CN105934518A - 用于生产发酵产品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从含淀粉的材料生产发酵产品的方法，其中α‑淀粉酶和热稳定性内切葡聚糖酶在液化期间存在和/或添加。本发明还涉及适合用于本发明的方法的组合物。
Description
发明领域
本发明涉及用于从含淀粉的材料生产发酵产品的方法。本发明还涉及适合用于本发明的方法中的组合物。
对序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
从含淀粉的材料生产发酵产品(如乙醇)是本领域中公知的。产业上，目前使用两种不同的方法。最普遍使用的方法，通常称为“常规方法”，包括在高温下通常使用细菌α-淀粉酶液化糊化的淀粉，接着在葡糖淀粉酶和发酵生物体的存在下同时进行糖化(saccharification)和发酵。另一种公知的方法，通常称为“原淀粉水解(raw starchhydrolysis)”方法(RSH方法)，包括在低于最初糊化温度下通常在至少一种葡糖淀粉酶的存在下同时糖化和发酵颗粒淀粉。
尽管在过去十年里对发酵产品生产方法的显著改进，大量的残留淀粉材料没有转化为期望的发酵产品，如乙醇。
因此，仍然渴望和需要提供用于从含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法，所述方法与常规方法相比可以提供更高的发酵产品产率或其它优点。
发明简述
本发明涉及使用发酵生物体从含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法。本发明还涉及用于本发明的方法的组合物。
在第一个方面，本发明涉及从含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化(gelatinization)温度的温度下使用下列各项液化含淀粉的材料：
-α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用碳水化合物源生成酶(carbohydrate-source generating enzyme)糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个实施方案中，在发酵或同时糖化和发酵(SSF)期间存在或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物。
在第二个方面，本发明涉及组合物，包含：
i)α-淀粉酶；
ii)具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
iii)可选地，具有以80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值蛋白酶；和
iv)可选地，碳水化合物源生成酶。
本发明还涉及本发明的组合物用于液化含淀粉的材料的用途。
最后，本发明涉及生产液化的淀粉的方法，包括用本发明的组合物液化含淀粉的材料。
发明详述
本发明涉及使用发酵生物体从含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法。本发明还涉及用于本发明的方法的组合物。
本发明人已经发现，当在热稳定性内切葡聚糖酶的存在下使用α-淀粉酶液化含淀粉的材料时及当纤维素酶存在于发酵中时(例如SSF)，获得增加的乙醇产率。
在第一个方面，本发明涉及生产发酵产品，优选乙醇的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在高于初始糊化温度的温度下液化含淀粉的材料：
-α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(Melting Point)(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用碳水化合物源生成酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
步骤ii)和iii)可以顺序进行或同时进行。在一个优选的实施方案中，步骤ii)和iii)同时进行。α-淀粉酶，具有70℃以上(如在70℃和95℃之间)的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶可以在液化步骤i)之前和/或期间添加。可选地，也可以存在或添加碳水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶，支链淀粉酶(pullulanase)，和/或植酸酶(phytase)。在一个优选的实施方案中，如下文定义的本发明的组合物可以适当用于本发明的方法中的液化。酶可以单独或作为混合组合物添加，所述混合组合物包含α-淀粉酶和具有70℃以上的熔点(DSC)的热稳定性内切葡聚糖酶和可选地蛋白酶，碳水化合物源生成酶，支链淀粉酶和/或植酸酶。
α-淀粉酶的例子可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶”中找到。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶是本文中的SEQ ID NO:1中示出的α-淀粉酶的变体，例如源自菌株嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，具有选自下组的突变：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。
嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶当产生时通常自然截短为长491个左右的氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1比较)，如长480-495个氨基酸。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌α-淀粉酶，如特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在液化中以0.01-10KNU-A/g DS之间，例如0.02-5KNU-A/g DS之间，如0.03和3KNU-A/g DS之间，优选0.04和2KNU-A/g DS之间，如特别是0.01和2KNU-A/g DS之间的浓度给予(dose)。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌α-淀粉酶，如特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在液化中以0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS，例如0.0005-0.5mg EP/g DS，如0.001-0.1mg EP/g DS的浓度给予。
具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶的例子可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的热稳定内切葡聚糖酶”中找到。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶是本文中的SEQ ID NO:3中示出的内切葡聚糖酶，如源自Talaromyces leycettanus菌株的内切葡聚糖酶(WO 2013/019780)，或与本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的内切葡聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶是本文中的SEQ ID NO:3中示出的内切葡聚糖酶，如源自Talaromyces leycettanus菌株的内切葡聚糖酶(WO 2013/019780，特此通过提述并入)，或与本文中的SEQ ID NO:3具有至少90％同一性且具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。
可选的蛋白酶的例子可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的蛋白酶”中找到。
适合的可选的碳水化合物源生成酶，优选热稳定碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶的例子可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶”中找到。
适合的可选的直链淀粉酶可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的直链淀粉酶”中找到。
在一个优选的实施方案中，支链淀粉酶源自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)。
植酸酶的例子可以在下面的小节“液化期间存在和/或添加的植酸酶”中找到。
在一个优选的实施方案中，植酸酶源自布丘氏菌属(Buttiauxella)菌株。
在糖化和/或发酵期间或同时糖化和发酵(SSF)期间存在和/或添加的适合的纤维素酶或纤维素分解酶可以在下面的小节“糖化和/或发酵期间或SSF期间存在和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物”中找到。
在一个实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉(Trichodermareesei)。
在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:3)以及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ IDNO:29)。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含如WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31公开的爱默生青霉(Penicillium emersonii)GH61A多肽，以及如WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:29公开的烟曲霉β-葡糖苷酶，或其变体，该变体具有下述取代中的一个，优选全部：F100D，S283G，N456G，F512Y(使用SEQ ID NO:29进行编号)。
根据本发明的方法，液化期间的pH可以在4.0-6.5之间，如4.5-6.2之间，如4.8-6.0以上，如5.0-5.8之间。
根据本发明，温度在初始糊化温度以上。术语“初始糊化温度”指代开始淀粉溶解(通常通过加热)的最低温度。对于不同淀粉，温度可以变化。初始糊化温度可以是50-70℃。
在一个实施方案中，液化步骤i)期间的温度在70-100℃的范围内，如在70-95℃之间，如在75-90℃之间，优选在80-90℃，如85℃左右。
在一个实施方案中，本发明的方法在步骤i)之前包括以下步骤：
a)降低含淀粉的材料的粒度，优选通过干磨；
b)形成包含含淀粉的材料和水的浆料(slurry)。
含淀粉的材料(如整谷粒)可以降低粒度，例如通过碾磨，从而打开结构以增加表面积并允许进一步的处理。一般有两类方法：湿磨和干磨。在干磨中，碾磨并使用整个籽粒(kernel)。湿磨给出胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白)的良好分离。经常在淀粉水解物用于例如糖浆(syrup)生产的场所应用湿磨。干磨和湿磨两者在淀粉加工领域中都是公知的。根据本发明，优选干磨。在一个实施方案中，粒度被降低到0.05至3.0mm之间，优选0.1-0.5mm，或使得至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％的含淀粉的材料适合通过具有0.05至3.0mm滤网，优选0.1-0.5mm滤网的筛。在另一个实施方案中，至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少90％的含淀粉的材料适合通过具有#6滤网的筛。
水性浆料可以含有10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体(DS)，更优选30-40w/w-％干固体(DS)的含淀粉的材料。
可以将浆料加热到初始糊化温度以上，优选到70-95℃之间，如80-90℃，pH 5.0-7.0之间，优选5.0和6.0之间，持续30分钟到5小时，如2小时左右。
在一个实施方案中，液化步骤i)在70-95℃的温度于4-6的pH进行0.5-5小时。
在一个优选的实施方案中，液化步骤i)在80-90℃的温度于4-6的pH进行0.5-3小时。
α-淀粉酶和热稳定性内切葡聚糖酶，和可选的蛋白酶，可选的碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，可选的支链淀粉酶，和/或可选的植酸酶可以最初添加到水性浆料以启动液化(稀释(thinning))。在一个实施方案中，酶的仅一部分添加到水性浆料，而剩下的酶在液化步骤i)期间添加。
一个实施方案中的水性浆料可以喷射蒸煮(jet-cooked)以在步骤i)中经历液化之前进一步糊化浆料。可以在95-160℃之间，如110-145℃，优选120-140℃，如125-135℃，优选130℃左右的温度进行喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟左右。
糖化和发酵
根据本发明的方法，一种或多种碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，可以在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间存在和/或添加。碳水化合物源生成酶可以优选的是葡糖淀粉酶，但是也可以是选自下组的酶：β-淀粉酶，生麦糖淀粉酶(maltogenic amylase)和α-葡糖苷酶。在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间添加的碳水化合物源生成酶通常与在液化步骤i)期间可选添加的可选的碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶不同。在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶与真菌α-淀粉酶一起添加。
碳水化合物源生成酶(包括葡糖淀粉酶)的例子可以在下面的小节“糖化和/或发酵期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶”中找到。
当进行顺序糖化和发酵时，可以以本领域公知的条件进行糖化步骤ii)。例如，糖化步骤ii)可以持续长达约24至约72小时。
在一个实施方案中，完成了预糖化步骤。在一个实施方案中，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)之前进行的预糖化期间添加碳水化合物源生成酶。也可以在同时糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化期间添加碳水化合物源生成酶。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶，和/或纤维素分解酶组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)之前进行的预糖化期间添加。水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶，和/或纤维素分解酶组合物也可以在同时糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化期间添加。
通常在30-65℃之间的温度，通常约60℃进行预糖化40-90分钟。预糖化可以继之以同时糖化和发酵(“SSF”)中的发酵期间的糖化。通常在从20-75℃的温度，优选从40-70℃，通常60℃左右，且于4和5之间的pH，例如pH 4.5左右进行糖化。
同时糖化和发酵(“SSF”)广泛用于工业规模的发酵产品生产方法，特别是乙醇生成方法。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。可以没有用于糖化的保持阶段(holding stage)，意味着发酵生物体(如酵母)和酶(在根据本发明的一个优选实施方案中是葡糖淀粉酶和纤维素分解酶组合物)可以一起添加。然而，也涵盖单独添加发酵生物体和酶。根据本发明，发酵或SSF通常可以在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵在进行中达6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施方案中，pH为3.5-5之间，特别是3.8至4.3之间。
发酵培养基
“发酵培养基”指代进行发酵的环境。发酵培养基包括发酵底物，即由发酵生物体代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于发酵生物体的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源，例如氨(ammonia)；尿素，维生素和矿物质，或其组合。
发酵生物体
术语“发酵生物体”指代适合于用于发酵过程并能够产生期望的发酵产品的任意生物体，包括细菌和真菌生物体，特别是酵母。特别适合的发酵生物体能够将糖类，如葡萄糖或麦芽糖直接或间接发酵(即转化)为期望的发酵产品，如乙醇。发酵生物体的例子包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属物种(Saccharomyces spp.)菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
发酵(如SSF)期间的活体发酵生物体的合适浓度是本领域中公知的或者可以由本领域技术人员容易地确定。在一个实施方案中，将发酵生物体，如乙醇发酵性酵母(例如酿酒酵母)添加到发酵培养基，使得活体发酵生物体，如酵母，每mL发酵培养基的计数在105至1012的范围内，优选从107至1010的范围内，特别是约5x107。
商品化酵母的例子包括例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从GertStrand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
含淀粉的材料
根据本发明，可以使用任意适合的含淀粉的材料。通常基于期望的发酵产品选择起始材料。适合用于本发明的方法的含淀粉的材料的例子包括整谷粒(whole grain)，玉米，小麦，大麦，黑麦，蜀黍(milo)，西米(sago)，木薯(cassava)，木薯粉(tapioca)，高粱，稻，豌豆，豆(bean)，或甘薯(sweet potato)，或其混合物，或从其衍生的淀粉或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。
在一个优选的实施方案中，根据本发明用于乙醇生产的含淀粉的材料是玉米或小麦。
发酵产品
术语“发酵产品”意指由包括使用发酵生物体的发酵步骤的方法生产的产品。根据本发明涵盖的发酵产品包括醇(例如，乙醇，甲醇，丁醇；多元醇，如甘油，山梨糖醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施方案中，发酵产品是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用酒精(potable neutral spirit)；或工业乙醇或用于食用醇业(例如啤酒和葡萄酒)，乳品业(例如，发酵的乳制品)，皮革业和烟草业中的产品。优选的啤酒类型包含爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、铂尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦味酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(lightbeer)。优选地，本发明的方法用于生产醇，如乙醇。根据本发明获得的发酵产品(如乙醇)可以用作燃料，其通常与汽油混合。然而，在乙醇的情况下，其也可以用作饮用乙醇。
回收
在发酵或SSF之后，可以将发酵产品与发酵培养基分离。可以蒸馏浆料以提取期望的发酵产品(例如乙醇)。或者，可以通过微过滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取期望的发酵产品。也可以通过提馏(stripping)或本领域中公知的其它方法回收发酵产品。
液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，在液化期间，α-淀粉酶与具有70℃以上，如在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，以及可选的蛋白酶，可选的碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，可选的支链淀粉酶，和/或可选的植酸酶一起存在和/或添加。
在液化步骤i)期间添加的α-淀粉酶可以是任意α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，如特别是芽孢杆菌α-淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其在液化期间使用的温度下稳定。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指任意归类于EC 3.2.1.1下的细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可以例如源自芽孢杆菌属的菌株，其有时也可以称为土芽孢杆菌属(genus Geobacillus)。在一个实施方案中，芽孢杆菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种TS-23，或枯草芽孢杆菌的菌株，但也可以源自其它芽孢杆菌属物种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467中SEQID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，以及如WO 2009/061380中SEQ ID NO:1公开的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶可以是与WO 2009/19467中SEQ ID NO:3、4或5中分别所示的序列以及WO 2009/061380中SEQ ID NO:1中所示的序列的任一项具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。
在一个实施方案中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的序列的任一项具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟的野生型或其成熟变体。成熟的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以在重组生成期间自然截短。例如，成熟的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以被截短，使得其具有491个左右的氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比)，例如480-495个氨基酸。
芽孢杆菌属α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体。这种变体的例子可以在WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、WO 02/10355和WO 2009/061380的任一中找到(在此通过提及收录全部文献)。具体的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中(在此通过提及收录)，并且包括在位置R179，G190，I181和/或G182处的一个或两个氨基酸的缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(通常称为BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873中公开的双重缺失：参见例如，第20页，第1-10行(在此通过提及收录)，优选对应于与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中列出的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1进行编号的氨基酸R179和G180的缺失(在此通过提及收录该参考文献)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双重缺失并进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶也可以具有对应WO 99/19467中的SEQ ID NO:4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的S239的位置中的取代，或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体。
在一个实施方案中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A，E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施方案中，变体是位置E188变体，优选嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。
其它涵盖的变体是WO 2009/061380中公开的芽孢杆菌属物种TS-23变体，特别是WO 2009/061380的权利要求1中定义的变体。
细菌杂合α-淀粉酶
细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个优选的实施方案中，该杂合体具有下述取代中的一个或多个，特别是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号)。还优选具有以下突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶主链中的相应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在176和179位之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ IDNO:5进行位置编号)。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶是Richardson et al.,2002,The Journal ofBiological Chemistry 277(29):.267501-26507中公开的嵌合α-淀粉酶的成熟部分，称为BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ ID NO:2中示出的α-淀粉酶相同。成熟的酶序列在位置1中的初始的“Met”氨基酸后开始。
热稳定性α-淀粉酶
根据本发明，与具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶组合在本发明的方法中使用或在本发明的组合物中包含的α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶，如热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌或芽孢杆菌属物种TS-23。在一个实施方案中，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少10的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少15的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少20的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少25的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少30的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少40的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少50的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少60的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有10-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有15-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有20-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有25-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有30-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有40-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有50-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有60-70之间的T1/2(min)。
