KR100374448B1

KR100374448B1 - 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도

Info

Publication number: KR100374448B1
Application number: KR1019950003560A
Authority: KR
Inventors: 구보다미찌오; 쓰사끼게이지; 마루다가즈히꼬; 스기모도도시유끼
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 2003-09-13
Also published as: TW428027B; EP0674005A2; US5871993A; US5871994A; DE69510116T2; EP0674005B1; DK0674005T3; EP0674005A3; KR950032623A; DE69510116D1; US5871977A; ATE181107T1

Abstract

글루코오스 중합도가 3 이상인 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA에 의해 이 효소의 활성을 가진 재조합 효소를 대규모로 제조할 수 있다. 재조합 효소에 의해 제조 가능한 비환원성 당류는 실질적으로 비환원성, 온화한 고품위의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 식품, 화장품, 의약품 및 시료 등에 사용할 수 있다.

Description

효소를 인코우드하는 DNA, 재조합 DNA와 효소, 형질 전환체 및 이들의 제조 방법과 용도

본 발명은 글루코오스 중합도 3 이상인 환원성 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 효소를 인코우드하는 신규의 DNA와 재조합 DNA와 DNA 함유 효소 및 형질 전환체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들이 제조 방법과 용도에 관한 것이다.

트레할로오스는 글루코오스 2 분자가 이들의 환원성 그룹으로 연결된 이당류인데 진균류, 조류(燥類), 곤충류 등에 극히 소량으로 존재하고 있다. 트레할로오스는 분자내에 환원성 잔기가 전혀 없으므로 아미노산 등의 존재하에 가열하더라도 불필요한 갈변 반응을 일으키지 않기 때문에 불필요한 착색이나 열화(劣化)를 일으킬 우려가 없이 식품의 감미 부여가 가능하다. 그러나 트레할로오스는 종래의 제조 방법으로서는 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 없으며 실제로 식품의 감미 부여에 사용되는 일이 드물다.

종래의 제조 방법은 대개 두가지로 나누어 지는데, 즉 그 한가지는 미생물의 세포를 사용하는 방법이고 다른 한가지는 당류에 효소를 작용시키는 다중 효소계를 이용하는 방법이다. 전자의 방법은 일본국 특허 공개 제154,485/75호에 개시되어 있는 바와 같이 박테리아, 효모 등의 미생물을 영양 배지중에서 생장시켜 수득한 배양액중의 증식된 세포로부터 트레할로오스를 채취하는 방법이다. 후자의 방법은 일본국 특허 공개 제216,695/83호에 개시되어 있는 바와 같이 기질인 말토오스를 준비하고, 막토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 다중 효소계를 말토오스에 작용시켜 생성된 트레할로오스를 반응계로부터 회수하는 방법이다. 전자의 방법에서는 비교적 용이하게 미생물을 생장시킬 수 있겠으나 건조 고형분 기준(d,s,b,)으로 트레할로오스를 불과 15 w/w % 함유한 미생물로부터 트레할로오스를 채취하기까지 순차적으로 복잡한 여러 단계를 거치게 된다. 한편, 후자의 방법에서는 트레할로오스를 비교적 용이하게 분리할 수는 있지만 효소 반응 그 자체가 두가지의 상이한 효소의 평형 반응이고 평형점이 항시 글루코오스 포스페이트 생성쪽으로 기울어지기 때문에 효소를 기질에 대해 상당히 높은 농도로 작용시켜 트레할로오스 수율을 증가시킨다는 것은 이론적으로 어렵다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 전분질 당류로부터 트레할로오스 구조를 가진 당류를 생성하는 효소에 대해 예의 검색한 결과, 리조븀(Rhizobium) sp M-11과 아르드로박터(Arthrobacter) sp, Q36 등의 종(鍾)에 속하는 미생물이 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성의 당류를 생성하는 신규의 효소를 생산한다는 것을 발견하였다. 이 발견을 전후하여 밝혀진 바로서는 이러한 비환원성 당은 위에 나온 것과 동일한 미생물에 의해 생성된 또 다른 효소에 이해 거의 정량적으로 가수 분해되어 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당을 생성한다는 것이다. 이들 효소를 병용하면 비교적 용이하게 필요한 양의 트래할로오스를 생성시킬 수 있으므로 트레할로오스와 관련된 위에 나온 목적을 완전히 해결할 수 있다. 이러한 미생물에 의해 신규의 효소가 불충분하게 생산된다는 결점이 있으므로 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당 및/또는 트레할로오스를 공영적 규모로 생산하기 위해서는 비교적 대규모의 배양을 해야만 한다.

재조합 DNA 기법은 근년에 와서 현저한 발전을 하고 있다. 현재 효소를 인코우드하는 유전자를 일단 분리하여 그 염기 배열이 디코우드되어 있다면 이 효소를 인코우드하는 DNA를 가진 재조합 DNA를 제조하여 이것을 미생물 또는 식물과 동물의 세포속에 도입한 다음 생성된 형질 전환체를 배양함으로써 총아미노산 배열이 밟혀지지 아니한 효소까지도 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 있다. 이러한 배경하에 시급히 요망되고 있는 것은 효소를 인코우드하는 유전자를 발견하여 그 염기 배열을 밝혀내는 것이다.

본 발명의 목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 함유한 재조합 DNA를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 재조합 DNA 기법에 의해 생성시키는 재조합 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 수득되는 형질 전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 재조합 효소의 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 효소를 사용하는 환원성 전분질 당류의 전환 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제1목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA에 의해 달성된다.

본 발명의 제2목적은 비환원성의 당을 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 함유하는 자체 복제 가능한 재조합 DNA에 의해 달성된다.

본 발명의 제3목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 재조합 효소에 의해 달성된다.

본 발명의 제4목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성의 당류를 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA가 도입되어 수득되는 형질 전환체에 의해 달성된다.

본 발명의 제5목적은 재조합 효소를 생성할 수 있는 형질 전환체를 배양하고 수득한 배양액으로부터 효소를 채취하는 단계를 포함하는 재조합 효소의 제조 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 제6목적은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류에 재조합 효소를 작용시켜 이들로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성시키는 단계를 포함하는 환원성의 전분질 당류의 전환 방법에 의해 달성된다.

본 발명에 의한 DNA는 DNA를 적당한 자체 복제가 가능한 벡터애 삽입하여 복제가 가능한 재조합 DNA를 생성시킨 다음 재조합 DNA를, 효소를 생성할 수는 없지만 용이하게 복제가 가능한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 생성시키도록 하는 방식으로 DNA에 의해 인코우드된 비환원성 당생성 효소를 생산한다.

재조합 DNA 자체는 효소를 생산하지 아니하더라도 DNA에 의해 인코우드된 효소의 생산은, 효소를 생성할 수 없으나 용이하게 복제가 가능한 숙주속에 재조합 DNA를 도입하고, 형질 전환체를 배양하여 효소를 생산함으로써 유도된다.

본 발명에 의한 형질 전환체는 배양시 효소를 생산한다.

본 발명에 의한 재조합 효소는 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분질 당류에 작용하여 말단 단위가 트레할로오스 구조인 비환원성 당류를 생성한다.

본 발명에 의해 형질 전환체를 배양하여 필요한 양의 효소를 비교적 용이하게 수득한다.

본 발명에 의한 전환 방법에 따라 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류를 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류로 전환시킨다.

본 발명은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위가 트레할로오스 구조인 비환원성의 당류를 생성하는 신규의 효소를 발견한데 근거하여 된 것이다. 이 효소는 리조븀 sp. M-11 및 아르드로박터 sp. Q36의 미생물의 배양액으로부터 수득할 수 있다(리조븀 sp. M-11과 아르드로박터 Q36으로부터의 효소를 이후 부터는 각각 "효소 M-11' 및 "효소 Q36"이라 한다).

본 발명자들은 칼럼 크로마토그래피를 주로 사용하는 종래의 정제 방법들을병용하여 효소를 분리한 다음 그 특성을 조사하여 실체를 밝혀내었는데, 아래의 물리 화학적 성질을 가진 폴리펩티드이었다.

(1) 작용

글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성 당류로부터 말단 단위가 트레할로오스 구조인 비환원성 당류를 생성함.

(2) 분자량

소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에서 약 76,000 ∼ 87,000 돌턴(dalton).

(3) 등전점

등전점 전기 영동에서 약 3.6 ∼ 4.6

(4) 최적온도

pH 7.0에서 60 분간 항온 처리시 35 ∼ 40℃ 부근의 최적 온도를 나타냄.

(5) 최적 pH

40℃에서 60 분간 항온 처리시 6.4 ∼ 7.2 부근의 최적 pH 나타냄.

(6) 열적 안정성

pH 7.0에서 60 분간 항온 처리시 35 ∼ 40℃ 부근의 온도 이하에서 안정함.

(7) pH 안정성

25℃에서 16 시간 항온 처리시 5.5 ∼ 11.0 부근의 pH 이하에서 안정함.

위에 나온 물리 화학적 성질을 구명하기 위해 수행된 실험에 대해 이하 상세히 설명한다.

실험 1 : 정제 효소의 제조

실험 1-1 : 리조븀 sp. M-11유래의 효소의 제조

500 ㎖ 삼각 플라스크에 2.0 w/v % 말토오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v % 효모 추출물, 0.1 w/v % 인산수소 2 나트륨 및 0.1 w/v % 인산 2 수소 칼륨을 함유한 액체 배지(pH 7.0) 100 ㎖ 씩을 각각 넣고 이들 플라스크를 120℃에서 20 분간 오토클레이브 처리하여 멸균시켰다. 플라스크를 냉각하고 리조븀 sp. M-11의 종배양액을 각 플라스크내의 액체 배지에 식균한 다음 회전 진탕 조건하에 27℃에서 24시간 배양하였다. 신선한 동일한 액체 배지 20ℓ 를 30ℓ 자아 퍼멘터(jar fermentor)에 넣고 멸균시킨 다음 위에서 얻은 배양액 1 v/v %을 자아 퍼어멘터의 멸균된 액체 배지에다 식균하고 통기 및 교반 조건하에 pH 6 ∼ 8 및 30℃에서 24시간 배양하였다.

