CN101629180A - 嗜温多功能淀粉酶基因和嗜温多功能淀粉酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于嗜温细菌ZW2531－1的嗜温多功能淀粉酶基因、由该基因重组载体在原核宿主中表达的嗜温多功能淀粉酶，以及该嗜温多功能淀粉酶在食品工业、医药工业、淀粉加工业等领域中的广泛应用。本发明所提供的嗜温多功能淀粉酶可作用淀粉直接生成异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖，但不产生葡萄糖。本发明所提供的嗜温多功能淀粉酶基因具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其部分序列、或与它们至少99％同源的核苷酸序列，嗜温多功能淀粉酶具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或其部分序列、或与它们至少99％同源的氨基酸序列。

Description

嗜温多功能淀粉酶基因和嗜温多功能淀粉酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于嗜温细菌ZW2531-1的嗜温多功能淀粉酶基因、由该基因表达的嗜温多功能淀粉酶，以及该嗜温多功能淀粉酶在食品工业、医药工业、淀粉加工业等领域中的广泛应用。

背景技术

淀粉酶的开发与应用极大地促进了食品工业与医药工业等领域的发展。传统的淀粉酶家族包括糖苷水解酶、转移酶和异构酶，它们催化淀粉降解或催化其降解产物转化，生成小分子的单糖或低聚糖，后者作为甜味剂或填加剂广泛应用于食品与医药产品中。然而，现在人们已经认识到，一些传统的甜味剂或填加剂对人体是有潜在危害的，如蔗糖易引起龋齿，葡萄糖过量摄入能导致肥胖、糖尿病、动脉硬化和胃肠疾病等。因此，开发健康性和功能性的淀粉加工产品已成为现代社会的迫切需求。异麦芽低聚糖，主要包括异麦芽三糖和异麦芽四糖，作为一种重要的双歧因子，是淀粉加工产品中少有的健康性和功能性低聚糖，已成为国际上重点开发的功能性淀粉加工产品。但是，在应用传统淀粉酶生产异麦芽低聚糖时，需要应用多种淀粉酶经连续多个催化过程才能实现，而且所获得的产品中异麦芽低聚糖的含量很低，副产品如葡萄糖较多，因此产品的质量不高，产品的纯化也较困难。所以，应用传统淀粉酶作用淀粉生产异麦芽低聚糖的方法存在过程复杂、周期长、成本高、产品质量低等缺点。

然而，自从1992年Takata等发现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus TRS40)的新普鲁兰酶(Neopullulanase，NPase)(EC 3.2.1.135)兼有糖苷水解酶和糖基转移酶催化活性(Takata H，et al.Action of neopullulanase.Neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosylation at alpha-(1，4)-andalpha-(1，6)-glucosidic Iinkages.1992，J Biol Chem，267(26)：18447-18452)以来，十余年间已陆续发现了多种相似的多功能淀粉酶(Park KH，et al.Structure，specificity and function of cyclomaltodextrinase，a multispecific enzyme of theα-amylase family.Biochim Biophy Acta，2000，1478(2)：165-185)。这些来源于微生物的、兼有糖苷水解酶(EC3.2.1-)和糖基转移酶(EC2.4.1.-)催化活性的淀粉酶都能催化淀粉中的α-1，4-糖苷键、α-1，6-糖苷键的水解，同时又能催化水解产物的转苷反应形成α-1，4-糖苷键、α-1，6-糖苷建，故称其为多功能淀粉酶(multifunctional amylases，MFA)。目前发现的多功能淀粉酶绝大多数属于嗜温酶(嗜温酶的催化温度在40～70℃范围内)，因此应用于淀粉加工时也较传统淀粉酶稳定，它们可作用淀粉生成异麦芽低聚糖(包括异麦芽三糖和异麦芽四糖)和麦芽低聚糖(包括麦芽糖和麦芽三糖)以及少量的葡萄糖。目前，多功能淀粉酶以其独特的催化功能多样性引起了人们极大的关注，应用多功能淀粉酶可实现单酶、以简单的一次催化过程催化淀粉转化生成异麦芽低聚糖，而且产品中副产物较少，产品质量较高，有些产品甚至不需要纯化而直接应用。因此，多功能淀粉酶在现代食品工业与医药工业等领域中占有重要的地位，具有广阔的应用前景。

目前世界各国都在致力于开发多功能淀粉酶，以期降低生产异麦芽低聚糖的成本。我国淀粉资源非常丰富，而且它具有分布广，产量大，价格低廉，生产不受季节限制等特点。以淀粉为原料生产异麦芽低聚糖，有望成为我国主要的功能性、健康性糖源，但是前提是要开发出理想的多功能淀粉酶。根据这一思路，我们进行了深入、系统的研究，终于完成了本发明。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种性能优良的嗜温多功能淀粉酶基因；

本发明的另一个目的是利用上述嗜温多功能淀粉酶基因通过基因工程技术制备催化功能优良、稳定性好的嗜温多功能淀粉酶，其中所述的催化功能优良包括催化淀粉转化的产物中不含有葡萄糖；