在一个实施方案中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，尤其是源自如WO 99/19467中以SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中公开的嗜热脂肪芽孢杆菌且在位置R179，G180，I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是缺失R179和G180，或缺失I181和G182，且具有以下的突变表中的突变。
在一个优选的实施方案中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双重缺失I181+G182，以及可选的取代N193F，进一步包含选自下表的突变：
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶，如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶与本文中的SEQ ID NO:1的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性。
在一个实施方案中，细菌α-淀粉酶变体，如芽孢杆菌α-淀粉酶变体，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体与本文中的SEQ ID NO:1的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的同一性。
应当理解当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶和其变体时，它们通常以截短形式天然产生。特别地，截短可以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C端截短，并通常长491个氨基酸左右，如长480-495个氨基酸。
液化期间存在和/或添加的热稳定性内切葡聚糖酶
根据本发明，具有70℃以上，如70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶(“EG”)与α-淀粉酶，如热稳定性细菌α-淀粉酶组合存在和/或添加到液化步骤i)。内切葡聚糖酶和α-淀粉酶可以单独添加，或作为酶混合物组合物添加。在一个优选的实施方案中，酶混合物是本发明的组合物，其包含α-淀粉酶和具有70℃以上，如70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。
可以如小节“材料和方法”中在“通过差异扫描量热法(Differential ScanningCalorimetry)对内切葡聚糖酶测定Td”下描述的，测定内切葡聚糖酶的热稳定性。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶具有72℃以上，如74℃以上，如76℃以上，如78℃以上，如80℃以上，如82℃以上，如84℃以上，如86℃以上，如88℃以上，如70℃和95℃之间，如76℃和94℃之间，如78℃和93℃之间，如80℃和92℃之间，如82℃和91℃之间，如84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
在一个优选的实施方案中，包含于本发明的组合物中的用于本发明的方法中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或者GH5内切葡聚糖酶(参见www.cazy.org网页上的CAZy数据库)。在一个实施方案中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文中的SEQID NO:3中所示的Talaromyces leycettanus内切葡聚糖酶；本文中的SEQ ID NO:4中所示的胶囊青霉(Penicillium capsulatum)内切葡聚糖酶，和如本文中的SEQ ID NO:5中所示的Trichophaea saccata内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施方案中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文中的SEQ ID NO:7中所示的粪生粪壳菌(Sordariafimicola)或本文中的SEQ ID NO:6中所示的土生梭孢霉(Thielavia terrestris)内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性。在一个实施方案中，内切葡聚糖酶源自踝节菌属(Talaromyces)菌株，如Talaromycesleycettanus菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性，优选源自青霉属菌株，例如胶囊青霉菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自Trichophaea菌株，例如Trichophaea saccata菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:6的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自梭孢霉属菌株(Thielavia)，例如土生梭孢霉菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性，优选源自粪壳菌属菌株，例如粪生粪壳菌菌株。
在一个实施方案中，热稳定性内切葡聚糖酶在液化步骤i)中以1-10,000μg EP(酶蛋白/g DS)，如10-1,000μg EP/g DS的剂量添加。
液化期间存在和/或添加的蛋白酶
在本发明的实施方案中，蛋白酶(如热稳定性蛋白酶)在液化期间与α-淀粉酶，如热稳定性α-淀粉酶，和具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，以及可选地碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，可选地支链淀粉酶和/或可选地植酸酶一同存在和/或添加。
蛋白酶基于它们的催化机制分为以下组：丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)，和未知的或尚未分类的蛋白酶(U)，见Handbook ofProteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds),Academic Press(1998)，特别是一般介绍部分。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶类)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是金属蛋白酶与否，参考以上的“Handbook ofProteolytic Enzymes”以及其中所示的原则。可以对于所有类型的蛋白酶进行这种确定，其为自然发生或野生型的蛋白酶，或遗传工程化或合成的蛋白酶。
可以使用任意适合的测定法测量蛋白酶的活性，其中采用底物，其包括所讨论的蛋白酶特异性相关的肽键。测定法pH和测定法温度同样要适用于所讨论的蛋白酶。测定法pH值的例子是pH 6，7，8，9，10或11。测定法温度的例子是30，35，37，40，45，50，55，60，65，70或80℃。
蛋白酶底物的例子是酪蛋白(casein)，例如Azurine交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。在“材料和方法”小节中描述了两种蛋白酶测定法，其中称作“AZCL-酪蛋白测定法”的测定法是优选的测定法。
在一个实施方案中，热稳定性蛋白酶具有通过“材料和方法”小节中描述的AZCL-酪蛋白测定法测定的蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的蛋白酶活性的至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％，如至少60％，如至少70％，如至少80％，如至少90％，如至少100％。
对用于本发明的方法或组合物中的热稳定性蛋白酶的起源没有限制，只要其符合下文定义的热稳定性特性。
在一个实施方案中，所述蛋白酶是真菌起源的。
热稳定性蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要蛋白酶具有本文中所定义的热稳定性特性。在一个优选的实施方案中，热稳定性蛋白酶是如上文所定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施方案中，用于本发明的方法或组合物中的热稳定性蛋白酶是真菌起源的，例如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属菌株，优选橙色嗜热子囊菌菌株，特别是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。
在一个实施方案中，热稳定性蛋白酶是WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1并示于本文中的SEQ IDNO:2的成熟部分的变体，其进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
在一个优选的实施方案中，热稳定性蛋白酶是如WO 2003/048353中公开的SEQ IDNO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:2的成熟部分的成熟金属蛋白酶的变体，其具有以下突变公开：
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L；或
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施方案中，蛋白酶变体与WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:2的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％的同一性。
热稳定性蛋白酶也可以源自任意细菌，只要蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。
在一个实施方案中，热稳定性蛋白酶源自火球菌属细菌菌株，如激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施方案中，蛋白酶是美国专利号6,358,726-B1(Takara Shuzo Company)和本文中的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
在另一个实施方案中，热稳定性蛋白酶是本文中的SEQ ID NO:13中公开的蛋白酶，或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13具有至少80％同一性，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可以购自Takara Bio,Japan。
激烈火球菌蛋白酶是根据本发明的热稳定性蛋白酶。发现了商业产品激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性，如本文的实施例2中所述的那样测定的。
在一个实施方案中，用于本发明的方法中的热稳定性蛋白酶具有大于20％的热稳定性值，其以如实施例2中所述那样测定的在80℃/70℃的相对活性测定。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，如大于105％，如大于110％，如大于115％，如大于120％的热稳定性。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的20和50％之间，如20和40％之间，如20和30％之间的热稳定性。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的50和115％之间，如50和70％之间，如50和60％之间，如100和120％之间，如105和115％之间的热稳定性。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的大于10％的热稳定性值，如实施例2中所述那样测定的。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的大于10％，如大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％的热稳定性。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性确定的10和25％之间，如10和30％之间，如10和25％之间的热稳定性。
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在80℃的剩余活性(remaining activity)测定的大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％；和/或
在一个实施方案中，蛋白酶具有以在84℃的剩余活性测定的大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％。
如实施例2中所述，完成“相对活性”和“剩余活性”的测定。
在一个实施方案中，蛋白酶在85℃可以具有90以上，如100以上的热稳定性，如使用实施例3中公开的玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
在一个实施方案中，蛋白酶在85℃具有60％以上，如90％以上，如100％以上，如110％以上的热稳定性，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
在一个实施方案中，蛋白酶在85℃具有60-120之间的热稳定性，如70-120％之间，如80-120％之间，如90-120％之间，如100-120％之间，如110-120％之间，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
在一个实施方案中，热稳定性蛋白酶具有通过AZCL-酪蛋白测定法测定的JTP106蛋白酶变体或蛋白酶Pfu活性的至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％，如至少60％，如至少70％，如至少80％，如至少90％，如至少95％，如至少100％。
液化期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶
根据本发明，碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶可以在液化期间与α-淀粉酶，如热稳定性α-淀粉酶，和具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，以及可选地支链淀粉酶和/或可选地植酸酶一同存在和/或添加。
术语“碳水化合物源生成酶”包括任意生成可发酵糖的酶。碳水化合物源生成酶能够产生碳水化合物，其可以被讨论的发酵生物体用作能源，例如，当在用于生产发酵产品，如乙醇的本发明的方法中使用时。生成的碳水化合物可以被直接或间接转化为期望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用碳水化合物源生成酶的混合物。特定的例子包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶，和生麦淀粉酶(为麦芽糖生成者)。
在一个优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是热稳定的。碳水化合物源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或单独添加。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，在85℃具有至少20％，至少30％，优选至少35％的相对活性热稳定性，如实施例4(热稳定性)中所述测定的。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，如100％的相对活性pH最佳值的葡糖淀粉酶，如实施例4(pH最佳值)中所述确定的。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少80％，至少85％，优选至少90％的pH稳定性的葡糖淀粉酶，如实施例4(pH稳定性)中所述确定的。
在一个特定和优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属菌株，特别是草酸青霉菌株的热稳定性葡糖淀粉酶，具体是WO 2011/127802(其在此通过提述并入)中的SEQ ID NO:2公开和本文SEQ IDNO:14所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在一个实施方案中，热稳定性葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的同一性。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，是本文SEQ ID NO:14所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在一个优选的实施方案中，生成碳水化合物的酶是如WO 2011/127802中的SEQ IDNO:2所公开并示于本文的SEQ ID NO:9或14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(称为“PE001”)(使用SEQ ID NO:14所示的成熟序列进行编号)。相对于WO 2013/036526(其在此通过提述并入)中公开的亲本，该K79V葡糖淀粉酶变体具有降低的对蛋白酶降解的敏感性。
在一个实施方案中，热稳定性葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所公开并示于本文的SEQ ID NO:9或14的成熟序列的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体。在一个优选的实施方案中，草酸青霉葡糖淀粉酶是如WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所公开并在本文的SEQ ID NO:9或14中所示且在位置79中具有Val(V)(使用本文SEQ ID NO:14进行编号)的草酸青霉葡糖淀粉酶。
涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体公开于WO 2013/053801(其通过提述并入本文)。
在一个实施方案中，这些变体具有降低的对蛋白酶降解的敏感性。
在一个实施方案中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。
更具体地，在一个实施方案中，葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用本文SEQ ID NO:14进行编号)，对应于PE001变体，并进一步包含至少一个以下取代或取代的组合：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*；
E501V+Y504T；或
T65A+K161S；或
T65A+Q405T；或
T65A+Q327W；或
T65A+Q327F；或
T65A+Q327Y；或
P11F+T65A+Q327F；或
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
P11F+T65A+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+S105P+Q327W；或
T65A+S105P+Q327F；或
T65A+Q327W+S364P；或
T65A+Q327F+S364P；或
T65A+S103N+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个优选的实施方案中，使用本文SEQ ID NO:14进行编号，草酸青霉葡糖淀粉酶具有K79V取代(PE001变体)，并进一步包含以下突变之一：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶变体，如草酸青霉葡糖淀粉酶变体与本文的SEQID NO:14的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％的同一性。
特别地，碳水化合物源生成酶可以以0.1-100微克EP/g的量添加，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g。
液化期间存在和/或添加的支链淀粉酶
可选地，在液化步骤i)期间，支链淀粉酶可以与α-淀粉酶和蛋白酶一同存在和/或添加。如上文所提到的，碳水化合物源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶也可以在液化步骤i)期间存在和/或添加。
支链淀粉酶可以在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。
支链淀粉酶(EC 3.2.1.41，直链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶(debranchingenzyme)，特征在于它们水解例如胶淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1,6-糖苷键的能力。
根据本发明考虑的支链淀粉酶包括美国专利号4,560,651(在此通过提述并入)中公开的来自Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶，如WO 01/151620(在此通过提述并入)中的SEQ ID NO:2公开的支链淀粉酶，如WO 01/151620(在此通过提述并入)中的SEQID NO:4公开的Bacillus deramificans，以及WO 01/151620(在此通过提述并入)中的SEQID NO:6公开的并描述于FEMS Mic.Let.(1994)115,97-106的来自Bacillusacidopullulyticus的支链淀粉酶。
根据本发明考虑的另外的支链淀粉酶包括来自乌兹炽热球菌(Pyrococcuswoesei)的支链淀粉酶，特别是WO 92/02614中公开的来自乌兹炽热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。
在一个实施方案中，支链淀粉酶是家族GH 57支链淀粉酶。在一个实施方案中，支链淀粉酶包括X47结构域，如WO 2011/087836(其在此通过提述并入)中公开的。更具体地，支链淀粉酶可以源自热球菌属(genus Thermococcus)的菌株，包括海岸热球菌(Thermococcus litoralis)和Thermococcus hydrothermalis，例如WO 2011/087836所示的Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶，其刚好在X47结构域后的X4位点处截短。支链淀粉酶也可以是海岸热球菌和Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶的杂合体，或T.hydrothermalis/海岸热球菌杂合酶，具有WO 2011/087836(其通过提述在此并入)中公开的截短位点X4。
在另一个实施方案中，支链淀粉酶是包含WO 2011/076123(Novozymes)中公开的X46结构域的支链淀粉酶。
根据本发明，支链淀粉酶可以以有效量添加，所述有效量包括约0.0001-10mg酶蛋白每克DS的优选量，优选0.0001-0.1mg酶蛋白每克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白每克DS。可以将支链淀粉酶活性以NPUN测定。用于测定NPUN的测定法描述于以下小节“材料和方法“中。
适合的商业化支链淀粉酶产品包括PROMOZYME 400L,PROMOZYMETM D2(NovozymesA/S,Denmark),OPTIMAX L-300(Genencor Int.,USA),和AMANO 8(Amano,Japan)。
液化期间存在和/或添加的植酸酶
可选地，植酸酶可以在液化期间与α-淀粉酶和具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶组合存在和/或添加。
根据本发明使用的植酸酶可以是能够实现无机磷酸盐从植酸肌醇六磷酸(myo-inositol hexakisphosphate))或从其任意的盐(植酸盐)释放的任意酶。植酸酶可以根据其在起始水解步骤中的特异性分类，也就是根据首先水解哪个磷酸酯基团。用于本发明中的植酸酶可以具有任意特异性，例如，为3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶(无EC编号)。在一个实施方案中，植酸酶具有50℃以上，如在50-90℃的范围内的温度最佳值。
植酸酶可以源自植物或微生物，如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。
植物植酸酶可以来自麦麸，玉米，大豆或百合花粉。适合的植物植酸酶描述于Thomlinson et al,Biochemistry,1(1962),166-171；Barrientos et al,Plant.Physiol.,106(1994),1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139。
细菌植酸酶可以来自芽孢杆菌属(Bacillus)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，哈夫尼菌属(Hafnia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，布丘氏菌属(Buttiauxella)或埃希氏菌属，特别是物种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)，Buttiauxella gaviniae，Buttiauxella agrestis，Buttiauxella noackies和大肠杆菌。适合的细菌植酸酶描述于Paver and Jagannathan,1982,Journal of Bacteriology 151:1102-1108；Cosgrove,1970,Australian Journal of Biological Sciences 23:1207-1220；Greiner et al,Arch.Biochem.Biophys.,303,107-113,1993；WO 1997/33976；WO1997/48812,WO 1998/06856,WO 1998/028408,WO 2004/085638,WO 2006/037327,WO2006/038062,WO 2006/063588,WO 2008/092901,WO 2008/116878,和WO 2010/034835。
酵母植酸酶可以源自酵母属(Saccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)，特别是物种酿酒酵母或西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)。前一种酶已经描述为适合的酵母植酸酶，描述于Nayini et al,1984,Lebensmittel Wissenschaft undTechnologie 17:24-26；Wodzinski et al,Adv.Appl.Microbiol.,42,263-303；AU-A-24840/95；
