CN100523182C - 突变α-淀粉酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种突变α-淀粉酶，其获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的α-淀粉酶或与该氨基酸序列至少有70%同源性的α-淀粉酶中该氨基酸序列中的至少一种氨基酸残基如167位Gln、169位Tyr和178位Ala进行置换或缺失，并涉及编码该突变α-淀粉酶的基因、载体、转化细胞、包括培养转化细胞的产生突变α-淀粉酶的方法、以及含有该突变α-淀粉酶的洗涤剂组合物。本发明的突变α-淀粉酶具有对螯合剂的高抗性、碱性区的高比活和极佳热稳定性的极佳性质，因此可用于自动洗碟机用洗涤剂、洗衣洗涤剂等。
Description
本申请为分案申请，其母案申请号为00118140.8，申请日为2000年6月9日，发明名称为“突变α-淀粉酶”。
发明背景
发明领域：
本发明涉及具有极佳耐热性、尤其可用作洗涤剂的酶之突变液化碱性α-淀粉酶，及其基因。
背景领域描述
当用α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]作为洗涤剂的酶时，迄今为止认为，能随机分解淀粉并对碱及螯合成分和氧化漂白成分稳定的液化碱性α淀粉酶是优选的。然而，在液化淀粉酶中，钙离子通常对保持酶结构至关重要，在螯合剂的存在下其稳定性降低。此外，大多数这类酶具有中性到弱酸性的最适pH。
在前述情况中，本发明者发现，自土壤中分离的嗜碱性芽孢杆菌属的种KSM-K38(FERM BP-6946)和芽孢杆菌属的种KSM-K36(FERMBP-6945)株产生的酶，在认为常规液化α-淀粉酶失活的高浓度螯合剂存在下根本不显示活性的降低，并且对表面活性剂和氧化剂具有抗性，与常规液化α-淀粉酶相比，在碱性侧具有更高的活性，并可用作洗涤剂的酶(日本专利申请号362487/1998)。
然而，在50℃或更高的温度下该酶显示失活，鉴于服装和餐具的清洗一般都在大约10-60℃下进行的事实，其耐热性略显不足。
发明概述
本发明的一个目的在于提供一种α-淀粉酶，它是一种在碱性方面具有高活性、对螯合成分和氧化漂白成分稳定、并具有极佳耐热性的液化碱性α-淀粉酶。
本发明者已经获得了对于液化碱性α-淀粉酶多种突变酶，并对其进行了研究。结果发现，当向来源于KSM-K38的淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO：1)指定氨基酸残基中引入突变时，该酶的耐热性提高而不丧失其特性，如对螯合剂的抗性和对氧化剂的抗性，以及碱性区域的高比活，通过组合这些突变能进一步提高耐热性。
根据本发明，提供了一种突变α-淀粉酶，其获得方法是：对具有SEQID NO：1所示氨基酸序列的α-淀粉酶或与该氨基酸序列至少有70％同源性的α-淀粉酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换或缺失，这些残基分别对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的11位Tyr、16位Glu、49位Asn、84位Glu、144位Ser、167位Gln、169位Tyr、178位Ala、188位Glu、190位Asn、205位His和209位Gln。
根据本发明，也提供了一种突变α-淀粉酶，其获得方法是：将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的α-淀粉酶或与该氨基酸序列至少有70％同源性的α-淀粉酶中对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列氨基端起11-100氨基酸残基的序列置换为另一种液化α-淀粉酶中对应于该氨基酸残基序列的氨基酸序列。
根据本发明，进一步提供了分别编码这些突变α-淀粉酶的基因、含有每种这些基因的载体、由这类载体转化的细胞和这些突变α-淀粉酶的产生方法，包括培养转化的细胞。
根据本发明，又进一步提供一种包含这些突变α-淀粉酶中任一种的洗涤剂组合物。
附图简述
通过下列描述和附加的权利要求书，结合下列附图，本发明的上述及其它目的、特征和优点将显而易见，其中：
图1说明了一种制备重组质粒的方法，用于来源于KSM-K38和KSM-AP1378株的α-淀粉酶的产生。
图2说明了一种向来源于KSM-38株的α-淀粉酶基因中引入突变的方法，
图3说明了一种方法，用于将来源于KSM-38株的α-淀粉酶基因的N端序列置换为来源于KSM-AP1378株的α-淀粉酶基因的N端区。