本发明的再一个目的是通过对嗜温多功能淀粉酶理化性质的研究，提供该嗜温多功能淀粉酶在食品工业、医药工业、淀粉加工业，特别是在异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖工业生产中的用途。

本发明涉及的嗜温多功能淀粉酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、或是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、或是与SEQ ID NO.1至少99％同源的核苷酸序列、或是与SEQ ID NO.2至少99％同源的核苷酸序列。

本发明所述的嗜温多功能淀粉酶，其氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列、或是SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列、或是与SEQ ID NO.3至少99％同源的氨基酸序列、或是与SEQ ID NO.4至少99％同源的氨基酸序列。

嗜温细菌ZW2531-1(其来源、性质等内容参见王阳等，“一株产新型淀粉酶的嗜温菌ZW2531-1的分离与鉴定”，吉林大学学报(理学版).2008，46(4)：779-783)来源于中国吉林省耕地深层土壤，最适生长温度为50～55℃。在前期工作中，我们发现，该菌所分泌的蛋白具有多功能淀粉酶的活力，因此推断该菌的基因组中含有多功能淀粉酶基因。但是，由于ZW2531-1属于嗜温细菌，生长缓慢，人工培养耗能较大，生产周期相对较长，而且表达的多功能淀粉酶含量非常低，因此从成本上考虑直接利用嗜温细菌培养液来生产多功能淀粉酶是不可行的。通过研究表明，将嗜温多功能淀粉酶基因转入可快速繁殖、培养条件简单的常温宿主如大肠杆菌或枯草杆菌内，能够有效地解决上述问题。

对于来源于中国耕地土壤的嗜温细菌ZW2531-1，通过菌体培养、目的基因钓取，则得到二种本发明所述的嗜温多功能淀粉酶基因：嗜温多功能淀粉酶N基因和嗜温多功能淀粉酶G基因。我们委托上海生工生物技术有限公司分别进行二种基因测序，测序结果分别如图3、图5所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

将本发明的嗜温多功能淀粉酶N基因和嗜温多功能淀粉酶G基因分别与表达载体重组，形成重组表达载体。本发明不限于特定的表达载体，优选的表达载体采用原核表达载体[pET-28a、pET-41b等系列的pET表达载体(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-或C-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)或pPZW103等表达载体(枯草杆菌表达载体，含有P43强启动子以及卡那霉素抗性基因等，参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2)：173～177)]，进一步优选的表达载体为pET-28a。

上述重组表达载体可按生物学常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括真核表达细胞和原核表达细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，优选的宿主细胞是大肠杆菌或枯草杆菌，进一步优选的大肠杆菌宿主细胞为E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21(DE3)pLysS(通用的大肠杆菌表达宿主细胞，Novagen、Invitrogen等公司有售)，进一步优选的枯草杆菌宿主细胞为WB600(参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2)：173～177)，表达载体导入宿主细胞后分别得到表达嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的工程菌。

两种工程菌表达产物均为可溶性嗜温蛋白。针对不同的宿主细胞，表达产物的纯化有不同的方法：1、针对大肠杆菌宿主细胞表达的胞内嗜温蛋白，通过表达细胞超声破碎和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可分离得到细胞可溶性嗜温蛋白，再使用Ni²⁺-NTA亲和柱纯化得到纯化的嗜温蛋白；2、针对枯草杆菌宿主细胞表达的胞外嗜温蛋白，通过表达体系细胞的离心分离获得枯草杆菌表达细胞的培养液，再通过加热失活培养液中的杂蛋白即可分离纯化得到表达细胞分泌的嗜温蛋白。

表达的两种嗜温蛋白经活性实验鉴定，均具有嗜温多功能淀粉酶的活性，均可催化淀粉转化为低聚糖，生成产物中均含有麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖，但均不含有葡萄糖。该两种嗜温蛋白即为本发明所述的嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G，它们是首例报道的催化淀粉转化只产生低聚糖不产生葡萄糖的两种嗜温多功能淀粉酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。与传统淀粉酶相比，它们具有明显的稳定性优势和功能多重性优势，而与其他的多功能淀粉酶相比，它们又具有催化功能优良、催化产物质量高的优点，作用淀粉的产物中不含有葡萄糖，而其他的多功能淀粉酶作用淀粉的产物中除了含有麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖外，还含有较高水平的葡萄糖。

以上技术方案中所有分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)进行。

附图说明

图1：嗜温多功能淀粉酶N基因和嗜温多功能淀粉酶G基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中M：DNA分子Marker；1：嗜温多功能淀粉酶N基因，在分子量约1800bp处有明亮条带；2：嗜温多功能淀粉酶G基因，在分子量约1700bp处有明亮条带；

图2：重组表达载体pET28a-N构建示意图；

图3：嗜温多功能淀粉酶N基因测序谱图，共测三个反应，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温多功能淀粉酶N基因(1767bp)；

