención, la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, es una alfa-amilasa hibrida de la SEC ID NO: 4 y la SEC ID NO: 6.

Específicamente, la alfa-amilasa híbrida similar al termamilo, progenitora, puede ser un híbrido de la alfa-amilasa que comprende los 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa de B . licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa madura derivada de B. amiloliquef aciens mostrada en la SEC ID NO: 6, la cual puede tener adicionalmente de manera adecuada las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4). Este híbrido se refiere como LE174. El híbrido LE174 puede ser combinado con una mutación adicional 1201F para formar un híbrido de alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, que tiene las mutaciones siguientes H156Y+A181T,N190F,A209V+Q264S+I201F (usando la SEC ID NO: 4 para numeración) . Esta variante de híbrido se muestra en la SEC ID NO: 2 y se usa en los ejemplos de abajo, y se refieren como LE429. También, LE174 o LE429 (SEC ID NO:2) o la alfa-amilasa de B. li cheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4 que comprende una o mas de las siguientes mutaciones, pueden ser usadas como cadena principal (usando la SEC ID NO: 4 para la numeración de las mutaciones) : E119C; D124C; R127C. A52 todos los residuos de aminoácido posibles; S85 todos los residuos de aminoácido posibles; N96 todos los residuos de aminoácido posibles V129 todos los residuos de aminoácido posibles; A269 todos los residuos de aminoácido posibles; A378 todos los residuos de aminoácido posibles; S148 todos los residuos de aminoácido posibles; en particular S14BN; E211 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular E211Q; N188 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular N188S, N188P M197 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular M197T, M197A, M197G, M197I, M197L, M197Y, M197F, M197I; W138 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular W138Y; D207 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular D207Y; H133 todos los residuos de aminoácido posibles, in particular H133Y; H205 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular H205H, H205C, H205R; S187 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular S187D; A210 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular A210S, A210T; H405 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular H405D; K176 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular K176R; F279 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular F279Y; Q298 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular Q298H; G299 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular G299R; L308 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular L30BF; T412 todos los residuos de aminoácido posibles, en particular T412A; Adicionalmente, la alfa-amilasa de B . licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 que comprende al menos una de las siguientes mutaciones pueden ser usadas como esqueleto o cadena principal: M15 todos los residuos de aminoácido posibles; A33 todos los residuos de aminoácido posibles; Cuando se usa LE429 (mostrada en la SEC ID NO: 2) como la estructura o cadena principal (es decir, como la alfa-amilasa similar al termamilo progenitora) mediante la combinación de LE174 con la mutación de I201F (SEC ID NO: 4 numeración) , las mutaciones/alteraciones, en particular las substituciones, eliminaciones e inserciones, pueden de acuerdo a la invención ser elaboradas en una o mas de las siguientes posiciones para mejorar la capacidad reducida para escindir o desdoblar un substrato cercano al punto de ramificación, y para mejorar la especificidad del substrato y/o actividad específica mejorada: W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, Allí, S168, M197 (usando la SEC ID NO: 4 numeración) en donde (a) la alteración (es) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en la dirección 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una substitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene una actividad de alfa-amilasa y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácido de la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4: V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, AS2S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; o T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; o T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G07I, G107L, G107C. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostradas en la SEC ID NO: 4: W13F,L, I,V,Y,A; G48A,V,S,T, 1,L; *48aD o *48aY (es decir., una inserción de D o Y); T49X; *49aX (es decir., la inserción de cualquier residuo de aminoácido) S50X, en particular D,Y,L,T,V, I; Q51R, K; A52X, en particular A52S, N, T, F, L, I, V; D53E, Q,Y, I,N,S,T,V,L; V54X, en particular V541, N, W, Y, F, L; G57S,A,V,L, I,F,Y,T; G107X, en particular G107A, V, S, T, I, L, C; G108X, en particular G108A, V, S, T, I, L; A111V, I,L; S168Y; M197X, en particular Y, F, L, I, T, A, G.

En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las mutaciones siguientes en la secuencia de aminoácido mostradas en la SEC ID NO: 4: 149X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, y puede además comprender G108A. En una modalidad preferida, una variante de la invención comprende al menos una mutación en una posición correspondiente a las mutaciones siguientes en la secuencia de aminoácido mostradas en la SEC ID NO: : T49L+G107A; T49I+G107A; T49L+G107A+V54I; T49I+G107A+V54I; A52S+V54N+T49L+G107A; A52S+V54I+T49L+G107A; A52S+T49L+G107A; A52T+T49L+G107A; A52S+V54N+T49I+G107A; A52S+V541+T49I+G107A; A52S+T49I+G107A; T49L+G108A; T49I+G108A; T49L+G108A+V54I; T49I+G108A+V54I. Mutaciones generales en variantes de la invención Puede preferirse que una variante de la invención comprenda una o mas modificaciones además de aquellas esquematizadas arriba. Así, puede ser ventajoso que uno o mas residuos presentes en la parte de la variante de alfa-amilasa que se modifica es/son reemplazadas con un residuo no-prolina que puede ser cualesquiera de los residuos posibles de no-prolina que se presentan de manera natural, y que preferiblemente es una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina. Análogamente, puede preferirse que uno o mas residuos de cisteina presentes entre los residuos de aminoácido con los cuales la alfa-amilasa progenitora se modifique es/son reemplazados con un residuo de que no sea cisteina tales como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leücina. Adicionalmente, una variante de la invención pueda - ya sea como la única modificación o en combinación con cualesquiera de las modificaciones esquematizados arriba -ser modificada de manera que uno o mas Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de la SEC ID NO: 4 se reemplaza mediante un Asn y/o Gln respectivamente. También de interés es el reemplazo en la alfa-amilasa similar al termamilo, de uno o mas de los residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácido correspondientes al fragmento al aminoácido 185-209 de la SEC ID NO: 4 mediante la Arg. Se entenderá que la presente invención incluye variantes que se incorporan en dos o mas de las modificaciones esquematizadas arriba. Adicionalmente, puede ser ventajoso por introducir mutaciones en cualesquiera de las variantes descritas aquí.

Métodos para preparar variantes de alfa-amilasa Varios métodos para introducir mutaciones en los genes son conocidos en la técnica. Después de una breve discusión de la clonación de las secuencias de ADN que codifican a la alfa-amilasa, serán discutidos los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica a la alfa amilasa.

Clonación de una, secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa La secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo produciendo la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, una biblioteca de ADN genómico y/o de ADNc deberá construirse usando un ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la alfa-amilasa a ser estudiada. Después, si la secuencia del aminoácido de la alfa-amilasa se conoce, se pueden sintetizar las sondas de oligonucleótido, etiquetadas, homologas y usarse para identificar los clones que codifican a la alfa-amilasa de una biblioteca genómica preparada del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótido etiquetada que contienen secuencias homologas para un gen de alfa-amilasa conocido, puede ser usada como una sonda para identificar los clones que codifican a la alfa-amilasa, usando la hibridización y las condiciones de lavado de baja severidad. Aún, otro método para identificar los clones que codifican a la alfa-amilasa involucraría la inserción de fragmentos del ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, la transformación de una bacteria alfa-amilasa negativa con la biblioteca del ADN genómico resultante, y después colocar la bacteria transformada en placas de agar que contiene un substrato para la alfa-amilasa, permitiendo así expresar los clones de la alfa-amilasa que van a ser identificados.

Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosforoamidita descrito por S.L. Beacage and M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforoamidita, los oligonucléotidos son sintetizados por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificado, sometido a calor y frió, ligado y clonado en vectores apropiados. Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen sintético y genómico mezclado, sintético mezclado y origen de ADNc o genómico mezclado y origen de ADNc preparado mediante los fragmentos ligantes de ADNc de origen sintético o genómico (apropiados, los fragmentos corresponden a varias partes de la secuencia de ADN total) , de acuerdo con las técnicas estándar. La secuencia de ADN puede también ser preparada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores específicos por ejemplo como se describe en la Patente norteamericana 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis dirigida al Sitio Una vez que una secuencia de ADN que codifica la alfa-amilasa se ha aislado, y los sitios deseables para la mutación se identificaron, las mutaciones pueden ser introducidas usando oligonucléotidos sintéticos. Estos oligonucléotidos contienen secuencias de nucleótido que flanquean los sitios de mutación deseadas; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis del oligonucleótido. En un método específico, un intervalo de una hebra de ADN, que enlaza la secuencia que codifica a la alfa-amilasa, se crea en un vector que transporta el gen de la alfa-amilasa. Después, el nucleótido sintético que lleva la mutación deseada se hibridiza mediante aplicación de calor y frío, a una porción homologa del ADN de una sola hebra. El espaciamiento o intervalo restante se llena después con la polimerasa I de ADN (fragmento Klenow) y el constructo se liga usando la ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). La US 4,760,025 describe la introducción de oligonucléotidos que codifican múltiples mutaciones mediante la realización de alteraciones menores del cásete. Sin embargo, aún una mayor variedad de mutaciones pueden ser introducidas en cualquier tiempo mediante el método Morinaga, porque pueden ser introducidos una multitud de oligonucléotidos de varias longitudes.

Otro método para introducir mutaciones en las secuencias de ADN que codifican a la alfa-amilasa se describe en Nelson y Long (1989) . Este involucra la generación en 3 pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada, introducida mediante el uso de una hebra de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR.' A partir del fragmento de PCR generado, un fragmento de ADN que lleva a cabo la mutación puede ser aislado mediante la escisión con endonucleasas de restricción y reinsertarse en un plásmido de expresión.