来自丝状真菌的植酸酶可以源自子囊菌门(Ascomycota)(子囊菌(ascomycetes))或担子菌门(Basidiomycota)的真菌门，例如曲霉属(genus Aspergillus)，嗜热真菌属(Thermomyces)(也称为腐质霉属，Humicola)，毁丝霉属(Myceliophthora)，红曲霉属(Manascus)，青霉菌属(Penicillium)，隔孢伏革菌属(Peniophora)，茶树菇属(Agrocybe)，桩菇属(Paxillus)，或栓菌属(Trametes)，特别是物种土曲霉(Aspergillus terreus)，黑曲霉(Aspergillus niger)，黑曲霉变种泡盛曲霉(awamori)，无花果曲霉(Aspergillusficuum)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，T.Lanuginosus(也称为H.lanuginosa)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，隔孢伏革菌(Peniophora lycii,)，Agrocybe pediades，红曲霉菌(Manascus anka)，桩菇(Paxillus involtus)或毛栓菌(Trametes pubescens)。适合的真菌植酸酶描述于Yamadaet al.,1986,Agric.Biol.Chem.322:1275-1282；Piddington et al.,1993,Gene 133:55-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 1998/28408；WO 1998/28409；JP 7-67635；WO 1998/44125；WO 1997/38096；WO 1998/13480。
在一个优选的实施方案中，植酸酶源自布丘氏菌属，例如Buttiauxellagaviniae，Buttiauxella agrestis，或Buttiauxella noackies，例如WO 2008/092901中的SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6中分别公开的那些。
在一个优选的实施方案中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属，例如布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，例如WO 2006/037328中公开的。
通过本领域已知的方法获得修饰的植酸酶或植酸酶变体，特别是通过EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330,WO 2003/066847,WO 2007/112739,WO 2009/129489,和WO 2010/034835中公开的方法。
商业化的含植酸酶产品包括BIO-FEED PHYTASETM,PHYTASE NOVOTM CT或L(都来自Novozymes),LIQMAX(DuPont)或RONOZYMETM NP,HiPhos,P5000(CT),NATUPHOSTM NG5000(来自DSM)。
糖化和/或发酵期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶
根据本发明，碳水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶，在糖化和/或发酵期间存在和/或添加。
在一个优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉，泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉，或篮状菌属(Talaromyces)菌株，优选T.emersonii。
葡糖淀粉酶
根据本发明，糖化和/或发酵期间存在和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任意适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源，选自下组：曲霉葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al.(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)，或其变体，如公开于WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)，或其变体或片段。其它的曲霉葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen et al.(1996),Prot.Eng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen et al.(1995),Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen etal.(1994),Biochem.J.301,275-281)；二硫键,A246C(Fierobe et al.(1996),Biochemistry,35,8698-8704；以及在位置A435和S436引入Pro残基(Li et al.(1997),Protein Eng.10,1199-1204。
其它葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii(先前命名为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(见美国专利号4,727,026和Nagasaka et al.(1998)“Purification and propertiesof the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,ApplMicrobiol Biotechnol 50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自Talaromyces emersonii(WO 99/28448)，Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)，Talaromyces duponti，Talaromyces thermophilus(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施方案中，糖化和/或发酵期间使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中公开的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括半环栓菌(Trametes cingulata)，Pachykytosporapapyracea，和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部公开于WO 2006/069289；和公开于WO 2007/124285的Peniophora rufomarginata；或其混合物。根据本发明也考虑杂合葡糖淀粉酶。例子包括WO 2005/045018中公开的杂合葡糖淀粉酶。特定的例子包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述在此并入)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属(Pycnoporus)菌株，特别是如WO2011/066576(SEQ ID NO 2，4或6)中所述的密孔菌菌株，或来自Gloephyllum属的菌株，特别是如WO 2011/068803(SEQ ID NO:2，4，6，8，10，12，14或16)中所述的Gloephyllum菌株，或Nigrofomes属菌株，特别是WO 2012/064351(SEQ ID NO:2)中公开的Nigrofomes sp.菌株(所有参考文献通过提述在此并入)。也考虑与上面提到的葡糖淀粉酶表现出高同一性的葡糖淀粉酶，即，与上面提到的酶序列的任意一个成熟部分的至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％同一性。
在一个实施方案中，可以在糖化和/或发酵期间以0.0001-20AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的商品化组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER,SANTMEXTRA L,SPIRIZYMETM PLUS,SPIRIZYMETM FUEL,SPIRIZYMETM B4U,SPIRIZYMETM ULTRA,SPIRIZYMETM EXCEL和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300,GC480,GC417(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900,G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
生麦淀粉酶
在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶也可以是生麦α-淀粉酶。“生麦α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)能够将支链淀粉和支链淀粉水解为α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的生麦淀粉酶可购自Novozymes A/S。生麦α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，生麦淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
糖化和/或发酵或SSF期间存在和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物
在本发明的一个优选实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)或SSF期间存在和/或添加。
纤维素酶或纤维素分解酶组合物可以包含一种或多种纤维素分解酶。纤维素酶或纤维素分解酶组合物可以是任意来源的。在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含真菌来源的纤维素分解酶。
在一个实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自木霉属菌株，例如里氏木霉；或腐质霉属(Humicola)菌株，例如特异腐质霉(Humicola insolens)；或金孢子菌属(Chrysosporium)菌株，例如Chrysosporium lucknowense；或青霉属菌株，例如斜卧青霉(Penicillium decumbens)。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶组合物源自里氏木霉菌株。
纤维素酶可以是β-葡糖苷酶，纤维二糖水解酶，和内切葡聚糖酶，或其组合。
纤维水解酶组合物可以包含β-葡糖苷酶，纤维二糖水解酶，和内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自下组的多肽：
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其混合物。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。纤维素分解增强活性如WO 2011/041397(通过提述并入)中描述的那样定义和确定。
术语“具有纤维素分解增强活性的GH61多肽”表示增强由具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的GH61多肽。为了本发明的目的，可以如下测定纤维素分解增强活性：与具有相等总蛋白加载而没有纤维素增强活性(1-50mg的纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)的对照水解相比，测量来自在下述条件下由纤维素水解酶对纤维素材料的水解的还原糖的增加或总共的纤维二糖和葡萄糖的增加：1-50mg的总蛋白/g PCS(预处理玉米秸秆)中的纤维素，其中总蛋白由50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽蛋白构成，于50℃持续1-7天。在一个优选的方面，在纤维素酶蛋白质加载的2-3％总蛋白重量的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或2-3％的总蛋白重量的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所述在烟曲霉中重组产生)的存在下的CELLUCLASTTM1.5L的混合物用作纤维素分解活性的来源。
纤维素分解酶组合物可以包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属的菌株，如米曲霉，例如WO 2002/095014中公开的，或WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(见SEQ ID NO:74或76)，或烟曲霉，例如WO 2005/047499中SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:29中公开的，或WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属菌株，如WO2007/019442中公开的巴西青霉菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉菌株。
在一个实施方案中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如烟曲霉，如烟曲霉述β-葡糖苷酶(本文SEQ ID NO:29)，或其变体，该变体包含一个或多个选自下组的取代：L89M，G91L，F100D，I140V，I186V，S283G，N456E，和F512Y；如具有以下取代的其变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
亲本β-葡糖苷酶与本文SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少60％的同一性，如至少70％，如至少80％，如至少90％，如至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％，如100％的同一性。
在β-葡糖苷酶是β-葡糖苷酶变体的情况下，其与本文SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少60％的同一性，如至少70％，如至少80％，如至少90％，如至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％，但低于100％的同一性。
在纤维素分解酶组合物可包含GH61多肽的情况下，其可以源自嗜热子囊菌属，例如橙色嗜热子囊菌菌株，如WO 2005/074656中如SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:30中所述的；或来自梭孢霉属，例如土生梭孢霉菌株，如WO 2005/074647中如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所描述的；或源自曲霉属菌株，如烟曲霉株的，如WO 2010/138754如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所描述的；或源自青霉菌属的菌株的，如爱默生青霉菌株，如WO 2011/041397如SEQID NO:2或本文SEQ ID NO:31中公开的。
在一个优选的实施方案中，GH61多肽如源自爱默生青霉菌株的GH61多肽选自下组：
(i)包含本文SEQ ID NO:31的成熟多肽的GH61多肽；
(ii)包含与本文SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列的GH61多肽。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属菌株，如烟曲霉菌株，如WO 2011/057140中SEQ ID NO:6或本文SEQ ID NO:32公开的Cel7a CBHI，或木霉属菌株，例如里氏木霉菌株。
在一个优选的实施方案中，纤维二糖水解酶I，如源自烟曲霉菌株的纤维二糖水解酶I选自下组：
(i)包含本文SEQ ID NO:32的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)包含与本文SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株，例如烟曲霉菌株；例如本文SEQ ID NO:33中公开的，或木霉属菌株，例如里氏木霉菌株，或梭孢霉属菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在一个优选的实施方案中，纤维二糖水解酶II，如源自烟曲霉菌株的纤维二糖水解酶II，选自下组：
(i)包含本文SEQ ID NO:33的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)包含与本文SEQ ID NO:33的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含源自青霉菌属菌株，如爱默生青霉菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如WO 2011/041397中如SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:31公开的，和β-葡糖苷酶。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，和β-葡糖苷酶，以及CBH I。
在一个实施方案中，纤维素分解酶合物包含源自青霉菌属菌株，如爱默生青霉菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如WO 2011/041397中如SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:31公开的，和β-葡糖苷酶，以及CBH I。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，CBH I，以及CBH II。
在一个实施方案中，纤维素分解酶合物包含源自青霉菌属菌株，如爱默生青霉菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如WO 2011/041397中如SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:31公开的，和β-葡糖苷酶，CBH I，以及CBH II。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)，以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含如WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:10公开的爱默生青霉GH61A多肽，和WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29公开的烟曲霉β-葡糖苷酶，或其变体，该变体具有一个，优选所有的以下取代：F100D，S283G，N456E，F512Y。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含一个或多个以下组分：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体。
在一个实施方案中，烟曲霉β-葡糖苷酶(本文SEQ ID NO:29)包含一个或多个选自下组的取代：L89M，G91L，F100D，I140V，I186V，S283G，N456E，和F512Y；如具有以下取代的其变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；或
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在一个实施方案中，纤维素水解酶组合物进一步包含与本文中的SEQ ID NO:31所示的青霉属物种GH61多肽；或包含与本文SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，如100％同一性的氨基酸序列的GH61多肽。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物包含以下组分：
(i)本文SEQ ID NO:32所示的烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)本文SEQ ID NO:33所示的烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)以SEQ ID NO:29所示的且具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D+S283G+N456E+F512Y；和
(iv)本文SEQ ID NO:31所示的青霉属物种GH61多肽。
在一个实施方案中，纤维素分解酶组合物以从0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/g DS，0.001-1mg EP/g DS，更优选从0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS给予(即，在步骤ii)中的糖化和/或步骤iii)中的发酵或SSF期间)。
本发明优选方法的例子
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于从含淀粉的材料生产发酵产品的方法，包含以下步骤：
i)使用以下酶在从高于4.0-6.5之间范围内的pH在从70-100℃范围内的温度液化含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
i)使用以下酶在从高于4.5-6.2之间范围内的pH在初始糊化温度以上的温度液化含淀粉的材料：
-在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2下具有T1/2(min)至少10的α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
i)在从高于4.0-6.5之间范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2下具有T1/2(min)至少10的细菌α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-可选地具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
i)使用下列各项在从高于4.0-6.5之间范围内的pH在高于初始糊化温度的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步具有下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；如与SEQ ID NO:3，4，5，6或7的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性的内切葡聚糖酶。
-可选地源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；
-可选地本文SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
i)使用以下酶在从高于4.0-6.5之间范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步包含下组取代的一个：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，优选与SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性；
-源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌蛋白酶，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；
-可选地本文SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；或
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
i)使用以下酶在从高于4.0-6.5之间的范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步具有下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)。
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，优选与SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性；
-源自激烈火球菌的蛋白酶，其具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；
-SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物在发酵或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。
在一个优选的实施方案中，源自里氏木霉的纤维素酶或纤维素分解酶组合物在发酵或同时糖化和发酵(SSF)期间存在和/或添加。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物和葡糖淀粉酶在发酵或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，特异腐质霉，Chrysosporium lucknowense或斜卧青霉。
本发明的组合物
本发明的组合物包含α-淀粉酶，如热稳定性α-淀粉酶，和具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，可选地蛋白酶，如热稳定性蛋白酶。组合物也可以进一步包含碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，可选地支链淀粉酶和也可选地植酸酶。
因此，在这个方面，本发明涉及组合物，包含：
i)α-淀粉酶；
ii)具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
iii)可选地蛋白酶；
iv)可选地碳水化合物源生成酶。
α-淀粉酶：α-淀粉酶可以是任意α-淀粉酶。在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，如源自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶。
α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶。热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5,85℃,0.12mMCaCl2具有至少10的T1/2(min)，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70之间，如20-70之间，如25-70之间，如30-70之间，如40-70之间，如50-70之间，如60-70之间。
在一个实施方案中，α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，特别是截短为长491个氨基酸，如长480至495个氨基酸，具有选自下组的突变：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)。
应当理解这些α-淀粉酶只是特定的例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶”公开的任意α-淀粉酶可以用作本发明组合物中的α-淀粉酶组分。