图4：重组表达载体pET28a-G构建示意图；

图5：嗜温多功能淀粉酶G基因测序谱图，共测三个反应，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温多功能淀粉酶G基因(1686bp)；

图6：纯化得到的嗜温多功能淀粉酶N(N)和嗜温多功能淀粉酶G(G)的SDS-PAGE电泳图谱，其中M：蛋白质分子Marker；

图7：嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的温度-活力曲线和温度稳定性曲线，其中N1：嗜温多功能淀粉酶N温度-活力曲线；N2：嗜温多功能淀粉酶N温度稳定性曲线；G1：嗜温多功能淀粉酶G的温度-活力曲线；G2：嗜温多功能淀粉酶G的温度稳定性曲线；

图8：嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的pH-活力曲线和pH稳定性曲线，其中N1：嗜温多功能淀粉酶N的pH-活力曲线；N2：嗜温多功能淀粉酶N的pH稳定性曲线；G1：嗜温多功能淀粉酶G的pH-活力曲线；G2：嗜温多功能淀粉酶G的pH稳定性曲线；

图9：嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G催化淀粉的产物薄层层析(TLC)图谱，其中M：标准糖，包括葡萄糖(G1)、麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、异麦芽三糖(IG3)、异麦芽四糖(IG4)；N、G：嗜温多功能淀粉酶N、G催化淀粉的产物；-：阴性对照。

具体实施方式

实施例1：嗜温多功能淀粉酶N基因克隆及嗜温多功能淀粉酶N的表达与制备，包括以下步骤：

(1)嗜温细菌ZW2531-1的培养及其染色体DNA的提取

每100毫升嗜温细菌ZW2531-1的培养基组分如下：酵母粉0.4g，蛋白胨0.08g，NaCl 0.3g，培养基的pH＝7.6；培养条件为：50℃摇床中以200rpm转速恒温培养约8h；ZW2531-1干细胞加入1ml上述培养基中培养8h后，再转至100ml新鲜的上述培养基中扩大培养8h，8000rpm离心5min收集培养的嗜温菌体，-20℃保存菌体备用。

取0.2g上述收集的嗜温菌体，用400μL、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0，含50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA)洗涤菌体一次后，离心弃上清液；再用200μL上述缓冲液重悬菌体，加入50μL、50mg/mL溶菌酶，室温消化5min；加入50μL的SDS溶液{终浓度为2％(g/mL)}、25μg蛋白酶K，55℃恒温水浴消化3h；加入2μL的1mg/mL RNase A，37℃恒温水浴再消化30min；加入300μL酚、氯仿和异戊醇的混合溶液(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀，10000rpm离心10min(4℃)，将上清液转移至另一支离心管中，向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置30min后，10000rpm离心10min(4℃)，收集菌体染色体DNA沉淀；用200μL的70％乙醇(体积比)漂洗沉淀，10000rpm离心10min(4℃)，收集沉淀，吸干，室温静置10min以除尽乙醇；最后用100μL的TE溶液(pH＝8.0)重新溶解DNA沉淀，取5μL溶液用0.7％(g/mL)的琼脂糖凝胶电泳鉴定所得染色体DNA的浓度和大小，只在分子量20Kb附近有一条亮带，为所制得的染色体DNA，即本发明所述的嗜温多功能淀粉酶基因的PCR扩增模板，-20℃保存备用。

(2)嗜温多功能淀粉酶N基因的钓取及重组表达载体的构建

本发明所述的嗜温多功能淀粉酶N基因通过PCR方法从步骤(1)所制得的染色体DNA中扩增而得到。所需引物依据多功能淀粉酶基因中的保守序列及表达载体的多克隆位点序列而设计，并委托上海生工生物技术有限公司合成，其序列如下：

上游引物：5’CGGAATTCATGGAATATGCAGC 3’，划线的GAATTC序列是内切酶EcoRI识别位点；

下游引物：5’ATAACCTCGAGTTATACAGGGGC 3’，划线的CTCGAG序列是内切酶XhoI识别位点。

上述两个引物所设置的酶切位点与本发明所用的表达载体pET-28a(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)的EcoRI和XhoI相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。

PCR反应：100μL反应体系中含1μL Ex-Taq DNA聚合酶、10μL Ex-Taq DNA聚合酶缓冲液、1.5μL dNTP混合物(每种核苷酸浓度为25mmol/L)、4μL染色体DNA、1μL上游引物、1μL下游引物、81.5μL超纯水。每个循环中94℃变性0.5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后一次循环延至10min，共30个循环。用1.0％(g/mL)的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量约为1800bp，如图1中N所示。

使用DNA纯化试剂盒(Bio Basic公司生产的EZ Spin Column DNA GelExtraction Kit)纯化PCR产物，步骤如下：向PCR溶液中加入4倍体积的结合缓冲液II(Binding Buffer II)，加入EZ-10柱子中，静止2min，10000rpm离心2min；加入500μL的洗脱缓冲液(Wash Solution)，10000rpm离心1min，重复1次，将EZ-10柱转移到干净的1.5mi微量离心管(microfuge tube)中，加入30μL无菌去离子水，室温放置2min，然后10000rpm离心2min，得到要纯化的目的DNA片段，-20℃保存备用。

