KR100532847B1

KR100532847B1 - β-프룩토푸라노시다아제활성을가진폴리펩티드

Info

Publication number: KR100532847B1
Application number: KR1019970023853A
Authority: KR
Inventors: 게이지 쓰사키; 미치오 구보타; 히로토 차엔
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2006-02-01
Also published as: TW555854B; KR980002064A; AU2476297A; US5962297A; EP0812915A3; EP0812915B1; CA2205080A1; DE69739053D1; AU721607B2; EP0812915A2

Abstract

미생물 유전자 발현에 의해 수득되는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA, 이 DNA를 적당한 숙주속에 도입하여 수득되는 형질 전환체, 이 형질 전환체를 배양하여 폴리펩티드를 생성시키고 생성된 폴리펩티드를 배양물로부터 채취하는 폴리펩티드의 제조방법 및 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체를 폴리펩티드 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는 프룩토푸라노실 전이 방법이 개시되어 있다.

Description

β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드

본 발명은 효소활성을 가진 폴리펩티드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미생물 유전자의 발현에 의해 수득되는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드에 관한 것이다.

크실로실프룩토시드와 락토수크로오스 등의 프룩토푸라노실 전이당은 비피드균에 대한 강력한 항발암 작용 및 성장촉진 작용을 가지고 있어서 식품, 의약 등의 산업분야에 있어서 수크로오스를 대체할 수 있는 감미료로서 최근 각광을 받고 있다. 프룩토푸라노실 전이당은 통상적으로 β-프룩토푸라노시다아제를 사용하여 원료로서 수크로오스 및 전분당 또는 락토오스와 효소를 접촉시킴으로써 제조되고 있다. 바실루스속(Bacillus屬)과 아르드로박터속(Arthrobacter屬)에 속하는 미생물 유래의 β-프룩토푸라노시다아제는 광범위하게 이용되고 있다. 그러나 이들 미생물의 효소 산생능(産生能)은 비교적 낮으므로 미생물의 대량 배양에 상당한 결점으로 작용한다.

재조합 DNA 기술의 최근의 발전은 괄목할만하다. 전체 아미노산 서열이 밝혀지지 아니한 효소라 하더라도, 이 효소를 코우드하는 유전자가 분리되어 뉴클레오티드 서열이 해독되어 있을 경우에만, 이 효소를 코우드하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 제조하고, 이것을 미생물 또는 동식물의 세포속에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음, 이 형질 전환체를 영양배지에서 배양함으로써 소요량을 비교적 용이하게 얻을 수 있다. 이러한 사정을 고려하면 β-프룩토푸라노시다아제를 코우드하는 유전자를 얻어 규명해야 하는 것이 급선무이다.

이상의 상황을 감안하여 본 발명의 제1목적은 재조합 DNA 기술을 응용하여 비교적 대규모로 용이하게 생산할 수 있는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공함에 있다.

본 발명의 제2목적은 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 제공함에 있다.

본 발명의 제3목적은 DNA가 도입되는 형질 전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 제4목적은 이 형질 전환체를 사용하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제5목적은 이 폴리펩티드를 사용하는 프룩토푸라노실의 전이방법을 제공함에 있다.

상기한 목적들을 해결하고자 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, β-프룩토푸라노시다아제 활성과 부분 아미노산 서열로서 전부 또는 일부의 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 아미노산 서열을 가지고 있으며 미생물 유전자 발현에 의해 소요량을 쉽사리 얻을 수 있는 폴리펩티드를 발견하였다.

본 발명의 제1목적은 β-프룩토푸라노시다아제 활성과 부분 아미노산 서열로서 전부 또는 일부의 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 아미노산 서열을 가지고 있으며 미생물 유전자 발현에 의해 얻을 수 있는 폴리펩티드에 의해 해결된다.

본 발명의 제2목적은 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA에 의해 해결된다.

본 발명의 제3목적은 DNA가 도입되는 형질 전환체에 의해 해결된다.

본 발명의 제4목적은 이 형질 전환체를 배양하고, 생성된 폴리펩티드를 배양물로부터 채취하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 의해 해결된다.