内切葡聚糖酶：根据本发明，组合物中的内切葡聚糖酶组分可以是具有70℃以上的熔点(DSC)，如70℃和95℃之间的内切葡聚糖酶，其使用下文小节“材料和方法”中描述的“差异扫描量热法(DSC)测定法”测定。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶具有72℃以上，如74℃以上，如76℃以上，如78℃以上，如80℃以上，如82℃以上，如84℃以上，如86℃以上，如88℃以上，如70℃和95℃之间，如76℃和94℃之间，如78℃和93℃之间，如80℃和92℃之间，如82℃和91℃之间，如84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物中包含的用于本发明的方法中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或者GH5内切葡聚糖酶(见CAZy数据库“www.cazy.org”网页上)。在一个实施方案中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文SEQID NO:3中所示的Talaromyces leycettanus内切葡聚糖酶；本文SEQ ID NO:4中所示的胶囊青霉内切葡聚糖酶，和如本文SEQ ID NO:5中所示的Trichophaea saccata内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施方案中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文SEQ ID NO:7中所示的粪生粪壳菌或本文SEQ IDNO:6中所示的土生梭孢霉内切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性。在一个实施方案中，所述内切葡聚糖酶源自踝节菌属菌株，例如Talaromyces leycettanus菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分经由至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自青霉属菌株，例如胶囊青霉菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性，优选源自Trichophaea菌株，例如Trichophaea saccata菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:6的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自梭孢霉属菌株，如土生梭孢霉菌株。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性，优选源自粪壳菌属菌株，例如粪生粪壳菌菌株。
应当理解这些内切葡聚糖酶只是特定的例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的热稳定性内切葡聚糖酶”公开的任意内切葡聚糖酶可以用作本发明组合物中的内切葡聚糖酶组分。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶与源自Talaromyces leycettanus菌株的具有80℃以上的熔点(DSC)的SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性。
蛋白酶：本发明的组合物可以可选包含蛋白酶，如热稳定性蛋白酶。对于蛋白酶组分的来源没有限制，只要其满足本文定义的热稳定性特性。
在一个实施方案中，蛋白酶是真菌来源。在一个实施方案中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶源自橙色嗜热子囊菌，在本文中以SEQ ID NO:2所示。
在一个优选的实施方案中，蛋白酶是上文提到的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值，如实施例2中所述测定的。
在一个具体的优选实施方案中，蛋白酶是如WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:2的成熟部分的源自橙色嗜热子囊菌的金属蛋白酶的变体，具有选自下组的突变：
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L；和
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在另一个实施方案中，蛋白酶是细菌蛋白酶。在另一个实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白酶源自激烈火球菌菌株，如US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13中所示的。
应当理解这些蛋白酶只是特定的例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的蛋白酶”公开的任意蛋白酶可以用作本发明组合物中的蛋白酶组分。
碳水化合物源生成酶：本发明的组合物可以可选地进一步包含碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，如在85℃，pH 5.3具有至少30％，优选至少35％的热稳定性的热稳定性葡糖淀粉酶。
碳水化合物源生成酶可以是在85℃具有至少20％，至少30％，优选至少35％的相对活性热稳定性的热稳定性葡糖淀粉酶，如实施例4(热稳定性)中所述测定的。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的相对活性pH最佳值的葡糖淀粉酶，如实施例4(pH最佳值)中所述测定的。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少80％，至少85％，优选至少90％的pH稳定性的葡糖淀粉酶，如实施例4(pH稳定性)中所述测定的。
在一个优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，特别是如WO 2011/127802(其在此通过提述并入)中的SEQ ID NO:2公开的来自草酸青霉菌株，或其变体，并示于本文SEQ ID NO:9或14。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶或其变体与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文SEQ ID NO:14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的同一性。
在一个具体且优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是如WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所公开并示于本文的SEQ ID NO:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14所述的成熟序列进行编号)。相对于WO 2013/036526(其在此通过提述并入)中公开的亲本，该K79V葡糖淀粉酶变体具有降低的对蛋白酶降的敏感性。
适合的热稳定草酸青霉葡糖淀粉酶变体的例子列于上文和以下实施例17和18中。
在一个实施方案中，碳水化合物源生成酶，如葡糖淀粉酶，如草酸青霉葡糖淀粉酶，具有支链淀粉酶副活性(side-activity)。
应当理解这些碳水化合物源生成酶，特别是葡糖淀粉酶只是例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶”公开的任意碳水化合物源生成酶可以用作本发明组合物中的组分。
在一个优选的实施方案中，碳水化合物源生成酶是本文SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶或与其具有至少90％同一性且进一步包含K79V取代的序列。
支链淀粉酶：本发明的组合物可以可选地进一步包含支链淀粉酶。支链淀粉酶可以是任意来源的。
在一个实施方案中，支链淀粉酶是细菌来源的。在一个实施方案中，支链淀粉酶源自芽孢杆菌属物种的菌株。
在一个实施方案中，支链淀粉酶是家族GH 57支链淀粉酶。在一个实施方案中，支链淀粉酶包括X47结构域，如WO 2011/087836(其在此通过提述并入)中公开的。
更具体地，支链淀粉酶可以源自热球菌属菌株，包括海岸热球菌和Thermococcushydrothermalis或其杂合体。
支链淀粉酶可以是在位点X4截短的本文SEQ ID NO:11所示的Thermococcushydrothermalis支链淀粉酶，或如WO 2011/087836(其通过提述在此并入)中公开的具有截短位点X4的Thermococcus hydrothermalis/海岸热球菌杂合体酶。
支链淀粉酶的另一个实施方案是包含WO 2011/076123(Novozymes)中公开的X46结构域的支链淀粉酶。
应当理解这些支链淀粉酶只是特定的例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的支链淀粉酶”公开的任意支链淀粉酶可以用作本发明组合物中的可选的支链淀粉酶组分。
植酸酶：本发明的组合物可以可选地进一步包含植酸酶。植酸酶可以是任意来源的。
在一个实施方案中，植酸酶是细菌来源的。在一个实施方案中，植酸酶源自布丘氏菌属菌株，例如Buttiauxella gaviniae，例如WO 2008/092901中的SEQ ID NO:2所示的植酸酶(氨基酸1-33预期为信号肽)；或Buttiauxella agrestis，如WO 2008/092901中的SEQID NO:4所示的植酸酶(氨基酸-9至-1预期为信号肽的一部分)；或Buttiauxellanoackies，如WO 2008/092901中的SEQ ID NO:6所示的植酸酶。
在另一个实施方案中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属菌株，如布氏柠檬酸杆菌菌株，如WO 2006/037328中(在此通过提述并入)SEQ ID NO:2或4公开的。
应当理解这些植酸酶只是特定的例子。上文中在以上小节“液化期间存在和/或添加的植酸酶”公开的任意植酸酶可以用作本发明组合物中的可选支链淀粉酶组分。
在一个优选的实施方案中，植酸酶源自布丘氏菌属菌株。
本发明的组合物的优选实施方案的例子
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-具有70℃以上，如70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-可选地源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶；
-可选地葡糖淀粉酶，例如源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含
-在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，；
-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌，；和
-可选地葡糖淀粉酶，例如，源自草酸青霉。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双重缺失I181+G182和可选地取代N193F；以及可选地进一步具有下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-可选地具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌；和
-可选地SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施方案中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文SEQ ID NO:1)，或其变体是与本文SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性的成熟α-淀粉酶或对应的成熟α-淀粉酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶具有74℃以上，如76℃以上，如78℃以上，如80℃以上，如82℃以上，如84℃以上，如86℃以上，如88℃以上，如70℃和95℃之间，如76℃和94℃之间，如78℃和93℃之间，如80℃和92℃之间，如82℃和91℃之间，如84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:3，4，5，6或7的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，如100％的同一性。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少80％的同一性。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶与具有70℃以上的熔点(DSC)的本文SEQ IDNO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性。
在一个实施方案中，激烈火球菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:13)和/或橙色嗜热子囊菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:2)或其变体是分别与本文的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟蛋白酶，或对应的成熟蛋白酶。
在实施方案1中，草酸青霉葡糖淀粉酶(本文SEQ ID NO:14)，或其变体，是与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟葡糖淀粉酶，或对应的成熟葡糖淀粉酶。
本发明的进一步方面
在本发明的进一步方面，其涉及本发明的组合物用于液化含淀粉的材料的用途。
在本发明的最后一个方面，涉及产生液化的淀粉的方法，包含使用本发明的组合物液化含淀粉的材料。
来自胶囊青霉(本文SEQ ID NO:4)和Trichophaea saccata(本文SEQ ID NO:5)的具有内切葡聚糖酶活性的多肽
在这一方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，选自下组：
(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。
在一个实施方案中，多肽包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的成熟多肽。在另一个实施方案中，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸19至334。
在另一个实施方案中，组合物包含本发明的多肽。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明涉及核酸构建体或表达载体，其包含可操作连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，所述控制序列指导多肽在表达宿主中的产生。本发明还涉及重组宿主细胞其，包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽的产生。此外，本发明涉及产生本发明的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞在其野生型的形式中产生所述多肽；和
(b)回收所述多肽。
本发明还涉及产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养权利要求7的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物，植物部分或植物细胞，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明涉及产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养权利要求10的转基因植物或植物细胞；和
(b)回收所述多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及产生蛋白的方法，包含：
(a)在有益于所述蛋白产生的条件下培养重组宿主细胞，其包含可操作连接到本发明的多核苷酸的编码蛋白的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和
(b)回收所述多肽。
本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，包含在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物处理所述纤维素材料。
在一个实施方案中，本发明涉及用于生产发酵产品，如乙醇的方法，包含：
(a)在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)使用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产品；和
(c)从发酵回收发酵产品。
在一个实施方案中，本发明涉及发酵纤维素材料的方法，包括：使用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化的。在一个实施方案中，所述纤维素材料的发酵产生发酵产品，如乙醇。
在这一方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，选自下组：
(a)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少940％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。
在一个实施方案中，多肽包含或组成为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的成熟多肽。成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸21至394。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明涉及核酸构建体或表达载体，其包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。
在一个实施方案中，本发明涉及重组宿主细胞，其包含可操作地连接到一个或多个控制序列的权利要求5的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽的产生。
在一个实施方案中，本发明涉及产生本发明的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，该细胞在其野生型的形式中产生所述多肽；和
(b)回收所述多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养本发明的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
在一个方面，本发明还涉及转基因植物，植物部分或植物细胞，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸。
在一个方面，本发明涉及产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养所述转基因植物或植物细胞；和
(b)回收所述多肽。
本发明还涉及产生蛋白的方法，包含：
(a)在有益于所述蛋白产生的条件下培养重组宿主细胞，其包含可操作地连接到本发明的多核苷酸的编码蛋白的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和
(b)回收所述多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及用于降解纤维素材料的方法，包含：在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物处理所述纤维素材料。
在本发明中，还涉及用于生产发酵产品，如乙醇的方法，包含：
(a)在权利要求1-3中任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)使用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产品；和
(c)从发酵回收所述发酵产品。
在一个实施方案中，本发明涉及发酵纤维素材料的方法，包含：使用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化的。
最后，本发明涉及方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产品。
材料和方法
材料：
α-淀粉酶369(AA369)：截短至491个氨基酸的具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(本文SEQ IDNO:1)。
内切葡聚糖酶TL(EG TL)：在WO 2013/019780中作为SEQ ID NO:2和本文SEQ IDNO:3公开的来自Talaromyces leycettanus的内切葡聚糖酶GH5(P23YSQ)。
内切葡聚糖酶PC(EG PC)：如本文SEQ ID NO:4公开的来自胶囊青霉的葡聚糖内切酶GH5(P244HZ)。
内切葡聚糖酶TS(EG TS)：如本文SEQ ID NO:5公开的来自Trichophaea saccata的内切葡聚糖酶GH5(P2PJ)。
内切葡聚糖酶TT(EG TT)：本文SEQ ID NO:6中公开的来自土生梭孢霉的内切葡聚糖酶GH45(P24PYU)。
内切葡聚糖酶SF(EG SF)：共同未决申请PCT/CN2012/080220中作为SEQ ID NO:2和本文SEQ ID NO:7公开的来自粪生粪壳菌的内切葡聚糖酶GH45(P2CF)。
蛋白酶196：(JTP196)如本文SEQ ID NO:2的氨基酸1-177和WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2中的氨基酸1-177公开的源自橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶，具有以下突变：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
蛋白酶Pfu：购自Takara Bio(日本)作为Pfu蛋白酶S(活性10.5mg/mL)并也示于本文SEQ ID NO:13中的源自激烈火球菌的蛋白酶。
葡糖淀粉酶PO:如WO 2011/127802中SEQ ID NO:2公开并示于本文SEQ ID NO:9中的草酸青霉葡糖淀粉酶的成熟部分。
葡糖淀粉酶PE001:具有K79V取代的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号。
葡糖淀粉酶AC：包含WO99/28448中公开的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶，WO06/69289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)葡糖淀粉酶，和WO 2006/069290中表5中作为V039公开的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD作为副活性的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)葡糖淀粉酶的混合物；以及纤维素分解酶组合物，其包含源自爱默生青霉菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2)，WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/044915中的SEQ ID NO:2)变体F100D，S283G，N456E，F512Y；WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:6公开的烟曲霉Cel7ACBH1；和WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:18公开的烟曲霉CBH II。
酵母：可从Red Star/Lesaffre,USA获得的RED STAR ETHANOL REDTM。
方法
通过差异扫描量热法对内切葡聚糖酶测定Td
通过差异筛选热量法(DSC)使用VP-毛细管差异筛选热量计(MicroCal Inc.,Piscataway,NJ,USA)确定了酶的热稳定性。热变性温度，Td(℃)理解为在以恒定编程加热速率200K/hr在缓冲液(50mM乙酸盐，pH 5.0)中加热酶溶液(约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中变性峰(主吸热峰)的顶点。
将样品和参考溶液(约0.2ml)从10℃的储存环境装载到热量计中(参照：没有酶的缓冲液)并在从20℃至120℃的DSC筛选前在20℃热预平衡20分钟。以大约+/-1℃的精确度确定变性温度。
同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”描述。
对于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度，以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，可通过程序“比对”确定，其为Needleman-Wunsch比对(即全局比对)。使用该程序以比对多肽以及核苷酸序列。使用缺省的评分矩阵BLOSUM50以供多肽比对，并使用缺省的同一性矩阵以供核苷酸比对。对于缺口的第一个残基的罚分对于多肽是-12，而对于核苷酸是-16。缺口的进一步的残基的罚分对于多肽是-2，而对于核苷酸是-4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS 85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)"Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA,"Methods in Enzymology 183:63-98)。FASTA蛋白比对使用Smith-Waterman算法，对缺口大小无限制(参见“Smith-Waterman算法”，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。
蛋白酶测定
AZCL-酪蛋白测定法
将0.2％蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液在搅拌的情况下悬浮于硼砂(Borax)/NaH2PO4缓冲液pH 9中。在搅拌的情况下将溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器(Thermomixer)中在45℃和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100℃煮沸20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4℃以3000rpm离心5分钟来将有色溶液与固体分开。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测量在595nm的吸光度。
pNA测定法
将50μL含蛋白酶的样品添加至微滴定板，并通过添加100μL 1mM pNA底物(5mg溶于100μL DMSO，并进一步用硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9.0稀释至10mL)来起始所述测定法。监测OD405在室温的增加作为蛋白酶活性的测量。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以用葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量。
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性与β-D-葡萄糖在上述提及的反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处确定作为起始葡萄糖浓度的量度。
| AMG温育： | |
| 底物： | 麦芽糖23.2mM |
| 缓冲液： | 乙酸盐0.1M |
| pH： | 4.30±0.05 |
| 温育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 酶工作范围： | 0.5-4.0AGU/mL |
| 颜色反应： | |
| GlucDH： | 430U/L |
| 变旋酶： | 9U/L |
| NAD： | 0.21mM |
| 缓冲液： | 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl |
| pH： | 7.60±0.05 |
| 温育温度 | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 波长： | 340nm |
更详细描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据请求从NovozymesA/S,Denmark可获得，该文件夹通过提述并入本文。
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue color)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其与有色玻璃标准进行比较。
