BRPI0809096A2 - Produção aumentada de amilase através da adição n-terminal à proteína amilase madura - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO AUMENTADA DE AMILASE ATRAVÉS DA ADIÇÃO N-TERMINAL À PROTEÍNA AMILASE MADURA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELA

CIONADOS

O presente pedido de patente reivindica prioridade sobre o Pedido de Patente Provisória Americana Número de Série 60/907.174, intitulado "Produção de Amilase Aumentada por Adição de N-terminal à Proteína Amilase Madura", depositado em 23 de março de 2007.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Está incorporada neste pedido por referência uma listagem de seqüência compreendendo as SEQ ID NOS: 1 a 18.

CAMPO DA INVENÇÃO

São descritos ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos com atividade amilase, em que o polipeptídeo é modificado a partir de uma aamilase de Bacillus, tal como a partir de uma α-amilase de Bacillus Iicheniformis.

ANTECEDENTES

Amido consiste em uma mistura de amilose (15 a 30% de p/p) e 20 amilopectina (70 a 85% de p/p). Amilose consiste em cadeias lineares de unidades de glicose a-l,4 ligadas tendo um peso molecular (PM) de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 800.000. Amilopectina é um polímero ramificado contendo pontos de ramificação a-1,6 a cada 24 a 30 unidades de glicose: seu PM pode sertão alto quanto 100 milhões.

Açúcares a partir de amido, na forma de xaropes de dextrose

concentrados, são atualmente produzidos por um processo catalisado por enzima englobando: (1) liquefação (ou redução de viscosidade) do amido sólido com uma α-amilase em dextrinas que têm um grau médio de polimerização de aproximadamente 7 a 10, e (2) sacarificação do amido liqüefeito 30 resultante (por exemplo, hidrolisado de amido) com amiloglicosidase (também chamada glicoamilase ou GA). O xarope resultante tem um alto teor de glicose. A maior parte do xarope de glicose que é comercialmente produzida é posteriormente enzimaticamente isomerizada a uma mistura de dextrose/frutose conhecida como isoxarope.

α-Amilases (EC 3.2.1.1) hidrolisam amido, glicogênio e polissacarídeos relacionados pela clivagem de ligações internas a-l,4-glicosídicas 5 randomicamente. Esta enzima tem diversas aplicações comerciais importantes em, por exemplo, indústrias de açúcar, fermentação, álcool e têxtil, aAmilases são isoladas a partir de uma ampla variedade de fontes bacterianas, fúngicas, vegetais e animais. As α-amilases mais importantes industrialmente são aquelas isoladas a partir de Bacillus.

Por vários anos, enzimas α-amilase foram usadas com vários

objetivos diferentes, incluindo a liquefação de amido, desengomagem de tecido, modificação de amido na indústria de polpa e papel e para fermentação. Estas enzimas também podem ser usadas para remover manchas de amido durante a lavagem de louças e lavagem de roupas.

Bacillus Iicheniformis e outras espécies Bacillus têm uma alta

capacidade de secretar proteínas (heterólogas) (por exemplo, amilases, proteases, etc.) no meio de crescimento. Para direcionar estas proteínas para o lado de fora da célula, são sintetizadas como pré-proteínas com um peptídeo sinal amino-terminal. Em geral, peptídeos sinal, os quais são normalmente 20 de 18 a 35 aminoácidos em tamanho, não contêm seqüências consenso estritas. Entretanto, os peptídeos sinal compartilham estruturas tripartidas formadas por (1) um terminal amino positivamente carregado (domínio N) e uma região mais polar, (2) seguido por um núcleo hidrofóbico (domínio H) e (3) uma região mais polar, contendo o sítio de clivagem do peptídeo sinal 25 (domínio C). Os aminoácidos -3 e -1 (em relação ao início da proteína madura) são normalmente resíduos com pequenas cadeias laterais neutras (por exemplo, alanina, glicina e serina). Em B. subtilis, o resíduo na posição 1 da cadeia madura é na maioria dos casos, uma alanina (Tjalsma, 1999, "Signal Peptidases of Bacillus subtilis: A Functional Analysis" tese de doutorado, U30 niversidade de Groningen, ISBN 90-367-1086-3). Há observações que indicam que o processamento das pré-proteínas, isto é, clivagem do peptídeo sinal, pela peptidase sinal é um gargalo de secreção para a produção de algumas proteínas (Bolhuis, 1999, "A Genetic Analysis of Determinants for Efficient Protein Secretion in Bacillus subtilis,'' tese de doutorado, Universidade de Groningen1 ISBN 90-367-1055-3).

Dessa maneira, há uma necessidade contínua por a-amilases, em que maiores quantidades de α-amilase possam ser produzidas em um organismo. A produção aumentada levará, entre outras coisas, a preços reduzidos, custos marginais melhorados, economias da capacidade de planta e produtos com atividades maiores.

SUMÁRIO

Consequentemente, um aspecto é direcionado a variantes de a

amilase que podem ser produzidas em uma quantidade aumentada com o menor preço. Estas variantes podem ser usadas em uma variedade de composições e processos que usam a-amilases.

Um aspecto contemplado é um polipeptídeo isolado compreen15 dendo o motivo representado na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 1 sem um peptídeo sinal, tal como α-amilase madura ou variante. Dessa maneira, as seqüências polipeptídicas contempladas podem estar com o peptídeo sinal, na forma de uma pré-proteína, ou como uma proteína madura. A préproteína pode incluir peptídeos sinal da mesma espécie que produz a20 amilase, ou pode ser um heterólogo à proteína madura (isto é, em que o peptídeo sinal foi derivado de outro micro-organismo em comparação à proteína madura).

Outra modalidade contempla uma seqüência de ácido nucleico que codifica qualquer uma das seqüências polipeptídicas isoladas discutidas acima.

Ainda outro aspecto fornece um vetor compreendendo qualquer uma das seqüências de ácidos nucleicos que codificam as seqüências polipeptídicas.

Um aspecto adicional contempla uma célula isolada compreendendo a seqüência de ácido nucleico ou um vetor que compreende qualquer uma das seqüências de ácidos nucleicos acima mencionadas. A célula isolada pode ser um micro-orqanismo. O micro-orqanismo pode ser uma bactéria ou um fungo. Bactérias exemplares incluem, mas não são limitadas a uma bactéria Gram-positiva selecionada a partir do grupo composto de Bacillus subtilis, B. Hcheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B.

5 thuringiensis, Streptomyces lividans, ou S. murinus; ou uma bactéria Gramnegativa, em que a dita bactéria Gram-negativa é Escherichia coli.

São também contemplados usos para os polipeptídeos acima em composições para lavagem (em formulações manuais ou automáticas), lavagem de louça (em formulações manuais ou automáticas), desengomagem de tecido, hidrolisação de biofilmes, sacarificação de amido, liquefação de amido ou processamento de amido a partir de açúcar de cana.

Um aspecto adicional contempla um aditivo detergente compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima, em que o dito aditivo detergente está opcionalmente na forma de um granulado não-esfarelado, Ii15 quido estabilizado ou enzima protegida. O aditivo pode compreender ainda uma celulase, uma protease ou uma amilase ou uma combinação das mesmas. A amilase pode ser uma α-amilase, uma β-amilase, ou uma glicoamilase ou uma combinação das mesmas.

Ainda em um aspecto adicional contempla uma composição de20 tergente compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima mencionados. Alternativamente, a composição detergente pode compreender o aditivo detergente mencionado acima. A composição detergente pode compreender ainda uma enzima, onde a dita enzima é uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma amilase, uma celulase, uma mananase, uma pectato Iiase 25 ou uma combinação das ditas enzimas.

Outro aspecto contempla uma composição detergente de lavagem de louça manual ou automática compreendendo qualquer um dos polipeptídeos supracitados. O detergente de lavagem de louça manual ou automática pode compreender ainda uma enzima, onde a dita enzima é uma pro30 tease, uma lipase, uma peroxidase, uma amilase, uma celulase, uma mananase, uma pectato liase, ou uma combinação das ditas enzimas.

Ainda em outra modalidade, uma composição de lavagem de roupa manual ou automática compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima mencionados é contemplada. A composição de lavagem de roupa manual ou automática é ainda contemplada para compreender uma enzima, em que a dita enzima é uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma 5 amilase, uma celulase, uma mananase, uma pectato liase, ou uma combinação de enzimas.

Outra modalidade contempla uma composição de desengomagem compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima mencionados em uma solução aquosa e opcionalmente compreendendo uma enzima.

Outro aspecto contempla uma composição de processamento

de amido compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima mencionados em uma solução aquosa. A composição de processamento de amido pode compreender ainda uma glicoamilase, uma isoamilase, uma pulanase, ou uma combinação das mesmas. A composição de processamento de ami15 do pode ser usada em um método de processamento de um amido compreendendo administração da composição por um tempo suficiente para liquefazer o dito amido, ou sacarificar o dito amido, ou liquefazer e sacarificar o dito amido.

Ainda em um aspecto adicional fornece uma composição de hi20 drolisação de biofilme compreendendo qualquer um dos polipeptídeos acima mencionados, em que a dita composição está em uma solução ou gel, e opcionalmente compreende ainda uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma lipase, uma protease, uma pectinase, um agente antimicrobiano, ou uma combinação dos mesmos. Além disso, é contemplado um método de 25 hidrolisação de um biofilme compreendendo administração da composição por um período de tempo suficiente para hidrolisar parcialmente ou totalmente o dito biofilme.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos associados são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram modalidades. Nos desenhos:

FIGURA 1 é a comparação da capacidade de produção entre duas bateladas de A1T e Spezyme® FRED em B. licheniformis. FIGURA 2A é um esquema de pICatH-FREDoril. A FIGURA 2B é um esquema de plCatH-FRED(A1T)ori1.

FIGURA 3 mostra o resultado de um teste de ágar Hl de cepas de B. subtilis expressando a variante de α-amilase A1T (inferior) versus cepas expressando α-amilase FRED (Spezyme® FRED) na digestão de amilose. Digestão de amilose mostra-se aumentada na variante A1T.

FIGURA 4 representa a progressão de DE de Spezyme® FRED quando comparada com a variante A1T quando o ensaio foi realizado em pH 5,8.

FIGURA 5 representa a progressão de DE de Spezyme®

FRED quando comparada com a variante A1T sem cálcio adicionado em pH 5,8.

FIGURA 6. Spezyme® FRED (tipo selvagem) quando comparada com a variante A1T sem cálcio adicional mas em um pH de 5,4.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O pedido de patente relaciona-se com um método de aumento da quantidade de uma α-amilase de Bacillus sp. pela modificação da seqüência polipeptídica da α-amilase madura. Alternativamente, o método pode ser usado em qualquer tipo de α-amilase de Bacillus sp. de tipo selvagem 20 ou recombinante. O seguinte fornece detalhes de como isto pode ser feito, bem como composições e usos das variantes de α-amilase produzidas por meio desses.

1. Definições & Abreviaturas

Conforme esta descrição detalhada, as seguintes abreviaturas e 25 definições aplicam-se. Deve se observar que como usado neste pedido, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa maneira, por exemplo, referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzimas e a referência a "a formulação" inclui a referência para uma ou mais formulações 30 e equivalentes das mesmas conhecidas aos versados na técnica e similares.

A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm a mesmo significado que comumente entendido por um versado ordinário na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

1.1 Definições

Por "amilase" cujo propósito é incluir qualquer amilase, tal como glicoamilases, a-amilase, β-amilases e α-amilases de tipo selvagem de Bacillus sp., tais como B. Iicheniformis e B. subtilis. Cepas de produção exemplares são aquelas usadas para proteína KLM3', amilase para processamento de grão (SGA) e uma amilase para tecido e limpeza doméstica. "Amilase" deve significar uma enzima, isto é, entre outras coisas, capaz de catálise da degradação de amido. Amilases são hidrolases que clivam as ligações a-D(I—>4)0-glicosídicas no amido. Geralmente, α-amilases (EC 3.2.1.1; a-D(I—>4) glicano glicanohidrolase) são definidas como enzimas de endoatuação que clivam ligações a-D-(l—>4) O-glicosídicas dentro da molécula de amido de uma maneira randômica. Ao contrário, a exo-atuação de enzimas amilolíticas, tais como β-amilases (EC 3.2.1.2; a-D-(l—>4)-glicano maltohidrolase) e algumas amilases produto-específicas como α-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133) clivam a molécula de amido a partir da extremidade não reduzida do substrato. β-Amilases, α-glicosidases (EC 3.2.1.20; a-D-glicosídeo glicohidrolase), glicoamilase (EC 3.2.1.3; a-D-(l—>4)-glicano glicohidrolase), e amilases produto-específicas podem produzir malto-oligossacarídeos de um tamanho específico a partir de amido.

Por "variante de α-amilase", "polipeptídeo variante de aamilase" e "enzima variante" significam uma proteína α-amilase que foi modificada pela substituição de resíduos de aminoácido no terminal amino da 25 proteína α-amilase madura. Como usado neste pedido, "enzimas parentais", "seqüência parental", "polipeptídeo parental", "proteína α-amilase de tipo selvagem" e "polipeptídeos parentais" devem significar enzimas e polipeptídeos a partir dos quais os polipeptídeos variantes de α-amilase são derivados. A enzima parental pode ser uma enzima de tipo selvagem ou uma a30 amilase que tenha sido anteriormente recombinantemente projetada. A variante de α-amilase pode incluir ainda mutações na seqüência sinal do polipeptídeo α-amilase parental, ou em outro lugar no polipeptídeo a-amilase parental. Dessa maneira, o polipeptídeo α-amilase pode ser uma enzima recombinantemente projetada.

A variante de α-amilase também pode ser uma proteína de fusão, ou "híbrido" ou "proteína quimérica," compreendendo uma seqüência polipeptídica não endógena às seqüências de B. Iicheniformis ou SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a seqüência polipeptídica facilita a purificação da proteína expressa. Em outro aspecto, a seqüência heteróloga é um polipeptídeo α-amilase derivado de um gênero ou espécie diferente de B. Iicheniformis. Por exemplo, a variante de α-amilase pode compreender uma variante de uma α-amilase de B. Iicheniformis ligada ao peptídeo sinal de outra α-amilase de Bacillus, tal como, mas não limitada a B. stearothermophilus. Alternativamente, a proteína α-amilase pode compreender o peptídeo sinal de B. Iicheniformis (LAT) ligado à proteína madura de outra α-amilase de Bacillus, em que a proteína de fusão também tem a mutação de produção de enzima aumentada ocorrendo no resíduo X2 da proteína madura. Estas podem incluir substituições com qualquer aminoácido exceto um resíduo de alanina ou valina em X2. O X2 pode ter ainda aminoácidos adicionais além do resíduo de substituição da alanina. O termo "variante" pode ser usado intercambiavelmente com o termo "mutante". Variantes devem incluir polipeptídeos bem como ácidos nucleicos. Variantes devem incluir inserções; estas variantes podem conter ainda substituições, inserções, transversões, truncamentos e/ou inversões adicionais, em uma ou mais posições. Variantes podem incluir seqüências que são complementares a seqüências que são capazes de hibridizar às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido. Por exemplo, uma seqüência variante é complementar a seqüências capazes de híbridização sob condições estrigentes (por exemplo, 50°C e 0,2X SSC (1X SSC = NaCI 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0) às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido. O termo variante engloba seqüências que são complementares a seqüências que são capazes de híbridização sob condições altamente estrigentes (por exemplo, 65°C e 0,1 X SSC {1X SSC = NaCI 0,15 M, citrato de Na3 de 0,015 M, pH 7,0}) às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido. A variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70, ou qualquer valor inteiro entre esses, substituições, deleções ou inserções de aminoácidos contanto que a variante conserve atividade α-amilase. A carga superficial da variante também pode ser alterada por qualquer número. Por exemplo, o número de 5 resíduos de aminoácidos positivamente carregados na superfície enzimática pode ser reduzido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Espera-se que tais substituições de aminoácido modifiquem o ponto isoelétrico (pl) da variante, entre outras coisas. Outras características da variante podem diferenciar da enzima de tipo selvagem, como descrito neste pedido.

Por "isolado" entende-se que a seqüência é pelo menos subs

tancialmente livre de pelo menos um outro componente que a seqüência está naturalmente associada e encontrada na natureza.

Por "purificado" entende-se que o material está em um estado relativamente puro, por exemplo pelo menos aproximadamente 90% puro, ou pelo menos aproximadamente 95% puro, ou pelo menos aproximadamente 98% puro.

Por "termoestável" entende-se a capacidade da enzima de conservar a atividade após exposição a temperaturas elevadas. A termoestabilidade de uma enzima, tal como enzimas α-amilases, é medida por sua meia20 vida. A meia-vida (Un) é o tempo em minutos, horas ou dias durante os quais a metade da atividade enzimática é perdida sob condições definidas. O valor de meia-vida é calculado pela mensuração da atividade amilase residual.

Por "faixa de pH" entende-se a capacidade da enzima de exibir a atividade catalítica de condições acídicas a básicas atravessando 5 ou mais unidades de pH.

Como usado neste pedido, "pH estável" relaciona-se à capacidade da enzima de conservar a atividade em uma ampla faixa de pHs.

Como usado neste pedido, "alimento" deve incluir ambos alimentos preparados, bem como um ingrediente de um alimento, tal como farinha.

Como usado neste pedido, "ingrediente alimentício" deve incluir uma formulação, que é ou pode ser adicionada a alimentos ou gêneros alimentidos funcionais e inclui formulações usadas em baixos níveis em uma ampla variedade de produtos que requerem, por exemplo, acidificação ou emulsificação. O ingrediente alimentício pode estar na forma de uma solução ou como um sólido, dependendo do uso e/ou o modo de aplicação e/ou o modo de administração.

Como usado neste pedido, "alimento funcional" significa alimento capaz de fornecer não só um efeito nutricional e/ou uma satisfação do paladar, mas é também capaz de entregar um efeito benéfico adicional ao consumidor.

Como usado neste pedido, "seqüência de aminoácidos" é sinô

nima ao termo "polipeptídeo" e/ou ao termo "proteína". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo ao termo "peptídeo". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo ao termo "enzima"

Como usado neste pedido, "seqüência nucleotídica" ou "se

qüência de ácido nucleico" refere-se a uma seqüência oligonucleotídica ou seqüência polinucleotídica, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados dos mesmos (tais como porções dos mesmos). A seqüência nucleotídica pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, e pode ser du20 pia fita ou fita simples se representar a fita de sentido reverso ou sentido direto. Como usado neste pedido, o termo seqüência nucleotídica inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA. O DNA inclui cDNA de codificação de seqüência de um polipeptídeo α-amilase variante

Por "homólogo" e "homologia" deve ser entendido uma entidade 25 tendo certo grau de identidade com as seqüências de aminoácidos objeto e as seqüências nucleotídicas objeto. Uma seqüência homóloga é tomada para incluir uma seqüência de aminoácidos pelo menos 75%, 80%, 85% ou 90% idêntica, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência objeto. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios 30 ativos que a seqüência de aminoácido objeto

Como usado neste pedido, "hibridização" deve incluir o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se iunta com uma fita complementar através do pareamento de bases, bem como o processo de amplificação como realizado nas tecnologias de reação da polimerase em cadeia (PCR). O ácido nucleico variante de α-amilase pode existir como DNA ou RNA de fita única ou dupla, um RNA/DNA heterodúplex ou um copolímero de RNA/DNA.

Como usado neste pedido, "copolímero" refere-se a uma fita de ácido nucleico única que compreende ambos ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. O ácido nucleico variante de α-amilase pode até ser um códon otimizado para aumentar ainda a expressão.

Como usado neste pedido, "sintético" deve referir-se àquele

que é produzido por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não é limitado a ácidos nucleicos variantes de α-amilase feitos com uso ótimo de códon de organismos hospedeiros, tais como as leveduras metilotróficas Pichia, Hansènula, Streptomyces, Trichoderma reesei, ou outros hospedeiros de expressão de escolha, tais como Bacillus.

Como usado neste pedido, "célula transformada" deve incluir células que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A transformação tipicamente ocorre pela inserção de uma ou mais seqüências nucleotídicas em uma célula. A seqüência nucleotídica inserida 20 pode ser uma seqüência nucleotídica heteróloga (isto é, é uma seqüência que não é natural para a célula que deve ser transformada, tal como uma seqüência que codifica uma proteína de fusão).

Como usado neste pedido, "operacionalmente ligado" deve significar que os componentes descritos estão em uma relação que os per25 mite funcionar em sua maneira desejada. Uma seqüência regulatória operacionalmente ligada a uma seqüência de codificação é ligada de tal modo que a expressão da seqüência de codificação é realizada sob condição compatível com as seqüências de controle.

Como usado neste pedido, "biologicamente ativo" deve referirse a uma seqüência que tem uma função estrutural semelhante (mas não necessariamente no mesmo grau), e/ou função regulatória similar (mas não necessariamente no mesmo grau) e/ou função bioquímica similar (mas não necessariamente no mesmo grau) da seqüência que ocorre naturalmente.

1.2 Abreviaturas

As seguintes abreviaturas aplicam-se a menos que indicado de outra maneira:

5

A1T substituição de alanina por treonina na posição 1 (X2) de uma α-amilase de Bacillus (ou A1->T) AE álcool etoxilato AEO álcool etoxilato AEOS álcool etoxissulfato AES álcool etoxissulfato AFAU unidades de α-amilase fúngica ácida AGU unidade de atividade glicoamilase AOS a-olefinassulfonato AS álcool sulfato BSA albumina sérica bovina cDNA DNA complementar CMC carboximetilcelulose DNA ácido desoxirribonucleico DP3 grau de polimerização com três subunidades DPn grau de polimerização com n subunidades DS ou ds sólido seco DTMPA ácido dietiltriaminopenta-acético EC enzima comprometida para classificação enzimática EDTA ácido etilenodiaminotetra-acético EO óxido de etileno F&HC cuidados para casa e roupas FAU unidade de amilase fúngica GA glicoamilase HFCS xarope de milho com alta frutose HFSS xarope baseado em amido com alta frutose IPTG isopropil β-D-tiogalactosídeo LAS alquilbenzenossulfonato linear LAT relacionado à amilase de B. Iincheniformis LU unidade de Liquiphon PM peso molecular NOBS nonanoiloxibenzenossulfonato NTA ácido nitrilotriacético OxAm Purastar® HPAM 5000L PCR reação da polimerase em cadeia PEG polietileno glicol PVA polivinil álcool PVP polivinil pirrolidona RNA ácido ribonucleico SAS alcanossulfonatos secundários TAED tetraacetiletiletilenodiamina TCA ácido tricloroacético p/v peso/volume p/p peso/peso Wt tipo selvagem 2. Variantes de α-Amilase

As variantes de amilase podem ser criadas a partir de qualquer amilase de Bacillus, incluindo formas de tipo selvagens bem como formas projetadas que foram projetadas para atividade específica aumentada, perfil 5 de pH, termoestabilidade, e perfil de faixa de temperatura, exigências de íon de cálcio, e outras características aumentadas. As variantes descritas neste pedido têm capacidade de produção aumentada, em que mais proteína pode ser secretada no meio celular do que a cepa parental produziu.

