CN106434601B - 一种突变的α-淀粉酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种突变的α‑淀粉酶及其制备方法和应用。本发明所提供的突变的α淀粉酶的耐高温氨基酸序列，氨基酸序列在野生型火球菌α‑淀粉酶氨基酸序列基础上，有下列一个或多个位点的氨基酸被其它氨基酸所替换，被替换的氨基酸位点为：W65、C204、N366，突变后的PFAMY基因在大肠杆菌中表达量达到了10000u/l，比之前的野生型的酶活有了大幅的提高；突变后的PFAMY热稳定性增加，由原来的最适温度90℃变为100℃，热稳定性更强，酶活更稳定，具有更好的工业应用前景。

Description

一种突变的α-淀粉酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种突变的α-淀粉酶及其制备方法和应用。
背景技术
淀粉是自然界中仅次于纤维素的第二大多糖储备物质，是许多食品与非食品行业的重要组成部分。直到１９世纪之前，淀粉水解使用的是稀释盐酸的酸水解法，但因该法的糖含量较低且产生一些不必要的化合物，现在几乎完全被酶水解法取代。
α-淀粉酶，即α-１,４-葡聚糖水解酶，普遍分布在动物、植物和微生物中，能随机作用于淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内部的α-１,４-糖苷键，将淀粉水解成糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等一系列小分子物质。
世界酶市场呈现一种高速增长现象，２００５年世界酶市场在３０亿美元左右，２００９年在５１亿美元，２０１０年已增长至５８亿美元，同时预计２０２０年将达到１００亿美元以上，其中淀粉酶产业约占３０％左右。α-淀粉酶是最早实现工业化生产并且是迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，几乎占淀粉酶制剂总产量的５０％以上。特别是微生物产α-淀粉酶已广泛应用于食品、饮料、制药、纺织等行业。
耐高温α-淀粉酶广泛应用于工业生产，如洗涤剂产业、纺织业、酿酒与烘焙行业。这些产业在淀粉加工时往往需要在较高的温度下进行，耐高温α-淀粉酶最直接的效应就是减少了冷却步骤，降低能源消耗和成本。其次，在高温环境下许多杂菌的生长受到抑制，降低了生产过程中的污染。耐高温α-淀粉酶的开发对淀粉加工行业有巨大的经济效益。
目前使用的α-淀粉酶最适温度在９５℃左右、ｐＨ在５．８～６．８之间，而工业生产过程中自然淀粉浆的ｐＨ在３．２～４．５之间，因此α-淀粉酶不能适应低ｐＨ的生产过程。为了调整其作用ｐＨ，往往需要将淀粉浆的ｐＨ从３．２～４．５调至５．８～６．２，且需添加Ｃａ２＋作为稳定剂。而下一个糖化步骤的ｐＨ在４．２～４．５，同α-淀粉酶的使用，可以使淀粉浆液化糖化的步骤省去调节ｐＨ与脱去Ｃａ２＋的进一步纯化，简化工艺流程，降低生产成本。
基于普通α-淀粉酶往往存在热稳定差与ｐＨ不适应工业生产等问题，目前研究者着重研究耐酸耐高温α-淀粉酶，使更利于工业生产，对于节约能源、降低成本等有重要意义。
古菌激烈火球菌生长环境特殊，其本身所含的基因蛋白抗逆性极强，其本身携带的淀粉酶（PFAMY）耐高温、强酸。本发明将激烈火球菌的淀粉酶（PFAMY）进行优化合成以及突变，最终获得突变的、酶活稳定性提高的具有更好的工业应用前景的α-淀粉酶。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种酶活稳定性提高的具有更好的工业应用前景的突变型的α-淀粉酶。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种突变的α淀粉酶的耐高温氨基酸序列，其氨基酸序列与激烈火球菌菌属α-淀粉酶（PFAMY）SEQ ID NO:1 具有至少90％以上的同源性。
所提供的氨基酸序列在SEQ ID NO:1的氨基酸序列基础上，有下列一个或多个位点的氨基酸被其它氨基酸所替换，被替换的氨基酸位点为：W65、C204、N366。
优选地，上述淀粉酶突变为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，即在野生型激烈火球菌菌属α-淀粉酶（PFAMY）氨基酸序列SEQ ID NO:1基础上，在其氨基酸W65、C204、N366位置有突变。
优选地，上述突变的α-淀粉酶在SEQ ID NO:1氨基酸序列基础上，有一个或多个位点的氨基酸被所述氨基酸替换 见SEQ ID NO:2，所述氨基酸为：W65D、C204N、N366C。
一种突变的α-淀粉酶，具有如SEQ ID NO:3所示DNA序列。该序列具有以下特征：