Mutagénesis Aleatoria La mutagénesis se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis aleatoria específica de región o localizada en al menos tres partes del gen que se traduce a la secuencia de aminoácido mostrado en cuestión, o dentro del gen completo. La mutagénesis de la secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa progenitora puede ser convenientemente realizada mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica . En relación a lo de arriba, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una alfa-amilasa progenitora, por ejemplo, en donde la variante exhibe una capacidad reducida de escisión o desdoblamiento de un substrato de oligosacárido cercano al punto de ramificación, y adicionalmente exhibe una especificidad del substrato mejorada y/o una actividad específica mejorada relativa a la progenitora, el método: (a) somete una secuencia de ADN que codifica a la alfa-amilasa progenitora a la mutagénesis aleatoria, (b) expresa la secuencia de ADN mutada obtenida en el paso (a) en una célula hospedera, y © selecciona las células hospederas expresando una variante que tiene una propiedad alterada (es decir, estabilidad térmica) relativa a la alfa-amilasa progenitora. El paso (a) del método de arriba de la invención se realiza preferiblemente usando cebadores alterados. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada mediante el uso de un agente químico o físico que ocasiona la mutagénesis adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o mediante el sometimiento de la secuencia de ADN a la mutagénesis generada por PCR. Adicionalmente, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes . El agente mutagenizante puede por ejemplo, ser uno de los cuales induzca las transiciones, transversiones, inversiones, mezclas, eliminaciones, y/o inserciones. Ejemplos de un agente mutagenizante químico o físico adecuado para el presente propósito incluyen la irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanídina (MNNG) , 0-meti1 hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando son usados tales agentes, la mutagénesis se realiza típicamente mediante la incubación de la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora que va a ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de preferencia bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tome lugar, y seleccionar el ADN mutado que tiene las propiedades deseadas. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser alterado o inutilizado con tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que van a ser cambiadas. La alteración o inutilización puede ser realizada de manera que sean evitados los codones para los aminoácidos no deseados. El oligonucleótido alterado o inutilizado puede incorporarse en el ADN que codifica la enzima de la alfa-amilasa mediante cualquier técnica publicada usando por ejemplo, PCR, LCR o cualquier polimerasa de ADN y ligasa como se estime apropiado. Preferiblemente, la alteración se lleva acabo usando "alteración aleatoria constante" en la cual el porcentaje del tipo silvestre y la mutación en cada posición se predefine. Adicionalmente, la alteración puede ser dirigida hacia una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos, y consecuentemente una preferencia para la introducción de uno o mas residuos de aminoácido específico. La alteración puede ser elaborada, por ejemplo, de manera que permita la introducción de 90% del tipo silvestre y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de alteración se basa en la genética así como en las restricciones estructurales de la proteína. El esquema de la alteración puede ser elaborada mediante el uso del programa DOPE, inter alia lo cual asegura que se evite la introducción de los codones. Cuando se usa la mütagénesis generada por PCR ya sea con un gen no tratado o tratado que codifica una alfa-amilasa progenitora se somete a PCR bajo condiciones que incrementen la incorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.l, 1989, pp . 11-15). Una cepa mutante de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191) , S . cerevisae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usado para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la alfa-amilasa mediante, por ejemplo, la transformación de un plásmido que contiene La glicosilasa progenitora en la cepa mutante, crecimiento de la cepa mutante con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutante. El plásmido mutado puede ser transformado subsecuentemente en el organismo de expresión. La secuencia de ADN a ser mutagenizada puede estar presente convenientemente en una biblioteca de ADNc o genómica preparada a partir de un organismo que expresa la alfa-amilasa progenitora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que puede ser incubado como tal con, o de otra manera expuesto al agente mutagenizante. El ADN a ser mutagenizado puede también estar presente en una célula hospedera ya sea por estar integrado en el genoma de dicha célula o por estar presente en un vector hospedado en la célula. Finalmente, el ADN a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN a ser sometida a la mutagénesis aleatoria es preferiblemente un ADNc o una secuencia de ADN genómica. En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada previa a la realización del paso de expresión b) o el paso de selección c) . Tal amplificación puede ser realizada de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, el método presente preferido es la amplificación generada por PCR usando cebadores de oligonucleótido preparados con base en el ADN o la secuencia de aminoácido de la enzima progenitora. Subsecuentemente a la incubación con o la exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa mediante el cultivo de una célula hospedera llevando a cabo la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten la realización de la expresión. La célula hospedera usada para este propósito puede ser una la cual se ha transformado con la secuencia de ADN mutado, opcionalmente presente en un vector, o uno en el cual se ha transportado la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora durante el tratamiento de la mutagénesis. Ejemplos de células hospederas adecuadas son las siguientes: las bacteria gram positivas tales como Bacill us subtilis, Bacillus licheniformis , Bacill us lentus, Bacill us brevis, Bacill us stearothermophil us , Bacill us alkalophil us, Bacillus amyloliquef aciens , Bacillus coagulans, Bacilus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megateri um, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y las bacterias gram negativas tales como E. coli . La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica las funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria puede ser localizada ventajosamente en una parte de la alfa-amilasa progenitora en cuestión. Esta puede ser, por ejemplo, ventajosa cuando ciertas regiones de la enzima se han identificado que son de particular importancia para una propiedad dada de la enzima, y cuando son modificadas se espera resulten en una variante que tiene propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima progenitora se ha elucidado y relacionado a la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria localizada o específica de la región se realiza convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se describe arriba o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a ser modificada puede ser aislada, por ejemplo, mediante la inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser sometida subsecuentemente por mutagénesis mediante el uso de cualesquiera de los métodos de mutagénesis discutidos arriba.

Métodos alternativos para proporcionar variantes de alfa-amilasa Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el método conocido en la técnica incluyendo los métodos por ejemplo, descritos en la WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) .

Expresión de las variantes de alfa-amilasas De acuerdo a la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida mediante los métodos descritos arriba, o mediante cualesquiera de los métodos alternativos conocidos en la técnica pueden ser expresados en forma de enzima, usando un vector de expresión que típicamente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de enlace del ribosoma, o varios genes activadores. El vector de expresión recombinante que lleva a cabo la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de al invención puede ser cualquier vector, el cual puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula hospedera en la cual esta va a ser introducida, Así, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector, que existe como una entidad extra-cromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extra-cromosomico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce dentro de la célula, se integra en el genoma de la célula hospedera y se replica junto con el (los) cromosoma (s) en el cual se ha integrado. En el vector, la secuencia de ADN deberá conectarse operablemente a una secuencia de promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, la cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedera de elección y puede derivarse de los genes que codifican las proteinas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un hospedero bacteriano, son el promotor del lac operon de E. Coli , los promotores dagA del gen de agarosa de Streptomyces coelicol or, los promotores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , los promotores del gen maltogénico de amilasa de Bacill us stearothermophil us { amyM) , los promotores de la alfa-amilasa de Bacill us amyl oliquef aciens ( amyQ) , los promotores de los genes xylA y xylB de Bacill us subtili s, etc. Para la transcripción en un hospedero fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. Oryzae, la proteinasa aspártica de Rhi zomucor mi ehi e, la alfa-amilasa neutral de A. Níger, la alfa-amilasa estable de ácido de A. Níger, la gluco-amilasa de A. Niger, la lipasa de Rhizomucor miehei , la proteasa alcalina de A. Oryzae, la isomerasa de fosfato triosa de A. Oryzae o la acetamidasa de A. nidulans . El vector de expresión en la invención puede también comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotes, secuencias de poli-adenilación conectadas operablemente a la secuencia de ADN que codifica la variante de alfa-amilasa de la invención. La terminación de las secuencias de poliadenilación pueden adecuadamente ser derivadas de las mismas fuentes como el promotor.

El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de la replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl y pIJ702. El vector puede también comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen, el producto del cual complemente un defecto en la célula hospedera, tal como los genes dai de B. subtilis o B. li cheniformis , o uno el cual confiere la resistencia antibiótica tal como la resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Adicionalmente, el vector puede comprender los marcadores de selección de Aspergill us tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que produce una elevación en la resistencia a la higromicina, o la selección puede ser acompañada por la cotransformación por ejemplo, como se describió en WO 91/17243. Mientras la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos respectos, cuando se usan ciertas bacterias como las células hospederas, se prefiere generalmente que la expresión sea intracelular. En general, las alfa-amilasas de Bacill us mencionadas aquí comprenden una pre-región que permiten la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta pre-región puede ser reemplazada mediante una pre-región diferente o secuencia de señal, convenientemente se completa mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las pre-regiones respectivas. Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente y para insertar esta en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidas por personas expertas en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) . La célula de la invención, ya sea que comprendan el constructo de ADN o un vector de expresión de la invención como se definió arriba, se usa ventajosamente como una célula hospedera en la producción recombinante de una variante de la alfa-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, convenientemente mediante la integración del constructo de ADN (en una o mas copias) en el cromosoma hospedero. Esta integración se considera generalmente que es una ventaja pues la secuencia de ADN es mas probable que se mantenga estable en la célula. La integración de los constructores de ADN en el cromosoma del hospedero puede ser realizado de acuerdo a los métodos convencionales, por ejemplo, mediante la recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se describió arriba en conexión con los diferentes tipos de las células hospederas . La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tales como un mamífero o insecto, pero preferiblemente es una célula microbiana por ejemplo, una célula bacteriana o fúngica (incluyendo a la levadura) . Ejemplos de bacterias adecuadas son las bacterias gram-positivas tales como Bacill us subtilis, Bacill us licheniformis, Bacillus lentus, Bacill us brevis, Bacillus stearothermophil us , Bacill us alkalophil us, Bacillus amyloliquef aciens , Bacill us coagulans, Bacill us circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacill us thuringiensis , o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o las bacterias gram-negativas tales como E. coli . La transformación de las bacterias puede ser, por ejemplo, ser afectada mediante la transformación del protoplasma o mediante el uso de células competentes de una manera conocida per se . El organismo de levadura puede ser seleccionada favorablemente de especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces , por ej emplo, Saccharomyces cerevisiae . Los hongos filamentosos pueden pertenecer ventajosamente a especies de Aspergill us , por ej empl o . , Aspergill us oryzae o Aspergill us níger. Las células fúngicas pueden ser transformadas mediante un proceso que involucra la formación del protoplasma y la transformación del protoplasma seguido por la regeneración de la pared de la célula de una manera conocida per se . Un procedimiento adecuado para la transformación de células hospedera Aspergill us se describe en la EP 238 023. Aún en un aspecto adicional, la presente invención se refiere al método de producir una variante de alfa-amilasa de la invención, el cual comprende cultivar una célula hospedera como se describe arriba, bajo condiciones favorables a la producción de la variante y recuperando la variante de las células y/o el medio de cultivo. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células hospedera en cuestión y obtener la expresión de la variante de la alfa-amilasa de la invención. El medio adecuado esta disponible por los proveedores comerciales o puede ser preparado de acuerdo a las formulas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo) . La variante de la alfa-amilasa secretada por las células hospederas puede ser convenientemente recuperada del medio de cultivo mediante los procedimientos bien conocidos, que incluyen la separación de las células del medio, mediante la centrifugación o filtración, y la precipitación de los componentes proteínicos del medio, por medio de una sal tal como el sulfato de amonio, seguido por el uso de los procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, o similares.