O motivo destas variantes é como se segue:

NH2-X1-X2-X3-X4-Y-COOH (SEQ ID NO: 1) em que Xi é o

último aminoácido em um peptídeo sinal que varia em tamanho de 18 a 35 aminoácidos: em que 0 peptídeo sinal é tripartido na natureza com uma porção carregada no terminal amino, um domínio H que é hidrofóbico e um domínio carbóxi que é carregado; e em que o domínio X2 pode ser derivado da mesma α-amilase parental ou pode ser uma proteína heteróloga ou quiméri

ca;

Xi é o último aminoácido na seqüência sinal;

X2 é A1-B', em que quando X2 é alanina (exemplificada pela 5 SEQ ID NO: 14 e 15), A’ é qualquer aminoácido exceto alanina ou valina, e B1 é qualquer resíduo de aminoácido ou nenhum resíduo de aminoácido; quando X2 é valina, histidina, ou ácido aspártico (exemplificada pela SEQ ID NO: 16 e 17), A1 é qualquer aminoácido e B1 é qualquer resíduo de aminoácido ou nenhum resíduo de aminoácido;

X3 é asparagina, alanina, histidina ou glicina;

X4 é leucina, glicina, prolina ou asparagina; e Y é o restante da variante de α-amilase ou α-amilase bacteriana madura. Em um aspecto, X2 tem A1 como uma treonina, e B1 não é nenhum aminoácido, ou B1 é qualquer um ou mais aminoácidos até 5 resíduos. A pro15 teína madura pode estar na forma inicial de uma proteína de fusão a um peptídeo sinal derivado de outros Bacillus spp. ou da mesma espécie que a seqüência parental. Estas podem ser α-amilases de Bacillus de tipo selvagem ou α-amilases recombinantes, tais como α-amilases similares a Teramyl, bem como as descritas nas Patentes Norte-americanasNos. 6.979.731;

6.338.959; 6.638.748; 6.440.716; 5.989.169; 6.022.724; 6.197.565; 6.887.986; 6.162.628; 6.482.622; 6.876.932; 6.093.562; 6.297.038; 6.867.031; 5.824531; 5.856.164; 6.939.703; 6.218.164; 6.432.689; 5.316.691; 5.429.766; 6.197.565; 6.617.143; 6.916.645, 6.403.355; 6.982.159; 7.005.289; 7.041.488; 7.045.332; 6.001639; 6.387.690; 6.855.531; 5.912.157; 6.117.664; e Publicações Americanas Nos. 2005176000 2005181493; 2005250663; 2005261156; 2005261158; 2006014265; 2006019856; 2006051849; 2005214920; e Pedidos de Patente Internacional PCT. Nos. WO 06/002643; WO 94/02597; WO 94/18314; WO 96/23873; WO 97/43424; WO 97/41213; WO 99/19467; WO 95/26397; WO 30 99/19467; e Patentes Européias Nos. 1050579; EP 1131418; EP 1226236; EP 1307547; EP 815209; EP 753057; EP 772684; EP 850307; e EP 749473. São também contemplados ácidos nucleicos que codificam as várias variantes de α-amilase, tais como mas não limitados a α-Amilase de Bacillus sp. A7-7 (DSM12368), α-amilase Stainzyme®, α-amilase de Bacillus sp. AA560 (SEQ ID NO: 24 da Patente Norte-americana No. 6.528.298), α-amilase de B. halmapalus (SEQ ID NO: 2 da Patente Norte-americana No. 6.093.562, 5 Natalase®), α-amilase de Bacillus sp. no. 707, α-amilase de Bacillus sp. KSM-AP1378 (Número de Acesso no GenBank AX428291 e SEQ ID NO: 3 da EP 1199356), α-amilase de Bacillus sp. KSM-K38 (SEQ ID NO: 4 da Patente Norte-americana No. 6.403.355), α-amilase de Bacillus sp. KSM-K36 (SEQ ID NO: 2 da Patente Norte-americana No. 6.403.355; Número de A10 cesso no GenBank AAN18957), α-amilase de B. clausii KSM-K16, a-amilase de B. halodurans, α-amilase de B. clausii BT-21 (Número de Acesso no GenBank

AX037557), α-amilase de B. amyloliquefaciens, SEQ ID NO: 2 da Patente Norte-americana No. 5.856.164, α-amilase OxAm®, Duramyl® e α-amilase de B. stearothermophilus.

Para secretar proteínas em B. licheniformis, o peptídeo sinal de α-amilase de B. licheniformis (LAT) é frequentemente usado. Entretanto, proteínas sinal de outras α-amilases de Bacillus também podem ser substituídas. A seqüência de aminoácidos do peptídeo sinal de LAT é: MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA (SEQ ID NO: 2).

Um sítio de clivagem deste peptídeo sinal combina com o motivo geral como descrito acima: Ala-Ser-Ala/Ala. Foi observado que a produção/secreção de Spezyme® FRED (um mutante de α-amilase de B. licheniformis) foi aumentada em mais de 20% pela substituição da alanina na posi25 ção +1 (X2) com treonina. Dessa maneira, a parte do gargalo da secreção de proteínas translocadas pelo peptídeo sinal de LAT é superada pela alteração do sítio de clivagem de Ala-Ser-Ala/Ala para Ala-Ser-Ala/Thr. Dessa maneira, um aspecto prevê proteínas recombinantes onde X2 é qualquer aminoácido exceto alanina ou valina. Por exemplo, X2 pode ser treonina. Outro as30 pecto contempla ter uma substituição de dois aminoácidos na posição X2, em que X2 é A-B,(exemplificada pela SEQ ID NO: 13) em que A é qualquer aminoácido exceto alanina ou valina, e B é qualquer aminoácido incluindo alanina. "B" também pode ser nenhum resíduo e "A" ser qualquer aminoácido exceto alanina ou valina. Por exemplo, a seqüência na ligação do peptídeo sinal e a cadeia madura pode ser: Ala-Ser-Ala/Thr-Ala (SEQ ID NO: 18), em que Thr-Ala é o A-B introduzido em X2. O sítio de clivagem neste caso é 5 o mesmo que aquele obtido pela substituição de alanina em +1 com Thr: Ala-Ser-Ala/Thr. A adição de um resíduo de treonina (ou outro resíduo exceto Ala) no lado N-terminal da cadeia madura de α-amilase de Bacillus, tal como Spezyme® FRED, ou qualquer outra proteína heteróloga translocada pelo peptídeo sinal de LAT é contemplada para resultar na produ10 ção/secreção aumentada.

2.1 Caracterização da Variante de a-Amilase Variantes enzimáticas podem ser caracterizadas por seqüências de ácido nucleico e polipeptídicas, pelas suas estruturas secundárias, terciárias, e/ou quaternárias, e/ou pela sua atividade específica. Características 15 adicionais da variante de α-amilase incluem estabilidade, dependência de íon de cálcio (Ca+2), faixa de pH, estabilidade à oxidação e termoestabilidade. As variantes de α-amilase de produção aumentada terão essencialmente as mesmas características que a proteína parental, por exemplo, a mesma atividade específica.

Em um aspecto, mutações (incluindo substituições e deleções

de aminoácido além dos aminoácidos substituídos ou adicionados para aumentar a produção de proteína) são de importância no que se refere ao alcance de estabilidade alterada, em particular, estabilidade melhorada (isto é, maior ou menor), a temperaturas especialmente altas (isto é, 70 a 120°C) e/ou pH extremo (isto é, pH baixo ou alto, isto é, pH 4,0 a 6,0 ou pH 8,0 a

11,0, respectivamente), e concentrações de cálcio abaixo de 60 ppm (isto é, não ligado, por isso em solução).

Estabilidade de Ca2+ alterada significa que a estabilidade da enzima sob depleção de Ca2+ foi melhorada, isto é, estabilidade maior ou menor. Mutações (além do Thr-Ala ou A-B introduzidos na posição X2 no terminal amino da proteína madura) de importância são aquelas que alcançam estabilidade de Ca2+ alterada, especialmente estabilidade melhorada de Ca2+, isto é, estabilidade maior ou menor, em pH especialmente alto (isto é, 5 pH 8,0 a 10,5). Dessa maneira, os mutantes com a capacidade de produção aumentada podem incluir ainda mutações que aumentam a estabilidade ao íon de cálcio.

Em um aspecto adicional, mutações importantes (incluindo substituições e deleções de aminoácidos) com respeito à obtenção de vari10 antes que exibem atividade específica alterada, em particular, atividade específica aumentada ou reduzida além da capacidade de produção aumentada, obtida pela mutação X2, especialmente a temperaturas de 10 a 60°C, 20 a 50°C e 30 a 40°C para uso em composições de limpeza. As faixas de temperatura de atividade específicas para assar produtos podem ser mais altas. 15 Variantes de α-amilase também podem ter estabilidade à oxida

ção alterada, em particular, estabilidade à oxidação mais alta, em comparação com a α-amilase parental. Estabilidade à oxidação aumentada é vantajosa, por exemplo, nas composições detergentes e estabilidade à oxidação reduzida podem ser vantajosas na composição para liquefação de amido.

A variante de α-amilase também pode ter uma mutação para

termoestabilidade. Tais variantes de α-amilase podem ser usadas no cozimento ou sob outras condições que necessitam de temperaturas elevadas. Por exemplo, a variante de α-amilase pode degradar o amido a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C ou mais. A variante de 25 α-amilase pode conservar sua atividade após exposição a temperaturas de até aproximadamente 95°C.

Os polipeptídeos variantes de α-amilase descritos neste pedido também podem ter mutações que estendem a meia-vida quanto à enzima parental em, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 30 90%, 100%, 200% ou mais, e em temperaturas elevadas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 95°C ou mais, tal como a aproximadamente 80°C ou mais. Por exemplo, a variante de α-amilase pode ser aquecida por aproximadamente 1 a 10 minutos a 80°C ou mais

O polipeptídeo variante de α-amilase tem a mesma estabilidade polipeptídica que a seqüência parental da qual ele deriva. Entretanto, mutações adicionais contemplam aumentar a estabilidade bem como aumentar a 5 produção da enzima, pode ser combinado com aqueles descritos neste pedido para a posição X2.

Dessa maneira, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo variante de α-amilase também pode compreender uma ou mais mutações além das estabelecidas acima. Outras mutações, tais como deleções, inserções, 10 substituições, transversões, transições e inversões, em uma ou mais posições exceto X2, também podem ser incluídas para ter uma ou mais das características acima como necessário. Do mesmo modo, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico pode estar faltando em pelo menos uma das substituições apresentadas acima.

O polipeptídeo variante de α-amilase codificado pelo ácido nu

cleico pode ter a mesma ou diferente estabilidade ao pH que a seqüência parental. Por exemplo, a variante também pode ter mutações que conferem uma maior faixa de estabilidade ao pH, ou desloca a faixa de pH para uma faixa desejada do objetivo comercial final da enzima. A variante é capaz de 20 degradar amido em um pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,5. As condições de pH específicas podem ser qualquer pH a partir de pH

5,0 ao pH 10,5. O polipeptídeo variante de α-amilase codificado pelo ácido nucleico pode ter uma meia-vida mais longa, ou atividade mais alta (dependendo do ensaio) quando comparado com o polipeptídeo parental sob con25 dições idênticas ou pode ter a mesma atividade que o polipeptídeo parental. O polipeptídeo variante de α-amilase também pode ter aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou meiavida mais longa quando comparado com seu polipeptídeo parental sob condições de pH idênticas. Alternativamente, ou além disso, a variante enzimá30 tica pode ter atividade mais alta quando comparada ao polipeptídeo parental sob condições de pH idênticas. Em outras modalidades, um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico que codifica qualquer uma das variantes de α-amilase apresentadas neste pedido é fornecido. Adicionalmente, um ácido nucleico capaz de híbridização ao complemento é fornecido. Em outro aspecto, um ácido 5 nucleico que codifica os equivalentes funcionais capazes de híbridização especificamente a qualquer uma das seqüências estabelecidas acima é fornecido neste pedido, bem como seu complemento.

Em uma modalidade adicional, a seqüência para uso nos métodos e composições descritas neste pedido é uma seqüência sintética. Inclui, mas não é limitada a seqüências feitas com uso ótimo de códon para expressão em organismos hospedeiros--tais como leveduras metilotróficas Pichia e Hansenula.

3. Produção de Variantes de a-Amilase

Uma seqüência de DNA que codifica a variante enzimática pro15 duzida por métodos descritos neste pedido, ou por quaisquer métodos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressa, na forma de enzima, usando um vetor de expressão que tipicamente inclui seqüências controle que codificam um promotor, operador, sítio de ligação a ribossomo, sinal de iniciação de tradução, e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ati20 vadores adequados.

O vetor de expressão recombinante que transporta a seqüência de DNA que codifica uma variante de α-amilase pode ser qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor muitas vezes dependerá da célula hospedeira na 25 qual deve ser introduzido. Dessa maneira, o vetor pode ser autonomamente um vetor de replicação, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossômico, minicromossomo ou um cromossomo artificial. Alternati30 vãmente, o vetor pode ser aquele que, quando introduzido em uma célula hospedeira, está integrado no genoma da célula hospedeira e duplicado em conjunto com o cromossomo(s) no qual foi integrado. O gene integrado também pode ser amplificado para criar múltiplas cópias do gene no cromossomo pelo uso de um construto amplificável direcionado pela seleção por antibióticos ou outra pressão seletiva, tal como um gene regulador essencial ou pela complementação através do efeito de dose de um gene de via metabó5 Iica essencial.

No vetor, a seqüência de DNA deve ser operacionalmente ligada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólo10 gas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da seqüência de DNA que codifica uma variante de α-amilase, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do Iac óperon de E. coli, os promotores de gene de agarase dagA ou celA de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de α-amilase de Bacillus 15 licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotores da α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores de genes xy1A e xy1B de Bacillus subtilis etc. Para a transcrição em um hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica amilase TACA de 20 Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, a-amilase neutra de Aspergillus niger, α-amilase estável em ácido de A. Niger, glicoamilase de A. Niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae, ou acetamidase de A. nidulans. Quando o gene que codifica o polipeptídeo variante de α-amilase é ex25 presso em uma espécie bacteriana, tal como E. coli, um promotor adequado pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um promotor de bacteriófago incluindo um promotor T7 e um promotor de fago lambda. Exemplos de promotores adequados para a expressão em uma espécie de levedura incluem mas não são limitados aos promotores Gal 1 e Gal 10 de Saccharomyces 30 cerevisiae e promotores AOX1 ou AOX2 de Pichia pastoris. Para expressão em Trichoderma reesei, o promotor CBHII também pode ser usado. O vetor de expressão também pode compreender uma transcrição adequada terminadora e, em eucariontes, seqüências de poliadenilação operacionalmente ligadas à seqüência de DNA que codifica a variante de α-amilase. As seqüências de terminação e poliadenilação podem ser derivadas das mesmas fontes que o promotor.

O vetor pode compreender ainda uma seqüência de DNA que

permite o vetor replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pICatH, pHPLT (Genencor International, Inc.) e plJ702.

O vetor também pode compreender um marcador selecionável,

por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um gene que confere a resistência a antibiótico tal como, por exemplo, resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Além disso, o vetor pode 15 compreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB, niaD e xxsC, uma marcador que dá origem a resistência à higromicina, ou a seleção pode ser realizada pela cotransformação, tal como conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCT WO 91/17243

Enquanto a expressão intracelular ou fermentação em estado

sólido podem ser vantajosas em alguns aspectos, por exemplo, ao usar certas bactérias ou fungos como células hospedeiras, geralmente, a expressão da variante é extracelular e no meio de cultura. Em geral, as α-amilases de Bacillus mencionadas neste pedido compreendem um formato de pré25 proteína permitindo a secreção da protease expressa no meio de cultura. Se desejável, este peptídeo de pré-proteína pode ser substituído por um prépeptídeo ou seqüência sinal diferentes, convenientemente realizado pela substituição das seqüências de DNA que codificam a respectiva préproteína. As pré-proteínas são tipicamente caracterizadas como tendo três 30 domínios, um domínio N-terminal, um domínio H e um domínio C-terminal e faixa de 18 a 35 resíduos em tamanho.

O vetor de expressão tipicamente inclui os componentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um elemento que permite a replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores detectáveis fenotipicamente com objetivos de seleção. O vetor de expressão normalmente compreende seqüências nucleotídicas con5 trole que codificam um promotor, operador, sítio de ligação a ribossomo, sinal de iniciação de tradução e opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais genes ativadores. As seqüências sinal são geralmente usadas para direcionar o material aos meios de cultura celulares para facilitar a coleta da enzima, e opcionalmente, a purificação.

Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA que

codifica uma variante de α-amilase, o promotor, os elementos terminadores e outros, respectivamente, e inseri-los em vetores adequados contendo informação necessária para replicação, são bem-conhecidos a pessoas versadas na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLO15 NING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 e 3rd ed„ 2001).

Uma célula isolada, compreendendo um construto de DNA ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de α-amilase. A célula pode 20 ser transformada com o construto de DNA que codifica a variante, convenientemente pela integração do construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem quando a seqüência de DNA é mais provável ser estavelmente mantida na célula. A integração dos construtos de DNA no cromos25 somo hospedeiro pode ser realizada de acordo com os métodos convencionais, por exemplo, pela recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão como descrito acima com relação aos tipos diferentes de células hospedeiras.

Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são espécies bacterianas Gram-positivas, tais como Bacillaceae incluindo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus Iautus, Bacillus megaterium, e Bacillus thuringiens/s; espécies Streptomyces, tais como Streptomyces murinus\ espécies bacterianas de ácido láctico incluindo Lactococcus spp., tal como Lactococcus Iactis; Lactobacillus spp. incluindo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc spp.; 5 Pediococcus spp.; e Streptococcus spp. Alternativamente, cepas de espécies bacterianas Gram-negativas que pertencem à Enterobacteriaceae incluindo E. coli, ou à Pseudomonadaceae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro. Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado a partir das espécies de leveduras biotecnologicamente re10 levantes tais como, mas não limitadas a espécies de levedura, tais como Pichia sp., Hansenula sp. ou Kluyveromyces, espécies Yarrowinia ou uma espécie de Saccharomyces, incluindo Saceharomyces cerevisiae ou uma espécie que pertence a Schizosaccharomyces tal como, por exemplo, espécie S. Pombe. Uma cepa da espécie de levedura metilotrófica Pichia pastoris 15 pode ser usada como o organismo hospedeiro. Alternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma espécie Hansenula. Organismos hospedeiros adequados entre fungos filamentosos incluem espécies de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori ou Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de uma 20 espécie Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum ou de uma espécie Rhizomucor, tal como Rhizomucor miehei podem ser usados como o organismo hospedeiro. Outras cepas adequadas incluem espécies Thermomyces e Mueor.

As espécies de levedura contempladas incluem mas não são Ii25 mitadas a uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. O fungo filamentoso pode pertencer vantajosamente a uma espécie de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos e transformação dos proto30 plastos seguida pela regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras Aspergillus inclui, por exemplo, aquele descrito na EP 238023. Ainda em um aspecto adicional, um método de produção de uma variante de α-amilase é fornecido, método o qual compreende cultivo de uma célula hospedeira como descrito acima sob condições que levam à produção da variante e recuperação da variante a partir das células e/ou meio de cultura.

O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para crescimento da célula hospedeira em questão e obtenção da expressão da variante de α-amilase. Meios e componentes dos meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais 10 ou podem ser preparados de acordo com os protocolos publicados (por exemplo, como descrito nos catálogos do American Type Culture Collection). Meios de cultura exemplares incluem mas não são limitados àqueles para fermentações em batelada alimentada realizadas em tanque agitado fermentador de três mil litros (3.000 L), que foi usado nos exemplos fornecidos infra. 15 Os meios usados seriam aqueles ainda mais adequados para a célula hospedeira que é usada, por exemplo, os meios discutidos abaixo para cultivo de Bacillus licheniformis. O meio de crescimento neste caso pode consistir em sólidos de maceração de milho e farinha de soja como fontes de compostos orgânicos, junto com sais inorgânicos como uma fonte de sódio, po20 tássio, fosfato, magnésio e sulfato, bem como elementos-traço. Tipicamente, uma fonte de carboidrato, tal como glicose é também parte do meio inicial. Uma vez que a cultura foi estabelecida e começou a crescer, o carboidrato é medido no tanque para manter a cultura como é conhecido na técnica. Amostras são removidas do fermentador em intervalos regulares para medir o 25 título enzimático usando, por exemplo, um método de ensaio colorimétrico. O processo de fermentação é parado quando a taxa de produção de enzima para de aumentar de acordo com as medições.

Uma variante de α-amilase secretada a partir das células hospedeiras pode ser convenientemente recuperada do meio de cultura por procedimentos bem-conhecidos, incluindo a separação das células do meio por centrifugação ou filtração, e precipitação dos componentes proteicos do meio por meio de um sal, tais como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos, tais como cromatografia de troca tônica, cromatografia por afinidade, ou similares.