利用EcoRI和XhoI切割位点将纯化的PCR产物N克隆进表达载体pET-28a中EcoRI和XhoI酶切位点之间，连接后成为重组载体pET28a-N，其中目的基因N的5’端融合了载体上的编码6×HIS标签序列(6×HIS标签的核苷酸序列见pET-28a图谱，网址为http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB074.pdf)，它是表达的该蛋白的纯化标签。

上述表达载体的构建步骤具体如下：

双酶切反应：将1.0μg pET-28a载体和上述纯化的PCR产物N分别与适量去离子水混匀，使其总体积分别为18μl，各加入2单位限制性内切酶EcoRI和2单位XhoI及2μl相应的10×H缓冲液，混匀，置37℃水浴保温2小时后，分别使用DNA纯化试剂盒回收目的DNA。

消化的PCR产物N与载体pET-28a的连接：取0.5μg上述步骤回收的pET-28a载体DNA，加入10倍摩尔量的消化的PCR产物N DNA、2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，加去离子水定容至20ul，最后加入1单位的的T4DNA连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置16℃水浴过夜或25℃水浴4小时后，得到连接好的重组DNApET28a-N。重组表达载体pET28a-N的构建过程如图2所示。

(3)嗜温多功能淀粉酶N基因的序列分析

重组表达载体pET28a-N转化E.coli DH5α：取10μl连接好的重组表达载体pET28a-N加入100μl E.coli DH5α感受态细胞【E.coli DH5α感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”(第二板，科学出版社)49页】中，冰浴30分钟后置入42℃水浴中保温1分钟，立即取出并置冰浴中冷却2分钟。加入200μl 37℃预热的SOC液体培养基，37℃、150rpm振摇培养60分钟后，取出100μl培养液涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂培养平板上，37℃培养16小时后，出现转化菌落。

重组载体pET28a-N的克隆与嗜温多功能淀粉酶N基因序列分析：挑取单菌落加入2ml含有卡那霉素的LB培养液中，37℃，200rpm培养过夜。提取扩增的重组载体pET28a-N，经EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，选择切割产物与理论值一致的克隆进行核酸序列分析，结果如图3(pET28a-N载体测序谱图，共测三个反应a、b、c)所示，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温多功能淀粉酶N基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(1767bp)，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

(4)嗜温多功能淀粉酶N的表达与制备

重组表达载体pET28a-N可转化到E.coli BL21(DE3)系列细胞中，如E.coliBL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli BL21(DE3)pLysE细胞等等，获得高表达的嗜温多功能淀粉酶N。

在本实施例中使用E.coli BL21(DE3)为宿主细胞，并使用卡那霉素筛选出能高效稳定表达的单细胞株。具体操作：将1.0μg表达载体pET28a-N加入到100μl E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃水浴保温90秒，冰浴冷却2分钟，加入800μl 37℃预热的LB液体培养基，37℃150rpm振摇培养60分钟。取200μl培养液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养平板上，37℃培养16小时后，获得转化的单菌落。

挑取转化的单菌落，接种于2ml LB培养基中，37℃振摇培养过夜。以1∶100(体积比)的比例接种10ml LB培养基(30μg/ml Kan)，37℃200r/min振荡培养至OD600＝0.8～1.0(约2～3小时)，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.6mM，37℃、200rpm振荡诱导4小时后，4℃、5000rpm离心5分钟收集菌体。

用1/10培养液体积的10mM Tris·C1(pH＝8.0)重悬菌体，置冰浴中超声波处理破碎菌体。破碎菌体4℃，5000rpm离心15分钟，获得上清液。然后使用Ni²⁺-NTA亲和柱纯化得到本发明的嗜温多功能淀粉酶N：将上清液缓慢流过Ni²⁺-NTA柱，然后用5倍柱体积PBST洗柱3次，最后用洗脱缓冲液(20mM GSH，50mM Tris-HCl，pH＝8.0)洗脱本发明的嗜温多功能淀粉酶N。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的嗜温多功能淀粉酶N的纯度和分子量，结果如图6中的N所示，可见只在66kDa处有一蛋白带，说明纯化得到的嗜温多功能淀粉酶N的分子量为68kDa，与理论值相符。

本发明从野生型产酶菌株ZW2531-1中钓取并克隆了嗜温多功能淀粉酶N的基因，使用该基因表达出嗜温多功能淀粉酶N。所述的嗜温多功能淀粉酶N以可溶性蛋白形式表达，使用Ni²⁺-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的嗜温多功能淀粉酶N。实施例2：嗜温多功能淀粉酶G基因克隆及嗜温多功能淀粉酶G的表达与制备，包括以下步骤：