Aplicaciones industriales Las variantes de alfa amilasas de esta invención poseen las propiedades disponibles que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes de enzimas de la invención son aplicables como un componente en el lavado, lavado de platos y en las composiciones de detergentes para limpieza de superficies duras. Numerosas variantes son particularmente útiles en la producción de endulzantes y etanol, por ejemplo, combustibles, bebidas o etanol industrial, de almidón, y/o para el desencolado de telas o textiles. Las condiciones para los procesos de conversión de almidón convencionales que incluyen la licuefacción de almidón y/o procesos de sacarificación son descritos en por ejemplo, US 3,912,590 y en publicaciones de patentes EP Nos. 252 730 y 63 909. Producción de endulzantes para almidón: Un proceso "tradicional" para la conversión de almidón a jarabes de fructuosa normalmente consiste de tres procesos enzimáticos consecutivos, viz. un proceso de licuefacción seguido por un proceso de sacarificación y un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se degrada a dextrinas mediante una alfa-amilasa (por ejemplo, Termamyl™ ) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a temperaturas de 95-160 °C durante un periodo de aproximadamente 2 horas. Para asegurar la estabilidad enzimática óptima bajo estas condiciones, se añade lmM de calcio (40 ppm de iones de calcio libres). Después del proceso de licuefacción, las dextrinas son convertidas en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa (por ejemplo., AMG™ ) y una enzima de desramificación, tal como un isoamilasa o una pululanasa (por ejemplo, Promozyme™) . Después de este paso, el pH se reduce a un valor por debajo de 4.5, manteniendo la temperatura elevada (arriba de 95°C) , y la actividad de alfa-amilasa de licuefacción se desnaturalizó. La temperatura se redujo a 60°C y se añadieron la glucoamilasa y la enzima de desramificación. El proceso de sacarificación prosiguió durante 24-72 horas. Después del proceso de sacarificación el pH se elevó a un valor en el rango de 6-8, preferiblemente a un pH de 7.5, y el calcio se eliminó mediante intercambio de ion.

El jarabe de dextrosa después se convirtió en jarabe de alta fructuosa, por ejemplo, una gluco-seisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme™) . Al menos una mejora enzimática de este proceso puede ser visualizada: La reducción de la dependencia de calcio de la alfa-amilasa de licuefacción. La adición de calcio libre se requiere para asegurar adecuadamente la estabilidad elevada de la alfa-amilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucoseisomerasa y necesita ser eliminado, por medio de una operación unitaria costosa, a un grado, el cual reduce el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. El ahorro del costo puede ser obtenido si tal operación puede ser evitada y el proceso de licuefacción puede ser realizado sin la adición de iones libres de calcio. Para lograr esto, se requiere una alfa-amilasa semejante al termamilo, menos dependiente del calcio, la cual sea estable y altamente activa a bajas concentraciones de calcio libre (< 40 ppm) . Tal alfa-amilasa semejante al termamilo podría tener un pH óptimo a un pH en el rango de 4.5 - 6.5, preferiblemente en el rango de 4.5 - 5.5. La invención también se refiere a una composición que comprende una mezcla de una mas variantes de la invención derivada de (como la alfa-amilasa semejante al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y una alfa-amilasa semejante al termamilo, derivada de la alfa-amilasa de B. Licheniformis que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4. Además, la invención también se refiere a una composición que comprende una mezcla de una o mas variantes de acuerdo a la invención derivada de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y una alfa-amilasa híbrida que comprende una parte de la alfa-amilasa de B . amyloliquef aci ens mostrada en la SEC ID NO: 6 y una parte de la alfa-amilasa B. li cheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4. La alfa-amilasa semejante al termamilo, híbrida, mencionada recientemente, comprende los 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa de B. licheniformis mostradas en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa derivada de B . amyloliquef aciens mostrada en la SEC ID NO: 6. Dicha alfa-amilasa híbrida mencionada recientemente puede comprender adecuadamente las siguientes mutaciones. H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) Preferiblemente, dicho híbrido de alfa-amilasa mencionada recientemente puede comprender adecuadamente las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (usando la SEC ID NO: 4 numeración) . En los ejemplos de abajo dicho híbrido de la alfa-amilasa semejante al termamilo, progenitora, mencionado recientemente referido como LE429 (mostrado en la SEC ID NO: 2) se usa para preparar variantes de la invención, las cuales pueden ser usadas en composiciones de la invención. Una variante de la alfa-amilasa de la invención o una composición de la invención puede en un aspecto de la invención, ser usada para la licuefacción del almidón, en las composiciones de detergentes tales como composiciones de lavandería y lavado de platos y limpieza de superficies difíciles o duras, producción de etanol tales como producción de etanol combustible, para beber o industrial, desencolado de textiles, telas y prendas de vestir.

MATERIALES Y MÉTODOS Enzimas : LE174: Variante de alfa-amilasa híbrida: LE174 es un híbrido de la alfa-amilasa semejante al termamilo que es idéntico a la secuencia de termamilo, por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacill us licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, excepto que los 35 residuos de aminoácido N-terminal (de la proteína madura) se han reemplazado mediante los 33 residuos N-terminales de BAN (proteina madura) , es decir, la alfa-amilasa de Bacill us amyloliquef aci ens mostrada en la SEC ID NO: 6, que adicionalmente tiene las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEC ID NO: 4) : LE429 Variante de la alfa-amilasa híbrida: LE429 es un híbrido de la alfa-amilasa semejante al termamilo que es idéntico a la secuencia de termamilo, es decir, la alfa-amilasa de Bacill us li cheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, excepto que los 35 aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) se han reemplazado mediante los 33 residuos N-terminal de BAN (proteína madura) , es decir, la alfa-amilasa de Bacill us amyl olíquef aci ens mostrada en la SEC ID NO: 6, que adicionalmente tienen las siguientes mutaciones : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEC ID NO: 4) . El LE429 se muestra en la SEC ID NO: 2 y fue construido mediante SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351). Dextrozyme™ E: una mezcla balanceada de glucoamilasa (AMG) y pululanasa obtenible de cepas seleccionadas de Aspergill us Níger y Bacill us deramificans (disponibles de Novo Nordisk A/S) Fermentación y purificación de las variantes de la alfa-amilasa Una cepa de B. subtili s que hospeda al plásmido de expresión relevante se coloca en capas en una placa de LB-agar con 10 micro g/ml de canamicina de material a -80°C y se hace crecer durante toda la noche a 37 °C. Las colonias son transferidas a 100 ml de un medio BPX suplementado con 10 micro g/ml de canamicina en un frasco de agitación de 500 ml . Composición del medio BPX: Almidón de papa 100 g/1 Harina de cebada 50 g/1 BAN 5000 SKB 0.1 g/1 Caseinato de sodio 10 g/1 Harina de frijol de soya 20 g/1 Na2HP04, 12 H20 9 g/1 Pluronic ™ 0.1 g/1 El cultivo se agita a 37°C a 270 rpm durante 5 días . Las células y los restos celulares son eliminados del caldo de fermentación mediante la centrifugación a 4500 rpm durante 20 a 25 minutos. Después, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado se concentra y se lava en un filtro UF (membrana de corte 10000) y el amortiguador se cambia a 20mM de acetato a un pH de 5.5. El filtrado UF se aplica en un F.F. de S-Sefarosa y la elución se lleva a cabo mediante el paso de elución con NaCl 0.2M en el mismo amortiguador. El eluido se dializa contra lOmM Tris, pH de 9.0 y se aplica en una Q-sefarosa F.F. y se eluye con un gradiente lineal de 0-0.3 M de NaCl en 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medida por el ensayo Phadebas) son combinados, el pH se ajusta a un pH de 7.5 y el color restante se elimina mediante el tratamiento con carbón activo al 0.5 % peso/volumen durante 5 minutos.

Determinación de la Actividad - (KNU) Una unidad Kilo de alfa-amilasas (1 KNU) es la cantidad de enzima que descompone 5.26 g de almidón (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, Batch 9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la determinación de la alfa-amilasa basadas en la siguiente condición: Substrato almidón soluble Contenido de calcio en el solvente 0.0043 M Tiempo de reacción 7-20 minutos Temperatura 37°C PH 5.6 Descripción detallada del método analítico de Novo Nordisk (AF 9) están disponibles según petición.

