KR100808517B1 - α-아밀라제 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변형된 성질, 구체적으로는 모 α-아밀라제에 비하여 분지점에 가까운 기질 절단력의 감소, 및 개선된 기질 특이성 및/또는 개선된 비활성도를 나타내는 모 터마밀-유사 알파-아밀라제 변이체에 관한 것이다.
모-터마밀 유사 α-아밀라제 변이체

Description

α-아밀라제 변이체{ALPHA-AMYLASE VARIANTS}
본 발명은 특히 공업용 전분 프로세싱(예를 들어, 전분의 액화 또는 당화)에서 변이체의 이용과 관련되어 잇점이 있는 특히 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 신규한 변이체, 그 중에서도 특히 변형된 성질을 나타내는 변이체, 특히 (모체에 비하여) 변형된 절단 형태를 가지는 변이체에 관한 것이다.
α-아밀라제(알파-1,4-글루칸-4-글루카노히드로라제, EC 3.2.1.1)는 전분 및 다른 직쇄 및 분지형 1,4-글루코시드 올리고- 및 다당의 가수분해를 촉매하는 효소군으로 구성된다.
공업상 매우 중요한 효소 유형에 관련된 광범위한 특허 및 과학 문헌이 있다. 터마밀-유사 α-아밀라제 변이체와 같은 많은 α-아밀라제가 예를 들어, WO 90/11352, WO 95/10603, WO95/26397, WO96/23873, WO96/23874 및 WO 97/41213 에 공지된다.
α-아밀라제와 관련된 최근의 개시중에서, WO 96/23874 는 본원에서 SEQ ID NO:6 로 제시된 아미노산을 포함하는 B.amyloliquefaciens α-아밀라제의 300 N-말단 아미노산 잔기 및 본원에서 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산을 포함하는 B.licheniformis α-아밀라제의 C-말단의 아미노산 잔기 301-483 으로 구성되며(후 자는 상표명 TermamylTM 으로 상업상 이용가능하다.), 따라서, 공업상 중요한 Bacillus α-아밀라제(본원에서 용어 "터마밀-유사 α-아밀라제"의 의미에 내포되고, 그중에서도 특히, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens 및 B.stearothermophilus α-아밀라제를 포함한다.)에 밀접하게 관련되는 BA2 로 일컫는 터마밀-유사 α-아밀라제에 관한 3-차원, X-레이 결정 구조 데이타를 제공한다. WO 96/23874 는 또한 모 터미밀-유사 α-아밀라제 구조의 분석에 기초하여, 모체와 비교하여 변형된 성질을 나타내는 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 유전적으로 설계하는 방법학을 개시한다.
WO 96/23874 및 WO 97/41213 (Novo Nordisk)은 본원에서 SEQ ID NO:4 로 제시된 서열의 아미노산 잔기 V54, D53, Y56, Q333, G57 및 A52 내의 돌연변이를 포함하는 변형된 절단 패턴을 가지는 터마밀-유사 α-아밀라제 변이체를 개시한다.
(발명의 개요)
본 발명은 터마밀-유사 α-아밀라제의 신규한 알파-녹말분해 변이체(돌연변이체), 특히 전분의 공업용 프로세싱(전분 액화, 당화등)과 관련하여 유리한, (모체에 비하여) 변형된 절단 패턴를 나타내는 변이체에 관한 것이다.
본 발명자는 본원에서 SEQ ID NO:4 로 제시된 서열의 아미노산 잔기 V54, D53, Y56, Q333, G57 및 A52 에서 돌연변이를 포함하는 변형된 절단 형태를 가지는, WO 96/23874 및 WO97/41213(Novo Nordisk)에 개시된 터마밀-유사 α-아밀라제 변이체와 비교할 때, 변형된 성질, 특히 개선된 분지점에 가까운 기질 절단력의 감 소, 및 개선된 기질 특이성 및/또는 개선된 비활성도를 더 가지는 변형된 절단 패턴을 가지는 변이체를 발견하였다.
본 발명은 본 발명의 변이체를 코드화하는 DNA 구조체, 본 발명의 변이체를 포함하는 조성물, 본 발명의 변이체를 제조하는 방법, 및 예를 들어, 전분 액화, 및 세탁, 식기 세척 및 경표면 클린징 조성물과 같은 세제 조성물; 연료, 음료 및 공업용 에탄올 제조와 같은 에탄올 제조; 직물, 섬유 또는 의복등의 풀빼기와 같은 다양한 공업상 과정에서 다른 알파-아밀로이드 가수분해 효소와 단독 또는 조합한 본 발명의 변이체 및 조성물의 사용에 관한 것이다.
명명법
본 발명의 상세한 설명 및 청구항에서, 아미노산 잔기에 관한 종래의 한-문자 및 세-문자 코드가 사용된다.
용이한 기준으로서, 본 발명의 α-아밀라제 변이체는 다음의 명명법을 사용하여 개시된다.
본래의 아미노산: 위치 : 치환 아미노산
명명법에 따라서, 예를 들어, 위치 30 에서 아스파라긴을 알라닌으로의 치환은:
Ala30Asn 또는 A30N
같은 위치에서 알라닌의 결실은:
Ala30* 또는 A30*
그리고, 리신과 같은 추가적인 아미노산 잔기의 삽입은:
*30aLys 또는 *30aK
아미노산 잔기 30-33 과 같은 일련의 아미노산 잔기의 결실은 (30-33)* 또는 △(A30-N33) 또는 델타(A30-N33)으로 나타낸다.
특정 α-아밀라제가 다른 α-아밀라제와 비교하여 "결실" 을 포함하는 경우에, 위치 36 에서 아스파라트산의 삽입은 하기와 같이 나타나는 위치에서 만들어진다:
*36aAsp 또는 *36aD
다중 돌연변이는 + 표시에 의해 분리된다, 즉:
각각, 아스파라긴 및 세린을 알라닌 및 글루탐산으로 치환하는 위치 30 및 34 에서 돌연변이를 나타내는
Ala30Asp + Glu34Ser 또는 A30N +E34S
다중 돌연변이는 또한 하기와 같이 분리될 수 있다. 즉, + 표시와 같이 의미로
Ala30Asp/Glu34Ser 또는 A30N/E34S
하나이상의 치환 아미노산 잔기는
A30N, E 또는
A30N 또는 A30E
와 같이 표시되는 위치에서 삽입될 수 있다.
더욱이, 제안된 어떤 특정 변형, 또는 A30X 없이 변형에 적합한 위치가 본원에서 확인될 때, 어떤 아미노산 잔기는 그 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 치 환될 수 있다고 이해된다. 그러므로, 예를 들어, 위치 30 의 알라닌의 변형이 구체적이지 않거나, X 로 특정되어 언급될 때, 알라닌은 어떤 아미노산 즉, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 중 어느 하나의 아미노산에 대한 결실 또는 치환일 수 있다는 것이 이해된다.
터마밀-유사 α-아밀라제
Bacillus spp. 에 의해서 생산된 많은 α-아밀라제가 아미노산 수준에서 매우 높은 상동성을 보인다는 것이 공지된다. 예를 들어, SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 B.licheniformis α-아밀라제(TermamylTM 으로 상업상 이용가능함)는 SEQ ID NO:6 으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 B.amyloliquefaciens α-아밀라제와 약 89% 상동성 및 SEQ ID NO:8 으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 B.stearothermophilus 알파-아밀라제와 약 79% 상동성을 가지는 것으로 발견되었다. 더욱 상동성의 α-아밀라제는 Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 또는 DSM 9375 균주로부터 유도된 α-아밀라제를 포함하고, 상기 모든 것은 WO 95/26397 에 상세히 개시되고, #707 α-아밀라제는 Tsukamoto 등, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151(1988), pp.25-31 에 개시된다.
더욱더 상동성인 α-아밀라제는 EP 0252666(ATCC 27811)에 개시된 B.licheniformis 균주에 의해 생산된 α-아밀라제, 및 WO 91/00353 및 WO 94/18314 에서 확인된 α-아밀라제를 포함한다. 다른 상업상 터마밀-유사 B.licheniformis α-아밀라제는 OptithermTM 및 TakathermTM (Solvay로부터 구입), MaxamylTM (Gist-brocades/Genencor로부터 구입), Spezym AATM 및 Spezyme Delta AATM (Genencor 로부터 구입), 및 KeistaseTM(Daiwa 로부터 구입)이다.
α-아밀라제간에 발견된 실질적인 상동성때문에, 그들은 같은 유형의 α-아밀라제, 즉 "터마닐-유사 알파 아밀라제" 유형에 속하는 것으로 여겨진다.
따라서, 본원에서, 용어 "터마밀-유사 알파 아밀라제"는 아미노산 수준에서 TermamylTM, 즉 본원에서 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.licheniformis α-아밀라제에 실질적인 상동성을 나타내는 α-아밀라제를 지시하고자 한다. 즉, 터마밀-유사 α-아밀라제는 α-아밀라제이고, 이것은 본원에서 SEQ ID NO:2, 4, 6, 또는 8 로 제시된 아미노산 서열, 및 WO 95/26397의 SEQ ID NO:1 또는 2 로 제시된 아미노산 서열(상기 SEQ ID NO:1 및 2는 각각 본원에서 SEQ ID NO:41 및 42 로 제시된다) 또는 Tsukamoto 등, 1988 에서 제시된 아미노산 서열(본원에서 SEQ ID NO:43 으로 제시된다)을 가지거나, i) 상기 아미노산 서열의 적어도 하나와 적어도 60 %, 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80 %, 특히 적어도 85%, 특히 바람직하게는 적어도 90 %, 특히 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 의 상동성을 나타내고/또는 ii) 상기 α-아밀라제의 적어도 하나로 유발된 항체와 면역 교차-반응성을 나타내고/또는 iii) 각각, 본 출원의 SEQ ID NO:1, 3, 5 및 7 및 WO 95/26397 의 SEQ ID NO:4 및 5 로부터 분명한 상기-특정된 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열에 혼성화하는 DNA 서열로 코드화된다.
성질과 관련하여, i) "상동성"은 종래의 알고리즘, 바람직하게는 GCG 패키지 버전 7.3 (June 1993)의 GAP 생성 페널티 3.0 및 GAP 확장 패널티 0.1 로 GAP 패널티에 대한 생략값을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. (Genetic Computer Group(1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
터마밀과 터마밀-유사 α-아밀라제간의 구조적 배열은 다른 터마밀-유사 α-아밀라제내의 등가/상보적인 위치를 확인하는 데 사용할 수 있다. 상기 구조적 배열을 얻는 방법은 갭 패널티의 생략값, 즉 캡 생성 패널피 3.0 및 갭 확장 패널피 0.1 을 사용하는 GCG 패키지로부터 파일 업(Pile Up)프로그램을 사용하는 것이다. 다른 구조적 배열 방법은 소수성 클러스터 분석(Gaboriaud et at., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) 및, α-아밀라제의 역 트레딩(Huber, T;Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol.7,No.1 pp. 142-149(1988)을 포함한다. α-아밀라제의 성질 ii), 즉 면역 교차 반응성은 관련된 터마밀-유사 α-아밀라제의 적어도 하나의 에피토프로 유발된 또는 이와 반응하는 항체를 사용하여 분석될 수 있다. 단일클론 또는 다클론인 항체는 예를 들어, Hudson et al., Practical Immunology, 제 3 판(1989), Blackwell Scientific Publication 에 개시된 대로 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 면역 교차-반응성은 예를 들어, Hudson et al., 1989 에 개시된 대로 웨스턴 블럿 또는 방사 면역확산 분석법과 같은 당업계를 공 지된 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 이 관점에서, 각각 아미노산 서열 SEQ ID NO:2, 4, 6 또는 8 을 가지는 α-아밀라제간의 면역 교차-반응성이 발견되었다.