一个Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质Merck Amylum Solubile溶质(solubile)的酶量。
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01在请求Novozymes A/S,Denmark后可获得，该文件夹通过提述并入本文。
α-淀粉酶活性(KNU-A)
关于确定KNU-A活性的文件夹EB-SM-5091.02-D在请求Novozymes A/S,Denmark后可获得，该文件夹通过提述并入本文。
α-淀粉酶活性KNU(S)
样品中的BS-淀粉酶和试剂盒中的酶α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G7)-对-硝基苯基(G1)-α-D-麦芽七糖苷(亚乙基-G7PNP))转化为葡萄糖和黄色的对-硝基酚。
可以通过Konelab 30观察对-硝基酚形成的速率。这是反应速率和由此酶活性的表示。
反应条件
反应:
pH:7.15
温度:37℃
反应时间:180sec
检测
波长:405nm
测量时间:120sec
单位定义
相对于声明强度的酶标准品，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(BS-淀粉酶)活性以KNU(S)，Kilo Novo单位(嗜热脂肪)测量。
更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0221.02(通过提述并入)在请求后从Novozymes A/S,Denmark可获得。
FAU活性的确定
一个真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为基于以下标准条件每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6,Batch 9947275)的酶量：
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的确定
酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)来测量，其相对于酶标准品确定。
使用的标准品是AMG 300L(来自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，也公开于Boel et al.(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)和WO 92/00381)。在室温储存3周后，该AMG中的中性α-淀粉酶从约1FAU/mL下降为0.05FAU/mL以下。
该AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性依照以下描述确定。在本方法中，1个AFAU定义为在标准条件下每小时分解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉而不与降解产物形成蓝色复合物。因此，颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将淀粉酶活性确定为特定分析条件下淀粉浓度的减少。
蓝色/紫色 t＝23sec.去色
标准条件/反应条件:(每分钟)
| 底物: | 淀粉，约0.17g/L |
| 缓冲液: | 柠檬酸盐，约0.03M |
| 碘(I2): | 0.03g/L |
| CaCl2: | 1.85mM |
| pH: | 2.50±0.05 |
| 孵育温度: | 40℃ |
| 反应时间: | 23秒 |
| 波长: | lambda＝590nm |
| 酶浓度: | 0.025AFAU/mL |
| 酶工作范围: | 0.01-0.04AFAU/mL |
如果优选进一步的细节，那么这些可以参见文件夹EB-SM-0259.02/01，其在请求后从Novozymes A/S,Denmark可获得，并通过提述并入。
支链淀粉酶活性(NPUN)的测定
以NPUN计的内切支链淀粉酶(endo-pullulanase)活性相对于Novozymes支链淀粉酶标准品测量。1个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(pullulan)(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。该活性使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量。
将1mL稀释的样品或标准品在40℃温育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰，0.5MKCl，50mM柠檬酸pH 5，并混合。将管在40℃温育20分钟，并通过添加2.5ml 80％乙醇来停止。将管于室温保持竖立10至60分钟，接着以4000rpm离心10分钟。然后在510nm测量上清液的OD，并使用标准曲线计算活性。
实施例
实施例1
α-淀粉酶变体的稳定性
参照α-淀粉酶(截短至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:1用于编号))和其α-淀粉酶变体的稳定性如下确定：通过将参照α-淀粉酶和变体在pH 4.5和5.5和温度75℃和85℃与0.12mM CaCl2孵育，接着使用底物(Ultra Amylase测定试剂盒，E33651，Molecular Probes)确定残留活性。
在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐,0.01％Triton X100,0.12mM CaCl2,pH5.0)中将纯化的酶样品稀释到工作浓度0.5和1或5和10ppm(微克/ml)。将20微升酶样品转移到48孔PCRMTP，并将180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐,150mM MES,0.01％Triton X100,0.12mMCaCl2,pH 4.5或5.5)添加到每个孔并混合。使用两种浓度的酶以两个重复进行该测定。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并在冰上储存作为对照。在PCR仪中以75℃和85℃进行孵育。孵育后，在残留活性缓冲液(100mM乙酸盐,0.01％Triton X100,0.12mM CaCl2,pH 5.5)中将样品稀释到15ng/ml，并将25微升稀释的酶转移到黑色的384-MTP。使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/ml)添加到每个孔确定残留活性。使用485-P nm激发滤光器和555nm发射滤光器每分钟确定荧光达15分钟(荧光读取器是Polarstar,BMG)。对于每个设置，残留活性相对于对照样品标准化。
假设使用以下公式计算对数衰减半衰期(T1/2(min))：T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T是以分钟计的测定孵育时间，而％RA是测定法中测定的％残留活性。
使用该测定设置，测定了参照α-淀粉酶及其变体的半衰期，如表1所示。
表1
ND未测定
该结果证明了α-淀粉酶变体比参照α-淀粉酶具有显著更大的半衰期和稳定性。
实施例2
制备蛋白酶变体和测试热稳定性
菌株和质粒
大肠杆菌DH12S(从Gibco BRL可获得)用于酵母质粒挽救(rescue)。pJTP000是在TPI启动子控制下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，从WO 01/92502中所述的pJC039构建，其中已经插入了橙色嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03048353)。
酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his4-539用于蛋白酶变体表达。它描述于J.Biol.Chem.272(15),pp 9720-9727,1997中。
培养基和底物
10X基础溶液：不含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/L，琥珀酸盐100g/l，NaOH60g/l。
SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即2％的最终浓度＝2g/100mL)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸(casamino acid)25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用0.20微米孔径的过滤器灭菌溶液。琼脂(2％)和H2O(约761mL)一起高压灭菌，并将分别灭菌的SC-葡萄糖溶液添加至琼脂溶液。
YPD：细菌用蛋白胨(Bacto peptone)20g/l，酵母提取物10g/L，20％葡萄糖100mL/L。
YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。
20 PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1mL。
96孔玉米醇溶蛋白微滴定板
每孔含有20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的200微升0.05-0.1％玉米醇溶蛋白(Sigma)，0.25mM ZnSO4和1％的琼脂。
DNA操作
除非另行声明，DNA操作和转化使用如Sambrook等(1989)Molecular cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等(编)"Current protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995；30Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编)中所述的分子生物学的标准方法进行。
酵母转化
使用乙酸锂方法进行酵母转化：将0.5微升载体(通过限制性内切核酸酶消化)和1微升的PCR片段混合。将DNA混合物，100微升的YNG318感受态细胞，和10微升的YEAST MAKER载体DNA(Clontech)添加至12mL聚丙烯管(Falcon2059)。添加0.6mL PEG/LiAc溶液并轻柔地混合。在30℃和200rpm温育30分钟，并在42℃温育30分钟(热休克)。转移至eppendorf管并离心5秒。移除上清，并溶解于3mL的YPD。将细胞悬液在30℃在200rpm温育45分钟。将悬液倾至SC葡萄糖平板，并在30℃温育3日以生长菌落。通过Zymoprep Yeast PlasmidMiniprep Kit(ZYMO Research)提取酵母总DNA。
DNA测序
用于DNA测序的大肠杆菌转化通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行。DNA质粒通过碱方法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或用质粒试剂盒制备。DNA片段从琼脂糖凝胶通过Qiagen凝胶提取试剂盒回收。PCR使用PTC-200DNA Engine进行。将ABI PRISMTM 310Genetic Analyzer用于确定所有的DNA序列。
蛋白酶表达载体的构建
用引物对Prot F(本文中的SEQ ID NO:15)和Prot R(本文中的SEQ ID NO:16)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得的PCR片段与用限制性酶消化以除去特异腐质霉角质酶(cutinase)基因的pJC039载体(描述于WO 2001/92502)一同导入酿酒酵母YNG318。
将SC-葡萄糖平板上的酵母克隆中的质粒回收以确认内部序列，并将其命名为pJTP001。
酵母文库和定点变体的构建
通过SOE PCR方法(通过重叠延伸的剪接，参见“PCR:A practical approach”,p.207-209,Oxford University press,编者McPherson,Quirke,Taylor)，接着进行酵母体内重组来构建酵母中的文库和定点变体。
用于扩增和测序的通用引物
使用引物AM34(本文中的SEQ ID NO:17)和AM35(本文中的SEQ ID NO:18)与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一同通过SOE方法制备含有任何突变片段的DNA片段或仅扩增全蛋白酶基因(AM34+AM35)。
通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化物混合。将混合的溶液导入酿酒酵母以通过体内重组构建文库或定点变体。
相对活性测定法
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至含有YPD+Zn培养基的96孔微滴定板的孔，并在28℃培养3日。将培养上清液施于96孔玉米醇溶蛋白微滴定板，并在至少2个温度(例如60℃和65℃，70℃和75℃，70℃和80℃)温育超过4小时或过夜。在平板中玉米醇溶蛋白的浊度作为A630测量，而相对活性(较高温度/较低温度)作为热活性改善的指标确定。选择具有与亲本变体相比更高相对活性的克隆并测定序列。
残余活性测定法
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至96孔微滴定板的孔中，并在28℃培养3日。在将培养上清液在某个温度(80℃或84℃，以4℃作为参照)在20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5温育10分钟之后，在65℃使用偶氮酪蛋白(azo-casein)(Megazyme)测量蛋白酶活性，以测定残余活性。选择与亲本变体相比具有更高残余活性的克隆，并确定序列。
偶氮酪蛋白测定法
将20微升的样品与150微升的底物溶液(96mL 20mM乙酸钠pH 4.5中的乙醇中的4mL 12.5％偶氮酪蛋白，含有0.01％triton-100和0.25mM ZnSO4)混合，并温育4小时或更长。
在添加20微升/孔100％三氯乙酸(TCA)溶液之后，离心平板，并移取100微升上清液以测量A440。
在米曲霉中表达蛋白酶变体
将包含蛋白酶变体基因的构建体用于构建供曲霉属用的表达载体。曲霉属表达载体由融合于构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)的基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的表达盒组成。在质粒上还存在来自构巢曲霉的曲霉属选择性标志物amdS，其使得能够以乙酰胺作为唯一氮源进行生长。将用于蛋白酶变体的表达质粒如Lassen等(2001),Appl.Environ.Microbiol.67,4701-4707中所述转化入曲霉属。对于每个构建体，分离了10至20个菌株，将其纯化并培养于摇瓶。
表达的变体的纯化
1.将0.22μm过滤的发酵样品的pH调整为4.0。
2.将样品置于具有磁力搅拌的冰浴上。添加小量等分试样的(NH4)2SO4(对应于大约2.0至2.2M(NH4)2SO4，在添加化合物时不考虑体积增加)。
3.在(NH4)2SO4最后一次添加之后，将样品在冰浴上以轻柔的磁力搅拌温育最少45分钟。
4.离心：配有R20A2转子头的Hitachi himac CR20G High-Speed RefrigeratedCentrifuge，5℃，20000rpm，30分钟。
5.将形成的沉淀物溶解于200mL 50mM乙酸钠pH 4.0。
6.通过使用0.22μm PES PLUS膜(IWAKI)的真空吸力过滤样品。
7.使用在冷室中超滤(来自Vivascience的Vivacell 250，配置有5kDa MWCO PES膜)过夜将样品脱盐/缓冲液交换至50mM乙酸钠pH 4.0。使用50mM乙酸钠pH 4.0将渗余物(retentate)样品稀释至200ml。样品的电导率优选低于5mS/cm。
8.将样品加载于用50mM乙酸钠pH 4.0平衡的阳离子交换柱。使用3个柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合的样品从柱中洗出，并使用线性梯度0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0)以10个柱体积将样品洗脱。
9.将收集的级分通过内切蛋白酶测定法(参见下文)，接着对选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)测定。基于内切蛋白酶测定法和SDS-PAGE汇集级分。
内切蛋白酶测定法
1.将Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠pH 5.0通过磁力搅拌溶解(底物：来自Megazyme的内切蛋白酶Protazyme AK片–cat.#PRAK 11/08)。
2.在搅拌下，将250微升的底物溶液转移至1.5mL Eppendorf管。
3.将25微升的样品添加至每个管(空白为样品缓冲液)。
4.将管在Thermomixer上在50℃振荡(1000rpm)温育15分钟。
5.将250微升的1M NaOH添加至每个管，接着进行涡旋振荡。
6.在16,000x G和25℃离心3分钟。
7.将200微升的上清转移至MTP，并记录在590nm的吸光度。
结果
实施例3
使用纯化的酶得到的选择的变体的温度概况
纯化显示良好热稳定性的选择的变体，并将纯化的酶用于如下所述的玉米醇溶蛋白-BCA测定法。在如指定的升高的温度下将酶温育60分钟之后在60℃确定残余的蛋白酶活性。
玉米醇溶蛋白-BCA测定法：
进行玉米醇溶蛋白-BCA测定以检测在各个温度由变体蛋白酶从玉米醇溶蛋白释放的可溶性蛋白量化。
方案：
1)将10微升的10微克/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米醇溶蛋白溶液在微滴定板(MTP)中混合。
2)在各个温度温育60分钟。
3)添加10微升的100％三氯乙酸(TCA)溶液。
4)将MTP在3500rpm离心5分钟。
5)取出15微升至新的含有100微升BCA测定溶液(Pierce Cat#:23225,BCAProtein Assay Kit)的MTP。
6)在60℃温育30分钟。
7)测量A562。
结果示于表7。与wt蛋白酶相比，所有测试的变体显示改善的热稳定性。
表7：玉米醇溶蛋白-BCA测定法
实施例4
草酸青霉葡糖淀粉酶的表征
草酸青霉葡糖淀粉酶公开于本文中的SEQ ID NO:9和14(成熟)。
底物。底物：去离子水中的1％可溶性淀粉(Sigma S-9765)
反应缓冲液：0.1M乙酸盐缓冲液于pH 5.3
葡萄糖浓度确定试剂盒：Wako葡萄糖测定试剂盒(LabAssay glucose,WAKO,Cat#298-65701)。
反应条件：将20微升可溶性淀粉和50微升乙酸盐缓冲液pH 5.3混合，将30微升酶溶液(50微克酶蛋白/ml)添加至100微升的终体积，接着在37℃温育15分钟。
葡萄糖浓度通过Wako试剂盒确定。
所有工作平行进行。
温度最佳值：为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的温度最佳值，将如上所述的“反应条件”测定法在20，30，40，50，60，70，80，85，90和95℃进行，结果示于表8。
表8：温度最佳值
根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下的温度最佳值是50至70℃之间，而葡糖淀粉酶在95℃保持超过80％活性。
热稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件测定法进行修改，其中将酶溶液和乙酸盐缓冲液在20，30，40，50，60，70，75，80，85，90和95℃预温育15分钟。在温育之后，将20微升的淀粉添加至溶液，并如上所述进行测定法。
结果示于表9。
表9：热稳定性
根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育15分钟之后在高至70℃时仍稳定，因为其保持超过80％活性。
pH最佳值。为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的pH最佳值，将如上所述的反应条件测定法在2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0 7.0，8.0，9.0，10.0和11.0进行。替换使用反应条件测定法中描述的乙酸盐缓冲液，使用下述缓冲液：100mM琥珀酸，HEPES，CHES，CAPSO，1mMCaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0 7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。
结果示于表10。
表10：pH最佳值
根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下在pH 5.0具有最高活性。草酸青霉葡糖淀粉酶在广泛的pH范围具有活性，因为其在pH 2至7保持超过50％活性。
pH稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定法修改为将酶溶液(50微克/mL)在使用在pH最佳值下描述的缓冲液在具有pH 2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0的缓冲液中预温育20小时。在预温育之后，将20微升可溶性淀粉添加至溶液中，至100微升的最终体积，并如上所述进行测定法。
结果示于表11。
表11：pH稳定性
根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育20小时之后，在pH 3至pH7稳定，且其在pH 8减少其活性。
实施例5
蛋白酶Pfu的热稳定性
使用与实施例2中相同的方法测试了购自Takara Bio Inc,(Japan)的激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性。发现了在pH 4.5热稳定性(相对活性)为110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。
实施例6
克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因
制备草酸青霉菌株cDNA
通过遵循3’Rapid Amplifiction of cDNA End System(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)的说明合成cDNA。
克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因
使用以下所示的寡核苷酸引物克隆草酸青霉葡糖淀粉酶基因，所述引物设计为从5’末端扩增葡糖淀粉酶基因。
有义引物：5’-ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’(SEQ ID NO:19)
通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)，通过使用有义引物和AUAP(由3’Rapid Amplifiction of cDNA End System提供)的PCR扩增全长基因。该扩增反应由5μl的10x PCR缓冲液，2μl的25mM MgCl2，1μl的10uM有义引物，1μl的10uM AUAP，2μl的第一链cDNA,0.5μl的HIFI Taq和37.5μl的去离子水组成。PCR程序为：94℃,3mins；10个循环：94℃ 40secs,60℃ 40secs，其中每个循环减少1℃,68℃2min；25个循环：94℃ 40secs,50℃ 40secs,68℃ 2min；在68℃最终延伸10mins。
使用pGEM-T载体系统(Promega Corporation,Madison,WI,USA)将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体(Promega Corporation,Madison,WI,USA)中以生成质粒AMG 1。插入质粒AMG 1中的葡糖淀粉酶基因测序确认。含有质粒AMG 1的大肠杆菌TOP10菌株(命名为NN059173)于2009年11月23日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，并分配了保藏号DSM 23123。
实施例7
克隆的草酸青霉葡糖淀粉酶的表达
通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因从质粒AMG 1重新克隆到曲霉表达载体中，所述克隆引物是基于已知的序列设计并且添加标签以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:20)
引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:21)
用质粒AMG 1来进行PCR反应以便扩增全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG1DNA、1μl的每种引物(100μM)、12.5μl的2X Extensor Hi-Fidelity主混合物(ExtensorHi-Fidelity Master Mix,ABgene,United Kingdom)、以及9.5μl的PCR级水组成。使用DYADPCR仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃下持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的25次循环；并且然后在72℃下10分钟。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳使用1xTAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切出并根据制造商的说明使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE Healthcare,United Kingdom)进行纯化。根据制造商的说明，使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)将与草酸青霉葡糖淀粉酶基因对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉表达载体中。线性化的载体构建是如WO2005/042735 A1所述的。
将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的Fusion Blue大肠杆菌细胞(包含在IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒中)。在42℃下热休克45秒并在冰上冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含50μg氨苄西林(ampicillin)的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用微型JETSTAR(德国Genomed公司)纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序(Sanger sequencing)来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。
如WO 95/02043所述，制备黑曲霉MBin118的原生质体。将100μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒混合，并且添加250微升的60％PEG4000(Applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔点琼脂糖(Biowhittaker Molecular Applications)相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)板上以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑出16个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，即Griton XT Precast凝胶(伯乐公司(BioRad)，美国加利福尼亚州)上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其作为孢子保存在20％甘油贮备物中并冷冻保存(-80℃)。
培养：在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃下在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃下培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。