Ensayo para la Actividad de la Alfa-Amilasa La actividad de la alfa-amilasa se determina mediante un método utilizando tabletas Phadebas® como substrato. Las tabletas Phadebas (Prueba de la amilasa Phadebas® suministrado por Pharmacia Diagnostic) que contiene un polímero de almidón coloreado azul, insoluble, reticulado, el cual se ha mezclado con albúmina de suero bovino y una substancia amortiguadora y se ha comprimido en tabletas . Para cada medición simple, una tableta se suspende en un tubo que contiene 5 ml de amortiguador Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, CaCl2 0.1 mM, pH ajustado al valor de interés con NaOH) . La prueba se realizó en una baño de agua a la temperatura de interés. La alfa-amilasa a ser probada se diluye en x ml de amortiguador Britton-Robinson 50 mM. Se añade 1 ml de esta solución de alfa-amilasa a 5 ml de amortiguador Britton-Robinson 50 mM. El almidón se hidroliza mediante la alfa-amilasa produciendo fragmentos de color azul solubles. La absorbancia de la solución azul resultante se midió espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la alfa-amilasa. Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) se encuentre en el rango de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este rango de absorbancia existe una linealidad entre la actividad y la absorbancia (Lambert-Beerlaw) . La dilución de la enzima debe por lo tanto, ser ajustada adecuadamente a este criterio. Bajo un conjunto especificado de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones de amortiguador) 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad de substrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/ mg de proteína de alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones. Determinación de la Actividad Específica La actividad específica se determina usando el ensayo Phadebas (Pharmacia) como actividad/enzima en mg.

Medición del perfil de la actividad del pH (estabilidad de pH) La variante se almacena en 20 mM TRIS pH 7.5, 0.1 mM, CaCl2 y se probó a 30°C, Briton-Robinson 50 mM, 0.1 mM de CaCl2. La actividad de pH se mide a un pH de 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 8.0, 9.5, 9.5, 10, y 10.5, usando el ensayo Phadebas descrito arriba.

Determinación de la Actividad AGU y AGU/mg AS Una unidad de Novo Amiglucosidasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 37 °C y un pH de 4.3. Una descripción detallada del método analítico (AEL-SM-0131) esta disponle sobre requerimiento por Novo Nordisk. La actividad se determina como AGU/ml mediante un método modificado después (AEL-SM-0131) usando el equipo de glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim, 124036. Standard: AMG-standard, lote 7-1195, 195 AGU/ml. 375 microL de substrato (1% de maltosa en acetato de sodio 50 mM, pH 4.3) se incubaron durante 5 minutos a 37 C. Se agregaron 25 microL de enzima diluida en acetato de sodio. La reacción se detuvo después de 10 minutos por la adición de 100 microL de NaOH 0.25 M. Se transfirieron 20 microL a una placa de titulación de 96 pozos y se agregaron 200 microL de solución GOD-Perid. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 650 nm y la actividad calculada en AGU/ml a partir de estándar de AMG. La actividad específica en AGU/ml se calculó entonces a partir de la actividad (AGU/ml) dividida con la concentración de proteína (mg/ml) .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de las variantes de termamilo de acuerdo con la invención. El termamilo (alfa-amilasa de B. li cheniformis SEC ID NO: 4) se expresa en la B. subtili s a partir de un plásmido denotado por pDN1528. Este plásmido contiene el gen completo que codifica al termamilo, amyL, la expresión de la cual se dirige por su promotor propio. Además, el plásmido contiene el origen de la replicación, ori , del plásmido pUBllO y el gen cat del plásmido pC194 que confieren resistencia hacia el cloranfenicol. El pDN1528 se muestra en la Fig. 9 de la WO 96/23874, Se preparó un vector de mutagénesis específico que contiene la mayor parte de la región codificante de la SEC ID NO: 3. Los rasgos importantes de este vector, denotado pJeENl, incluyen un origen de replicación derivado de los plásmidos pUC, el gan cat que confiere a la resistencia hacia el cloranfenicol y una versión que contiene desviación o corrimiento de la estructura del gen bla, el tipo silvestre del cual normalmente confiere resistencia hacia la ampicilina (fenotipo ampR ) . Esta versión mutada resulta en un fenotipo amps. El plásmido pJeNl se muestra en la Fig. 10 de WO 96/23874, y el origen de E. coli de replicación ori , bla , cat, la versión truncada en 5' del gen de amilasa termamilo y los sitios de restricción seleccionada son indicados en el plásmido. Las mutaciones son introducidas en amyL mediante el método descrito por Deng y Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88) excepto que los plásmidos con el "cebador de selección" (cebador #6616; ver abajo) incorporado son seleccionados basándose en el fenotipo ampR de células E. coli transformadas que hospedan un plásmido con un gen bla reparado, en lugar de emplear la selección mediante la restricción de la digestión de la enzima esquematizada por Deng y Nickoloff. Los químicos y las enzimas usados para la mutagénesis se obtuvieron a partir del equipo o conjunto de mutagénesis Chameleonó de Stratagene (catálogo número 200509) . Después de la verificación de la secuencia de ADN en los plásmidos de la variante, el gen truncado que contienen la alteración, se subclona en el pDN1528 como un fragmento Pstl -EcoRI y se transforma en la cepa SHA273 de Bacill us subtilis agotada con amilasa y proteasa (descrita en W092/113557 y WO95/10603) para expresar la enzima de la variante . La variante de termamilo V54W se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG (SEC ID NO: 9) La variante de termamilo A52W + V54W se construyo mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG ( SEC ID NO : 10) Cebador # 6616 (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha; P denota un fosfato 5' ) : P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C (SEC ID NO: 11) La variante de termamilo V54E se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG (SEC ID NO: 12) La variante de termamilo V54M se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG (SEC ID NO: 13) La variante de termamilo V54I se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG (SEC ID NO: 14) Las variantes de termamilo Y290E y Y290K se construyeron mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C (SEC ID NO: 15) Y representa una mezcla igual de C y T . La presencia de un codon que codifica ya sea Glutamato o Lisina en la posición 290 se verificó mediante la secuencia de ADN. La variante de termamilo N190F se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C (SEC ID NO: 16) La variante de termamilo N188P+N190F se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC (SEC ID NO : 17 ) La variante de termamilo H140K+H142D se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG (SEC ID NO: 18) La variante de termamilo H156Y se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG (SEC ID NO: 19) La variante de termamilo A181T se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC (SEC ID NO: 20) La variante de termamilo A209V se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC (SEC ID NO: 21) La variante de termamilo Q264S se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC (SEC ID NO: 22) La variante de termamilo S187D se construyó mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC (SEC ID NO: 23) . La variante de termamilo DELTA (K370-G371-D372) (es decir, eliminada de los residuos de aminoácido nos. 371 y 372) se construyeron mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC (SEC ID NO: 24) La variante de termamilo DELTA (K372-S373-Q374) se construyeron mediante el uso de los siguientes cebadores de mutagénesis (escrito de 5' a 3' de izquierda a derecha) : PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C (SEC ID NO: 25) Las variantes de termamilo A181T y A209V se combinaron a A181T+A209V mediante la digestión del A181T que contienen el plásmido similar a pDN1528 (es decir, el pDN1528 que contienen dentro de amyL la mutación resultante en la alteración de A181T) y el plásmido similar a pDN1528 que contiene A209V (es decir, pDN1528 que contienen dentro de amyL la mutación resultante en la alteración A209V) con restricción de la enzima ClaJ que corta los plásmidos similares a pDN1528 dos veces resultando en un fragmento de 1116 bp y la parte del vector (es decir, contiene el origen del plásmido de replicación) de 3850 bp. El fragmento que contiene la mutación A209V y la parte del vector que contiene la mutación A181T se purificó mediante el equipo de extracción de gel QIAquick (comprado por QIAGEN) después de la separación en un gel de agarosa. El fragmento y el vector se ligaron y se transformaron la cepa de Bacill us subtilis agotada con proteasa y amilasa referidas arriba. El plásmido de amy+ (zonas de limpieza en placas de agar que contienen almidón) y transformantes resistentes al cloranfenicol son analizados para la presencia de ambas mutaciones en el plásmido . De manera similar como se describió arriba, H156Y y A209V se combinaron utilizando las endonucleasas de restricción Acc65I y EcoRI, dando H156Y+A209V. H156Y +A209V y A181T+A209V se combinaron en H156Y+A181T+A209V mediante el uso de las endonucleasas de restricción Acc65I y HindIII. Los 35 residuos N-terminales de la parte madura déla variante de termamilo H156Y + A181T+A209V se substituyeron mediante los 33 residuos N-terminales de la alfa-amilasa de B. amyloliquef aci ens (SEC ID NO: 4) (la cual en el presente contexto se llamó BAN) mediante un método SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351) como sigue: Cebador 19364 (secuencia 5' a 3' ) : CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG (SEC ID NO: 26) Cebador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG (SEC ID NO: 27) Cebador 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC (SEC ID NO: 28) Cebador 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC (SEC ID NO: 29) Una reacción de la cadena de la polimerasa, PCR estándar, se llevó a cabo usando la polimerasa termoestable Pwo de Boehringer Mannheim de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes y el ciclo de temperatura: 5 minutos a 94 °C, 25 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72° C durante 1 minuto), 72°C durante 10 minutos. Un fragmento de aproximadamente 130 bp se amplificó en un primer PCR denotado PCR1 con los cebadores 19364 y 19362 en un fragmento de ADN que contienen el gen que codifica la alfa-amilasa B.. amyl oliquef aciens . Un fragmento de aproximadamente 400 bp se amplificó en otro PCR denotado PCR con cebadores 19363 y 1C en la plantilla o patrón pDN1528. PCR1 Y PCR2 se purificaron a partir de un gel de agarosa y se usaron como plantilla o patrón en PCR3 con los cebadores 19364 y 1C, que resultó en un fragmento de aproximadamente 520 bp . Este fragmento contiene así una parte de ADN que codifica el N-términal a partir de BAN fusionados a una parte de ADN que codifica al termamilo del 35avo aminoácido. El fragmento de 520 bp se subclonó en un plásmido similar a pDN1528 (que contienen el gen que codifica la variante de termamilo H156Y+A181T+A209V) mediante la digestión con la restricción de las endonucleasas PstI y SacII, ligación y transformación de la cepa de B . subtili s como se describió previamente. La secuencia de ADN entre los sitios de restricción PstI y SacII se verificó mediante la secuenciación de ADN en los plásmidos extraídos a partir de amy- y los transformantes resistentes al cloranfenicol. La construcción o constructo final que contiene los N-terminales correctos de BAN y H156Y + A181T+A209V se denotaron BAN(l-35) + H156Y+ A181T+A209V. El N190F se combinó con el BAN(l-35)+ H156Y+ A181T+A209V produciendo BAN (1-35)+ H156Y+ A181T+N19OF+A209V llevando a cabo la mutagénesis como se describió arriba excepto que la secuencia de amyL en PJeENl se sustituyó mediante la secuencia de ADN que codifica la variante de termamilo BAN (1-35)+ H156Y+ A181T+A209V. El Q264S se combinó con BAN (1-35)+ H156Y+ A181T+A209V produciendo BA (1-35)+ H156Y+ A181T+A209V+Q264S llevando a cabo la mutagénesis como se describió arriba excepto que la secuencia de amyL en PJeEN se substituyó mediante la secuencia de ADN que codifica a la variante del termamilo BAN (1-35)+ H156Y+ A181T+A209V. BAN(l-35)+ H156Y+A81T+A209V+Q264S y BAN (1-35)+ H156Y+A181T+N190F+A209V se combinaron en BAN (1-35)+ H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S utilizando endonucleasas de restricción BsaHI (sitio de BsaHI se introdujo cerca de la mutación A209V y la PstI. La 1201F se combinó con BAN(1- 35)+H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S produciendo BAN(1-35)+H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S+I2?lF (SEC ID NO: 2) llevando a cabo la mutagénesis como se describió arriba. Se usó el cebador de mutagénesis AM100 introducida la substitución 1201F y eliminado simultáneamente un sitio de restricción Cía I que facilita la orientación de sujeción de los mutantes. Cebador AM100: 5'GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3' (SEC ID NO: 30) EJEMPLO 2 Construcción de las variantes de alfa-amilasa similares al termamilo con un patrón de escisión alterado de acuerdo a la invención. La variante de la alfa-amilasa de B . licheniformis que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de B. li cheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácido N-terminales de alfa-amilasa derivada de la B. amyl oliquef aci ens mostrada en la SEC ID NO: 6 y que comprende además las siguientes mutaciones : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (la construcción de esta variante se describe en el Ejemplo 1 y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2) tiene una capacidad reducida de escindir un substrato cerca al punto de ramificación. En un intento para mejorar adicionalmente la capacidad reducida de escindir un substrato cerca al punto de ramificación de dicha variante de alfa-amilasa, el sitio dirigido de la mutagénesis se llevó a cabo usando el método de cebador Mega como se describió por Sarkar y Sommer, 1990 (BioTechniques 8: 404-407): La construcción de LE313: híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+V54N: El cebador 27274 específico del gen y el cebador mutagénico AM115 son usados para amplificar mediante PCR un fragmento de ADN de aproximadamente 440 bp a partir de un plásmido similar al pDN1528 (que hospeda a las mutaciones BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+l2OlF+A209V+Q264S en el gen que codifica la amilasa de la SEC ID NO: 4) . El fragmento de 440 bp se purifica a partir de un gel de agarosa y se usa como un Mega-cebador junto con el cebador 113711 en un segundo PCR llevado a cabo en la misma plantilla o patrón. El fragmento de aproximadamente 630 bp resultante se sometió a digestión con las enzimas de restricción EcoR V y Acc65 I y el fragmento de ADN de aproximadamente 370 bp resultante se purifica y se liga con el plásmido similar a pDN1528 digerido con las mismas enzimas. Las células Bacill us subtili s SHA273 competentes (bajas en amilasa y proteasa) son transformadas con la ligación y los transformantes resistentes al cloranfenicol, son inspeccionadas mediante la secuencia de ADN para verificar la presencia de las mutaciones correctas en el plásmido. Cebador 27274: 5' CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3' (SEC ID NO: 31) Cebador IB: 5' CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3' (SEC ID NO: 32) Cebador AM115: 5' GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO: 33) La construcción de LE314: Híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S se lleva a cabo de una forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM116. AM116: 5' GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO: 34) La construcción de LE315: Híbrido BAN/Termamilo +H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N se lleva a cabo de una forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM117. AM117: 5' GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO: 35) La construcción de LE316: Híbrido BAN/Termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + T49L se lleva a cabo de una forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM118. AM118: 5' GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3' (SEC ID NO: 36) La Construcción de LE317: Híbrido BAN/Termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + 149L+G107A se lleva a cabo de una forma similar excepto que el cebador mutagénico AM118 y el cebador mutagénico AM119 son usados simultáneamente.