상기 성질 iii)을 가지는 터마밀-유사 알파-아밀라제의 특징화에 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 문제의 α-아밀라제의 전체 또는 부분적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 기초하여 적절하게 준비될 수 있다.
혼성화를 시험하기 위한 적당한 조건은 5xSSC 에서 예비침액하는 단계 및 20 % 포르마마이드 용액, 5xDenhardt 용액, pH 6.8, 50 mM 소듐 포스페이트 및 50 mg 의 변성 초음파처리된 송아지 흉선 DNA 용액에서 ~40 ℃ 로 1 시간동안 예비 혼성화 다음에, ~40 ℃ 에서 18 시간동안 100 mM ATP 로 보충된 같은 용액에서 혼성화하는 단계, 그 다음, 40 ℃ 에서(저 강도), 바람직하게는 50 ℃(중 강도), 더욱 바람직하게는 65 ℃ 에서 (고 강도), 더욱 더 바람직하게는 ~75 ℃(매우 고강도)에서 30 분동안 2xSSC, 0.2% SDS 에서 여과기를 3 번 세척하는 단계를 포함한다. 혼성화 방법에 대한 더욱 상세한 설명은 Sambrook et al., Molecular_Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, 1989 에서 밝혀진다.
본원에서, "유도형"은 문제의 균주에 의해 생산되거나 생산가능한 α-아밀라제를 지시할 뿐만 아니라, 이러한 균주에서 분리된 DNA 서열에 의해서 코드화된 α-아밀라제 및 상기 DNA 서열로 형질전환된 유기물 숙주에서 생산된 α-아밀라제를 지시하고자 한다. 결국, 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열로 코드화되고, 문제의 α-아밀라제의 확인된 특징을 가지는 α-아밀라제를 지시할 목적으로 사용된다. 용어는 또한 모 α-아밀라제가 자연 발생 α-아밀라제의 변이체, 즉, 자 연 발생 α-아밀라제의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형(삽입, 치환, 결실)의 결과로서의 변이체일 수 있다는 것을 나타내고자 한다.
모 하이브리드 α-아밀라제
모 α-아밀라제는 하이브리드 α-아밀라제, 즉, 적어도 2 개의 α-아밀라제로부터 유도된 부분적인 아미노산 서열의 조합을 포함하는 α-아밀라제일 수 있다.
모 하이브리드 α-아밀라제는 터마밀-유사 α-아밀라제 부류에 속하는 것으로 결정될 수 있는 아미노산 상동성 및/또는 면역 교차-반응성 및/또는 DNA 혼성화(상기 정의됨)에 기초한 것일 수 있다. 이러한 경우에, 하이브리드 α-아밀라제는 전형적으로 터마밀-유사 α-아밀라제의 적어도 한 부분과 미생물(세균 또는 균류) 및/또는 포유동물 기원의 터마밀-유사 α-아밀라제 또는 비-터마밀-유사 알파 아밀라제로부터 선택되는 하나 이상의 다른 α-아밀라제의 부분으로 구성된다.
따라서, 모 하이브리드 α-아밀라제는 적어도 2 개의 터마밀-유사 α-아밀라제, 또는 적어도 하나의 터마밀-유사 및 적어도 하나의 비-터마밀-유사 박테리아 α-아밀라제, 또는 적어도 하나의 터마밀-유사 및 적어도 하나의 균류 α-아밀라제로부터 유도된 부분적인 아미노산 서열의 조합을 포함할 수 있다. 부분적인 아미노산 서열로부터 유도된 터마밀-유사 α-아밀라제는 예를 들어, 본원에 언급된 특정 터마밀-유사 α-아밀라제의 어떤 것일 수 있다.
예를 들어, 모 α-아밀라제는 균주 B.licheniformis 로부터 유도된 α-아밀라제의 C-말단 부분 및 균주 B.amyloliquefaciens 또는 균주 B.stearothermophilus 로부터 유도된 α-아밀라제의 N-말단 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모 α-아 밀라제는 B.licheniformis α-아밀라제의 C-말단 부분의 적어도 430 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들어, a) SEQ ID NO:6 로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.amyloliquefaciens α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 절편 및 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 절편, 또는 b) SEQ ID NO:8 으로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제의 68 N-말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 절편 및 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.licheniformis α-아밀라제의 415 C-말단 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 절편을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 모 터마밀-유사 α-아밀라제는 (완성형 단백질의) N-말단 35 아미노산 잔기를 SEQ ID NO:6 로 제시된 Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제(BAN)의 완성형 단백질의 N-말단 33 아미노산 잔기로 대체한 것을 제외하고는 SEQ ID NO:4 로 제시된 Bacillus licheniformis α-아밀라제에 동일한 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제이다. 상기 하이브리드는 다음의 돌연변이를 더 포함할 수 있다: LE174 로서 언급된 H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용).
다른 바람직한 모 하이브리드 α-아밀라제는 SEQ ID NO:2 로 제시된 LE429 이다.
비-터마밀-유사 α-아밀라제는 (터미밀-유사 α-아밀라제와 다른) 예를 들어, 균류 α-아밀라제, 포유동물 또는 식물 α-아밀라제 또는 박테리아 α-아밀라 제일 수 있다. 이러한 α-아밀라제의 특정 예는 Aspergillus oryzae TAKA α-아밀라제, A.niger 산 α-아밀라제, Bacillus subtillus α-아밀라제, 돼지 췌장 α-아밀라제 및 보리 α-아밀라제를 포함한다. 모든 α-아밀라제는 본원에 언급된 전형적인 터마밀-유사 α-아밀라제의 구조와 현저하게 다른 밝혀진 구조를 가진다.
A.niger 및 A. orzae 로부터 유래된 상기에 언급된 균류 α-아밀라제는 아미노산 수준에서 높은 상동성을 가지고 일반적으로 같은 부류의 α-아밀라제에 속하는 것으로 여겨진다. Aspergillus orzae 로부터 유도된 균류 α-아밀라제는 FungamylTM 이란 상표명으로 상업적으로 구입할 수 있다.
더욱이, 터마밀-유사 α-아밀라제의 특정 변이체가(본 발명의 변이체) 특정 터마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산 서열에서 특정 아미노산 잔기의 변형(예를 들어, 결실 또는 치환)을 기준으로 종래의 방식으로 언급될 때, (각각의 아미노산 서열사이의 가장 가능한 아미노산 서열 배열로 결정될 때) 등가의 위치에서 변형된 다른 터마밀-유사 α-아밀라제의 변이체는 그것에의해 포함된다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 변이체의 바람직한 구체예는 예를 들어, SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B.licheniformis α-아밀라제와 같은 상기에 언급된 것 중 하나와 같은 (모 터마밀-유사 α-아밀라제로서) B.licheniformis α-아밀라제로부터 유도된 것이다.
본 발명의 변이체의 제조
관심의 변이체 제조는 변이체 생산에 기여하는 조건으로 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 미생물을 배양함으로써 달성될 수 있다. 그 다음, 변이체는 결과적인 배양물 육즙으로부터 후에 회수될 수 있다. 이것은 하기에 더욱 상세하게 개시된다.
변형된 성질
하기에서는 본 발명의 변이체에 존재할 수 있고, (모 터마밀-유사 α-아밀라제의 성질과 비교하여) 성질면에서 바람직한 변형일 수 있고, 그것으로부터 유래할 수 있는 돌연변이간의 상관관계를 논의한다.
제 1 의 양태에서, 본 발명은
W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, A111, S168, M197 의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 변형을 포함하는 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이고, 여기에서 (a) 변형은 독립적으로
(i) 위치를 차지하는 아미노산의 다운스트림에 아미노산의 삽입
(ii) 위치를 차지하는 아미노산의 결실, 또는
(iii) 위치를 차지하는 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환이고,
(b) 변이체는 α-아밀라제 활성을 가지고, (c) 각 위치는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 가지는 모 터마밀-유사 알파 아밀라제의 아미노산 서열의 위치에 해당한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 다음의 돌연변이 중 적어도 하나에 해당하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다:
V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; 또는 T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; 또는 T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G07I, G107L, G107C.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 하기의 돌연변이에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다 :
W13F, L, I, V, Y, A;
G48A, V, S, T, I, L;
*48aD 또는 *48aY (즉, D 또는 Y 의 삽입);
T49X;
*49aX (즉, 어떤 가능한 아미노산 잔기의 삽입)
S50X, 특히 D, Y, L, T, V, I;
Q51R,K;
A52X, 특히 A52S, N, T, F, L, I, V;
D53E, Q, Y, I, N, S, T, V, L;
V54X, 특히 V54I, N, W, Y, F, L;
G57S, A, V, L, I, F, Y, T;
G107X, 특히 G107A, V, S, T, I, L, C;
G108X, 특히 G108A, V, S, T, I, L ;
A111V, I, L;
S168Y;
M197X, 특히 Y, F, L, I, T, A, G.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A 의 돌연변이에 해당하는 위치에서 이의의 돌연변이를 포함하고; G108A 를 더 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 하기의 돌연변이에 해당하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다:
T49L+G107A;
T49I+G107A;
T49L+G107A+V54I;
T49I+G107A+V54I;
A52S+V54N+T49L+G107A;
A52S+V54I+T49L+G107A;
A52S+T49L+G107A;
A52T+T49L+G107A;
A52S+V54N+T49I+G107A;
A52S+V54I+T49I+G107A;
A52S+T49I+G107A;
T49L+G108A;
T49I+G108A;
T49L+G108A+V54I;
T49I+G108A+V54I.
상기 언급된 모든 본 발명의 변이체는 변형된 성질(증가 또는 감소된 성질을 의미), 특히 모 α-아밀라제와 관련된 다음의 성질 중 적어도 하나의 성질: 분지점에 가까운 기질을 절단하는 능력의 감소, 개선된 기질 특이성 및/또는 개선된 비활성도, 변형된 기질 결합, 변형된 열안정성, 변형된 pH/활성 프로파일, 변형된 pH/안정성 프로파일, 산화에 대한 변형된 안정성, 변형된 Ca2+ 의존성을 가진다.
안정성
본원에서, 변형된 안정성, 특히 낮은 pH(즉, pH 4-6)에서 특히 개선된 안정성(즉, 더 높거나 더 낮은)을 획득하는 것과 관련된 중요한 돌연변이(아미노산 치환 및/또는 결실을 포함)는 상기 "변형된 성질" 단락에 목록화된 어떤 돌연변이 및 바로 하기에 언급된 변이체를 포함한다.
다음의 변이체: Q360A, K; N102A, N326A, L, N190G, N190K; Y262A, K, E (BAN, 즉 SEQ ID N: 6 의 사용, 넘버링)를 pH 안정성에 대해 시험했다. 바람직한 모 α-아밀라제는 상기에 개시된 BA2 일 수 있다. pH 안정성은 "물질&방법"단락에 개시된 대로 결정되었다.
Ca 2+ 안정성
변형된 Ca2+ 안정성은 Ca2+ 소모가 개선된 경우에 효소의 안정성 즉, 더 높거나 더 낮은 안정성을 의미한다. 본원에서, 변형된 Ca2+ 안정성을 획득하는 것, 특히 낮은 pH(즉, pH 4-6 )에서 특히 개선된 Ca2+ 안정성, 즉, 더 높거나 더 낮은 안정성과 관련된 중요한 돌연변이(아미노산 치환 포함)는 상기 "변형된 성질" 단락에서 열거된 어떤 돌연변이를 포함한다.
비활성도
본 발명의 더 나은 양태에서, 변형된 비활성도, 특히 60-100 ℃, 바람직하게는 75-95 ℃, 특히 80-90 ℃ 의 온도에서 특히, 증가 또는 감소된 비활성도를 나타내는 변이체를 얻는 것과 관련된 중요한 돌연변이는 상기 "변형된 성질"단락에 열거된 어떤 돌연변이를 포함한다. LE174 및 L3174 의 비활성도를 "물질 및 방법" 단락에 개시된 Phaedbas
Figure 112001024347959-pct00001
분석법을 사용하여 16,000 NU/mg 으로 결정했다.