优选实施方案详述
根据本发明的突变α-淀粉酶的获得方法是，突变编码具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列或与该氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列的液化碱性α-淀粉酶的基因。然而，对常规液化α-淀粉酶也进行了通过氨基酸缺失和/或置换提高耐热性的实验。例如，曾经报道了通过删除来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的酶中残基177位Arg-178位Gly而获得的酶(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，264，18933，1989)，和通过将来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的酶中的133位His置换为Tyr而获得的酶(生物化学杂志，265，15481，1990)。然而，本发明所用的液化碱性α-淀粉酶与常规液化碱性α-淀粉酶有低度的氨基酸同源性。在这些α-淀粉酶中，对应于177位Arg-178位Gly残基的位点已经缺失，对应于133位His的氨基酸已是Tyr。因此，常规酶的例子不总是适用的。更特别地，本发明中提高耐热性的氨基酸序列突变完全不同于迄今为止的实例。
液化碱性α-淀粉酶的实例包括这样一种酶(日本专利申请号362487/1998)，它来源于本发明者从土壤中分离的芽孢杆菌种KSM-K38(FERM BP-6946)株，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，和这样一种来源于芽孢杆菌种KSM-K36(FERM BP-6945)的酶(SEQ ID NO：4)(日本专利申请号362487/1998)，它与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有大约95％的同源性。顺便提一句，按照Lipman-Pearson法(科学(Science)，227，1435，1985)计算了氨基酸序列的同源性。
为了获得根据本发明的突变α-淀粉酶，首先从产生液化α-淀粉酶的微生物中克隆了编码液化α-淀粉酶的基因。作为其方法，可以使用普通的基因重组法。例如，可以使用日本专利申请公开号336392/1996所述的方法。基因的实例包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的基因。
然后向这样获得的基因中引入突变。作为其方法，可以采用任一方法，只要它是一种通常进行的位点专一突变方法。例如，能通过使用Takara Shuzo Co.，Ltd生产的定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒进行突变。利用重组PCR(聚合酶链反应)方法(《PCR方案》(PCRprotocols)，Academic Press，纽约，1990)可以将该基因的任选序列置换为另一基因对应于该任选序列的序列。
希望本发明中提高耐热性的突变是这样一种突变，其中对应于SEQID NO：1所示氨基酸序列中11位Tyr的氨基酸残基被置换为Phe，对应于16位Glu的氨基酸残基置换为Pro，对应于49位Asn的氨基酸残基置换为Ser，对应于84位Glu的氨基酸残基置换为Gln，对应于144位Ser的氨基酸残基置换为Pro，对应于167位Gln的氨基酸残基置换为Glu，对应于169位Tyr的氨基酸残基置换为Lys，对应于178位Ala的氨基酸残基置换为Gln，对应于188位Glu的氨基酸残基换为Asp，对应于190位Asn的氨基酸残基置换为Phe，对应于205位His的氨基酸残基置换为Arg，对应于209位Gln的氨基酸残基置换为Val。
也能如下实现耐热性的提高，将根据本发明的SEQ ID NO：1的氨基酸序列中对应于从氨基端(Asp)起11-100个氨基酸残基的氨基酸序列、优选地对应于1位Asp-19位Gly的氨基酸残基的序列，置换为另一种液化α-淀粉酶对应于该氨基酸残基序列的氨基酸序列。
置换中使用的所述另一种液化α-淀粉酶的实例包括具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的酶。其对应于所述氨基酸残基1位Asp-19位Gly的氨基酸序列的位点是1位His-21位Gly。该酶是来源于芽孢杆菌种KSM-AP1378(FERM BP-3048)株的液化α-淀粉酶，该基因的序列公开于日本专利申请公开号336392/1996中。