Geralmente, um polinucleotídeo em um vetor é operacionalmente ligado a uma seqüência controle que é capaz de fornecimento da ex5 pressão da seqüência de codificação pela célula hospedeira, isto é, o vetor é um vetor de expressão. As seqüências controle podem ser modificadas, por exemplo, pela adição de elementos reguladores transcricionais adicionais para fazer o nível da transcrição dirigido pelas seqüências controle mais responsivo a moduladores transcricionais. As seqüências controle podem com10 preender especialmente promotores

Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão da proteína variante de α-amilase. A expressão das proteínas pode ser constitutiva, tal que sejam constantemente produzidas, ou indutível, requerendo um estímulo para iniciar a expressão. 15 No caso de expressão indutível, a produção proteica pode ser iniciada quando necessária por, por exemplo, adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona, IPTG ou Sefarose. Polipeptídeos também podem ser produzidos recombinantemente em um sistema livre de células in vitro, tal como o sistema de reticulócito de coelho TnT®(Promega). 20 Um hospedeiro de expressão da variante de α-amilase também

pode ser cultivado no meio apropriado para hospedeiro, sob condições aeróbicas. Agitação ou uma combinação de agitação e aeração podem ser fornecidas, com a produção ocorrendo na temperatura apropriada para aquele hospedeiro, por exemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 25 75°C, dependendo das necessidades do hospedeiro e a produção da variante de α-amilase desejada. Cultivo pode ocorrer em aproximadamente 12 a aproximadamente 100 horas ou mais (e qualquer valor de hora que haja entre) ou por exemplo, de 24 a 72 horas. Tipicamente, o caldo de cultura está em um pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,0, novamente 30 dependendo das condições de cultura necessárias para a célula hospedeira em relação à produção da variante de a-amilase. 4. Purificação de Variantes de a-Amilase Técnicas de fermentação, separação e de concentração são conhecidas na técnica e métodos convencionais podem ser usados a fim de preparar a solução contendo a variante de α-amilase concentrada.

Após fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as célu

las microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo materiais de fermentação residuais crus, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução de amilase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração de tambor rotativo a vácuo, seguida por uItrafiItração, extração ou cromatografia, ou similares são geralmente usadas.

É desejável concentrar a variante de α-amilase contendo solução a fim de otimizar a recuperação. O uso de soluções não concentradas necessita de tempo de incubação aumentado a fim de coletar o precipitado contendo a variante de α-amilase purificada.

A solução contendo a variante de α-amilase é concentrada em

uma solução concentrada usando técnicas de concentração convencionais até que o nível de enzima desejado seja obtido. A concentração da solução contendo a variante enzimática pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas acima. Por exemplo, uItrafiItração pode ser usada.

A solução de variante enzimática é concentrada em uma solu

ção de variante enzimática concentrada até atividade da variante enzimática da dita solução contendo variante de α-amilase concentrada geralmente aproximadamente 4 g/L ou mais (por exemplo, 25 g/L ou qualquer quantidade entre 4 e 25 g/L). A concentração é limitada somente pela quantidade de enzima capaz de ser solubilizada em solução.

Por "agente de precipitação" com objetivos de purificação entende-se um composto eficaz para precipitar a variante de α-amilase a partir da solução de variante enzimática concentrada na forma sólida, qualquer uma que sua natureza possa ser, isto é, cristalina, amorfa ou mistura de ambas.

A precipitação pode ser realizada usando, por exemplo, um agente de precipitação haleto metálico. Agentes de precipitação haleto metáIico incluem: cloretos de metais alcalinos, brometos de metais alcalinos e misturas de dois ou mais destes haletos metálicos. O haleto metálico pode ser qualquer um de cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e misturas de dois ou mais destes haletos metálicos. 5 Por exemplo, o haleto metálico é escolhido entre cloreto de sódio e cloreto de potássio. Em caso do cloreto de sódio, ele também pode servir como um conservante.

O agente de precipitação haleto metálico é usado em uma quantidade eficaz para precipitar a variante de α-amilase. A seleção de pelo me10 nos uma quantidade eficaz e uma quantidade ótima de haleto metálico eficaz para causar a precipitação da variante enzimática, bem como as condições da precipitação para máxima recuperação incluindo tempo de incubação, pH, temperatura e concentração da variante de α-amilase, será prontamente evidente para um versado ordinário na técnica após testes de rotina.

Geralmente, pelo menos aproximadamente 5% p/v (pe

so/volume) a aproximadamente 25% p/v de haleto metálico são adicionados à solução de variante enzimática concentrada, e normalmente pelo menos 8% p/v. Geralmente, não mais do que aproximadamente 25% p/v de haleto metálico são adicionados à solução de variante enzimática concentrada e 20 normalmente não mais do que aproximadamente 20% p/v. A concentração ótima do agente de precipitação haleto metálico dependerá, entre outros, da natureza da variante de α-amilase específica e de sua concentração na solução de variante de α-amilase concentrada.

Uma alternativa para efetuar a precipitação da enzima é usar 25 compostos orgânicos, que podem ser adicionados à solução de variante enzimática concentrada. O agente de precipitação composto orgânico pode incluir: ácido 4-hidroxibenzoico, sais de metais alcalinos de ácido 4- hidroxibenzoico, ésteres de alquila de ácido 4-hidroxibenzoico, e misturas de dois ou mais destes compostos orgânicos. A adição dos ditos agentes de 30 precipitação compostos orgânicos pode realizar-se antes de, simultaneamente com ou subsequente à adição do agente de precipitação haleto metálico, e a adição de ambos os agentes de precipitação, composto orgânico e haleto metálico, pode ser realizada em seqüência ou simultaneamente.

Para descrições adicionais, vide, por exemplo, Patente Norteamericana No. 5.281.526. Geralmente, os agentes de precipitação compostos orgânicos são selecionados a partir do grupo composto de sais de metais alcalinos de ácido 4- hidroxibenzoico, tais como sais de sódio ou potássio, e ésteres de alquila lineares ou ramificados de ácido 4- hidroxibenzoico, em que o grupo alquila contém de 1 a 12 átomos de carbono, e misturas de dois ou mais destes compostos orgânicos. Os agentes de precipitação compostos orgânicos podem ser ésteres de alquila, por exemplo, lineares ou ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, em que o grupo alquila contém de 1 a 10 átomos de carbono, e misturas de dois ou mais destes compostos orgânicos. Por exemplo, os compostos orgânicos podem ser ésteres de alquila lineares de ácido 4-hidroxibenzoico, em que o grupo alquila contém de 1 a 6 átomos de carbono, e misturas de dois ou mais destes compostos orgânicos. Metil ésteres de ácido 4-hidroxibenzoico, propil éster de ácido 4-hidroxibenzoico, butil éster de ácido 4-hidroxibenzoico, etil éster de ácido 4-hidroxibenzoico e misturas de dois ou mais destes compostos orgânicos também podem ser usadas. Compostos orgânicos adicionais também incluem, mas não são limitados a metil éster de ácido 4-hidroxibenzoico (denominado metil PARABENO), propil éster de ácido 4-hidroxibenzoico (denominado propil PARABENO), que também são agentes conservantes de amilase.

Adição do dito agente de precipitação composto orgânico fornece a vantagem de alta flexibilidade das condições de precipitação com relação a pH, temperatura, concentração de variante de α-amilase, concentração de agente de precipitação e tempo de incubação.

O agente de precipitação composto orgânico é usado em uma quantidade eficaz para melhorar a precipitação da variante enzimática por meio do agente de precipitação haleto metálico. A seleção de pelo menos uma quantidade eficaz e uma quantidade ótima de agente de precipitação 30 composto orgânico, bem como as condições da precipitação para recuperação máxima incluindo tempo de incubação, pH, temperatura e concentração da variante enzimática, será prontamente evidente para uma versado ordinário na técnica, à Iuz da presente revelação, após teste de rotina

Geralmente, pelo menos 0,01% p/v do agente de precipitação composto orgânico é adicionado à solução de variante enzimática concentrada e normalmente pelo menos 0,02% p/v. Geralmente, não mais do que 5 0,3% p/v do agente de precipitação composto orgânico são adicionados à solução de variante enzimática concentrada e normalmente não mais do que 0,2% p/v.

A solução de variante enzimática concentrada, contendo agente de precipitação haleto metálico e, por exemplo, agente de precipitação composto orgânico, é ajustada em um pH que dependerá, inevitavelmente, da variante enzimática a ser purificada. Geralmente, o pH é ajustado em um nível próximo ao ponto isoelétrico da amilase. Geralmente, o pH é ajustado em um pH em uma faixa de aproximadamente 2,5 unidades de pH abaixo do ponto isoelétrico (pl) até aproximadamente 2,5 unidades de pH acima do ponto isoelétrico. Com objetivos de ilustração, quando a variante enzimática é uma variante de α-amilase derivada de Bacillus licheniformis, a solução de variante enzimática concentrada é normalmente ajustada a um pH entre aproximadamente 5,5 e 9,7 ou a um pH entre aproximadamente 6,5 e 9,0. Modificações de pH para outras variantes de α-amilases de Bacillus podem ser similarmente preparadas.

O tempo de incubação necessário para obter um precipitado de variante enzimática purificada depende da natureza da variante enzimática específica, a concentração da enzima, e o agente(s) de precipitação específico e sua (suas) concentração. Geralmente, o tempo eficaz para precipitar a 25 variante enzimática está entre aproximadamente 1 a aproximadamente 30 horas; normalmente não excede aproximadamente 25 horas. Na presença do agente de precipitação composto orgânico, o tempo de incubação pode ainda ser reduzido a menos de aproximadamente 10 horas, e na maioria dos casos até aproximadamente 6 horas 30 Geralmente, a temperatura durante a incubação está entre a

proximadamente 40°C e aproximadamente 50°C. Normalmente, o método é realizado em uma temperatura entre aproximadamente 10°C e aproximamente 45°C, ou entre aproximadamente 20°C e aproximadamente 40°C. A temperatura ótima para indução da precipitação varia de acordo com as condições de solução e a variante enzimática ou agente(s) de precipitação usados.

A recuperação total da variante enzimática purificada precipita

da, e a eficiência com a qual o processo é conduzido, é melhorada pela agitação da solução compreendendo a variante enzimática, o haleto metálico adicionado e o composto orgânico adicionado. A etapa de agitação é feita tanto durante a adição do haleto metálico como durante o composto orgâni10 co, e durante o período de incubação subsequente. Métodos de agitação adequados incluem agitação ou mistura mecânica, aeração vigorosa, ou qualquer técnica similar.

Após o período de incubação, a variante enzimática purificada então é separada do pigmento dissociado e outras impurezas e coletada por 15 técnicas de separação convencionais, tais como filtração, centrifugação, microfiltração, filtração rotativa a vácuo, ultrafiltração, filtração em prensa, microfiltração cruzada de membrana, microfiltração de fluxo cruzado de membrana ou similares. Microfiltração cruzada de membrana pode ser um método usado. Purificação adicional do precipitado de variante enzimática purifi20 cada pode ser obtido pela lavagem do precipitado com água. Por exemplo, o precipitado de variante enzimática purificada é lavado com água contendo o agente de precipitação haleto metálico, ou, por exemplo, com água contendo os agentes de precipitação haleto metálico e composto orgânico.

Durante o cultivo, amilase termoestável acumula-se extracelu25 Iarmente no caldo de cultura. Para o isolamento e purificação da variante de α-amilase desejada, o caldo de cultura é centrifugado ou filtrado para eliminar células, e o líquido livre de célula resultante é usado para a purificação da enzima. Em uma modalidade, o caldo livre de célula é submetido à salinização usando sulfato de amônio em saturação de aproximadamente 70%; a 30 fração de precipitação de saturação de 70% então é dissolvida em um tampão e aplicada a uma coluna, tal como uma coluna Sephadex G-100, e eluída para recuperar a fração ativa da variante enzimática. Para purificação adicional, um procedimento convencional, tal como cromatografia de troca iônica, pode ser usado.

As variantes enzimáticas purificadas são úteis para todas as aplicações nas quais as variantes enzimáticas são geralmente utilizadas. Por 5 exemplo, podem ser usadas em detergentes de lavanderia e removedores de mancha, na indústria de alimentos, em processamento e cozimento de amido e em composições farmacêuticas como auxiliares de digestão. Podem ser feitas em um produto final que seja líquido (solução, pasta fluida) ou sólido (grânulo, pó)

Alternativamente, o produto enzimático pode ser recuperado e

um agente floculante é adicionado aos meios a fim de remover células e debris celulares por filtração ou centrifugação sem purificação adicional da enzima.

5. Composições Compreendendo Variantes de a-Amilase As variantes de α-amilase possuem propriedades valiosas per

mitindo uma variedade de aplicações industriais. Uma variante enzimática pode ser usada como um componente nas composições detergentes de lavagem, lavagem de louça e de limpeza de superfície dura. Numerosas variantes são particularmente úteis na produção de adoçantes e etanol a partir 20 de amido, e/ou para desengomagem de tecido. Condições de processos de conversão de amido convencionais, incluindo processos de liquefação e/ou sacarificação de amido são descritas em, por exemplo, na Patente Norteamericana No. 3.912.590 e nas Publicações de Patente Européia Números 252.730 e 63.909.

Nas aplicações farmacêuticas, as variantes de α-amilase são

normalmente secas, tal como por liofilização.

5.1 Composições e Uso de Limpeza e Lavagem de Louça

As variantes de α-amilase discutidas neste pedido podem ser formuladas em composições detergentes para uso na limpeza de louças ou outras composições de limpeza. Estas podem ser pós ou líquidos. As composições podem compreender a variante de α-amilase sozinha, outras enzimas amilolíticas, outras enzimas de limpeza e outros componentes comuns a composições de limpeza.

Dessa maneira, uma composição detergente de lavagem de louça pode compreender um tensoativo. O tensoativo pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfótero ou uma mistura destes tipos. O detergente 5 pode conter de 0% a aproximadamente 90% em peso de um tensoativo nãoiônico, tal como alcoóis de cadeia linear etoxilados propoxilados pouco ou não espumantes.

Nas aplicações detergentes, as variantes de α-amilase são normalmente usadas em uma composição líquida que contém propileno glicol. A variante de α-amilase é solubilizada em, por exemplo, propileno glicol pela circulação em uma solução de propileno glicol 25% volume/volume contendo cloreto de cálcio 10%.

A composição detergente pode conter sais de construtores detergentes de tipos inorgânicos e/ou orgânicos. Os construtores detergentes podem ser subdivididos nos tipos contendo fósforo e não contendo fósforo. A composição detergente normalmente contém aproximadamente 1% a aproximadamente 90% de construtores detergentes. Exemplos de construtores detergentes alcalinos inorgânicos contendo fósforo, quando presente, incluem os sais solúveis em água, especialmente pirofosfatos, ortofosfatos e polifosfatos de metais alcalinos. Um exemplo do construtor detergente alcalino orgânico contendo fósforo, quando presente, inclui os sais solúveis de fosfonatos em água. Exemplos de construtores inorgânicos não contendo fósforo, quando presentes, incluem carbonatos de metais alcalinos solúveis em água, boratos e silicatos, bem como vários tipos de alumino silicatos amorfos ou cristalinos insolúveis em água, dos quais zeólitos são os representantes mais conhecidos.

Exemplos de construtores orgânicos adequados incluem metais alcalinos; amônio e amônio substituído; citratos; succinatos; malonatos; sulfonatos de ácido graxo; carboximetóxi succinatos; poliacetato de amônio; carboxilatos; policarboxilatos; aminopolicarboxilatos; carboxilatos de poliacetila; e polihidroxissulfonatos.

Outros construtores orgânicos adequados incluem os polímeros de peso molecular mais alto e copolímeros conhecidos por ter propriedades construtoras, por exemplo, ácido poliacrílico, polimaleico e copolímeros de ácidos poliacrílico/polimaleico apropriados e seus sais.

A composição de limpeza pode conter agentes de alvejamento 5 do tipo cloro/bromo ou do tipo oxigênio. Exemplos de alvejantes inorgânicos do tipo cloro/bromo são hipoclorito de lítio, sódio ou cálcio, e hipobrometo, bem como fosfato trissódico clorado. Exemplos de alvejantes orgânicos do tipo cloro/bromo são N-bromo- e N-cloro- imidas heterocíclicas, tais como ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibromoisocianúrico, e diclo10 roisocianúrico e sais dos mesmos com cátions solubilizados em água, tais como potássio e sódio. Compostos de hidantoína são também adequados.

A composição de limpeza pode conter alvejantes de oxigênio, por exemplo, na forma de um persal inorgânico, como, por exemplo, um precursor de alvejamento ou como um composto peroxiácido. Exemplos típicos 15 de compostos de alvejamento peróxi adequados são perboratos de metais alcalinos, tanto tetrahidratos como monohidratos, percarbonatos, persilicatos e perfosfatos de metais alcalinos. Materiais ativadores exemplares são TAED e triacetato de glicerol. Sistemas de ativação de alvejamento enzimático também podem estar presentes, por exemplo, tais como perborato ou per20 carbonato, triacetato de glicerol e perhidrolase, por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional PCT WO 2005/056783.

A composição de limpeza pode ser estabilizada usando agentes de estabilização convencionais para enzima(s), por exemplo, um poliol, tal como, por exemplo, propileno glicol, um açúcar ou um álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster borato aromático).

A composição de limpeza também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais, por exemplo, material defloculante, material de enchimento, depressores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes 30 suspensores de sujeira, agentes sequestrantes, agentes de antirredeposição de sujeira, agentes desidratantes, tinturas, bactericidas, fluorescedores, espessantes e perfumes. Finalmente, as variantes de α-amilase podem ser usadas em detergentes de lavagem de louça convencionais, por exemplo, em quaisquer dos detergentes descritos em quaisquer das seguintes publicações de patente com a consideração que α-amilase modificada é uma α-amilase modi5 ficada de Bacillus em X2 na SEQ ID NO: 1 para a produção aumentada ou é α-amilase nas patentes listadas e pedidos de patentes usados além das variantes de α-amilase descritas neste pedido: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 10 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, Patente Norte-americana No. 15 5.112.518, Patente Norte-americana No. 5.141.664 e Patente Norteamericana No. 5.240.632.

5.2 Composições e Uso para Detergentes de Lavanderia De acordo com a modalidade, uma ou mais variantes de aamilase podem ser tipicamente um componente de uma composição detergente. Como tal, podem estar incluídas na composição detergente na forma de um granulado não-esfarelado, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida. Granulados não-esfarelados podem ser produzidos, por exemplo, como descrito nas Patentes Norte-americanasNos. 4.106.991 e 4.661.452 (ambas de Novo Industri A/S) e podem ser opcionalmente recobertos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento encerados são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e no qual há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formador de filme adequados para aplicação por técnicas de fluidização em leito são dados em, por exemplo, Patente Britânica No. 1483591. Preparações enzimáticas líquidas podem ser, por exemplo, estabilizadas pela adição um poliol, tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. Outros estabilizadores de 5 enzima são bem-conhecidos na técnica. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em, por exemplo, EP 238.216. Polióis há muito foram reconhecidos como estabilizadores de proteínas bem como para melhorar a solubilidade de proteínas, vide, por exemplo, J. K. Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer? An analy10 sis of thermal stability of proteins in the presence of compatible osmolyte trehalose" J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003) e referências citadas neste; e M. Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility", J. Chromatography 757: 237-245 (1997).

A composição detergente pode estar em qualquer forma ade15 quada, por exemplo, como pós, grânulos, pastas ou líquidos. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até aproximadamente 70% de água, e 0% a aproximadamente 30% de solvente orgânico, também pode estar na forma de um tipo de gel compacto contendo somente aproximadamente 30% de água.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos,

cada um dos quais pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, ou zwitteriônico. O detergente conterá normalmente 0% a aproximadamente 50% de tensoativo aniônico, tais como alquilbenzenossulfonato linear (LAS); aolefinassulfonato (AOS); sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo) (AS); ál25 cool etoxissulfato (AEOS ou AES); alcanossulfonatos secundários (SAS); asulfo ésteres de metila de ácido graxo; ácido alquil- ou alquenilsuccínico; ou sabão. A composição também pode conter 0% a aproximadamente 40% de tensoativo não-iônico, tal como álcool etoxilato (AEO ou AE), álcool etoxilatos carboxilados, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminó30 xido, ácido graxo etoxilado de monoetanolamida, ácido graxo de monoetanolamida, ou amida de ácido graxo de polihidroxialquila (como descrito, por exemplo, em WO 92/06154). A composição detergente pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas, tais como lipase, cutinase, protease, celulase, peroxidase e/ou Iacase em qualquer combinação.

O detergente pode conter aproximadamente 1% a aproximadamente 65% de um construtor detergente ou agente complexante, tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos estratificados (por exemplo, SKS-6 de Hoechst). O detergente também pode ser não construído, isto é, essencialmente livre de construtores de detergente. Enzimas podem ser usadas em qualquer composição compatível com a estabilidade da enzima. As enzimas podem ser protegidas contra componentes geralmente deletérios por formas conhecidas de encapsulamento, como por exemplo, por granulação ou seqüestro em hidrogéis. Enzimas e especificamente α-amilases com ou sem os domínios de ligação a amido não são limitados a aplicações de lavanderia e lavagem de louça, mas podem se ligar ao uso em limpadores de superfície e a produção de etanol a partir de amido ou biomassa.