본 발명의 제5목적은 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체를 상기 폴리펩티드의 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는 프룩토푸라노실의 전이방법에 의해 해결된다.

본 발명을 설명함에 있어서 본 발명에서 언급되는 "폴리펩티드"란 용어는 미생물 유전자의 발현에 의해 수득되고 부분 아미노산 서열로서 전체 또는 일부의 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 아미노산 서열을 가진 일반적인 폴리펩티드를 의미하며 이들을 모두 포함한다. 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드는 일부 또는 완전히 밝혀진 아미노산 서열을 가지고 있다. 예컨대 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 가진 것들을 들 수 있다. β-프룩토푸라노시다아제의 활성 외에도 이러한 폴리펩티드는 적당한 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체 사이의 프룩토푸라노실 전이를 촉진하며 아래의 물리화학적 성질을 가지고 있다.:

(1) 분자량

SDS-PAGE에서 약 44,000∼54,000 달톤;

(2) 최적 pH

40℃에서 10분간 유지했을 경우 약 5.5∼6.0;

(3) 최적 온도

pH 6.0에서 10분간 유지했을 경우, 칼슘 이온 부재하에서는 약 45℃이고 칼슘이온 존재하에서는 약50℃;

(4) pH 안정성

4℃에서 24시간 유지했을 경우 pH 약 5.0∼8.0 에서 안정함;

(5) 열적 안정성

pH 6.0에서 1시간 유지했을 경우 온도 약 45℃까지 안정함.

폴리펩티드의 물리화학적 성질과 숙주중에서의 폴리펩티드의 발현 레벨을 향상시키고자 이 기술분야에서는 다음과 같이 실시할 수 있다. 즉, (가) 폴리펩티드의 아미노산 서열중의 아미노산 한 개 이상을 인위적으로 다른 아미노산으로 치환할 수 있고, (나) 폴리펩티드의 N말단 및 C말단에 인접한 아미노산 한 개 이상 및/또는 내부부위에 있는 아미노산 한 개 이상을 결손시킬 수 있으며, (다) 아미노산 한 개 이상을 폴리펩티드의 N말단 및/또는 C말단에 부가할 수도 있다. 물론, 이러한 아미노산 서열변경은 본 발명의 폴리펩티드에도 적용가능하다. 동일한 유전자를 사용할 경우에 있어서도 형질 전환체의 배양조건과 숙주의 종류에 따라서는 숙주의 내부효소에 의한 DNA 발현후에 변형시킴으로써 아미노산 서열번호(SEQ ID NO:) 1 내지 3의 N말단 및 C말단에 인접한 아미노산 한 개 이상을 결실시켜도 좋다. 이러한 점에 있어서 본 발명의 폴리펩티드는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가지고 있고 부분 아미노산 서열로서 전부 또는 일부 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 아미노산 서열을 가지고 있는 한, 전체로서 서열번호(SEQ ID NO:) 3과 상이한 아미노산 서열을 가진 것들을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 미생물 유전자의 발현에 의해 얻을 수 있는데, 통상적으로는 숙주 미생물로서 에세리히아 콜리, 방선균속(actinomyces), 효모 및 바실루스속에 속하는 미생물을 사용하여 숙주중에서 바실루스속, 특히 바실루스 sp. V230 속에 속하는 미생물 유래의 유전자를 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는 뉴클레오티드 서열번호(SEQ ID NO:) 4, 특히 서열번호(SEQ ID NO:) 5를 가진 것들과 서열번호 5에 상보적인 DNA를 가진 것들 및 이들이 코우드하는 아미노산 서열을 바꿈이 없이 유전 코우드의 축중에 대하여 상기 뉴클레오티드 서열에서의 염기 한 개 이상을 다른 염기로 치환하여 얻은 DNA를 가진 것들을 들 수 있다. 유전자가 숙주 중에서 본 발명의 폴리펩티드를 용이하게 발현하도록 하자면 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA중의 염기 한 개 이상을 다른 염기로 치환하거나, 적당한 인핸서(enhancer)와 프로모우터(promoter)를 DNA에 연결시킬 수 있다.