변형된 절단 패턴
전분 액화 과정에서, 더 짧고, 분지형 올리고당의 형성(종래의 터마밀-유사 α-아밀라제와 유사)을 유발하는 α-아밀라제보다 전분 분자를 긴, 분지형 올리고당으로 분해할 수 있는 α-아밀라제를 사용하는 것이 바람직하다. 짧은, 분지형 올리고당(판노스 전구체)은 액화 과정에서 α-아밀라제 처리 후, 또는 당화 아밀로 글루코시다제(글루코아밀라제)와 동시에, 또는 당화 아밀로글루코시다제(글루코아밀라제)의 첨가전에 사용되는 풀루라나제에 의해 충분히 가수분해되지 않는다. 그러므로, 판노스 전구체의 존재하에서, 글루코아밀라제 처리후에 존재하는 혼합물은 상당한 비율의 짧은, 분지형의 소위 제한-덱스트린인 삼당 판노스를 포함한다. 판노스의 존재는 당화 산출량을 상당히 낮추기 때문에 바람직하지 않다.
글루코아밀라제 및 풀루라나제로 당화하는 경우에 α-아밀라제가 당화 단계전에 불활성된다면, 액화 과정에서 발생한 잔기 α-아밀라제의 존재는 더 낮은 글루코스 산출량을 유도한다는 것이 이미 보고되었다(US 특허 5,234, 823). 불활성화는 전형적으로 당화를 위해 온도를 60 ℃ 까지 더 낮추기 전에, 95 ℃, 4.7 이하의 pH 로 조정함으로써 수행될 수 있다.
글루코스 산출량에 대한 네가티브한 효과의 원인이 완전하게 이해되지는 않지만, α-아밀라제(예를 들어, B.licheniformis 로부터 터마밀 120L)의 액화는 아밀로펙틴에서 분지점에 가까운 양 측면의 1,4-α-글루코시드 결합을 가수분해함으로써 (풀루라나제에 대한 바람직하지 않은 기질인) "제한 덱스트린"을 발생시킨다는 것이 추측된다. 글루코아밀라제에 의한 제한 덱스트린의 가수분해는 삼당 판노스의 축적을 유발하여, 글루코아밀라제에 의한 가수분해만을 늦춘다.
이러한 단점을 겪지 않는 열안정성 α-아밀라제의 개발은 별개의 불활성 단계를 요구하지 않기 때문에, 중요한 개선일 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 적당히 변형된 전분-분해 특징을 가지지만, 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 열안정성을 보유하는 돌연변이체 α-아밀라제를 얻는 것이다.
따라서, 본 발명은 분지점에 가까운 기질 절단력의 감소가 개선되고, 더욱이 개선된 기질 특이성 및/또는 개선된 비활성도를 가지는 터마밀-유사 α-아밀라제의 변이체에 관한 것이다.
특정 관심의 변이체는 환원 말단으로부터, 분지점으로부터 하나 이상의 글루코스 단위, 바람직하게는 분지점으로부터 2 또는 3 이상의 글루코스 단위, 즉, 야생형 B.licheniformis α-아밀라제의 사용으로 얻어진 것보다 분지점으로부터 더 먼 거리에서 아밀로펙틴 기질을 절단한다.
WO 96/23874 에 따라서, 다음의 돌연변이의 적어도 하나를 포함하는 변이체가 분지점에 가까운 절단을 방지하는 것으로 기대된다는 것이 본원에 언급될 수 있다:
V54L, I, F, Y, W, R, K, H, E, Q;
D53L, I, F, Y, W;
Y56W;
Q333W;
G57, 모든 가능한 아미노산 잔기;
A52, A 보다 더 큰 아미노산 잔기, 예를 들어, A52W, Y, L, F, I.
분지점에 가까운 기질 절단력 감소성의 개선된 성질을 가지고, 더욱이 개선된 기질 특이성 및/또는 개선된 비활성도를 가지는 본 발명의 변이체를 얻는 것과 관련된 특정 관심의 돌연변이는 B.licheniformis α-아밀라제, SEQ ID NO:4 에서 다음의 위치의 돌연변이를 포함한다: H156, A181, N190, A209, Q264 및 I201.
하기에 구체적으로 언급된 터마밀-유사 α-아밀라제만이 사용될 수 있는 것이 아니라는 것이 강조되어야 한다. 다른 상업적 터마밀-유사 α-아밀라제가 또한 사용될 수 있다. 이러한 α-아밀라제의 무제한의 리스트는 하기와 같다: EP 0252666(ATCC 27811) 에 개시된 B.lichenliformis 균주에 의해 생산된 α-아밀라제, 및 WO 91/00353 및 WO 94/18314 에서 확인된 α-아밀라제. 다른 상업상 터마밀-유사 B.licheniformis α-아밀라제는 OptithermTM 및 TakathermTM (Solvay로부터 구입), MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor 로부터 구입), Spezym AATM Spezyme Delta AATM (Genencor 로부터 구입), 및 KeistaseTM (Daiwa 로부터 구입)이다.
모든 터마밀 유사 α-아밀라제는 본 발명의 변이체를 제조하기 위한 골격으로 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 모 터마밀-유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6 의 하이브리드 α-아밀라제이다. 특히, 모 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기와 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amyloliquefaciens 로부터 유래된 완성형 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함하는 하이브리드 α-아밀라제일 수 있고, 이것은 적절하게 다음의 돌연변이를 더 가질 수 있다:H156Y +A181T+N190F+A209V+Q264S(SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용). 하이브리드는 LE174 라고 한다. LE174 하이브리드는 더이상의 돌연변이 I201F 와 결합하여 H156Y +A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용)돌연변이를 가지는 모 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제를 형성할 수 있다. 하이브리드 변이체는 SEQ ID NO:2 로 제시되고, 하기의 실시예에 사용되며, LE429 라고 한다.
또한, 하기의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO:4 로 제시된 LE174 또는 LE429(SEQ ID NO:2) 또는 B.licheniformis α-아밀라제가 골격으로 사용될 수 있다(돌연변이의 넘버링을 위해 SEQ ID NO:4 사용).
E119C;
S130C;
D124C;
R127C;
A52 모든 가능한 아미노산 잔기;
S85 모든 가능한 아미노산 잔기;
N96 모든 가능한 아미노산 잔기;
V129 모든 가능한 아미노산 잔기;
A269 모든 가능한 아미노산 잔기;
A378 모든 가능한 아미노산 잔기;
S148 모든 가능한 아미노산 잔기; 특히 S148N;
E211 모든 가능한 아미노산 잔기; 특히 E211Q;
N188 모든 가능한 아미노산 잔기; 특히 N188S; N188P
M197 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 M197T, M197A, M197G, M197I, M197L, M197Y, M197F, M197I;
W138 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 W138Y;
D207 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 D297Y;
H133 모든 아미노산 잔기, 특히 H133Y;
H205 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 H205H, H205C, H205R;
S187 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 S187D;
A210 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 A210S, A210T;
H405 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 H405D;
K176 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 K176R;
F279 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 F279Y;
Q298 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 Q298H;
G299 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 G299R;
L308 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 L308F;
T412 모든 가능한 아미노산 잔기, 특히 T412A;
더욱이, 하기의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniformis α-아밀라제는 골격으로 사용될 수 있다:
M15 모든 가능한 아미노산 잔기;
A33 모든 가능한 아미노산 잔기;
LE174 를 돌연변이 I201F(SEQ ID NO:4 넘버링)와 결합시킴으로써 LE429(SEQ ID NO:2로 제시됨)를 골격으로 사용하는 경우에(즉, 모 터마밀-유사 α-아밀라제일 때), 본 발명에 따른 돌연변이/변형, 특히 치환, 결실 및 삽입이 하기의 위치의 하나 이상에서 만들어져서 분지점 가까운 기질 절단력의 감소를 개선시키고, 기질 특이성 및/또는 비활성도를 개선시킨다:
W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, A111, S168, M197(SEQ ID NO:4 넘버링의 사용)
여기에서 (a) 변형은 독립적으로
(i) 위치를 차지하는 아미노산의 아미노산 다운스트림의 삽입,
(ii) 위치를 차지하는 아미노산의 결실, 또는
(iii) 위치를 차지하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환이고,
(b) 변이체는 α-아밀라제 활성 및 (c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:4 를 가지는 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 아미노산 서열 위치에 해당하는 각 위치를 가진다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 하기의 돌연변이에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다:
V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R, Q51R+A52S, A52N; 또는
T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; 또는
T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G07I, G107L, G107C.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 다음의 돌연변이에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다 :
W13F, L, I, V, Y, A;
G48A, V, S, T, I, L;
*48aD 또는 *48aY (즉, D 또는 Y 의 삽입);
T49X;
*49aX (즉, 어떤 아미노산 잔기의 삽입)
S50X, 특히 D, Y, L, T, V, I;
Q51R,K;
A52X, 특히 A52S, N, T, F, L, I, V;
D53E, Q, Y, I, N, S, T, V, L;
V54X, 특히 V54I, N, W, Y, F, L;
G57S, A, V, L, I, F, Y, T;
G107X, 특히 G107A, V, S, T, I, L, C;
G108X, 특히 G108A, V, S, T, I, L ;
A111V, I, L;
S168Y;
M197X, 특히 Y, F, L, I, T, A, G.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A 의 돌연변이에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, G108A 를 더 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 다음의 돌연변이에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
T49L+G107A;
T49I+G107A;
T49L+G107A+V54I;
T49I+G107A+V54I;
A52S+V54N+T49L+G107A;
A52S+V54I+T49L+G107A;
A52S+T49L+G107A;
A52T+T49L+G107A;
A52S+V54N+T49I+G107A;
A52S+V54I+T49I+G107A;
A52S+T49I+G107A;
T49L+G108A;
T49I+G108A;
T49L+G108A+V54I;
T49I+G108A+V54I.
본 발명의 변이체에서 일반적인 돌연변이
본 발명의 변이체는 하나 이상의 변형뿐만 아니라 상기에 개시된 것을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 변형된 α-아밀라제 변이체 부분에 존재하는 하나 이상의 프롤린 잔기는 가능한, 자연발생 비-프롤린 잔기의 어떤 것일 수 있는 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린 또는 류신인 비-프롤린 잔기로 치환되는 것이 유리할 수 있다.
유사하게, 변형된 모 α-아밀라제를 가지는 아미노산 중에 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기는 세린, 알라닌, 트레오닌, 글리신, 발린 또는 류신과 같은 비-시스테인 잔기로 치환되는 것이 바람직할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 변이체는-변형만이거나 상기 개시된 변형의 어느 것과 조합으로-변형되어서 SEQ ID NO:4 의 아미노산 단편 185-209 에 해당하는 아미노산 단편에 존재하는 하나 이상의 Asp 및/또는 Glu 가 각각 Asn 및/또는 Gln 으로 치환될 수 있다. 또한 터마밀-유사 α-아밀라제에서 SEQ ID NO:4 의 아미노산 단편 185-209 에 해당하는 아미노산 단편에 존재하는 하나 이상의 Lys 잔기를 Arg 로 치환하는 것이 관심 대상이다.
본 발명은 둘 이상의 상기 개시된 변형이 삽입된 변이체를 포함한다는 것이 이해될 것이다.
더욱이, 본원에 개시된 변이체의 어떤 것에 점-돌연변이를 도입하는 것이 유리할 수 있다.
α-아밀라제 변이체를 제조하는 방법
유전자에 돌연변이를 도입하는 몇개의 방법이 당업계에 공지된다. α-아밀라제-코드화 DNA 서열 클로닝의 간략한 개시후에, α-아밀라제-코드화 서열내에서 특정 부위에 돌연변이를 유발하는 방법이 논의될 것이다.