이어서 수득한 배양액 약 18ℓ 을 초고압 세포 파쇄 장치에서 처리하여 세포를 파쇄하고 수득한 현탁액을 원심 분리하여 상청액을 얻은 다음 이 상청액 약 16ℓ 에 황산 암모늄을 가하여 20 w/v % 포화도로 한 후 4℃에서 1 시간 방치하고 원심 분리하여 침강물을 제거하였다. 수득한 상청액에 황산 암모늄을 가하여 60 w/v% 포화도로 하여 4℃에서 24 시간 방치하고 원심 분리하여 침강물을 채취한 다음 이것을 극소량의 10 mm 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하였다. 수득한 용액을 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대해 24 시간 투석한 다음 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 여기서 얻은 상청액을 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화시켜 둔 "DEAE-TOYOPEARL" " 칼럼(일본국 Tosoh사제의 이온 교환 크로마토그래피용 제품)에통과 시킨 다음 10 mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서의 0 M ∼ 0.5 M 범위의 염화 나튜륨의 직선 기울기 완충액을 상기 칼럼속을 통과시켰다. 목적이 효소를 함유한 획분을 용출액으로부리 회수하여 한데 모아 2 M 황산 암모늄 함유의 50mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대해 10 시간 투석한 다음 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 이어서 수득한 상청액을 "BUTYL TOYOPEARL^*"(일본국 Tosoh사제 판매의 소수성 칼럼 크로마토그래피용- 겔)이 충전된 칼럼으로서 2 M 황산 암모늄 함유의 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화시켜둔 칼럼속을 통과시킨 다음 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서의 2 M ∼ 0 M 범위의 황산 나트륨의 직선 기울기 완충액을 상기 칼럼속을 통과시켰다.

목적의 효소를 함유한 획분을 용출액으로부터 회수하고 한데 모아 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화시켜둔 "TOYOPEARL HW-55" 칼럼(일본국 Tosoh 사 판매의 겔 여과 칼럼 크로마토그래피용 제품) 속을 통과시킨 다음 이 칼럼에 50mM 인산 완충액(PH 7.0)을 통과시켜 목적의 효소를 함유한 획분을 회수하였다. 이 효소의 비활성은 약 195 단위/mg 단백질이었고 그 수득량은 배양액 1ℓ 당 약 220 단위이였다.

명세서중에서 효소 활성은 다음의 방법으로 측정한 값으로 나타낸 것이다. 즉, 1.25 w/v % 말토펜타오스를 함유한 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 4 ㎖을 시험관에 넣고 효소액 1 ㎖을 가한 다음 40℃에서 60 분간 배양하여 효소 반응시켰다. 이어서 수득한 반응액을 100℃에서 10 분간 가열하에 효소 반응을 정지시켰다. 수득한 반응액을 증류수로 10 배로 희석한 다음 소모기-넬슨법(Somogyi-Nelson's method)으로 환원 활성을 측정하였다. 이 효소의 1 단위 활성은 위와 같은 동일한 조건하에서 1 분당 말토펜타오스 1 u mol에 상응한 환원력을 감소시키는 효소의 양으로 정의한다.

실험 1-2 : 효소 Q36의 정제

실험 1-1과 마찬가지로 아르드로박터 sp. Q36의 종배양액을 배양하고, 수득한 배양액을 처리하여 비활성이 약 200 단위/mg 단백질인 정제 효소 Q36을 배양액 1ℓ 당 약 295 단위의 수득량으로 얻었다.

실험 2 : 효소의 물리 화학적 성질

실험 2-1 : 작용

기질로서 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스를 20 w/v % 함유한 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에다 실험 1에서 수득한 효소 Q36 또는 정제 효소 M-11을 건조 고형분 기준(d. s. b )으로 기질 1 g 당 2 단위/기질 가하고, 이 혼합물을 40℃에서 48 시간 효소 반응시켰다. 반응액을 통상의 방법으로 탈염하고 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 칼럼 "WB-T-330"(일본국 Tosoh사 판매)에 공급한 다음 이 칼럼애 증류수를 주위 온도에서 0.5 ㎖/min의 유속으로 통과시켜 용출액의 당농도를 시차 굴절계 "MODEL RI-8012" (일본국 和光 순약공업사제)로 모니터링하면서 반응액중에 함유된 당류를 분리하였다. 반응액중의 당조성은 표 1 또는 표 2에 나와있다. 표에서 부호 "P1 ∼ P5"는 글루코오스 중합도에 있어서 가장 작은 것으로부터 가장 큰 것에 이르기 까지의 순서로 생성된 당류에 대하여 부여한 명칭이다.

표 1

표 2

표 1과 표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이 효소 M-11과 Q36은 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스 등의 글루로오스 중합도 3 이상의 환원성 당류로부터 새로이 당을 생성한 반면 글루코오스, 말토오스 등의 글루코오스 중합도 3 미만의 것들로부터는 당을 생성하지 못하고 있다. 이 효소 반응에서 새로 생성된 당은 P1 ∼ P5인데 이들 당 P2 ∼ P5의 총 수득량은 건조 고형분 기준으로 85 w/w % 이상으로서 많았다.

당 P1 ∼ P5을 분리하기 위해 자켓부 스테인레스강 칼럼(내경 2.0 cm 길이 1 m) 3 개에 강산성 양이온 교환 수지 "XT-1016, Na⁺" (일본국의 Tokyo Organic Chimical Industries사제 판매)를 충전하고 직열로 연결하였다. 당 P1 ∼ P5 중의 한가지 당을 각각 함유한 반응액을 칼럼 내부 온도 55℃에서 칼럼에 따로 따로 가한 다음 이 칼럼에 55℃의 증류수를 SV(공간속도) 0.13의 유속으로 가하였다. 수득한 용출액중의 당조성을 조사한 후 당 P1 ∼ P5 중의 한가지 당을 97 w/w % 이상 함유한 획분을 회수하여 감압하에 분쇄하였다. 소모기-넬슨법에 의해서는 정제당 P1 ∼ P5에서 실질적인 환원력이 전혀 검출되지 않았다.

당 P1 ∼ P5을 확인하기 위해 각각 50 mg을 달아 50 mM 아세트산 완충액(pH4.5) 1 ㎖ 중에 용해하고 글루코아밀라아제 1 단위와 혼합한 다음 40℃에서 6 시간 배양하였다. 수득한 반응액에 대해 고속 액체 크로마토그래피 분석을 한 결과 표 3과 표 4에 있는 바와 같이 글루코오스와 트레할로오스가 검출되었다. 당 P1 ∼ P5에 β -아밀라아제를 작용시켰을 때 당 P1과 P2는 β -아밀라아제에 의해 가수 분해되지 않았으나, 당 P3, P4 및 P5는 각각 가수 분해되어 말토오스 1 몰을 당 P2 및 말토오스 1 몰을, 그리고 P1 및 말토오스 2 몰을 각각 생성하였다.

표 3

(주) : 부호 " "로 나타낸 몰비는 트레할로오스 1 몰에 대해 글루코오스의 몰수로 계산한 값이다.

표 4

표 3과 표 4의 결과로부터 당 P1 ∼ P5는 트레할로오스 1 몰과 글루코오스 1∼ 5 몰로 구성되어 있음을 알 수 있다. 글루코아밀라아제는 말토올리고당의 α -1,4 결합과 α -1,6 결합을 특이하게 가수 분해하고 β -아밀라아제는 말단으로부터 말토올리고당의 α -1,4 결합을 말토오스 단위로 가수분해한다는 사실로부터 당 P1∼ P5는 글루코오스 중합도가 2 ∼ 5인 말토올리고당 또는 글루로오스로 구성된 구조를 가지며 이들 모두 말단에 트레할로오스 잔기를 가지고 있는 것으로 생각된다.

위의 결과를 종합적으로 판단해 보면 당 P1 ∼ P5는 각각 α -글루코실 트레할로오스, α -말토실 트레할로오스, α -말토트리오실 트레할로오스, α -말토테트라오실 트레할로오스 및 α -말토펜타오실 트레할로오스임이 확인되고 있고, 이것은 이 효소가 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성시키는 활성을 가지고 있다는 것을입증하는 것이다.

실험 2-2 : 분자량

문헌[U.K.Laemmli Nature, Vol. 227, pp. 680 ∼ 6685(1970)]에 보고된 방법에 따라 실험 1에서의 정제 효소 M-11 및 Q36을 소디움 도데실 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 각각 전기 영동 처리하여 약 76,000 ∼ 87,000 돌털에 해당되는 위치에서 단하나의 단백질 밴드를 얻었다. 이 실험에 사용된 마아커(marker) 단백질은 미오신(MW = 200,000 돌턴), β -갈락토시다이제(MW = 116,250 돌턴), 포스포릴라아제 B(MW = 97,400 돌턴), 혈청 알부민(MW = 66,200 돌턴) 및 오브알부민(MW= 45,000 돌턴)이었다.

실험 2-3 : 등전점

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11과 Q36의 등전점 전기 영동 측정에 의한 등전점은 각각 약 3.6 ∼ 4.6이었다.

실험 2-4 : 최적 온도

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11과 Q36을 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서 60 분간 통상의 방법으로 항온처리했을 때의 최적 온도는 도 1 또는 도 2에 있는 바와 같이 약 35 ∼ 40℃이었다.

실험 2-5 : 최적 pH

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11과 Q36을 50 mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산 나트륨-탄산 수소 나트륨의 각기 상이한 pH에서 40℃에서 60 분간 항온 처리하여 통상의 방법으로 실험했을 때의 최적 pH는 도 3 또는 도 4에 있는 바와 같이 약 6.4 ∼ 7.2이었다.

실험 2-6 : 열적 안정성

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11과 Q36을 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서 60 분간 항온 처리하여 통상의 방법으로 실험했을 때 도 5와 도 6에 있는 바와 같이 약 35 ∼ 40℃ 이하에서 안정하였다.

실험 2-7 : pH 안정성

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11과 Q36을 50 mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산 나트륨-탄산 수소 나트륨 완충액의 상이한 pH에서 25℃에서 16 시간 항온 처리하여 통상적인 방법으로 실험했을 때 도 7과 도 8에 있는 바와 같이 pH약 5.5 ∼ 11.0 이하에서 안정하였다.

실험 2-8 : N 말단을 가진 아미노산의 배열

실험 1에서 얻은 정제 효소 M-11의 N 말단을 가진 아미노산의 배열을 기상 단백질 시퀀서 "MODEI. 470A" (미합중국의 Applied Biosytems사 판매)에서 분석한 결과 효소 M-11은 배열 리스트(SEQ ID NO : 12)에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

정제 효소 Q36의 N 말단을 가진 아미노산의 배열을 효소 M-11에서와 마찬가지로 분석한 결과 배열 리스트(SEQ ID NO : 13)에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

실험 2-9 : 부분 아미노산 배열

실험 1-1에서 얻은 정제 효소 M-11 적당량을 달아 10 mM Tris-HCI완충액(pH9.0)에 대해 4℃에서 18 시간 투석한 다음 10 mM Tris-HCI 완충액(pH 9.0)과 혼합하여 효소 1 ㎖ 당 약 1 mg의 농도로 하였다. 수득한 용액중 약 1 ㎖을 용기에 넣고 10 ㎍ 리실 엔도펩티다아제와 혼합하고 30℃에서 22 시간 항온 처리하여 효소를 부분적으로 가수 분해하였다. 수득한 가수 분해물을 16 v/v % 아세토니트릴 수용액 함유 0.1 v/v % 트리플루오로 아세테이트로 미리 평형화시켜 둔 역상 고속 액체 크로마토그래피 칼럼(일본국의 Shiseido사 판매 : "CAPCELL-PAK C18")에 가한 다음 아세토니트릴의 농도를 16 v/v %에서 부터 64 v/v %로 증가시키면서 0.1 v/v % 트리플루오로 아세테이트를 0.9 ㎖/min의 유속으로 상기 칼럼에 공급하여 공급개시후 약 28 분 또는 40 분에서의 펩티드 단편을 가진 획분을 분리하여 회수하였다(이 펩티드 획분을 각각 "펩티드 단편 A" 및 "펩티드 단편 B"라 함).