AM119: 5' CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3' (SEC ID NO: 37) La Construcción de LE318: Híbrido BAN/Termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N+T49L+G107A se lleva a cabo de una forma similar excepto que el cebador mutagénico AM118 y el cebador mutagénico AM120 son usados simultáneamente . AM120: 5' GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEC ID NO: 38) La construcción de LE 319: Híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N+T49L se lleva a cabo de forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM120. La construcción de LE320: Híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + G107A se lleva a cabo en forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM119. La construcción de LE322: Híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S + Q51R+A52S se lleva a cabo de forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM121. 5' GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO: 39) La construcción de LE323: Híbrido BAN/termamilo + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52N se lleva a cabo de una forma similar excepto que se usa el cebador mutagénico AM122: AM122: 5' GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3' (SEC ID NO: 40) EJEMPLO 3 Prueba de las variantes LE429 (sacarificación) Las condiciones estándar de reacción son: Concentración del substrato 30% peso/peso Temperatura 60°C PH inicial (a 60°C) 5.5 Dosis de la enzima Glucoamilasa 0.18 AGU/g DS Pululanasa 0.06 PUN/g DS Alfa-amilasa 10 micro g enzima/ g DS La Dextrozyme ™ E se usó para proporcionar actividades de glucoamilasa y pululanasa.

Los substratos para la sacarificación se prepararon mediante la disolución común de los granos de almidón en agua desionizada y ajustando la substancia seca a aproximadamente 30% peso/peso. El pH se ajustó a 5.5 (medido a 60°C) y las alicotas del substrato correspondiente a 10 g de peso seco se transfirieron a frascos de vidrio de tapa azul. Los frascos se colocaron después en un baño de agua agitada equilibrada a 60°C y se añadieron las enzimas. El pH se reajustó a 5.5 cuando fue necesario. Las muestras se tomaron después de 48 horas de sacarificación; el pH se ajustó a aproximadamente 3.0, y después se calentó en un baño de agua caliente durante 15 minutos para inactivar a las enzimas. Después del enfriamiento, las muestras se trataron con aproximadamente 0.1 g de resina de intercambio de ion de lecho, mezclada (BIO-RAD 501 X8 (D) ) durante 30 minutos en un mezclador rotatorio para remover las sales y el N soluble. Después de la filtración, la composición del carbohidratos se determinó mediante HPLC. Se obtuvieron los siguientes resultados: La alfa-amilasa progenitora para las variantes es LE429: Comparado con el control, la presencia de una variante de alfa-amilasa de la invención durante la licuefacción resulta en una disminución de los niveles de panosa (DP3) . Especialmente la variante T49L+G107A de LE429 y la variante A52S+V54N+T49L de LE429, respectivamente, resulta en un nivel drásticamente disminuido de panosa (DP3) . Si estas variantes de alfa-amilasa son usadas para iniciar la licuefacción del almidón, no será necesario inactivar la enzima antes del comienzo de la sacarificación.

Ejemplo 4 Licuefacción y sacarificación de las variantes de LE429 El experimento en el Ejemplo 3 se repitió para un número de otras variantes de LE429 bajo las mismas condiciones . El resultado se muestra debajo: Variante/perfil del azúcar DPI DP2 DP3 DP4+ T49V+G107A 95.9% 1.72% 1.27% 1.11% T49Y+G107A 95.3% 1.73% 1.29% 1.65% T49N+G107A 95.7% 1.64% 1.51% l.lí T49L+A52S+G107A 95.7% 1.73% 0.95% 1.67% T49L+A52T+G107A 95.8 ¡, 1.66% 1.03Í 1.48! T49L+A52F+G107A 95.7% 1.69% 1.16% 1.42% T49L+A52L+G107A 95.5% 1.70% 1.40% 1.31 T49L+A521+G107A 95.9% 1.72% 1.31% 1.07% T49L+A52V+G107A 94.7% 1.69% 1.16Í 2.44% T49L+452V+G107A+A111V 94.5% 1.75% 0.72% 2.99% LE429 94.9% 1.71% 1.85% 1.51% Ejemplo 5 El experimento en el ejemplo 3 se repitió para un número de variantes LE429 excepto que la licuefacción se llevó a cabo a 95°C, pH 6.0 y la sacarificación a 60°C, pH 4.5, CaCl2 40 ppm, seguido por la inactivación. La variante referida abajo son las variantes LE429. Los resultados encontrados son como sigue: Variante/perfil del azúcar DP4+ DP3 DP2 DPI T49F 1.15 0.92 1.83 96.12 T49D+G107A 0.84 1.03 1.82 96.3 T49I+G107A 0.97 0.64 1.84 96.55 T49L+G107A 0.96 0.81 1.82 96.42 T49L+A52S+G107A 1.37 0.75 96.01 T49L+A52T+G107A 0.87 0.81 1. 96.52 T49L+A52F+G107A 0.98 0.83 1.87 96.31 T49V+G107A 0.65 0.8 2.13 96.43 T49Y+G107A 0.83 0.94 1.89 96.35 LE429 1.16 1.21 1.77 95.87 REFERENCIAS CITADAS Klein, O., et al., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746, Mizuno, H., et al., J. Mol . Biol . (1993) 234, 1282-1283, Chang, C, et al, J. Mol . Bi ol . (1993) 229, 235-238, Larson, S.B., J. Mol. Biol . (1994) 235, 1560-1584, Lawson, C.L., J. Mol . Biol . (1994) 236, 590-600, Qian, M., et al., J. Mol . Bi ol . (1993) 231, 785-799, Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect . E, 47, 527-535, Swift, H.J., et al., Acta Crystallogr. sect . E, 47, 535-544 A. Kadziola, Ph.D. Thesis: "An alpha-amylase from Barley and its Complex with a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography", Department of Chemistry University of Copenhagen 1993 MacGregor, E.A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol.l, No. 5-6, p.