천연 유전자 또는 인공합성 유전자로서 상기한 DNA중 어떠한 DNA라도 함유하고 있는 것이면 본 발명에서 사용할 수 있다. 이러한 유전자의 천연 공급원으로서는 바실루스 sp. V230 균주 등의 바실루스속 미생물을 포함하며, 이들 미생물로부터는 본 발명에서 사용되는 DNA를 가진 유전자를 얻을수 있는데, 즉, 미생물의 종배양물을 영양배지에서 접종하여 호기적 조건하에서 약 1∼3일 동안 미생물을 배양하고, 증식된 세포를 배양물로부터 채취하여 세포벽 용해효소 또는 초음파에 의해 처리함으로써 소요의 DNA를 함유한 유전자를 균체 밖으로 용출시켜 얻는다. 이들 효소는 프로테아제 등의 단백질 분해 효소와 병용할 수 있으며, 초음파 처리시에는 SDS 등의 계면활성제 존재하에 실시하거나 동해법(freezing-thawing method)과 병용하여 실시할 수 있다. 수득한 혼합물 페놀 추출법, 알코올 침전법, 원심분리법, 프로테아제 처리법, 리보뉴클레아제 처리법 등의 일반적인 방법을 적용함으로써 소요의 DNA를 채취한다. DNA를 인공합성하자면 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 뉴클레오티드 서열에 근거하여 화학합성하거나 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 코우드하는 DNA를 자체 복제성 벡터 속에 삽입하여 재조합 DNA를 얻고, 이것을 적당한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 얻은후, 배양물로부터 증식된 형질 전환체를 채취하여 이 형질 전환체로부터 DNA를 함유한 소요의 플라스미드를 제조함으로써 얻을 수도 있다. 바실루스 sp. V230 균주를 일본국의 오카야마의 토양으로부터 분리하여 미생물 국제 기탁기관(일본국의 Agency of Industrial Science and Technology 산하의 the Fermentation Research Institute)에 1995년 3월 24일자로 기탁하였다. 이 미생물은 상기 기탁기관에서 수탁번호 FERM BP-5054로 유지보관되어 있다.

상기한 DNA는 일반적으로 재조합 DNA 형태로서 숙주중에 도입된다. 일반적으로 재조합 DNA에는 상기한 DNA와 자체 복제성 벡터를 함유하며, 이들은 원료인 DNA가 입수되어 있을 경우에는 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 쉽사리 제조할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHY300PLK, pHV14, TRp7, TEp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터와 λgt·λC, λgt·λB, ρ11, φ1, φ105 등의 파아지 벡터를 들 수 있다. 이들 플라스미드 벡터와 파아지 벡터 중에서 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), λgt·λC 및 λgt·λB는 본 발명의 DNA를 에세리히아 콜리중에서 발현시켜야 할 때 만족하게 사용할수 있는 반면 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, 및 φ105는 본 발명의 DNA를 바실루스속 미생물에서 발현시킬때 만족하게 사용할 수 있다. pHY300PLK, pHV14, TRp7, TEp7 및 pBS7 등의 플라스미트 벡터는 재조합 DNA를 2종 이상의 숙주중에서 성장시키고자 할때 유리하다.

본 발명의 DNA를 벡터중에 삽입하는 방법으로서는 이 기술분야에서 종래에 일반적으로 사용되고 있는 방법을 포함한다. 예컨대 본 발명의 DNA와 자체 복제성 벡터를 함유한 유전자를 먼저 제한효소 및/또는 초음파로 분해한 다음, 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 이들 단편의 연결은 뉴클레오티드, 상세하게는 타입 II 제한효소, 보다 상세하게는 Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I, Pst I 등에 특이하게 작용하는 제한효소에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 필요한 경우, 이들 DNA 및 벡터 단편들을 어니일링한 후에 여기에 DNA 리가아제를 생체내 또는 생체외에서 작용시켜 이들을 연결할 수 있다. 이렇게 하여 수득한 재조합 DNA를 적당한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 영양배지에서 배양함으로써 실질적으로 제한없이 복제할 수 있다.