펩티드 단편 A 또는 B를 함유한 획분을 각각 한데 모아 감압 건조하고 50 v/v % 아세토니트릴 함유의 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트에 용해하였다. 실험 2-8에서와 마찬가지로 펩티드 단편 A와 B를 분석한 결과 배열 리스트(SEQ ID NO : 14)에 있는 아미노산 배열과 배열 리스트(SEQ ID NO : 15)에 있는 아미노산 배열을 가지고 있음을 확인하였다.

효소 M-11에서와 마찬가지로 실험 1-2에서 얻은 효소 Q36을 부분 가수 분해하여 역상 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼(일본국의 Japan Millipore사 판매의 "μ BONDAPAK C18")에 공급한 다음 농도 범위 24 v/v % ∼ 44 v/v %의 수성 아세토니트릴을 함유하는 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트를 0.9 ㎖/min의 유속으로 상기 칼럼에 공급하였다. 공급개시후 약 22 분 또는 약 40 분에 용출된 펩티드 단편을 함유한 획분(이들 회분을 이하 각각 "펩티드 단편 C" 및 "펩티드 단편 D"라 함)을 각각 회수하여 한데모아 감압 건조하여 50 v/v % 수성 아세토니트럴 함유의 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트에 용해하였다. 펩티드 단편 C와 D에 대한 분석을 위에서와 마찬가지로 한 결과 배열 리스트(SEQ ID NO : 16 및 17)에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 각각 가지고 있음을 확인하였다.

이러한 물리화학적 성질을 가진 효소는 아직까지 알려진바가 없으므로 이것은 신규 물질이라는 결론을 얻었다. 리조븀 sp, M-11의 경우에 있어서 이것은 일본국의 Okayama시의 토양으로부터 분리한 미생물로서 1992년 12월 24일자로 기탁(기탁기관 : 일본국의 이바라키, 츠쿠바시의 National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology)되어 수탁번호FERM BP-4130으로 접수되어 보관되어 있다. 아르드로박터 sp. Q36은 일본국의 Okayama의 Soja시의 토양으로부터 분리한 미생물로서 1993년 6월 3일자로 위에 나온 기탁 기관에 기탁되어 수탁번호 FERM BP-4316으로 접수되어 보관되어 있다. 본 출원인이 출원한 일본국 특허출원 제349,216/93호에는 비환원성 당질 생성 효소의 특성과 이들 미생물의 구체적인 세균학적 성질이 기재되어 있다.

본 발명자들은 실험 2-9에서 확인된 효소 M-11의 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브(probe)로서 사용하여 리조븀 sp. M-11의 염색체 DNA를 예의 검색한 결과 5' 말단에서 시작하는 다음의 배열리스트(SEQ ID NO : L)에 있는 바와 같은 염기 배열을 가진 2,316 염기쌍으로 된 DNA 단편을 발견하였다. 염기 배열의 디코우드에 이해 이 효소는 배열 리스트(SEQID NO : 2)에 있는 바와 같은 772 개의 아미노산으로 구성되어 있음이 확인되었다.

효소 M-11에서와 마찬가지로 효소 Q36의 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 사용하여 효소 Q36의 염색체 DNA를 검색하여 배열 리스트(SEQ ID NO : 3)와 같이 5' 말단에서부터 2,325 염기쌍으로 구성된 염기 배열을 가진 DNA 단편을 얻었다. 이 염기 배열을 디코우드 한 결과 이 효소 Q36은 775 개의 아미노산으로 구성되어 있고 배열 리스트(SEQ ID NO : 4)와 같은 N 말단을 가진 부분 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다. 배열리스트(SEQ ID NO : 1∼4)에 나와 있는 아미노산 배열과 염기 배열을 확인하는데 사용된 순차적인 실험 단계를 요약하면 아래와 같다.

(1) 공여체 미생물의 배양액으로부터 효소를 분리하여 고도로 정제하였다. 정제 효소를 프로테아제로 부분 가수 분해하고, 수득한 두가지의 상이한 펩티드 단편을 분리하여 이들의 아미노산 배열을 결정하였다.

(2) 별도로 공여체 미생물의 세포로부터 염색체 DNA를 분리하여 정제한 다음 제한 효소로 부분 소화하여 약 3,000 ∼ 7,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한 효소로 미리 절단해둔 플라스미드 벡터에다 DNA 리가아제로 결찰하여 재조합 DNA를 얻었다.

(3) 이 재조합 DNA를 대장균에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 위에 나온 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 사용하는 콜로니 하이브리다이제이션 방법으로 상기 형질 전환체로부터, 효소를 인코우드하는 DNA를 가진 목적의 형질 전환체를 선택하였다.

(4) 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 얻어 프라이머로 어니일링한 다음 DNA 폴리머라아제를 작용시켜 프라이머를 연장시키고, 수득한 상보(相補)체인 DNA의 염기 배열을 디데옥시 체인 종결법으로 결정하였다. 결정된 염기 배열로부터 추정되는 아미노산 배열과 위에 나온 아미노산 배열을 비교해 본 결과 염기 배열이 효소를 인코우드한다는 것을 확인하였다.

위에서 설명한 바와 같이 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성의 당류를 생성하는 효소는 본 발명자들의 장기간에 걸친 연구 결과로 발견된 효소이다. 이 효소는 종래의 효소와는 구별되는 물리 화학적 성질을 가지고 있는데, 본 발명은 재조합 DNA 기법을 적용하여 이 효소를 제조하는 것이다. 재조합 DNA와 그 제조 방법 및 용도에 대해 실시예를 참조하면서 상세히 설명한다.

본 발명에서 말하는 재조합 효소란 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있고 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성할 수 있는 전(全) 효소를 뜻한다. 일반적으로 본 발명에 의한 재조합 효소는 예컨대 배열 리스트(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 나온 바와 같은 N 말단으로부터 시작하는 아미노산 배열을 가진것으로 확인되었으며 이것과 상동(相同)적인 것도 포함된다. 배열 리스트(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 나온 것과 상동적인 아미노산 배열을 가진 변종은 배열 리스트(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 있는 염기 하나 이상을 효소의 고유의 작용을 실질적으로 변화시킴이 없이 다른 염기로 치환하여 얻을 수 있다. 동일한 DNA를 사용하고 DNA가 도입되는 숙주와 형질전환체 배양 배지의 성분과 이들의 배양 온도 및 pH에 따라 좌우된다 하더라도, 배열 리스트(SEQ ID NO : 2 또는 4)와 유사한 아미노산 배열을 가지며 DNA에 의해 인코우드된 효소의 효소 작용을 가지지만 배열 리스트(SEㅃ ID NO : 2 또는 4)에 있는 아미노산 배열의 N 말단에 가까이 위치한 아미노산 하나 이상이 결실된/혹은 숙주의 세포내 효소(intracellular enzyme)의 개질에 의해 DNA 발현후에 N 말단에 새로 첨가된 아미노산 하나 이상을 가진 개질된 효소를 생산할 수도 있다.

재조합 효소는 특정의 DNA를 가진 형질 전환체의 배양에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 이러한 형질 전환체는 N 말단에서부터 시작하는 염기 배열 또는 이득에 대해 상보적인 염기 배열 혹은 이것과 상동적인 염기 배열을 가진 DNA를 숙주속에 도입함으로써 제조할 수 있다. 이러한 염기 배열은 인코우드된 아미노산 배열을 변화시키지 않고 유전 코우드의 축중(縮重)을 이용하여 그 염기 하나 이상을 치환함으로써 제조하여도 좋다. 물론 효소 또는 이들의 변이종을 인코우드하는 염기 배열중의 염기 하나 이상을 다른 염기로 쉽사리 치환하여 DNA가 실제로 숙주에서 효소 생산을 발현하도록 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 DNA로서는 위에 나온 바와 같은 염기 배열을 가진 것 이면 천연 유래의 것이거나 인공 합성의 것이거나를 불문하고 어느 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에 의한 DNA의 천연 공급원의 예로서는 리조븀, 아르드로박터, 브래비박테륨(Brevibacterium) , 플라보박테륨(Flavobacterium) , 마이크로코커스(Micrococcus) 및 쿠르토박테륨(Curtobacterium) , 마이코 박테륨(Mycobacterium)및 테라박터(Terrabacter) 등의 속(屬)에 속하는 미생물이있는데, 즉 구체적인 예로서는 리조븀 sp, M-11(FERM BP-4130), 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316), 브레비박테륨 헬로볼륨(ATCC 11822), 플라보박테륨 아쿠아틸레(IFO 3772), 마이크로코커스 루테우스(IFO :1064), 마이크로코커스 로제우스(ATCC 186), 쿠르토박테륨 시트레움(IFO 15231), 마이코박테륨 스메그마티스(ATCC 19420) 및 테라박터투메센스(IFO 12960) 등이 있으며 이들로부터 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 얻을 수 있다. 위에 나온 미생물은 영양 배지에서 식균하여 호기성 조건하에 약 1 ∼3 일간 배양한 다음 수득한 세포를 배양액으로부터 회수하여 초음파 처리하거나 리소자임 또는 β -글루카나아제 등의 세포벽 용해 효소로 처리하여 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 추출한다. 이 경우에 있어서 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 세포벽 용해 효소와 더불어 사용할 수 있으며 초음파 파쇄기로 세포를 처리할 경우에 있어서는 이들을 소디움 도데실 술페이트(SDS) 등의 계면 활성제 존재하에 처리하거나 동결, 해동법으로 처리하여도 좋다. 목적으로 하는 DNA는 수득물을 페놀 추출법, 알코올 침강법, 윈심 분리법, 프로테아제 처리법 및/또는 리보뉴클레아제 처리법 등이 기술 분야에서 통상적으로 이용되고 있는 방법으로 처리하여 제조한다. 본 발명의 DNA를 인공적으로 합성하자면 배열 리스트(SEQ ID NO : 1 또는 3)에 있는 염기 배열을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 배열 리스트(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 있는 아미노산 배열을 인코우드하는 DNA를 적당한 자체 복제가 가능한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA를 얻고, 이 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음, 이 형질 전환체를 배양하여 수득한 배양액으로부터 증식된 세포를 분리하고 이 세포로부터 DNA를 함유한 플라스미드를 채취함으로써 플라스미드 형태로 수득할 수 있다.

