JPH0884586A

JPH0884586A - 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素

Info

Publication number: JPH0884586A
Application number: JP7189706A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Maruta; 和彦丸田; Michio Kubota; 倫夫久保田; Toshiyuki Sugimoto; 利行杉本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-04
Publication date: 1996-04-02
Anticipated expiration: 2015-07-04
Also published as: DK0709461T3; ATE171727T1; TW432112B; KR100395445B1; EP0709461B1; CA2154307A1; US5976856A; CA2154307C; US20020102696A1; DE69505084D1; DE69505084T2; US5922578A; AU2713295A; JP3557288B2; IL114637A0; AU690698B2; EP0709461A1

Abstract

(57)【要約】【目的】還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を
有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素、そ
の組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡとそのＤＮＡ
を含む組換えＤＮＡと形質転換体、その形質転換体を利
用する組換え型耐熱性酵素の製造方法、さらには、組換
え型耐熱性酵素による還元性澱粉糖の酵素的変換方法を
提供する。【構成】特定の理化学的性質を有する組換え型耐熱性
酵素と、その組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡ
と、そのＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる
複製可能な組換えＤＮＡと、その組換えＤＮＡを適宜宿
主に導入してなる形質転換体と、その形質転換体を培養
し、培養物から組換え型耐熱性酵素を採取してなる組換
え型耐熱性酵素の製造方法と、特定の還元性澱粉糖に組
換え型耐熱性酵素を作用させて末端にトレハロース構造
を有する非還元性糖質を生成させる工程を含んでなる還
元性澱粉糖の酵素的変換方法を要旨とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、グルコース重合度３
以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有す
る非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、グルコース２分子が還
元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真
菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分
子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で
加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の
懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしな
がら、従来の方法では所望量を入手するのが難しく、実
際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなかった。

【０００３】これまでの製造方法は、微生物の菌体を利
用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに
大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５
号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生
物を栄養培地で増殖させ、主として菌体からトレハロー
スを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭
５８−２１６６９５号公報などにもみられるように、基
質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフ
ォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからな
る複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外
に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの
増殖は比較的容易なものの、菌体に含まれるトレハロー
スが高々１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があ
った。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比
較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡
反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側
に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、
トレハロースの収量を上げるのが原理的に難しかった。

【０００４】斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖か
らトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき
鋭意検索したところ、リゾビウム属やアルスロバクター
属に属するある種の微生物がグルコース重合度３以上の
還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還
元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素
を産生することを見出し、特願平５−３４９２１６号明
細書に開示した。そして、この非還元性糖質は、グルコ
アミラーゼやα−グルコシダーゼを作用させると、容易
にトレハロースを与えることも見出した。

【０００５】ところが、上記微生物が産生する酵素は、
いずれも４０℃付近に至適温度を有しており、実際にト
レハロースの製造に使用するには熱安定性にやや難のあ
ることが判明した。すなわち、斯界においては、澱粉や
澱粉質を糖化するには、一般に、５５℃を上回る温度で
反応させるのが望ましいとされており、これは、５５℃
以下で糖化すると雑菌汚染が顕著となり、反応物のｐＨ
が低下して酵素が失活したり、これにより、大量の基質
が未反応のまま残存したりすることによる。敢えて熱安
定性に劣る酵素で糖化しようとすると、ｐＨの推移に多
大の注意を払わなければならず、万一、ｐＨが顕著に低
下した場合には、反応物にアルカリ等を加えて可及的速
やかにｐＨを上昇させるなどの対策を講じなければなら
ない。

【０００６】斯かる状況に鑑み、本発明者が、斯かる作
用ある耐熱性酵素につき引続き検索したところ、スルフ
ォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）
を始めとするスルフォロブス属の微生物が産生する酵素
は、５５℃を上回る温度で反応させても、実質的に失活
することなく、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖
から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を効
率的に生成することを見出した。しかしながら、これら
微生物はいずれも酵素の産生能が充分でなく、トレハロ
ースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を
大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しな
ければならないという問題がある。

【０００７】一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には
目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解
明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝
子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素を
コードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを
微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を
培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得
できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記耐熱性酵
素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明
するのが急務となっている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、組
換えＤＮＡ技術を応用することにより、グルコース重合
度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を
有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素を創
製することにある。

【０００９】この発明の別の目的は、その創製された組
換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡを提供することに
ある。

【００１０】この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮ
Ａを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにあ
る。

【００１１】この発明のさらに別の目的は、斯かる組換
えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。

【００１２】この発明のさらに別の目的は、斯かる形質
転換体を利用する、組換え型耐熱性酵素の製造方法を提
供することにある。

【００１３】この発明のさらに別の目的は、組換え型耐
熱性酵素を利用する、グルコース重合度３以上の還元性
澱粉糖を末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質
に変換する方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、下記の理化学的性質を有する組換え型耐熱性酵
素により解決するものである。（１）作用グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレ
ハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。（２）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
すると、分子量約６９，０００乃至７９，０００ダルト
ンを示す。（３）等電点等電点電気泳動法により測定すると、約５．４乃至６．
４に等電点を示す。（４）熱安定性水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベ
ートしても、実質的に失活しない。

【００１５】この発明は、前記第二の課題を、上記組換
え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡにより解決するもの
である。

【００１６】この発明は、前記第三の課題を、上記組換
え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベ
クターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決
するものである。

【００１７】この発明は、前記第四の課題を、上記組換
え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベ
クターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主
に導入してなる形質転換体により解決するものである。

【００１８】この発明は、前記第五の課題を、上記組換
え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベ
クターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主
に導入してなる形質転換体を培養し、培養物から組換え
型耐熱性酵素を採取してなる組換え型耐熱性酵素の製造
方法により解決するものである。

【００１９】この発明は、前記第六の課題を、グルコー
ス重合度３以上の還元性澱粉糖に上記組換え型耐熱性酵
素を作用させて末端にトレハロース構造を有する非還元
性糖質を生成させる工程を含んでなる還元性澱粉糖の酵
素的変換方法により解決するものである。

【００２０】

【作用】この発明の組換え型耐熱性酵素は、５５℃を越
える温度で反応させても、実質的に失活することなく、
グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレ
ハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。

【００２１】この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜
ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、これ
を、通常、当該酵素を産生しないけれども、容易に増殖
させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とす
ることにより、当該酵素の産生を発現する。

【００２２】この発明の組換えＤＮＡは、通常、当該酵
素を産生しないけれども、容易に増殖させることのでき
る適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当
該酵素の産生を発現する。

【００２３】この発明の形質転換体は、培養すると、当
該酵素を産生する。

【００２４】斯かる形質転換体をこの発明の製造方法に
したがって培養すれば、所望量の当該酵素が容易に得ら
れる。

【００２５】この発明の酵素的変換方法により、グルコ
ース重合度３以上の還元性澱粉糖は、末端にトレハロー
ス構造を有する非還元性糖質に変換される。

【００２６】この発明は、グルコース重合度３以上の還
元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元
性糖質を生成する、従来未知の全く新規な耐熱性酵素の
発見に基づくものである。斯かる酵素はスルフォロブス
・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）の培養物
から得ることができ、本発明者がカラムクロマトグラフ
ィーを中心とする種々の精製方法を組合わせてこの酵素
を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は
ポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有する
ことが判明した。（１）作用グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレ
ハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。（２）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
すると、分子量約６９，０００乃至７９，０００ダルト
ンを示す。（３）等電点等電点電気泳動法により測定すると、約５．４乃至６．
４に等電点を示す。（４）至適温度ｐＨ５．５で６０分間反応させると、７５℃付近に至適
温度を示す。（５）至適ｐＨ６０℃で６０分間反応させると、ｐＨ５．０乃至５．５
に至適ｐＨを示す。（６）熱安定性ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、８５℃付
近まで安定である。（７）ｐＨ安定性４℃で２４時間インキュベートすると、ｐＨ４．０乃至
９．５まで安定である。

【００２７】次に、スルフォロブス・アシドカルダリウ
ス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の理化
学的性質を解明すべく行った実験について説明する。

【００２８】

【実験例１精製酵素の調製】５００ｍｌ容フラスコに
０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）
酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、
０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％
（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／
ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地を約１００ｍ
ｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅
菌し、冷却後、硫酸を加えてｐＨ３．０に調整した。こ
の液体培地にスルフォロブス・アシドカルダリウス（Ａ
ＴＣＣ３３９０９）を接種し、７５℃、１３０ｒｐｍで
２４時間回転振盪培養して第一の種培養液を得た。１０
ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約５
ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０
に調整後、第一の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７
５℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養し
て第二の種培養液を得た。その後、３００ｌ容ファーメ
ンターに上記と同一組成の液体培地を約２５０ｌとり、
同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整
後、第二の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、
通気量１００ｌ／分で４２時間通気撹拌培養した。