在根据本发明的突变α-淀粉酶中，具有至少两种置换或缺失的突变也是有效的，其选自上述多种氨基酸残基的置换或缺失以及彼此组合的氨基酸序列的置换，通过这种组合能获得耐热性更加提高的突变酶。更具体而言，突变组合的实例包括：多种氨基酸残基至少两种置换或缺失的组合、至少两种氨基酸序列置换的组合、和至少两种氨基酸残基置换或缺失及氨基酸序列置换的组合。优选地，至少两种突变可以从下列突变中适当组合，其中对应于49位Asn的氨基酸残基被置换为Ser，对应于167位Gln的氨基酸残基置换为Glu，对应于169位Tyr的氨基酸残基置换为Lys，对应于190位Asn的氨基酸残基置换为Phe，对应于205位His的氨基酸残基置换为Arg，对应于209位Gln的氨基酸残基置换为Val，以及这样的突变体，其中对应于氨基酸残基1位Asp-19位Gly的氨基酸序列被置换为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中1位His-21位Gly的氨基酸序列。
最优选的组合的实例包括下列突变的组合，其中对应于49位Asn的氨基酸残基被置换为Ser，对应于167位Gln的氨基酸残基置换为Glu，对应于169位Tyr的氨基酸残基置换为Lys，对应于190位Asn的氨基酸残基置换为Phe，对应于205位His的氨基酸残基置换为Arg，对应于209位Gln的氨基酸残基置换为Val，以及下列两种突变的组合，其中对应于氨基酸残基1位Asp-19位Gly的氨基酸序列置换为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中1位His-21位Gly的氨基酸序列的突变，与其中对应于167位Gln的氨基酸残基被置换为Glu、对应于190位Asn的氨基酸残基置换为Phe、或对应于209位Gln的氨基酸残基置换为Val的突变的组合。
另外，改进除耐热性之外其它性质的突变，例如更大地提高对氧化剂抗性的突变，其中对应于107位Met的氨基酸残基被置换为Leu，提高洗衣洗涤剂去垢性的突变，其中对应于188位Glu的氨基酸残基被置换为Ile，等等，这些可以与上述突变结合。
这样获得的根据本发明的突变α-淀粉酶在热稳定性方面有所改进，而不丧失对螯合剂高抗性和碱性区高比活的极佳性质，因此可用于自动洗碟机用洗涤剂、洗衣洗涤剂和纤维脱浆剂。
除了上述突变α-淀粉酶外，这些洗涤剂还可能含有一种或多种酶，其选自脱支酶(例如支链淀粉酶、异淀粉酶、新支链淀粉酶等)、α-糖苷酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、原果胶酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶、漆酶和过氧化氢酶。
此外，也可以掺入通常掺入典型洗涤剂中的表面活性剂如阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子表面活性剂、螯合剂、碱化剂、无机盐、再染污预防剂、氯清除剂、还原剂、漂白剂、荧光染料增溶剂、香基、粘结预防剂、酶激活剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、上蓝剂、漂白激活剂、酶稳定剂、相位调节剂，等等。
按照本领域本身所知的方法，通过将上述突变α-淀粉酶与上述公知的洗涤剂成分相结合，能产生根据本发明的洗涤剂组合物。对于预计的最终用途，必要时可以适当地选择洗涤剂组合物的形式，例如，洗涤剂组合物可以是液体、粉末或颗粒的形式。根据本发明的洗涤剂组合物能用作洗衣洗涤剂、漂白去污剂、自动洗碟机用、排水管清理机用及人工牙齿清洗机用洗涤剂等。尤其，优选地能用作洗衣洗涤剂、漂白去污剂或自动洗碟机用洗涤剂。
可以用根据本发明的突变α-淀粉酶作为用于淀粉液化和糖化的组合物，也可使之与选自葡糖淀粉酶、麦芽糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、新支链淀粉酶等的一种或多种酶一起作用于淀粉。
通过掺入一种酶如支链淀粉酶、异淀粉酶或新支链淀粉酶，根据本发明的突变α-淀粉酶也可以用作纤维脱浆剂组合物。
实施例
淀粉酶活性和蛋白质含量的测定：
按照下列各自方法测定每种酶的淀粉酶活性和蛋白质含量。
用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)进行淀粉酶活性的测定。50℃下在与含于50mM甘氨酸缓冲液(pH：10)中的可溶淀粉的反应混合物中进行反应15分钟后，用DNS法测定形成的还原糖。对于酶活性，将1分钟形成相当于1μmol葡萄糖的还原糖的酶量定义为1单位。