a.该基因序列为根据SEQ ID NO:2 氨基酸序列，针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）碱基含量，进行全基因合成的全新DNA序列；
b.该基因与野生型激烈火球菌属α-淀粉酶（PFAMY）基因序列（SEQ ID NO:4）相比，稀有密码子从13 个降到 0个；同时删除了原基因SEQ ID NO:4内部的NdeI、SacI酶切位点。
进一步地，含有上述突变的α-淀粉酶氨基酸序列或DNA的重组载体、宿主菌均属于本发明的保护范围。
一种含有权利要求1所述氨基酸序列或权利要求要求2所述DNA序列的重组载体。
一种含有权利要求1所述氨基酸序列或权利要求要求2所述DNA序列的宿主菌。
本发明依据本领域技术人员熟知的方法，构建了含有上述突变的α-淀粉酶基因（SEQ ID NO:2）（《精编分子生物学实验指南第四版》第8章方法和《分子克隆试验指南第三版》第15章方案2方法构建）；选择诱导型载体如PET系列（Novagen公司购买）或其它诱导型载体，如：一种携带上述突变基因的诱导型表达载体PET30-PFAMY (见图1)。
本发明采用诱导型载体，其所述的的宿主菌优选为E.coli BL21(DE3)(Promegea公司)或JM109（DE3）（生工生物工程（上海）有限公司）或其它适宜菌株为受体菌。
上述含有PET30-PFAMY的受体构建方法，参照本领域技术人员熟知的氯化钙或电穿孔转移法（J.萨姆布鲁克等，《分子克隆试验指南第三版》第1章方案25或方案26）。
本发明的工程菌经诱导表达后，采用离心、超声破壁、加热、pH调整、盐析等步骤进行纯化，即可用于α-１,４-葡聚糖的水解。
本发明具有的优点和积极效果是：
（1）突变后的PFAMY基因在大肠杆菌中表达量达到了10000u/l，比之前的野生型的酶活有了大幅的提高，简化该酶工业化后期处理，降低成本；
（2）突变后的PFAMY热稳定性增加，由原来的最适温度90℃变为100℃，热稳定性更强，酶活更稳定；
（3）该酶在90℃高温条件下，在实验设计的4个小时内，野生型与突变的的PFAMY酶活都没有变低，高温稳定性强；在100℃时随时间的延长野生型PFAMY酶活下降，而突变的PFAMY酶活稳定，证明在100℃下，突变的PFAMY半衰期延长，热稳定性强，增强了其工业应用潜力。
附图说明
图1 质粒PET30-PFAMY的图谱。
图2 温度对野生型与突变的PFAMY的影响。
图3长时间高温对野生型与突变的PFAMY的影响。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进行具体描述和说明。
实施例
1 基因设计及合成
（1）基因设计：根据Genebank中古生菌Pyrococcus furiosus DSM 3638蛋白序列（SEQ ID NO：1，Genebank：AAL80601.1），在其W65、C204、N366位点引入突变位点，及得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；利用在线设计工具Jcat（http://www.jcat.de/）反向设计基因序列。针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G＋C碱基含量，优化上述设计的基因序列为SEQ ID NO:3序列，该序列与野生型基因序列SEQ ID NO:4相比：大肠杆菌稀有密码子从野生型（SEQ ID NO:4）的 13个降低到了0个，同时在设计过程中去除NdeI、SacI酶切位点，有利后期基因操作。通过上述系列设计有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因（SEQ ID NO:3）。
（2）基因合成：
根据SEQ ID NO:3所示基因序列，即PFAMY片段交由生工生物工程（上海）有限公司进行全基因合成。
2 表达载体PET30-PFAMY及转化体BL21(DE3) / PET30-PFAMY的构建
（1）质粒PET30-PFAMY的构建：对步骤1获得的基因片段PFAMY使用BamHI、HindIII双酶切。酶切体系如下：酶切体系50μL，ASPGA片段5μL（2μg），BamHI、HindIII酶各1μL，缓冲液5μL，灭菌双蒸水补足50μL。37℃保温4小时。采用相同的体系酶切质粒PET30（Novagen公司）。通过酶切得到线性片段，采用DNA凝胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）纯化得到目的片段。使用T4连接酶对所得片段进行连接反应，体系如下：T4 DNA连接酶1μL，PFAMY酶切片段3μL，PET30酶切片段2μL，连接缓冲液1μL，灭菌双蒸水补足10μL。16℃保温4小时。将保温后的产物，通过热激方法（J.萨姆布鲁克等，《分子克隆试验指南第三版》第1章方案25或方案26）转化到宿主菌E.coli DH5α中，涂布到LB培养抗性平板（配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章），37℃保温过夜。随机挑取阳性克隆，进行LB液体培养基（配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章）37℃，220rpm培养过夜。采用质粒快速提取试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）提取质粒，即得到所构建的质粒PET30-PFAMY（见图1）。