【００２９】約１７０ｌの培養物をＳＦ膜により膜濾過
し、遠心分離して得られた湿重量約２５８ｇの菌体を１
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｌに浮遊さ
せ、超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を１０，
０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた約３００
ｍｌの上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるよう
に加え、４℃で２４時間静置後、１０，０００ｒｐｍで
３０分間遠心分離した。沈澱部を採取し、適量の１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、新鮮な
同じ緩衝液に対して２４時間透析後、１０，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離して酵素活性ある約６００ｍｌの
上清を得た。

【００３０】この上清を略二等分し、それぞれ別々に、
予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡
化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー
用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール』約３５０ｍｌのカラム
に負荷し、０Ｍから０．３Ｍに上昇する塩化ナトリウム
の濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を通液した。塩化ナトリウム濃度０．１
Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、１Ｍ硫酸
アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に対して１０時間透析し、１０，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離して不溶物を除去した後、予め１Ｍ
硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製疎水クロ
マトグラフィー用ゲル『ブチルトヨパール６５０』約３
５０ｍｌのカラムに負荷し、１Ｍから０Ｍに下降する硫
酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。

【００３１】硫酸アンモニウム濃度０．８Ｍ付近で溶出
した酵素活性ある画分を採取し、０．２Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に
対して１６時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間
遠心分離して不溶物を除去した後、予め０．２Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で平衡化させておいたセプラコル製ゲル濾過クロマ
トグラフィー用ゲル『ウルトロゲルＡｃＡ４４』約３
５０ｍｌのカラムに通液した。溶出液から酵素活性ある
画分を採取し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に対して１６時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離して不溶物を除去した後、予め１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておい
たファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル
『ＭｏｎｏＱ』約１０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍか
ら０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カ
ラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通
液した。そして、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近で溶
出した酵素活性ある画分を採取し、以下の実験に供し
た。このようにして調製した精製酵素の比活性は約８１
単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約
０．２４単位であった。

【００３２】常法により、この精製酵素を７．５％（ｗ
／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したとこ
ろ、ゲル上には酵素活性を伴なう実質的に単一のバンド
が観察され、精製酵素が極めて高純度であることが窺わ
れた。

【００３３】なお、この発明を通じて、耐熱性酵素の活
性は、次の方法により測定した活性値（単位）で表示す
る。すなわち、基質としてマルトペンタオースを１．２
５％（ｗ／ｖ）含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
４ｍｌに適宜希釈した酵素液を１ｍｌ加え、６０℃で６
０分間インキュベートして反応させた後、１００℃で３
０分間加熱して反応を停止させる。反応物を１ｍｌと
り、脱イオン水で１０倍希釈した後、ソモギ−ネルソン
法により還元力を測定する。同時に、予め１００℃で３
０分間加熱して失活させておいた酵素液を使用する系を
設け、上記と同様に処置して対照とする。耐熱性酵素の
１単位とは、上記反応条件下において、１分間にマルト
ペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を消失させる
酵素量と定義する。

【００３４】

【実験例２耐熱性酵素の理化学的性質】

【００３５】

【実験例２−１作用】基質としてグルコース、マルト
ース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオ
ースを１０％（ｗ／ｖ）含む水溶液を調製し、これに実
験例１で調製した精製酵素を基質固形分１ｇ当たり２単
位加え、６０℃、ｐＨ５．５で４８時間反応させた。反
応物を常法により脱塩後、和光純薬工業製高速液体クロ
マトグラフィー用カラム『ワコービーズＷＢ−Ｔ−３３
０』を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により糖組成を分析した。高速液体クロマトグラフ
ィーは室温下で実施し、溶出液を東ソー製示差屈折計
『ＲＩ−８０１２型』でモニタしながら、溶離液として
水を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。結果を表１に示
す。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１の結果は、精製酵素がグルコース重合
度３以上の還元性澱粉糖であるマルトトリオース、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース及びマルトヘプタオースに作用して、末端にトレハ
ロース構造を有する非還元性糖質であるα−グルコシル
トレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マル
トトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルト
レハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを
生成したことを示している。反応物からはこれら非還元
性糖質と未反応の基質に加えて、基質の加水分解物と考
えられるグルコース及び低分子のマルトオリゴ糖が検出
され、精製酵素に加水分解作用のあることを示唆してい
た。個々の基質からの非還元性糖質及び加水分解物の収
量は、固形分当たり、マルトトリオースでそれぞれ３
０．２％及び２７．６％で、マルトテトラオースで６
５．４％及び１８．４％、マルトペンタオース乃至マル
トヘプタオースで約７４乃至７５％及び約２乃至３％で
あり、グルコース重合度５以上のマルトオリゴ糖からは
非還元性糖質が好収率で生成し、加水分解も僅少となる
傾向が見られた。なお、グルコース及びマルトースから
は新たな糖質の生成を見なかった。

【００３８】

【実験例２−２分子量】ユー・ケー・レムリが『ネイ
チャー』、第２２７巻、第６８０乃至６８５頁（１９７
０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約
６９，０００乃至７９，０００ダルトンに相当する位置
に酵素活性を伴う単一バンドが観察された。なお、この
ときの分子量マーカーは、ミオシン（２００，０００ダ
ルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダル
トン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルト
ン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオ
ボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。

【００３９】

【実験例２−３等電点】２％（ｗ／ｖ）アンフォライ
ンを含むポリアクリルアミドゲル上で精製酵素を等電点
電気泳動したところ、約５．４乃至６．４に等電点を示
した。

【００４０】

【実験例２−４至適温度】常法により、２０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）中、相違する温度で６０分間反応
させたところ、図１に示すように、精製酵素は７５℃付
近に至適温度を示した。

【００４１】

【実験例２−５至適ｐＨ】常法により、ｐＨの相違す
るマッキルヴェイン氏緩衝液中、６０℃で６０分間反応
させたところ、図２に示すように、精製酵素はｐＨ５．
０乃至５．５付近に至適ｐＨを示した。

【００４２】

【実験例２−６熱安定性】常法により、１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）中、相違する温度で６０分間イン
キュベートしたところ、図３に示すように、精製酵素は
８５℃付近まで安定であった。

【００４３】

【実験例２−７ｐＨ安定性】常法により、ｐＨの相違
するマッキルヴェイン氏緩衝液又は５０ｍＭ炭酸ナトリ
ウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間
インキュベートしたところ、図４に示すように、精製酵
素はｐＨ４．５乃至９．５付近まで安定であった。

【００４４】

【実験例２−８Ｎ末端アミノ酸配列】常法により、パ
ーキン・エルマー製気相プロテイン・シーケンサ『４７
３Ａ型』を使用して分析したところ、精製酵素はＮ末端
に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し
ていた。

【００４５】

【実験例２−９部分アミノ酸配列】精製酵素を適量と
り、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対し
て４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度約１ｍｇ／ｍｌとし
た。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダー
ゼを１０μｇ加え、３０℃、４８時間インキュベートし
て酵素を部分加水分解した。加水分解物を予め１６％
（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／
ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた日本ミリポ
ア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム
『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、１６％（ｖ
／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニト
リルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そし
て、通液開始から約１１分後に溶出したペプチド断片を
含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性
アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ
酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析した
ところ、ペプチド断片は配列表における配列番号４に示
すアミノ酸配列を有していた。

【００４６】以上のような理化学的性質を有する酵素は
未だ知られておらず、新規物質であると判断される。

【００４７】そこで、本発明者が、配列表における配列
番号３及び４に示す部分アミノ酸配列に基づき化学合成
したオリゴヌクレオチドをプローブにし、スルフォロブ
ス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）の染色
体ＤＮＡを鋭意検索したところ、配列表における配列番
号２に示す５´末端からの塩基配列を有する約２，２０
０塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その
塩基配列を解読したところ、同微生物が産生する耐熱性
酵素は７２０個のアミノ酸からなる、配列表における配
列番号１に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有している
ことが判明した。

【００４８】配列表における配列番号１及び２に示すア
ミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の工程
を要約すると、次のようになる。（１）供与体微生物の培養物から耐熱性酵素を分離
し、高度に精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。一
方、その精製酵素プロテアーゼにより部分加水分解し、
加水分解物からペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配
列を決定した。（２）別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを
分離し、精製後、制限酵素により部分消化し、消化物か
ら約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断
片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片
を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに
連結し、組換えＤＮＡを作製した。（３）大腸菌にこの組換えＤＮＡを導入して形質転換
体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成し
たオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブ
リダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを
含む形質転換体を選択した。（４）形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライ
マーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作
用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡを
ジオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩
基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定され
るアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列を比較し、その
塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。

【００４９】次の実験例３及び４では、上記（２）乃至
（４）の工程を具体的に説明するが、これら実験例で使
用する手法自体は斯界において公知のものであり、例え
ば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニ
ング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９
８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー発行などにも詳述されている。