이렇게 하여 수득한 재조합 DNA를 에세리히아 콜리를 비롯한 적당한 숙주 미생물 및 바실루스속, 방선균속, 효모 등의 적당한 숙주 미생물속에 도입할 수 있다. 에세리히아 콜리를 숙주로 사용할 경우에 있어서, 재조합 DNA 및 칼슘 이온 존재하에 숙주를 배양함으로써 재조합 DNA를 숙주속에 도입할 수 있고, 바실루스속 미생물을 숙주로 사용할 경우에 있어서는 컴피던트 셀법과 원형질체법을 사용할 수 있다. 소요의 형질 전환체는 콜로니 하이브리다이제이션법으로 클로닝하거나 적당한 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체를 함유한 영양배지에서 각종 형질 전환체를 배양한 다음 프룩토푸라노실 전이 생성물을 생성하는 소요의 형질 전환체를 선택함으로써 클로닝할 수 있다.

이렇게 하여 수득한 형질 전환체는 영양배지에서 배양할 경우 본 발명의 폴리펩티드를 균체외에서 생성한다. 일반적으로 이러한 배지로서는 탄소원, 질소원 및 미네랄이 보충되어 있고, 필요에 따라서는 아미노산, 비타민 등의 미량 영양이 추가로 보충되어 있는 일반적인 배지를 포함한다. 탄소원의 예로서는 전분, 전분 분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 트레할로오스 등의 당류를 들 수 있다. 질소원의 예로서는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 질산염, 펩톤, 효모 엑스, 탈지 대두, 코온 스티프 리커, 육 엑스 등의 질소 함유 유기 및 무기물질을 들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 배양물은 형질 전환체를 영양배지에 접종하고 이들을 온도 20∼65℃ 및 pH 2∼9에서 통기 교반 등의 호기적 조건하에서 약 1∼6일 동안 배양하여 얻는다. 수드한 배양물을 그대로 효소제로서 사용할 수 있는데, 통상적으로는 배양물로부터 여과, 원심분리 등의 방법으로 미생물의 세포를 분리하고 초음파 및 세포벽 용해효소로써 파쇄한후 여과하여 원심분리함으로써 균체 및 균체 부스러기로부터 폴리펩티드를 분리하여 정제한다. 폴리펩티드의 정제방법으로서는 종래의 일반적인 방법을 포함한다. 즉, 균체 및 균체 부스러기를 제거하여, 원심분리, 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침강, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 등전 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 크로마토그래피, 등전 전기영동 등의 방법중 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

상기한 바와 같이, β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 본 발명의 폴리펩티드는 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체 사이의 프룩토푸라노실 전이를 촉진한다. 따라서 유용한 프룩토푸라노실 전이 생성물은 폴리펩티드 존재하에 적당한 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체를 반응시켜 제조한다. 일반적으로 분자내에 β-프룩토푸라노시드 결합을 가진 수크로오스, 라피노오스 및 에를로오스 등의 당류를 프룩토푸라노실 공여체로서 사용할 수 있는 반면, 분자내에 β-프룩토푸라노시드 결합을 가지지 아니한 당류, 예컨대 크실로오스, 크실로올리고당, 갈락토오스, 갈락토올리고당, 락토오스, 말토오스, 말토올리고당, 이소말토오스 및 이소말토올리고당 등의 환원당; 트레할로오스 및 네오트레할로오스 등의 비환원당; 소르비톨 및 말티톨 등의 당 알코올류; 및 글리세롤과 에틸렌 글리콜 등의 알코올류를 프룩토푸라노실 수용체로서 사용할 수 있다. 이들 화합물을 적절히 병용함으로써 크실로실프룩토시드, 에를로오스, 이소말토프룩토시드, 락토수크로오스 및 프룩토실트레할로오스 등의 유용한 프룩토푸라노실 전이당을 얻을 수 있다.