α-아밀라제 코드화 DNA 서열의 클로닝
모 α-아밀라제 코드화 DNA 는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 문제의 α-아밀라제를 생산하는 어떤 세포 또는 미생물로부터 분리될 수 있다. 첫번째로, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리를 염색체 DNA 또는 메신저 RNA 를 사용하여 연구될 α-아밀라제를 생산하는 유기물로부터 제조해야만 한다. 그 다음, α-아밀라제의 아미노산 서열이 공지된 경우에, 상동성, 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성할 수 있고, 문제의 유기물로부터 제조된 게놈 라이브러리의 α-아밀라제 코드화 클론을 확인하는 데 사용될 수 있다. 택일적으로, 공지된 α-아밀라제 유전자에 상동적인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화 및 저 강도의 세척조건을 사용하여 α-아밀라제-코드화 클론 확인에 사용될 수 있다.
그러나, α-아밀라제-코드화 클론을 확인하는 다른 방법은 게놈 DNA 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하는 단계, 결과적인 게놈 DNA 라이브러리로 α-아밀라제-음성 박테리아를 형질전환시키는 단계, 그 다음, α-아밀라제에 대한 기질을 포함하는 한천상에 형질전환된 세균을 플레이팅함으로써 클론이 확인 대상인 α-아밀라제를 발현하도록 하는 단계를 포함할 것이다.
택일적으로, 효소를 코드화하는 DNA 서열은 예를 들어, S.L.Beaucage 및 M.H. Caruthers(1981) 에 개시된 포스포로아미다이트 방법 또는 Matthes et al.(1984)에 개시된 방법과 같은 확립된 표준방법으로 합성될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐링되고, 연결되고, 적당한 벡터에 클론된다.
최종적으로, DNA 서열은 표준 기법에 따라서, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편(바람직하게, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 해당하는 단편)을 연결하여 제조된 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다. DNA 서열은 또한 예를 들어, US 4,683,202 또는 R.K.Saiki et al.(1988)에 개시된대로 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응(PCR)으로 제조될 수 있다.
부위-특이적 돌연변이유발
일단 α-아밀라제-코드화 DNA 서열이 분리되고, 돌연변이에 바람직한 부위가 확인되면, 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바람직한 돌연변이 부위의 양측면에 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 돌연변이체 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성동안 삽입된다. 구체적인 방법에서, α-아밀라제-코드화 서열을 연결하는 DNA 의 단일-가닥 갭이 α-아밀라제 유전자를 운반하는 벡터에 생성된다. 그 다음, 바람직한 돌연변이를 포함 하는 합성 뉴클레오티드가 단일-가닥 DNA 의 상동적 부분에 어닐링된다. 그 다음 잔여 갭이 DNA 폴리머라제 I(클루노우 단편)로 채워지고, 구조체는 T4 리가제를 사용하여 연결된다. 본 방법의 구체적 예는 Morinaga et al.(1984)에 개시된다. US 4,760,025 는 카세트의 경미한 변형을 수행함으로써 다중 돌연변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, 다양한 길이의 많은 올리고뉴클레오티드가 도입될 수 있기 때문에 더욱 다양한 돌연변이조차도 Morinaga 방법에 의해서 한번에 어떤 위치에라도 도입될 수 있다.
α-아밀라제-코드화 DNA 서열에 돌연변이를 도입하는 다른 방법은 Nelson 및 Long(1989)에 개시된다. 그것은 PCR 반응에서 프라이머의 하나로서 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 사용함으로써 도입된 바람직한 돌연변이를 포함하는 PCR 단편의 3-단계 생산을 포함한다. PCR-생산 단편으로부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제로 절단 분리되어, 발현 플라스미드에 재삽입될 수 있다.
무작위 돌연변이유발
무작위 돌연변이유발은 관심대상으로 제시된 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 3 부분 또는 전 유전자내에서 국부화 또는 영역-특이적 무작위 돌연변유발로 적절하게 수행된다.
모 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이유발은 당업계에 공지된 어떤 방법을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다.
상기와 관련하여, 본 발명의 더 이상의 양태는 예를 들어, 분지점 가까운 올리고당 기질 절단력의 감소, 및 개선된 기질 특이성 및/또는 모체에 비하여 개선된 비활성도를 나타내는 모 터마밀-유사 α-아밀라제의 변이체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 방법은:
(a) 모 터마밀-유사 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열에 무작위 돌연변이유발을 일으키는 단계,
(b) 숙주세포에서 단계(a)에서 얻은 돌연변이화 DNA 서열을 발현하는 단계, 및
(c) 모 α-아밀라제에 비하여 변형된 성질(즉, 열안정성)을 가지는 α-아밀라제를 발현하는 숙주 세포를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 단계 (a) 는 바람직하게는 도핑 프라이머를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 무작위 돌연변이유발은 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이화제를 사용하거나, 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, DNA 서열을 PCR 생성 돌연변이유발 과정에 놓음으로써 수행될 수 있다. 더욱이, 무작위 돌연변이유발은 이러한 돌연변이화제의 어떤 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이화제는 예를 들어, 트란지션, 트랜스버전, 인버전, 스크램블링, 결실 및/또는 삽입을 유발하는 어떤 것일 수 있다.
본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이화제의 예는 자외선(UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 니트로산, 에틸 메탄 술포네이트(EMS), 소듐 바이술파이트, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 약제가 사용될 때, 돌연변이유발은 전형적으로 돌연변이유발이 발생하는 적당한 조건하에서 돌연변이약제의 선택으로 돌연변이 화될 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 인큐베이션하고, 원하는 성질을 가지는 돌연변이화된 DNA 를 선택함으로써 수행된다. 돌연변이유발이 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되는 경우에, 올리고뉴클레오티드는 변형될 위치에서 올리고뉴클레오티드의 합성동안 3 개의 비-모체 뉴클레오티드로 도핑되거나 스파이킹된다. 도핑 또는 스파이킹은 원하지 않는 아미노산을 피하기 위해서 수행될 수 있다. 도핑 도는 스파이킹 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, PCR, LCR 또는 적절하다고 여겨지는 어떤 DNA 폴리머라제 및 리가제를 사용하여 어떤 공개된 기법에 의해서 α-아밀라제 효소를 코드화하는 DNA 에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 도핑은 "항상 무작위 도핑"을 사용하여 수행되고, 여기에서 각 위치에서 야생형 및 돌연변이의 비율이 미리 한정된다. 더욱이, 도핑은 어떤 뉴클레오티드의 도입 선호에 특이적일 수 있고, 이에 의해서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입이 선호된다. 도핑은 각 위치에서 예를 들어, 90 % 야생형 및 10 % 돌연변이의 도입을 허용하기 위해서 만들어질 수 있다. 도핑 계획의 선택에서 추가적인 고려는 유전적 뿐만 아니라 단백질-구조 압력에 기초한다. 도핑 계획은 그 자체로 정지 코돈의 도입의 예방을 보장하는 DOPE 프로그램을 사용하여 이루어질 수 있다. PCR-발생 돌연변이유발이 사용되는 경우에, 모 α-아밀라제를 코드화하는 화학적 처리 또는 비-처리 유전자가 뉴클레오티드의 미스-결합을 증가시키는 조건하에서 PCR 에 놓인다(Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp.11-15). E.coli 의 돌연변이 유발인자 균주(Fowler et al., Molec. Gen. Genet.,133,1974,pp. 179-191), S.cereviseae 또는 어떤 다른 미생물은 예를 들어, 모 글리코실라제를 포함하는 플라스미드로 돌연 변이 유발인자 균주를 형질전환시키고, 플라스미드를 가지는 돌연변이 유발인자 균주를 배양하고, 돌연변이 유발인자 균주로부터 돌연변이화 플라스미드를 분리함으로써 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 의 무작위 돌연변이유발에 사용될 수 있다. 돌연변화 플라스미드는 연이어서, 발현 유기물을 형질전환시킬 수 있다. 돌연변이 대상이 되는 DNA 서열은 모 α-아밀라제를 발현하는 유기물로부터 제조된 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 용이하게 존재할 수 있다. 택일적으로, DNA 서열은 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 적당한 벡터상에서 존재할 수 있고, 이것은 그 자체로 함께 인큐베이션되거나 그렇지 않으면, 돌연변이화제에 노출될 수 있다. 돌연변이대상이 되는 DNA 는 또한 상기 세포의 게놈에 삽입되거나 세포에 함유된 벡터상에 존재함으로써 숙주세포에 존재할 수 있다. 최종적으로, 돌연변이 대상이 되는 DNA 는 분리형일 수 있다. 무작위 돌연변이 대상이 되는 DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 서열일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 어떤 경우에, 발현 단계 b) 또는 스크리닝 단계 c)를 수행하기 전에 돌연변이화 DNA 서열을 증폭시키는 것이 편리할 수 있다. 이러한 증폭은 당업계에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 현재에 DNA 또는 모 효소의 아미노산 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR-발생 증폭이 바람직한 방법이다. 돌연변이화제와 함께 또는 이에 노출하여 인큐베이션한 다음에, 돌연변이화 DNA 는 유전자가 발현되는 조건하에서 DNA 서열을 운반하는 적당한 숙주 세포를 배양함으로써 발현된다. 본 목적에 사용된 숙주 세포는 선택적으로, 돌연변이유발 처리동안 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 운반하는 벡터상에 존재하는 돌연변이화 DNA 서열로 형질전환된 것 일 수 있다. 적당한 숙주 세포의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis , Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 와 같은 그람 양성 박테리아; 및 E.coli 와 같은 그람-음성 박테리아이다. 돌연변이화 DNA 서열은 돌연변이화 DNA 서열의 발현을 허용하는 기능을 코드화하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.
국부화 무작위 돌연변이유발
무작위 돌연변이유발은 문제의 모 α-아밀라제의 부분에 유리하게 국부화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 효소의 어떤 영역이 효소의 허여된 성질에 특히 중요한 것으로 확인되는 경우, 및 변형이 개선된 성질을 가지는 변이체를 유발하는 것으로 여겨지는 경우에 유리할 수 있다. 이러한 영역은 일반적으로 모 효소의 3 차원 구조가 도시되는 경우에 확인될 수 있고, 효소의 기능과 관련된다.
국부화, 또는 영역-특이적, 무작위 돌연변이유발은 상기에 개시된 PCR 발생 돌연변이유발 기법 또는 당업계에 공지된 다른 적당한 기법을 사용하여 용이하게 수행된다. 택일적으로, 변형될 DNA 서열의 일부분을 코드화하는 DNA 서열은 예를 들어, 적당한 벡터에의 삽입에 의해서 분리될 수 있고, 이어서, 상기 부분은 상기에 개시된 어떤 돌연변이유발 방법을 사용하여 돌연변이유발에 놓일 수 있다.
α-아밀라제 변이체를 제공하는 대안적인 방법
본 발명의 변이체를 제공하는 대안적인 방법은 예를 들어, WO 95/22625 (Affymax Tcehnologies N.V.) 및 WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S) 에 개시된 방법을 포함하여 당업계에 공지된 유전자-서플링 방법을 포함한다.
알파 아밀라제 변이체의 발현
본 발명에 따라서, 상기에 개시된 방법, 또는 당업계에 공지된 어떤 대안적인 방법으로 생산된 변이체를 코드화하는 DNA 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 시그널, 및 선택적으로, 억제 유전자 또는 다양한 활성제 유전자를 코드화하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.
본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 운반하는 재조합 발현 벡터는 용이하게 재조합 DNA 과정에 놓일 수 있는 어떤 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 도입될 숙주세포에 따라서 결정된다. 따라서, 벡터는 독립적으로 복제 가능한 벡터, 즉, 염색체외 전체로서 존재하는 벡터일 수 있고, 그것의 복제는 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체와 같이 염색체 복제에 독립적이다. 택일적으로, 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우에 숙주 세포 게놈에 삽입되어 통합된 염색체와 함께 복제될 수 있다.