【００５０】

【実験例３耐熱性酵素をコードするＤＮＡを含む組換
えＤＮＡと形質転換体の調製】

【００５１】

【実験例３−１染色体ＤＮＡの調製】５００ｍｌ容フ
ラスコに０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％
（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモ
ニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、
０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０
２％（ｗ／ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地を
約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレ
ーブして滅菌し、冷却後、硫酸を加えてｐＨ３．０に調
整した。この液体培地にスルフォロブス・アシドカルダ
リウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を接種し、７５℃、１３
０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。
１０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を
約５ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ
３．０に調整後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）
接種し、７５℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気
撹拌培養した。

【００５２】遠心分離により培養物から採取した菌体を
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを
０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ
緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ
緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離によ
り上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを
加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液
（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテア
ーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃
で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロ
ロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体Ｄ
ＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染
色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩
衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結し
た。

【００５３】

【実験例３−２組換えＤＮＡｐＳＴ３５と形質転換
体ＳＴ３５の調製】実験例３−１で調製した精製染色体
ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色
体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法によ
り約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断
片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・
システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＳＫ（＋）』を１μｇとり、常法により制限
酵素ＢａｍＨＩを作用させて完全に切断した後、上記
で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼを２
単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片に
連結した。得られた組換えＤＮＡにストラタジーン・ク
ローニング・システムズ製コンピテントセル『Ｅｐｉｃ
ｕｒｉａｎＣｏｌｉＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ
加え、氷冷下で３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯ
Ｃブロスを加え、３７℃で１時間インキュベートして組
換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００５４】このようにして得た形質転換体を５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを
５０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に接種
し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された約
５，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定した。別
途、常法により、配列表における配列番号３に示すアミ
ノ酸配列のＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐで表わされる配列に基づき５´−ＡＡＹ
ＹＴＮＴＧＧＴＡＹＴＴＹＡＡＲＧＡ−３´で表わされ
る塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体³²Ｐで標
識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニ
ーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した１５種類
の形質転換体を選択した。

【００５５】常法により、これら１５種類の形質転換体
から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表における配列
番号４に示すアミノ酸配列のＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅで表わされる配列に基
づき５´−ＧＡＲＧＡＲＴＧＧＣＡＹＷＳＮＡＴＨＡＴ
−３´で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成
し、同位体³²Ｐで標識後、イー・エム・サザーン『ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８
巻、第５０３乃至５１７頁（１９７５年）に記載されて
いる方法に準じて上記組換えＤＮＡにハイブリダイズさ
せ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを採取した。この
ようにして得た組換えＤＮＡ及び形質転換体を、それぞ
れ、『ｐＳＴ３５』、『ＳＴ３５』と命名した。

【００５６】形質転換体ＳＴ３５をアンピシリン１００
μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に接種
し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠
心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ
法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を
常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡｐＳ
Ｔ３５は約６，２００塩基対からなり、図５に示すよう
に、当該酵素をコードする約２，２００塩基対からなる
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位の下流に
連結していた。

【００５７】

【実験例３−３形質転換体ＳＴ３５による組換え型耐
熱性酵素の産生】５００ｍｌ容フラスコに０．１％（ｗ
／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、
０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０５％（ｗ
／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸
マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カリウ
ム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を約１００ｍ
ｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅
菌し、冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた。
この液体培地に実験例３−２で調製した形質転換体ＳＴ
３５を接種し、３７℃、１３０ｒｐｍで２４時間回転振
盪培養して種培養液を得た。次に、１０ｌ容ファーメン
ターに上記と同一組成の液体培地を約５ｌとり、同様に
滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンを５０μｇ／
ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃、
通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養した。

【００５８】培養物を常法により超音波処理して菌体を
破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、上清に硫酸ア
ンモニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で２４
時間静置後、遠心分離により沈澱部を採取した。この沈
澱を少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解
し、新鮮な同一緩衝液に対して１０時間透析後、酵素活
性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約８．０単位の
組換え型耐熱性酵素が検出された。

【００５９】対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又
はスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３
９０９）をアンピシリン無含有の上記と同一組成の液体
培地を使用し、スルフォロブス・アシドカルダリウス
（ＡＴＣＣ３３９０９）の場合、始発ｐＨ及び培養温度
をそれぞれ３．０及び７５℃に設定した以外は前記と同
様に培養・処理した。処理物の酵素活性を測定したとこ
ろ、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３
３９０９）により耐熱性酵素の産生は培養物１ｌ当たり
約１．８単位と、形質転換体ＳＴ３５と比較して有意に
低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ
−Ｂｌｕｅ株は耐熱性酵素を全く産生しなかった。

【００６０】その後、形質転換体ＳＴ３５が産生した組
換え型耐熱性酵素を実験例１乃至２の方法により精製
し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分子量約６９，０００乃至７
９，０００ダルトンと等電点電気泳動で約５．４乃至
６．４に等電点を示すとともに、水溶液（ｐＨ７．０）
中、８５℃で６０分間インキュベートしても実質的に失
活しないなど、供与体微生物であるスルフォロブス・ア
シドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐
熱性酵素とほぼ同じ理化学的性質を有していた。このこ
とは、組換えＤＮＡ技術によっても耐熱性酵素を製造で
き、且つ、その生産性も有意に向上することを示唆して
いる。

【００６１】

【実験例４相補鎖ＤＮＡの調製並びにその塩基配列及
びアミノ酸配列の決定】実験例３−２で調製した組換え
ＤＮＡｐＳＴ３５を２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナ
トリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノ
ールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を
採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学
合成した５´−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−
３´で表わされる塩基配列のプライマーを５０ｐｍｏｌ
／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと塩化ナトリウム
を含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１
０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニー
リングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれ
ぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−³²Ｐ］ｄ
ＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジ
チオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７
ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間イ
ンキュベートすることによりプライマーを５´末端から
３´末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させ
た。

【００６２】次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応
物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ
ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．
５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応さ
せた後、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブ
ロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレ
ンシアノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド
溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水
中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド
ゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら
電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法により
ゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィー
した。

【００６３】ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を分
析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５
に示す約２，２００塩基対からなる塩基配列を含んでい
ることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ
酸配列はその配列番号５に併記したとおりであり、この
アミノ酸配列と配列表における配列番号３及び４に示す
部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号３の配列
は配列番号５における第１乃至３０番目の配列に、ま
た、配列番号４の配列は配列番号５における第４６８乃
至４７８番目の配列に一致した。これは、この発明の組
換え型耐熱性酵素が配列表における配列番号１に示すＮ
末端からのアミノ酸配列を有することあり、スルフォロ
ブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）由来
のＤＮＡにおいては、そのアミノ酸配列が配列表におけ
る配列番号２に示す５´末端からの塩基配列によりコー
ドされていることを示している。

【００６４】以上説明したように、グルコース重合度３
以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有す
る非還元性糖質を生成する耐熱性酵素は、本発明者の長
年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従
来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備
している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用するこ
とにより、この耐熱性酵素を創製しようというものであ
る。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え
型耐熱性酵素並びにその製造方法及び用途につき、具体
的に説明する。

【００６５】この発明でいう組換え型耐熱性酵素とは、
組換えＤＮＡ技術により創製され、グルコース重合度３
以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有す
る非還元性糖質を生成する耐熱性酵素全般を意味する。
この発明の組換え型耐熱性酵素は、通常、解明されたア
ミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配
列表における配列番号１に示すＮ末端からのアミノ酸配
列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列
番号１に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有
する変異体は、所期の理化学的性質を実質的に変えるこ
となく、配列番号１のアミノ酸配列における構成アミノ
酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することに
より得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、
それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の
培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・ｐＨ
などに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾
などにより、所期の理化学的性質は保持しているもの
の、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近
のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１
個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産
生することがある。斯かる変異体であっても、それが所
期の理化学的性質を具備しているかぎり、当然、この発
明の組換え型耐熱性酵素に包含される。

【００６６】この発明による組換え型耐熱性酵素は、特
定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取すること
ができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、
配列表における配列番号２に示す５´末端からの塩基配
列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的
な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得
ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コード
の縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えるこ
となく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置き換え
てもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産
生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコ
ードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他
の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。

【００６７】この発明で使用するＤＮＡは、それが前述
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、スルフォロブス・アシドカル
ダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を含むスルフォロブス
属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からはこ
の発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯
かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１日
乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチー
ムやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で
処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に
溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼ
などの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波
処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍
結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例え
ば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロ
テアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界におけ
る通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られ
る。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配
列表における配列番号２に示す塩基配列に基づいて化学
合成するか、配列表における配列番号１に示すアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクター
に挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入し
て得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取
し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取す
ればよい。

【００６８】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡ
と自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手
できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＢ１１
０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、Ｙ
Ｅｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・
λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのフ
ァージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤ
ＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＫＫ
２２３−３、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であ
り、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｚ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適で
ある。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７
は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合
に有用である。

【００６９】ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、
斯界において通常一般の方法が採用される。具体的に
は、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクタ
ーとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、
生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝
子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用す
る制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、
Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＢａｎＩＩＩ、ＳｐｅＩなどを使用すれば、
ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。
ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じ
て、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤ
ＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組
換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、こ
れを培養することにより無限に複製可能である。