利用Bio-Rad Laboratories生产的蛋白质测定试剂盒，用牛血清白蛋白作为标准，测定蛋白质含量。
参考实施例1：
液化碱性淀粉酶的筛选：
将土壤(大约0.5g)悬浮于无菌水中，在80℃下进行热处理15分钟。用无菌水适当稀释热处理的悬液的上清液，将得到的稀释溶液涂于琼脂培养基(培养基A)上进行分离。然后在30℃下培养2天形成菌落。筛选那些由于淀粉分解在其边缘形成透明环的菌落，分离为产生淀粉酶的细菌。进而，将这样分离的细菌接种于培养基B上，并在30℃下进行需氧摇床培养2天。培养后，测定离心分离的上清液对螯合剂(EDTA)的抗性表现，进一步测定其最适pH以筛选出产生液化碱性α-淀粉酶的细菌。
芽孢杆菌种KSM-K38(FERM BP-6946)和芽孢杆菌种KSM-K36(FERM BP-6945)株能够通过上述方法获得。
培养基A：胰化蛋白胨1.5％
Soyton 0.5％
氯化钠 0.5％
有色淀粉 0.5％
琼脂 1.5％
Na2CO3 0.5％
(pH 10)
培养基B：胰化蛋白胨 1.5％
Soyton 0.5％
氯化钠 0.5％
可溶淀粉 1.0％
Na2CO3 0.5％
(pH10)
表1中显示了KSM-K38和KSM-K36株的真菌学性质。
表1
参考实施例2：
KSM-K38和KSM-K36株的培养：
将KSM-K38或KSM-K36株接种于参考实施例1中所用的液体培养基B中，在30℃下进行摇床培养2天。测定离心分离的上清液的淀粉酶活性(pH 8.5时)。结果，这两种菌株分别具有每升培养基557U和1177U的活性。
参考实施例3：
液化碱性淀粉酶的纯化：
向参考实施例2所获得的KSM-K38株的培养上清液中加入硫酸铵至80％饱和。搅拌得到的混合物后，收集形成的沉淀，将其溶解于含有2mM CaCl2的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH：7.5)中，并对相同缓冲液透析过夜。使这样获得的透析液通过用相同缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱，使其吸附于柱上，并按0-1M的氯化钠浓度梯度用相同缓冲液洗脱目标酶。将活性级分对相同缓冲液透析后，将通过凝胶过滤柱层析获得的活性级分对上述缓冲液透析，由此获得一种纯化的酶，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度：10％)和十二烷基硫酸钠(SDS)电泳上都产生单一条带。顺便提一句，也能够按照与上述相同的方法从KSM-K36株的培养上清液中获得纯化的酶。
参考实施例4：
酶的性质：
(1)作用：
两种酶都能分解淀粉、直链淀粉、支链淀粉的α-1，4-糖苷键，部分地分解其产物，并由直链淀粉产生葡萄糖(G1)、麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)。然而，这两种酶不作用于支链淀粉。
(2)pH稳定性(Britton-Robinson缓冲液)：
在40℃ 30分钟的处理条件下，在6.5-11的pH范围中，两种酶都显示至少70％的残余活性。
(3)作用温度范围和最适作用温度：
两种酶在20-80℃的宽温度范围内都起作用，并且具有50-60℃的最适作用温度。
(4)温度稳定性：
在不同温度下，在50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH：10)中温育该酶30分钟，然后测定残余酶活性。结果，两种酶都显示40℃时至少80％的残余活性，以及甚至在45℃时大约60％的残余活性。
(5)分子量：
如通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳所测定的，两种酶都具有55,000+5,000的分子量。
(6)等电点：
如通过等电聚焦所测定的，两种酶都具有大约4.2的等电点。
(7)表面活性剂的影响：
即使当两种酶在多种表面活性剂中每一种的0.1％溶液中于pH10及30℃下处理30分钟时，它们几乎没有活性的抑制(残余活性：至少90％)，这些表面活性剂如线性烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、聚氧乙烯烷基硫酸钠、α-烯属磺酸钠、α-磺化脂肪酸酯的钠盐、烷基磺酸钠、SDS、肥皂和Softanol。
(8)金属盐的影响：
两种酶都在pH 10及30℃下用不同金属盐的每一种处理30分钟，由此测定其影响。
K38株受1mM Mn2+的抑制(抑制率：大约75％)，略受1mM Sr2+和Cd2+的抑制(抑制率：30-40％)。
实施例1：液化α-淀粉酶基因的克隆