프룩토푸라노실 전이의 반응조건은 일반적으로 다음과 같다: 프룩토푸라노실 수용체 1 중량부에 대하여 프룩토푸라노실 공여체 약 0.1∼10 중량부, 바람직하게는 약 0.5∼5 중량부로 된 혼합물을 농도 10w/w% 이상, 바람직하게는 20∼60w/w%가 되도록 수성 매체중에 용해하고, 온도 약 60℃ 이하, 바람직하게는 온도 약 5∼55℃ 및 pH 약 3.5∼8.0, 바람직하게는 pH 약 4.5∼6.5에서 반응시켰다. 반응조건에 따라 본 발명의 폴리펩티드의 양을 임의로 선택하는데, 통상적으로는 건조 고형물 기준으로 프룩토푸라노실 공여체 1g당 약 0.1∼50단위의 양으로 사용할 경우에는 반응을 약 0.1∼100시간 이내에 종료한다. 이렇게 하여 수득한 반응 혼합물에는 프룩토푸라노실 전이 생성물을 건조 고형물 기준으로 약 5% 이상, 통상적으로 10% 이상 함유한다.

이렇게 하여 수득한 반응 혼합물을 통상적으로 여과하고 원심분리하여 불용물(不溶物)을 제거하고, 활성탄 및 이온교환 수지를 사용하여 정제한 후 시럽상으로 농축하였다. 필요에 따라서는 이 시럽을 건조하여 분말상으로 할 수 있다. 프룩토푸라노실 전이 생성물의 함유량을 증가시키기 위하여 이 시럽을 인베르타아제 결손 효모와 함께 인큐베이트하여 단당류를 동화시키고, 알칼리 존재하에 가열처리하여 환원당을 분해하거나 멤브레인 여과 또는 크로마토그래피 처리하여 불순물을 제거한다. 일본국 특허공개 제23,799/83호 공보 및 제72,598/83호 공보에 개시된 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피는 크로마토그래피를 이용하는 방법으로서 유리하게 이용할 수 있다. 이들 칼럼 크로마토그래피를 적용할 경우, 소요량의 고순도 프룩토푸라노실 전이 생성물을 최소의 코스트와 인력으로 제조할 수 있다. 종래의 고정상 방법, 이동상 방법 및 의사 이동상(pseudo-moving-bed) 방법을 칼럼 크로마토그래피로서 이용할 수 있다.

수득한 프룩토푸라노실 전이 생성물은 양호한 맛과 감미, 온화한 점성 및 보습성을 가지고 있고, 또한 효과적인 항충치 유발성, 비피드균 생장촉진 작용 및 미네랄 흡수촉진 작용을 가지고 있다. 따라서 본 발명의 프룩토푸라노실 전이 방법으로 제조된 프룩토푸라노실 전이 생성물을 상기한 성질과 작용을 필요로 하는 음식물, 화장품 및 의약품의 감미 부여와 맛 및 텍스쳐 개선에 만족하게 사용할 수 있다.

아래의 각 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다. 여기에 사용된 기술 그 자체는 종래의 것들이다. 이들 기술의 예에 대해서는 문헌[J. Sambrook et al. in "Molecular Cloning A Laboaratory Manual", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA(1989)]에 기재되어 있다.

(실시예 1 : 정제 β-프룩토푸라노시다아제의 제조)

수크로오스 1.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 인산 수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 2수화물 0.06w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.05w/v%, 탄산 칼슘 0.3w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지(pH 7.0)를 제조하였다. 이 배지를 100ml씩 취하여 500ml 플라스크에 넣고, 120℃에서 15분간 오토클레이브 처리하여 멸균한 다음 냉각하고, 여기에 바실루스 sp. V230(FERM BP-5054)의 종자를 접종한후, 회전 진탕 조건하에 30℃에서 20시간 동안 배양하여 종배양물을 얻었다.

동일한 신선한 액상의 영양배지 약 7리터를 10리터 용량의 자아 퍼멘터(jar fermenter)에 넣고 위와 마찬가지로 멸균한후 30℃로 냉각한 다음, 여기에 종배양물 1v/v%을 접종하고 통기교반 조건하에서 30℃에서 약 20시간 동안 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 β-프룩토푸라노시다아제를 3.6단위/ml 함유하는 상청액을 6.3리터 얻었다. 이 배양 상청액에 80% 포화도가 되도록 황산 암모늄을 가하고 4℃에서 하룻밤 방치한 다음 원심분리하여 β-프룩토푸라노시다아제를 함유한 침전물을 얻었다.