이러한 재조합 DNA는 일반적으로 재조합 DNA 형태로 숙주속에 도입된다. 일반적으로 재조합 DNA는 위에 나온 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 함유하며, 이것은 DNA 원료를 확보하고 있을 경우에는 일반적으로 재조합 DNA 기법에 의해 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 pBR322, pUC18, 블루우스크림프(Bluescript) II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터와 λ gt ·λ C, λ gt · λ B, p 11, Φ 1, Φ 105 등의 파아지(phase)벡터가 있는데, 이들 플라스미드 벡터와 파아지 벡터중에서 pBR322, pUC18, 블루우스크립트(Blueseript) II SK(+), λ gt · λ C 및 λ gt · λ B는 본 발명의 DNA를 대장균(Escherichia coli)에서 발현시킬 필요가 있을 때 만족스럽게 사용할 수 있는 반면 pUB110, pTZ4, pC194, p 11, Φ 1 및 Φ 105는 바실루스속 미생물에서 DNA를 발현시킬 때 만족스럽게 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터 pHV14, TRp7, TEp7 및 pBS7는 재조합 DNA를 두가지 이상의 숙주에서 생장시킬 경우에 유리하게 사용된다.

본 발명에서 본 발명의 DNA를 이러한 벡터속에 삽입할 때 이용하는 방법은 이 기술 분야에서 일반적으로 통용되고 있는 종래의 방법이어도 좋다. 본 발명의 DNA와 자체 복제성 벡터를 함유한 유전자를 제한 효소 및/또는 초음파 파쇄기로 먼저 분해한 다음 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 결찰(ligation)시킨다. DNA와 벡터를 분해하자면 뉴클레오티드, 특히 타입 II 제한 효소, 더욱 구체적으로는 Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, SaI I, Xba I, Sac I, Pst I 등에 특이적으로 작용하는 제한 효소에 치하여 DNA 단편과 벡터 단편을 용이하게 결찰시킬 수 있다. DNA 단편을 벡터 단편으로 결찰시키자면 필요에 따라 이들을 어니일링한 다음 생체내 또는 시험관내에서 DNA 리가아제로 처리한다. 이렇게 해서 수득한 재조합 DNA는 적당한 숙주속에 도입하여 수득한 형질 전환체를 배양함으로써 실질적으로 아무런 제한없이 복제가 가능하다.

여기서 수득한 재조합 DNA를 대장균과 바실루스속, 악티노마이세스속 및 효모를 비롯한 적당한 숙주 미생물속에 도입할 수 있다. 숙주로서 대장균을 사용할 경우에 있어서 DNA를 도입할 때는 재조합 DNA와 칼슘 이온 존재하에 숙주를 배양하여 DNA를 도입할 수 있고, 숙주로서 바실루스속 미생물을 이용할 경우에는 컴피턴트 필법(competent cell method)과 콜로니 하이브리다이제이션법(colony hybridization method)을 이용할 수 있다. 필요로 하는 형질 전환체를 콜로니 하이브다이제이션법으로 클로닝 하거나 또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류를 함유한 영양 배지에서 여러가지 형질 전환체를 배양한 다음 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성의 전분질 당류를 생성하는, 목적의 형질 전환체를 선택함으로써 클로닝 할 수 있다.

이렇게 해서 수득한 형질 전환체는 영양 배지에서 배양하면 목적으로 하는 효소를 세포외에서 생성한다. 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미네랄이 보충된 액상 배지, 필요에 따라서는 소량의 아미노산과 비타민류가 보충된 액상 배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 탄소원의 예로서는 전분, 전분 가수 분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 등의 당류가 있고, 질소원의 예로서는 암모니아, 암모늄염,우레아, 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 탈지대두, 옥수수 침출액, 육(肉) 추출물 등의 질소 함유 무기 및 유기 물질이 있다. 목적으로 하는 효소를 함유하는 배양액은 형질 전환체를 영양 배지에서 접종하고 통기 교반하면서 호기성 조건하에 25 ∼ 65℃ 및 pH 2 ∼ 8에서 약 1 ∼ 6 일 동안 배양함으로써 제조할 수 있다. 이 배양액을 그대로 효소제로 사용할 수 있는데, 통상적으로는 초음파 파쇄기 및/또는 세포벽 융해 효소로 파쇄한 다음 여과 및/또는 원심 분리에 의해 세포와 세포 부스러기 로부터 효소를 분리하여 이 효소를 정제하여 사용한다. 효소 정제법으로는 일반적으로 종래의 방법이 포함된다. 배양액으로부터 세포와 세포 부스러기를 제거하고 원심 분리, 염석, 투석, 분별침강, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

위에 나온 바와 같이 본 발명에 의한 재조합 효소는 글루코오스 중합도가 3이상인 환원성의 전분질 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 특징을 가지고 있다. 생성된 비환원성 당류는 온화한 고품위의 감미와 적당한 점성 및 보습성을 가지고 있으며, 큰 특징으로서는 이들은 분자내에 환원성 잔기를 가지고 있지 않기 때문에 착색이나 열화의 우려가 없이 식품에 감미를 부여할 수 있다. 이러한 특징을 이용하여 환원성의 이유로 해서 쓸모없이 되어 있었던 여러가지 전분질 당류를 취급이 만족스럽고 유용성이 있으며 환원성이 실질적으로 전혀 없거나 극히 감소된 당류로 전환시킬 수 있다.

전환방법에 대해 이하 구체적으로 설명한다. 전분, 아밀로펙틴 및 아밀로오스를 산 및/또는 아밀라아제로 부분 가수 분해하여 수득되는 환원성의 전분 가수 분해물을 통상적으로 본 발명의 재조합 효소의 기질로 사용할 수 있다. 이러한 전분 가수 분해물은 종래의 방법으로 제조할 수 있는데, 그 예로서는 글루코오스 중합도가 3 이상인 말토올리고당류, 즉, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 막토헥사오스 및 말토헵타오스중의 한가지 이상이 포함된다. 문헌["Handbook of Amylases and Related Enzymes", lst edition, edited by Thc Amylase Research Society of Japan, published by Pergamon Press plc, Oxford, England(1988)]에 기재되어 있는 바와 같이 α -아밀라아제, 말토테트라오스 생성 아밀라아제, 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토헥사오스 생성 아밀라아제는 본 발명에서 사용되는 환원성의 전분질 당류 제조시 특히 유용한데, 이들 아밀라아제중의 한가지를 사용하여도 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류를 다량 함유한 전분질 당 혼합물을 상당히 높은 수율로 얻게 된다. 필요에 따라서는 풀룰라나아제와 이소아밀라아제 등의 전분 지절 효소(starch debranching enzyme)와 아밀라아제를 병용하면 본 발명의 재조합 효소의 기질로 사용된 환원성의 전분질 당류의 수율을 증대 시킬 수 있다.

본 발명에 의한 전환 방법에 있어서 위에 나온 환원성의 전분질 당류 한가지 이상을 기질로 함유하는 수용액중에 본 발명의 재조합 효소를 공존시켜 이 용액을 일정 온도와 pH에서 효소 반응시킴으로써 목적으로 하는 환원성의 전분질 당을 필요로 하는 양으로 생성시킨다. 효소 반응이 기질 농도 0.1 w/v % 이하에서도 진행하지만 2 w/v %의 고농도, 바람직하게는 5 ∼ 50 w/v %의 기질 농도를 사용하면 본발명에 의한 전환 방법을 공업적 생산 규모에 만족스럽게 적용할 수 있다. 이 효소 반응에 사용된 온도와 pH는 재조합 효소를 실활하지 않고 재조합 효소를 기질에 대해 효과적으로 작용시키는 범위내로 설정하는데, 즉 약 55℃의 온도, 바람직하게는 약 40 ∼ 55℃ 및 pH 5 ∼ 10, 바람직하게는 pH 6 ∼ 8의 범위로 설정한다. 본 발명의 재조합 효소의 양과 반응 시간은 효소 반응 조건에 따라 달리 선택된다. 효소 반응에 의해 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당류의 환원력을 상당히 크게 감소시키는데, 말토펜타오스의 경우에 있어서 환원력은 최초의 수준에 대해 약 7 %까지 저하된다.

본 발명의 전환 반응에서 수득한 반응 혼합물을 그대로 사용할 수 있는데, 통상적으로는 정제한 후 사용한다. 즉, 불용성 물질을 여과와 원심 분리에 의해 반응 혼합물로부터 제거하고 수득한 용액을 활성탄으로 탈색하여 탈염한 다음 이온 교환체로 정제한 후 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 용도에 따라 이 시럽상 제품을 감압 건조하고 분무 건조하여 고형제품을 얻는다. 비환원성 당류로 된 제품을 제조하자면 위에 나온 시럽상 제품을 이온 교환체를 사용하는 크로마토그래피, 활성탄 및 실리카 겔에 의한 당의 분리법, 알코올 및/또는 아세톤을 사용하는 분별 침강법, 멤브레인 여과법, 효모에 의한 발효법, 알칼리에 의한 환원당의 제거 및 분해법 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다. 예컨대 다량의 반응 혼합물을 처리하는 방법으로서는 고정상법 또는 의사(擬似) 이동상법-이온 교환 칼럼 크로마토그래피가 있는데(일본국 특허 공개 제23,799/83호 및 제72,598/83호 참조), 이 방법에서는 비환원성 당 고함유 제품을 공업적 규모로 상당히 고수율로제조할 수 있다.

이렇게 해서 수득한 환원성 당류는 당 감미제의 환원성에 의하여 용이하게 손상을 받는 여러가지 제품에 폭넓은 용도를 가지고 있다. 예컨대 식품, 화장품 및 의약품 등에 있어서, 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로서 만족스럽게 사용할 수 있다. 비환원성 당류는 일본 특허 출원 제340,343/92호에 개시된 트레할로오스 방출 효소의 효소 작용을 받으면 거의 정량적으로 트레할로오스를 생성하므로 쉽사리 제조할 수 없었던 트레할로오스의 제조시 중간체로서 이들을 사용할 수 있다.

다음의 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명하는데, 여기에 사용된 재조합 DNA 기법 또는 기타 기법 그 자체는 이 기술 분야, 예컨대 문헌[J, Sumbruck et al. in "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)]에 기재된 종래의 공지의 방법 들이다.