用按照Saito和Miura(生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，72，619，1961)的方法从KSM-K38株细胞中提取的染色体DNA作为模板，通过利用引物K38US(SEQ ID NO：19)和K38DH(SEQ ID NO：20)的PCR，扩增编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的液化碱性α-淀粉酶(以下称为“K38AMY”)的基因片段(大约1.5kb)。用限制酶Sal I酶切如此扩增的片段，然后插入表达载体pHSP64(日本专利申请公开号217781/1994)的Sal I-Sma I位点中，由此制备含有K38AMY结构基因的重组质粒pHSP-K38，该结构基因与pHSP64中所含源自芽孢杆菌种KSM-64(FERM P-10482)株的碱性纤维素酶基因强启动子的尾随末端相键合(图1)。
同样，用从芽孢杆菌种KSM-AP1378(FERM BP-3048)株(日本专利申请公开号336392/1998)细胞中提取的染色体DNA作为模板，通过利用引物LAUS(SEQ ID NO：21)和LADH(SEQ ID NO：22)的PCR扩增，获得编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的液化碱性α-淀粉酶(以下称为“LAMY”)的基因片段(大约1.5kb)，以与上述相同的方法将其插入表达载体pHSP64的Sal I-Sma I位点中，由此制备重组质粒pHSP-LAMY(图1)。
实施例2：突变K38AMY基因的制备-1
用Takara Shuzo Co.，Ltd.生产的定点诱变系统Mutan-SuperExpress Km试剂盒进行位点专一突变。首先用实施例1中获得的重组质粒pHSP-K38作为模板，利用引物CLUBG(SEQ ID NO：23)和K38DH(SEQ ID NO：20)进行PCR，由此扩增一个大约2.1kb的片段，它从来源于KSM-64株的强启动子的前导末端直到液化碱性α-淀粉酶基因的尾随末端。将该片段插入上述试剂盒所附质粒载体pKFl9k的Sma I位点，制备用于突变引入的重组质粒pKF19-K38(图2)。
将分别如SEQ ID NO：6-NO：15所示、用于位点专一突变引入的多种寡核苷酸引物用T4DNA激酶5′-磷酸化后，用得到的每种产物和pKF19-K38按照该试剂盒所述的方法进行引入突变的反应，并用得到的反应产物转化大肠杆菌MV1184株(感受态细胞MV1184，Takara ShuzoCo.，Ltd.的产品)。从得到的转化子中提取重组质粒进行碱基序列分析，由此证实突变。
在通过向pKF19k的Sma I位点中插入表达启动子区和突变K38AMY基因部分而引入不同突变后，使已引入突变的基因作为模板质粒，由此按照与上述相同的方法引入另一个突变。
用这样获得的突变重组质粒中的每一个作为模板，进行利用引物CLUBG(SEQ ID NO：23)和K38DH(SEQ ID NO：20)的PCR，由此扩增每一种突变K38AMY基因片段。用Sal I酶切该片段，然后插入表达载体pHSP64(日本专利申请公开号217781/1994)的Sal I-Sma I位点中，制备用于突变K38AMY产生的质粒(图1)。
实施例3：突变K38AMY基因的制备-2(与LAMY基因的嵌合体)
用重组PCR进行突变，其中K38AMY基因的N端区被置换为LAMY基因的相应区(图3)。首先用实施例1中获得的重组质粒pHSP-K38作为模板，利用引物K38DH(SEQ ID NO：20)和LA-K38(SEQ ID NO：17)进行PCR，由此扩增编码SEQ ID NO：1所示K38AMY氨基酸序列从20位Gln到C末端的序列的片段。另一方面，用重组质粒pHSP-LAMY作为模板，利用引物CLUBG(SEQ ID NO：23)和LA-K38R(SEQ ID NO：18)进行PCR，由此扩增编码SEQ IDNO：2所示LAMY氨基酸序列从强启动子前导末端到21位Gly的序列的基因片段。利用DMA片段和引物CLUBG(SEQ ID NO：23)和K38DH(SEQ ID NO：20)进行第二次PCR，由此扩增编码置换的突变酶(以下缩写为“LAK38AMY”)的基因片段(大约2.1kb)，其中具有来源于引物LA-K38(SEQ ID NO：17)和LA-K38R(SEQ ID NO：18)的各自互补序列的两种片段与末端键合，而编码LAMY的1位His-21位Gly序列的区域和随后的编码K38AMY的20位Gln到C末端的序列的区域与强启动子的尾随末端键合。用Sal I酶切该基因片段，插入表达载体pHSP64(日本专利申请公开号217781/1994)的Sal I-Sma I位点，由此制备用于突变K38AMY产生的质粒(图1)。