벡터에서, DNA 서열은 적절한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포와 상동 또는 비상동의 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될 수 있다. 특히 숙주 박테리아 숙주에서 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하 는 DNA 서열의 전사를 지시적인 적당한 프로모터의 예는 E.coli 오페론의 lac 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가로스 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자(amyL)의 프로모터, Bacillus stearthermophilus 말토스생성 아밀라제 유전자(amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제(amyQ) 의 프로코터, Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자등의 프로모터이다. 군류 숙주 전사의 경우에, 유용한 프로모터의 예는 A. orzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트산 프로테인아제, A.niger 중성 α-아밀라제, A.niger 산 안정성 α-아밀라제, A.niger 글루코아밀라제, Rhizomucor niehei 리파제, A.oryzae 알칼리 프로테아제, A.orzae 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 A.nidulans 아세타미다제를 코드화하는 유전자로부터 유도된 것이다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 적당한 전사 종결자, 및 진핵생물에서 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리-아데닐화 서열을 포함한다. 종결서열 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 같은 원으로부터 적절하게 유도될 수 있다.
벡터는 문제의 숙주 세포에서 벡터를 복제가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702 의 복제 기점이다.
벡터는 또한 예를 들어, B.subtilis 또는 B.licheniformis 로부터의 dal 유전자와 같은 숙주 세포의 결핍을 보충하는 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 더욱이, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 sC 와 같은 Aspergillus 선택 마터, 히그로마이신 내성을 유발하는 마커를 포함할 수 있거나, 선택은 예를 들어, WO 91/17243 에 개시된 것과 같은 공-형질전환으로 달성될 수 있다.
세포내 발현이 예를 들어, 숙주 세포로서 어떤 박테리아를 사용하는 경우와 같이 어떤 측면에서는 유리할 수 있지만, 발현은 세포외인 것이 일반적으로 바람직하다. 일반적으로, 본원에 언급된 Bacillus α-아밀라제는 발현된 프로테아제를 배지로 분비하도록 하는 예비-영역을 포함한다. 바람직한 경우에, 예비-영역은 서로 다른 예비 영역 또는 신호 서열로 대체될 수 있고, 각각의 예비영역을 코드화하는 DNA 서열의 치환에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
각각 α-아밀라제 변이체, 프로모터, 터미네이터 및 다른 요소를 코드화하는 본 발명의 DNA 구조체 연결에 사용된 과정, 및 그것은 복제에 필요한 정보를 포함하는 적당한 벡터에 삽입하는 과정은 당업자(참고로, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Ed.,Cold Spring Harbor, 1989)에게 공지된다.
상기에 개시된 본원의 DNA 구조체 또는 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 재조합 생산에서 숙주 세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 숙주 염색체에 DNA 구조체(하나 이상의 카피로)를 통합시킴으로써 용이하게 변이체를 코드화하는 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환될 수 있다. 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포에 더욱 안정하게 유지될때 유리한 것으로 여겨진다. DNA 구조체의 숙주 염색체로의 통합은 예를 들어, 상동성 또는 비상동성 재조 합과 같은 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포는 숙주 세포의 다른 형태와 연관되어어 상기에 개시된 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 세포는 포유동물 또는 곤충과 같은 고등 유기물의 세포일 수 있으나, 바람직하게는 예를 들어, 박테리아 또는 균류(효모 포함) 세포와 같은 미생물 세포이다.
적당한 박테리아의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Baciillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Baciillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 와 같은 그람-양성 벡테리아, 또는 E. coli 와 같은 그람음성 박테리아이다. 벡테리아의 형질전환은 예를 들어, 원형질체 형질전환 또는 그자체로 공지된 방법으로 수용성 세포를 사용하여 수행될 수 있다.
효모 유기물은 예를 들어, Saccharomyces cerevisiae 와 같은 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 종으로부터 선택되는 것이 유리할 수 있다. 사상균은 예를 들어, Aspergillus orzae 또는 Aspergillus niger 과 같은 Aspergillus 종에 속하는 것이 유리할 수 있다. 균류 세포는 그 자체로 공지된 방법으로 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환 다음에 세포벽의 재생성을 포함하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. Asperillus 숙주 세포의 형질전환의 적당한 과정이 EP 238 023 에 개시된다.
더 나은 양태에서, 본 발명은 발명의 α-아밀라제 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이고, 그 방법은 변이체의 생산에 기여하는 조건으로 상기에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배지로부터 변이체를 회수하는 단계를 포함한다.
세포 배양에 사용된 배지는 문제의 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 발현된 α-아밀라제 변이체를 얻기에 적합한 종래의 어떤 배지일 수 있다. 적당한 배지는 상업적 공급자로부터 이용가능하거나, 공개된 방법에 따라서 준비될 수 있다 (예를 들어, American Type Cluture Collection 의 카탈로그에 개시).
숙주 세포로부터 분비된 α-아밀라제 변이체는 원심분리 또는 여과에 의해서 세포를 배지로부터 세포를 분리하는 단계, 및 암모늄 설페이트와 같은 염 다음에, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피등과 같은 크로마토그래피 과정의 사용에 의해서 배지의 단백질성 성분을 침전시키는 단계를 포함하는 주지된 방법으로 배지로부터 용이하게 회수될 수 있다.
공업상 이용분야
본 발명의 α-아밀라제 변이체는 다양한 공업상 응용을 허용하는 가치있는 성질을 가진다. 특히, 본 발명의 효소 변이체는 세척, 식기세척 및 경표면 클린징 세제 조성물의 성분으로 이용가능하다. 많은 변이체는 특히 예를 들어, 연료, 음료 또는 공업용 에탄올과 같은 전분으로부터 감미료 및 에탄올에 제조, 및/또는 직물 풀빼기에 사용될 수 있다. 전분 액화 및/또는 당화 과정을 포함하는 종래의 전분-전환 과정의 조건은 예를 들어, US 3,912,590 및 EP 특허 공개번호 252 730 및 63 909 에 개시된다.
전분으로부터 감미료 제조
전분을 과당 시럽으로 전환하는 "종래의" 과정은 일반적으로 액화 과정 다음에, 당화 과정 및 이성화과정에 의한 3 단계의 연속적인 효소적 과정으로 구성된다. 액화 과정 동안에, 전분은 대략 2 시간동안 5.5 및 6.2 사이의 pH 값 및 온도 95-160 ℃ 에서 α-아밀라제(예를 들어, TermamylTM)에 의해 덱스트린으로 분해된다. 이러한 조건에서 최적의 효소 안정성을 보장하기 위해서, 1mM 의 칼슘이 첨가된다(40 ppm 무칼슘 이온).
액화 가공처리 후에, 덱스트린은 글루코아밀라제(예를 들어, AMGTM) 및 이소아밀라제 또는 풀루라나제(예를 들어, PromozymeTM)와 같은 가지절단 효소를 첨가하여 덱스트로스로 전환된다. 이 단계 전에, 고 온도(95 ℃ 이상)를 유지하면서, pH 는 4.5 이하로 감소되어, 액화 α-아밀라제 활성이 변성된다. 온도는 60 ℃ 이하로 유지되고, 글루코아밀라제 및 가지절단 효소가 첨가된다. 당화 가공처리는 24-72 시간동안 지속된다.
당화 가공처리 후에, pH 는 6-8 의 범위, 바람직하게는 pH 7.5 로 증가되고, 칼슘은 이온 교환으로 제거된다. 그 다음, 덱스트로스 시럽은 예를 들어, 고정화 글루코세이소머라제(SweetzymeTM) 와 같은 고 과당 시럽으로 전환된다.
이 가공처리의 적어도 하나의 효소적 개선이 예견될 수 있다: 액화 α-아밀 라제의 칼슘 의존성의 감소. 무 칼슘의 첨가가 α-아밀라제의 고 안정성을 적절히 유지하기 위해서 요구되지만, 무 칼슘은 글루코세이소머라제의 활성을 강력하게 억제하고, 무 칼슘의 수준이 3-5 ppm 으로 감소되는 정도로 고비용의 단위 작동장치에 의해서 제거될 필요가 있다. 비용 절감은 이러한 작동장치를 피할 수 있고, 액화 과정이 무칼슘 이온의 첨가 없이 수행될 수 있는 경우에 얻을 수 있다.
이것을 달성하기 위해서, 저 농도의 무칼슘(＜40 ppm)에서 안정적이고 고 활성인 칼슘에 덜 의존적인 터마밀-유사 α-아밀라제가 요구된다. 이러한 터마밀-유사 α-아밀라제는 pH 4.5 -6.5 , 바람직하게는 범위 4.5-5.5 의 범위에서 pH 최적을 가져야만한다.
본 발명은 또한 (모 터마밀-유사 α-아밀라제로서) SEQ ID NO:8 으로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 본 발명의 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO:4 로 제시된 서열을 가지는 B.licheniformis α-아밀라제로부터 유도된 터마밀-유사 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 (모 터마밀-유사 α-아밀라제로서) SEQ ID NO:8 에 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 본 발명의 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amyloliquefaciens α-아밀라제 부분 및 SEQ ID NO:4 로 제시되는 B.licheniformis α-아밀라제의 부분을 포함하는 하이브리드 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 후자로 언급된 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniformis α-아 밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amyloliquefaciens 로부터 유도된 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 후자로 언급된 하이브리드 α-아밀라제는 다음의 돌연변이: H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4에서의 넘버링 사용)를 적절히 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 후자로 언급된 하이브리드 α-아밀라제는 다음의 돌연변이 H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEQ ID NO:4 넘버리 사용)를 적절히 포함할 수 있다. 하기 실시예에서, LE429 로 말하는 상기-마직막으로 언급된 모 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제는(SEQ ID NO:2 로 제시) 본 발명의 변이체를 제조하는 데 사용될 수 있고, 그 변이체는 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다.
본 발명의 α-아밀라제 변이체 또는 본 발명의 조성물은 본 발명의 양태에서 전분 액화, 세탁, 식기 세척 조성물 및 경표면 클린징과 같은 세제 조성물, 연료, 음료 및 공업용 에탄올 제조와 같은 에탄올 제조, 직물, 섬유 및 의류의 풀빼기에 사용될 수 있다.
물질 및 방법
효소
LE174: 하이브리드 α-아밀라제 변이체:
LE174 는 (완성형 단백질)의 N-말단 35 아미노산 잔기가 BAN(완성형 단백질)의 N-말단 33 잔기로 치환되었다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:4 로 제시된 Bacillus licheniformis α-아밀라제인 터마밀 서열에 동일한 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제로서, SEQ ID NO:6 로 제시된 Bacillus amyloliquefaciens α-아 밀라제가 H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO:4)의 돌연변이를 더 가지는 것이다.
LE429 하이브리드 α-아밀라제 변이체:
LE429 는 (완성형 단백질)의 N-말단 35 잔기가 BAN(완성형 단백질)의 N-말단 33 잔기로 치환되었다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:4 로 제시된 Bacillus licheniformis α-아밀라제인 터마밀 서열에 동일한 하이브리드 터마밀-유사 α-아밀라제로서, SEQ ID NO:6 로 제시된 Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제가 H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEQ ID NO:4)의 돌연변이를 더 가지는 것이다. LE429 는 SEQ ID NO:2 로 제시되고, SOE-PCR(Higuchi et al.1988, 핵산 연구 16:7351)로 제조된다.
DextrozymeTM E : Aspergillus niger 및 Bacillus deramificans 의 선택균주로부터 얻을 수 있는 글루코아밀라제(AMG) 및 풀루라나제의 균형잡힌 혼합물(Novo Nordisk 로부터 구입가능)
α-아밀라제 변이체의 발효 및 정제
관련 발현 플라스미드를 포함하는 B.subtilis 균주를 -80 ℃ 스톡의 10 ㎍/ml 카나마이신으로 LB-한천 평판상에서 스트레이킹했고, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양했다. 콜로니를 500 ml 진탕 플라스크에서 10 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 100ml BPX 배지에 옮겼다.