실시예 1 : 효소 M-11 유래의 DNA 함유 재조합 DNA 및 전환체의 제조

실시예 1-1 : 염색체 DNA 제조

리조븀 sp. M-11의 종배양액을 박토 영양 육즙 배지(pH 7.0)에 식균하고 27℃에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 배양하였다. 세포를 배양액으로부터 원심 분리하여 제거하여 TES 완충액(pH 8.0) 중에 현탁시킨 다음 0.05 w/v % 리소자임을 가하여 혼합한 후 37℃에서 30 분간 배양하였다. 수득물을 -80℃에시 1 시간 동결시키고 TSS 완충액(pH 9.0)을 가하여 혼합하고 60℃로 가열한 다음, TES 완충액과페놀의 혼합액과 혼합하여 수득한 용액을 얼음으로 급냉한 후 원심 분리하여 침전한 미정제 염색체 DNA를 회수하였다. 상청액에 2 배 체적의 차가운 에탄올을 가하고 침전한 미정제 염색체 DNA를 회수하여 SSC 완충액(pH 7.1) 중에 현탁시켜 리보뉴클레아제 7.5 ㎍과 프로테아제 125 ㎍을 가해 혼합한 다음 37℃에서 1 시간 배양하였다. 이어서 이 반응액에 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합액을 가하여 목적으로 하는 염색체 DNA를 추출하고 차가운 에탄올과 혼합한 다음 염색체 DNA 함유 침강물을 채취하였다. 여기서 얻은 정제 염색체 DNA를 SSC 완충액(pHl 7.1)에 용해하여 약 1 mg/㎖의 농도로 한 다음 이 용액을 -80℃에서 동결시켰다.

실시예 1-2 : 재조합 DNA pBMT7과 형질 전환체 BMT7의 제조

실시예 1-1에서 제조한 정제 염색체 DNA 약 1 ㎖을 용기에 넣고 제한 효소인 Sau 3AI 약 35 단위를 가해 혼합하여 37℃에서 약 20 분간 효소 반응시켜 염색체 DNA를 부분 분해한 다음 수크로오스 밀도 기울기 초원심 분리에 의해 약 3,000 ∼7,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 회수하였다. 플라스미드 벡터인 블루우스크립트II SK(+), 1 ㎍을 준비하여 제한 효소인 Bam HI을 작용시켜 플라스미드 벡터를 완전히 소화시킨 후 DNA 단편 10 ㎍ 및 T4 DNA 리가아제 2 단위와 혼합하여 4℃에서 하룻밤 방치함으로써 DNA 단편을 벡터 단편에다 결찰시켰다. 수득한 재조합 DNA에 "Epicurian Coli^*XLI-Blue", (일본국의 Toyobo사 판매의 컴피턴트 셀) 30 ㎕을 가하고 얼음 냉각 조건하에서 30 분간 방치한 다음 42℃로 가열하고 나서 SOC 육즙을 가해 혼합하여 37℃에서 1 시간 항온 처리함으로써 재조합 DNA를대장균 속에 도입하였다.

수득한 형질 전환체를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β -갈락토시드 50 ㎍/㎖ 함유의 한천 플레이트(pH 7.0)에 식균하고 37℃에서 18 시간 배양한 다음 한천 플레이트 위에 나일론 필름을 얹어 이 위에 한천 플레이트에 생성된 약 4,400 콜로니를 고정시켰다. 실험 2-9에서 확인된 펩티드 단편 A의 아미노산 배열에 있어서 17∼ 21 위치에 있는 아미노산 배열 Pro-Glu-Trp-Glu-Lys에 근거하여 배열 리스트(SEQ ID NO : 5)에 있는 프로우브 1의 염기 배열을 화학적으로 합성하여³²P로 표지한 다음 나일론 필름위에 고정된 형질 전환체의 콜로니로 하이브리다이제이션한 후 강렬한 하이브리다이제이션을 나타낸 9 개의 형질 전환체를 선택하였다.

이 9 개의 형질 전환체로부터 통상적인 방임으로 목적으로 하는 재조합 DNA를 선택하고 문헌[E.M. Southern in Journal of Molecular Biology, Vol. 98, pp.503 ∼ 517 (1975)]에 기재된 방법에 따라, 실험 2-9에서 확인된 펩티드 단편 B의 아미노산 배열의 16 ∼ 20 위치에 있는 아미노산 배열 Thr-Glu-Phe-Trp-Asp에 근거하여 화학적으로 합성한 배열 리스트(SEQ ID NO : 6)에 있는 염기 배열을 가진 프로우브 2로 하이브리다이제이션한 다음, 프로우의 2에 의해 강력히 하이브리다이 제이션된 재조합 DNA를 선택하였다. 이렇게 해서 선택한 재조합 DNA와 형질 전환체를 각각 pBMT7 및 BMT7로 각각 명명하였다.

형질 전환체 BMT7을 앰피실린 100 ㎍/㎖을 함유하는 L-육즙(pH 7.0)에 식균하고 37℃에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 배양한 다음 원심 분리에 의해 배양액으로부터 세포를 채취하여 알칼리법으로 처리하여 세포외에서 재조합 DNA를 추출하였다. 수득물을 통상의 방법으로 정제하고 분석한 결과, 재조합 DNA pBMT7는 약 9,300 염기쌍으로 구성되어 있고 도 9에 있는 바와 같은 제한 지도(restriction map)로 나타내어지는 구조를 가지고 있음이 확인되었다. 또한, 도 9에 있는 바와 같이 효소 M-11을 인코우드하는 2,316 염기쌍으로 구성된 DNA는 제한 효소인 Pst I 에 의해 분해 부위에 근접한 하류쪽에 위치하고 있음이 확인되었다.

실시예 1-3 : 형질 전환체에 의한 효소의 제조

2.0 w/v % 말토오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v % 효모 추출물, 0.1 w/v % 인 산수소 2 나트륨 및 0.1 w/v % 인산 2 수소 칼륨으로 된 액상 배지를 pH 7.0으로 조정하고 앰피실린 50 ㎍/㎖을 가하여 혼합한 다음 120℃에서 20 분간 오토클레이브 처리하고 냉각하여 실시예 1-2에서 수득한 형질 전환체 BMT7의 종배양액으로 접종한 후 37℃에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 형질 전환체를 배양하였다. 수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하고, 수득한 현탁액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 수득한 상청액에 대해 효소 활성을 측정한 결과, 이 배양액 1ℓ 에서 약 3,000 단위의 효소를 얻었다.

대조로서 대장균 XLI-블루우 또는 리조븀 sp, M-11의 종배양액을 앰피실린 무함유의 갓 제조한 신선한 동일 액상 배지에 접종하고, 리조븀 sp, M-11의 배양액의 경우에는 이것을 30℃의 배양 온도에서 위와 마찬가지로 배양하여 처리하였다. 수득물의 활성을 분석한 결과, 리조븀 sp. M-11의 배양액 1ℓ 에서 약 1500 단위의 효소를 얻었는데, 그 수율은 형질 전환체 BMT7보다 상당히 저하되어 있었다. 숙주로 사용된 대장균 XLI-블루우는 효소를 생성하지 않았다.

이어서 형질 전환체 BMT7에 의해 생성된 효소를 실험 1-1과 마찬가지로 정제하여 그 특성을 조사한 결과, 이것은 SDS-PAGE에서 약 76,000 ∼ 87,000 돌턴의 분자량과 등전점 전기 영동에서 약 3.6 ∼ 4.6의 등전점을 나타내어 실험 2에서와 실질적으로 동일한 물리 화학적 성질을 가지고 있음이 확인되었다. 또한, 이 결과로 부터 본 발명의 효소는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있으며, 따라서 그 수율은 상당히 증가함을 알 수 있다.

실시예 2 : 효소 M-11 유래의 상보 DNA 제조 및 그 염기 배열과 아미노산 배열의 결정

실시예 1-2의 방법으로 제조한 재조합 DNA pBMT7 2 ㎍을 달아 2 M 수산화 나트륨 수용액과 혼합하여 변성시킨 다음 적당량의 차가운 에탄올과 혼합하고 수득한 주형(template) DNA 함유 침강물을 채취하여 감압 건조하였다. 이 주형 DNA에 배열 리스트(SEQ ID NO : 7)의 염기 배열을 가진 화학 합성된 프라이머 1 50 pmole/㎖와 20 mM 염화 마그네슘 및 50 mM 염화 나트륨 함유의 40 mM Tris-HCI 완충액(pH 7.5)10 ㎕을 가하고 65℃에서 2 분간 항온 처리하여 어니일링시킨 후 혼합물을, dATP, dGTP 및 dTTP를 각각의 양으로 7.5 μ M, [α -³²-P]dCTP 0.5 ㎕ (2 mCi/㎖), 0.1 M 디티오트레이톨 1 ㎕ 및 1.5 단위/㎖ T7 DNA 폴리머라아제 2 ㎕을 함유하는 수용액 2 ㎕와 혼합한 다음 25℃에서 5 분간 항온 처리하여 5' 말단으로부터 3' 말단까지 프라이머 1을 연장시킴으로써 상보 체인 DNA를 생성시켰다.

상보 체인 DNA를 함유하는 반응 생성물을 1/4 부분으로 나누어 각각에다 80 μ M dNTP와 8 μ M ddATP, ddCTP, ddGTP, ddGTP 또는 ddTTP를 함유하는 50 mM 염화나트륨 수용액을 2.5 ㎕ 가하고, 수득한 혼합물을 37℃에서 5 분간 항온 처리한 다음 20 mM EDTA, 0.05 w/v % 브로모페놀 블루우 및 0.05 w/v % 크실렌 시아놀을 함유하는 95 v/v % 포름아미드 수용액 4 ㎕을 가하여 반응을 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 용기에 넣고 끓는 워터 배드(water-bath)에서 3 분간 가열한 후 6 w/v % 폴리아크릴아미드 함유 겔에 가하여 약 2000 볼트의 일정 전압으로 겔을 활성화시켜 전기 영동 처리함으로써 DNA 단편을 분리한 다음 통상의 방법으로 겔을 고정시키고, 건조하고 나서 자동 방사선 사진법으로 처리하였다.

방사선 사진에서 분리된 DNA 단편을 분석한 결과 상보 체인 DNA에는 배열 리스트(SEQ ID NO : 10)에 있는 바와 같은 2.936 염기쌍으로 구성된 염기 배열을 가지고 있음이 밝혀졌다. 이 염기 배열로부터 추정할 수 있는 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 10)에 나와 있는 바와 같은데, 이것을 배열 리스트(SEQ ID NO: 12, 14 또는 15)에 있는 효소 M-11의 부분 아미노산 배열과 N 말단을 가진 아미노산 배열과 비교해 본 결과 배열 리스트(SEQ ID NO :12)의 N 말단 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 10)의 1 ∼ 20 위치에서의 아미노산 배열에 상응하였으며, 배열 리스트(SEQ ID NO : 14 또는 15)의 부분 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 10)의 606 ∼ 626 위치 또는 486 ∼ 506 위치에서의 아미노산 배역에 상응한 것임이 확인 되었다. 이 결과로부터 리조븀 sp, M-11에서 생성된 효소는 배열 리스트(SEQ ID NO : 2)의 아미노산 배열을 가지고 있고, 미생물 유래의효소는 배열 리스트(SEQ ID NO : 1)에 있는 염기 배열을 가진 DNA에 의해 인코우드 되는 것임을 알 수 있다.