α-环糊精亲和凝胶。使10克经Epoxy活化的Sepharose 6B(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,U.K)粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶联溶液(100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH)并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH 10的100ml 1M乙醇胺中，并在50℃下孵育4小时以进行封闭。随后使用pH 8的50mM Tris-HCl和可替代地pH 4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液(50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)将该凝胶装填在35-40ml的柱中。
从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并应用在之前在50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现单一带。
实施例8
草酸青霉葡糖淀粉酶的定点变体(PE001)的构建和表达
用实施例9所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79V F和K79V R(这些引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸K取代为缬氨酸(varin)V)以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940(这两个引物基于已知的序列设计并且添加标签以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆)进行两个PCR反应。
引物K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC(SEQ ID NO:22)
引物K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG(SEQ ID NO:23)
引物F-NP003940：
5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:24)
引物R-NP003940：
5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:25)
在以下所述的条件下使用PTC-200DNA Engine进行PCR。
根据制造商的说明通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用N-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。线性化的载体构建是如WO2005/042735A1所述的。
使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(TOYOBO)。在每ml补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用Qiagen质粒微型试剂盒(Qiagen)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择质粒之一来用于进一步表达并且将其命名为pPoPE001。
如WO 95/02043所述，制备黑曲霉MBin118的原生质体。将100μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG4000(Applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta 133:51-56)中将原生质体与1％的琼脂糖L(Nippon Gene)相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑出16个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。
实施例9
定点Po AMG变体PE001的纯化
将所选择的变体转化株和表达实施例8中所述的野生型草酸青霉葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2％麦芽糖培养基中，并且培养物通过0.22μm PES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后，相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。
实施例10
PE001蛋白酶稳定性的表征
将40μl在50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的酶溶液(1mg/ml)与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液(如在Biochem J.1975Apr；147(1):45-53中所述的aspergillopepsin I、或从Sigma可商购的产品以及在Biochemical journal[0264-6021]Ichishima,2003,371(2):541中所述的aorsin)相混合，并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H2O而不是蛋白酶添加到样品。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。
在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kCa的更低分子大小的一条带。
表12 蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果
N.D.：未检测到。
实施例11
培养过程中更少切割
在32℃下将变体(PE001)和野生型草酸青霉葡糖淀粉酶的曲霉菌转化株在含有4X稀释的、补充有10mM乙酸钠缓冲液的YP-2％麦芽糖培养基(pH 4.5)的6孔MT板中培养1周。
将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。
表13 培养物上清液的SDS-PAGE结果
N.D.：未检测到。
在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完整的分子。
实施例12
变体PE001与亲本相比的葡糖淀粉酶活性
针对野生型草酸青霉的纯化酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述以AGU的葡糖淀粉酶活性测量。
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
表14
| 相对比活性 | AGU/mg |
| 草酸青霉菌wt | 100％ |
| 草酸青霉菌PE001 | 102％ |
实施例13
具有增加的热稳定性的麦芽糖酶变体的纯化
可以类似于实施例8中描述的程序构建并表达显示出增加的热稳定性的变体。所有变体都衍生自PE001。在YPM培养基中表达以后，将包含T65A或Q327F(SEQ ID NO:14编号)取代的变体如下进行微纯化：
可以通过经由0.22μm过滤器过滤除去菌丝体。向滤板(Whatman，Unifilter 800μl，25-30μm MBPP)的孔中添加50μl柱材料(根据制造商的推荐，与Mini-Leak二乙烯砜(divinylsulfone)-活化的琼脂糖培养基偶联的α-环糊精)。通过两次添加200μl缓冲液用结合缓冲液(200mM乙酸钠，pH 4.5)平衡该柱材料，剧烈震荡10min(Heidolph，Titramax101，1000rpm)并且通过真空除去缓冲液(Whatman，UniVac 3)。随后，添加400μl培养上清液和100μl结合缓冲液，并且在剧烈振荡下将板孵育30min。通过真空除去未结合的材料并且重复结合步骤。通常，每个变体使用4个孔。然后，通过添加200μl具有减少的离子强度的缓冲液(50/10/5mM乙酸钠，pH 4.5)，振荡15min并且通过真空除去缓冲液进行三个洗涤步骤。通过两次添加100μl洗脱缓冲液(250mM乙酸钠，0.1％α-环糊精，pH 6.0)，振荡15min并且通过真空在微量滴定板中收集洗脱材料实现结合的AMG的洗脱。将合并的洗脱物浓缩并且使用具有10kDa截留的离心过滤单元(Millipore Microcon Ultracel YM-10)将缓冲液变为50mM乙酸钠，pH 4.5。将微纯化的样品保存在-18℃下直到热稳定性测试。
实施例14
蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定法(Thermal shift assay))
使用Sypro Orange(In-vitrogen，S-6650)监测T65A和Q327F变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(Applied Biosystems；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在一个96孔板中，将25微升微纯化的、处于约100微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与Sypro Orange相混合(5:1)(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR封条(optical PCR seal)将板密封。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用Sypro Orange(In-vitrogen，S-6650)监测E501V+Y504T变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(Applied Biosystems；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在一个96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖(Acarbose)(Sigma A8980)的情况下，将15微升纯化的、处于约50微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与SyproOrange相混合(1:1)(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR封条将板密封。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。
将Tm值计算为第一衍生物的最大值(dF/dK)(参考：Gregory et al.,2009,J.Biomol.Screen.14:700)。
表15a.
表15b.
实施例15
通过差异扫描量热法(DSC)分析热稳定性
基本如在实施例8中所描述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的其它位点特异性变体并且如在实施例9中所描述进行纯化。
使用VP-毛细管差示扫描量热器(MicroCal Inc.,Piscataway,NJ,USA)，通过差异扫描量热法(DSC)在pH 4.0或4.8处(50mM乙酸钠)测定纯化的Po-AMG PE001衍生的变体的热稳定性。在以200K/hr的恒定程序化加热速率下，在选择的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.0或4.8)中加热酶溶液后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要吸热峰)的顶端。
将样品溶液和参照溶液(约0.3ml)装载到来自10℃的保存条件的热量计中(参照：没有酶的缓冲液)，并且在从20℃至110℃的DSC扫描以前，于20℃用热方法预平衡10分钟。以约+/-1℃的精确度测定变性温度。
分离的变体以及DSC数据披露于下表16中。
表16.
实施例16
通过热应激测试和pNPG测定法分析热稳定性
从来自实施例10的经鉴别的取代变体之一(被鉴别为PE008)开始，通过热应激测定法测试其它变体，其中在83℃下热休克5min后，测定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶(AMG)活性。
在热休克以后，也在非应激样品中测量变体的残余活性。
Po-AMG pNPG活性测定法的说明：
草酸青霉葡糖淀粉酶pNPG活性测定法是一种分光光度测定端点测定法(spectrometric endpoint assay)，其中将样品一分为二并且以热应激和非热应激测量。因此，数据输出是应激样品中的残余活性的量度。
生长：
向无菌微量滴定板(MTP)的每个孔中添加200μL丰富生长培养基(rich growthmedia)(没有Dowfax的FT X-14)。将感兴趣的菌株从冻存原液(stock)一式三份直接接种至MTP。在20个孔中接种基准点(benchmark)。将具有培养基的未接种的孔用作测定空白。将MTP放在包含湿组织的塑料箱中，以阻止孵育过程中自孔的蒸发。将塑料箱在34℃下放置4天。
测定法：
将50μL上清液转移至50μL 0.5M NaAc(pH 4.8)中，以获得准确的样品pH。
将50μL稀释物转移至PCR板上并且在PCR仪中在83℃下热应激5分钟。将剩余一半的稀释物保持在室温下。
将20μL的应激样品和非应激样品两者转移至标准MTP中。添加20μL pNPG-底物，以起始该反应。将该板在室温下孵育1h。
终止该反应并且通过添加50μL 0.5M Na2CO3进行显色。在405nm处，在读板仪(Molecular Devices)上测量黄色。
缓冲液：
0.5M NaAc pH 4.8
0.25M NaAc pH 4.8
底物，6mM pNPG：
10mL 0.25 NaAc(pH 4.8)中的15mg 4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylD-glucopyranoside)
终止/显色溶液：
0.5M Na2CO3
数据处理：
在Excel中，来自应激和非应激样品两者的原始Abs405数据是用其对应的空白进行空白消除。计算残余活性(％残余活性＝(Abs非应激-(Abs非应激-Abs应激))/Abs非应激*100％)并且相对于基准点Po-amg0008绘图。
表17
表18
实施例17
根据本发明的热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性测试
已经使用在实施例16中描述的pNPG测定法证实了在表16、17、和18中披露的所有以上描述的变体在培养上清液上的葡糖淀粉酶活性。
实施例18
通过差异扫描量热法(DSC)测定内切-β-葡聚糖酶(EG)的热稳定性
如“材料和方法”小节“通过差异扫描量热法对内切葡聚糖酶测定Td”中所述测试EG的热稳定性。
实施例19
在玉米液化中添加热稳定性内切-β-葡聚糖酶(EG)
所有处理通过25g小规模液化评价。从工业玉米乙醇工厂获得的玉米粉(cornflour)和酒糟水(thin stillage)用于本实验。玉米粉的干固体(DS)为85.62％而酒糟水的DS为8.08％，两者都是通过Mettler-Toledo HB43卤素水分平衡测定的。对于液化，将7.9g玉米粉，7.5g酒糟水，和9.6g自来水添加以在具有螺纹盖和橡胶密封的Nalgene 30mL聚碳酸酯管中达到29.5％DS和25g的质量。发现在不调节的情况下玉米浆的pH为约5.1。接着将含有玉米浆的管放置到Boekel杂交炉中，其中将旋转架设定为60±1℃以在酶添加前加热；将旋转设定为20rpm。使用的α-淀粉酶(AA)为BE369。除了仅AA的对照外，评价了五种热稳定性EG，如表19所示。在预加热20-30分钟后，将管取出并以适当量的稀释酶给予，如下面的表20所示。每个液化处理重复测试。实际的酶剂量假定每个管中糊状物(mash)的恒定体积；所有添加后且液化前的玉米浆的最终DS为28.2％。酶添加后，将管彻底振荡并返回加热到75±1℃的Boekel杂交炉，持续两小时十分钟；将架旋转设定为20rpm。在75±1℃的期望时间是两小时，额外的十分钟是为了允许玉米浆的温度平衡。
表19：EG来源，家族和序列ID列表
| EG的来源 | 家族 | 序列ID |
| 粪生粪壳菌 | GH45 | (SEQ ID NO:7) |
| 土生梭孢霉 | GH45 | (SEQ ID NO:6) |
| Talaromyces leycettanus | GH5 | (SEQ ID NO:3) |
| 胶囊青霉 | GH5 | (SEQ ID NO:4) |
| Trichophaea saccata | GH5 | (SEQ ID NO:5) |
表20：液化中的酶剂量
两小时液化后，将管从炉取出并浸没在凉水中并周期性摇动约15分钟，直到管冷却到触摸。将内部制备的尿素和青霉素溶液添加到每个管，以分别达到终浓度1000ppm和3ppm。对于发酵，通过在盖子钻1/32英寸(1.5mm)的孔准备好15mL聚丙烯管，然后称重以记录空重量。将来自每个Nalgene管(液化)的约5g浆料转移到四个15mL管的每一个。接着，再次称重管以测定每个管中玉米浆的精确重量。对每个管给予适当量的稀释的葡糖淀粉酶AC。实际的酶剂量为0.6AGU/g DS，基于每个管中玉米浆的精确重量。对所有管给予100μL酵母繁殖物(propagate)，然后放置到32℃水浴中进行同时糖化和发酵(SSF)。在SSF开始时，最终计算的DS为27.8％。
发酵53小时后，收集样品用于HPLC分析。HPLC样品制备包括通过添加50μL的40％H2SO4终止酶和酵母反应，涡旋振荡以分散酸，以3000rpm离心10分钟，以及使上清液通过0.45μm滤器。将样品储存在4℃，直到分析。用于测定乙醇和寡糖浓度的系统是与RI检测器相结合的AgilentTM 100 HPLC系统。分离柱为BioRadTM Aminex HPX-87H离子排斥柱(300mmx 7.8mm)。
结果
HPLC分析的结果总结于以下表21。当在75℃持续2小时的液化中添加时，5个EG比用单独BE369AA(对照)液化的玉米糊显示更高的SSF后的最终乙醇产率。与仅BE369AA对照相比，来自Talaromyces leycettanus的GH5将最终乙醇产率增加了1.93％。该EG具有89℃的Td。
表21：总结的乙醇产率和百分比变化结果
| 液化处理 | 乙醇(％w/v) | 乙醇增加 |
| AA369(对照) | 10.13 | - |
| AA369+粪生粪壳菌EG V | 10.27 | 1.31％ |
| AA369+土生梭孢霉EG V | 10.25 | 1.16％ |
| AA369+T.leycettanus EG II | 10.33 | 1.93％ |
| AA369+胶囊青霉EG II | 10.26 | 1.21％ |
| AA369+T.saccata EG II | 10.25 | 1.19％ |
实施例20
在玉米液化中添加热稳定性内切-β-葡聚糖酶(EG)
所有处理通过100或107g液化评价。从工业玉米乙醇工厂获得了2种不同的玉米粉，称为玉米粉A和玉米粉B，以用于本实验；每种玉米粉在单独的实验中评价。玉米粉A的干固体(％DS)为86.1％而玉米粉B为86.3％，如通过Mettler-Toledo HB43卤素水分平衡一式两份测定的。
对于玉米粉A的液化，将37.2g玉米粉和62.8g自来水添加到200ml不锈钢Lab-O-Mat罐以达到32％的DS和100g的质量。发现该玉米浆的pH为约6.0；添加80μl的40％H2SO4以将pH降低到5.0用于液化。使用的α-淀粉酶(AA)为BE369。除了仅AA的对照外，评价了三种热稳定性EG，如表22所示。每个罐给予适当量的稀释酶，如下面的表23所示。每个液化处理一式两份测试。实际的酶剂量假定每个罐中糊状物的恒定体积；所有添加后且液化前的玉米浆的最终体积为107g且最终DS为29.9％。酶添加后，将罐紧密密闭，彻底振荡，接着放在Lab-O-Mat腔室中。用于液化的程序以升温速率为5℃/min开始以达到75℃；75℃持续两分钟。这立即继之以1℃/min的升温速率达到80℃；80℃持续110分钟。在整个程序中持续交替45rpm顺时针旋转30秒，接着45rpm逆时针30秒。
表22：EG来源，家族和序列ID列表
表23：液化中的酶剂量
程序完成后，将罐从Lab-O-Mat取出并浸没在冷水中约20分钟，直到罐冷却到触摸。将内部制备的尿素和青霉素溶液添加到每个罐，以分别达到终浓度800ppm和3ppm。对于发酵，由Corning制造的帽上具有螺纹的125mL带有挡板的聚碳酸酯瓶称重以记录空重量。将来自每个罐(液化)的约50g浆料转移到两个125mL瓶的每一个。接着，再次称重每个瓶以测定每个瓶中玉米糊的精确重量。对每个瓶给予适当量的稀释的葡糖淀粉酶AC。实际的酶剂量为0.6AGU/g DS，基于每个瓶中玉米浆的精确重量。基于每个瓶中平均糊状物重量对所有瓶给予1100μL酵母繁殖物，且酵母剂量20μl/g玉米糊四舍五入到最接近的100。接着，将瓶放置到Infors湿度控制的振荡培养箱用于同时糖化和发酵(SSF)。浓度为32℃，湿度设定为80％，振荡为150rpm。在SSF开始时最终计算的DS为28.6％。
发酵62小时后，收集样品用于HPLC分析。HPLC样品的制备包括通过添加550μL的40％H2SO4(10μl/g玉米糊)终止酶和酵母反应，混合以分散酸，转移约5g到15ml Falcon管，3000rpm离心8分钟，以及使上清液通过0.45μm滤器。将样品储存在4℃，直到分析。用于测定乙醇和寡糖浓度的系统是与RI检测器相结合的AgilentTM 100 HPLC系统。分离柱为BioRadTM Aminex HPX-87H离子排斥柱(300mm x 7.8mm)。
对于玉米粉B的液化，将37.7g玉米粉和55.3g自来水添加以在200ml不锈钢Lab-O-Mat罐中达到35％的DS和93g的质量。发现该玉米浆的pH为约6.0；添加70μl的40％H2SO4以将pH降低到5.0用于液化。使用的α-淀粉酶(AA)为BE369。除了仅AA的对照外，评价了三种热稳定性EG，如表22所示。每个罐给予适当量的稀释酶，如表23所示；添加另外的自来水使得每个罐的最终体积为100g。每个液化处理一式两份测试。实际的酶剂量假定每个罐中糊状物的恒定体积；所有添加后且液化前的玉米浆料的最终体积为100g且最终DS为32.6％。酶添加后，将罐紧密密闭，彻底振荡，接着放到Lab-O-Mat腔室中。用于液化的程序以升温速率为5℃/min开始以达到75℃；75℃持续两分钟。这立即继之以通过1℃/min的温度速率达到80℃；80℃持续110分钟。在整个程序中持续交替45rpm顺时针旋转30秒，接着45rpm逆时针30秒。
程序完成后，将罐从Lab-O-Mat取出并浸没在冷中约20分钟，直到罐冷却到触摸。对于发酵，由Corning制造的在盖上具有螺纹的125mL带有挡板的聚碳酸酯瓶称重以记录空重量。将来自每个罐(液化)的约50g浆料转移到两个125mL瓶的每一个。接着，再次称重每个瓶以测定每个瓶中玉米糊的精确重量。每个瓶给予适当量的稀释的葡糖淀粉酶AC。实际的酶剂量为0.6AGU/g DS，基于每个瓶中玉米浆的精确重量。基于每个瓶中平均糊状物重量对所有瓶给予1000μL酵母繁殖物，且20μl/g玉米糊的酵母剂量四舍五入到最接近的100。接着，将瓶放置到Infors湿度控制的振荡培养箱用于同时糖化和发酵(SSF)。温度为32℃，湿度设定为80％，振荡为150rpm。在SSF开始时最终计算的DS为30.5％。
发酵63小时后，收集样品用于HPLC分析。HPLC样品的制备包括通过添加550μL的40％H2SO4(10μl/g玉米糊)终止酶和酵母反应，混合以分散酸，转移约5g到15ml Falcon管，3000rpm离心8分钟，以及使上清通过0.45μm滤器。将样品储存在4℃，直到分析。用于测定乙醇和寡糖浓度的系统是与RI检测器相结合的AgilentTM 100 HPLC系统。分离柱为BioRadTMAminex HPX-87H离子排斥柱(300mm x 7.8mm)。
结果
HPLC分析的结果总结于以下表24中。当在85℃持续2小时的液化中添加时，在玉米粉A和玉米粉B中测试的所有EG比用单独BE369AA(对照)液化的玉米糊显示更高的SSF后的最终乙醇产率。
表24：总结的乙醇产率和百分比变化结果
本发明在以下编号的段落中进一步描述：
1.一种用于从含淀粉的材料生产发酵产品的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在高于初始糊化温度的温度下液化所述含淀粉的材料：
-α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用碳水化合物源生成酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
2.段1的方法，其中所述内切葡聚糖酶具有72℃以上，如74℃以上，例如76℃以上，例如78℃以上，例如80℃以上，例如82℃以上，例如84℃以上，例如86℃以上，例如88℃以上，例如70℃和95℃之间，例如76℃和94℃之间，例如78℃和93℃之间，例如80℃和92℃之间，例如82℃和91℃之间，例如84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
3.段1或2的方法，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自踝节菌属菌株，例如Talaromyces leycettanus菌株。
4.段1或2的方法，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自青霉属菌株，例如胶囊青霉菌株。
5.段1或2的方法，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自Trichophaea属菌株，例如Trichophaea saccata菌株。
6.段1或2的方法，其中所述内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:6的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自梭孢霉属菌株，例如土生梭孢霉菌株。
7.段1或2的方法，其中所述内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性，优选源自粪壳菌属菌株，例如粪生粪壳菌菌株。
8.段1-7任一项的方法，在液化步骤i)之前进一步包括以下方法：
a)降低含淀粉的材料的粒度，优选通过干磨；
b)形成浆料(slurry)，包含含淀粉的材料和水。
9.段1-8任一项的方法，其中至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少90％的含淀粉的材料适合通过具有#6滤网的筛。
10.段1-9任一项的方法，其中液化期间的pH在4.0-6.5之间，例如4.5-6.2，例如4.8-6.0以上，例如5.0-5.8之间。
11.段1-10任一项的方法，其中液化期间的温度在70-100℃的范围内，例如70-95℃之间，例如75-90℃之间，优选80-90℃之间，例如85℃左右。
12.段1-5任一项的方法，其中在步骤i)中的液化之后进行喷射蒸煮(jet-cooked)步骤。
13.段12的方法，其中所述喷射蒸煮步骤以在95-160℃之间的温度进行，例如110-145℃，优选120-140℃，例如125-135℃，优选约130℃持续约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟左右。
14.段1-7任一项的方法，其中糖化和发酵步骤顺序或同时进行。
15.段1-14任一项的方法，其中糖化在从20-75℃的温度，优选从40-70℃，例如60℃左右，和4和5之间的pH进行。
16.段1-15任一项的方法，其中发酵或同时糖化和发酵(SSF)在从20℃至40℃的温度，例如从28℃至35℃，例如从30℃至34℃，优选约32℃左右进行，例如持续6至120小时，特别是24至96小时。
17.段1-16任一项的方法，其中在发酵后回收所述发酵产品，例如通过蒸馏。
18.段1-17任一项的方法，其中所述发酵产品是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇，饮用乙醇和/或工业乙醇。
19.段1-18任一项的方法，其中所述含淀粉起始材料是全谷类。
20.段1-19任一项的方法，其中所述含淀粉的材料源自玉米，小麦，大麦，黑麦，蜀黍(milo)，西米，木薯，树薯(manioc)，木薯粉(tapioca)，高粱，稻或土豆。
21.段1-20任一项的方法，其中所述发酵生物体是酵母，优选酵母属菌株，特别是酿酒酵母菌株。
22.段1-21任一项的方法，其中所述α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。
23.段1-22任一项的方法，其中所述α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，例如WO 99/019467的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1中示出的。