이 침전물을 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에 용해하고, 동일한 신선한 아세테이트 완충액에 대하여 하루 동안 투석한 다음 원심분리하여 상청액 210ml을 얻었다. 이 상청액을 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 미리 평형화해 둔 "DEAE-TOYOPEARL 650"(일본국의 Tosoh사 판매의 이온교환 크로마토그래피용 겔) 380ml을 충전한 칼럼에 공급하고, 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에서 0M로부터 0.5M까지 증가하는 염화 나트륨의 직선 기울기 완충액을 가한 다음, 농도 0.1M 부근의 염화 나트륨에서 용출한 획분을 채취하였다.

이 획분을 한데 모아 1M 황산 암모늄 및 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석하고 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 이 상청액을 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 미리 평형화해 둔 "BUTYL-TOYOPEARL 650"(일본국의 Tosoh사 판매의 소수성 겔) 100ml을 충전한 칼럼에 공급하고, 5mM 염화 칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에서 1M로부터 0M까지 감소하는 황산 암모늄의 직선 기울기 완충액을 공급한 다음, 농도 0.1M 부근의 황산 암모늄에서 용출한 획분을 채취하였다.

이어서 이 획분을 한데 모아 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석하고 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 이 상청액을 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 미리 평형화해 둔 "DEAE-TOYOPEARL 650"(일본국의 Tosoh사 판매의 겔) 10ml을 충전한 칼럼에 공급하고, 위와 마찬가지로 분획하여 비활성이 205단위/단백질mg인 정제 β-프룩토푸라노시다아제 14mg을 얻었다. SDS-PAGE에서 전기 영동했을 경우, 정제 β-프룩토푸라노시다아제는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 실질적으로 단일 단백질로서 관찰되었다.

본 발명의 β-프룩토푸라노시다아제의 활성을 다음과 같이 분석하였다. 즉, 5mM 염화 칼슘을 함유한 20mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에 농도 0.1w/v%가 되도록 기질인 수크로오스를 용해하였다. 이 용액 5ml에 시험용 시료 0.2ml을 가하고 이 혼합물을 40℃에서 10분간 유지한 다음, 소모기(Somogyi) 구리 용액 0.2ml을 가하여 효소반응을 중지시키고 소모기-넬슨의 방법으로 반응 혼합물의 환원력을 측정하였다. 대조로서 100℃에서 10분간 예열하여 효소를 실활시킨 대조액을 위와 마찬가지로 처리하였다. 상기한 반응 조건하에서 β-프룩토푸라노시다아제 활성 1단위는 1분당 글루코오스 2μmole의 경우와 동일한 환원력을 나타내는 효소 또는 폴리펩티드의 양으로 정의된다.

(실시예 1-2 : N 말단을 가진 아미노산 서열)

실시예 1의 정제 β-프룩토푸라노시다아제의 N말단을 가진 아미노산 서열을 기상 단백질 시

서 "MODEL 473A"(미합중국의 Applied Biosystems사 판매)로 분석한 결과, 그 아미노산 서열은 서열번호 (SEQ ID NO:) 2인 것이 판명되었다.

(실시예 1-3 : 부분 아미노산 서열)

실시예 1-1의 방법으로 얻은 정제 β-프룩토푸라노시다아제 적당량을 용기에 넣고 4℃에서 18시간 동안 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한후, 여기에 단백질 농도가 약 1mg/ml되도록 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)을 혼합하였다. 수용액 약 1ml을 용기에 넣고, 여기에 리실 엔도펩티다아제를 20㎍/ml 혼합하고 30℃에서 60시간 유지하여 효소를 부분적으로 가수분해하였다. 수득한 분해물을 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트로 미리 평형화해 둔 "μBONDAPAK C18"(일본국의 Japan Millipore사 판매의 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼)에 가한 다음, 이 칼럼에 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트 중에서 0v/v%로부터 40v/v% 까지 증가하는 직선 기울기의 아세토니트릴 수용액을 0.9ml/min의 유속으로 공급하고, 공급개시후 약 77분에서 용출하는 펩티드 단편을 함유한 획분을 채취하였다. 이 획분을 진공건조하고, 50v/v% 아세토 니트릴 수용액을 함유한 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트 중에 용해하였다. 실시예 1-2에서와 마찬가지로 이 펩티드 단편을 분석한 결과, 서열번호(SEQ ID NO:) 2의 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다.