실시예 3 : 아르트로박터 sp. Q36 유래의 DNA를 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 제조

실시예 3-1 : 염색체 DNA의 제조

실시예 1-1에서와 마찬가지로 아르드로박터 sp. Q36으로부터 염색체 DNA를 분리하고 정제하여 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하여 농도 약 1 mg/㎖로 한 다음 이 용액을 -80℃에서 동결시켰다.

실시예 3-2 : 재조합 DNA pBQT13과 형질 전환체 BQT13의 제조

실시예 3-1에서 수득한 정제 염색체 DNA를 실시예 1-2에서와 마찬가지로 부분 분해시킨 다음 수크로오스 밀도 기울기 초원심 분리법으로 약 3,000 ∼ 6,000 염기쌍으로 구성된 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편을 실시예 1-2에서와 마찬가지로 Bam HI으로 처리한 블루우스크립트 II SK(+)의 세포 용해물에다 결찰시키고, 수득한 재조합 DNA를 대장균 XLI-블루우속에 도입하였다. 여기서 얻은 형질 전환체를 실시예 1-2에서와 마찬가지로 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β -D-갈락토시드 함유의 한천 플레이트에서 배양하고, 생성된 약 4,500 콜로니를 나일론 필름에 고정시키는 한편으로는 배열 리스트(SEQ ID NO : 8)에 있는 염기 배열을 가진 프로우브 3을 배열 리스트(SEQ ID NO : 17)에 있는 펩티드 단편 D의 아미노산 배열의 11~ 16 위치에 있는 Phe-Asp-Val-Asp-Trp-Asp에 의해 발현된 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 다음³²P로 표지하여 나일론 필름위에 고정시켜 둔 형질 전환체 콜로니로 하이브리다이제이션한 후 프로우브 3과 강력히 하이브리다이제이션된 8 개의 형질 전환체를 선택하였다.

실시예 1-2에서와 마찬가지로 목적으로 하는 재조합 DNA를 8 개의 형질 전환체로부터 선택하여 배열 리스트(SEQ ID NO : 16)에서의 16 ∼ 20 위치에 있는 아미노산 배열, 즉 Thr-Glu-Phe-Trp-Asp에 근거하여 화학적으로 합성한 배열 리스트(SEQ ID NO : 9)에 나온 염기 배열을 가진 프로우브 4와 하이브리다이제이션한 다음 프로우브 4와 강력히 하이브리다이제이션 된 재조합 DNA를 선택하였다. 이렇게 하여 선택한 재조합 DNA와 형질 전환체를 각자 pBQT13 및 BQT13으로 명명하였다.

형질 전환체 BQT13을 앰피실린 함유의 L 육즙에 식균하고 실시예 3-2에서와 마찬가지로 배양하여 수득한 배양액으로부터 증식된 세포를 회수한 다음 여기서 재조합 DNA를 추출하고 정제하여 분석한 결과, 재조합 pBQT13은 약 7,200의 염기쌍으로 구성되어 있고 도 10에 있는 제한도로 나타내어지는 구조를 가지고 있음이 확인되었다. 도 3에 있는 바와 같이 2,325 염기쌍으로 구성되어 있고 효소 Q36의 DNA를 인코우드하는 DNA가 Xmn I의 분열 부위에 인접한 하류에 위치하고 있음을 알 수 있다.

실시예 3-3 : 형질 전환체 BQT13에 의한 효소의 제조

2.0 w/v % 말토오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v % 효모 추출물, 0.1 w/v % 인산수소 2 나트륨 및 0.1 w/v % 인산 2 수소 칼륨으로 된 액상 배지를 pH 7.0으로 조정하고 앰피실린 50 ㎍/㎖을 가하여 혼합한 다음 120℃에서 20 분간 오토클레이브 처리하고 냉각하여 실시예 3-2에서 수득한 형전 전환체 BQT13의 종배양액으로 접종한 후 37℃에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 형질 전환체를 배양하였다. 수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하고, 수득한 현탁액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 수득한 상청액에 대해 효소 활성을 측정한 결과, 이 배양액 1ℓ 에서 약 2,450 단위의 효소를 얻었다.

대조로서 대장균 XLI-블루우 또는 아르드로박터 sp, Q36의 종배양액을 앰피실린 무함유의 갓 제조한 신선한 동일 액상 배지에 접종하고, 이것을 30℃의 배양 온도에서 위와 마찬가지로 배양하여 처리하였다. 수득물의 활성을 분석한 결과, 아르드로박터 sp, Q36의 배양액 1ℓ 에서 약 1,200 단위의 효소를 얻었는데, 그 수율은 형질 전환체 BQT13보다 상당히 저하되어 있었다. 숙주로 사용된 대장균 XLI-블루우는 효소를 생성하지 않았다.

이어서 형질 전환체 BMT7에 의해 생성된 효소를 실험 1-1과 마찬가지로 정제하여 그 특성을 조사한 결과, 이것은 SDS-PAGE에서 약 76,000 ∼ 87,000 돌턴의 분자량과 등전점 전기 영동에서 약 3.6 ∼ 4.6의 등전점을 나타내어 실험 2에서와 실질적으로 동일한 물리 화학적 성질을 가지고 있음이 확인되었다.

또한, 이 결과로부터 본 발명의 효소는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있으며, 따라서 그 수율은 상당히 증가함을 알 수 있다.

실시예 4 : 아르트로박터 sp. Q36 유래의 상보 체인 DNA 제조와 그 염기 배열 및 아미노산 배열의 결정

실시예 3-2에서 수득한 재조합 DNA pBQT13을 실시예 2와 마찬가지로 처리하여 주행 DNA를 생성시킨 다음 이것을 프라이머 1과 함께 어니일링한 후 T7 DNA 폴리미라아제를 작용시켜 5' 말단으로부터 3' 말단까지 프라이머 1을 연장시킴으로써 상보 체인 DNA를 수득하였다. 실시예 2와 마찬가지로 상보 체인 DNA를 디데옥시 체인 종결법으로 처리하여 방사선 사진위에 분리된 DNA 단편을 분석하였다. 이 결과로부터 알 수 있는 것은 상보 체인 DNA에는 3,073 염기쌍으로 구성된 염기 배열을 가지고 있고, 이 염기 배열로부터 추정 가능한 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 11)에 나와 있는 바와 같다. 이 아미노산 배열을 배열 리스트(SEQ ID NO : 13, 16 또는 17)의 부분 아미노산 배열과 N 말단 아미노산 배열에 대해 비교해 본 결과 배열 리스트(SEQ ID NO : 13)의 N 말단 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 11)의 1 ∼ 20 위치에 있는 것에 상응하였고, 배열 리스트(SEQ ID NO : 16 및 17)의 부분 아미노산 배열은 배열 리스트(SEQ ID NO : 11)의 110 ∼ 129 위치 또는 606 ∼ 625 위치에 있는 아미노산 배열에 상응한 것임을 확인하였다. 또한, 이 결과로부터 효소 Q36은 배열 리스트(SEQ ID NO : 4)의 아미노산 배열을 가지며, 이것은 배열 리스트(SEQ ID NO : 3)에 있는 염기 배열은 가진 DNA에 의해 인코우드됨을 알 수 있다.

실시예 5 : 재조합 효소의 제조

500 ㎖ 삼각 플라스크에 2.0 w/v % 말토오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v % 효모 추출물, 0.1 w/v % 인산수소 2 나트륨 및 0.1 w/v % 인산 2 수소 칼륨으로 된액상 배지(pH 7.0) 100 ㎖ 씩을 각각 넣고, 각 플라스크에 앰피실린 50 ㎍/㎖을 가하고 120℃에서 20 분간 오토클레이브 처리를 하였다. 이어서 각 플라스크를 냉각하고 실시예 1-2에서 얻는 형질 전환체 BMT7로 접종한 다음 27℃에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 형질 전환체를 배양하였다. 이것과는 별도로, 갓 제조한 동일한 액상 배지 18ℓ 를 삼각 플라스크에 넣고 앰피실린 50 ㎍/㎖을 가하여 120℃에서 20분간 멸균 처리한 다음 냉각하고 위에서 얻은 종배양액 1 v/v %로 접종한 후 통기 교반하에 37℃에서 24 시간 배양하였다. 수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하고, 수득한 현탁액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 수득한 상청액에 대해 효소 활성을 측정한 결과, 이 배양액 1ℓ 에서 약 3,000 단위의 효소를 얻었다. 상청액을 실험 1-1의 방법으로 정제하여 비활성이 약 200 단위/mg 단백질인 재조합 효소를 약 135 단위/㎖ 함유한 수용액을 약 50 ㎖ 얻었다.

실시예 6 : 재조합 효소의 제조

실시예 3-2의 방법으로 제조한 재조합 형질 전환체 BQT13를 실시예 5와 마찬가지로 배양하고, 수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하였다. 수득한 현탁액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하고 수득한 상칭액에 대해 효소 활성을 측정한 결과 배양액 1ℓ 당 약 2,450 단위의 효소를 생성하였다. 상청액을 실험 1-1의 방법으로 정제하여 비활성이 약 200 단위/mg 단백질인 재조합 효소를 약 120 단위/㎖ 함유한 수용액을 약 45 ㎖ 얻었다.

실시예 7 : 재조합 효소에 의한 전분 가수 분해물의 전환

감자 전분을 물속에 현탁시켜 6 w/w % 현탁액을 만들어 이것을 120℃에서 10분간 오토클레이브 처리하여 전분을 호화하였다. 호화 전분을 신속히 50℃로 냉각하고 pH 약 4.5로 조정하여 이소아밀라아제 표품(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사 판매)을 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 2,500 단위와 혼합한 다음 50℃에서 20 시간 동안 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 pH 6.0으로 조정하고 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존 효소를 실활시킨 후 신속히 45℃로 냉각하여 α -아밀라아제 표품인 "TERMAMYL 60L" (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S 판매)을 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 150 단위와 혼합한 다음 45℃에서 24 시간 효소 반응시켜 글루코오스 중합도가 3 이상인 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스 등의 환원성의 전분질 당류를 함유하는 반응 혼합물을 얻었다. 이 반응 혼합물을 120℃에서 20 분간 오토클레이브 처리하여 잔존효소를 실활시키고 45℃로 급냉하여 실시예 5에서 얻은 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 1 단위 가하여 혼합하고 45℃에서 96 시간 효소 반응 시켰다. 수득한 반응 혼합물을 96℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 냉각하여 여과한 다음, 여액을 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고. 탈염하여 이온 교환체로 정제한 후 농축하여 건조 고형분 기준으로 약 70 w/w % 시럽을 약 91% (건조 고형분 기준)의 수율로 얻었다.