24.段23的方法，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选具有约491个氨基酸，例如从480-491个氨基酸。
25.段23或24任一项的方法，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置I181+G182具有双重缺失和可选的N193F取代，或R179和G180缺失(使用本文的SEQ ID NO:1用于编号)。
26.段23-25任一项的方法，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242Q取代。
27.段23-26任一项的方法，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代。
28.段1-27任一项的方法，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70之间，例如15-70之间，例如20-70之间，例如25-70之间，例如30-70之间，例如40-70之间，例如50-70之间，例如60-70之间。
29.段1-28任一项的方法，其中所述α-淀粉酶选自下组的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其除了I181*+G182*和可选地N193F(使用本文的SEQ ID NO:1编号)外具有以下突变：
| -V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F； |
| -V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T； |
| -A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T； |
| -E129V+K177L+R179E+S242Q； |
| -E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -M284V； |
| -V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V. |
30.段1-29任一项的方法，其中所述α-淀粉酶是选自下组的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1编号)。
31.段1-30任一项的方法，进一步其中液化中存在和/或添加蛋白酶，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于25％的热稳定性值。
32.段1-31任一项的方法，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％的热稳定性值。
33.段1-26任一项的方法，其中所述蛋白酶具有以80℃/70℃的相对活性测定的20和50％之间，例如20和40％之间，例如20和30％之间的热稳定性。
34.段1-33任一项的方法，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的50和115％之间的热稳定性，例如50和70％之间，例如50和60％之间，例如100和120％之间，例如例如105和115％之间或者其中所述蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的大于10％的热稳定性，例如大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。
35.段1-34任一项的方法，其中所述蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的10和50％之间的热稳定性，例如10和30％之间，例如10和25％之间。
36.段1-35任一项的方法，其中所述蛋白酶在85℃具有60％以上，例如90％以上，例如100％以上，例如110％以上的热稳定性，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
37.段1-36任一项的方法，其中所述蛋白酶在85℃具有60-120之间的热稳定性，例如70-120％之间，例如80-120％之间，例如90-120％之间，例如100-120％之间，例如110-120％之间，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
38.段1-37任一项的方法，其中所述蛋白酶是真菌来源的。
39.段1-38任一项的方法，其中所述蛋白酶是源自嗜热子囊菌属菌株，优选橙色嗜热子囊菌菌株，特别是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。
40.段1-39任一项的方法，其中所述热稳定性蛋白酶是WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:2的成熟部分公开的金属蛋白酶的变体，具有选自下组的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
41.段1-40任一项的方法，其中所述蛋白酶是如WO 2003/048353中公开的SEQ IDNO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:2的成熟部分公开的金属蛋白酶的变体，具有以下突变：
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L；或
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
42.段1-41任一项的方法，其中所述蛋白酶变体与WO 2003/048353中公开的SEQID NO:2的多肽的成熟部分，或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:2的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％的同一性。
43.段1-41任一项的方法，其中所述SEQ ID NO:2中所示的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下的一个：
-D79L S87P D142L
-D79L S87P A112P D142L
-D79L Y82F S87P A112P D142L
-S38T D79L S87P A112P A126V D142L
-D79L Y82F S87P A112P A126V D142L
-A27K D79L S87P A112P A126V D142L
-S49P D79L S87P A112P D142L
-S50P D79L S87P A112P D142L
-D79L S87P D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L
-D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G A112P D142L
-D79L Y82F S87G D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P A126V D142L
-Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L
-Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L
-A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L
44.段1-43任一项的方法，其中所述蛋白酶是细菌来源的。
45.段1-44任一项的方法，其中所述蛋白酶源自火球菌属菌株，优选激烈火球菌菌株。
46.段1-45任一项的方法，其中所述蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13中所示的。
47.段1-46任一项的方法，其中所述蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的。
48.段1-47任一项的方法，进一步其中碳水化合物源生成酶在液化步骤i)期间存在和/或添加，优选葡糖淀粉酶。
49.段1-48任一项的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶是在85℃，pH 5.3具有至少20％，例如至少30％，优选至少35％热稳定性的葡糖淀粉酶。
50.段48-49任一项的方法，其中所述碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性pH最佳值的葡糖淀粉酶。
51.段48-50任一项的方法，其中所述碳水化合物源生成酶是在pH 5.0具有至少80％，至少85％，至少90的pH稳定性的葡糖淀粉酶。
52.段48-51任一项的方法，其中液化步骤i)期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶是葡糖淀粉酶，优选源自青霉属菌株，特别是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2公开和本文SEQ ID NO:9或14公开的草酸青霉菌株。
53.段48-52任一项的方法，其中所述葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ IDNO:2或本文SEQ ID NO:9或14(成熟)所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的同一性。
54.段48-53任一项的方法，其中所述碳水化合物源生成酶是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所公开的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列编号)。
55.段52-54任一项的方法，其中所述草酸青霉葡糖淀粉酶具有K97V取代(使用本文的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列编号)和进一步以下的一个：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*；
E501V+Y504T；或
T65A+K161S；或
T65A+Q405T；或
T65A+Q327W；或
T65A+Q327F；或
T65A+Q327Y；或
P11F+T65A+Q327F；或
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
P11F+T65A+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+S105P+Q327W；或
T65A+S105P+Q327F；或
T65A+Q327W+S364P；或
T65A+Q327F+S364P；或
T65A+S103N+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
56.段48-55任一项的方法，进一步其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。
57.段1-56任一项的方法，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉，泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉，或Talaromyces菌株，优选T.emersonii，或密孔菌属(Pycnoporus)菌株，或Gloephyllum菌株，或Nigrofomes菌株。
58.段1-57任一项的方法，进一步其中在液化和/或糖化期间存在和/或添加支链淀粉酶。
59.段58的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加的支链淀粉酶是家族GH57支链淀粉酶，其中所述支链淀粉酶优选包括WO 2011/087836中公开的X47域。
60.段1-59任一项的方法，其中在液化和/或糖化期间存在和/或添加植酸酶。
61.段58-60任一项的方法，其中所述植酸酶源自布丘氏菌属，例如Buttiauxellagaviniae，Buttiauxella agrestis，或Buttiauxella noackies，公开于WO 2008/092901中，或布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，例如WO 2006/037328中公开的。
62.段1-61任一项的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在从4.0-6.5以上之间范围内的pH在从70-100℃范围内的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
63.段1-62任一项的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在从4.5-6.2以上之间范围内的pH在初始糊化温度以上的温度液化所述含淀粉的材料：
-在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
64.段1-63任一项的方法，包括以下步骤：
i)在从4.0-6.5以上之间范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的细菌α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-可选地具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
65.段1-64任一项的方法，包括以下步骤：
i)在从4.0-6.5以上之间范围内的pH在初始糊化温度以上的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步具有下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用本文SEQ ID NO:1编号)；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；例如与本文的SEQ ID NO:3，4，5，6或7的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的内切葡聚糖酶。
-可选地源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊的菌蛋白酶，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；
-可选地本文SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；(使用SEQ ID NO:14编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
66.段1-65任一项的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在从4.0-6.5以上之间范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步下组取代的一个：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用本文SEQ ID NO:1编号)；
-具有70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶，与本文的SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性；
-源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌的蛋白酶，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；和可选地
-本文SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；或
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文SEQ ID NO:14编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
67.段1-65任一项的方法，包括以下步骤：
i)使用下列各项在从4.0-6.5以上之间范围内的pH在70-100℃之间的温度液化所述含淀粉的材料：
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，具有双重缺失I181+G182和可选的取代N193F；以及可选地进一步下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文SEQ ID NO:1编号)。
-源自激烈火球菌且具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶；
-本文SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
68.段62-67任一项的方法，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文SEQ IDNO:1)是与SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％同一性，例如至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟α-淀粉酶或对应的成熟α-淀粉酶。
69.段64-68任一项的方法，其中所述激烈火球菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:13)和/或橙色嗜热子囊菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:2)是分别与SEQ ID NO:13或本文的SEQ ID NO:3具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟蛋白酶或对应的成熟蛋白酶。
70.段65-69任一项的方法，其中所述草酸青霉葡糖淀粉酶(本文SEQ ID NO:14)，或其变体是与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟葡糖淀粉酶或对应的成熟葡糖淀粉酶。
71.段1-70任一项的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵期间，存在或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物。
72.段1-71任一项的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵期间，存在或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物和葡糖淀粉酶。
73.段1-72任一项的方法，其中在发酵或同时糖化和发酵期间，存在或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物和葡糖淀粉酶。
74.段71-73任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，特异腐质霉，Chrysosporium lucknowense或斜卧青霉。
75.段71-74任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，纤维二糖水解酶，和内切葡聚糖酶。
76.段71-75任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属菌株，例如米曲霉，例如WO 2002/095014中公开的，或WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如WO 2005/047499中SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:6中公开的，或WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属菌株，例如WO 2007/019442中公开的巴西青霉菌株，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
77.段71-76任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌属，例如橙色嗜热子囊菌菌株的，例如WO 2005/074656中如SEQ ID NO:2中所述的；或源自梭孢霉属，例如土生梭孢霉菌株，例如WO 2005/074647中如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所描述的；或源自曲霉属菌株，例如烟曲霉株，例如WO 2010/138754如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所描述的；或源自青霉菌属的菌株，例如爱默生青霉，例如WO 2011/041397中或本文SEQ ID NO:8中公开的。
78.段71-77任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如源自曲霉属菌株，例如烟曲霉株，例如WO 2011/057140中SEQ IDNO:6或本文SEQ ID NO:2公开的Cel7a CBHI，或木霉属菌株，例如里氏木霉菌株。
79.段71-78任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株，例如烟曲霉株；例如本文SEQ ID NO:4中公开的，或木霉属菌株，例如里氏木霉菌株，或梭孢霉属菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
80.段71-79任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
81.段71-80任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
82.段71-81任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶和CBH I。
83.段71-82任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，CBH I和CBH II。
84.段71-83任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
85.段71-84任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2)或本文的SEQ ID NO:6。
86.段71-85任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含WO 2011/041397中(本文SEQ ID NO:8)公开的具有纤维素分解增强活性的爱默生青霉GH61A多肽和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQID NO:2)或本文的SEQ ID NO:6公开，或其具有以下取代的变体：F100D，S283G，N456G，F512Y。
87.段71-86任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同源物。
88.段71-87任一项的方法，其中所述纤维素酶或纤维素分解酶组合物是SPIRIZYME ACHIEVETM,CELLIC CTECTM,CELLIC CTEC2TM,CELLIC CTEC3TM,ACCELLERASE1000TM,ACCELLERASE 1500TM,ACCELLERASE DUETTM,ACCELLERASE TRIOTM。
89.段71-88任一项的方法，其中在糖化或同时糖化和发酵期间存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉，泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉，或Talaromyces菌株，优选T.emersonii，或密孔菌属(Pycnoporus)菌株，或Gloephyllum菌株，或Nigrofomes菌株。
90.段72-89任一项的方法，其中所述葡糖淀粉酶是WO99/28448或本文SEQ ID NO:28中公开的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶，WO 06/69289中SEQ ID NO:2或本文SEQID NO:26公开的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，和WO 2006/069290中表5中作为V039或本文SEQ IDNO:27公开的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)葡糖淀粉酶的混合物。
91.段72-90的方法，其中所述α-淀粉酶是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)(本文SEQ ID NO:11)的微小根毛霉α-淀粉酶，其进一步包含至少一个以下取代或取代组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用本文SEQ ID NO:11编号)。
92.组合物，包括：
i)α-淀粉酶；
ii)具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
iii)可选地蛋白酶；
iv)可选地碳水化合物源生成酶。
93.段92的组合物，其中所述α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。
94.段92-93任一项的组合物，其中所述α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，例如WO 99/019467的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1中示出的。
95.段94的组合物，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选具有约491个氨基酸，例如从480-495个氨基酸。
96.段92-95任一项的组合物，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置I181+G182具有双重缺失和可选地N193F取代，或R179和G180缺失(使用本文的SEQ ID NO:1编号)。
97.段92-96任一项的组合物，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242Q取代。
98.段92-97任一项的组合物，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代。
99.段92-98任一项的组合物，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70之间，例如15-70之间，例如20-70之间，例如25-70之间，例如30-70之间，例如40-70之间，例如50-70之间，例如60-70之间。
100.段92-99任一项的组合物，其中所述α-淀粉酶选自下组嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1编号)。
101.段92-100任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶具有72℃以上，例如74℃以上，例如76℃以上，例如78℃以上，例如80℃以上，例如82℃以上，例如84℃以上，例如86℃以上，例如88℃以上的熔点(DSC)。
102.段92-101任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性，优选源自踝节菌属菌株，例如Talaromyces leycettanus菌株。
103.段92-102任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性，优选源自青霉属菌株，例如胶囊青霉菌株。
104.段92-103任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性，优选源自Trichophaea属菌株，例如Trichophaea saccata菌株。
105.段92-104任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:6的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性，优选源自梭孢霉属菌株，例如土生梭孢霉菌株。