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exempios incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietiIenoglicol (PEG), polivinil álcool) (PVA), policarboxilatos, tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de alvejamento, que pode 25 compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato, que pode ser combinado com um ativador de alvejamento formador de perácido, tal como tetraacetiletilenodiamina (TAED) ou nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS). Alternativamente, o sistema de alvejamento pode compreender peroxiácidos de, por exemplo, amida, imida ou do tipo sulfona. O sistema de 30 alvejamento também pode ser um sistema de alvejamento enzimático onde uma perhidrolase ativa o peróxido, tal como descrito em Pedido de Patente Internacional PCT WO 2005/056783. As enzimas da composição detergente podem ser estabilizadas usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo, um poliol, tal como propileno glicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido láctico; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico tal como, por exemplo, um 5 éster borato aromático; e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais, tais como condicionadores de tecido incluindo argilas, incrementador de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensão de sujeira, agentes de antirredeposição de sujeira, tinturas, bactericidas, alvejantes óticos, ou perfume, por exemplo. O pH (medido na solução aquosa na concentração de uso) é normalmente neutro ou alcalino, por exemplo, o pH aproximadamente 7,0 a aproximadamente 11,0 A variante de α-amilase pode ser incorporada em concentrações convencionalmente empregadas em detergentes. É atualmente contemplado que, na composição detergente, a variante de α-amilase pode ser adicionada em uma quantidade correspondente a 0,00001 a 1,0 mg (calculado como proteína enzima pura) da variante de α-amilase por litro de licor de lavagem. Formas particulares de composições detergentes compreendendo as variantes de α-amilase podem ser formuladas para incluir:

1) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 7% a aproximadamente 12%; álcool etoxissulfato (por exemplo, álcool C-i2-i8> 1-2 25 óxido de etileno (EO)) ou sulfato de alquila (por exemplo, Ci6-is) aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C14-15, 7 EO) aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2COs) aproximadamente 14% a aproximadamente 20%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2Si02) aproximadamente 2 a a30 proximadamente 6%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 15% a aproximadamente 22%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a aproximadamente 6%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na3O7ZCeH8O7) aproximadamente 0% a aproximadamente 15%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) aproximadamente 11 % a aproximadamente 18%; TAED aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, 5 copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) O a 3%; proteínas enzimas (calculado como enzima pura) de 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfumes, alvejante ótico, fotoalvejamento) 0 a 5%.

2) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de aproximadamente 6% a aproximadamente 11%; álcool etoxissulfato (por exemplo, álcool C12-18, 1-2 EO) ou sulfato de alquila (por exemplo, Ci6-is) aproximadamente 1% a aproximadamente 3%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C14-15, 7 EO) aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2Si02) aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 24% a aproximadamente 34%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) aproximadamente 4% a aproximadamente 10%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na3O7ZC6H8O7) 0% a aproximadamente 15%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1 a 6%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

3) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 5% a aproximadamente 9%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C12-15. 7 EO) a30 proximadamente 7% a aproximadamente 14%; Sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido graxo Ci6-22) aproximadamente 1 a aproximadamente 3%; carbonato de sódio (como Na2CO3) aproximadamente 10% a aproximadamente 17%; silicato solúvel (por exemplo, Na20, 2Si02) aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; zeólito (como NaAISiO4) aproximadamente 23% a aproximadamente 33%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a aproximadamente 4%; perborato de sódio (por exemplo, NaBOsH2O) aproxi5 madamente 8% a aproximadamente 16%; TAED aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; fosfonato (por exemplo, EDTMPA) 0% a aproximadamente 1%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) O a 3%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredi10 entes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume, alvejante ótico) 0 a 5%.

4) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 8% a 15 aproximadamente 12%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool Ci2-i5, 7 EO) aproximadamente 10% a aproximadamente 25%; carbonato de sódio (como Na2CO3) aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2Si02) aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 25% a aproximadamente 20 35%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a aproximadamente 10%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1 a 3%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

5) Uma composição detergente líquida aquosa compreendendo

alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool Ci2-i5, 7 EO ou álcool C-12-15, 5 EO) aproximadamente 12% a aproximadamente 18%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) aproximadamente 3% a 30 aproximadamente 13%; ácido alquenilsuccínico (C12-14) 0% a aproximadamente 13%; aminoetanol aproximadamente 8% a aproximadamente 18%; ácido cítrico aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; fosfonato 0% a aproximadamente 3%; polímeros (por exemplo, PVP1 PEG) 0% a aproximadamente 3%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a aproximadamente 2%; etanol 0% a aproximadamente 3%; propileno glicol aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 5 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, alvejante ótico) 0 a 5%.

6) Uma composição detergente líquida estruturada aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 15% a aproximadamente 21%; álcool etoxilato (por exem

pio, álcool C-12-15, 7 EO, ou álcool C12-15, 5 EO) 3 a 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) aproximadamente 3% a aproximadamente 10%; zeólito (como NaAISiO4) aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; citrato de potássio aproximadamente 9% a aproximadamente 18%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a aproximadamente 2%; carboximetilcelulose 15 (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, PEG, PVP) 0% a aproximadamente 3%; polímeros de ancoragem (por exemplo, copolímero de metacrilato de laurila/ácido acrílico); razão molar 25:1, PM 3800) 0% a aproximadamente 3%; glicerol 0% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários 20 (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, alvejantes óticos) 0 a 5%.

7) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo sulfato de álcool graxo aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; ácido

graxo de monoetanolamida etoxilada aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; sabão como ácido graxo 0 a 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2Si02) aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 20% a aproximadamente 30 40%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) aproximadamente 12% a aproximadamente 18%; TAED aproximadamente 2% a aproximadamente 7%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante ótico, supressores de espuma, perfume) 0 5 a 5%.

8) Uma composição detergente formulada como um granulado comprendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; ácido graxo de monoetanolamida etoxilada aproximadamente 5% a aproximadamente 11%; sabão como 10 ácido graxo 0% a aproximadamente 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) aproximadamente 4% a aproximadamente 10%; silicato solúvel (Na2O1 2Si02) aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 30% a aproximadamente 50%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) aproximadamente 3% a aproximadamen15 te 11%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) aproximadamente 5% a aproximadamente 12%; polímeros (por exemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 a 5%.

9) Uma composição detergente formulada como um granulado

comprendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente 6% a aproximadamente 12%; tensoativo não-iônico aproximadamente 1% a aproximadamente 4%; sabão como ácido graxo aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; carbonato de sódio (por exemplo, 25 Na2CO3) aproximadamente 14% a aproximadamente 22%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 18% a aproximadamente 32%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) aproximadamente 5% a aproximadamente 20%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3H2O) aproxi30 madamente 4% a aproximadamente 9%; ativador de alvejamento (por exemplo, NOBS ou TAED) aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a aproximadamente 2%; polímeros (por exemplo, policarboxilato ou PEG) aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante ótico, perfume) 0 a 5%.

10) Uma composição detergente líquida aquosa compreenden5 do alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente

15% a aproximadamente 23%; álcool etoxissulfato (por exemplo, álcool Ci2. 15, 2-3 EO) aproximadamente 8% a aproximadamente 15%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C-12-15, 7 EO1 ou álcool C12-15, 5 EO) aproximadamente 3% a aproximadamente 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido 10 láurico) 0% a aproximadamente 3%; aminoetanol aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; citrato de sódio aproximadamente 5% a aproximadamente 10%; hidrotropo (por exemplo, toluenossulfonato de sódio) aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; borato (por exemplo, B4O7) 0% a aproximadamente 2%; carboximetilcelulose 0% a aproximadamente 1%; eta15 nol aproximadamente 1% a aproximadamente 3%; propileno glicol aproximadamente 2% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, polímeros, dispersantes, perfume, alvejantes óticos) 0 a 5%.

11) Uma composição detergente líquida aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) aproximadamente

20% a aproximadamente 32%; álcool etoxilato (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO, ou álcool C-12-15, 5 EO) 6 a 12%; aminoetanol aproximadamente 2% a aproximadamente 6%; ácido cítrico aproximadamente 8% a aproximadamente 14%; borato (por exemplo, B4O7) aproximadamente 1% a aproximada25 mente 3%; polímero (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de ancoragem, tal como copolímero de metacrilato de laurila/ácido acrílico) 0% a aproximadamente 3%; glicerol aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, hidrotropos, dispersantes, 30 perfume, alvejantes óticos) 0 a 5%.

12) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo tensoativo aniônico (alquilbenzenossulfonato linear, sulfato de alquila, aolefinassulfonato, α-sulfo ésteres de metila de ácido graxo, alcanossulfonatos, sabão) aproximadamente 25% a aproximadamente 40%; tensoativo não-iônico (por exemplo, álcool etoxilato) aproximadamente 1% a aproxima5 damente 10%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) aproximadamente 8% a aproximadamente 25%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O1 2Si02) aproximadamente 5% a aproximadamente 15%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a aproximadamente 5%; zeólito (NaAISiO4) aproximadamente 15% a aproximadamente 28%; perborato de sódio (por exemplo, Na10 B034H20) 0% a aproximadamente 20%; ativador de alvejamento (TAED ou NOBS) aproximadamente 0% a aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; ingredientes secundários (por exemplo, perfume, alvejantes óticos) 0 a 3%.

13) As composições detergentes como descrito em composições 1) a 12) supra, em que todo ou parte do alquilbenzenossulfonato linear é substituído pelo sulfato de alquila (C-I2--I8).

14) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo (Ci2. C-I8) sulfato de alquila aproximadamente 9% a aproximadamente 15%; álcool 20 etoxilato aproximadamente 3% a aproximadamente 6%; amida de ácido graxo de polihidroxialquila aproximadamente 1% a aproximadamente 5%; zeólito (por exemplo, NaAISiO4) aproximadamente 10% a aproximadamente 20%; dissilicato estratificado (por exemplo, SK56 de Hoechst) aproximadamente 10% a aproximadamente 20%; carbonato de sódio (por exemplo, 25 Na2CO3) aproximadamente 3% a aproximadamente 12%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O1 2Si02) 0% a aproximadamente 6%; citrato de sódio aproximadamente 4% a aproximadamente 8%; percarbonato de sódio aproximadamente 13% a aproximadamente 22%; TAED aproximadamente 3% a aproximadamente 8%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) 0% a 30 aproximadamente 5%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante ótico, fotoalvejamento, perfume, supressores de espuma) 0 a 5%. 15) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo (C-|2. C18) sulfato de alquila aproximadamente 4% a aproximadamente 8%; álcool etoxilato aproximadamente 11% a aproximadamente 15%; sabão aproxima

5 damente 1% a aproximadamente 4%; zeólito MAP ou zeólito A aproximadamente 35% a aproximadamente 45%; carbonato de sódio (como Na2CO3) aproximadamente 2% a aproximadamente 8%; silicato solúvel (por exemplo, Na2O, 2Si02) 0% a aproximadamente 4%; percarbonato de sódio aproximadamente 13% a aproximadamente 22%; TAED 1 a 8%; carboximetilcelulose 10 (CMC) 0% a aproximadamente 3%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) 0% a aproximadamente 3%; enzimas (calculado como proteína enzima pura) 0,0001 a 0,1%; e ingredientes secundários (por exemplo, alvejante ótico, fosfonato, perfume) 0 a 3%

16) Formulações detergentes como descrito em 1) a 15) acima, que contém um perácido estabilizado ou encapsulado, como um componente adicional ou como um substituto por sistemas de alvejamento já especificados.

17) Composições detergentes como descrito acima em 1), 3), 7), 9) e 12), em que perborato é substituído por percarbonato.

18) Composições detergentes como descrito acima em 1), 3),

7), 9), 12), 14) e 15), que adicionalmente contém um catalisador de manganês.

19) Composição detergente formulada como um líquido detergente não-aquoso compreendendo um tensoativo não-iônico líquido tal como, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sistema construtor (por exemplo, fosfato), uma enzima(s), e álcali. O detergente também pode compreender tensoativo aniônico e/ou um sistema de alvejamento.

A variante de α-amilase pode ser incorporada em concentrações convencionalmente empregadas em detergentes. É atualmente contemplado que, na composição detergente, a variante de α-amilase pode ser adicionada em uma quantidade correspondente a 0,00001 a 1,0 mg (calculado como proteína enzima pura) de variante de α-amilase por litro de licor de lavagem.

Em outro aspecto, a 2,6-3-D-frutano hidrolase pode ser incorporada em composições detergentes e usada para a remoção/limpeza do presente biofilme em casa e/ou na lavanderia/indústria têxtil.

A composição detergente, por exemplo, pode ser formulada co

mo uma composição detergente de lavanderia manual ou de máquina, incluindo uma composição de aditivo de lavanderia adequada para prétratamento de tecidos tingidos e uma composição amaciante de tecido adicionada ao enxágüe, ou ser formulada como uma composição detergente 10 para operações de limpeza de superfície dura para uso doméstico em geral, ou é formulada para operações de lavagem de louça em máquina ou manual.

Em um aspecto específico, a composição detergente pode compreender 2,6-a-D-frutano hidrolase, uma ou mais variantes de a-amilase, 15 e uma ou mais enzimas de limpeza, tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma carbohidrase, uma celulase, um pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, uma lacase, e/ou uma peroxidase e/ou combinações das mesmas

Em geral, as propriedades da enzima(s) escolhida devem ser compatíveis com o detergente selecionado, (por exemplo, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e a enzima(s) deve estar presente em quantidades eficazes.

Proteases: proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Proteases exemplares incluem derivados de 25 micro-organismos. Mutantes proteicos projetados ou modificados quimicamente estão incluídos. A protease pode ser uma serino protease ou uma metaloprotease, uma protease microbiana alcalina ou uma protease semelhante à tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente as derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina 30 Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (vide, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases semelhantes à tripsina são tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e proteases de Fusarium {vide, por exemplo, WO 89/06270 e WO 94/25583). Exemplos de proteases úteis também incluem mas não são limitados às variantes descritas em WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946. Enzimas proteases exemplares comercialmente disponíveis incluem Alcalase®, Savinase®, 5 Primase®, Duralase®, Esperase® e Kannase® (Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect OxP®, FN2® e FN3® (Genencor International, Inc.).

Lipases: Iipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes proteicos projetados ou modificados quimicamente 10 estão incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem mas não são limitados a lipases de Humicola (sinônima a Thermomyces), por exemplo de H. Ianuginosa (T. lanuginosus) (vide, por exemplo, EP 258068 e EP 305216), de H. insolens (vide, por exemplo, WO 96/13580); uma Iipase de Pseudomonas (por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes] vide, por exemplo, 15 EP 218272), P. cepacia (vide, por exemplo, EP 331376), P. stutzeri (vide, por exemplo, GB 1.372.034), P. fluorescens, cepa de Pseudomonas sp. SD 705 (vide, por exemplo, WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (vide, por exemplo, WO 96/12012); uma Iipase de Bacillus (por exemplo, de

B. subtilis; vide, por exemplo, Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 20 1131; 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (vide, por exemplo, JP 64/744992), ou B. pumilus (vide, por exemplo, WO 91/16422). Variantes de Iipase adicionais contempladas para uso nas formulações incluem as descritas, por exemplo, em: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 25 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 e EP 260105. Algumas enzimas Iipase comercialmente disponíveis incluem Lipolase® e Lipolase® Ultra (Novo Nordisk A/S).

Poliesterases: Poliesterases adequadas incluem mas não são limitadas àquelas descritas nos Pedidos de Patente Internacionais PCT WO 01/34899 e WO 01/14629, e podem ser incluídas em qualquer combinação com outras enzimas discutidas neste pedido.

Amilases: As composições podem ser combinadas com outras α-amilases, tal como α-amilase de não produção aumentada. Estas podem incluir amilases comercialmente disponíveis, tais como mas não limitadas a Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® e BAN® (Novo Nordisk A/S), Rapidase®, e Purastar® (de Genencor International, Inc.)

Celulases: Celulases podem ser adicionadas às composições.

Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes proteicos projetados ou modificados quimicamente estão incluídos. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases 10 fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum descritas, por exemplo, nas Patentes NorteamericanasNos. 4.435.307; 5.648.263; 5.691.178; 5.776.757; e WO 89/09259. Celulases exemplares contempladas para uso são aquelas tendo a vantagem de preservar a cor do tecido. Exemplos de tais celulases são 15 celulases descritas em, por exemplo, EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 e WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase, tais como as descritas em WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; Patentes Norte-americanasNos. 5.457.046; 5.686.593; e 5.763.254. Celulases comercialmente disponíveis 20 incluem Celluzyme® e Carezyme® (Novo Nordisk A/S); Clazinase® e Puradax® HA (Genencor International, Inc.); e KAC-500(B)® (Kao Corporation)

Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas contempladas para uso nas composições incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Mutantes proteicos projetados ou modificados quimi25 camente estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes das mesmas como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Guardzyme® (Novo Nordisk A/S).

A enzima(s) detergente pode estar incluída em uma composição

detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo detergente, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, um líquido, uma pasta fluida, etc. Formulações de aditivos detergentes exemplares são granulados, em particular, granulados não-esfarelados, líquidos, em paris ticular, líquidos estabilizados, ou pastas fluidas.

Granulados não-esfarelados podem ser produzidos, por exemplo, como descrito nas Patentes Norte-americanasNos. 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente recobertos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento encerado são produtos 10 poli(óxido de etileno) (por exemplo, polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e no qual há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de 15 ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formador de filme adequados para aplicação por técnicas de fluidização em leito são dadas em, por exemplo, GB 1483591. Preparações enzimáticas líquidas podem ser, por exemplo, estabilizadas pela adição de um poliol, tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acor20 do com os métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238.216.

A composição detergente pode estar em qualquer forma adequada, por exemplo, uma barra, um comprimido, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente 25 contendo até aproximadamente 70% de água e 0% a aproximadamente 30% de solvente orgânico. Géis detergentes compactos contendo 30% ou menos de água também são contemplados. A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não-iônicos incluindo semipolar e/ou aniônico e/ou catiônico e/ou zwitteriônico. Os tensoativos estão presentes 30 tipicamente em um nível de 0,1 % a 60% em peso.

Quando incluído neste, o detergente conterá tipicamente de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de um tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear, α-olefinassulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), álcool etoxissulfato, alcanossulfonato secundário, α-sulfo éster de metila de ácido graxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ou sabão.

Quando incluído neste, o detergente conterá normalmente de

aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de um tensoativo nãoiônico, tal como álcool etoxilato, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, polihidroxiamida de ácido graxo de alquila, ou derivados N-acil-N-alquii de glicosamina ("glicamidas").

O detergente pode conter 0% a aproximadamente 65% de um construtor detergente ou agente complexante, tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopenta-acético, ácido alquil15 ou alquenilsuccínico, silicato solúvel ou silicato estratificado (por exemplo, SKS-6 de Hoechst).

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etileno glicol) (PEG), poli(vinil álcool) (PVA), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, por exemplo, poliacrilatos, copolímeros de ácidos maleico/acrílico) e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de alvejamento que pode compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato, que pode ser combinado com um ativador de alvejamento formador de perácido 25 (por exemplo, tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato). Alternativamente, o sistema de alvejamento pode compreender peroxiácidos (por exemplo, a amida, imida, ou peroxiácidos do tipo sulfona). O sistema de alvejamento também pode ser um sistema de alvejamento enzimático

A enzima(s) da composição detergente pode ser estabilizada usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo, como poliol (por exemplo, propileno glicol ou glicerol), um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster borato aromático), ou uma fenila derivada de ácido borônico (por exemplo, 4-formilfenil de ácido borônico). A composição pode ser formulada como descrito em WO 92/19709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientes deter5 gentes convencionais tais como, por exemplo, condicionadores de tecido incluindo argilas, incrementadores de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensão de sujeira, agentes de antirredeposição de sujeira, tinturas, bactericidas, alvejantes óticos, hidrotropos, inibidores de descoloramento ou perfumes.

É atualmente contemplado que nas composições detergentes,

especialmente as variantes de enzima, podem ser adicionadas em uma quantidade correspondente a aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg da proteína enzima por litro de licor de lavagem, por exemplo, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5,0 mg da proteína enzima por 15 litro de licor de lavagem, em particular, 0,1 a aproximadamente 1,0 mg da proteína enzima por litro de Iicorde lavagem.

5.3 Métodos de Avaliação de Composições Detergentes Numerosos ensaios de limpeza com α-amilase existem. Descrição exemplar de limpeza teste inclui o seguinte Uma "amostra de tecido" é uma parte do material, tal como um

tecido que tem uma mancha aplicada nele. O material pode ser, por exemplo, tecidos feitos de algodão, poliéster ou misturas de fibras naturais e sintéticas. A amostra de tecido pode ser ainda de papel, tal como papel de filtro ou nitrocelulose, ou uma pedaço de um material duro tal como cerâmica, 25 metal ou vidro. Para amilases, a mancha é baseada em amido, mas pode incluir sangue, leite, tinta, grama, chá, vinho, espinafre, molho de carne, chocolate, ovo, queijo, argila, pigmento, óleo, ou misturas destes compostos.

Uma "amostra de tecido menor" é uma seção da amostra que foi cortada com um dispositivo furador de buraco único, ou foi cortado com um dispositivo de 96 buracos fabricado adaptado, onde o padrão do furador multiburaco é combinado placas-padrão de microtítulo de 96 poços, ou a seção foi removida de outra maneira da amostra de tecido. A amostra de tecido pode ser de tecido, papel, metal, ou outro material adequado. A amostra de tecido menor pode ter a mancha fixada antes ou após de ser colocada na placa de microtítulo de 24, 48 ou 96 poços. A "amostra de tecido menor" também pode ser feita pela aplicação de uma mancha a um pequeno peda5 ço do material. A amostra de tecido menor é um pedaço manchado de tecido que tem 1,5875 cm (5/8") de diâmetro ou menos, tal como uma amostra que tem 0,625 cm (0,25") de diâmetro. O furador fabricado adaptado é desenhado de tal maneira que forneça 96 amostras de tecido simultaneamente a todos os poços de uma placa de 96 poços. O dispositivo permite o fornecimen10 to de mais de uma amostra de tecido por poço simplesmente pelo carregamento da mesma placa de 96 poços múltiplas vezes. Os dispositivos furadores multiburaco podem ser concebidos para fornecer simultaneamente amostras a qualquer formato de placa, incluindo mas não limitado a placas de

24 poços, 48 poços e 96 poços. Em outro método concebível, a plataforma de teste suja pode ser uma conta feita de metal, plástico, vidro, cerâmica ou de outro material adequado que é recoberto com substrato de sujeira. Uma ou mais contas recobertas então são colocadas em poços de placas de 96, 48, ou 24 poços ou formatos maiores, contendo tampão adequado e enzima. Neste caso, o sobrenadante pode ser examinado para sujeira liberada pela medição de absorvância direta ou após uma reação de desenvolvimento de cor secundária. Análise da sujeira liberada também poderia ser tomada pela análise espectral de massa. Um ensaio adicional de microsseleção poderia ser para fornecer e proteger uma amostra de tecido, por exemplo, um algodão grosso tingido de índigo, a um poço de uma placa multipoço e para adicionar partículas, tais como areia ou partículas maiores tais como, por exemplo, granada peneirada para incluir partículas de calibre de 6 a 8 ou 9, e agitar a placa para causar abrasão da amostra de tecido pelas partículas adicionadas. Este ensaio foi usado, por exemplo, na avaliação de celulases em aplicações de desbotamento. A eficácia da enzima é julgada por qualquer liberação de cor (isto é, índigo liberado que é dissolvido em dimetilssulfóxido e a absorvância em A6oo nm é medida) no tampão de reação ou por medições de reflectância da amostra desgastada. Quando, por exemplo, amostras de tecido não-tratada como BMI (sangue/leite/tinta) são lavadas em detergente sem alvejamento, uma grande porção da tinta é liberada mesmo sem ajuda de uma protease. Adição de uma protease leva a um pequeno aumento na liberação de tinta, que 5 pode ser difícil quantificar sobre um grande fundo. A presente invenção fornece um protocolo de tratamento que permite controlar o grau de fixação de uma mancha. Como um resultado, é possível produzir amostras de tecido que, por exemplo, liberam quantidades variadas de mancha quando lavadas na ausência da enzima que é testada. O uso de amostras de tecido fixadas 10 leva a uma melhora dramática da proporção sinal/ruído nos ensaios de lavagem. Além disso, pela variação do grau de fixação, cada um pode gerar manchas que dão resultados ótimos sob várias condições de limpeza.