BPX 배지의 조성물
감자 전분 100 g/l
보리 가루 50 g/l
BAN 5000 SKB 0.1 g/l
소듐 카제인네이트 10 g/l
콩가루 20 g/l
Na2HPO4, 12H2O 9g/l
PluronicTM 0.1 g/l
배양물을 5 일동안 270 rpm 으로 37 ℃ 에서 진탕했다.
세포 및 세포 부스러기를 4500 rpm 으로 20-25 분동안 원심분리하여 발효 육즙으로부터 제거한다. 그 후에, 상청액을 여과하여 완전히 투명 용액을 얻었다. 여과액을 농축하여 UF-여과기(10000 컷오프 막)상에서 세척하고, 완충액을 20 mM 아세테이트 pH 5.5 로 교환했다. UF-여과액을 S-세파로스 F.F 에 놓았고, 같은 완충액에서의 0.2 M NaCl 로 용리 단계에 의해서 용리했다. 용리액을 10 mM Tirs, pH 9.0 에 대해 전개했고, Q-세파로스 F.F.에 놓았고, 6 컬럼 부피상에 0-0.3 M NaCl 로부터 선형 구배로 용리했다. 활성(Phadebas 분석법으로 측정)을 포함하는 분획을 모아서, pH 를 pH 7.5 로 조정했고, 잔여 색상을 5 분동안 0.5% W/부피 활성 석탄으로 처리하여 제거했다.
활성 결정-(KNU)
1 킬로 α-아밀라제 단위(1 KNU)는 하기의 조건에 기초하여 α-아밀라제의 결정을 위한 Novo-Nordisk 표준 방법에서 시간당 5.26 g 전분(Merck, Amylum Solubile, Erg. B6, Batch 9947275)을 분해하는 효소량이다.
조건:
기질 수용성 전분
용매에서 칼슘 농도 0.0043 M
반응 시간 7-20 분
온도 37 ℃
pH 5.6
Novo Nordisk 의 분석 방법의 상세한 설명(AF9)이 요청으로 이용가능하다.
α-아밀라제 활성 분석법
α-아밀라제 활성은 기질로서 Phadebas
Figure 112001024347959-pct00002
정제를 사용하는 방법으로 결정된다. Phadebas 정제(Pharmacia Diagnostic에 의해 제공된 Phadebas
Figure 112001024347959-pct00003
아밀라제 시험)는 소 혈청 알부민과 완충액 물질이 혼합, 정제된 교차-결합 불용성 블루-칼라 전분 폴리머를 포함한다.
매 단일 측정의 경우에, 1 정제를 5 ml 50 mM 브리톤-로빈손 완충액(50 mM 아세트산, 50 mM 포스포르산, 50 mM 보르산, 0.1 mM CaCl2)을 포함하는 튜브에서 현탁하고, pH 를 NaOH 로 관심의 값까지 조정했다. 시험은 관심의 온도에서 물욕에서 수행했다. 시험 대상 α-아밀라제를 x ml 의 50 mM 브리톤-로빈손 완충액에 희석한다. 1 ml 의 α-아밀라제 용액을 5 ml 50 mM 브리톤-로빈손 완충액에 첨가한 다. 전분을 α-아밀라제로 가수분해하여 수용성 블루 단편을 생성한다. 620 nm 에서 분광광도계적으로 측정된 결과적인 블루 용액의 흡광도는 α-아밀라제 활성의 기능이다.
10 분 또는 15 분의 인큐베이션(시험 시간)후에 측정된 620 nm 흡광도는 620 nm 에서 0.2 내지 2.0 흡광도 단위의 범위라는 것이 중요하다. 이 흡광도 범위에서, 활성 및 흡광도 사이에 상관관계가 있다(Lambert-Beer 법칙). 그러므로, 효소의 희석은 이 기준에 적합하게 조정되어야만 한다. 조건의 특정화된 고정하에서(온도, pH, 반응시간, 완충액 조건) 1mg의 허여된 α-아밀라제는 어떤 양의 기질을 가수분해할 것이고, 블루 색상을 나타낼 것이다. 색상 강도는 620 nm 에서 측정된다. 측정된 흡광도는 허여된 고정 조건하에서 문제의 α-아밀라제의 특정 활성(순수한 α-아밀라제 단백질의 활성/mg)에 직접 비례한다.
비활성도의 결정
비활성도는 활성/mg 효소로서 파데바스(Phadebas) 분석법(Pharmacia) 을 사용하여 결정한다.
pH 활성 프로파일(pH 안정성)의 측정
변이체를 20 mM TRIS pH 7.5, 0.1 mM, CaCl2 에서 저장했고, 30 ℃, 50 mM 브리톤-로빈손, 0.1 mM CaCl2 에서 시험했다. pH 활성을 상기에 개시된 Phadebas 분석법을 사용하여 pH 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 8.0, 9.5, 10, 및 10.5 에서 측정한다.
AGU 활성 및 AGU/mg 의 결정
하나의 노보 아밀로글루코시다제 단위(AGU)는 37 ℃ 및 pH 4.3 에서 분당 1 ㎛ 말토스를 가수분해하는 효소양으로 정의된다. 분석 방법(AEL-SM-0131)의 상세한 설명은 Novo Nordisk 에 요청하여 구입할 수 있다.
활성은 Boehringer Mannheim, 124036 으로부터 글루코스 GOD-Perid 키트를 사용하여 AEL-SM-0131 후에 변형된 방법으로 AGU/ml 로 결정된다. 표준: AMG-표준, 배치 7-1195, 195 AGU/ml.
375 ㎕ 기질(50 mM 소듐 아세테이트에서 1 % 말토스, pH 4.3)을 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션했다. 소듐 아세테이트에서 희석된 25 ㎕ 효소를 첨가했다. 반응을 100 ㎕ 0.25 M NaOH 를 첨가함으로서 10 분 후에 중단시켰다. 20 ㎕ 를 96 웰 마이크로티터 플레이트에 옮겼고, 200 ㎕ GOD-Perid 용액을 첨가했다. 30 분후에, 실내온도, 650 nm 에서 흡광도를 측정했고, 활성을 AMG-표준으로부터 AGU/ml 로 계산했다.
그 다음, AUG/mg 의 비활성도를 단백질 농도(mg/ml)로 나누어진 활성 (AGU/ml)으로부터 계산된다.
실시예 1
본 발명에 따른 터마밀 변이체의 제조
터마밀(B.licheniformis α-아밀라제 SEQ ID NO:4)은 B.subtilis 에서 pDN1528 로 표시된 플라스미드로부터 발현된다. 플라스미드는 터마밀, amyL 를 코 드화하는 완전한 유전자를 포함하고, 그것의 발현은 플라스미드 자신의 프로모터에 의해 지시된다. 플라스미드는 플라스미드 pUB110 으로부터 복제 기점, ori, 및 클로람페니콜 내성을 부여하는 플라스미드 pC194 로부터 cat 유전자를 더 포함한다. pDN1428 은 WO96/23874 의 도 9 에서 보여진다. SEQ ID NO:3 의 코드 영역의 대부분을 포함하는 특정 돌연변이유발 벡터를 제조한다. pJeEN1 으로 표시되는 벡터의 중요한 특징은 pUC 플라스미드에서 기원한 복제기점, 클로람페니콜 내성을 부여하는 cat 유전자, 및 bla 유전자의 프레임쉬프트-함유 버전, 일반적으로 암피실린 내성을 부여하는 야생형(ampR 표현형)을 포함한다. 돌연변이유발 버전은 ampS 표현형을 초래한다. 플라스미드 pJeEN1 은 WO 96/23874 의 도 10 에 도시되고, E.coli 복제기점, ori, bla, cat, 터마밀 아밀라제 유전자의 5'-절단형 버전, 선택된 제한 부위가 플라스미드에 표시된다.
돌연변이는 "선택 프라이머"(프라이머 #6616; 하기 참조)결합을 가진 플라스미드가 Deng 및 Nickoloff 에 의해 개관된 제한 효소 절단에 의한 선택을 채택하는 대신에, 회복된 bla 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 형질전환된 E.coli 세포의 ampR 표현형에 기초하여 선택된다는 것을 제외하고는 Deng 및 Nickoloff (1992, Anal.Biochem.200,pp.81-88)에 개시된 방법으로 amyL 에 도입된다. 돌연변이유발에 사용된 화학제 및 효소는 Startagene(카타로그 번호 200509)의 ChameleonO 돌연변이유발에 의해 얻었다.
변이체 플라스미드에서 DNA 서열을 확인한 후에, 바람직한 변형을 포함하는 절단된 유전자를 PstI-EcoRI 단편으로 pDN1528 에 서브클론하고, 변이체 효소를 발현하기 위해서 프로테아제- 및 아밀라제-결핍 Bacillus subtilis 균주 SHA273 (WO 92/11357 및 WO95/10603)를 형질전환시켰다.
터마밀 변이체 V54W 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG (SEQ ID NO: 9)
터마밀 변이체 A52W + V54W 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG (SEQ ID NO: 10)
프라이머 # 6616 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독; P 는 5' 포스페이트를 나타냄):
P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C (SEQ ID NO: 11)
터마밀 변이체 V54E 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG (SEQ ID NO: 12)
터마밀 변이체 V54M 을 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG (SEQ ID NO: 13)
터마밀 변이체 V54I 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG (SEQ ID NO: 14)
터마밀 변이체 Y290E 및 Y290K 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C (SEQ ID NO: 15)
Y 는 C 및 T 의 동등한 혼합물을 나타낸다. 위치 290 에서 글루타메이트 또는 리신을 코드화하는 코돈의 존재는 DNA 서열결정으로 증명되었다.
터마밀 변이체 N190F 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C (SEQ ID NO: 16)
터마밀 변이체 N188P + N190F 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC (SEQ ID NO: 17)
터마밀 변이체 H140K + H142D 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG (SEQ ID NO: 18)
터마밀 변이체 H156Y 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG (SEQ ID NO: 19)
터마밀 변이체 A181T 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC (SEQ ID NO: 20)
터마밀 변이체 A209V 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC (SEQ ID NO: 21)
터마밀 변이체 Q264S 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC (SEQ ID NO: 22)
터마밀 변이체 S187D 를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC (SEQ ID NO: 23)
터마밀 변이체 델타(K370-G371-D372)(즉, 아미노산 잔기 번호 370, 371, 및 372 의 결실)를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC (SEQ ID NO: 24)
터마밀 변이체 델타(K372-G373-D374)를 하기의 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 제조했다 (5'에서 3', 왼쪽에서 오른쪽으로 해독):
PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C (SEQ ID NO: 25)
터마밀 변이체 A181T 및 A209V 를 1116 bp 의 단편 및 3850 bp 의 벡터-부분 (즉, 플라스미드 복제 기점 포함)을 유발하도록 pDN1528-유사 플라스미드를 2 번 절단하는 제한 효소 ClaI 로 A181T-함유 pDN1528-유사 플라스미드 (즉, amyL 내에 A181T 변형을 초래하는 돌연변이를 포함하는 pDN1528) 및 A209V-함유 pDN1528-유사 플라스미드(즉, amyL 내에 A209V 변형을 초래하는 돌연변이를 포함하는 pDN1528)를 절단함으로써 A181T +A209V 에 결합시킨다. A209V 돌연변이를 포함하는 단편 및 A181T 돌연변이를 포함하는 벡터 부분을 아가로스 겔 상에서 분리한 후에 QIAquick 겔 추출 키트(QIAGEN 으로부터 구입)로 정제했다. 단편 및 벡터를 연결하여 상기에 언급된 프로테아제 및 아밀라제 결실 Bacillus subtilis 균주를 형질전환시켰다. amy+ 로부터의 플라스미드(한천-평판을 포함하는 전분상의 투명대) 및 클로람페니콜 내성 형질전환체를 플라스미드상의 양 돌연변이 존재에 관하여 분석했다.