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LISTA DE SECUENCIAS <110> Novo Nordisk A/S <120> <130> <160> 40 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1443 <212> DNA <213> Bacillus amyloliguefaciens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1443) <400> 1 gca aat ggc acg ceg acg cag cac tct gaa cgg tat acg ceg aac gac 48 Val Asn Gly Thr Leu MeC Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 ggc cag cat tgg aaa cga ttg cag aat gat gcg gaa cat tta teg gat 96 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 atc ggt att act gcc gtc tgg att ccc ceg gca tat aag gga acg age 144 lie Gly lie Thr Ala Val Trp lie Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 caá gcg gat gtg ggc tac ggt gct tac gac ett tat gat tta ggg gag 192 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 ttt cat caá aaa ggg acg gtt cgg acá aag tac ggc ac aaa gga gag 240 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 ctg caá tct gcg atc aaa agt ett cat tcc cgc gac att aac gtt tac 288 Leu Gln Ser Ala lie Lvs Ser Leu His Ser Arg Asp lie Asn Val Tyr 85 ' 90 95 ggg gat gtg gtc atc aac cac aaa ggc ggc gct gat gcg acc gaa gat 336 Gly Asp Val Val lie Asn His Lye Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 gta acc gcg gtt gaa gtc gat ccc gct gac cgc aac cgc gta att tea 384 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val lie Ser 115 120 125 gga gaa cac cta att aaa gcc tgg acá cat ttt cat ttt ceg ggg cgc 432 Gly Glu His Leu He Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 ggc age acá tac age gat ttt aag tgg tat tgg tac cat ttt gac gga 480 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 acc gat tgg gac gag tcc cga aag ctg aac cgc atc tat aag ttt caá 528 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg He Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 ggg aag act tgg gat tgg gaa gtt tcc aat gaa ttc ggc aac tat gat 576 Gly Lvs Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 ISO tat ttg atg tat gcc gac ttt gat tat gac cat cct gat gtc gta gca S24 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp Has Pro Asp Val Val Ala 195 200 ' 205 gag att aag aga tgg ggc act tgg tat gcc aat gaa ctg caá ttg gac 672 Glu He Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 ggt ttc cgt ett gat gct gtc aaa cac att aaa ttt tct ttt ttg cgg 720 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His He Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 gat tgg gtt aat cat gtc agg gaa aaa acg ggg aag gaa atg ttt acg 768 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 gta gct gag cac tgg teg aat gac ttg ggc gcg ctg gaa aac tat ttg 816 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Aen Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 aac aaa acá aat ttt aat cat tea gtg ttt gac gtg ceg ett cat tat 864 Asn Lye Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 cag ttc cat gct gca teg acá cag gga ggc ggc tat gat atg agg aaa 912 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 ttg ctg aac ggt acg gtc gtt tcc aag cat ceg ttg aaa teg gtt acá 96D Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 305 310 315 * 320 ttt gtc gat aac cat gat acá cag ceg ggg caá teg ett gag teg act 1008 Phe Val Aep Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 gtc caá acá tgg ttt aag ceg ett gct tac gct ttt att ctc acá agg 1056 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe He Leu Thr Arg 340 345 350 gaa tct gga tac cct cag gtt ttc tac ggg gat atg tac ggg acg aaa 1104 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 gga gac tcc cag cgc gaa att cct gcc ttg aaa cac aaa att gaa ceg 1152 Gly Aep Ser Gln Arg Glu He Pro Ala Leu Lys Hae Lys He Glu Pro 370 375 380 atc tta aaa gcg aga aaa cag tat gcg tac gga gca cag cat gat tat 1200 He Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 ttc gac cac cat gac att gtc ggc tgg acá agg gaa ggc gac age teg 1248 Phe Asp His His Asp He Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 gtt gca aat tea ggt ttg gcg gca tta ata acá gac gga ccc ggt ggg 1296 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu He Thr Aep Gly Pro Gly Gly 420 425 430 gca aag cga atg tat gtc ggc cgg caá aac gcc ggt gag acá tgg cat 1344 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 gac att acc gga aac cgt teg gag ceg gtt gtc atc aat teg gaa ggc 1392 Asp He Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val He Asn Ser Glu Gly 450 455 460 tgg gga gag ttt cac gta aac ggc ggg teg gtt tea att tat gtt caá 1440 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser He Tyr Val Gln 465 470 475 480 aga 1443 Arg <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Bacillus amyloliguefaciens <400> 2 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Aen Asp Ala Glu Hie Leu Ser Asp 20 25 30 He Gly He Thr Ala Val Trp He Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala He Lys Ser Leu His Ser Arg Aep He Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val He Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val He Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu He Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lye Trp Tyr Trp Tyr Hie Phe Asp Gly 145 150 155 160 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg He Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Aep Hie Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu He Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His He Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu ' 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Glr. 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(1872) <400> 3 cggaagattg gaagtacaaa aataagcaaa agattgtcaa tcatgtcatg agccatgcgg 60 gagacggaaa aatcgtctta atgcacgata tttatgcaac gttcgcagat gctgctgaag 120 agattattaa aaagctgaaa gcaaaaggct atcaattggt aactgtatct cagcttgaag 180 aagtgaagaa gcagagaggc tattgaataa atgagtagaa gcgccatatc ggcgcttttc 240 ttttggaaga aaatataggg aaaatggtac ttgttaaaaa ttcggaatat ttatacaaca 300 tcatatgttt cacattgaaa ggggaggaga atcatgaaac aacaaaaacg gctttacgcc 360 cgattgctga cgctgttatt tgcgctcatc ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg 420 gca aat ett aat ggg acg ctg atg cag tat ttt gaa tgg tac atg ccc 466 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro 1 5 10 15 aat gac ggc caá cat tgg agg cgt ttg caá aac gac teg gca tat ttg 516 Aen Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 gct gaa cac ggt att act gcc gtc tgg att ccc ceg gca tat aag gga 564 Ala Glu His Gly He Thr Ala Val Trp He Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 acg age caá gcg gat gtg ggc tac ggt gct tac gac ett tat gat tta 612 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 ggg gag ttt cat caá aaa ggg acg gtt cgg acá aag tac ggc acá aaa 660 GÍy Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 gga gag ctg caá tct gcg atc aaa agt ett cat tcc cgc gac att aac 708 Gly Glu Leu Gln Ser Ala He Lys Ser Leu His Ser Arg Asp He Asn 85 90 95 gtt tac ggg gat gtg gtc atc aac cac aaa ggc ggc gct gat gcg acc 756 Val Tyr Gly Asp Val Val He Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 gaa gat gta acc gcg gtt gaa gtc gat ccc gct gac cgc aac cgc gta 804 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Aia Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 att tea gga gaa cac cta att aaa gcc tgg acá cat ttt cat ttt ceg 852 He Ser Gly Glu His Leu He Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 ggg cgc ggc age acá tac age gat ttt aaa tgg cat tgg tac cat ttt 900 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lye Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 gac gga acc gat tgg gac gag tcc cga aag ctg aac cgc atc tat aag 948 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg He Tyr Lys 165 170 175 ttt caá gga aag gct tgg gat tgg gaa gtt tcc aat gaa aac ggc aac 996 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 tat gat tat ttg atg tat gcc gac atc gat tat gac cat cct gat gtc 1044 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp He Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 gca gca gaa att aag aga tgg ggc act tgg tat gcc aat gaa ctg caá 1092 Ala Ala Glu He Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 ttg gac ggt ttc cgt ett gat gct gtc aaa cac att aaa ttt tct ttt 1140 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys Hie He Lye Phe Ser Phe 225 230 235 240 ttg cgg gat tgg gtt aat cat gtc agg gaa aaa acg ggg aag gaa atg 1188 Le? 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Tyr Trp Gln Asn Asn 255 260 265 gcc ggg aaa ctc gaa aac tac ttg aat aaa acá age ttt aat caá tcc 1708 Ala Gly Lye Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser 270 275 280 gtg ttt gat gtt ceg ett cat ttc aat tta cag gcg gct tcc tea caá 1756 Val Phe Asp Val Pro Leu Hie Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln 285. 290 295 gga ggc gga tat gat atg agg cgt ttg ctg gac ggt acc gtt gtg tcc 1804 Glv Gly Gly Tyr Asp Met Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser 300 305 310 agg cat ceg gaa aag gcg gtt acá ttt gtt gaa aat cat gac acá cag 1852 Arg His Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln 315 320 325 330 ceg gga cag tea ttg gaa teg acá gtc caá act tgg ttt aaa ceg ett 1900 Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu 335 340 345 gca tac gcc ttt att ttg acá aga gaa tcc ggt tat cct cag gtg ttc 1948 Ala Tyr Ala Phe He Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe 350 355 360 tat ggg gat atg tac ggg acá aaa ggg acá teg cea aag gaa att ccc 1996 Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu He Pro 365 370 375 tea ctg aaa gat aat ata gag ceg att tta aaa gcg cgt aag gag tac 2044 Ser Leu Lys Asp Asn He Glu Pro He Leu Lye Ala Arg Lys Glu Tyr 380 385 390 gca tac ggg ccc cag cac gat tat att gac cac ceg gat gtg atc gga 2092 Ala Tyr Gly Pro Gln Hie Aep Tyr He Asp His Pro Asp Val He Gly 395 400 405 410 tgg acg agg gaa ggt gac age tcc gcc gcc aaa tea ggt ttg gcc gct 2140 Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala 415 420 425 tta atc acg gac gga ccc ggc gga tea aag cgg atg tat gcc ggc ctg 2188 Leu He Thr Asp' Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu 430 435 440 aaa aat gcc ggc gag acá tgg tat gac ata acg ggc aac cgt tea gat 2236 Lys Asn Ala Gly Glu Thr Trp Tyr Asp He Thr Gly Asn Arg Ser Asp 445 450 455 act gta aaa atc gga tct gac ggc tgg gga gag ttt cat gta aac gat 2284 Thr Val Lys He Gly Ser Aso Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp 460 46*5 470 ggg tcc gtc tcc att tat gtt cag aaa taa ggtaataaaa aaacacctcc 2334 Gly Ser Val Ser He Tyr Val Gln Lys 475 480 aagctgagtg cgggtatcag cttggaggtg cgtttatttt ttcagccgta tgacaaggtc 2394 ggcatcaggt gtgacaaata cggtatgctg getgtcatag gtgacaaatc cgggttttgc 2454 gccgtttggc tttttcacat gtctgatttt tgtataatca acaggcacgg agccggaatc 2514 tttcgccttg gaaaaataag cggcgatcgt agctgcttcc aatatggatt gttcatcggg 2574 atcgctgctt ttaatcacaa cgtgggatcc 2604 <210> 6 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 6 val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Aep 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 He Gly He Thr Ala Val Trp He Pro Pro Ala Tyr Lye Gly Leu Ser 35 40 45 Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Glv Glu 50 55 60 Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu 65 70 75 80 Leu Gln Asp Ala He Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 al Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Gln He Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Aen Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Aia Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys He Ser Arg He Phe Lys Phe Arg 165 170 175 Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tvr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly He Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg He Asp Ala Ala Lys His He Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe He Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu He Pro Ser Leu Lys Asp Asn He 370 375 380 Glu Pro He Leu Lye Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr He Asp His Pro Asp Val He Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu He Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp Tyr Asp He Thr Gly Asn Arg Ser Aep Thr Val Lys He Gly Ser 450 455 460 Aep Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser He Tyr 465 70 475 480 Val Gln Lys <210> 7 <211> 154B <212> DNA c213> Bacillus stearothermophilue <220> <221> CDS <222> (1) .. (1548) <400> 7 gcc gca ceg ttt aac ggc acc atg atg cag tat ttt gaa tgg tac ttg 4ß Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 ceg gat gat ggc acg tta tgg acc aaa gtg gcc aat gaa gcc aac aac 96 Pro Áep Aep Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 tta tcc age ett ggc atc acc gct ett tgg ctg ceg ccc gct tac aaa 144 Leu Ser Ser Leu Gly He Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 gga acá age cgc age gac gta ggg tac gga gta tac gac ttg tat gac 192 Gly Thr ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 ctc ggc gaa ttc aat caá aaa ggg acc gtc cgc acá aaa tac gga acá 240 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 aaa gct caá tat ett caá gcc att caá gcc gcc cac gcc gct gga atg 288 Lys Ala Glr Tyr Leu Gln Ala He Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 caá gtg tac gcc gat gtc gtg ttc gac cat aaa ggc ggc gct gac ggc 336 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 acg gaa tgg gtg gac gcc gtc gaa gtc aat ceg tcc gac cgc aac caá 384 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 gaa atc teg ggc acc tat caá atc caá gca tgg acg aaa ttt gat ttt 432 Glu He Ser Gly Thr Tyr Gln He Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 ccc ggg cgg ggc aac acc tac tcc age ttt aag tgg cgc tgg tac cat 480 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lye Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 ttt gac ggc gtt gat tgg gac gaa age cga aaa ttg age cgc att tac 528 Phe Asp Gly Val Aep Trp Aep Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg lie Tyr 165 170 " 175 aaa ttc cgc ggc atc ggc aaa gcg tgg gat tgg gaa gta gac acg gaa 576 Lye Phe Arg Gly He Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 aac gga aac tat gac tac tta atg tat gcc gac ett gat ate gat cat 624 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205 ccc gaa gtc gtg acc gag ctg aaa aac tgg ggg aaa tgg tat gtc aac 672 Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Aen Trp Gly Lye Trp Tyr Val Asn 210 215 220 acá acg aac att gat ggg ttc cgg ett gat gcc gtc aag cat att aag 720 Thr Thr Asn He Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His He Lys 225 23° 235 240 ttc agt ttt ttt cct gat tgg ttg teg tat gtg cgt tct cag act ggc 768 Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly 245 250 255 aag ecg cta ttt acc gtc ggg gaa tat tgg age tat gac atc aac aag 816 Lye Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Ásp He Asn Lye 260 265 270 ttg cac aat tac att acg aaa acá gac gga acg atg tct ttg ttt gat 864 Leu His Asn Tyr He Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 275 280 285 gcc ceg tta cac aac aaa ttt tat acc gct tcc aaa tea ggg ggc gca 912 Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala 290 295 300 ttt gat atg cgc acg tta atg acc aat act ctc atg aaa gat caá ceg 960 Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 305 310 315 320 acá ttg gcc gtc acc ttc gtt gat aat cat gac acc gaa ccc ggc caá 1008 Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln 325 330 335 gcg ctg cag tea tgg gtc gac cea tgg ttc aaa ceg ttg gct tac gcc 1056 Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 ttt att cta act cgg cag gaa gga tac ceg tgc gtc ttt tat ggt gac 1104 Phe He Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 tat tat ggc att cea caá tat aac att cct teg ctg aaa age aaa atc 1152 Tyr Tyr Gly He Pro Gln Tyr Asn He Pro Ser Leu Lys Ser Lys He 370 375 380 gat ceg ctc ctc atc gcg cgc agg gat tat gct tac gga acg caá cat 1200 Asp Pro Leu Leu He Ala Arg Arg ASD Tyr Ala Tyr Glv Thr Gln His 3B5 390 * 395 400 gat tat ett gat cac tcc gac atc atc ggg tgg acá agg gaa ggg ggc 1248 Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp He He Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly 405 410 415 act gaa aaa cea gga tcc gga ctg gcc gca ctg atc acc gat ggg ceg 1296 Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu- He Thr Asp Gly Pro 420 425 430 gga g a a e aaa tgg atg tac gtt ggc aaa caá cac gct gga aaa gtg 1344 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln Kis Ala Gly Lys Val 435 440 445 ttc tat gac ett acc ggc aac cgg agt gac acc gtc acc atc aac agt 1392 Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr He Asn Ser 450 455 460 gat gga tgg ggg gaa ttc aaa gtc aat ggc ggt teg gtt teg gtt tgg 1440 Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Aen Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 gtt cct aga aaa acg acc gtt tct acc atc gct cgg ceg atc acá acc 1488 Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr He Ala Arg Pro He Thr Thr 485 490 495 cga ceg tgg act ggt gaa ttc gtc cgt tgg acc gaa cea cgg ttg gtg 1536 Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu- Pro Arg Leu Val 500 505 510 gca tgg cct tga 1548 Ala TrD Pro 515 <210> 8 c211> 515 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilue <400> 8 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly He Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala He Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Aep Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu He Ser Gly Thr Tyr Gln He Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg He Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly He Gly Lys Ala Trp Aep Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Aen Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn 210 215 220 Thr Thr Asn He Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lye Hie He Lye 225 230 235 240 Phe Ser Phe Phe Pro Aep Trp Leu Ser Tvr Val Arg Ser Gln Thr Gly 245 250 255 Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp He Asn Lye 260 265 270 Leu His Asn Tyr He Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 275 280 285 Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala 290 295 300 Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Aen Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 305 310 315 320 Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Glp 325 330 335 Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Phe He Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cye Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly He Pro Gln Tyr Aen He Pro Ser Leu Lys Ser Lys He 370 375 380 ASD Pro Leu Leu He Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp He He Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly 405 410 415 Thr Glu Lye Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu He Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lye Val 435 440 445 Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr He Asn Ser 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr He Ala Arg Pro He Thr Thr 485 490 495 Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val 500 505 510 Ala Trp Pro 515 <210> 9 <211> 31 <212> ADN <213 > Secuencia artificial <220 < 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 9 ggtcgtaggc accgtagccc caatccgctt g 31 <210> 10 <211> 36 <212> ADN <2i3> Secuencia artificial <220> <222 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <4 00 > J.U ggtcgtaggc accgtagccc caatcccatt ggctcg 36 c210> 11 <211> 2B <212 > ADN < 2 i 3 > Secuencia artificial <220> < 223 > Descripción de la secuencia artificial, cebador <4 00 > 11 ctgtgactgg tgagtactca accaagtc 2B <210> 12 <211> 31 <212> ADN <2 3 > Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 12 ggtcgtaggc accgtagccc tcatccgctt g 31 <210> 13 <211> 31 <212> ADN <213> <220> c223 > Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 13 ggtcgtaggc accgtagccc atatccgctt .g 31 <210> 14 <211> 31 <212=> ADN 2 13 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial' cebador <400 > 14 ggtcgtaggc accgtagcca atatccgctt g 31 <210> 15 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial' cebador <400> 15 gcagcatgga actgctyatg aagaggcacg tcaaac 36 <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213* <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial cebador < 4 00 > 16 catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30 <210> 17 «211> 34 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220? <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <4 00> 17 catagttgcc gaattcaggg gaaacttccc aatc 3 c210> 18 <211> 41 < 12> ADN < 213 » Secuencia artificial <220> < 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador < 4 00> 18 ccgcgccccg ggaaatcaaa ttttgtccag gctttaatta g l <210> 19 <211> 32 <212s ADN <213 > Secuencia artificial <220 > <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 19 caaaatggta ccaataccac ttaaaatcgc tg 32 <210> 20 <211> 29 <212> ADN >: 213 > Secuencia artificial <220 > <223 Descripción de la secuencia artificial: cebador <400 > 20 cttcccaatc ccaagtcttc ccttgaaac 29 <210> 21 <211> 36 <212> ADN <213 > Secuencia artificial e220 > <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400 > 21 cttaatttct gctacgacgt caggatggtc ataatc 6 <210> 22 <211> 3B <212> ADN < 213 > Secuencia artificial c220> < 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400 > 22 cgcccaagtc attcgaccag tactcagcta ccgtaaac 38 <210> 23 <211» 29 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 23 gccgttttca ttgtcgactt cccaatccc 29 <210> 24 «211» 35 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 24 ggaatttcgc gctgactagt cccgtacata tcccc 35 <210> 25 <211> 36 c212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 25 ggcaggaatt tcgcgacctt tcgtcccgta catate 36 <210> 26 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 26 cctcattctg cagcagcagc cgtaaatggc acgctg 36 <210> 27 <211> 38 <212> ADN 213 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 27 ccagacggca gtaatacega tatcegataa atgttccg 38 <211 > 30 <212 > ADN « 213 > Secuencia artificial c220 > <222 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 28 cggatatcgg tattactgcc gtctggattc 30 c210> 29 <211> 21 <212> ADN <213 > Secuencia artificial <220 > c223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400 > 29 ctcgtcccaa tcggttccgt c 21 <210> 30 <211> 26 <21 s ADN <213 > Secuencia artificial <220 > e223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 30 gatgtatgcc gacttcgatt atgacc 26 <210> 31 <211> 30 <212> ADN <2i2 > Secuencia artificial e220 > e223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 31 catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30 <21C > 32 «211 » 24 c212 > ADN <213 Secuencia artificial <220 > <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 32 ccgattgctg acgctgttat ttgc 24 <210> 33 <211> 25 c212s ADN < 213 > Secuencia artificial «220 > <223> <400> 33 gccaagcgga taacggctac ggtgc 25 <210> 34 <211> 28 C212> ADN < 13 > Secuencia artificial c <220s •> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador c400> 34 gaacgagcca atcggacgtg ggctacgg 28 <210> 35 c211> 32 <212> ADN <213 > Secuencia artificial <220 a 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 35 0 ggaacgagcc aatcggataa cggctacggt ge 32 <210» 36 <211> 25 212> ADN < 21 > Secuencia artificial <220? <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 36 geatataagg gactgagcca agcgg 25 -;210> 37 <211> 25 <212> ADN <213 > Secuencia artificial c220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador c400> 37 caaccacaaa gtícggcgctg atgcg 25 <210> 38 <211> 41 <212> ADN < 13 > Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 38 geatataagg gactgagcca atcggataac ggctacggtg c 41 <210> 39 <211> 28 <212> ADN <2i3> Secuencia artificial <220> <223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 39 gaaegagecg atcggacgtg ggctacgg 28 <210> 40 <211> 28 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 40 gaaegageca aaacgacgtg ggctacgg 28