【００７０】このようにして得られる組換えＤＮＡは、
大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主
微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合に
は、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で
培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コン
ピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。
形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリ
ダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度３以
上の還元性澱粉糖を含む栄養培地で培養し、該澱粉糖よ
り末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成
するものを選択すればよい。

【００７１】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培
地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、
必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を
補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源
としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、また、窒
素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、
尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コー
ンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有
機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種
し、栄養培地を温度２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保
ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６
日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。こ
の培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、
通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞溶解
酵素により菌体を破砕した後、瀘過、遠心分離などによ
り酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精
製には酵素を精製するための通常の方法が採用でき、例
えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合
わせて適用すればよい。

【００７２】前述のとおり、この発明による組換え型耐
熱性酵素は、５５℃を越える温度で反応させても、実質
的に失活することなく、グルコース重合度３以上の還元
性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性
糖質を生成するという、従来の酵素には見られない独特
の性質を有する。生成した非還元性糖質は温和で上品な
甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有し、そして、何よ
りも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の
懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点があ
る。当該酵素のこの性質を利用することにより、従来、
還元性故に敬遠されがちであった種々の澱粉糖を、還元
性を有しないか還元性が顕著に低下した、扱い易い、有
用な糖質に変換できることとなる。

【００７３】斯かる変換方法につきさらに説明すると、
この発明による組換え型耐熱性酵素の基質には、通常、
澱粉、アミロペクチン、アミロースなどの澱粉又は澱粉
質を酸及び／又はアミラーゼによって部分的に加水分解
して得られる還元性澱粉糖が用いられる。斯かる澱粉糖
は斯界における通常一般の方法により得ることができ、
通常、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
スなどのグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の１
種又は２種以上を含んでなる。アミラーゼ研究会編『ハ
ンドブック・オブ・アミレーシーズ・アンド・リレイテ
ッド・エンザイムズ』、１９８８年、バーガモン・プレ
ス発行に記載されているα−アミラーゼ、マルトテトラ
オース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラ
ーゼ及びマルトヘキサオース生成アミラーゼは、この発
明で使用する還元性澱粉糖の調製に特に有用であり、こ
れらアミラーゼのいずれかを使用することにより、グル
コース重合度３以上の還元性澱粉糖を豊富に含む澱粉糖
混合物が容易に且つ効率的に得られる。なお、このと
き、必要に応じて、プルラナーゼやイソアミラーゼなど
の澱粉枝切酵素を併用すれば、当該酵素の基質となり得
る還元性澱粉糖の収量を上げることができる。

【００７４】この発明による酵素的変換方法において
は、通常、基質として上記したような還元性澱粉糖の１
種又は２種以上を含む水溶液にこの発明による組換え型
耐熱性酵素を共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに
保ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応さ
せる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の基質濃度下でも
進行するが、この発明による変換方法を大規模に実施す
る場合には、より高濃度の２％（ｗ／ｗ）以上、望まし
くは、５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時
の温度とｐＨは組換え型耐熱性酵素が失活することなく
基質に効率的に作用するレベルに設定され、温度は５５
℃を越え、８５℃を越えないレベルに、望ましくは、約
５６乃至７０℃に、また、ｐＨは４乃至７、望ましく
は、約５乃至６の範囲に設定される。組換え型耐熱性酵
素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設
定する。斯くして、グルコース重合度３以上の還元性澱
粉糖は末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質に
変換され、マルトペンタオースの場合、変換率は約７４
％にも達する。

【００７５】この発明の変換方法により得られた反応物
はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精
製する。すなわち、瀘過、遠心分離などにより反応物か
ら不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交
換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とす
る。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴
霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的に非還元
性糖質のみからなる製品を得るには、上記シロップ状物
にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質
を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコー
ル、アセトンなどによる分別沈澱、膜瀘過、酵母による
発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種
又は２種以上を適用する。大量に反応物を処理するに
は、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５
８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン
交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は疑似移
動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であ
り、これらの方法によるときには、非還元性糖質の含量
が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。

【００７６】斯くして得られる非還元性糖質は、糖質甘
味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例
えば、飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般
の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤な
どとして極めて有用である。加えて、斯かる非還元性糖
質は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、あるい
は、特願平６−７９２９１号明細書に開示されているト
レハロース遊離酵素を作用させると、ほぼ定量的にトレ
ハロースを与えることから、従来、大量に入手が難しか
ったトレハロースを製造するための中間体としても有用
である。

【００７７】以下、２〜３の実施例により、この発明に
よる組換え型耐熱性酵素の製造方法とその組換え型耐熱
性酵素による還元性澱粉糖の酵素的変換方法を具体的に
説明する。

【００７８】

【実施例Ａ−１組換え型耐熱性酵素の製造】５００ｍ
ｌ容フラスコに１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％
（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリ
ウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を約１００
ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして
滅菌し、冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え
た。この液体培地に実験例３−２の方法で得た形質転換
体ＳＴ３５を接種し、３７℃、１３０ｒｐｍで２４時間
回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファ
ーメンターに上記と同一組成の液体培地を約１８ｌと
り、同様に滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種
し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。

【００７９】培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠
心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定
したところ、培養物１ｌ当たり、約７５単位の組換え型
耐熱性酵素が産生していた。この上清を実験例１の方法
により精製したところ、比活性約８０単位／ｍｇ蛋白質
の組換え型耐熱性酵素を１ｍｌ当たり約５７単位含む水
溶液が約１０ｍｌ得られた。

【００８０】

【実施例Ａ−２組換え型耐熱性酵素の製造】

【００８１】

【実施例Ａ−２（ａ）形質転換体の作製】常法により
化学合成した５´−ＧＡＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡ
ＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴ−３´、５´−
ＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＣＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＡ−３´、
５´−ＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＧ
ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＡＣ
Ａ−３´、５´−ＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＧ
ＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＡＴＣＧ
ＡＴＧＡＡ−３´、５´−ＴＴＣＡＣＴＡＧＴＴＡＧＡ
ＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧ
ＣＡＧＡＧＣＴＣＡ−３´、５´−ＣＧＡＴＧＡＴＴＡ
ＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡ
ＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣ−３´、５´−ＴＴＴＴＡＴ
ＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣ
ＡＣＡＴＴＡＧＡＣＧＡＧＣ−３´、５´−ＴＴＡＡＣ
ＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡ
ＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡ−３´、５´−ＴＡ
ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＡＡ
ＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴ−３´及び５´−ＡＧ
ＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣ
ＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＴＡＡＣ−３´で表わされ
る塩基配列を有する１０種類のオリゴヌクレオチドを適
量混合し、１００℃、６５℃、３７℃及び２０℃でそれ
ぞれ２０分間インキュベートしてアニールさせた。得ら
れた下記の化１に示す塩基配列の二本鎖ＤＮＡに予め制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断してお
いたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３
−３』を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で
一晩静置して連結させることにより、配列表の配列番号
２に示す塩基配列における第１乃至５９番目及び第２，
１４９乃至２，１６０番目の塩基配列を含む第一の組換
えＤＮＡを得た。なお、この第一の組換えＤＮＡにおい
ては、配列表の配列番号２に示す塩基配列における第一
番目のグアニンがアデニンに置換されていた。

【００８２】

【化１】

【００８３】別途、実験例３−２の方法により得た組換
えＤＮＡｐＳＴ３５を制限酵素ＢａｎＩＩＩ及びＳ
ｐｅＩで切断し、配列表の配列番号２に示す塩基配列
における第６０乃至２，１４８番目までの配列を含む約
２，０９０塩基対のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
に予め制限酵素ＢａｎＩＩＩ及びＳｐｅＩで切断し
ておいた第一の組換えＤＮＡを上記と同様にして連結す
ることにより、配列表の配列表の配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を変えることなく配列番号２に示す塩基配列に
おける第一番目のグアニンのみがアデニンに置換された
２，１６０塩基対の塩基配列を含むこの発明による組換
えＤＮＡｐＳＴ３６を得た。

【００８４】この組換えＤＮＡｐＳＴ３６を実験例３
−２の方法に準じて宝酒造製コンピテントセル『ＢＭＨ
７１−１８』に導入し、この発明による組換え型耐熱性
酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体ＳＴ３６を得
た。実験例３−２の方法により形質転換体ＳＴ３６を培
養し、培養物から菌体を採取し、溶出させた組換えＤＮ
Ａを精製し、分析したところ、組換えＤＮＡｐＳＴ３
６は約６，７００塩基対からなり、図６に示すように、
当該酵素をコードする約２，１６０塩基対からなるＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位の下流に連結
していた。