实施例4：突变液化碱性α-淀粉酶的产生
按照原生质体法(分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，168，111，1979)，将实施例2和3中获得的用于产生突变K38AMY的多种质粒的每一种引入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ISW 1214株(leuA metB5hsdM1)中，在液体培养基(含有8％玉米浆、1％肉膏提取物、0.02％一代磷酸钾、5％麦芽糖、5mM氯化钙和15μg/mL四环素)中30℃培养得到的重组枯草芽孢杆菌3天。得到的培养上清液对Tris-HCl缓冲液(pH：7.0)透析，使透析液吸附于用相同缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl650M柱上，并用NaCl浓度梯度洗脱。该洗脱液对10mM甘氨酸缓冲液(pH：10.0)透析，由此获得每种突变K38AMY的纯化的酶。
实施例5：耐热性的测定-1
按照实施例1、2和4的方法获得SEQ ID NO：1中的11位Tyr被置换为Phe的酶(缩写为“Y11F”)、49位Asn被置换为Ser的酶(缩写为“N49S”)、84位Glu被置换为Gln的酶(缩写为“E84Q”)、144位Ser被置换为Pro的酶(缩写为“S144P”)、167位Gln被置换为Glu的酶(缩写为“Q167E”)、169位Tyr被置换为Lys的酶(缩写为“Y169K”)、178位Ala被置换为Gln的酶(缩写为“A178Q”)、188位Glu被置换为Asp的酶(缩写为“E188D”)、190位Asn被置换为Phe的酶(缩写为“N190F”)、209位Gln被置换为Val的酶(缩写为“Q209V”)的纯化酶制剂，并用下列方法测定其耐热性。使用野生型K38AMY作为对照。
将每种酶加入50mM甘氨酸缓冲液(pH：10.0)中，在50℃下预温育，使得产生大约1.2U/mL的浓度，30分钟后，取样该缓冲液，按照以上实施例所述的方法测定酶的残余淀粉酶活性。把开始时的酶活性作为100％测定相对活性，将其视为残余淀粉酶活性。结果显示于表2中。对于野生型K38AMY，残余活性降低为15％，而与野生型相比所有突变酶都显示高残余活性。
表2
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| 野生型Y11FN49SE84QS144PQ167EY169KA178QE188DN190FQ209V | 1540302530466320307040 |
实施例6：耐热性的测定-2
按照实施例1、2和4所述的方法制备含有以下列方式组合的实施例5所述突变中Q167E、Y169K、N190F和Q209V的突变酶。
Q167E/Y169K(缩写为“QEYK”，利用SEQ ID NO：16的引物制备)
N190F/Q209V(缩写为“NFQV”)
Q167E/Y169K/N190F/Q209V(缩写为“QEYK/NFQV”)
对于这些酶，用类似于实施例5的方法测定耐热性。但是，将热处理的温度改变为55℃，并用Q167E、Y169K、N190F和Q209V作为对照。结果，如表3所示，观察到所有突变都由于组合而在耐热性方面有所提高，组合四种突变而获得的QEYK/NFQV甚至在55℃30分钟后仍显示85％的残余活性。
表3
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| Q167EY169KQEYKN190FQ209VNFQVQEYK/NFQV | 714452014085 |
实施例7：耐热性的测定-3
按照实施例1、2和4所述的方法制备下列突变酶，其含有与实施例5所述S144P组合、和进一步与用Pro置换16位Gln的突变(缩写为“E16P”)相组合的实施例6所述突变NFQV。
S144P/NFQV(缩写为“SP/NFQV”)
E16P/S144P/NFQV(缩写为“EPSP/NFQV”)
对于这些酶，用类似于实施例5的方法(50℃)测定耐热性。结果，如表4所示，观察到由于E16P与SP/NFQV组合引起的耐热性的提高。
表4
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| SP/NFQVEPSP/NFQV | 4050 |
实施例8：耐热性的测定-4