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : l.Una variante de una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, caracterizada porque comprende una alteración en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: G48, T49, S50, Q51, G107, G108, Allí, S168, en donde (a) la(s) alteración (es) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en dirección 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una eliminación del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una substitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa, y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácido de la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4. 2. La variante de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una mutación en una posición correspondiente a al menos una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO.4 A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; o T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+C107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A,
2. T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; o T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, G107V, G07I, G107L, G107C.
3. 3. La variante de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque comprende una mutación en una posición correspondiente o al menos una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostradas en la SEC ID NO: 4: G48A,V,S,T, I,L; *48aD o *48aY (es decir, una inserción de D o de Y) ; T49X; *49aX (es decir, una inserción de cualquier residuo de aminoácido S50X, en particular D,Y,L,T,V, I; Q51R,K; A52S,N, T,V; D53Q,N,S,T,V; G107X, en particular G107A, V, S, T, I, L, C; G108X, en particular G108A, V, S, T, I, L; AllIV, I,L; S168Y; M197Y, F,G.
4. 4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende las siguientes mutaciones correspondientes a al menos una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4; T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/ +G107A.
5. 5. La variante de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende G108A.
6. 6. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende las siguientes mutaciones correspondientes a al menos una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. T49L+G107A; T49I+G107A; T49L+G107A+V54I; T49I+G107A+V54I; A52S+V54N+T49L+G107A; A52S+V54I+T49L+G107A; A52S+T49L+G107A; A52T+T49L+G107A; AS2S+V54N+T49I+G107A; A52S+V54I+T49I+G107A; A52S+T49I+G107A; T49L+G108A; T49I+G108A; T49L+G108A+V54I; T49I+G108A+V54I.
7. 7. Una variante de cualquiera de las reivindicaciones l a ß, caracterizada porque dicha variante tiene una capacidad reducida de escisión o desdoblamiento en un substrato de oligo-sacárido cerca al punto de ramificación comparado a la alfa-amilasa progenitora.
8. 8. Una variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque exhibe adicionalmente una especificidad del substrato mejorada y/o una actividad especifica mejorada relativa a la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora.
9. 9. Una variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la alfa-amilasa progenitora es una alfa-amilasa hibrida de la SEC ID NO: 4 y la SEC ID NO: 6.
10. 10. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la alfa-amilasa hibrida, progenitora, es una alfa-amilasa hibrida que comprende 445 residuos de aminoácidos C terminales de la alfa-amilasa B. li cheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquef aciens mostrada en la SEC ID NO: 6.
11. 11. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, hibrida, tiene además las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) o LEI74.
12. 12. La variante de cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque la alfa-amilasa similar al termamilo, hibrida, comprende además las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+190F+A209V+Q264S+I201F (usando la numeración de la SEC ID NO: 4) o LE429.
13. 13. Un constructo de ADN, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. 14. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque transporta un constructo de ADN de acuerdo a la reivindicación 13.
15. 15. Una célula caracterizada porque se transforma con un constructo de ADN de acuerdo a la reivindicación 13 o a un vector de acuerdo a la reivindicación 14.
16. 16. La célula de la reivindicación 15, caracterizada porque comprende un microorganismo, en particular una bacteria o un hongo, tal como una bacteria gram positiva tales como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Bacill us lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophil us , Bacillus amyloliquef aciens , Bacill us coagulans, Bacill us circulans, Bacill us lautus o Bacill us thuringiensis .
17. 17. Una composición caracterizada porque comprende: (i) una mezcla de alfa-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 con una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8; o (ii) una mezcla de la alfa-amilasa de B . stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de una o mas de otras alfa-amilasas similares al termamilo, progenitoras; o (iii) una mezcla de una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o mas variantes de acuerdo a la invención derivada de una o mas de otras alfa-amilasas similares al termamilo, progenitoras.
18. 18. Una composición caracterizada porque comprende: una mezcla de una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora derivada de la alfa-amilasa de B . li cheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4.
19. 19. Una composición caracterizada porque comprende: una mezcla de una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) la alfa-amilasa de B. stearothermophil us que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y una alfa-amilasa hibrida que comprende una parte de la alfa-amilasa de B . amyloliquef aciens mostrada en la SEC ID NO: 6 y una parte de la alfa-amilasa de B. li cheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4.
20. 20. Una composición caracterizada porque comprende: una mezcla de una o mas variantes de las reivindicaciones 1 a 12 derivadas de (como la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora) una alfa-amilasa hibrida que comprende una parte de la alfa-amilasa de B. amyl oliquef aci ens mostrada en la SEC ID NO: 6 y una parte de la alfa-amilasa de B. licheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4.
21. 21. Una composición de la reivindicación 20, caracterizada porque el híbrido de la alfa-amilasa es un híbrido de alfa-amilasa que comprende los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de B . li cheniformi s mostrada en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquef aciens mostrada en la SEC ID NO: 6.
22. 22. Una composición de la reivindicación 21, caracterizada porque la alfa-amilasa hibrida tiene además las siguientes mutaciones : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) o LE174.
23. 23. Una composición de la reivindicación 21, caracterizada porque la alfa-amilasa hibrida tiene además las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F como se muestra en la SEC ID NO: 2 o LE429.
24. 24. Un método para generar una variante de una alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora, la cuál variante exhibe una capacidad reducida para escindir o desdoblar un substrato cerca del punto de ramificación, y exhibe además una especificidad de substrato mejorada y/o actividad especifica mejorada relativa al progenitor, el método está caracterizado porque comprende: (a) someter una secuencia de ADN que codifica a la alfa-amilasa similar al termamilo, progenitora para una mutagénesis aleatoria, (b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en el paso (a) en una célula hospedera, y (c) seleccionar las células hospederas que expresan una alfa-amilasa mutada la cual tiene estabilidad incrementada a un pH bajo y baja concentración de calcio relativas o en relación a la alfa-amilasa progenitora.
25. 25. El uso de una variante de alfa-amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23 para la licuefacción de almidón; en una composición de detergente tales como las de lavandería, lavado de platos y composiciones de limpieza de superficies difíciles o duras; producción de etanol, tal -como la producción de etanol para combustible, para beber e industrial; desencolado de textiles, telas o prendas.