Amostras de tecido tendo manchas de "força" conhecida em vários tipos de material estão comercialmente disponíveis (EMPA, St. Gallen, 15 Suíça; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld, Alemanha; ou Center for Test Materials, Vlaardingen, Holanda) e/ou pode ser feito pelo profissional (Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982)). Amostras de tecido exemplares são uma mancha sangue/leite/tinta (BMI) em um tecido contendo algodão, uma mancha de espinafre em um tecido contendo algodão, ou 20 grama em um tecido contendo algodão, e chocolate/leite/fuligem em um tecido contendo algodão.

Em um aspecto, uma mancha de BMI pode ser fixada ao algodão com 0,0003% a 0,3% de peróxido de hidrogênio. Outras combinações incluem grama ou espinafre fixados com 0,001% a 1% de glutaraldeído, gelatina e corante Coomassie fixada com 0,001% a 1% de glutaraldeído, ou chocolate, leite e fuligem fixados com 0,001% a 1% de glutaraldeído

A amostra de tecido também pode ser agitada durante a incubação com a enzima e/ou formulação detergente. Dados de desempenho de lavagem são dependentes da orientação das amostras de tecido nos poços 30 (horizontal versus vertical), particularmente na placa de 96 poços. Isto indicaria que a mistura foi insuficiente durante o período de incubação. Embora haja diversos modos de assegurar a agitação suficiente durante a incubação, um suporte de placa no qual a placa de microtítulo é imprensada entre duas placas de alumínio pode ser construído. Isto pode ser tão simples como colocação, por exemplo, um selador de placas adesivo sobre os poços que então fixam as duas placas de alumínio à placa de 96 poços com qual5 quer tipo apropriado de fixadores, comercialmente disponíveis. Então pode ser montado em um agitador de incubação comercial. A configuração do agitador a aproximadamente 400 rpm resulta em mistura muito eficiente, enquanto vazamento ou contaminação cruzada são eficientemente prevenidos pelo suporte.

Ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS) pode ser usado para

quantificar a concentração de grupos amino no licor de lavagem. Isto pode servir como uma medida da quantidade de proteína que foi removida da amostra de tecido {vide, por exemplo, Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184 0200 (1997)). Entretanto, se um detergente ou uma amostra de 15 enzima leva à formação de fragmentos peptídicos excepcionalmente pequenos (por exemplo, a partir da presença de peptidases na amostra), então cada um obterá um maior sinal de TNBS, isto é, mais "ruído".

Outros meios de mensuração do desempenho de lavagem de sangue/leite/tinta são baseados na liberação de tinta. A proteólise da proteína nas amostras de tecido leva à liberação de partículas de tinta que podem ser quantificadas pela mensuração da absorvância do licor de lavagem. A absorvância pode ser medida em qualquer comprimento de onda entre 350 e 800 nm. Em outro aspecto, o comprimento de onda é medido em 410 nm ou 620 nm. O licor de lavagem também pode ser examinado para determinar o desempenho da lavagem em manchas contendo grama, espinafre, gelatina ou corante Coomassie. Comprimentos de onda exemplares para estas manchas incluem 670 nm para espinafre ou grama e 620 nm para gelatina ou Coomassie. Por exemplo, uma alíquota do Iicorde lavagem (tipicamente 100 150 μ!_ de uma microplaca de 96 poços, por exemplo) é removida e colocada em uma cubeta ou microplaca multipoço. Isto então é colocado em um espectrofotômetro e a absorvância é lida em um comprimento de onda apropriado. O sistema também pode ser usado para determinar uma composição enzimática e/ou de detergente para lavagem de louças, por exemplo, usando uma mancha de sangue/leite/tinta em um substrato adequado, tal como tecido, plástico ou cerâmica.

Em um aspecto, uma mancha de BMI é fixada ao algodão pela

aplicação de peróxido de hidrogênio 0,3% à amostra de tecido BMI/algodão por 30 minutos a 25°C ou pela aplicação de peróxido de hidrogênio 0,03% à amostra de tecido BMI/algodão por 30 minutos a 60°C. Amostras de tecido menores de aproximadamente 0,635 cm (0,25") são cortadas a partir da a10 mostra de tecido BMI/algodão e colocadas nos poços de uma placa de microtítulo de 96 poços. Em cada poço, uma mistura conhecida de uma composição detergente e uma enzima, tal como uma proteína variante é colocada. Após colocar um selador de placa adesivo sobre a placa de microtítulo, a placa de microtítulo é fixada a uma placa de alumínio e agitada em um agi15 tador orbital a aproximadamente 250 rpm por aproximadamente 10 a 60 minutos. No fim deste tempo, os sobrenadantes são transferidos para poços em uma nova placa de microtítulo e a absorvância da tinta em 620 nm é medida. Isto pode ser similarmente testado com manchas de espinafre ou manchas de grama fixadas ao algodão pela aplicação de glutaraldeído 0,01% à 20 amostra de tecido de espinafre/algodão ou amostra de tecido de grama/algodão por 30 minutos a 25°C. O mesmo pode ser feito com manchas de chocolate, leite, e/ou fuligem. Para variações e condições adicionais para ensaios de sangue/leite/tinta, recorrer a Patente Norte-americana No. 7.122.334 (de Genencor International, Inc.).

5.4 Composições e Uso de Desengomagem de Tecido

São também contempladas composições e métodos de tratamento de tecidos (por exemplo, para desengomar um tecido) usando uma ou mais das variantes de enzima. As variantes de enzima podem ser usadas em quaisquer métodos de tratamento de tecido, que são bem-conhecidos na 30 técnica, vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 6.077.316. Porexemplo, em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contatar o tecido com uma variante enzimática em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão

Em um aspecto, as enzimas são aplicadas durante ou após a 5 tecelagem de tecidos, ou durante a etapa de desengomagem, ou uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Durante a tecelagem de tecidos, os fios são expostos à tensão mecânica considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura muitas vezes são recobertos com goma de amido ou derivados de amido a fim de aumentar sua 10 força elástica e prevenir a quebra. As enzimas podem ser aplicadas para remover essas engomagens de amido ou derivados de amido. Após os tecidos terem sido produzidos, um tecido pode prosseguir para uma etapa de desengomagem. Isto pode ser seguido por uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Desengomagem é o ato de remover goma de 15 tecidos. Após a tecelagem, o revestimento de goma deve ser removido antes ainda do processamento do tecido a fim de assegurar um resultado à prova de lavagem e homogêneo. É também fornecido um método de desengomagem compreendendo hidrólise enzimática da goma pela ação de uma variante enzimática

As variantes enzimáticas podem ser usadas sozinhas ou com

outros reagentes químicos para desengomagem e/ou enzimas de desengomagem para desengomar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos detergentes, por exemplo, em composições aquosas. As variantes de enzima também podem ser usadas em composições e métodos para 25 produzir um visual desbotado tingido pelo tecido de algodão grosso tingido com índigo e artigos de vestuário. Para a produção de roupas, o tecido pode ser cortado e costurado em roupas ou artigos de vestuário, que é posteriormente terminado. Especialmente, para a produção de jeans de algodão grosso, métodos de acabamento enzimático diferentes foram desenvolvidos. 30 O acabamento do artigo de vestuário de algodão grosso normalmente é iniciado com uma etapa de desengomagem enzimática, durante a qual os artigos de vestuário são submetidos à ação de enzimas amilolíticas a fim de fornecer maciez ao tecido e tornar o algodão mais acessível às etapas de acabamento enzimáticas subsequentes. As variantes enzimáticas podem ser usadas em métodos de acabamento de artigos de vestuário de algodão grosso (por exemplo "processo de biodesbotamento"), desengomagem enzimática e fornecimento de maciez a tecidos, e/ou processo de acabamento. 5.5 Composições de Processamento de Amido e Uso Em outro aspecto, composições com as variantes de a-amilase descritas podem ser utilizadas para a liquefação ou sacarificação de amido.

Um aspecto são composições e usos de composições para pro10 duzir adoçantes a partir de amido. Um processo "tradicional" para conversão de amido a xaropes de frutose normalmente consiste em três processos enzimáticos consecutivos, precisamente um processo de liquefação seguido por um processo de sacarificação e um processo de isomerização. Durante o processo de liquefação, o amido é degradado a dextrinas por uma variante 15 de α-amilase em valores de pH entre aproximadamente 5,5 e aproximadamente 6,2 e a temperaturas de aproximadamente 95°C a aproximadamente 160°C por um período de aproximadamente 2 horas. A fim de assegurar uma ótima estabilidade enzimática sob estas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (40 ppm de íons cálcio livres). Processamento de amido é útil 20 para produção de álcool (por exemplo, liquefação de cereal para combustível e álcool potável, fermentação de álcool), liquefação de amido para produção de adoçante, processamento de açúcar de cana, e outros alimentos relacionados a objetivos de processamento de amido. Outras condições podem ser usadas para variantes de α-amilase diferentes.

Após o processo de liquefação, as dextrinas são convertidas à

dextrose pela adição de uma glicoamilase (por exemplo, AMG®) e uma enzima de desramificação, tal como uma isoamilase ou uma pululanase (por exemplo, Promozyme®). Um exemplo de pulanase é a pululanase da cepa 139 gerada em B. Iicheniformis e derivado de BML 780 (gene Aamy; gene de 30 PU amplificável a partir de B. deramificans no Iocus cat com marcador catR; Δ spo Il AC; Δ apr L; e Δ endo-glu C, que são dois genes de protease deletados para prevenir a hidrólise de pululanase). Antes desta etapa, o pH é reduzido a um valor abaixo de aproximadamente 4,5, mantendo a alta temperatura (acima de 95°C), e a atividade de liquefação da variante de a-amilase é desnaturada. A temperatura é reduzida a 60°C, e uma glicoamilase e uma enzima de desramificação podem ser adicionadas. O processo de sacarifi5 cação prossegue tipicamente por aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas.

Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado a um valor na faixa de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0 (por exemplo, pH 7,5), e o cálcio é removido por troca iônica. O xarope de dextrose então é convertido em xarope de alta frutose usando, por exemplo, uma glicose isomerase imobilizada (tal como Sweetzyme®).

Pelo menos uma melhora enzimática deste processo pode ser realizada. Redução da dependência de cálcio da variante de α-amilase de liquefação. Adição de cálcio livre deve assegurar a estabilidade apropriada15 mente alta da variante de α-amilase, mas o cálcio livre inibe fortemente a atividade da glicose isomerase e tem que ser removido, por meio de uma operação unitária cara, até um ponto que reduz o nível de cálcio livre abaixo de 3 a 5 ppm. Economias de custos podem ser obtidas se tal operação puder ser evitada, e o processo de liquefação poderia ser realizado sem adição 20 de íons cálcio livres.

Por exemplo, variante de α-amilase menos dependente de cálcio, que é estável e altamente ativa em concentrações baixas de cálcio livre (<40 ppm) pode ser utilizada na composição e procedimentos. Tal variante de α-amilase deve ter uma condição favorável de pH em um pH na faixa de 25 aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5 (por exemplo, na faixa de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5)

Variantes de α-amilase podem ser usadas em configurações laboratoriais e industriais para hidrolisar amido ou qualquer composto compreendendo maltodextrina com um variedade de objetivos. Estas variantes de 30 α-amilase podem ser usadas sozinhas para fornecer hidrólise específica ou podem ser combinadas com outras amilases para fornecer um "coquetel" de um amplo espectro de atividade. Usos exemplares incluem a remoção ou hidrólise parcial ou completa do amido ou qualquer composto compreendendo maltodextrina a partir de amostras biológicas, alimentícias, de ração animal, farmacêuticas ou industriais.

Um uso exemplar está em um processo de fermentação em que um substrato de amido é liqüefeito e/ou sacarificado na presença da variante(s) enzimática para produzir glicose e/ou maltose adequada para conversão em um produto de fermentação por um organismo fermentador, tal como uma levedura. Tais processos de fermentação incluem um processo para produção de etanol para combustível ou etanol para bebidas (álcool potável), um processo para produção de uma bebida, um processo para produção de compostos orgânicos desejados (por exemplo, tais como ácido cítrico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glicônico, gliconato de sódio, gliconato de cálcio, gliconato de potássio, glicono delta Iactona ou eritorbato de sódio), cetonas, aminoácidos (tais como ácido glutâmico, monoglutaminato de sódio), mas também compostos mais complexos (por exemplo, antibióticos, tais como penicilina, tetraciclina), enzimas, vitaminas (por exemplo, riboflavina, vitamina B12, β-caroteno), e hormônios, que são difíceis de produzir sinteticamente

O amido a ser processado pode ser uma qualidade de amido al20 tamente refinado, por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99,5% puro. Alternativamente, o amido pode ser um amido mais bruto contendo material compreendendo grão inteiro moído incluindo frações não-amido, tais como resíduos de germe e fibras. A matéria-prima, tal como grão inteiro, é moída a fim de abrir a estrutura e permitir 25 processamento adicional. Dois processos de moagem podem ser usados: moagem úmida e seca. Além disso, grãos de milho e grãos de milho moídos podem ser usados.

O grão moído seco, em combinação com amido, compreenderá quantidades significantes de compostos de carboidrato não-amido. Quando tal material heterogêneo é processado por processamento contínuo muitas vezes somente uma gelatinização parcial do amido é alcançada. Como as variantes enzimáticas têm uma alta atividade em relação ao amido nãogelatinizado, as variantes enzimáticas são vantajosamente aplicadas em um processo compreendendo liquefação e/ou sacarificação de amido moído seco por processamento contínuo.

Além disso, devido à atividade de hidrólise superior da variante enzimática, a necessidade de glicoamilase durante a etapa de sacarificação é muito reduzida. Isto permite que sacarificação ser realizada em níveis muito baixos de atividade glicoamilase, e a atividade glicoamilase está ausente ou se presente, então presente em uma quantidade de não mais do que ou até menos de 0,5 AGU/g DS (atividade da GU por grama de sólidos secos IO (DS)); não mais do que ou até menos de 0,4 AGU/g DS; não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,3 AGU/g DS; e menos de 0,1 AGU, tal como não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,05 AGU/g DS de substrato de amido. Expresso em mg de proteína enzima, a enzima tendo atividade glicoamilase está ausente ou presente em uma quantidade de não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,5 mg EP/g DS (proteína enzima por grama de sólidos secos); não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,4 mg EP/g DS; não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,3 mg EP/g DS; e não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,1 mg EP/g DS, tal como não mais do que ou até menos de aproximadamente 0,05 mg EP/g DS ou não mais do que ou até menos de 0,02 mg EP/g DS de substrato de amido. A glicoamilase pode ser derivada de uma cepa dentro de Aspergillus sp., Talaromyces sp., Pachykytospora sp., ou Trametes sp., com exemplos exemplares sendo Aspergillus niger, Talaromyees emersonii, Trametes eingulata ou Paehykytospora papyraeea. Expresso em mg de proteína enzima, a variante enzimática po

de ser dosada em quantidades de não mais do que ou até menos de 0,5 mg EP/g DS; não mais do que ou até menos de 0,4 mg EP/g DS; não mais do que ou até menos de 0,3 mg EP/g DS; ou não mais do que ou até menos de 0,1 mg EP/g DS, tal como não mais do que ou até menos de 0,05 mg EP/g 30 DS ou não mais do que ou até menos de 0,02 mg EP/g DS de substrato de amido. A variante enzimática do primeiro aspecto pode ser dosada em quantidades de 0,05 a 10,0 AFAU/g DS, tal como 0,4 a 5,0 AFAU/g DS, tal como de 0,25 a 2,5 AFAU/g DS de amido.

O processo pode compreender a) contato de um substrato de amido com uma variante enzimática compreendendo um módulo catalítico tendo atividade α-amilase e um módulo de ligação a carboidrato, por exem5 pio, o polipeptídeo do primeiro aspecto; b) incubação do dito substrato de amido com a dita variante enzimática por um tempo e a uma temperatura suficiente para alcançar a conversão de pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% de p/p do dito 10 substrato de amido em açúcares fermentáveis; c) fermentação para produzir um produto de fermentação; e d) opcionalmente recuperação do produto de fermentação. Durante as etapas do processo b) e/ou c), uma enzima tendo atividade glicoamilase está ausente ou presente em uma quantidade de 0,001 a 2,0 AGU/g DS, de 0,01 a 1,5 AGU/g DS, de 0,05 a 1,0 AGU/g DS, 15 de 0,01 a 0,5 AGU/g DS. A enzima tendo atividade glicoamilase pode estar ausente ou presente em uma quantidade de não mais do que ou até menos de 0,5 AGU/g DS; não mais do que ou até menos de 0,4 AGU/g DS; não mais do que ou até menos de 0,3 AGU/g DS; ou não mais do que ou até menos de 0,4 AGU/g DS, tal como não mais do que ou até menos de 0,05 20 AGU/g DS de substrato de amido. Expresso em mg de proteína enzima, a enzima tendo atividade glicoamilase está ausente ou presente em uma quantidade de não mais do que ou até menos de 0,5 mg EP/g DS; não mais do que ou até menos de 0,4 mg EP/g DS; não mais do que ou até menos de 0,3 mg EP/g DS; ou não mais do que ou até menos de 0,4 mg EP/g DS1 tal 25 como não mais do que ou até menos de 0,05 mg EP/g DS ou não mais do que ou até menos de 0,02 mg EP/g DS de substrato de amido. Nas etapas do processo a), b), c), e/ou d) podem ser realizadas separadamente ou simultaneamente.

Em outro aspecto, o processo pode compreender: a) contato de um substrato de amido com uma célula de levedura transformada para expressar uma variante enzimática compreendendo um módulo catalítico tendo atividade α-amilase e um módulo de ligação a carboidrato, por exemplo, o polipeptídeo do primeiro e/ou segundo aspecto; b) incubação do dito substrato de amido com a dita levedura por um tempo e a uma temperatura suficiente para alcançar a conversão de pelo menos 90% de p/p do substrato do dito amido em açúcares fermentáveis; c) fermentação para produzir eta5 nol; d) opcionalmente recuperação de etanol. As etapas a), b), e c) podem ser realizadas separadamente ou simultaneamente.

Ainda em outro aspecto, o processo compreendendo hidrólise de uma pasta fluida de amido gelatinizado ou granular, em particular, hidrólise de amido granular em um hidrolisado de amido solúvel a uma temperatu10 ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do dito amido granular. Além de ser contatado com um polipeptídeo compreendendo um módulo catalítico tendo atividade α-amilase e um módulo de ligação a carboidrato, por exemplo, o polipeptídeo do primeiro aspecto, o amido pode ser contatado com uma enzima selecionada a partir do grupo composto de α-amilase fún15 gica (EC 3.2.1.1) e um ou mais do seguinte: uma β-amilase (EC 3.2.1.2), e uma glicoamilase (EC 3.2.1.3). Em uma modalidade, outra enzima amilolítica adicional ou uma enzima de desramificação, tal como uma isoamilase (EC 3.2.1.68), ou pululanases (EC 3.2.1.41) podem ser adicionadas à variante de a-amilase.

Em uma modalidade, o processo é conduzido a uma temperatu

ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial. Tais processos são muitas vezes conduzidos pelo menos a 30°C, pelo menos 31 °C, pelo menos 32°C, pelo menos 33°C, pelo menos 34°C, pelo menos 35°C, pelo menos 36°C, pelo menos 37°C, pelo menos 38°C, pelo menos 39°C, pelo menos 40°C, 25 pelo menos 410C1 pelo menos 42°C, pelo menos 43°C, pelo menos 44°C, pelo menos 45°C, pelo menos 46°C, pelo menos 47°C, pelo menos 48°C, pelo menos 49°C, pelo menos 50°C, pelo menos 51 °C, pelo menos 52°C, pelo menos 53°C, pelo menos 54°C, pelo menos 55°C, pelo menos 56°C, pelo menos 57°C, pelo menos 58°C, pelo menos 59°C, ou pelo menos 60°C. 30 O pH no qual o processo é conduzido deve estar na faixa de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, ou de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 6,0, ou de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. Um aspecto contempla um processo compreendendo fermentação, por exemplo, com uma levedura para produzir o etanol, por exemplo, a uma temperatura em torno de 32°C, tal como de 30 a 35°C.

Em outro aspecto, o processo compreende sacarificação e fermentação simultâneas, por exemplo, com uma levedura para produção de etanol, ou outro organismo de fermentação adequado para produzir um composto orgânico desejado, tal como a uma temperatura de 30 a 35°C, por exemplo, em torno de 32°C.

Nos processos de fermentação acima, o conteúdo de etanol al10 cança pelo menos aproximadamente 7%, pelo menos aproximadamente 8%, pelo menos aproximadamente 9%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 11%, pelo menos aproximadamente 12%, pelo menos aproximadamente 13%, pelo menos aproximadamente 14%, pelo menos aproximadamente 15%, tais como pelo menos aproximadamente 15 16% de etanol.

A pasta fluida de amido a ser usada em qualquer um dos aspectos acima pode ter aproximadamente 20% a aproximadamente 55% de sólidos secos de amido granular, ou aproximadamente 25% a aproximadamente 40% de sólidos secos de amido granular, ou aproximadamente 30% a 20 aproximadamente 35% de sólidos secos de amido granular. Após ser contatada com a variante enzimática, a variante enzimática converte o amido solúvel em um hidrolisado de amido solúvel do amido granular na quantidade de pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo 25 menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%.