(2) 转化体BL21(DE3) / PET30-PFAMY的构建（参照J.萨姆布鲁克等，《分子克隆试验指南第三版》方法）
挑取大肠杆菌BL21（DE3）单菌落到LB试管接种后在37℃振荡过夜培养；在含50mlLB的三角瓶中加入0.5ml的过夜培养液，37℃剧烈振荡培养约2小时使菌体长到对数前期；.无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10分钟；4℃，4000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入6ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，放置冰上30分钟；4℃，3000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入1.2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀（若要制备于-70°C保存备用的感受态细胞，则加入含有20%甘油的0.1mol/L CaCl2悬浮菌体），4℃放置5~24小时后转化；吸200μl感受态细胞悬液，加DNA（体积<10μl, DNA<50ng）轻轻混匀，冰上放置30分钟；42℃水浴静止热激90秒，立即放入冰上冷却；加入500μl液体LB培养液，混匀，放入37℃摇床低速摇动复苏45分钟（也可加LB后直接放入37℃水浴复苏1小时，中间振荡管子使细胞悬浮）；吸取转化的细胞涂布加有抗生素的平板上，放于37℃培养箱中倒置培养，生长出的菌落即为转化体PET30-PFAMY/BL21(DE3)。
3转化体BL21(DE3) /PET30-PFAMY的诱导表达
挑取单菌落于含50μg/ mLKan的LB液体培养基中，37℃ 250r/min培养过夜后成为活化种子，再以2%的接种量接种到M9培养基（装液量为50mL/250mL, 23℃ 250r/min培养14小时，加入终浓度为0.05mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 中，进行诱导表达，继续培养12小时，离心收集菌体。
其中，M9培养基的配置方法为：
（1）配制1M的MgSO4: MgSO4·7H2O 2.46g 加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；
（2）配制1M的Cacl2: Cacl2·6H2O 2.191g 加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；
（3）配制5×M9盐溶液：Na2PO4·7H2O 12.8g；KH2PO4 3.0g；Nacl 0.5g；NH4cl 1.0g；加双蒸水200mL溶解，121度灭菌15分钟；
（4）配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20mL溶解，0.22微米滤器过滤除菌；
（5）无菌操作配制M9培养基：5×M9盐溶液 200mL；1M的MgSO4 2mL；20%的葡萄糖溶液 20mL；1M的Cacl2 0.1mL；加灭菌双蒸水至1000m。
4 PFAMY淀粉水解酶酶活测定
离心收集使用步骤3方法得到的菌体，加入等体积的0.02M，pH8.0的磷酸盐缓冲液，使用超声波细胞破壁仪进行破壁20分钟；离心得到上清为粗制酶液。
试剂和溶液
1）碘。
2）碘化钾。
3）原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。
4）稀碘液：吸取原碘液2. 00 mL，加20.0g碘化钾用水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。
5）可溶性淀粉溶液(20 g/L)：称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70 mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100 mL。溶液现配现用。（注：可溶性淀粉应采用湖州展望化学药业有限公司生产的酶制剂专用可溶性淀粉。）