【００８５】

【実施例Ａ−２（ｂ）形質転換体による組換え型耐熱
性酵素の製造】形質転換体ＳＴ３６を２％（ｗ／ｖ）マ
ルトース、４％（ｗ／ｖ）『Ｎ−Ｚ−Ｓｏｙペプトン』
（シグマ製）、２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％
（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、２００μｇ／ｍｌア
ンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用
いた以外は実施例Ａ−１と同様にして培養した。培養物
を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物
を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物
１ｌ当たり、約１２０，０００単位の組換え型耐熱性酵
素が産生していた。この上清を実験例１の方法により精
製したところ、比活性約８０単位／ｍｇ蛋白質の組換え
型耐熱性酵素を１ｍｌ当たり約２３０単位含む水溶液が
約４，０４０ｍｌ得られた。

【００８６】実験例２の方法によりこの精製酵素の性質
・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分子量約６９，０００乃至７９，０００ダ
ルトンと等電点電気泳動で約５．４乃至６．４に等電点
を示すとともに、水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６
０分間インキュベートしても実質的に失活しないなど、
供与体微生物であるスルフォロブス・アシドカルダリウ
ス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素とほぼ
同じ理化学的性質を有していた。

【００８７】

【実施例Ｂ−１非還元性糖質を含むシロップ状物への
変換】濃度６％（ｗ／ｗ）の馬鈴薯澱粉乳を加熱して糊
化した後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、林原生物
化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当たり
２，５００単位加え、２０時間反応させた。反応物をｐ
Ｈ６．５に調整し、１２０℃で１０分間オートクレーブ
して酵素を失活させた後、４０℃まで冷却し、ノボ・ノ
ルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ター
マミール６０Ｌ』を澱粉固形分１ｇ当たり１５０単位加
え、２０時間反応させた。新たに得られた反応物を１２
０℃で２０分間オートクレーブして酵素を失活させた
後、６０℃まで冷却し、ｐＨ５．５に調整後、実施例Ａ
−１の方法で得た組換え型耐熱性酵素を澱粉固形分１ｇ
当たり１単位加え、９６時間反応させた。反応物を９７
℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過
後、常法により活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により
脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロ
ップ状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得
た。

【００８８】ＤＥが２４．５と低く、非還元性糖質とし
てα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハ
ロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マル
トテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシ
ルトレハロースを固形分当たりそれぞれ１２．１％、
５．４％、３０．０％、１．４％又は２．０％含む本品
は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有
しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、
賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする
組成物一般に有利に配合使用できる。

【００８９】

【実施例Ｂ−２非還元性糖質を含む粉状物への変換】
実施例Ｂ−１の方法で得たシロップ状物における非還元
性糖質の含量を高めるべく、強酸性カチオン交換樹脂に
よるカラム分画を適用した。すなわち、架橋度４％の東
京有機化学工業製ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂
『ＸＴ−１０１６』を水中に懸濁させ、内径５．４ｃ
ｍ、長さ５ｍのジャケット付ステンレス製円筒管４本に
均一に充填後、円筒管を直列に連結してカラムの全長を
２０ｍとした。カラム温度を５５℃に保ちつつ、水で適
宜希釈したシロップ状物をカラムに対して約５％（ｖ／
ｖ）負荷し、カラムに５５℃の温水をＳＶ０．１３で通
液した。そして、溶出液から非還元性糖質の含量が高い
画分を採取し、常法により精製し、濃縮し、真空乾燥
し、粉砕して、非還元性糖質含量の高い粉状物を原料固
形分当たり約６４％の収率で得た。

【００９０】ＤＥが４．８と低く、非還元性糖質として
α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロ
ース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルト
テトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシル
トレハロースを固形分当たり１２．８％、１１．５％、
４６．６％、２．３％又は３．４％含む本品は、実施例
Ｂ−１のシロップ状物と同様、温和で上品な甘味を有し
ており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦
形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組
成物一般に有利に配合使用できる。

【００９１】

【実施例Ｂ−３非還元性糖質を含むシロップ状物への
変換】濃度３３％（ｗ／ｗ）のとうもろこし澱粉乳に最
終濃度０．１％（ｗ／ｗ）となるように炭酸カルシウム
を加え、ｐＨ６．５に調整後、ターマミール６０Ｌを澱
粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）加え、９５℃で１５
分間反応させた。反応物を１２０℃で１０分間オートク
レーブして酵素を失活させ、５５℃に冷却後、林原生物
化学研究所製シュードモナス・スツッチェリ由来のマル
トテオラオース生成アミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当た
り５単位加えて６時間反応させた。反応物に上田化学製
α−アミラーゼ剤『α−アミラーゼ２Ａ』を澱粉固形分
１ｇ当たり３０単位加え、６５℃でさらに４時間反応さ
せた後、１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を
失活させ、６５℃まで冷却し、ｐＨ５．５に調整し、実
施例Ａ−１の方法で得た組換え型耐熱性酵素を澱粉固形
分１ｇ当たり２単位加え、４８時間反応させた。反応物
を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、
濾過後、常法により活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で
脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロ
ップ状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得
た。

【００９２】ＤＥが１７．１と低く、非還元性糖質とし
てα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハ
ロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マル
トテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシ
ルトレハロースを固形分当たりそれぞれ８．９％、２
９．３％、０．８％、０．７％又は０．７％含む本品
は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有
しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、
賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする
組成物一般に有利に配合使用できる。

【００９３】

【実施例Ｂ−４非還元性糖質を含む粉状物への変換】
林原生物化学研究所製高純度マルトペンタオースの２０
％（ｗ／ｗ）水溶液に実施例Ａ−１の方法で得た組換え
型耐熱性酵素をマルトペンタオース１ｇ当たり１．０単
位加え、７０℃で４８時間反応させた。マルトペンタオ
ースの約７２％がα−マルトトリオシルトレハロースに
変換された反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失
活させ、冷却し、瀘過後、常法により活性炭で脱色し、
イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮した。

【００９４】その後、濃縮物に実施例Ｂ−２のカラム分
画を適用し、α−マルトトリオシルトレハロース含量の
高い画分を採取し、常法により精製し、濃縮し、噴霧乾
燥して非還元性糖質含量の高い粉状物を原料固形分当た
り約２６％の収率で得た。

【００９５】ＤＥが０．２未満と極めて低く、非還元性
糖質としてα−マルトトリオシルトレハロースを固形分
当たり９９．０％含む低甘味の本品は、呈味改良剤、品
質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、
医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用でき
る。

【００９６】

【実施例Ｂ−５結晶性トレハロースを含む粉状物への
変換】松谷化学工業製還元性澱粉糖『パインデックス＃
４』４０重量部を水６０重量部に加熱溶解し、溶液を６
５℃、ｐＨ５．５に調整後、実施例Ａ−１の方法で得た
組換え型耐熱性酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり１単位加
え、９６時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加
熱して酵素を失活させ、濃度約２０％（ｗ／ｗ）まで希
釈後、ナガセ生化学工業グルコアミラーゼ剤『グルコチ
ーム』を澱粉糖固形分１ｇ当たり１０単位加えて４０時
間反応させた。その後、反応物を加熱して酵素を失活さ
せ、冷却し、濾過後、常法により活性炭で脱色し、イオ
ン交換樹脂により脱塩・精製し、濃度約６０％（ｗ／
ｗ）まで濃縮した。このようにして得られた固形分当た
りトレハロースを３０．１％（ｗ／ｗ）含む濃縮物を分
画用イオン交換樹脂としてオルガノ製ナトリウム型強酸
性カチオン交換樹脂『ＣＧ６０００』を使用した以外は
実施例Ｂ−２と同様にしてカラム分画することにより、
固形分当たりトレハロースを約９７％（ｗ／ｗ）含む画
分を採取した。

【００９７】この画分を約７５％（ｗ／ｗ）まで濃縮
し、助晶缶にとり、撹拌しながら徐冷して得た晶出率約
４５％のマスキットを、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔上
部から下方に向かって送風しつつ、噴霧乾燥塔の上部に
設けたノズルより約１５０ｋｇ／ｃｍ²加圧下で噴霧乾
燥塔の下方に向かって噴霧する一方、噴霧乾燥塔底部に
設けた金網コンベア上に捕集した結晶性粉末を、コンベ
ア下部より約４５℃の温風を送風しつつ、噴霧乾燥塔外
に徐々に搬出した。その後、結晶性粉末を熟成塔に充填
し、温風気流中で１０時間熟成し、結晶化と乾燥を完了
した。このようにして、トレハロース含水結晶の粉状物
を原料固形分当たり約９０％の収率で得た。

【００９８】実質的に吸湿性を示さず、取扱いも容易な
本品は、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦
形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組
成物一般に有利に配合使用できる。

【００９９】

【実施例Ｂ−６非還元性糖質を含むシロップ状物への
変換】林原生物化学研究所製高純度マルトテトラオース
を４０％（ｗ／ｗ）水溶液とし、実施例Ａ−２の方法に
より得た組換え型耐熱性酵素をマルトテトラオース固形
分１ｇ当たり２．０単位加え、６０℃で７２時間反応さ
せて固形分当たりα−マルトシルトレハロース及びα−
グルコシルトレハロースをそれぞれ約５７％及び約９％
含む反応物を得た。この反応物を９７℃で３０分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、常法にしたがって濾過
し、活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・
精製した後、濃縮した。