按照实施例1、2和4所述的方法制备下列突变酶，其含有实施例6所述突变中的QEYK/NFQV，它与SEQ ID NO：1中的107位Met被置换为Leu的突变(缩写为“M107L”)、205位His被置换为Arg的突变(缩写为“H205R”)和实施例5所述突变中的N49S适当组合。
M107L/QEYK/QV(缩写为“ML/QEYK/NFQV”)
N49S/M107L/QEYK/NFQV(缩写为“NSML/QEYK/NFQV”)
N49S/M107L/H205R/QEYK/NFQV(缩写为“NSMLHR/QEYK/NFQV”)
对于这些酶，用类似于实施例5的方法测定耐热性。但是，将热处理的温度改变为60℃。
结果，由于ML/QEYK/NFQV与N49S及进一步与H205R组合，耐热性又得到提高，NSMLHR/QEYK/NFQV甚至在60℃30分钟后仍显示75％的残余活性(表5)。
表5
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| ML/QEYK/NFQVNSML/QEYK/NFQVNSMLHR/QEYK/NFQV | 305075 |
实施例9：耐热性的测定-5
按照实施例1、3和4的方法获得一种突变酶LA-K38AMY，其K38ANY的序列1位Asp-19位Gly被置换为LAMY的序列1位His-21位Gly。用实施例5所述的方法测定该酶的耐热性。结果，如表6所示，观察到由置换引起的耐热性的提高。
表6
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| 野生型LA-K38AMY | 1533 |
实施例10：耐热性的测定-6
按照与实施例1和3相同的方法，向实施例6所述的突变酶QEYK/NFQV的基因中引入一种突变，其序列1位Asp-19位Gly被置换为LAMY的序列1位His-21位Gly。对于按照实施例4所述方法用该酶获得的突变酶LA-K38AMY/QEYK/NFQV，用与实施例8相同的方法(热处理温度：60℃)测定其耐热性。
结果，由于组合耐热性又得到提高，LA-K38AMY/QEYK/NFQV甚至在60℃30分钟后仍显示63％的残余活性(表7)。
表7
| 酶 | 30分钟后的残余活性(％) |
| LA-K38AMYQEYK/NFQVLA-K38AMY/QEYK/NFQV | 14063 |
实施例11：用于自动洗碟机的洗涤剂组合物
按照表8所示的配方生产用于自动洗碟机的洗涤剂组合物，并将多种突变酶独立掺入该洗涤剂组合物中，进行洗涤试验。结果，当加入具有彼此相同的活性值的酶时，与野生型酶相比，突变酶显示极佳的去污作用。
表8
| 洗涤剂组成 | (％) |
| Pluronic L-61碳酸钠碳酸氢钠过碳酸钠硅酸钠1号柠檬酸三钠聚丙二醇硅KST-04(Toshiba silicone Co.，Ltd.的产品)Socarane CP-A45(BASFAG的产品) | 2.224.724.710.012.020.02.20.24.0 |
根据本发明的突变α-淀粉酶具有对螯合剂高抗性、碱性区的高比活、极佳热稳定性等极佳性质，因此可用于自动洗碟机用洗涤剂、洗衣洗涤剂、用于淀粉液化和糖化的组合物和纤维脱浆剂。
序列表
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Claims (6)
1.一种突变α-淀粉酶，其获得方法是对下述SEQ ID NO：1中的特定位置的至少一个氨基酸残基进行置换，其中氨基酸序列SEQ ID NO：1中11位Tyr的所述氨基酸残基被置换为Phe，16位Glu的所述氨基酸残基被置换为Pro，49位Asn的所述氨基酸残基被置换为Ser，84位Glu的所述氨基酸残基被置换为Gln，144位Ser的所述氨基酸残基被置换为Pro，167位Gln的所述氨基酸残基被置换为Glu，169位Tyr的所述氨基酸残基被置换为Lys，178位Ala的所述氨基酸残基被置换为Gln，188位Glu的所述氨基酸残基被置换为Asp，190位Asn的所述氨基酸残基被置换为Phe，205位His的所述氨基酸残基被置换为Arg，209位Gln的所述氨基酸残基被置换为Val，或者107位Met的所述氨基酸残基被置换为Leu。
2.一种编码根据权利要求1的突变α-淀粉酶的基因。
3.含有权利要求2的基因的载体。
4.用根据权利要求3的载体转化的细胞。
5.一种产生突变α-淀粉酶的方法，包括培养根据权利要求4的转化细胞。
6.一种洗涤剂组合物，其含有根据权利要求1的突变α-淀粉酶。
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