106.段92-105任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文中的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性，优选源自粪壳菌属菌株，例如粪生粪壳菌菌株。
107.段92-106任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％，如大于25％的热稳定性值。
108.段92-107任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％的热稳定性值。
109.段92-108任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的20和50％之间，例如20和40％之间，例如20和30％之间的热稳定性。
110.段92-109任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的50和115％之间的热稳定性，例如50和70％之间，例如50和60％之间，例如100和120％之间，例如例如105和115％之间
111.段92-110任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的大于10％的热稳定性，例如大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。
112.段92-111任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在85℃/70℃的相对活性测定的10和50％之间的热稳定性，例如10和30％之间，例如10和25％之间。
113.段92-112任一项的组合物，其中所述蛋白酶在85℃具有60％以上，例如90％以上，例如100％以上，例如110％以上的热稳定性，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
114.段92-113任一项的组合物，其中所述蛋白酶在85℃具有60-120之间的热稳定性，例如70-120％之间，例如80-120％之间，例如90-120％之间，例如100-120％之间，例如110-120％之间，如使用玉米醇溶蛋白-BCA测定法测定的。
115.段92-114任一项的组合物，其中所述蛋白酶是真菌来源的。
116.段92-115任一项的组合物，其中所述蛋白酶是源自嗜热子囊菌属菌株，优选橙色嗜热子囊菌菌株，特别是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。
117.段92-116任一项的组合物，其中所述蛋白酶是如WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:2的成熟部分的金属蛋白酶的变体，具有以下突变：
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L；或
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
118.段92-118任一项的组合物，其中所述蛋白酶变体具有与WO2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分，或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ IDNO:2的成熟部分至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但少于100％的同一性。
119.段92-118任一项的组合物，其中本文中的SEQ ID NO:2中所示的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下的一个：
-D79L S87P D142L
-D79L S87P A112P D142L
-D79L Y82F S87P A112P D142L
-S38T D79L S87P A112P A126V D142L
-D79L Y82F S87P A112P A126V D142L
-A27K D79L S87P A112P A126V D142L
-S49P D79L S87P A112P D142L
-S50P D79L S87P A112P D142L
-D79L S87P D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L
-D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G A112P D142L
-D79L Y82F S87G D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P A126V D142L
-Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L
-Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L
-A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L
120.段92-119任一项的组合物，其中所述蛋白酶是细菌来源的。
121.段92-120任一项的组合物，其中所述蛋白酶源自火球菌属菌株，优选激烈火球菌菌株。
122.段92-121任一项的组合物，其中所述蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13中所示的。
123.段92-122任一项的组合物，其中所述蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ IDNO:1或本文SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的。
124.段92-123任一项的组合物，其中碳水化合物源生成酶是葡糖淀粉酶。
125.段92-124任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是在85℃，pH 5.3具有至少20％，例如至少30％，优选至少35％热稳定性的葡糖淀粉酶。
126.段92-125任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是在pH5.0具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性pH最佳值的葡糖淀粉酶。
127.段92-126任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是在pH5.0具有pH稳定性至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶。
128.段92-127任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来自青霉属菌株，特别是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2公开和本文SEQ ID NO:9或14公开的草酸青霉菌株。
129.段92-128任一项的组合物，其中所述葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQID NO:2或本文SEQ ID NO:9或14(成熟)所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更有选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的同一性。
130.段92-129任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所公开的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。
131.段92-130任一项的组合物，进一步包含葡糖淀粉酶。
132.段92-131任一项的组合物，其中在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉，泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉，或Talaromyces菌株，优选T.emersonii，或密孔菌属(Pycnoporus)菌株，或Gloephyllum菌株，或Nigrofomes菌株。
133.段92-132任一项的组合物，进一步包含支链淀粉酶。
134.段133组合物，其中所述支链淀粉酶是家族GH57支链淀粉酶，其中所述支链淀粉酶优选包括WO 2011/087836中公开的X47域。
135.段92-134任一项的组合物，进一步包含植酸酶。
136.段135任一项的组合物，其中所述植酸酶源自布丘氏菌属，例如公开于WO2008/092901的Buttiauxella gaviniae，Buttiauxella agrestis，或Buttiauxellanoackies，或布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，例如WO 2006/037328中公开的。
137.段92-136任一项的组合物，包含
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)，例如70℃和95℃之间的内切葡聚糖酶；
-可选地源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌，具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶；
-可选地葡糖淀粉酶，例如源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
138.段92-137任一项的组合物，包含
-在pH 4.5,85℃,0.12mM CaCl2具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌；
-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌；和
-可选地葡糖淀粉酶，例如，源自草酸青霉。
139.段92-138任一项的组合物，包含
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双重缺失I181+G182和可选地取代N193F；以及可选地进一步具有下组取代的一个：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文SEQ ID NO:1编号)；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
-可选地具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值的蛋白酶，优选源自激烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌；和
-可选地SEQ ID NO:14中具有选自下组的取代的草酸青霉葡糖淀粉酶：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14编号)。
140.段92-139任一项的组合物，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文SEQID NO:1)或其变体是具有与本文SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性的成熟多肽或对应的成熟多肽。
141.段92-140任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶具有74℃以上，例如76℃以上，例如78℃以上，例如80℃以上，例如82℃以上，例如84℃以上，例如86℃以上，例如88℃以上，例如70℃和95℃之间，例如76℃和94℃之间，例如78℃和93℃之间，例如80℃和92℃之间，例如82℃和91℃之间，例如84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
142.段92-141任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:3，4，5，6或7的多肽的成熟部分具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，例如100％的同一性。
143.段92-142任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少80％的同一性。
144.段92-143任一项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶与具有70℃以上的熔点(DSC)的本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少90％的同一性。
145.段92-144任一项的组合物，其中所述激烈火球菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:13)和/或橙色嗜热子囊菌蛋白酶(本文SEQ ID NO:2)，或其变体，是分别与SEQ ID NO:2或SEQID NO:13具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟蛋白酶或对应的成熟蛋白酶。
146.段92-145任一项的组合物，其中所述草酸青霉葡糖淀粉酶(本文SEQ ID NO:14)，或其变体，是与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少99％同一性的成熟葡糖淀粉酶或对应的成熟葡糖淀粉酶。
147.一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，选自下组：
(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。
148.段147的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的成熟多肽。
149.段147或148的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸19至334。
150.一种组合物，包含段147-149任一项的多肽。
151.一种多核苷酸，编码段147-149任一项的多肽。
152.一种核酸构建体或表达载体，包含可操作连接到一个或多个控制序列的段151的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。
153.一种重组宿主细胞，包含可操作连接到一个或多个控制序列的段151的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽的产生。
154，一种产生段147-149任一项的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，该细胞在野生型的形式中产生所述多肽；和
(b)回收所述多肽。
155.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养段153的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
156.一种转基因植物，植物部分或植物细胞，包含编码段147-149任一项的多肽的多核苷酸。
157.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包含：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养段156的转基因植物或植物细胞；和
(b)回收所述多肽。
158.一种产生蛋白的方法，包含：
(a)在有益于所述蛋白产生的条件下培养重组宿主细胞，其包含可操作地连接到段5的多核苷酸的编码蛋白的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和
(b)回收所述蛋白。
159.一种用于降解纤维素材料的方法，包含：在段1-3任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物处理所述纤维素材料。
160.一种用于生产发酵产品的方法，包含：
(a)在段147-149任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)使用一种或多种发酵微生物发酵所述糖化的纤维素材料以产生所述发酵产品；和
(c)从发酵回收所述发酵产品。
161.一种发酵纤维素材料的方法，包括：使用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在段147-149任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化的。
162.段161的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产品。
163.一种具有内切葡聚糖活性的多肽，选自下组：
(a)与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少940％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性的多肽；
(b)(a)的多肽的片段，其具有内切葡聚糖酶活性。
164.段163的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的成熟多肽。
165.段163或164的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸21至394。
166.一种组合物，包含段1-3任一项的多肽。
167.一种多核苷酸，编码段163-165任一项的多肽。
168.一种核酸构建体或表达载体，包含可操作地连接到一个或多个控制序列的段167的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。
169.一种重组宿主细胞，包含可操作地连接到一个或多个控制序列的段167的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽的产生。
170.一种产生段163-165任一项的多肽的方法，包括：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，该细胞在其野生型的形式中产生所述多肽；和
(b)回收所述多肽。
171.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包括：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养段169的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
172.一种转基因植物，植物部分或植物细胞，包含编码段163-165任一项的多肽的多核苷酸。
173.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包括：
(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养段172的转基因植物或植物细胞；和
(b)回收所述多肽。
174.一种产生蛋白的方法，包括：
(a)在有益于所述蛋白产生的条件下培养重组宿主细胞，其包含可操作地连接到段167的多核苷酸的编码蛋白的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和
(b)回收所述多肽。
175.一种用于降解纤维素材料的方法，包括：在段163-165任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物处理所述纤维素材料。
176.一种用于生产发酵产品，包括：
(a)在段163-165任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化纤维素材料；
(b)使用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料以产生所述发酵产品；和
(c)从发酵回收所述发酵产品。
178.一种发酵纤维素材料的方法，包括：使用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在段163-165任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下使用酶组合物糖化的。
179.段178的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产品。
在此描述的和要求保护的发明在范围上不限于在此公开的特定方面，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，通过前述描述，本发明的各自修改对于本领域普通技术人员而言将变得明显。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
Claims (20)
1.一种用于从含淀粉的材料生产发酵产品的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下使用下列各项液化所述含淀粉的材料：
-α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
ii)使用碳水化合物源生成酶糖化；
iii)使用发酵生物体发酵。
2.权利要求1的方法，其中所述α-淀粉酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)，如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如本文中的SEQ ID NO:1中示出的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl2具有至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70之间，如15-70之间，如20-70之间，如25-70之间，如30-70之间，如40-70之间，如50-70之间，如60-70之间的T1/2(min)。
4.权利要求1-3中任一项的方法，进一步其中在液化中存在和/或添加蛋白酶，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于25％的热稳定性值。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述蛋白酶是源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)，优选橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，特别是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体，如本文SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的变体，其中所述蛋白酶变体与本文中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但低于100％的同一性。
6.权利要求4或5的方法，其中所述蛋白酶源自火球菌属(Pyrococcus)菌株，优选激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)菌株，如本文中的SEQ ID NO:13，或与本文中的SEQ ID NO:13具有至少80％，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％的同一性的蛋白酶。
7.权利要求1-6中任一项的方法，进一步其中在液化步骤i)期间存在和/或添加碳水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶。
8.权利要求7的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶是在85℃，pH 5.3具有至少20％，如至少30％，优选至少35％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
9.权利要求7或8的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加的碳水化合物源生成酶是葡糖淀粉酶，优选源自青霉属(Penicillium)菌株，特别是以本文中的SEQ ID NO:9或14公开的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，或与本文中的SEQ ID NO:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的同一性的葡糖淀粉酶。
10.一种组合物，其包含：
i)α-淀粉酶；
ii)具有70℃以上的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；
iii)可选地蛋白酶；
iv)可选地碳水化合物源生成酶。
11.权利要求10的组合物，其中所述α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如本文中的SEQ ID NO:1，优选其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有位置I181+G182中的双重缺失和可选地N193F取代，或R179和G180的缺失(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。
12.权利要求11的组合物，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mMCaCl2具有至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70之间，如15-70之间，如20-70之间，如25-70之间，如30-70之间，如40-70之间，如50-70之间，如60-70之间的T1/2(min)。
13.权利要求10-12中任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有以在80℃/70℃的相对活性测定的大于20％，如大于25％的热稳定性值。
14.权利要求10-13中任一项的组合物，其中所述蛋白酶是源自嗜热子囊菌属菌株，优选橙色嗜热子囊菌菌株，特别是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，如本文中的SEQ ID NO:2的成熟部分的金属蛋白酶的变体，其具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
15.权利要求10-14中任一项的组合物，其中所述蛋白酶源自火球菌属菌株，优选激烈火球菌菌株，如本文中的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶，或与本文中的SEQ ID NO:13具有至少80％，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的蛋白酶。
16.权利要求10-15中任一项的组合物，其进一步包含碳水化合物源生成酶，优选葡糖淀粉酶，其中所述碳水化合物源生成酶是在85℃，pH 5.3具有至少20％，如至少30％，优选至少35％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
17.权利要求10-16中任一项的组合物，其中所述碳水化合物源生成酶是葡糖淀粉酶，优选源自青霉属菌株，特别是以本文中SEQ ID NO:9或14公开的草酸青霉菌株，或与本文中的SEQ ID NO:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的葡糖淀粉酶。
18.权利要求10-17中任一项的组合物，其包含
-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-具有70℃以上的熔点(DSC)，如70℃和95℃的内切葡聚糖酶；
-可选地源自激烈火球菌或橙色嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有以80℃/70℃的相对活性测定的大于20％的热稳定性值；
-可选地葡糖淀粉酶，如源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
19.权利要求10-18中任一项的组合物用于液化含淀粉的材料的用途。
20.一种生产液化淀粉的方法，包括用权利要求10-18中任一项的组合物液化含淀粉的材料。
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