【０１００】その後、濃縮物に実施例Ｂ−２のカラム分
画を適用し、得られたα−マルトシルトレハロース含量
の高い画分を採取し、常法にしたがって精製し、濃縮し
て濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を原料マルト
テトラオース固形分当たり約９０％の収率で得た。

【０１０１】ＤＥが３．７と低く、非還元性糖質として
α−マルトシルトレハロース及びα−グルコシルトレハ
ロースを固形分当たりそれぞれ８４％及び４．０％含む
本品は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性
を有しており、甘味材、呈味改善剤、品質改善剤、安定
剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めと
する組成物一般に有利に配合使用できる。

【０１０２】

【発明の効果】以上説明したように、この発明は、グル
コース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質を生成する新規な耐熱性
酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤ
ＮＡ技術により、この耐熱性酵素を大規模且つ効率的に
生産する道を拓くものである。この発明の組換え型耐熱
性酵素を使用する変換方法によるときには、雑菌汚染を
懸念することなく、グルコース重合度３以上の還元性澱
粉糖を末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質に
効率的に変換することができる。この発明の酵素的変換
方法により得られる非還元性糖質は温和で上品な甘味を
有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しない
ので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を
始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益があ
る。しかも、この発明の組換え型耐熱性酵素はアミノ酸
配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品へ
の配合使用を前提とするトレハロースや末端にトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質の製造に安心して使用し
得るものである。

【０１０３】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な
発明であると言える。

【０１０４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：720 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Asn Phe Asn Phe Gly 1 5 10 15 Asp Val Ile Asp Asn Leu Trp Tyr Phe Lys Asp Leu Gly Val Ser His Leu 20 25 30 Tyr Leu Ser Pro Val Leu Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn His Gly Tyr Asp 35 40 45 50 Val Ile Asp His Ser Arg Ile Asn Asp Glu Leu Gly Gly Glu Lys Glu Tyr 55 60 65 Arg Arg Leu Ile Glu Thr Ala His Thr Ile Gly Leu Gly Ile Ile Gln Asp 70 75 80 85 Ile Val Pro Asn His Met Ala Val Asn Ser Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp 90 95 100 Val Leu Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys Tyr Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe 105 110 115 Pro Glu Asp Asp Lys Ile Arg Leu Pro Ile Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr 120 125 130 135 Val Ile Ser Lys Gly Leu Leu Lys Ile Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr Phe 140 145 150 Leu Glu Tyr Phe Lys Trp Lys Leu Pro Leu Thr Glu Val Gly Asn Asp Ile 155 160 165 170 Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Gln Asn Tyr Thr Leu Met Ser Trp Lys Asn Pro 175 180 185 Pro Ser Tyr Arg Arg Phe Phe Asp Val Asn Thr Leu Ile Gly Val Asn Val 190 195 200 Glu Lys Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser Lys Ile Leu Asp Leu Asp 205 210 215 220 Val Asp Gly Tyr Arg Ile Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Lys 225 230 235 Tyr Ile Asn Asp Leu Arg Ser Ile Ile Lys Asn Lys Ile Ile Ile Val Glu 240 245 250 255 Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys Leu Asn Ser Asp Gly Thr Thr 260 265 270 Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Ser Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn Gln Glu 275 280 285 Ile Met Asp Ser Ile Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Glu Lys Ile Ser Ile Ser 290 295 300 305 Glu Ser Ile Lys Lys Ile Lys Ala Gln Ile Ile Asp Glu Leu Phe Ser Tyr 310 315 320 Glu Val Lys Arg Leu Ala Ser Gln Leu Gly Ile Ser Tyr Asp Ile Leu Arg 325 330 335 340 Asp Tyr Leu Ser Cys Ile Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val 345 350 355 Lys Glu Cys Asp Lys Thr Asn Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Arg Asn Pro 360 365 370 Glu Ala Tyr Thr Lys Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala 375 380 385 390 Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Ile Asn Glu 395 400 405 Val Gly Ser Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val 410 415 420 425 Phe Asn Gln Lys Arg Arg Gly Lys Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr His 430 435 440 Asp Thr Lys Phe Ser Glu Asp Val Arg Met Lys Ile Ser Val Leu Ser Glu 445 450 455 Phe Pro Glu Glu Trp Lys Asn Lys Val Glu Glu Trp His Ser Ile Ile Asn 460 465 470 475 Pro Lys Val Ser Arg Asn Asp Glu Tyr Arg Tyr Tyr Gln Val Leu Val Gly 480 485 490 Ser Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Asp Phe Lys Glu Arg Ile Lys Gln His 495 500 505 510 Met Ile Lys Ser Val Arg Glu Ala Lys Ile Asn Thr Ser Trp Arg Asn Gln 515 520 525 Asn Lys Glu Tyr Glu Asn Arg Val Met Glu Leu Val Glu Glu Thr Phe Thr 530 535 540 Asn Lys Asp Phe Ile Lys Ser Phe Met Lys Phe Glu Ser Lys Ile Arg Arg 545 550 555 560 Ile Gly Met Ile Lys Ser Leu Ser Leu Val Ala Leu Lys Ile Met Ser Ala 565 570 575 Gly Ile Pro Asp Phe Tyr Gln Gly Thr Glu Ile Trp Arg Tyr Leu Leu Thr 580 585 590 595 Asp Pro Asp Asn Arg Val Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu His Glu Ile Leu 600 605 610 Glu Lys Ser Lys Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu Glu Ser Met Asp Asp Gly 615 620 625 Arg Ile Lys Met Tyr Leu Thr Tyr Lys Leu Leu Ser Leu Arg Lys Gln Leu 630 635 640 645 Ala Glu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly 650 655 660 Leu Cys Gly Phe Ile Arg Phe Asn Lys Ile Leu Val Ile Ile Lys Thr Lys 665 670 675 680 Gly Ser Val Asn Tyr Lys Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr Thr Asp 685 690 695 Val Leu Thr Gly Glu Glu Ile Lys Lys Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro 700 705 710 Arg Ile Leu Val Arg Met 715 720

【０１０５】配列番号：2 配列の長さ：2160 配列の型：核酸配列 GTGATATCAG CAACCTACAG ATTACAGTTA AATAAGAATT TTAATTTTGG TGACGTAATC 60 GATAACCTAT GGTATTTTAA GGATTTAGGA GTTTCCCATC TCTACCTCTC TCCTGTCTTA 120 ATGGCTTCGC CAGGAAGTAA CCATGGGTAC GATGTAATAG ATCATTCAAG GATAAACGAT 180 GAACTTGGAG GAGAGAAAGA ATACAGGAGA TTAATAGAGA CAGCTCATAC TATTGGATTA 240 GGTATTATAC AGGACATAGT ACCAAATCAC ATGGCTGTAA ATTCTCTAAA TTGGCGACTA 300 ATGGATGTAT TAAAAATGGG TAAAAAGAGT AAATATTATA CGTACTTTGA CTTTTTCCCA 360 GAAGATGATA AGATACGATT ACCCATATTA GGAGAAGATT TAGATACAGT GATAAGTAAA 420 GGTTTATTAA AGATAGTAAA AGATGGAGAT GAATATTTCC TAGAATATTT CAAATGGAAA 480 CTTCCTCTAA CAGAGGTTGG AAATGATATA TACGACACTT TACAAAAACA GAATTATACC 540 CTAATGTCTT GGAAAAATCC TCCTAGCTAT AGACGATTCT TCGATGTTAA TACTTTAATA 600 GGAGTAAATG TCGAAAAAGA TCACGTATTT CAAGAGTCCC ATTCAAAGAT CTTAGATTTA 660 GATGTTGATG GCTATAGAAT TGATCATATT GATGGATTAT ATGATCCTGA GAAATATATT 720 AATGACCTGA GGTCAATAAT TAAAAATAAA ATAATTATTG TAGAAAAAAT TCTGGGATTT 780 CAGGAGGAAT TAAAATTAAA TTCAGATGGA ACTACAGGAT ATGACTTCTT AAATTACTCC 840 AACTTACTGT TTAATTTTAA TCAAGAGATA ATGGACAGTA TATATGAGAA TTTCACAGCG 900 GAGAAAATAT CTATAAGTGA AAGTATAAAG AAAATAAAAG CGCAAATAAT TGATGAGCTA 960 TTTAGTTATG AAGTTAAAAG ATTAGCATCA CAACTAGGAA TTAGCTACGA TATATTGAGA 1020 GATTACCTTT CTTGTATAGA TGTGTACAGA ACTTATGCTA ATCAGATTGT AAAAGAGTGT 1080 GATAAGACCA ATGAGATAGA GGAAGCAACC AAAAGAAATC CAGAGGCTTA TACTAAATTA 1140 CAACAATATA TGCCAGCAGT ATACGCTAAA GCTTATGAAG ATACTTTCCT CTTTAGATAC 1200 AATAGATTAA TATCCATAAA TGAGGTTGGA AGCGATTTAC GATATTATAA GATATCGCCT 1260 GATCAGTTTC ATGTATTTAA TCAAAAACGA AGAGGAAAAA TCACACTAAA TGCCACTAGC 1320 ACACATGATA CTAAGTTTAG TGAAGATGTA AGGATGAAAA TAAGTGTATT AAGTGAATTT 1380 CCTGAAGAAT GGAAAAATAA GGTCGAGGAA TGGCATAGTA TCATAAATCC AAAGGTATCA 1440 AGAAATGATG AATATAGATA TTATCAGGTT TTAGTGGGAA GTTTTTATGA GGGATTCTCT 1500 AATGATTTTA AGGAGAGAAT AAAGCAACAT ATGATAAAAA GTGTCAGAGA AGCTAAGATA 1560 AATACCTCAT GGAGAAATCA AAATAAAGAA TATGAAAATA GAGTAATGGA ATTAGTGGAA 1620 GAAACTTTTA CCAATAAGGA TTTCATTAAA AGTTTCATGA AATTTGAAAG TAAGATAAGA 1680 AGGATAGGGA TGATTAAGAG CTTATCCTTG GTCGCATTAA AAATTATGTC AGCCGGTATA 1740 CCTGATTTTT ATCAGGGAAC AGAAATATGG CGATATTTAC TTACAGATCC AGATAACAGA 1800 GTCCCAGTGG ATTTTAAGAA ATTACACGAA ATATTAGAAA AATCCAAAAA ATTTGAAAAA 1860 AATATGTTAG AGTCTATGGA CGATGGAAGA ATTAAGATGT ATTTAACATA TAAGCTTTTA 1920 TCCCTAAGAA AACAGTTGGC TGAGGATTTT TTAAAGGGCG AGTATAAGGG ATTAGATCTA 1980 GAAGAAGGAC TATGTGGGTT TATTAGGTTT AACAAAATTT TGGTAATAAT AAAAACCAAG 2040 GGAAGTGTTA ATTACAAACT GAAACTTGAA GAGGGAGCAA TTTACACAGA TGTATTGACA 2100 GGAGAAGAAA TTAAAAAAGA GGTACAGATT AATGAGCTAC CTAGGATACT AGTTAGAATG 2160