실험 2-1의 방법으로 실시한 시럽의 분석 결과로부터 이 제품의 DE(덱스트로오스 당량 : dextrose eqivalent)가 약 18.7이고 건조 고형분 기준으로 8.4 w/w %α -글루코실 트레할로오스, 5.6 w/w % α -말토실 트레할로오스, 37.9 w/w % α -말토트리오실 트레할로오스를 주성분으로 함유하고 있었으며, 위에 나온 환원성 당류의 대부분이 이들의 각기 상응한 비환원성 당류로 전환되었음이 확인되었다. 이 제품은 온화한 중간 정도의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로 만족하게 사용할 수 있다. 이 제품은 비환원성 당류를 비교적 많이 함유하고 있으므로 트레할로오스 제조시 중간체로 사용할 수도 있다.

실시예 8 : 재조합 효소에 의한 전분 가수 분해물의 전환

감자 전분을 물에 현탁하여 건조 고형분 기준으로 농도 33 w/w %로 하고 이 현탁액에 건조 고형분 기준으로 0.1 w/w % 탄산 칼슘과 혼합하였다. 수득한 현탁액에 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 α -아밀라아제 표품인 "TERMAMYL 60L" (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S 판매)을 0.2 w/w % 가하여 혼합한 다음 95℃에서 15 분간 효소 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존효소를 실활한 다음 급냉하고 일본국 특허 공개 제240,784/88호에 개시된 슈우도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) 유래의 말토테트라오스 생성 효소를 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 5 단위 가해 혼합한 후 55℃에서 6 시간 동안 효소 반응시켰다. 이어서 수득한 반응 혼합물을 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 α -아밀라아제 표품인 "α -아밀라아제 2A" (일본국의 Ueda Chemical사 판매)30 단위와 혼합하고 65℃에서 4 시간 효소 반응시켜 글루코오스 중합도가 3 이상인 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스 등의 환원성의 전분질 당류 약 50 w/w % (건조 고형분)을 생성하였다. 수득한 혼합물을 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존 효소를 실활하고 45℃로 급냉한 다음 pH 4.5로 조정하여실시예 5에서 제조한 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 전분질 당 1 g 당 2 단위 가하여 혼합한 후 45℃에서 64 시간 효소 반응시켰다. 수득한 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 여과한 다음 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 탈염하여 이온 교환체로 정제한 후 농축하여 건조 고형분 기준으로 농도 약 70 w/w %의 시럽상 제품을 원료인 전분에 대하여 건조 고형분 기준으로 약 90 %의 수율로 얻었다.

실험 2-1의 방법으로 시럽상 제품을 분석한 결과 이것의 DE는 10.5이었고 건조 고형분 기준으로 3.8 w/w % α -글루코실 트레할로오스, 43.8 w/w % α - 말토실트레할로오스 및 1.2 w/w % α -말토트리오실 트레할로오스를 주성분으로 함유하고 있었으며, 여기에 함유된 환원성의 전분질 당류의 대부분이 이들의 각기 상응한 비환원성 당류로 전환되었음이 확인되었다. 이 제품은 온화한 중간정도의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제 등으로 만족하게 사용할 수 있다. 이 제품은 비환원성 당류를 비교적 고함량으로 함유하므로 트레할로오스 제조시 중간체로 사용할 수도 있다.

실시예 9 : 재조합 효소에 의한 말토펜타오스의 전환

고순도 말토펜타오스(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사제)를 물에 용해하여 농도 20 w/w % (건조 고형분 기준)로 하고, 이 용액을 pH 6.5로 조정하여 실시예 5에서 제조한 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 말토펜타오스 1 g 당 1 단위 가해 혼합한 다음 45℃에서 48 시간 효소 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 95℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각, 여과한 후 농축하여 실험 2-1의 방법으로 분석한 결과, 원료인 말토펜타오스 약 92 w/w %(건조 고형분 기준)가 α -말토트리오실 트레할로오스로 전환되었음이 확인되었다.

자켓부 스테인레스강 칼럼(직경 5.4 cm, 길이 5 m) 4 개에 각각 강산성 양이온 교환 수지(일본국 Tokyo Organic Chemical Industries사 판매의 "XT-1016(Na형)")를 균일하게 충전하고 직열로 연결하여 칼럼의 총길이를 20 m로 하였다. 위에서 얻은 반응 혼합물을 수지에 대하여 약 5 v/v %의 유속으로 컬럼 내부 온도 55℃ 에서 칼럼속으로 공급한 다음 이 칼럼에 SV(공간 속도) 0.13에서 55℃의 열수를 공급하여 당성분을 용출시켰다. 용출액중의 당 조성 분석 결과에 따라 비환원성 당류 고함유 획분을 채취하여 한데 모아 농축, 감압 건조후 분쇄하여 고형 분말을 건조 고형분 기준으로 약 55 %의 수율로 얻었다.

실험 2-1의 방법으로 고형 제품을 분석한 결과로부터 이것의 DE는 약 0.2 이하이었고 건조 고형분 기준으로 99.0 w/w % α -말토트리오실 트레할로오스를 함유하고 있었음을 확인하였다. 이 제품은 흡습성이 비교적 적고 환원성이 충분히 낮으며 약간의 감미를 가지고 있어서 식품, 화장품 및 의약품에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조세로서 만족스럽게 사용할 수 있다. 또한, 이 제품은 비환원성 당류의 함량이 비교적 많으므로 트레할로오스 제조시 중간체로 사용할 수도 있다.

실시예 10 : 재조합 효소에 의한 전분 가수 분해물의 전환

"PINE-DEX #4" (일본국의 Matsutani Chemical Ind.사제의 전분 가수 분해물)

을 물에 용해하여 건조 고형분 기준으로 농도 40 w/w %로 하고, 이 용액을 45℃로 가열하여 pH 6.5로 조정한 다음 실시예 5에서 제조한 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 전분 가수분해물 1 g 당 1 단위 가하여 혼합하여 45℃에서 96 시간 효소 반응시켜 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다. 이어서 이 반응 혼합물을 100℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 농축하여 건조 고형분 기준으로 20 w/w % 이하의 용액을 얻은 다음 55℃로 냉각하고 pH 4.5로 조정하여 글루코아밀라아제 표품인 "GLUCOZYME" (일본국의 Nagase Biochemicals사 판매)을 건조 고형분 기준으로 당 1 g에 대해 10 단위 가해 혼합한 후 40 시간 효소 반응시켰다, 이 반응 혼합물을 100℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 탈염한 다음 이온 교환체로 정제한 후 농축하여 건조 고형분 기준으로 약 29.7 w/w %트레할로오스를 함유하는 약 60 w/w %시럽상 제품을 얻었다.

"CG 6000(Na⁺형)"을 사용한 외에는 실시예 9와 마찬가지로 시럽상 제품을 분획한 다음 건조 고형분 기준으로 약 90 w/w % 트레할로오스를 함유하는 획분을 채취하여 한데모아 농축하여 약 75 w/w % 용액을 얻어 이것을 결정화기에 넣고, 당류에 대해 종정으로서 건조 고형분 기준으로 약 2 w/w % 트레할로오스 수화물을 가해 혼합하여 완만히 교반하면서 결정화하여 결정화도가 약 45 %인 매스키트(massecuite)를 얻었다. 이 매스키트를 분무탑의 상부에 장치된 노즐을 통해 약 150 kg/cm²의 압력으로 아래쪽으로 분무하면서 분무탑의 상부로부터는 약 85℃의 열풍을 아래쪽으로 불어주어 분무탑의 바닥에 설치된 벨트 컨베이어 위에 결정 분말을 축적시킨 다음 건조탑으로부터 서서히 배출하였다. 그 후, 이 분말을 숙정탑에 도입하여 내용물에다 약 40℃의 열풍을 불어주면서 10 시간 숙성함으로써 결정화와 건조를 완료하였다.

이 제품은 실질적으로 비흡습성이고 온화하고 고품위의 감미를 가지고 있으므로 식품, 화장품, 의약품 및 사료 등에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로 만족하게 사용할 수 있다.

실시예 11 : 재조합 효소에 의한 전분 가수 분해물의 전환

타피오카 전분을 물에 용해하여 농도 34 w/w %로 하고, 0.1 w/w % 탄산칼슘을 가해 혼합하였다. 현탁액에 α -아밀라아제 표품인 "TERMAMYL 60L" (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S사 판매)을 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 0. 2 w/w % 가하고 95℃에서 15 분간 효소 반응시켜 전분을 액화하였다. 액화 전분을 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존 효소를 실활하고 55℃로 급냉하여 pH 5.2로 조정하고 α -아밀라아제 표품인 "α -아밀라아제 2A" (일본국의 Ueda Chemical사 판매)을 건조 고형분 기준으로 전분 1 g 당 10 단위와 이소아밀라아제 표품(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories사 판매) 500 단위를 가해 혼합한 다음 55℃에서 20 시간 효소 반응시켜 글루코오스 중합도가 3 이상인 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스 및 말토헥사오스 등의 환원성의 전분질 당류를 건조 고형분 기준으로 약 60 w/w % 함유하며 DE 약 29의 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존 효소를 실활하고 45℃로급냉하여 pH 6.5로 조정한 다음 실시예 6의 방법으로 제조한 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 전분질 당 1 g에 대하여 2 단위 가하여 혼합하고 45℃에서 64 시간 효소 반응시켰다. 수득한 반응 혼합물을 95℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고, 냉각, 여과한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 탈염하여 이온 교환체로 정제한 다음 농축하여 건조 고형분 기준으로 약 70 w/w % 농도의 시럽상 제품을 원료 전분에 대해 건조 고형분 기준으로 약 90 %의 수율로 얻었다.

실험 2-1의 방법으로 시럽상 제품을 분석한 결과, DE는 15.8이었고 건조 고형분 기준으로 5.8 w/w % α -글루코실 트레할로오스, 8,5 w/w % α -말토실 트레할로오스, 13,1 w/w % α -말토트리오실 트레할로오스, 18.9 w/w % α -말토테트라오실트레할로오스 및 3.6 w/w % α -말토펜타오실 트레할로오스를 주성분으로 함유하고 있었으며, 여기에 함유된 환원성의 전분질 당류 대부분은 이들의 각기 상응한 비환원성 당류로 전환되었음을 확인하였다. 이 제품은 온화한 중간 정도의 감미와 적당한 점성 및 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품 등에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로 만족하게 사용할 수 있다. 또한, 이 제품은 비환원성 당류를 비교적 많이 함유하므로 트레할로오스 제조용 중간체로 사용할 수도 있다.