6）磷酸缓冲液（pH-5.0）：称取36.88 g磷酸氢二钠(Na2HP04·12H2 0)和9.32g柠檬酸(C6 H8 07.H2O)，用水溶解并定容至1 000 mL。用pH计校正后使用。
7）盐酸溶液[c(HCI) =0.1 mol/L]：按GB/T 601配制。
仪器
1）分光光度计。
2）恒温水浴：控温精度土0.1℃。
3）自动移液器。
4）试管：25 mm×200 mm。
5）秒表。
分析步骤
待测酶液的制备
准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入100mL的容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。
测定
吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.00 mL，摇匀后，置于95℃土0.2℃恒温水浴中预热8 min;
加入1.00 mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min;
立即用自动移液器吸取1.00 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5. 00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查国标GB/T 601，求得测试酶液的浓度。
耐高温淀粉酶制剂的酶活力按下式计算：
X=C×N×16. 67
式中：
X:样品的酶活力，u/mL或u/g;
C:测试酶样的浓度，u/mL或u/g；
N:样品的稀释倍数；
16. 67:根据酶活力定义计算的换算系数。
所得结果表示至整数。
6 突变的PFAMY在淀粉水解中的应用。
经过突变的PFAMY在本发明所提供的培养基中进行发酵，诱导后48小时发酵单位达到10000u/l，与野生型的PFAMY 2500u/l相比较，提高了3倍，突变位点显著地提高了发酵单位，为后期处理提供了方便。
表1 突变的PFAMY与野生型的PFAMY发酵后的酶活
发酵时间 诱导后24小时 诱导后48小时
突变的PFAMY 3500u/l 10000u/l
无突变的PFAMY 1500u/l 2500u/l
突变后的PFAMY热稳定性有所增加，由原来的最适温度90℃变为100℃，热稳定性更强，酶活更稳定，见图2；
将野生型PFAMY以及突变后的PFAMY的反应体系分别置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃进行反应，它们在90-100摄氏度时酶活达到最高点，然后随温度的上升酶活急速下降（见图2.将最高值设定成为100，其余酶活按100进行折算）；
该酶在90℃高温条件下，在实验设计的4个小时内，野生型与突变的的PFAMY酶活几乎没有变化，稳定性强；在100℃时随时间的延长野生型PFAMY酶活下降，而突变的PFAMY酶活稳定，证明在100℃下，突变的PFAMY半衰期延长，热稳定性强，增强了其工业应用潜力（见图3.将最高值设定成为100，其余酶活按100进行折算）。

Claims (7)

1.一种突变的α-淀粉酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的突变的α-淀粉酶的DNA序列，其特征在于，经过人工合成和优化合成得到的 SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
3.一种权利要求1所述突变的α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基因的合成和表达：在激烈火球菌菌属α-淀粉酶SEQ ID NO:1氨基酸序列的基础上，在其W65、C204、N366位点引入突变位点，及得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，利用在线设计工具反向设计基因序列，优化上述设计的基因序列为SEQ ID NO:3序列，然后进行全基因合成；
（2）构建表达载体PET30-PFAMY及转化体BL21 / PET30-PFAMY；
（3）转化体BL21 /PET30-PFAMY的诱导表达，即得突变的α-淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤（4）采用离心、超声破壁、加热、pH调整和盐析步骤进行纯化。
5.一种如权利要求1所述的突变的α-淀粉酶的用途，其特征在于，将其用于α-1,4-葡聚糖的水解。
6.含有权利要求2所述DNA序列的重组载体。
7.含有权利要求2所述DNA序列的重组菌株。
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