(1)嗜温多功能淀粉酶G基因的钓取及重组表达载体的构建

本发明所述的嗜温多功能淀粉酶G基因通过PCR方法钓取，所用引物的设计依据同实施例1，其序列如下：

上游引物：5’CGGAATTCATGAGTGAATGGTGGAA 3’，划线的GAATTC序列是内切酶EcoRI识别位点；

下游引物：5’GGCCTCGAGTCATATACTAATGCCCATC 3’，划线的CTCGAG序列是内切酶XhoI识别位点。

使用上述两个引物钓取嗜温多功能淀粉酶G基因，其操作步骤同实施例1中的嗜温多功能淀粉酶N基因。用1.0％(g/mL)的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物G，分子量约为1700bp，如图1中G所示。

利用EcoRI和XhoI切割位点将纯化的PCR产物G克隆进表达载体pET-28a中EcoRI和XhoI酶切位点之间，连接后成为重组载体pET28a-G，其结构特性与构建步骤同实施例1中的pET28a-N。重组载体pET28a-G的构建过程如图4所示。

(2)嗜温多功能淀粉酶G基因的序列分析

重组载体pET28a-G的克隆步骤同实施例1。提取扩增的重组载体pET28a-G，进行核酸序列分析，结果如图5(pET28a-G载体测序谱图，共测三个反应a、b、c)所示，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温多功能淀粉酶G基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(1686bp)，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

(3)嗜温多功能淀粉酶G的表达与制备

重组表达载体pET28a-G转化E.coli BL21(DE3)宿主细胞的步骤以及嗜温多功能淀粉酶G基因的表达步骤同实施例1中pET28a-N的转化以及嗜温多功能淀粉酶N基因的表达。

挑取pET28a-G转化E.coli BL21(DE3)宿主细胞的单菌落，按与实施例1中相同的方法诱导发酵后的菌体以及收集菌体和破碎菌体，获得上清液，然后使用Ni²⁺-NTA亲和柱按与实施例1中相同的方法纯化得到本发明的嗜温多功能淀粉酶G。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的嗜温多功能淀粉酶G的纯度和分子量，结果如图6中的G所示，可见只在65kDa处有一蛋白带，说明纯化得到的嗜温多功能淀粉酶N的分子量为65kDa，与理论值相符。

本发明从野生型产酶菌株ZW2531-1中钓取并克隆了嗜温多功能淀粉酶G的基因，使用该基因表达出嗜温多功能淀粉酶G。所述的嗜温多功能淀粉酶G以可溶性蛋白形式表达，使用Ni²⁺-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的嗜温多功能淀粉酶G。

实施例3：嗜温多功能淀粉酶的特性

(1)最适反应温度和温度稳定性

温度是影响酶催化活力的重要因素。通常酶在高温下的反应活力远高于低温，但是在最适温度附近的稳定性却显著下降，对本发明所述嗜温多功能淀粉酶的催化活力检测的温度范围为30～80℃。

以淀粉作为反应底物，在30～80℃的温度范围内分别测定嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的活力，以酶的相对活力对温度作图，如图7中的N1、G1所示，表明嗜温多功能淀粉酶N的活力在30～60℃、嗜温多功能淀粉酶G的活力在30～50℃温度范围内随温度的升高而提高，在此温度以上，活力则下降，最适温度：嗜温多功能淀粉酶N为60℃，嗜温多功能淀粉酶G为50℃。

酶活性的检测：于10mL试管中依次加入5％(g/mL)可溶性淀粉溶液1mL，缓冲液0.5mL，蒸馏水3mL，于60℃恒温水浴中预热5min，加酶液0.5mL或浓缩的酶液适量，使总体积为5mL。保温30min后，立即取出，加入1mL酶终止液，并煮5min。冷却，6000rmp离心5min，取上清液0.5mL，于25mL大试管中依次加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸、蒸馏水1.5mL，混匀。沸水浴中加热5min，最后加入蒸馏水至25mL。测定520nm处OD值。1个酶活力单位定义为30min水解1％(g/mL)可溶性淀粉，产生相当于1微摩尔葡萄糖还原端所需的酶量。

将浓度为0.1mg/mL的纯酶置于不同的温度(30℃～80℃)孵育1h，然后按上述方法分别测定酶嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的残余活力，结果如图7N2、G2所示，表明在30℃～60℃下嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G相对稳定，保温1h后，依然维持90％以上的活性，而当温度提高到70℃以上，活力明显下降。这说明嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G在30～60℃温度范围内具有非常好的热稳定性。

(1)最适反应pH和pH稳定性

pH值是影响酶催化活力的另一个重要因素。通常酶在一定的pH值下表现出最大的催化活力，而偏离此pH值越远，酶的催化活力越低，对本发明所述嗜温多功能淀粉酶的催化活力检测的pH范围为3.0～10.0。

以淀粉作为反应底物，在pH值为3.0～9.0的缓冲液中分别测定嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的活力，以酶的相对活力对pH值作图，如图8中的N1、G1所示，表明嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的催化淀粉的最适pH值均为7.5。