【０１０６】配列番号：3 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント配列 Met Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Asn Phe Asn Phe 1 5 10 15 Gly Asp Val Ile Asp Asn Leu Trp Tyr Phe Lys Asp Leu Gly 20 25 30

【０１０７】配列番号：4 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの種類：中間部フラグメント配列 Val Glu Glu Trp His Ser Ile Ile Asn Pro Lys 1 5 10

【０１０８】配列番号：5 配列の長さ：2160 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴起源生物名：スルフォルブス・アシドカルダリウス株名：ATCC33909 配列 GTG ATA TCA GCA ACC TAC AGA TTA CAG TTA AAT AAG AAT TTT AAT TTT 48 Met Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Asn Phe Asn Phe 1 5 10 15 GGT GAC GTA ATC GAT AAC CTA TGG TAT TTT AAG GAT TTA GGA GTT TCC 96 Gly Asp Val Ile Asp Asn Leu Trp Tyr Phe Lys Asp Leu Gly Val Ser 20 25 30 CAT CTC TAC CTC TCT CCT GTC TTA ATG GCT TCG CCA GGA AGT AAC CAT 144 His Leu Tyr Leu Ser Pro Val Leu Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn His 35 40 45 GGG TAC GAT GTA ATA GAT CAT TCA AGG ATA AAC GAT GAA CTT GGA GGA 192 Gly Tyr Asp Val Ile Asp His Ser Arg Ile Asn Asp Glu Leu Gly Gly 50 55 60 GAG AAA GAA TAC AGG AGA TTA ATA GAG ACA GCT CAT ACT ATT GGA TTA 240 Glu Lys Glu Tyr Arg Arg Leu Ile Glu Thr Ala His Thr Ile Gly Leu 65 70 75 80 GGT ATT ATA CAG GAC ATA GTA CCA AAT CAC ATG GCT GTA AAT TCT CTA 288 Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Val Asn Ser Leu 85 90 95 AAT TGG CGA CTA ATG GAT GTA TTA AAA ATG GGT AAA AAG AGT AAA TAT 336 Asn Trp Arg Leu Met Asp Val Leu Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys Tyr 100 105 110 TAT ACG TAC TTT GAC TTT TTC CCA GAA GAT GAT AAG ATA CGA TTA CCC 384 Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Pro Glu Asp Asp Lys Ile Arg Leu Pro 115 120 125 ATA TTA GGA GAA GAT TTA GAT ACA GTG ATA AGT AAA GGT TTA TTA AAG 432 Ile Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr Val Ile Ser Lys Gly Leu Leu Lys 130 135 140 ATA GTA AAA GAT GGA GAT GAA TAT TTC CTA GAA TAT TTC AAA TGG AAA 480 Ile Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Tyr Phe Lys Trp Lys 145 150 155 160 CTT CCT CTA ACA GAG GTT GGA AAT GAT ATA TAC GAC ACT TTA CAA AAA 528 Leu Pro Leu Thr Glu Val Gly Asn Asp Ile Tyr Asp Thr Leu Gln Lys 165 170 175 CAG AAT TAT ACC CTA ATG TCT TGG AAA AAT CCT CCT AGC TAT AGA CGA 576 Gln Asn Tyr Thr Leu Met Ser Trp Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Arg 180 185 190 TTC TTC GAT GTT AAT ACT TTA ATA GGA GTA AAT GTC GAA AAA GAT CAC 624 Phe Phe Asp Val Asn Thr Leu Ile Gly Val Asn Val Glu Lys Asp His 195 200 205 GTA TTT CAA GAG TCC CAT TCA AAG ATC TTA GAT TTA GAT GTT GAT GGC 672 Val Phe Gln Glu Ser His Ser Lys Ile Leu Asp Leu Asp Val Asp Gly 210 215 220 TAT AGA ATT GAT CAT ATT GAT GGA TTA TAT GAT CCT GAG AAA TAT ATT 720 Tyr Arg Ile Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Lys Tyr Ile 225 230 235 240 AAT GAC CTG AGG TCA ATA ATT AAA AAT AAA ATA ATT ATT GTA GAA AAA 768 Asn Asp Leu Arg Ser Ile Ile Lys Asn Lys Ile Ile Ile Val Glu Lys 245 250 255 ATT CTG GGA TTT CAG GAG GAA TTA AAA TTA AAT TCA GAT GGA ACT ACA 816 Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys Leu Asn Ser Asp Gly Thr Thr 260 265 270 GGA TAT GAC TTC TTA AAT TAC TCC AAC TTA CTG TTT AAT TTT AAT CAA 864 Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Ser Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn Gln 275 280 285 GAG ATA ATG GAC AGT ATA TAT GAG AAT TTC ACA GCG GAG AAA ATA TCT 912 Glu Ile Met Asp Ser Ile Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Glu Lys Ile Ser 290 295 300 ATA AGT GAA AGT ATA AAG AAA ATA AAA GCG CAA ATA ATT GAT GAG CTA 960 Ile Ser Glu Ser Ile Lys Lys Ile Lys Ala Gln Ile Ile Asp Glu Leu 305 310 315 320 TTT AGT TAT GAA GTT AAA AGA TTA GCA TCA CAA CTA GGA ATT AGC TAC 1008 Phe Ser Tyr Glu Val Lys Arg Leu Ala Ser Gln Leu Gly Ile Ser Tyr 325 330 335 GAT ATA TTG AGA GAT TAC CTT TCT TGT ATA GAT GTG TAC AGA ACT TAT 1056 Asp Ile Leu Arg Asp Tyr Leu Ser Cys Ile Asp Val Tyr Arg Thr Tyr 340 345 350 GCT AAT CAG ATT GTA AAA GAG TGT GAT AAG ACC AAT GAG ATA GAG GAA 1104 Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys Asp Lys Thr Asn Glu Ile Glu Glu 355 360 365 GCA ACC AAA AGA AAT CCA GAG GCT TAT ACT AAA TTA CAA CAA TAT ATG 1152 Ala Thr Lys Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys Leu Gln Gln Tyr Met 370 375 380 CCA GCA GTA TAC GCT AAA GCT TAT GAA GAT ACT TTC CTC TTT AGA TAC 1200 Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg Tyr 385 390 395 400 AAT AGA TTA ATA TCC ATA AAT GAG GTT GGA AGC GAT TTA CGA TAT TAT 1248 Asn Arg Leu Ile Ser Ile Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Tyr Tyr 405 410 415 AAG ATA TCG CCT GAT CAG TTT CAT GTA TTT AAT CAA AAA CGA AGA GGA 1296 Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln Lys Arg Arg Gly 420 425 430 AAA ATC ACA CTA AAT GCC ACT AGC ACA CAT GAT ACT AAG TTT AGT GAA 1344 Lys Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser Glu 435 440 445 GAT GTA AGG ATG AAA ATA AGT GTA TTA AGT GAA TTT CCT GAA GAA TGG 1392 Asp Val Arg Met Lys Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu Trp 450 455 460 AAA AAT AAG GTC GAG GAA TGG CAT AGT ATC ATA AAT CCA AAG GTA TCA 1440 Lys Asn Lys Val Glu Glu Trp His Ser Ile Ile Asn Pro Lys Val Ser 465 470 475 480 AGA AAT GAT GAA TAT AGA TAT TAT CAG GTT TTA GTG GGA AGT TTT TAT 1488 Arg Asn Asp Glu Tyr Arg Tyr Tyr Gln Val Leu Val Gly Ser Phe Tyr 485 490 495 GAG GGA TTC TCT AAT GAT TTT AAG GAG AGA ATA AAG CAA CAT ATG ATA 1536 Glu Gly Phe Ser Asn Asp Phe Lys Glu Arg Ile Lys Gln His Met Ile 500 505 510 AAA AGT GTC AGA GAA GCT AAG ATA AAT ACC TCA TGG AGA AAT CAA AAT 1584 Lys Ser Val Arg Glu Ala Lys Ile Asn Thr Ser Trp Arg Asn Gln Asn 515 520 525 AAA GAA TAT GAA AAT AGA GTA ATG GAA TTA GTG GAA GAA ACT TTT ACC 1632 Lys Glu Tyr Glu Asn Arg Val Met Glu Leu Val Glu Glu Thr Phe Thr 530 535 540 AAT AAG GAT TTC ATT AAA AGT TTC ATG AAA TTT GAA AGT AAG ATA AGA 1680 Asn Lys Asp Phe Ile Lys Ser Phe Met Lys Phe Glu Ser Lys Ile Arg 545 550 555 560 AGG ATA GGG ATG ATT AAG AGC TTA TCC TTG GTC GCA TTA AAA ATT ATG 1728 Arg Ile Gly Met Ile Lys Ser Leu Ser Leu Val Ala Leu Lys Ile Met 565 570 575 TCA GCC GGT ATA CCT GAT TTT TAT CAG GGA ACA GAA ATA TGG CGA TAT 1776 Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe Tyr Gln Gly Thr Glu Ile Trp Arg Tyr 580 585 590 TTA CTT ACA GAT CCA GAT AAC AGA GTC CCA GTG GAT TTT AAG AAA TTA 1824 Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Val Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu 595 600 605 CAC GAA ATA TTA GAA AAA TCC AAA AAA TTT GAA AAA AAT ATG TTA GAG 1872 His Glu Ile Leu Glu Lys Ser Lys Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu Glu 610 615 620 TCT ATG GAC GAT GGA AGA ATT AAG ATG TAT TTA ACA TAT AAG CTT TTA 1920 Ser Met Asp Asp Gly Arg Ile Lys Met Tyr Leu Thr Tyr Lys Leu Leu 625 630 635 640 TCC CTA AGA AAA CAG TTG GCT GAG GAT TTT TTA AAG GGC GAG TAT AAG 1968 Ser Leu Arg Lys Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr Lys 645 650 655 GGA TTA GAT CTA GAA GAA GGA CTA TGT GGG TTT ATT AGG TTT AAC AAA 2016 Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu Cys Gly Phe Ile Arg Phe Asn Lys 660 665 670 ATT TTG GTA ATA ATA AAA ACC AAG GGA AGT GTT AAT TAC AAA CTG AAA 2064 Ile Leu Val Ile Ile Lys Thr Lys Gly Ser Val Asn Tyr Lys Leu Lys 675 680 685 CTT GAA GAG GGA GCA ATT TAC ACA GAT GTA TTG ACA GGA GAA GAA ATT 2112 Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr Thr Asp Val Leu Thr Gly Glu Glu Ile 690 695 700 AAA AAA GAG GTA CAG ATT AAT GAG CTA CCT AGG ATA CTA GTT AGA ATG 2160 Lys Lys Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Arg Met 705 710 715 720