Em outra modalidade, a variante enzimática compreende um módulo catalítico que tem atividade α-amilase e um módulo de ligação a carboidrato, por exemplo, o polipeptídeo do primeiro aspecto, é usado em 30 um processo para liquefação, sacarificação de um amido gelatinizado, por exemplo, mas não limitado à gelatinização por processamento contínuo. O processo pode compreender fermentação para produzir um produto de fermentação, por exemplo, etanol. Tal processo para produção de etanol a partir do material contendo amido por fermentação compreende: (i) liquefação do dito material contendo amido com um polipeptídeo compreendendo um módulo catalítico tendo atividade α-amilase e um módulo de ligação a carboidrato, por exemplo, o polipeptídeo do primeiro aspecto; (ii) sacarificação da massa liqüefeita obtida; e (iii) fermentação do material obtido na etapa (ii) na presença de um organismo fermentador. Opcionalmente o processo compreende ainda a recuperação de etanol. Os processos de sacarificação e fermentação podem ser realizados como um processo de sacarificação e fermentação simultâneo (processo SSF). Durante a fermentação, o conteúdo de etanol atinge pelo menos aproximadamente 7%, pelo menos aproximadamente 8%, pelo menos aproximadamente 9%, pelo menos aproximadamente 10%, tais como pelo menos aproximadamente 11%, pelo menos aproximadamente 12%, pelo menos aproximadamente 13%, pelo menos aproximadamente 14%, pelo menos 15%, tal como pelo menos 16% de etanol O amido a ser processado nos processos dos aspectos acima pode ser especialmente obtido de tubérculos, raízes, troncos, legumes, cereais ou grão inteiro. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido de milhos, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. Especialmente contempladas são ambos os tipos encerados e não encerados de milho e cevada.

A composição descrita acima pode ser usada para liquefação e/ou sacarificação de um amido gelatinizado ou granular, e um amido parci25 almente gelatinizado. Um amido parcialmente gelatinizado é um amido que até certo ponto é gelatinizado, isto é, em que parte do amido inchou irreversivelmente e gelatinizou e parte do amido está presente ainda em um estado granular.

A composição descrita acima pode compreender variante de aamilase ácida presente em uma quantidade de 0,01 a 10,0 AFAU/g DS, ou 0,4 a 5,0 AFAU/g DS1 ou 0,5 a 3,0 AFAU/AGU, ou 0,3 a 2,0 AFAU/g DS. A composição pode ser aplicada em qualquer um dos processos de amido descritos acima.

Como usado neste pedido, o termo "liquefação" ou "liquefazer" significa um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas de cadeia mais curta e menos viscosas. Geralmente, este processo implica a gelatini5 zação do amido simultaneamente com ou seguido pela adição da variante de α-amilase. As enzimas de indução de liquefação adicionais também podem ser opcionalmente adicionadas

Como usado neste pedido, o termo "liquefação primária" referese a uma etapa de liquefação quando a temperatura da pasta fluida é eleva10 da para ou próxima a sua temperatura de gelatinização. Subsequente a elevação da temperatura, a pasta fluida é enviada através de um trocador de calor ou jato a temperaturas de 93,3 a 148,8°C, por exemplo, 104,4 a 112,7°C. Subsequente à aplicação a uma troca de calor ou temperatura em jato, a pasta fluida é mantida por um período de 3 a 10 minutos naquela 15 temperatura. Esta etapa de manutenção da pasta fluida a 93,3 a 148,8°C é a liquefação primária.

Como usado neste pedido, o termo "liquefação secundária" refere-se à etapa de liquefação subsequente à liquefação primária (aquecendo a 93,3 a 148,8°C F), quando se permite que a pasta fluida resfrie à temperatura atmosférica. Esta etapa de resfriamento pode ser de 30 minutos a 180 minutos (3 horas), por exemplo, 90 minutos a 120 minutos (2 horas).

Como usado neste pedido, o termo "minutos de liquefação secundária" refere-se ao tempo decorrido a partir da liquefação secundária, tempo que a DE é medida Outro aspecto contempla o uso adicional de uma β- amilase na

composição compreendendo a variante de a-amilase, β-amilases (EC 3.2.1.2) são amilases maltogênicas de exo-atuação, que catalisam a hidrólise de ligações 1,4- α-glicosídicas na amilose, amilopectina, e polímeros de glicose relacionados, por meio disso liberando maltose. β-Amilases fo30 ram isoladas de várias plantas e micro-organismos (W. M. Fogarty and C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979). Estas β-amilases são caracterizadas por ter temperaturas ótimas na faixa de 40°C a 65°C, e pH ótimo na faixa de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0. β-amilases contempladas incluem, mas não são limitadas a, β-amilases de cevada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt® ME, Optimalt® BBA (Genencor International, Inc.); e Novozym® WBA (Novozymes AJS).

Outra enzima contemplada para uso na composição é uma glicoamilase (EC 3.2.1.3). Glicoamilases são derivadas de um micro-organismo ou uma planta. Glicoamilases exemplares são de origem fúngica ou bacteriana. Glicoamilases bacterianas exemplares são glicoamilases de Aspergil10 lus, em particular, glicoamilase de A. Niger G1 ou G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1102), ou variantes das mesmas, tal como descrito em WO 92/00381; e WO 00/04136; a glicoamilase de A. awamori (WO 84/02921); A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4):941-949), ou variantes ou fragmentos das mesmas.

Outras variantes de glicoamilase de Aspergillus contempladas

incluem variantes para aumentar a estabilidade térmica: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot Eng. 9: 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35: 20 8698-8704); e introdução de resíduos de Pro em posições A435 e S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10:1199-1204. Outras glicoamilases contempladas incluem glicoamilases de Talaromyces, especialmente derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces Ieycettanus (Patente Norteamericana No. RE 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilics 25 (Patente Norte-americana No. 4.587.215). Glicoamilases bacterianas contempladas incluem glicoamilases do gênero Clostridium, em particular, C. thermoamylolyticum (EP 135138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Glicoamilases exemplares incluem as glicoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, tais como uma glicoamilase tendo homologia de 50%, 30 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ou até 90% à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 de WO 00/04136. São também contempladas as glicoamilases comerciais, tais como AMG 200L; AMG 300L; SAN® SUPER e AMG® E (de Novozymes); OPTIDEX® 300 (de Genencor International, Inc.); AM IGAS E® e AMIGASE® PLUS (de DSM); G-ZYME® G900 (de Enzyme Bio-Systems); G-ZYME® G990 ZR (glicoamilase de A. niger e baixo conteúdo de protease).

Glicoamilases podem ser adicionadas em uma quantidade de

0,02 a 2,0 AGU/g DS1 tais como 0,4 a 1,0 AGU/g DS, ou, tais como 0,2 AG U/g DS.

Variantes enzimáticas adicionais também são contempladas para inclusão na composição. Duas ou mais variantes de α-amilase podem ser 10 usadas sozinhas ou em combinação com outras enzimas discutidas neste pedido. Por exemplo, uma terceira enzima pode ser outra α-amilase (por exemplo, uma α-amilase de levedura) ou outra variante de α-amilase. Estas podem ser α-amilases de Bacillus ou α-amilases não-BacilIus.

Outra enzima que pode ser opcionalmente adicionada é uma 15 enzima de desramificação, tal como uma isoamilase (EC 3.2.1.68) ou puluIanases (EC 3.2.1.41). A isoamilase hidrolisa as ligações ramificadas a-l,6-Dglicosídicas na amilopectina e dextrinas de limite β e pode ser distinta das pululanases pela incapacidade da isoamilase em atacar pululana, e pela ação limitada em dextrinas de limite o. Enzimas de desramificação podem ser 20 adicionadas em quantidades eficazes bem-conhecidas à pessoa versada na técnica.

A composição exata dos produtos do processo depende da combinação de enzimas aplicadas bem como o tipo de amido granular processado. O hidrolisado solúvel pode ser maltose com uma pureza de pelo 25 menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95,0%, pelo menos aproximadamente 95,5%, pelo menos aproximadamente 96,0%, pelo menos aproximadamente 96,5%, pelo menos aproximadamente 97,0%, pelo menos aproximadamente 97,5%, pelo menos aproximadamente 98,0%, pelo menos aproximadamente 98,5, pelo 30 menos aproximadamente 99,0% ou pelo menos aproximadamente 99,5%. O hidrolisado de amido solúvel também pode ser glicose ou o hidrolisado de amido tem um DX (porcentagem de glicose do total de sólidos secos solubilizados) de pelo menos 94,5%, pelo menos 95,0%, pelo menos 95,5%, pelo menos 96,0%, pelo menos 96,5%, pelo menos 97,0%, pelo menos 97,5%, pelo menos 98,0%, pelo menos 98,5, pelo menos 99,0% ou pelo menos 99,5%. Igualmente contemplado, entretanto, é o processo em que o produto 5 é um xarope especial, tal como um xarope especial contendo uma mistura de glicose, maltose, DP3 e DPn para uso na produção de sorvetes, tortas, balas, fruta em conserva.

Dois processos de moagem contemplados incluem: moagem úmida e seca. Na moagem seca, a semente inteira é moída e usada. A mo10 agem úmida fornece uma boa separação de germe e farinha (grânulos de amido e proteína), e é com algumas exceções, aplicada em locais onde o hidrolisado de amido é usado na produção de xaropes. Ambas as moagens, seca e úmida, são bem-conhecídas na técnica do processamento de amido e são igualmente contempladas para o uso com as composições e métodos 15 descritos. O processo pode ser conduzido em um sistema de ultrafiltração onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto e água e onde o permeado é o hidrolisado de amido solúvel. Igualmente contemplado é o processo conduzido em um reator de membrana contínuo com membranas de ultrafiltração e onde o retido é mantido sob recircu20 lação na presença de enzimas, amido bruto e água, e onde o permeado é o hidrolisado de amido solúvel. É também contemplado o processo conduzido em um reator de membrana contínuo com membranas de microfiltração e onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto e água, e onde o permeado é o hidrolisado de amido solúvel.

Em uma consideração, o hidrolisado de amido solúvel do pro

cesso é submetido à conversão em xarope baseado em amido de alta frutose (HFSS), tal como xarope de milho de alta frutose (HFCS). Esta conversão pode ser realizada usando uma glicose isomerase, e, tal como a enzima imobilizada em um suporte sólido. Isomerases contempladas incluem os pro30 dutos comerciais Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, e Gzyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquida, e GenSweet® IGI. Em outro aspecto, o hidrolisado de amido solúvel da produção de rendimentos produzidos de combustível ou etanol potável. No processo do terceiro aspecto, a fermentação pode ser realizada simultaneamente ou separadamente/seqüencial à hidrólise da pasta fluida de amido granular.

5 Quando a fermentação é realizada simultânea à hidrólise, a temperatura pode estar entre 30°C e 35°C, ou entre 310C e 34°C. O processo pode ser conduzido em um sistema de ultrafiltração onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto, levedura, nutrientes de levedura e água e onde o permeado é um líquido contendo etanol. Igualmente 10 contemplado é o processo conduzido em um reator de membrana contínuo com membranas de ultrafiltração e onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto, levedura, nutrientes de levedura e água e onde o permeado é um líquido contendo etanol.

O hidrolisado de amido solúvel do processo também pode ser 15 usado para produção de um produto de fermentação compreendendo fermentação do amido tratado em um produto de fermentação, tal como ácido cítrico, glutamato de monossódico, ácido glicônico, gliconato de sódio, gliconato de cálcio, gliconato de potássio, glicono delta lactona, ou eritorbato de sódio.

A atividade amilolítica da variante de α-amilase pode ser de

terminada usando amido de batata como substrato. Este método é baseado no esgotamento do amido de batata modificado pela enzima, e a reação é seguida pela mistura das amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor enegrecida azulada é formada, mas 25 durante o esgotamento do amido a cor azul torna-se mais fraca e gradualmente transforma-se em um castanho-avermelhado, que é comparada a um padrão de vidro colorido.

5.7 Composições e Uso para Remoção de Biofilme A composição pode compreender variantes de α-amilase como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente para uso na remoção de biofilmes. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como múltipias amilases, ou um coquetel de enzimas incluindo uma aminopeptidase, amilase (β- ou a- ou glicoamilase), carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deSoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, β-galactosidase, glicoamilase, a5 glucosidase, β-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase e/ou xilanase, ou qualquer combinação das mesmas para remoção de biofilmes. A enzima(s) adiciona(ais) pode(m) ser produtível por meio de um micro10 organismo pertencente ao gênero Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae\ ou Trichoderma\ Humicola, tal como Humicola insolens; ou Fusarium, tal como Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heteros15 porum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum.

As composições compreendendo variante de α-amilase podem 20 ser preparadas conforme métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição contendo a variante de α-amilase pode estar na forma granular ou microgranular. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado conforme métodos conhecidos na técnica 25 Exemplos são dados abaixo dos usos das composições polipep

tídicas. A dosagem da composição contendo a variante de α-amilase e outras condições sob as quais a composição é usada pode ser determinada com base em métodos conhecidos na técnica.

As variantes de α-amilase são ainda contempladas para uso em uma composição junto com uma 2,6^-D-frutano hidrolase ou variante da mesma.

Um processo é a desintegração e/ou remoção de biofilme. O termo "desintegração" como usado neste pedido deve ser entendido como a hidrólise de polissacarídeos em uma conexão de matriz de biofilme e ligação em conjunto a células microbianas individuais no biofilme, pelo qual as células microbianas podem ser liberadas e removidas do biofilme. O biofilme es5 tá presente em uma superfície, e a desintegração do biofilme é realizada pela indução da superfície em contato, por exemplo, por imersão, revestimento ou borrifo da superfície com um meio aquoso compreendendo uma variante de α-amilase ou uma ou mais enzimas responsáveis por fragmentar biofilmes, tais como mas não limitadas a 2,6-p-D-frutano hidrolase. A com10 posição pode ser usada para hidrolisar a lama, por exemplo, em águas brancas na indústria de polpa e papel.

A variante de α-amilase pode estar presente na quantidade de 0,0001 a 10.000 mg/L, ou 0,001 a 1000 mg/L, ou 0,01 a 100 mg/L, ou até 0,1 a 10 mg/L. Enzimas adicionais e variantes enzimáticas podem estar presentes em quantidades semelhantes ou menos, dependente do uso e solubilidade da enzima na solução final.

O processo pode ser apropriadamente realizado em temperaturas de aproximadamente temperatura ambiente a aproximadamente 70°C. Uma faixa de temperatura exemplar é de aproximadamente 30°C a aproximadamente 60°C, por exemplo, aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C.

Um pH adequado para hidrolisação de biofilmes situa-se na faixa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,5. Uma faixa exemplar inclui pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8, por exemplo, de 25 aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. O tempo de contato ou o tempo da reação para variante enzimática remover efetivamente um biofilme pode variar consideravelmente, dependendo das propriedades do biofilme e da frequência a qual uma superfície é tratada com a variante enzimática sozinha ou em combinação com outras enzimas, tais como 2,6^-D-frutano 30 hidrolase. Por exemplo, um tempo de reação adequado situa-se em aproximadamente 0,25 a aproximadamente 25 horas, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, por exemplo aproximadamente 2 horas.

Enzimas adicionais que podem ser combinadas com as variantes de α-amilase e 2,6-p-D-frutano hidrolases incluem mas não são limitadas a celulases, hemicelulases, xilanases, outras amilases incluindo outras a5 amilases, lipases, proteases e/ou pectinases.

As enzimas podem ser ainda combinadas com agentes antimicrobianos, tais como biocidas enzimáticos ou não-enzimáticos. Um biocida enzimático pode ser, por exemplo, uma composição compreendendo uma oxidorredutase, por exemplo, uma Iacase ou uma peroxidase, especialmente 10 haloperoxidase, e opcionalmente um agente de potencialização, tal como um siringato de alquila, como descrito, por exemplo, nos Pedidos de Patente WO 97/42825 e DK 97/1273.

A superfície da qual um biofilme deve ser removido e/ou tirado pode ser uma superfície dura, que por definição relaciona-se a qualquer superfície que é essencialmente não-permeável a micro-organismos. Exemplos de superfícies são superfícies feitas de metal, por exemplo, ligas de aço inoxidável, polímero plásticos/sintético, borracha, papelão, vidro, madeira, papel, tecido, concreto, pedra, mármore, gesso e materiais cerâmicos que opcionalmente podem ser recobertos, por exemplo, com pintura, esmalte, polímeros e similares. Consequentemente, a superfície pode ser um membro de um sistema de controle, transporte, processamento, ou no contato com soluções aquosas, tais como sistemas de distribuição de água, sistemas de processamento de alimentos, sistemas de resfriamento, sistemas de processamento químico ou sistemas de processamento farmacêutico. As composições e métodos de uso das composições para remoção de biofilme na indústria de processamento de madeira, tal como a indústria de polpa e/ou papel. Consequentemente, as variantes enzimáticas e composições contendo as variantes enzimáticas são úteis em um sistema de limpeza no local convencional (C-l-P). A superfície pode ser um membro de uma unidade de sistema, tal como tubos, tanques, bombas, membranas, filtros, trocadores de calor, centrífugas, evaporadores, misturadores, torres de pulverização, válvulas e reatores. A superfície também pode ser ou ser uma parte de utensílios usados na ciência médica e indústria tal como endoscópios, dispositivos protéticos ou implantes médicos contaminados

As composições para remoção de biofilme também são contempladas para impedir que a chamada biocorrosão ocorra quando uma superfí5 cie metálica, por exemplo, um duto, é atacado por um biofilme microbiano, que pela desintegração do biofilme que por meio disso impede as células microbianas do biofilme de criar um ambiente para biofilme, que corrói a superfície metálica á qual está ligado

Outra aplicação para composições antibiofilme é para o cuidado oral. A superfície também pode, entretanto, ser de origem biológica, tal como membranas mucosas, pele, dentes, cabelo, unhas etc.

Dentes com placa dentária, por exemplo, pela incorporação de variantes enzimáticas na pasta de dentes, e lentes de contato contaminadas são englobadas como superfícies. Consequentemente, as enzimas variantes 15 podem ser usadas para composições e processos para produzir um medicamento compreendendo uma variante enzimática para desintegração da placa presente em um dente humano ou animal. Um uso adicional é a desintegração de biofilme de membranas mucosas, tal como biofilme em pulmões em pacientes sofrendo de fibrose cística.

Consequentemente, ainda em um aspecto adicional relaciona

se a uma composição para cuidado oral compreendendo uma variante enzimática recombinante, purificada e essencialmente livre de quaisquer contaminantes ativos. Uma composição de cuidado oral pode compreender apropriadamente uma quantidade de uma variante enzimática recombinante.

Outras enzimas para uso em composições de cuidado oral in

cluem mas não são limitadas a atividade 2,6-p-D-frutano hidrolase na composição de cuidado oral. Atividades enzimáticas contempladas incluem atividades do grupo de enzimas compreendendo dextranase; mutanases; oxidases, tais como glicose oxidase, L-aminoácido oxidase, peroxidases, tais co30 mo, por exemplo, peroxidases de Coprinus sp. descritas em WO 95/10602 (de Novo Nordisk A/S) ou lactoperoxidase, haloperoxidases, especialmente haloperoxidase derivável de Curvularia sp., em particular, C. verruculosa e C. inaequalis; lacases; proteases, tais como papaína, protease acídica (por exemplo, as proteases acídicas descritas em WO 95/02044 (Novo Nordisk A/S)), endoglicosidases, Iipases, amilases, incluindo amiloglicosidases, tais como AMG (de Novo Nordisk A/S); enzimas antimicrobianas e misturas das 5 mesmas.

A composição para cuidado oral pode ter qualquer forma física adequada {isto é, pó, pasta, gel, líquido, unguento, pastilha etc.). Uma "composição para cuidado oral" inclui uma composição, que pode ser usada para manter ou melhorar a higiene oral na boca de humanos e animais, pela prevenção de cáries dentárias, prevenção da formação de placa dentária e tártaro, remoção da placa dentária e tártaro, prevenção e/ou tratamento doenças dentárias etc. Pelo menos no contexto das composições para cuidado oral também engloba produtos para limpar dentaduras, dentes artificiais e similares. Exemplos de tais composições para cuidado oral incluem pasta de dente, creme dental, gel ou pó para dente, lavagens bucais odônticas, formulações de enxágüe pré ou pós escovação, chiclete, pastilhas e bala. Pastas de dente e géis dentais tipicamente incluem materiais de polimento abrasivos, agentes espumantes, agentes aromatizantes, umectantes, ligantes, espessantes, agentes adoçantes, agentes removedores de mancha/alvejamento/clareamento, água, e opcionalmente enzimas.

Os enxaguantes bucais, incluindo líquidos de remoção de placa, tipicamente compreendem uma solução de água/álcool, sabor, umectante, adoçante, agente espumante, corante e opcionalmente, enzimas.

Material de polimento abrasivo também poderia ser incorporado na composição para cuidado oral, tal como um dentifrício.

Consequentemente, o material de polimento abrasivo pode incluir alumina e hidratos da mesma, tais como alfa alumina tri-hidrato; trissilicato de magnésio; carbonato de magnésio; caulim; aluminossilicatos, tais como silicato de alumínio calcinado e silicato de alumínio; carbonato de cál30 cio; silicato de zircônio; e também plásticos em pó, tais como cloreto de polivinila; poliamidas; metacrilato de polimetila; poliestireno; resinas de fenolformaldeído; resinas de melamina-formaldeído; resinas de ureia-formaldeído; resinas epóxi; polietileno em pó; xerogéis de sílica; hidrogéis e aerogéis e similares. São também adequados como agentes abrasivos, pirofosfato de cálcio; metafosfatos alcalinos insolúveis em água; fosfato de dicálcico e/ou seu di-hidrato, ortofosfato dicálcico; fosfato tricálcico; hidroxiapatita particuIada e similares. É também possível empregar misturas destas substâncias Dependendo da composição para cuidado oral, o produto abrasivo pode estar presente de aproximadamente 0% a aproximadamente 70% em peso, por exemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 70%. Para pastas de dente, o conteúdo material abrasivo tipicamente situa-se na faixa a partir de 10% a 70% em peso da pasta de dente final.