将浓度为0.1mg/mL的纯酶置于不同pH值(3.0～10.0)的缓冲液中孵育1h，然后按上述方法分别测定酶嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G的残余活力，结果如图8中的N2、G2所示，表明嗜温多功能淀粉酶N在pH值6.5～8.5、嗜温多功能淀粉酶G在pH值5.0～8.5范围内相对稳定，保温1h后，依然维持80％以上的活性，而当pH值低于或高于此范围时，活力明显下降。这说明嗜温多功能淀粉酶N在pH值6.5～8.5、嗜温多功能淀粉酶G在pH值5.0～8.5范围内具有较好的pH稳定性。

实施例4：嗜温多功能淀粉酶作用淀粉的产物组成分析

分别在上述确定的最适温度和最适pH值条件下应用纯化的嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G作用淀粉，采用薄层层析(TLC)法分析淀粉转化产物，结果如图9所示，表明本发明的嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G均能以单酶有效催化淀粉转化，生成异麦芽低聚糖(异麦芽三糖和异麦芽四糖)和麦芽低聚糖(麦芽糖和麦芽三糖，但不产生葡萄糖，因此产品质量较高，这是本发明的嗜温多功能淀粉酶N或嗜温多功能淀粉酶G的最显著的优势。

薄层层析(TLC)法分析产物组分的操作步骤如下：

点样：取上述酶作用淀粉后的上清液，使用10μL点样管向自制硅胶GF₂₅₄薄层板上点样，点样基线距底边2.0cm，点样时必须注意勿损伤薄层表面。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

展开：将点好样品的薄层板放入封闭展开室中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中)，上行展开2～3次。

显色：显色剂置于雾化器中，将此溶液均匀喷洒在薄层表面，放在90～100℃烘箱内烘干5min。

自制硅胶GF₂₅₄薄层板：铺板20cm×10cm光滑玻璃板，匀浆配比一般是硅胶∶CMC水溶液＝1∶2～3(体积比)

展开剂为正丁醇∶醋酸∶水(8∶1∶1)(体积比)。

显色剂为二苯胺1g+苯胺1mL+85％(体积比)磷酸5mL，一并溶于50mL丙酮中，混匀。

以上结果表明，应用本发明的嗜温多功能淀粉酶N或嗜温多功能淀粉酶G作用淀粉可获得高质量的功能性低聚糖。

本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

附：本发明所涉及嗜温多功能淀粉酶N基因和嗜温多功能淀粉酶G基因核苷酸序列

表和相应嗜温多功能淀粉酶N和嗜温多功能淀粉酶G氨基酸序列表。

<110>吉林大学

<120>嗜温多功能淀粉酶基因和嗜温多功能淀粉酶及应用

<160>4

<210>1

<211>1767

<212>DNA

<213>嗜温细菌ZW2531-1

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<221>CDS

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<210>2

<211>1686

<212>DNA

<213>嗜温细菌ZW2531-1

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1686)

<400>2

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Glu Arg Trp Lys Val Leu Ile Ser Asn Tyr Pro Gln Glu Arg Ala Asp

    530                 535                 540

tta aag agt att agc ctc aaa cct tat gaa gct gtg atg ggc att agt

Leu Lys Ser Ile Ser Leu Lys Pro Tyr Glu Ala Val Met Gly Ile Ser

545                 550                 555                 560

ata tga

Ile  *

<210>3

<211>588

<212>PRT

<213>嗜温细菌ZW2531-1

<400>3

Met Glu Tyr Ala Ala Ile His His Gln Pro Phe Ser Thr Asp Ala Tyr

 1               5                  10                   15

Ser Tyr Asn Gly Arg Thr Val His Ile Lys Ile Arg Thr Lys Lys Gly

            20                  25                  30

Asp Ala Asp His Ile Arg Phe Ile Trp Gly Asp Pro His Glu Tyr Asn

        35                 40                 45

Asp Gly Lys Trp Ser Ala Asn Glu Gln Pro Met Arg Lys Ile Ala Ala

    50                  55                  60

Thr Glu Met His Asp Tyr Trp Phe Ala Glu Val Val Pro Pro Phe Arg

65                  70                  75                  80

Arg Leu Gln Tyr Ala Phe Val Val Thr Asp Asp His Glu Asp Ile Phe

                85                  90                  95

Phe Gly Ser Ser Gly Val Cys Pro Tyr Asn Glu Lys Thr Leu Glu Thr

            100                 105                 110

Ile His Tyr Tyr Phe Lys Phe Pro Phe Val His Glu Ala Asp Thr Phe

        115                 120                 125

Gln Ala Pro Glu Trp Val Lys Ser Thr Val Trp Tyr Gln Ile Phe Pro

    130                 135                 140

Glu Arg Phe Ala Asn Gly Arg Glu Asp Leu Ser Pro Lys Asn Ala Leu

145                 150                 155                 160

Pro Trp Gly Ser Lys Asp Pro Gly Val Asn Asp Phe Phe Gly Gly Asp

                165                 170                 175

Leu Gln Gly Ile Val Asp Lys Leu Asp Tyr Leu Glu Asp Leu Gly Val

            180                 185                 190

Asn Gly Ile Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Ser Ala Pro Ser Asn His Lys