실시예 12 : 재조합 효소에 의한 가수 분해물의 전환

실시예 8과 마찬가지로 액화 감자 전분에 말토테트라오스 생성 효소와 α -아밀라아제를 연속해서 작용시켜 글루코오스 중합도가 3 이상인 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스 등의 환원성의 전분질 당류를 건조 고형분 기준으로약 50 w/w % 함유하는 혼합물을 제조하였다. 이 반응 혼합물을 120℃에서 10 분간 오토클레이브 처리하여 잔존 효소를 실활하고 45℃로 급냉하여 pH 6.5로 조정한 후 실시예 6의 방법으로 제조한 재조합 효소를 건조 고형분 기준으로 전분질 당 1 g에 대하여 2 단위 가하여 혼합한 다음 45℃에서 64 시간 효소 반응시켰다. 수득한 반응 혼합물을 95℃에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고, 냉각 및 여과한 다음 여액을 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 탈염하여 이온 교환체로 정제한 후 농축하여 약 70 w/w % 시럽상 제품을 원료 전분에 대하여 건조 고형분 기준으로 약 90 w/w %의 수율로 얻었다.

실험 2-1의 방법으로 시럽상 제품을 분석한 결과, DE는 10.3이었고 건조 고형분 기준으로 3.6 w/w % α -글루코실 트레할로오스, 44.0 w/w % α -말토실 트레할로오스 및 1.0 w/w % α -말토트리오실 트레할로오스를 주성분으로 함유하고 있었으며, 시럽상 제품에 함유된 환원성의 전분질 당류 대부분은 이들의 각기 상응한 비환원성 당류로 전환되었음을 확인하였다.

이 제품은 온화한 중간 정도의 감미와 적당한 점성 및 보습성을 가지고 있어서 식품, 화장품 및 의약품 등에 있어서 감미제, 맛개선제, 품질개전제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로서 만족스럽게 사용할 수 있다. 또한, 이 제품은 비환원성 당류를 비교적 많이 함유하므로 트레할로오스 제조용 중간체로 사용할 수도 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성 당류로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류를 생성하는 신규의 효소의 발견에 근거한 것이다. 본 발명은 재조합 DNA 기법으로 이 효소를 비교적 대규모로 상당히 높은 수율로 제조하는 방법을 탐색한 것이다. 본 발명의 재조합 효소를 사용하는 전환 방법에 의해 환원성의 전분질 당류를, 온화한 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지나 분자내에 환원성 잔기가 없고, 불필요한 착색이나 열화를 일으킬 우려가 없이 시품에 감미를 부여할 수 있는 각각 상응한 비환원성 당류로 효과적으로 전환시킨다. 더욱이, 본 발명의 재조합 효소는 전체 아미노산 배열이 확인된 것이므로 부작용의 우려가 없이 식품에 사용할 수 있는 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당류와 트레할로오스 제조시에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 위와 같은 현저한 작용, 효과를 나타내고 산업에 큰 기여를 할 수 있는 중요한 발명이다.

도 1은 효소 M-11의 최적 온도를 나타내는 그래프.

도 2는 효소 Q36의 최적 온도를 나타내는 그래프.

도 3은 효소 M-11의 최적 pH를 나타내는 그래프.

도 4는 효소 Q36의 최적 pH를 나타내는 그래프.

도 5는 효소 M-11의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

도 6은 효소 Q36의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

도 7은 효소 M-11의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

도 8은 효소 Q36의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

도 9는 본 발명에 의한 재조합 DNA pBMT7의 제한도로서, 이 도면에서 굵은 선으로 나타낸 부분은 효소 M-11을 인코우드하는 DNA.

도 10은 본 발명에 의한 재조합 DNA pBQT13의 제한도로서, 이 도면에서 굵은 선으로 나타낸 부분은 효소 Q36을 인코우드하는 DNA.

Claims

글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당으로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성의 당을 생성하는 효소를 인코우드하는 DNA로서, (가) 상기 DNA는 리조븀속, 아르드로박터속, 브레비박테륨속, 플라보박테륨속, 마이크로코저스속, 쿠르토박테륨속, 마이코박테륨속 및 테라박터속의 미생물로 된 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래하고, 또한 아래의 SEQ ID NO : 1과 SEQ ID NO : 3에 나와 있는 바와 같은 5' 말단에서 시작하는 염기 배열들을 가지며, (나) 상기 효소는 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 4에 나와 있는 바와 같은 N 말단에서 시작하는 아미노산 배열들로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 배열을 가지고, 또한아래와 같은 물리 화학적 성질을 가진 것인 DNA.

효소의 물리 화학적 성질

(1) 분자량

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에서 76,000 ∼ 87,000 돌턴.

(2) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동에서 3.6 ∼ 4.6
제1항에 있어서, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 1 및 SEQ ID NO : 3에서의 염기 하나 이상을, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 2 및 SEQ ID NO : 4에서의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 유전 코우드의 축중에 의해 다른 염기로 치환된 DNA.
제1항에 있어서, SEQ ID NO : 10 또는 SEQ ID NO : 11에 나온 염기 배열을가진 DNA.
제1항의 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 DNA.
제4항에 있어서, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 1과 SEQ ID NO : 3에서의 염기 하나 이상을, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 4의 각기 상응한 아미노산 배열을 바꾸지 않고 유전 코우드의 축중에 의해 다른 염기로 치환된 복제 가능한 DNA.
제4항에 있어서, 제3항에서 정의된 SEQ ID NO : 10과 SEQ ID NO : 11의 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기 배열을 가진 복제 가능한 DNA.
제4항에 있어서, 상기 자체 복제가 가능한 벡터가 플라스미드 벡터Bluescript II SK(+)인 복제 가능한 DNA.
적당한 숙주속에 자체 복제가 가능한 벡터와 제1항의 DNA를 함유한 DNA를 도입하여 수득되는 박테리아.
제8항에 있어서, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 1과 SEQ ID NO : 3의 염기 하나 이상을, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 4에서의 각기 상응한 아미노산 배열을 바꾸지 않고 유전 코우드의 축중에 의해 다른 염기로 치환된 박테리아.
제8항에 있어서, 상기 제1항의 DNA가 제6항에서 정의된 SEQ ID NO : 10과 SEQ ID NO : 11에 있는 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기 배열을 가진 박테리아.
제8항에 있어서, 상기 자체 복제가 가능한 벡터가 플라스미드벡터Bluescript II SK(+)인 박테리아.
제8항에 있어서, 상기 숙주가 대장균(Escherichia coli) 종의 미생물인 박테리아.
글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당으로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당을 생성하는, 제8항의 박테리아로부터 수득되는 재조합 효소로서, (가) 상기 DNA는 리조븀속, 아르드로박터속, 브레비박테륨속, 플라보박테륨속, 마이크로코커스속, 쿠르토박테륨속, 마이코박테륨속 및 테라박터속의 미생물로된 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래하고, (나) 상기 효소는 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 4에 나와 있는 바와 같은 N 말단에서 시작하는 아미노산 배열들로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 배열을 가지고, 또한 아래와 같은 물리 화학적 성질을 가진 것인 재조합 효소.

효소의 물리 화학적 성질

(1) 분자량

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에서 76,000 ∼ 87,000 돌턴,

(2) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동에서 3.6 ∼ 4.6
제13항의 재조합 효소를 생성할 수 있는 제8항의 박테리아를 영양배지에서 배양하고, 생성된 재조합 효소를, 수득한 배양액으로부터 채취하는 것을 포함하는 제13항의 재조합 효소의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 박테리아는, 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당으로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당을 생성하는 효소를 인코우드하는 제1항의 DNA와 자체 복제가 가능한 벡터를 가진 DNA를 적당한 숙주속에 도입하여 수득되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 효소를 인코우드하는 상기 DNA는, 제1항에서의 정의된 SEQ ID NO : l과 SEQ ID NO : 3에 있는 바와 같은 5' 말단에서 시작하는 염기 배열 들과, 상기 효소의 고유활성을 실질적으로 변화함이 없이 SEQ ID NO : 1 및 SEQ ID NO : 3에서의 염기 하나 이상을 다른 염기로 치환하여 얻어지는 SEQ ID NO : 1 및 SEQ ID NO : 3에 대해 상보성의 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가짐을 특징으로 하는 제조 방법.
제16항에 있어서, 상기 효소를 인코우드하는 상기 DNA는, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO : 4의 각기 상응한 아미노산 배열을 바꾸지 않고 하나 이상의 염기가 유전 코우드의 축중에 의해 다른 염기로 치환되는, 제1항에서 정의된 SEQ ID NO : 1과 SEQ ID NO : 3의 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 효소는, 제3항에서의 정의된 SEQ ID NO : 10과 SEQ ID NO : 11의 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기 배열을 가지는 DNA에 의해 인코우드되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 박테리아는, 숙주로서 대장균(Escherichia coli) 종의 미생물을 사용하여 제조되는 것인 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 박테리아는, 자체 복제가 가능한 벡터로서 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+)를 사용하여 제조되는 것인 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 박테리아를 pH 2~8의 액상 배지에 접종하여 25~65℃의 온도에서 1 ∼ 6일 동안 배양함을 특징으로 하는 제조 방법.
제14항에 있어서, 배양액 중의 상기 효소를 원심 분리, 여과, 농축, 염석, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동으로 된 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 방법으로 채취하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
환원성의 전분질 당의 전환 방법의 개량으로서, 그 개량된 것이 제25항의 효소를 생성할 수 있는 제8항의 박테리아를 배양하여 생성된 효소를 배양액으로부터 채취함으로써 제13항의 효소를 제조하고, 글루코오스 중합도가 3 이상인 환원성의 전분질 당에 상기 재조합 효소를 작용시켜 전분질 당으로부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당을 생성시키는 단계를 포함하는 환원성의 전분질 당의 전환 방법.
제23항에 있어서, 상기 환원성의 전분질 당은 전분 가수 분해물과, 아밀라아제에 의한 처리 또는 무처리된 전분 물질로 된 군으로부터 선택되는 1 종인 것을 특징으로 하는 전환 방법.
제23항에 있어서, 상기 환원성의 전분질 당은 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 이들의 혼합물로 된 군으로부터 선택되는 1 종인 것을 특징으로 하는 전환 방법.
제23항에 있어서, 환원성 전분질 당은 농도가 50 w/v %또는 그 이하인 용액 형태이고, 40 ∼ 55℃의 온도 및 pH 5 ∼ 10에서 공정 단계를 실시함을 특징으로 하는 전환 방법.
제23항에 있어서, 상기 비환원성 당은 α -글루코실 트레할로오스, α -말토실트레할로오스, α -말토트리오실 트레할로오스, α -말토테트라오실 트레할로오스, α -말토펜타오실 트레할로오스 및 이들의 혼합물로 된 군으로부터 선택되는 1 종인 것을 특징으로 하는 전환 방법.