Umectantes são empregados para prevenir a perda de água de, por exemplo, pastas de dente. Umectantes adequados para uso em composições para cuidado oral incluem os seguintes compostos e misturas dos mesmos; glicerol; poliol; sorbitol; polietileno glicóis (PEG); propileno gli15 col; 1,3-propanodiol; 1,4-butanodiol; polissacarídeos hidrolisados parcialmente hidrogenados e similares. Umectantes estão presentes em geral de 0% a aproximadamente 80%, por exemplo, aproximadamente 5% a aproximadamente 70% em peso, na pasta de dente.

Sílica, amido, goma tragacanta, goma de xantanoa, extratos de 20 musgo irlandês, alginatos, pectina, derivados de celulose, tais como hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e hidroxipropilcelulose, ácido poliacrílico e seus sais, polivinilpirrolidona, podem ser mencionados como exemplos de espessantes e Iigantes adequados, que ajudam na estabilização de um produto dentifrício. Espessantes podem estar presentes nas pas25 tas de dente em cremes e géis em uma quantidade de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% em peso, e Iigantes em um nível de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10% em peso do produto final.

Como agente espumante de sabão, tensoativos aniônicos, catiônicos, não-iônicos, anfóteros e/ou zwitteriônicos podem ser usados. Estes podem estar presentes em níveis de 0% a aproximadamente 15%, ou de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 13%, ou de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 10% em peso do produto final. Tensoativos são somente adequados até o nível que não exerçam um efeito de inativação sobre as enzimas presentes. Tensoativos incluem sulfatos de álcool graxo, sais de monoglicerídeos sulfonados ou ácidos graxos que têm 10 a 20 átomos de carbono, produtos de condensação de 5 albumina-ácido graxo, sais de amidas de ácidos graxos e taurinas e/ou sais de ésteres de ácido graxo de ácido isetiônico

Adoçantes adequados incluem sacarina para uso em uma formulação.

Aromas, tais como hortelã, estão presentes normalmente em baixas quantidades, tais como de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% em peso, especialmente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%.

Agentes de clareamento/alvejamento incluem H2O2 e podem ser adicionados em quantidades de menos que aproximadamente 5%, ou de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 4%, calculadas por peso do produto final

Os agentes de clareamento/alvejamento podem ser uma enzima, tal como uma oxidorredutase. Exemplos de enzimas de alvejamento dos dentes adequadas, tais como aquelas descritas em WO 97/06775 (de Novo Nordisk AJS).

Água é normalmente adicionada em uma quantidade que fornece, por exemplo, a pasta de dentes uma forma fluida

Agentes anti-bacterianos solúveis em água adicionais, tais como digliconato de cloroexidina, hexetidina, alexidina, Triclosan®, compostos antibacterianos de amônio quaternário e fontes solúveis em água de certos íons metálicos, tais como zinco, cobre, prata e estanho (por exemplo, cloreto de zinco, cobre e estanho, e nitrato de prata) também podem ser incluídos.

É também contemplada a adição de compostos que podem ser usados como fonte de fluoreto, tinturas/corantes, conservantes, vitaminas, agentes de ajuste de pH, agentes de anticárie, agentes desensibilizantes etc.

Outros componentes úteis em composições para cuidado orais são enzimas como descritas acima. Enzimas são catalisadores biológicos de reações químicas em sistemas vivos. Enzimas combinam-se com os substratos sobre os quais atuam formando um complexo enzima-substrato intermediário. Este complexo então é convertido em um produto de reação, e 5 uma enzima liberada que continua a sua função enzimática específica.

Enzimas fornecem vários benefícios quando usadas para limpar a cavidade oral. Proteases fragmentam proteínas salivares, que são adsorvidas na superfície do dente e formam a película, a primeira camada da placa resultante. Proteases junto com lipases destroem bactérias pela Iise de 10 proteínas e lipídios que formam os componentes estruturais das paredes e membranas celulares bacterianas.

Dextranase e outras carbohidrases, tais como os 2,6-β-ϋfrutano hidrolase fragmentam a estrutura do esqueleto orgânico produzido por bactérias que formam uma matriz para adesão bacteriana. Proteases e 15 amilases, não só previnem a formação de placa, mas também previnem o desenvolvimento de cálculos pela quebra do complexo de carboidratoproteína que liga cálcio, impedindo a mineralização.

Uma pasta de dente pode compreender tipicamente os seguintes ingredientes (em % em peso da composição de pasta de dente final): 20 material abrasivo em aproximadamente 70%; umectante: 0% a aproximadamente 80%; espessante: aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20%; ligante: aproximadamente 0,01% a aproximadamente 10%; adoçante: aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%; agente espumante: 0% a aproximadamente 15%; clareador: 0% a aproximadamente 5%; e enzimas: apro25 ximadamente 0,0001 % a aproximadamente 20%.

Em uma modalidade específica, uma pasta de dentes tem um pH na faixa de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, e compreende: a) aproximadamente 10% a aproximadamente 70% de material abrasivo; b) 0% a aproximadamente 80% de umectante; c) 0,1% a aproximadamente 30 20% de espessante; d) 0,01% a aproximadamente 10% de ligante; e) aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% de adoçante; f) 0% a aproximadamente 15% de agente espumante; g) 0% a aproximadamente 5% de ciareador; i) aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 20% de enzimas.

As ditas enzimas mencionadas sob i) incluem variantes de aamilase sozinhas ou em combinação com outras enzimas, tais como 2,6-βD-frutano hidrolase, e opcionalmente outros tipos de enzimas mencionadas acima conhecidas por serem usadas em pastas de dente e similares.

Um enxaguante bucal pode compreender tipicamente os seguintes ingredientes (em % em peso da composição de lavagem bucal final): 0% a aproximadamente 20% de umectante; 0% a aproximadamente 2% de tensoativo; 0% a aproximadamente 5% de enzimas; 0% a aproximadamente 10 20% de etanol; 0% a aproximadamente 2% de outros ingredientes (por exemplo, aroma, adoçantes, ingredientes ativos, tais como fluoretos). A composição também pode conter de aproximadamente 0% a aproximadamente 70% de água.

A composição de lavagem bucal pode ser tamponada com um tampão apropriado, por exemplo, citrato ou fosfato de sódio na faixa de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5.

O enxaguante bucal pode estar em uma forma não-diluída (isto é, deve ser diluído antes do uso).

As composições para cuidado oral podem ser produzidas usando qualquer método convencional conhecido na técnica de cuidado oral.

Será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições e métodos de uso mesmo sem se afastar do espírito ou escopo do uso desejado. Dessa maneira, estão as modificações e variações fornecidas por eles no escopo das reivindicações acrescentadas e seus equivalentes.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

α-amilase variante de B. Iicheniformis AM de Spezyme® FRED

FRED da cepa BML 612 de B. Iicheniformis é o gene Aamy, gene amplificável de FRED no Iocus cat com o marcador catR, e Δ spo Il AC.

Para expressar α-amilase de Spezyme® FRED a partir do plasmídeo de expressão pHPLT (vide, por exemplo, Pedido de Patente Norteamericana Publicado No. 2006/0014265 e Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2005/111203), o gene α-amilase de Spezyme® FRED foi amplificado por PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) com os iniciadores de sentido direto LAT(PstI) e de sentido reverso LAT(HpaI):

LAT (PSTI) de sentido direto.

5’

GAAT GTCT GCAG CTT CAGCAG CAAAT CTT AAT G G G ACG CT GAT G CAG3’(SEQ ID NO: 3)

LAT(HPAI)

5’

CCCGGGGTTAACT CAT CTTT GAACAT AAATT GAAACCGACCCGCCG3'(SEQ ID NO: 4)

PCR foi realizada em um termociclador com Taq polimerase Platinum de Alta Fidelidade de (Invitrogen, Carlsbad, Calif. EUA) de acordo 15 com as instruções do fabricante (temperatura de anelamento de 55°C). O fragmento resultante da PCR foi digerido com as enzimas de restrição Pstl e Hpal e ligadas com DNA Iigase T4 em pHPLT digerido por Pstl e Hpal de acordo com as instruções do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, Calif, EUA). A mistura de ligação foi transformada na cepa SC6.1 de B. subtilis como des20 crito em Pedido de Patente Norte-americana Publicado US2002/0182734 (vide também, Publicação Internacional WO 02/14490). Os três clones produziram halos relativamente grandes, que é indicativo de alta expressão de amilase. Os insertos de três clones foram sequenciados por sequenciamento de DNA. Um dos clones continha uma mutação única no gene FRED, prova25 velmente devido a um erro no iniciador de sentido direto LAT(PSTI), e expressa a amilase FRED(AIT). Neste clone, o primeiro códon da a-amilase Spezyme® FRED (seqüência sinal ausente na cadeia madura), codificando uma alanina (gca), foi mutado em outro códon (aca) codificando uma treonina.

O gene FRED(AIT) foi então clonado no vetor de pICatH (vide,

por exemplo, Pedido de Patente Publicado No. 2006/0014265 e Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2005/111203). O qene FRED(AIT) foi amplificado por PCR como descrito acima mas usando os iniciadores de sentido direto EBS2Xhol e de sentido reverso EBS2Xhol:

EBS2XHOI de sentido direto: 5'-ATCCTACTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGG-3'

(SEQ ID NO: 5)

EBS2XHOI de sentido reverso:

5'-T GGAAT CT CGAGGTTTT AT CCTTT ACCTT GT CT CC-3'

(SEQ ID NO: 6)

O fragmento resultante da PCR foi digerido com a enzima de 10 restrição, Xho\, e ligado com DNA Iigase T4 no pICatH digerido por Xho\ de acordo com as instruções do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, Calif. EUA). A mistura de ligação foi transformada na cepa SC6.1 de B. subtilis como descrito acima. Um clone foi selecionado no qual a orientação do gene FRED(AIT) é a mesma que o gene catH flanqueador (FIGURA 2B). Isto re

sultou na cepa SC6.1(plCatH-FRED(A1T)ori1) e sua seqüência foi confirmada por sequenciamento de DNA

O gene da α-amilase Spezyme® FRED de 'tipo selvagem' (que codifica a FRED amilase sem a mutação A1T) também foi clonado no vetor pICatH. O gene FRED foi amplificado por PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) a partir da α-amilase Spezyme® FRED com os iniciadores de sentido direito PIatFREDXhoI e de sentido reverso FRED-Tlat:

PIatFREDXhoI de sentido direito 5'

ACCCCCCT CGAGG CTTTT CTTTTGG AAG AAAAT AT AGGGAA AAT GGT ACTT GTT AAA AATT C G G AAT ATTT AT ACAAT AT CAT AT GTTT CAC ATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGC-3'(SEQ ID NO: 7)

FRED-TIat de sentido reverso 5-

GT CGACCT CGAGGTTTT ATCCTTT ACCTT GT CT CCAAGCTT A

AAAT AAAAAAACGG ATTT CCTT CAGG AAAT CCGT CCT CT GTT AACT CAT C TTTGAACATAAATTG-3' (SEQ ID NO: 8) PCR foi executado em um termociclador com DNA polimerase de Alta Fidelidade de Fusão (Finnzymes OY1 Espoo, Finlândia) de acordo com as instruções do fabricante (temperatura de anelamento de 55°C). O . fragmento resultante da PCR foi digerido com a enzima de restrição Xho\, e ligado com DNA Iigase T4 em pICatH digerido por Xho\ como descrito acima. A mistura de ligação foi transformada na cepa SC6.1 de B. subtilis como descrito acima. Um clone foi selecionado no qual a orientação do gene FRED é a mesma que a do gene catH flanqueador (Figura 2A). A seqüência do clone foi confirmada por sequenciamento de DNA. Este clone foi denominado SC6.1 (pICatH-FREDoril).

SC6.1(plCatH-FREDori1) e SC6.1(plCatH-FRED(A1T)ori1) de B. subtilis foram aplicados em triplicata em uma placa de ágar Infusão de Coração (HI) em uma nova placa Hl contendo 0,2% de amido solúvel. Após

16 h de crescimento a 37°C, a placa foi corada com uma solução de iodo para visualizar o clareamento do amido na placa (FIGURA 3). O tamanho do halo em volta da colônia (isto é, o amido clareado) é uma medida da produção de amilase uma vez que a atividade específica de molécula FRED(AIT) não é alterada com relação à molécula FRED de tipo selvagem. Os halos formados pela cepa de B. subtilis expressando FRED (A1T) (na parte inferior, A1T marcado) são maiores do que aqueles das mesmas cepas hospedeiras expressando amilase FRED de tipo selvagem (na parte superior, tipo selvagem marcado). Dessa maneira, a produção da amilase FRED por B. subtilis é aumentada pela introdução da mutação A1T na molécula FRED. EXEMPLO 2

Expressão da Variante FRED(AIT) em Bacillus Iicheniformis

Os plasmídeos, pICatH-FREDoril e plCatH-FRED(A1T)ori1, foram transformados na cepa BML612 de B. Iieheniformis (vide Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2005/111203) na temperatura permissiva, 37°C. Para cada construto, um transformante resistente à neomicina (neoR) 30 e um resistente a cloranfenicol (CmR) foram selecionados e denominados BML612(plCatH-FREDori1) e BML612(plCatH-FRED(A1T)ori1), respectivamente. Os plasmídeos em BML612(plCatH-FREDori1) e BML612(plCatHFRED(A1T)ori1) foram integrados na região catH no genoma de B. Iieheniformis pelo crescimento das cepas em uma temperatura não permissiva (50°C) em meio com 5 pg/mL de cloranfenicol. Para cada construto, um clo. ne resistente CmR foi selecionado e denominado BML612-plCatH-FREDori1 e BML612-plCatH-(A1T)FREDori1, respectivamente

Ambas as cepas foram cultivadas novamente a temperatura permissiva por várias gerações sem neomicina para seqüências de vetor "loop out" e então para cada construto, um clone sensível à neomicina (ne

oS) mas CmR foi selecionado. Nestes clones, as seqüências de vetor de pICatH no cromossomo foram excisadas (incluindo o gene de resistência à neomicina) e somente o cassete amilase catH foi mantido. A seguir, a cassete amilase catH no cromossomo foi amplificado por crescimento da cepa em meios com concentrações crescentes de cloranfenicol. Após vários ciclos de amplificação, para cada construto um clone (resistente contra 75 pg/mL de cloranfenicol) foi selecionado o qual produziu o maior halo em uma placa de amido. Estas cepas foram então denominadas BML612-FRED e BML612- FRED(AIT), respectivamente. Ambas as cepas foram inseridas por um processo de fermentação típico de B. Iicheniformis em ambas as escalas 14L e 3000L. Em ambas as escalas as fermentações de FRED(AIT) mostraram ambas uma taxa de produção enzimática inicial e um título final mais alto. O gráfico na FIGURA 3 mostra os resultados de três fermentações experimentais de 3000L comparando uma curva de produção típica da cepa BML612- FRED e duas curvas da cepa BML612-FRED(A1T). O gráfico mostra um aumento significante no título enzimático final da cepa expressando aamilase Spezyme® FRED. O meio de crescimento usado consistiu em sólidos de maceração de milho e farinha de soja como fontes de compostos orgânicos junto com sais inorgânicos como uma fonte de sódio, potássio, fosfato, magnésio, sulfato e outros elementos-traço. Uma fonte de carboidrato, tal como glicose, também foi incluída como parte do meio inicial. Uma vez que a cultura foi estabelecida e começa a crescer, o carboidrato é medido no tanque para manter a cultura. A amostragem periódica do meio de cultura no fermentador foi medida em intervalos regulares para avaliar título enzimático usando um método de ensaio colorimétrico. A fermentação terminou quando a taxa de produção enzimática parou de aumentar.

A proteína variante foi caracterizada como tendo a seguinte atividade específica. Dois materiais purificados de FRED A1T e quatro outras amostras de FRED A1T foram analisadas para determinar a atividade específica de FRED A1T. FRED A1T também foi analisado e foi usado como um padrão proteico. Géis de SDS-PAGE, proteínas totais e TCA através da análise de nitrogênio e densitometria foram realizados. As seguintes amostras foram testadas:

FRED A1T

1) n°1 - material purificado

2) n°2 - material purificado

3) 20060100 - corrida PA 14L, corrida "normal", processo clarificado

4)

5) 20068013, clarificado - 1a corrida PA 3K, processo clarificado

6) 20068013, célula inteira - 1a corrida PA 3K, caldo total

7) 20068024, clarificado - 2a corrida PA 3K, processo clarificado

8) 20068024, célula inteira - 2a corrida PA 3K, caldo total

FRED

1) 105-01086-002 - gel referência de FRED

2) 107-04326-001 - corrida 1 de FRED-L

3) 101-05330-001 - corrida 2 de FRED-L

A atividade específica de FRED A1T foi determinada como 1317 LU/mg de proteína ativa. Este resultado foi baseado na Atividade Proteica/Ajustada por TCA e um gel com apenas uma amostra de FRED A1T, que foi usada como um padrão proteico. Com base em trabalho mais recente, a amostra FRED A1T foi de fato sobrecarregada neste gel fazendo os resultados de FRED A1T falsamente altos

Vários géis diferentes usando pelo menos três amostras de FRED A1T foram usados como padrões e controles. Albumina sérica bovina (BSA) e LAT foram também usados como padrões proteicos em alguns dos géis. Atividade específica foi calculada usando dois métodos diferentes: usando a Atividade Proteica/Ajustada por TCA e usando Spezyme® FRED, LAT e/ou BSA como padrões proteicos.

Os resultados usando Atividade proteica/Ajustada por TCA dife5 renciam-se dos resultados usando um padrão proteico. Uma vez que os resultados contra o padrão são mais próximos dos que os esperados para ambas as amostras de Spezyme® FRED (FRED) e FRED A1T, os resultados da Atividade da proteína precipitada/Ajustada por Ácido tricloroacético (TCA) não foram incluídos na determinação da atividade específica final. Com base IO nestes experimentos, FRED A1T tem uma atividade específica de 1323 LU/mg de proteína ativa ou 0,00076 mg/LU, que é aproximadamente 2% mais alto do que o valor historicamente determinado de 1317 LU/mg de proteína ativa ou 0,00076 mg/LU.

EXEMPLO 3

Métodos de Aumento da Fermentação e Purificação de FRED

A1T

As amostras obtidas no Exemplo 1 então foram corridas em um gel de poliacrilamida em SDS. No gel de poliacrilamida em SDS, as amostras de Spezyme® FRED e FRED A1T foram carregadas com base nos valo20 res de proteína ativa. A proteína ativa foi calculada usando uma conversão Spezyme® FRED de 0,00076 mg de proteína ativa/LU. As amostras foram preparadas usando inativação por ácido tricloroacético (TCA). O gel foi corado usando Coomassie convencional. Quando o carregamento de todas as amostras usando o valor de atividade específica de Spezyme® FRED, am25 bos Spezyme® FRED e FRED A1T mostraram intensidades de banda principais similares, indicando que a proteína ativa/ atividades específicas são muito similares entre a cepa variante e parental.

A atividade específica foi calculada usando 2 métodos diferentes. Primeiro, a proteína ativa foi determinada pela multiplicação de proteína precipitada por TCA com a pureza da proteína (resposta da banda ativa versus área total por Coomassie) do gel.

No segundo método, três lotes de FRED A1T bem como LAT e albumina sérica bovina (BSA), foram avaliados usando seus valores de proteína ativa, e foram usados como um padrão com o qual todas as outras amostras foram comparadas e os valores de atividade específica foram de. terminados; isto foi realizado usando a área bruta da banda proteica principal de cada amostra.

Tabela 1 . Atividade Específica (Atividade Proteica /Ajustada por TCA) usando Valores Ajustados por TCA _

Tipo de Atividade Proteína Proteína Proteína por % Atividade Amostra (LU/ml) Total por TCA TCA/Total (%) Pureza proteica/Ajustada (mg/ml) (mg/ml) por TCA FRED-gel ref 22527 33,57 18,31 54,5 95,9 1283 FRED-L- 18245 55,21 14,87 26,9 94,6 1297 Corrida 1 FRED-L- 19172 48,83 14,81 30,3 94,8 1366 Corrida 2 1315 FRED A1T 9990 5,84 5,95 101,8 89,6 1875 puro FRED A1T 16708 8,35 8,49 101,7 96,5 2039 puro FRED A1T 21045 17,78 12,22 68,7 94,4 1826 FRED A1T 24530 24,34 15,6 64,1 95,5 1645 Clarificado FRED A1T 19581 42,75 13,84 32,4 98,4 1438 Caldo Total FRED AU 20353 28,35 17,94 63,3 93,3 1216 Clarificado FRED A1T 22760 66,02 17,43 26,4 96,4 1354 Caldo Total Média de FRED A1T 1655 Nota: As proteínas foram calculadas usando um fator de con

versão de 5,78 g proteína/g de nitrogênio para Spezyme® FRED. Um fator de conversão de 5,79 g proteína/g de nitrogênio foi usado para FRED A1T. Por "FRED A1T puro" entende-se uma enzima purificada como descrito no exemplo acima. Por "caldo total" entende-se não clarificado.

O uso do cálculo de Atividade Proteica/Ajustada por TCA fornece uma média de atividade específica de 1315 LU/mg em três corridas. As amostras de FRED A1T variam de 1216 a 2039 LU/mg, com uma média de 15 1655 LU/mg. As corridas de A1T tinham muitas diferenças no processo de fermentação e recuperação que podem contribuir para a variabilidade nestes resultados. Tabela 2 . Atividade Específica usando Spezyme® FRED

"FRED"), LAT e BSA como Padrões Proteicos Tipo de Amostra Atividade Específica Média (LU/mg) * FRED-gel ref 1203 FRED-L 1354 FRED-L 1412 1323 FRED A1T puro 1430 FRED A1T puro 1403 FRED A1T 1428 FRED A1T 1299 FREDA1T Clarificado 1331 FREDAITCaIdo Total 1307 FREDA1T Clarificado 1126 FREDAITCaIdo Total 1213 Média de FRED A1T 1317 Por entende-se que a atividade específica é a média obtida a partir de quatro géis usando 3 diferentes análises e 5 padrões proteicos diferentes (3 padrões de Spezyme® FRED bem como padrões BSA e LAT). A 5 atividade específica contra os padrões proteicos diferentes forneceram o resultado de FRED de 1323 LU/mg, que é similar ao valor determinado de 1299 LU/mg. FRED A1T teve um resultado de atividade específica de 1317 LU/mg.