        195                 200                 205

Tyr Asp Thr Leu Asp Tyr Phe Ser Ile Asp Pro His Phe Gly Asp Pro

    210                 215                 220

Glu Leu Phe Arg Thr Leu Val Ser Gln Leu His Gln Arg Gly Met Arg

225                 230                 235                 240

Ile Met Leu Asp Ala Val Phe Asn His Ile Gly Ser Ala Ser Pro Gln

                245                 250                 255

Trp Leu Asp Val Val Lys Asn Gly Asp Gln Ser Arg Tyr Lys Asp Trp

            260                 265                 270

Phe His Ile His Ser Phe Pro Val Thr Gly Asp Asn Tyr Asp Arg Phe

        275                 280                 285

Ala Phe Thr Ala Asp Met Pro Lys Leu Asn Thr Ala Asn Pro Glu Val

    290                 295                 300

Gln Lys Tyr Leu Leu Asp Ile Ala Leu Tyr Trp Ile Arg Glu Phe Asp

305                 310                 315                 320

Ile Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Asn Glu Val Asp His Val Phe

                325                 330                 335

Trp Lys Thr Phe Arg Gln Ala Val Ser Thr Glu Lys Pro Asp Val Tyr

            340                 345                 350

Ile Leu Gly Glu Ile Trp His Ser Ala Glu Pro Trp Leu Arg Gly Asp

        355                 360                 365

Glu Phe His Ala Ala Met Asn Tyr Pro Phe Thr Glu Pro Met Ile Glu

    370                 375                 380

Tyr Pro Ala Asp Arg Thr Ile Pro Ala Ser Arg Met Ala Tyr Arg Val

385                 390                 395                 400

Asn Ala His Leu Met Asn Gly Met Lys Gln Ala Asn Glu Val Met Phe

                405                 410                 415

Asn Leu Leu Asp Ser His Asp Thr Lys Arg Leu Leu Thr Arg Cys Arg

            420                 425                 430

Asn Asp Glu Lys Lys Ala Arg Ala Leu Leu Ala Phe Met Phe Ala Gln

        435                 440                 445

Thr Gly Ser Pro Cys Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Ile Gly Leu Asn Gly

    450                 455                 460

Glu Asn Asp Pro Leu Cys Arg Glu Cys Met Val Trp Glu Lys Glu Lys

465                 470                 475                 480

Gln Asn Gln Asp Met Leu Gln Phe Met Lys Arg Leu Ile Ala Leu Arg

                485                 490                 495

Lys Gln Glu Asn Thr Leu Leu Thr Glu Gly Asn Leu Glu Trp Asn Leu

            500                 505                 510

Leu Asp Asp Gln Asn Asp Phe Ile Ser Phe Ser Arg Thr Leu Asp Glu

        515                 520                 525

Lys Ile Leu Ile Tyr Phe Phe Asn Gln Gly Asn Ala Val Gln Tyr Val

    530                 535                 540

Ser Leu Arg Asp Leu Asn Ile Glu Arg Asn Lys Lys Ile Cys Asp Ala

545                 550                 555                 560

Trp Thr Glu Gln Pro Leu Gln His His Asp Val Ile Ala Val Gln Pro

                565                 570                 575

Gly Glu Phe Leu Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Val

            580                 585

<210>4

<211>561

<212>PRT

<213>嗜温细菌ZW2531-1

<400>4

Met Ser Glu Trp Trp Lys Glu Ala Val Val Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg

 1               5                  10                  15

Ser Phe Tyr Asp Ala Asn Gly Asp Gly Phe Gly Asp Leu Gln Gly Val

            20                  25                  30

Ile Gln Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Trp

        35                  40                  45

Leu Ser Pro Val Phe Asp Ser Pro Gln Asp Asp Asn Gly Tyr Asp Ile

    50                 55                 60

Ser Asp Tyr Lys Asn Met Tyr Glu Lys Phe Gly The Asn Glu Asp Met

65                 70                 75                 80

Phe Gln Leu Ile Asp Glu Val His Lys Arg Gly Met Lys Ile Val Met

                85                 90                 95

Asp Leu Ala Val Asn His The Ser Asp Glu His Ala Trp Phe Ala Glu

            100                 105                 110

Ser Arg Lys Ser Lys Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Lys

        115                 120                 125

Asp Pro Lys Pro Asp Gly Ser Glu Pro Asn Asn Trp Gly Ser Ile Phe

    130                 135                 140

Ser Gly Ser Ala Trp The Tyr Asp Glu Gly The Gly Gln Tyr Tyr Leu

145                 150                 155                 160

His Tyr Phe Ser Lys Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Glu Ala

                165                 170                 175

Val Arg Arg Glu Val Tyr Asp Val Met Arg Phe Trp Met Asp Arg Gly

            180                 185                 190

Val Asp Gly Trp Arg Met Asp Val Ile Gly Ser Ile Ser Lys Tyr The

        195                 200                 205

Asp Phe Pro Asp Tyr Glu The Asp His Ser Arg Ser Tyr Ile Val Gly

    210                 215                 220

Arg Tyr His Ser Asn Gly Pro Arg Leu His Glu Phe Ile Gln Glu Met

225                 230                 235                 240

Asn Arg Glu Val Leu Ser His Tyr Asp Cys Met The Val Gly Glu Ala

                245                 250                 255

Asn Gly Ser Asp Ile Glu Glu Ala Lys Lys Tyr The Asp Ala Ser Arg

            260                 265                 270

Gln Glu Leu Asn Met Ile Phe The Phe Glu His Met Asp Ile Asp The

        275                 280                 285

Glu Gln Asn Ser Pro Asn Gly Lys Trp Gln Ile Lys Pro Phe Asp Leu

    290                 295                 300

Ile Ala Leu Lys Lys The Met The Arg Trp Gln The Gly Leu Met Asn

305                 310                 315                 320

Val Gly Trp Asn The Leu Tyr Phe Glu Asn His Asp Gln Pro Arg Val

                325                 330                 335

Ile Ser Arg Trp Gly Asn Asp Gly Lys Leu Arg Lys Glu Cys Ala Lys

            340                 345                 350

Ala Phe Ala The Val Leu His Gly Met Lys Gly The Pro Phe Ile Tyr

        355                 360                 365

Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met Val Asn Ser Asp Met Pro Leu Glu Met

    370                 375                 380

Tyr Asp Asp Leu Glu Ile Lys Asn Ala Tyr Arg Glu Leu Val Val Glu

385                 390                 395                 400

Asn Lys The Met Ser Glu Lys Glu Phe Val Lys Ala Val Met Ile Lys

                405                 410                 415

Gly Arg Asp His Ala Arg The Pro Met Gln Trp Asp Ala Gly Lys His

            420                 425                 430

Ala Gly Phe The Ala Gly Asp Pro Trp Ile Pro Val Asn Ser Arg Tyr

        435                 440                 445

Gln Asp Ile Asn Val Glu Glu Ser Leu Lys Asp Gln Asp Ser Ile Phe

    450                 455                 460

Phe Tyr Tyr Gln Lys Leu Ile Gln Leu Arg Lys Gln Tyr Lys Ile Met

465                 470                 475                 480

Ile Tyr Gly Asp Tyr Gln Leu Leu Gln Glu Asn Asp Pro Gln Val Phe

                485                 490                 495

Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Gln Gly Glu Lys Leu Leu Val Val Val Asn

            500                 505                 510

Leu Ser Glu Glu Lys Ala Leu Phe Val Ala Pro Pro Glu Leu Ile His

        515                 520                 525

Glu Arg Trp Lys Val Leu Ile Ser Asn Tyr Pro Gln Glu Arg Ala Asp

    530                 535                 540

Leu Lys Ser Ile Ser Leu Lys Pro Tyr Glu Ala Val Met Gly Ile Ser

545                 550                 555                 560

Ile   *

Claims (10)

1、一种嗜温多功能淀粉酶基因，其特征在于：其核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、或是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、或是与SEQ ID NO.1至少99％同源的核苷酸序列、或是与SEQ ID NO.2至少99％同源的核苷酸序列。

2、一种嗜温多功能淀粉酶，其特征在于：其氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列、或是SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列、或是与SEQ ID NO.3至少99％同源的氨基酸序列、或是与SEQ ID NO.4至少99％同源的氨基酸序列。

3、如权利要求2所述的嗜温多功能淀粉酶，其特征在于：是由权利要求1所述的嗜温多功能淀粉酶基因与表达载体重组，重组后的表达载体导入真核表达细胞或原核表达细胞内得到表达的嗜温多功能淀粉酶。

4、如权利要求3所述的嗜温多功能淀粉酶，其特征在于：表达载体为pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103表达载体。

5、如权利要求3所述的嗜温多功能淀粉酶，其特征在于：原核表达细胞为大肠杆菌或枯草杆菌。

6、如权利要求3～5任何一项所述的嗜温多功能淀粉酶，其特征在于：所产生的嗜温多功能淀粉酶为胞内酶或胞外酶。

7、权利要求3～5任何一项所述的嗜温多功能淀粉酶在淀粉加工方面的应用。

8、如权利要求7所述的嗜温多功能淀粉酶在淀粉加工方面的应用，其特征在于：用于制备异麦芽低聚糖或用于制备麦芽低聚糖。

9、如权利要求8所述的嗜温多功能淀粉酶在淀粉加工方面的应用，其特征在于：异麦芽低聚糖包括异麦芽三糖和异麦芽四糖，麦芽低聚糖包括麦芽糖和麦芽三糖。

10、权利要求6所述的嗜温多功能淀粉酶在淀粉加工方面的应用。

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