상기에 개시된 것과 유사한 방법으로, H156Y 및 A209V 를 제한 엔도뉴클레아제 Acc65I 및 EcoRI 을 사용하여 결합시켜서, H156Y + A209V 를 생성했다.
H156Y +A209V 및 A181T+A209V 를 제한 엔도뉴클레아제 Acc65I 및 HindIII 를 사용하여 결합시켜서, H156Y+ A181T+A209V 를 생성했다.
터마밀 변이체 H156Y + A181T+ A209V 의 완성형 부분의 35 N-말단 잔기를 하기와 같이 SOE-PCR 접근법(Higuchi et al. 1988, 핵산 리서치 16: 7351)에 의해서 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 33 N-말단 잔기(SEQ ID NO: 4)(본원에서 BAN 으로 명명)로 치환했다.
프라이머 19364 (서열 5'-3'): CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG (SEQ ID NO: 26)
프라이머 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG (SEQ ID NO: 27)
프라이머 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC (SEQ ID NO: 28)
프라이머 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC (SEQ ID NO: 29)
표준 PCR, 폴리머라제 사슬 반응을 제조자의 지시에 따라 Boehringer 메카니즘으로부터 Pwo 열안정성 폴리머라제 및 온도 사이클러를 사용하여 수행했다: 94℃ 에서 5 분, (94 ℃ 에서 30 초, 50 ℃ 에서 45 초, 72 ℃ 에서 1 분) 25 사이클, 72 ℃ 에서 10 분.
약 130 bp 의 단편을 B.amyloliquefaeiens α-아밀라제를 코드화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편상에서 프라이머 19364 및 19362 를 가지고 PCR1 으로 표시된첫번째 PCR 에서 증폭했다.
약 400 bp 단편을 주형 pDN1528 상에서 프라이머 19363 및 1C 를 가지고 PCR2 로 표시된 다른 PCR 에서 증폭했다.
PCR1 및 PCR2 를 아가로스 겔로부터 정제했고, 프라이머 19364 및 1C 를 가지고 PCR3 에서 주형으로 사용하여 약 520 bp 의 단편을 유발했다. 따라서, 단편은 35 번째 아미노산으로부터 터마밀을 코드화하는 DNA 의 부분에 융합된 BAN 으로부터 N-말단을 코드화하는 DNA 부분을 포함한다.
520 bp 단편을 제한 엔도뉴클레아제 PstI 및 SacII 로 절단하여 pDN1528-유사 플라스미드(터마밀 변이체 H156Y + A181T +A209V 를 코드화하는 유전자 포함)에 서브클론하고 연결하여, 상기에 개시된 B.subtilis 균주를 형질전환시켰다. 제한 부위 PstI 및 SacII 간의 DNA 서열을 amy+ 및 클로람페니콜 내성 형질전환체로부터 추출된 플라스미드에서 DNA 서열결정에 의해 확인했다.
BAN 및 H156Y + A181T + A209V 의 올바른 N-말단을 포함하는 최종 구조체는 BAN (1-35) + H156Y+ A181T + A209V 로 표시된다.
N190F 는 pJeEN1 의 amyL 서열이 터마밀 변이체 BAN(1-35) + H156Y + A181T + A209V 를 코드화하는 DNA 서열에 의해 치환된다는 것을 제외하고는 상기에 개시된 돌연변이유발을 수행함으로써 BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V 와 결합되어, BAN(1-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V 를 유발한다.
Q264S 는 pJeEN1 의 amyL 서열이 터마밀 변이체 BAN(1-35) + H156Y + A181T + A209V 를 코드화하는 DNA 서열에 의해 치환된다는 것을 제외하고는 상기에 개시된 돌연변이유발을 수행함으로써 BAN(1-35) + H156Y+ A181T + A209V 와 결합되어, BAN(1-35) + H156Y+ A181T + A209V + Q264S 를 유발한다.
BAN(1-35) + H156Y + A181T + A209V + Q264S 및 BAN(1-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V 는 제한 엔도뉴클레아제 BsaHI (BsaHI 부위는 A209V 돌연변이 가까이에 도입된다) 및 PstI 를 이용하여 BAN(1-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S 에 결합된다.
I201F 를 상기에 개시된 돌연변이유발을 수행함으로써 BAN (1-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S 와 결합시켜서, BAN(1-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + I201F (SEQ ID NO: 2)를 유발한다. 돌연변이유발 프라이머 AM100 를 사용하여 I201F 치환을 도입함과 동시에, 용이한 핀-포인트 돌연변이를 용이하게 하는 Cla I 제한 부위를 제거했다.
프라이머 AM100:
5'GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3' (SEQ ID NO: 30)
실시예 2
본 발명에 다른 변형된 절단 패턴을 가지는 터마밀-유사 α-아밀라제 변이체의 제조
열안정성 B.licheniformis α-아밀라제 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amylolipuefaciens 로부터 유도된 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함하고, 다음의 돌연변이를 더 포함한다: H145Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + 211F(변이체의 제조는 실시예 1 에 개시되고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 에 제시된다.)는 분지점 가까운 기질 절단력이 감소된다.
상기 α-아밀라제 변이체의 분지점에 가까운 기질을 절단력의 감소성을 더욱 개선하기 위해서, 부위 특이적 돌연변이유발를 Sarkar 및 Sommer, 1990 (BioTec hniques 8:404-407) 에 개시된 Mega-프라이머 방법을 사용하여 수행했다.
LE313의 제조: BAN/Termamyl 하이브리드+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+ V54N:
유전자 특이적 프라이머 27274 및 돌연변이성 프라이머 AM115 가 pDN1528-유사 플라스미드(SEQ ID NO:4 로부터 아밀라제 코드화 유전자에서 BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S 돌연변이를 포함)로부터 약 440 bp DNA 단편을 PCR 로 증폭시키는 데 사용된다. 440bp 단편을 아가로스 겔로부터 정제하여, 같은 주형상에서 수행된 두번째 PCR 에서 프라이머 113711 과 함께 Mega-프라 이머로서 사용했다.
결과적인 약 630 bp 단편을 제한 효소 EcoR V 및 Acc65 I 로 절단하고, 결과적인 약 370 bp DNA 단편을 정제하여 같은 효소로 절단된 pDN1528-유사 플라스미드와 연결한다. 수용성 Bacillus subtilis SHA273 (저 아밀라제 및 저 프로테아제)세포는 연결로 형질전환되고, 클로람페니콜 내성 형질전환체가 DNA 서열결정으로 확인되어 플라스미드상의 올바른 돌연변이의 존재를 증명한다.
프라이머 27274:
5'CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3' (SEQ ID NO: 31)
프라이머 1B:
5'CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3' (SEQ ID NO: 32)
프라이머 AM115: 5'GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEQ ID NO: 33)
LE314 의 제조: BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+ A209V+Q264S + A52S 가 돌연변이성 프라이머 AM116 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM116:
5'GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEQ ID NO: 34)
LE315 의 제조 : BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+ A209V+Q264S + A52S+V54N 가 돌연변이성 프라이머가 AM117 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM117:
5'GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEQ ID NO: 35)
LE316 의 제조 : BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+ A209V+Q264S + T49L 가 돌연변이성 프라이머가 AM118 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AMI 18:
5'GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3' (SEQ ID NO: 36)
LE317 제조 : BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+ A209V+Q264S+ T49L+G107A 가 돌연변이성 프라이머 AM118 및 돌연변이성 프라이머 AM119 가 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM119:
5'CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3' (SEQ ID NO: 37)
LE318 의 제조: BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+ A209V+Q264S+ A52S+V54N+T49L+G107A 가 돌연변이성 프라이머 AM120 및 돌연변이성 프라이머 AM119 이 동시에 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM120:
5'GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3' (SEQ ID NO: 38)
LE 319 의 제조 : BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + A52S+V54N+T49L 가 돌연변이성 프라이머가 AM120 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
LE320 의 제조: BAN/터마밀 하이브리드 +H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S+ G107A 가 돌연변이성 프라이머가 AM119 가 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
LE322 의 제조: BAN/터마밀 하이브리드 +H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S+ Q51R+A52S 가 돌연변이유발 프라이머가 AM121 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM121:
5'GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3' (SEQ ID NO: 39)
LE323 의 제조: BAN/터마밀 하이브리드 + H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S+ A52N 가 돌연변이성 프라이머가 AM122 이 사용된다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행된다.
AM122:
5'GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3' (SEQ ID NO: 40)
실시예 3
LE429 변이체의 시험(당화)
표준 반응 조건은:
기질 농도 30% w/w
온도 60℃
초기 pH (60 ℃) 5.5
효소 투여량
글루코아밀라제 0.18 AGU/g DS
풀루라나제 0.06 PUN/g DS
α-아밀라제 10 ㎍ 효소/g DS
DextrozymeTM E 는 글루코아밀라제 및 풀루라나제 활성 제공에 사용되었다.
당화용 기질을 탈이온수에서 일반적인 옥수수 전분을 용해시키고, 건조 물질을 약 30 % w/w 로 조정하여 준비했다. pH 를 5.5 로 조정했고(60 ℃ 에서 측정), 10 g 건조량에 해당하는 물질의 알리쿼트를 블루 캡 유리 플라스크에 옮겼다.
그 다음, 플라스크를 60 ℃ 에서 평형화된 진탕 물욕에 놓고, 효소를 첨가했다. 필요한 경우 pH 를 5.5 로 재조정했다. 48 시간의 당화후에 샘플을 채취했다; pH 를 약 3.0 으로 조정한다음, 끓는 물욕에서 15 분동안 가열하여 효소를 불활성화시킨다. 냉각후에, 샘플을 회전식 믹서상에서 30 분동안 약 0.1 g 혼합 기저 이온 교환 수지(BIO-RAD 501 X8(D))로 처리하여, 염 및 수용성 N 을 제거했다. 여과후에, 카보히드레이트 조성물을 HPLC 로 결정했다. 다음의 결과를 얻었다.
변이체에 대한 모 α-아밀라제는 LE429 이다.
첨가된 α-아밀라제 변이체 DP1 DP2 DP3 비활성도 (NU/mg)
V54N 96.1 1.75 1.18 8200
A52S 95.9 1.80 1.11 18800
A52S+V54N 96.3 1.84 1.08 10000
T49L 96.3 1.77 1.11 12300
T49L+G107A 96.4 1.87 0.72 13600
A52S+V54N+T49L+G107A 80.5 2.55 0.43 10000
A52S+B54N+T49L 95.8 1.76 0.84 8400
G107A 94.4 1.89 1.04 19600
Q52R+A52S 95.9 1.77 1.27 16500
A52N 95.5 1.89 1.56 17600
LE174(대조군) 95.9/ 95.8 1.87/ 1.83 1.17/ 1.35 16000
대조군과 비교할 때, 당화동안 본 발명의 활성 α-아밀라제 변이체의 존재는 감소된 파노스 수준을 초래한다(DP3).
특히, LE429 의 T49L + G107A 변이체 및 LE429 의 A52S + V54N + T49L 변이체 각각은 급격히 감소된 판노스 수준(DP3)을 초래한다. α-아밀라제 변이체가 전분 액화에 사용된다면, 당화의 개시전에 효소를 반드시 불활성화시킬 필요는 없을 것이다.
실시예 4
LE429 변이체의 액화 및 당화
실시예 3 의 실험을 같은 조건하에서 많은 다른 LE429 변이체에 대해 반복했다.
결과는 하기에 제시된다.