EXEMPLO 4

Produção de B. subtilis por FRED(AIT)

B. subtilis foi usado como um hospedeiro intermediário para construir os plasmídeos de integração de A1T e Spezyme de tipo selvagem® FRED. O resultado foi que o polipeptídeo FRED(AIT) de B. subtilis tem uma quantidade aumentada de proteína produzida sobre aquela da Spezyme FRED® de tipo selvagem.

O gene amilase de Spezyme® FRED (que codifica α-amilase de Spezyme® FRED com uma alanina na posição um, X2) e o gene mutante FRED(AIT) (que codifica uma mutante de FRED com uma treonina em vez da alanina em X2) foram clonados no vetor pICatH (Publicação Americana No. 20060014265) e transformado na cepa SC6.1 de B. subtilis (Pedido de Patente Australiana No. 20041293826). Para ambos os construtos de Spezyme® FRED e FRED A1T, um clone foi selecionado no qual a origem do gene Spezyme® FRED foi a mesma que o gene catH flanqueador (Figura 2A e . 2B). Isto produziu as cepas SC6.1(plCatH-FREDori1) e SC6.1(plCatHFRED(A1T)ori1). Ambas as cepas foram aplicadas em triplicata em uma placa de ágar Infusão de Coração (HI) em uma nova placa Hl contendo 0,2% de amido solúvel. Após 16 h de crescimento a 37°C, a placa foi corada com uma solução de iodo para visualizar o clareamento do amido na placa. O tamanho do halo em volta da colônia (amido clareado) é uma medida da produção de α-amilase (atividade específica da molécula FRED(AIT) não é alterada com relação à Spezyme® FRED de tipo selvagem). A Figura 3 mostra que os halos formados pela cepa de B. subtilis expressando FRED(AIT) (na parte inferior, "A1T" marcado) são maiores do que aqueles da mesma cepa expressando Spezyme® FRED de tipo selvagem (na parte superior, "tipo selvagem" marcado).

Destes dados, foi determinado que a produção de a-amilase Spezyme® FRED por B. subtilis é aumentada pela introdução de mutação A1T na molécula Spezyme® FRED.

EXEMPLO 5 Modificação da LAT a-amilase

Outra α-amilase contemplada é α-amilase LAT madura. A forma madura pode ser produzida como uma proteína heteróloga fusionada com o polipeptídeo sinal que não é o mesmo que aquele de LAT ou derivado do mesmo parental. Ela envolveria substituição de qualquer aminoácido exceto 25 alanina ou valina no primeiro resíduo. Outra modificação deveria substituir o primeiro resíduo (alanina sublinhada) com dois, três, quatro ou cinco resíduos daquela alanina, em que os primeiros daqueles resíduos são um aminoácido exceto alanina ou valina. Ainda outro exemplo deveria ser a substituição de uma treonina pela alanina sublinhada. O polipeptídeo então pode30 ria ser sintetizado como descrito neste pedido ou conhecido na técnica. ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD WINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG GYDMRKLLNG TWSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR (SEQ IE NO: 9)

EXEMPLO 6

Modificação de Spezyme® FRED

Uma α-amilase contemplada é a Spezyme® FRED madura. A 5 forma madura pode ser produzida como uma proteína heteróloga fusionada com o polipeptídeo sinal que não é o mesmo que aquele de LAT ou derivado da espécie Bacillus. Ela envolveria a substituição do primeiro resíduo (isto é, alanina) com qualquer aminoácido exceto alanina ou valina. Outra modificação deveria substituir dois, três, quatro ou cinco resíduos por aquela alanina,

em que os primeiros daqueles resíduos são um aminoácido exceto alanina ou valina. Ainda outro exemplo deveria ser a substituição de uma treonina pela alanina sublinhada, isto é, A1T também conhecida como FRED A1T. O polipeptídeo então poderia ser sintetizado como descrito neste pedido ou conhecido na técnica.

A Spezyme® FRED tem as seguintes mutações em comparação

com a seqüência polipeptídica da LAT madura: M15T, H133Y, N188S e A209V, os resíduos estão sublinhados na seqüência abaixo. A Iisina no resíduo 23 também pode ser uma arginina.

ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS 50 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD 100 WINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY 150 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEV SSEN GNYDYLMYAD 200 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE 250 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG 300 GYDMRKLLNG TWSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF 350 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH 400 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH 450 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR (SEQ ID NO: 10) 20 EXEMPLO 7

Modificação de Teramil de tipo selvagem de B. Iicheniformis Outra α-amilase contemplada é a modificação da amilase Teramil de tipo selvagem de B. Iicheniformis (vide, por exemplo, WO 02/10355).

Esta α-amilase tem uma substituição K23R. A seqüência abaixo representa a amilase Teramil madura.

Outra variante poderia ser uma forma R23K com a substituição em X2 ou uma seqüência em que R ocorra no resíduo 23 na forma madura. Ela envolveria substituição do primeiro resíduo da α-amilase madura (a ala10 nina sublinhada) com qualquer aminoácido exceto alanina ou valina. O primeiro resíduo no polipeptídeo maduro é de fato o resíduo 30 na préproteína. Outra modificação deveria substituir o primeiro resíduo (a alanina sublinhada) com dois, três, quatro ou cinco resíduos por aquela alanina, em que os primeiros daqueles resíduos são um aminoácido exceto alanina ou 15 valina. Ainda outro exemplo seria a substituição de uma treonina pela alanina sublinhada. O polipeptídeo então poderia ser sintetizado como descrito neste pedido ou conhecido na técnica.

ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWRRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS QADVGYGAYD GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD WINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS

FHFPGRGSTY SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD

EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDVfVNHVRE KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL

HSVFDVPLHY QFHAASTQGG GYDMRKLLNG TWSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ

ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH DYFDHHDIVG

NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY NO: 11).

EXEMPLO 8

Modificação de Seqüência Sc de Teramil SC/Liquozyme®

Outra α-amilase contemplada para mutação em X2 (alanina sublinhada na seqüência madura) é a seqüência Sc de Termamyl SC/Liquozyme®, que pode ser usada para processamento de amido. Ela envolveria a substituição do primeiro resíduo (a alanina sublinhada) com 25 qualquer aminoácido exceto alanina ou valina. Outra modificação deveria substituir dois, três, quatro ou cinco resíduos por aquela alanina, em que os primeiros daqueles resíduos são um aminoácido exceto alanina ou valina. O polipeptídeo então poderia ser sintetizado como descrito neste pedido ou

LYDLGEFHQK GEHLIKAWTH IDYDHPDVAA ENYLNKTNFN TWFKPLAYAF WTREGDSSVA VQR (SEQ ID conhecido na técnica.

AAPFNGTMMO yfewylpddg TLWTKVANEA nnlsslgita lwlppaykgt srsdvgygvy dlydlgefnq KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DWFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG KAWDWEVDTE FGNYDYLMYA DLDMDHPEW TELKNWGKWY VNTTNIDGFR LDAVKHIKFS FFPDWLSYVR SQTGKPLFTV GEYWÍ3YDINK LHNYITKTNG TMSLFDAPLH NKFYTAS KSG GAFDMRTLMT NTLMKDQPTL AVTFVDNHDT EPGQALQSWV DPWFKPLAYA FILTRQEGYP CVFYGDYYGI PQYNIPSLKS KIDPLLIARR DYAYGTQHDY LDHSDIIGWT REGGTEKPGS GLAALITDGP GGSKWMYVGK QHAGKVFYDL TGNRSDTVTI NSDGWGEFKV NGGSVSVWVP RKTTVS (SE< ID NO: 12)

EXEMPLO 9

Ensaio de Liquefação Comparando FRED A1T com Spezyme®

FRED A α-amilase de tipo selvagem, Spezyme® FRED, foi comparada à mutante A1T em um ensaio de liquefação padrão, bem como ensaio sob pH baixo e um ensaio sob condições de cálcio menor.

Materiais e Métodos. Quatro amostras A1T foram avaliadas quando comparadas com o tipo selvagem. A amilase foi fermentada em IO Pseudomonas. Os seguintes materiais foram usados:

Amido em saca Cargill, Lote. No. RM 228B D Amido de milho Clinton Brand 106B Pearl, Lote. No. CS4 C20 076 106

TSL 06.275 blip A1T 20060100 (clarificado), atividade: 18,392,

LU/g

TSL 06.276 blip A1T 20060101 (clarificado), atividade: 20,832,

LU/g

TSL 06.277 blip A1T 20068013 (célula inteira), atividade:

16.969, LU/g

TSL 06.278 blip A1T 20068013 (clarificado), atividade: 22,154,

LU/g

Spezyme® (padrão de laboratório), Lote No. 107-05190-001, atividade: 19.678 LU/g

Ácido Sulfuroso, JT Baker, Lote No. L14635 Cloreto de Cálcio, Fisher, Lote No. 006902

Para cada conjunto de liquefações, uma pasta fluida de amido

de milho com 35% de sólido seco (ds) foi feita pela adição de 4666,67 g de amido em saca Cargill a 7333,33 g em água tratada por osmose reversa (RO). A esta pasta fluida, 100 ppm de SO2 foram adicionados usando 15,385 g de ácido sulfuroso 6,5%. Cálcio foi adicionado quando necessário como um di-hidrato de cloreto de cálcio. As pastas fluidas tiveram pH ajustado com carbonato de sódio 20% ao pH desejado (5,8 ou 5,4). A pasta fluida foi então filtrada através de uma peneira de 100 mesh e partícionada em porções de 5 2000 g. Cada pasta fluida foi dosada com 10 LU/g, de Spezyme® (Lote padrão No. 107-05190-001) ou da amostra de A1T apropriada aproximadamente 10 minutos antes de ser bombeada através de fogareiro. As pastas fluidas foram bombeados pelo fogareiro a uma taxa de aproximadamente 43,33 mL/min para alcançar um tempo de retenção de 9 minutos a uma temperatu10 ra de 109°C. Liqüefeito então foi coletado em um frasco Erlenmeyer de 500 mL, e mantido em um banho a 95°C por 120 minutos para liquefação secundária. Amostras foram coletadas em 30, 60, 90 e 120 minutos. DE foi determinada usando o método de redução de açúcar de Schoorl. O método de Schoorl de redução de açúcar é um ensaio baseado na redução de íon co15 bre (II) a cobre (I) pela presença de açúcares redutores e um excesso conhecido de íon cobre (II). A concentração de íon cobre restante (II) então reduz o íon iodeto em meios acéticos formando o íon tri-iodeto. O íon triiodeto é então titulado com uma solução de tiossulfato padronizada. Os materiais e métodos específicos usados são como se segue: pipeta de boca 20 larga de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, pipetadores de dispensação automática com reservatório (10 mL e 2 mL), aquecedor com reostato, grampo, frasco, pinças de segurança, soluções de Fehlings AeB, solução de iodeto de potássio (30% p/v), solução de ácido sulfúrico (26% p/v), tiossulfato de sódio (0,1 N) padronizado, solução indicadora de ammido, glicose 25 (1,00% p/v padronizada). A solução de iodeto depotássio (30% p/v) foi preparada pela dissolução de 150 g de Kl em 40 mL de água destilada, adição de 1,5 mL de NaOH a 1N, e transferência quantitativa para um frasco volumétrico de 500 mL e avolumando até a marca com água destilada. Ácido sulfúrico (26% p/v) foi preparado como se segue: com a agitação suave, Ien30 tamente adicionar 72,f mL de ácido sulfúrico concentrado (S.G. 1,84) a 400 mL de água destilada em um béquer de 600 mL. Resfriar à temperatura ambiente. Transferir quantitativamente para um frasco volumétrico de 500 mL e avolumar até a marca com água destilada. A solução indicadora de amido foi preparada pela dissolução de 150 g de NaCI em 300 mL de água destilada e aquecendo-se á fervura. Uma pasta fluida de amido em água destilada fria então foi preparada contendo 5 g (peso seco) de amido solúvel. Enquanto 5 agitando a solução de NaCI quente, lentamente adicionou-se à pasta fluida de amido. Induz-se a mistura combinada à fervura por aproximadamente 5 minutos e então se resfria à temperatura ambiente. Transfere-se quantitativamente para um frasco volumétrico de 500 mL e avoluma-se até a marca com água destilada. Nem todos os sais serão dissolvidos. A glicose padroni10 zada, o tiossulfato de sódio padronizado e as soluções Fehlings foram comprados.

O procedimento de Schrool é como se segue. Aquece-se completamente no aquecedor e ajusta-se a 50 mL de água a uma fervura em 3 minutos. Obtém-se uma amostra da massa e prepara-se uma diluição con15 tendo o equivalente de dextrose de 47 a 67 mg por mL. Por exemplo, dilui-se aproximadamente 15 g de massa liqüefeita (com DE = 10 a 12) ou 4 g de massa sacarificada (com DE = 50 a 60) em 100 mL. Determina-se a % de sólidos (%S) da amostra diluída. Tara-se um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Pipeta-se 10 mL da amostra diluída no frasco e pesa-se (F + S). Com mistu20 ra, adiciona-se 15 mL de água destilada, então 10 mL de solução Fehlings A, e 10 mL solução Fehlings B. Leva-se a mistura a uma fervura no aquecedor em 3 minutos (+/-15 segundos). Continua-se fervendo durante mais aproximadamente 2 minutos. Resfria-se imediatamente sob água corrente de torneira. Com mistura, adiciona-se 10 mL de iodeto de potássio 30% e então 25 10 mL de ácido sulfúrico 26%. Adiciona-se 2 mL de indicador de amido e mistura-se. Titula-se imediatamente com de tiossulfato de sódio a 0,1 N até o complexo amido-iodo azul desaparecer. A cor azul não deveria reaparecer por pelo menos um minuto. Registra-se o volume de titulação (TVs). Para um padrão, pipeta-se 5,00 mL de glicose 1,00% e 20 mL de água destilada 30 em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. O branco de água usado foi 25 mL de água destilada em outro frasco. As etapas foram repetidas iniciando na etapa onde com mistura 15 mL de água destilada foram adicionados junto com os 10 mL de cada uma das Soluçoes de Fehlings A e B. O cálculo é como se segue:

% DE = 5 x (TVwb - TVs^ x 100

% S x [(F + S) - F] x (TVwb - TVstd)

Resultados. Cada uma das quatro amostras teve melhorada 5 progressão DE em Spezyme® FRED quando liqüefeitas usando um fogareiro a 109°C com um tempo de retenção de 9 minutos. Ambas as Spezyme® FRED e A1T FRED variante em pH 5,4 entretanto tiveram significativamente desenvolvimento de DE (dextrose equivalente) em 5,8. A adição de 10 ppm de cálcio à pasta fluida de amido não teve um efeito significante sobre a Ii10 quefação de Spezyme® FRED ou da variante A1T. Foi concluído que o conteúdo de cálcio nativo do amido foi alto o suficiente para estabilizar cada uma das enzimas em um pH de 5,8. Tabela 3 minutos cálcio DE Enzima Lote n° PH Temperatura 0C primários adicionado 30 min 60 min 90 min 120 min FRED padrão 107-05190-001 5,8 109 9 10 ppm 4,27 7,37 9,61 11,15 A1T 20060100 5,8 109 9 10 ppm 4,54 7,29 10,03 12,58 A1T 20060101 5,8 109 9 10 ppm 4,6 7,24 9,98 12,42 A1T 20068013WC 5,8 109 9 10 ppm 4,78 7,2 10,24 12,62 A1T 20068013 5,8 109 9 10 ppm 4,6 7,54 9,82 11,91 Spezyme® 107-05190-001 5,8 109 9 0 4,66 7,07 9,18 11,21 A1T 20060100 5,8 109 9 0 4,66 7,56 9,84 12,26 A1T 20060101 5,8 109 9 0 4,68 7,2 9,82 12,27 A1T 20068013WC 5,8 109 9 0 4,63 7,68 9,83 12,43 A1T 20068013 5,8 109 9 0 4,52 7,13 9,57 11,94 Spezyme® 107-05190-001 5,4 109 9 0 3,93 5,67 7,72 9,66 Α1Τ 20060100 5,4 109 9 0 4,39 7,19 9,06 11,08 Al T 20060101 5,4 109 9 0 4,28 6,29 8,63 10,5 Al T 20068013WC 5,4 109 9 0 4,26 6,61 8,87 11,04 Al T 20068013 5,4 109 9 0 3,94 6,24 8,44 10,57 Os dados mostram que todas das amostras de A1T funcionaram melhor nestas condições do que a Spezyme® padrão. A amostra de célula inteira de A1T funcionou melhor do que a sua parte contrária clarificada. Não está claro porque a Spezyme® padrão produziu uma curva não característica na regressão linear, indicando que a enzima foi desnaturada durante o curso de 120 minutos secundários. A FIGURA 4 mostra a progressão de DE das amostras A1T sem adição de cálcio; a FIGURA 5 mostra que a progressão de DE não foi significativamente afetada com a adição de 10 ppm, mas que a A1T ainda funciona melhor do que a Spezyme® controle.

Quando o pH foi modificado para pH 5,4 (sem adição de cálcio), houve uma leve redução da estabilidade de ambas as enzimas (FIGURA 6). Entretanto, as amostras A1T foram em média menos afetadas pela redução de pH do que a Spezyme® controle.

Todas as referências citadas acima estão neste pedido incorporadas por referência em sua totalidade com todos os objetivos.

Claims (33)

1. Polipeptídeo isolado compreendendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 1 sem um peptídeo sinal.

2. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a SEQ ID NO: 1 compreende as SEQ ID NOS: 9 ou 10.

3. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a dita SEQ ID NO: 1 sem um peptídeo sinal é selecionada a partir do grupo composto das SEQ ID NOS: 9, 10, 11 ou 12.

4. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polipeptídeo é composto da SEQ ID NO: 1.

5. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a SEQ ID NO: 1 compreende um peptídeo sinal da SEQ ID NO: 2.

6. Seqüência de ácido nucleico isolada que codifica o polipeptídeo isolado como definodo em qualquer uma de acordo com as reivindicações 1 a 5.

7. Vetor compreendendo a seqüência de ácido nucleico isolada como definido na reivindicação 6.

8. Célula isolada compreendendo o vetor de seqüência como definido na reivindicação 7.

9. Célula isolada compreendendo o ácido nucleico da seqüência de como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

10. Célula isolada de acordo com a reivindicação 8, em que a célula é um micro-organismo.

11. Célula isolada de acordo com a reivindicação 10, em que o micro-organismo é uma bactéria ou um fungo.

12. Célula isolada de acordo com a reivindicação 11, em que a bactéria é uma bactéria Gram positiva selecionada a partir do grupo composto de Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyIoliquefaciens, B. circulans, B. coagulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces Iividans ou S. murinus; ou uma bactéria Gram negativa, em que a dita bactéria Gram negativa é Eseheriehia eoli.

13. Uso do polipeptídeo como definodo em qualquer uma de acordo com as reivindicações 1 a 5, em uma composição para lavagem ou lavagem de louça.

14. Uso do polipeptídeo como definido em qualquer uma de acordo com as reivindicações 1 a 5, em uma composição de aditivo detergente para lavagem ou lavagem de louça.

15. Aditivo detergente compreendendo um polipeptídeo como definido em uma de acordo com as reivindicações 1 a 5, opcionalmente na forma de granulado não-esfarelado, líquido estabilizado ou enzima protegida.

16. Aditivo detergente de acordo com a reivindicação 15, em que o aditivo detergente compreende ainda uma enzima selecionada a partir do grupo composto de uma celulase, uma protease e uma amilase.

17. Aditivo detergente de acordo com a reivindicação 16, em que a amilase é uma α-amilase, uma β-amilase ou uma glicoamilase.

18. Composição detergente compreendendo um polipeptídeo de qualquer como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

19. Composição detergente compreendendo o aditivo detergente como definido em qualquer uma das reivindicações 15 ou 16.

20. Composição detergente de acordo com a reivindicação 18, compreendendo ainda uma enzima, em que a dita enzima é uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma amilase, uma celulase, uma mananase, uma pectato Iiase ou uma combinação das ditas enzimas.

21. Composição detergente para lavagem de louça manual ou automática compreendendo um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

22. Composição detergente para lavagem de louça manual ou automática de acordo com a reivindicação 21, compreendendo ainda uma enzima, em que a dita enzima é uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma amilase, uma celulase, uma mananase, uma pectato Iiase ou uma combinação das ditas enzimas.

23. Composição de lavagem de roupa manual ou automática compreendendo um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

24. Composição de lavagem de roupa manual ou automática de acordo com a reivindicação 23, compreendendo ainda uma enzima, em que a dita enzima é uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma amilase, uma celulase, um mananase, uma pectato Iiase ou uma combinação das ditas enzimas.

25. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma de acordo com as reivindicações 1 a 5, em uma composição de desengomagem de tecido.

26. Composição de desengomagem compreendendo urn polipeptídeo qualquer como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em uma solução aquosa e opcionalmente compreendendo uma enzima.

27. Composição para processamento de amido compreendendo um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em uma solução aquosa.

28. Composição para processamento de amido de acordo com a reivindicação 27 compreendendo ainda uma glicoamilase, uma isoamilase, uma pulanase, ou uma combinação das mesmas.

29. Método para processamento de um amido compreendendo administração da composição como definido na reivindicação 27, por um tempo suficiente para Iiquefazero dito amido.

30. Composição de hidrolisação de biofilme compreendendo um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita composição está em uma solução ou gel, e opcionalmente compreende ainda uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma lipase, uma protease, uma pectinase, um agente antimicrobiano ou uma combinação dos mesmos.

31. Método de hidrolisação de biofilme compreendendo administração da composição como definida na reivindicação 30, por um período de tempo suficiente para hidrolisar parcialmente ou totalmente o dito biofilme.

32. Composição para sacarificação de amido compreendendo um polipeptídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em uma solução.

33. Método de sacarificação de amido compreendendo administração da composição como definida na reivindicação 32, por um período de tempo suficiente para sacarificaro dito amido.