【図面の簡単な説明】

【図１】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣ
Ｃ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の至適温度を示す
図である。

【図２】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣ
Ｃ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の至適ｐＨを示す
図である。

【図３】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣ
Ｃ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の熱安定性を示す
図である。

【図４】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣ
Ｃ３３９０９）が産生する耐熱性酵素のｐＨ安定性を示
す図である。

【図５】この発明による組換えＤＮＡであるｐＳＴ３５
の制限酵素地図である。

【図６】この発明による組換えＤＮＡであるｐＳＴ３６
の制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する組換え型耐
熱性酵素。（１）作用グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレ
ハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。（２）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
すると、分子量約６９，０００乃至７９，０００ダルト
ンを示す。（３）等電点等電点電気泳動法により測定すると、約５．４乃至６．
４に等電点を示す。（４）熱安定性水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベ
ートしても実質的に失活しない。
【請求項２】配列表における配列番号１に示すＮ末端
からのアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列を
有する請求項１に記載の組換え型耐熱性酵素。
【請求項３】請求項１乃至２に記載の組換え型耐熱性
酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列表における配列番号２に示す５´末
端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又は
それらに相補的な塩基配列を有する請求項３に記載のＤ
ＮＡ。
【請求項５】遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
おける配列番号１に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号２に示す塩基配列における
塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項３
又は４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】スルフォロブス属の微生物に由来する請
求項３、４又は５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項１乃至２に記載の組換え型耐熱性
酵素をコードするＤＮＡと、自律複製可能なベクターを
含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項８】ＤＮＡが配列表における配列番号２に示
す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基
配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項７に
記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
た請求項７又は８に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１０】ＤＮＡがスルフォロブス属の微生物に
由来する請求項７、８又は９に記載の複製可能な組換え
ＤＮＡ。
【請求項１１】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）又は
ｐＫＫ２２３−３である請求項７、８、９又は１０に記
載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１２】請求項１乃至２に記載の組換え型耐熱
性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを
含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入し
てなる形質転換体。
【請求項１３】ＤＮＡが配列表における配列番号２示
す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基
配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１２
に記載の形質転換体。
【請求項１４】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
た請求項１２又は１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】ＤＮＡがスルフォロブス属の微生物に
由来する請求項１２、１３又は１４に記載の形質転換
体。
【請求項１６】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）又は
ｐＫＫ２２３−３である請求項１２、１３、１４又は１
５に記載の形質転換体。
【請求項１７】宿主が大腸菌である請求項１２、１
３、１４、１５又は１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】請求項１乃至２に記載の組換え型耐熱
性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを
含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入し
てなる形質転換体を培養し、培養物から組換え型耐熱性
酵素を採取してなる組換え型耐熱性酵素の製造方法。
【請求項１９】ＤＮＡが配列表における配列番号２に
示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩
基配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１
８に記載の組換え型耐熱性酵素の製造方法。
【請求項２０】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
たものである請求項１８又は１９に記載の組換え型耐熱
性酵素の製造方法。
【請求項２１】ＤＮＡがスルフォロブス属の微生物に
由来する請求項１８、１９又は２０に記載の組換え型耐
熱性酵素の製造方法。
【請求項２２】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）又は
ｐＫＫ２２３−３である請求項１８、１９、２０又は２
１に記載の組換え型耐熱性酵素の製造方法。
【請求項２３】宿主が大腸菌である請求項１８、１
９、２０、２１又は２２に記載の組換え型耐熱性酵素の
製造方法。
【請求項２４】培養物中の組換え型耐熱性酵素を遠心
分離、瀘過、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎
水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採
取する請求項１８、１９、２０、２１、２２又は２３に
記載の組換え型耐熱性酵素の製造方法。
【請求項２５】グルコース重合度３以上の還元性澱粉
糖に請求項１乃至２に記載の組換え型耐熱性酵素を作用
させて末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を
生成させる工程を含んでなる還元性澱粉糖の酵素的変換
方法。
【請求項２６】還元性澱粉糖が澱粉又は澱粉質を酸及
び／又はアミラーゼにより加水分解して得られたもので
ある請求項２５に記載の還元性澱粉糖の酵素的変換方
法。
【請求項２７】還元性澱粉糖がマルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサ
オース及び／又はマルトヘプタオースである請求項２５
又は２６に記載の還元性澱粉糖の酵素的変換方法。
【請求項２８】還元性澱粉糖濃度が５０％（ｗ／ｗ）
以下の水溶液に組換え型耐熱性酵素を共存せしめ、５５
℃を越える温度で作用させる請求項２５、２６又は２７
に記載の還元性澱粉糖の酵素的変換方法。
【請求項２９】非還元性糖質がα−グルコシルトレハ
ロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリ
オシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロ
ース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請
求項２５、２６、２７又は２８に記載の還元性澱粉糖の
酵素的変換方法。