변이체/당 프로파일 DP1 DP2 DP3 DP4+
T49V+G107A 95.9% 1.72% 1.27% 1.11%
T49Y+G107A 95.3% 1.73% 1.29% 1.65%
T49N+G107A 95.7% 1.64% 1.51% 1.18%
T49L+A52S+G107A 95.7% 1.73% 0.95% 1.67%
T49L+A52T+G107A 95.8% 1.66% 1.03% 1.48%
T49L+A52F+G107A 95.7% 1.69% 1.16% 1.42%
T49L+A52L+G107A 95.5% 1.70% 1.40% 1.38%
T49L+A52I+G107A 95.9% 1.72% 1.31% 1.07%
T49L+A52V+G107A 94.7% 1.69% 1.16% 2.44%
T49L+A52V+G107A+A111V 94.5% 1.75% 0.72% 2.99%
LE429 94.9% 1.71% 1.85% 1.51%
실시예 5
실시예 3 의 실험을 액화는 95 ℃, pH 6.0 에서 수행되고, 당화는 60 ℃, pH 4.5, 40 ppm CaCl2 에서 수행된 다음 불활성화한다는 것을 제외하고는 많은 LE429 변이체에 대해 반복했다. 하기에 언급된 변이체가 L3429 변이체이다. 관찰된 결과는 하기와 같다.
변이체/당 프로파일 DP4+ DP3 DP2 DP1
T49F 1.15 0.92 1.83 96.12
T49D+G107A 0.84 1.03 1.82 96.3
T49I+G107A 0.97 0.64 1.84 96.55
T49L+G107A 0.96 0.81 1.82 96.42
T49L+A52S+G107A 1.37 0.75 1.88 96.01
T49L+A52T+G107A 0.87 0.81 1.8 96.52
T49L+A52F+G107A 0.98 0.83 1.87 96.31
T49V+G107A 0.65 0.8 2.13 96.43
T49Y+G107A 0.83 0.94 1.89 96.35
LE429 1.16 1.21 1.77 95.87
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atccgctgga ttccccggag aattgaaatg aaagatctca agcccgcttt tttcattatt 360 gccgcgacaa atgaccgagg cgtgaatcag gagatagccg caaacgcttc tgaaacgcag 420 ctggtcaact gtgtaagcaa ggctgaacaa ggcagcgtat atatgccgaa gatcatccgc 480 aaagggcgca ttcaagtatc agtatcaaca agcggggcaa gccccgcaca tacgaaaaga 540 ctggctgaaa acattgagcc tttgatgact gatgatttgg ctgaagaagt ggatcgattg 600 tttgagaaaa gaagaagacc ataaaaatac cttgtctgtc atcagacagg gtatttttta 660 tgctgtccag actgtccgct gtgtaaaaaa taggaataaa ggggggttgt tattatttta 720 ctgatatgta aaatataatt tgtataagaa aatgagaggg agaggaaaca tgattcaaaa 780 acgaaagcgg acagtttcgt tcagacttgt gcttatgtgc acgctgttat ttgtcagttt 840 gccgattaca aaaacatcag cc gta aat ggc acg ctg atg cag tat 886 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr 1 5 ttt gaa tgg tat acg ccg aac gac ggc cag cat tgg aaa cga ttg cag 934 Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln 10 15 20 aat gat gcg gaa cat tta tcg gat atc gga atc act gcc gtc tgg att 982 Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile 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Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala 290 295 300 Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 305 310 315 320 Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln 325 330 335 Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly 405 410 415 Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val 435 440 445 Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr 485 490 495 Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val 500 505 510 Ala Trp Pro 515 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 9 ggtcgtaggc accgtagccc caatccgctt g 31 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 10 ggtcgtaggc accgtagccc caatcccatt ggctcg 36 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 11 ctgtgactgg tgagtactca accaagtc 28 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 12 ggtcgtaggc accgtagccc tcatccgctt g 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 13 ggtcgtaggc accgtagccc atatccgctt g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 ggtcgtaggc accgtagcca atatccgctt g 31 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 gcagcatgga actgctyatg aagaggcacg tcaaac 36 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 catagttgcc gaattcaggg gaaacttccc aatc 34 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 ccgcgccccg ggaaatcaaa ttttgtccag gctttaatta g 41 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 19 caaaatggta ccaataccac ttaaaatcgc tg 32 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 cttcccaatc ccaagtcttc ccttgaaac 29 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 cttaatttct gctacgacgt caggatggtc ataatc 36 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 cgcccaagtc attcgaccag tactcagcta ccgtaaac 38 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 gccgttttca ttgtcgactt cccaatccc 29 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 ggaatttcgc gctgactagt cccgtacata tcccc 35 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 ggcaggaatt tcgcgacctt tcgtcccgta catatc 36 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 26 cctcattctg cagcagcagc cgtaaatggc acgctg 36 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 ccagacggca gtaataccga tatccgataa atgttccg 38 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 cggatatcgg tattactgcc gtctggattc 30 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 ctcgtcccaa tcggttccgt c 21 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 gatgtatgcc gacttcgatt atgacc 26 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 31 catagttgcc gaattcattg gaaacttccc 30 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 32 ccgattgctg acgctgttat ttgc 24 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 gccaagcgga taacggctac ggtgc 25 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 34 gaacgagcca atcggacgtg ggctacgg 28 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 35 ggaacgagcc aatcggataa cggctacggt gc 32 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 36 gcatataagg gactgagcca agcgg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 37 caaccacaaa gccggcgctg atgcg 25 <210> 38 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 38 gcatataagg gactgagcca atcggataac ggctacggtg c 41 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 39 gaacgagccg atcggacgtg ggctacgg 28 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 40 gaacgagcca aaacgacgtg ggctacgg 28 <210> 41 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 41 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Val Trp Val Lys Gln 485 <210> 42 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 42 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Lys Arg 485 <210> 43 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 43 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485

Claims (31)

  1. SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 41, 42, 또는 43으로부터 선택되는 모 α-아밀라제의 변이체로서,
    상기 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 하기의 돌연변이:
    A52S, A52S+V54N, T49L, T49L+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A,
    A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R+A52S, A52N; 또는
    T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49N+G107A,
    T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A,
    T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A;
    T49L+A52V+G107A+A111V, 또는 T49F 중 하나 이상에 해당하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 모 α-아밀라제와 비교할 때, 분지점에 가까운 올리고당 기질의 감소된 절단력을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 모 α-아밀라제와 비교하여 개선된 기질 특이성 또는 개선된 비활성도를 더 나타내는 것을 특징으로 하는 변이체.
  9. i) SEQ ID NO:6 의 처음 37개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 445개 아미노산으로 구성된 하이브리드,
    ii) SEQ ID NO:4 의 처음 35개 아미노산이 SEQ ID NO:6 의 처음 33개 아미노산으로 치환된 하이브리드, 및
    iii) SEQ ID NO:8 의 N-말단 68개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 415개 아미노산으로 구성된 하이브리드로부터 선택되는 모 하이브리드 α-아밀라제의 변이체로서,
    상기 변이체는 SEQ ID NO:4 로 제시된 아미노산 서열에서 하기의 돌연변이:
    A52S, A52S+V54N, T49L, T49L+G107A, A52S+V54N+T49L+G107A,
    A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R+A52S, A52N; 또는
    T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49N+G107A,
    T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A,
    T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A;
    T49L+A52V+G107A+A111V, 또는 T49F 중 하나 이상에 해당하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
  10. 제 9 항에 있어서, 모 하이브리드 α-아밀라제는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniforms α-아밀라제의 C-말단 445개 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amyloliquefaciens 로부터 유도된 α-아밀라제의 N-말단 37개 아미노산 잔기를 포함하는 하이브리드 α-아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
  11. 제 10 항에 있어서, 모 하이브리드 α-아밀라제는 돌연변이: H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S (SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용) 를 더 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  12. 제 11 항에 있어서, 모 하이브리드 α-아밀라제는 돌연변이: H156Y+A181T+N19OF+A209V+Q264S+I201F (SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용)를 더 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  13. 제 1 항 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조체.
  14. 제 13 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제 13 항에 따른 DNA 구조체로 형질전환된 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제 15 항에 있어서, 세포는 박테리아 또는 균류인 미생물인 것을 특징으로 하는 세포.
  17. (i) SEQ ID NO:4 로 제시된 서열을 가지는 B.licheniformis 로부터의 α-아밀라제와, SEQ ID NO:8 로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 제 1 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체의 혼합물; 또는
    (ii) SEQ ID NO:8 로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus 로부터의 α-아밀라제와, 제 1 항 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체의 혼합물; 또는
    (iii) SEQ ID NO:8 로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 제 1 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체와, 제 1 항에 의한 하나 이상의 변이체의 혼합물
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. SEQ ID NO:8 로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 제 1 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체와, SEQ ID NO:4 로 제시된 서열을 가지는 B.licheniformis 로부터의 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. SEQ ID NO:8 로 제시된 서열을 가지는 B.stearothermophilus α-아밀라제로부터 유도된 제 1 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체와,
    i) SEQ ID NO:6 의 처음 37개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 445개 아미노산으로 구성된 하이브리드,
    ii) SEQ ID NO:4 의 처음 35개 아미노산이 SEQ ID NO:6 의 처음 33개 아미노산으로 치환된 하이브리드, 및
    iii) SEQ ID NO:8 의 N-말단 68개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 415개 아미노산으로 구성된 하이브리드로부터 선택되는 하이브리드 α-아밀라제
    의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. i) SEQ ID NO:6 의 처음 37개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 445개 아미노산으로 구성된 하이브리드,
    ii) SEQ ID NO:4 의 처음 35개 아미노산이 SEQ ID NO:6 의 처음 33개 아미노산으로 치환된 하이브리드, 및
    iii) SEQ ID NO:8 의 N-말단 68개 아미노산 및 SEQ ID NO:4 의 C-말단 415개 아미노산으로 구성된 하이브리드로부터 선택되는 하이브리드 α-아밀라제로부터 유도된 제 9 항의 하나 이상의 변이체의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 하이브리드 α-아밀라제는 SEQ ID NO:4 로 제시된 B.licheniformis α-아밀라제의 C-말단 445개 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO:6 로 제시된 B.amyloliquefaciens 로부터 유도된 α-아밀라제의 N-말단 37개 아미노산 잔기를 포함하는 하이브리드 α-아밀라제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 하이브리드 α-아밀라제는 돌연변이: H156Y+A181T+ N19OF+A209V+Q264S (SEQ ID NO:4 의 넘버링 사용)를 더 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서, 하이브리드 α-아밀라제는 돌연변이: SEQ ID NO:2 로 제시된 H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F를 더 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 17 항에 있어서, 전분 액화공정 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 17 항에 있어서, 세탁, 식기세척 또는 경표면 클린징 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 17 항에 있어서, 에탄올 제조 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 에탄올 제조는 연료 또는 음료 또는 공업용 에탄올 제조인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 17 항에 있어서, 직물 또는 섬유 또는 의복의 풀빼기 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 모체에 비하여 분지점 가까운 기질 절단력의 감소, 및 개선된 기질 특이성 또는 개선된 비활성도를 나타내는,
    SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 41, 42, 또는 43으로부터 선택되는 모 α-아밀라제의 변이체 생산 방법으로서,
    (a) 모 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열에 무작위 돌연변이유발을 일으키는 단계,
    (b) 숙주세포에서 단계 (a)에서 얻은 돌연변이화 DNA 서열을 발현하는 단계, 및
    (c) 모 α-아밀라제에 비하여 저 pH 및 저 칼슘 농도에서 안정성이 증가된 돌연변이화 α-아밀라제를 발현하는 숙주 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체 생산 방법.
  30. 제 14 항에 따른 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 세포.
  31. 제 16 항에 있어서, 세포는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus 또는 Bacillus thuringiensis 로부터 선택되는 그람 양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 세포.
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