(실시예 1-4 : 염색체 DNA의 제조)

폴리펩톤 1w/v%, 효모 엑스 0.5w/v%, 염화 나트륨 0.5w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지(pH 7.0)를 100ml씩을 취하여 500ml 용량의 플라스크에 나누어 넣고 오토클레이브에서 120℃에서 20분 동안 멸균한후 냉각한 다음 여기에 바실루스 sp. V230(FERM BP-5054) 균주의 종을 접종하고 회전진탕 조건하에 27℃에서 24시간 배양하였다.

증식된 세포를 수득한 배양물로부터 원심분리에 의해 분리하고 적당량의 TES 완충액(pH 8.0)중에 현탁하여 여기에 리소자임을 0.05w/v% 혼합하여 37℃에서 30분간 유지하고 -80℃에서 1시간 동결시킨후 여기에 TSS 완충액(pH 9.0)을 가한 다음, 여기에 60℃로 예열된 TES 완충액과 페놀의 혼합물을 가하여 냉각하고 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액에 2배 체적의 차거운 에탄올을 가하고 생성된 염색체 DNA 함유 침강물을 채취하여 SSC 완충액(pH 7.1)중에 용해한후 여기에 리보뉴클레아제 7.5㎍과 프로테아제 125㎍을 혼합하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물에 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합액을 가하여 염색체 DNA를 추출하였다. 이 추출물을 차거운 에탄올과 혼합하여 발치함으로써 정제 염색체 DNA를 함유한 침강물을 얻었다. 이 침강물을 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)중에 용해한 다음, -80℃에서 동결하였다.

(실시예 1-5 : 형질 전환체 BBF4의 제조)

실시예 1-4의 방법으로 제조한 정제 염색체 DNA 용액 1ml을 용기에 넣고 여기에 제한 효소 Sau 3AI을 약 30단위 가하여 37℃에서 20분간 유지하여 염색체 DNA를 부분 가수분해한 다음, 수크로오스 기울기 원심분리하여 약 2,000∼5,000 염기쌍(bp)으로 된 DNA 단편을 얻었다. 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+)를 제한효소 Bam HI으로 소화시키는 한편으로는 위에서 얻은 DNA 단편 1㎍과 생성된 벡터 단편 0.01㎍을 "DNA LIGATION KIT"(일본국의 Takara Schuzo사 제품)을 사용하여 연결하였다. 수득한 재조합 DNA에 "EPICURIAN COLI XLI-BLUE"(일본국의 Toyobo사 판매의 컴피턴트 셀)을 30㎕ 혼합하고 얼음냉각 조건하에서 30분간 방치한후 42℃로 가열하고 여기에 SOC 브로드(broth)를 혼합하여 37℃에서 1시간 유지함으로써 재조합 DNA를 에세리히아 콜리속에 도입하였다.

수득한 형질 전환체를 50㎍/ml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드를 함유한 한천 평판(pH 7.0)에 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 다음, 한천 평판 위에 생긴 약 2,000개의 콜로니를 "HYBOND-H⁺"(미합중국의 Amersham사 판매의 나일론 필름) 위에 고정하였다. 서열번호 (SEQ ID NO:) 3에서의 아미노산 5-13에 위치한 아미노산 서열 Asp-Tyr-Lys-Glu-Asp-Tyr-Gly-Phe-Ala에 근거하여 5'-GAYTAYAARGARGAYTAYGGNTTYGC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고 ³²P로 표지하였다. 이 수득물을 프로우브(probe)로 하여 나일론 필름위에 고정된 형질 전환체의 콜로니와 하이브리다이즈시킨 다음, 강력한 하이브리다이제이션을 나타낸 형질 전환체를 선택하여 "BBF4"로 명명하였다.

이 형질 전환체 BBF4를 100㎍/ml 앰피실린 함유의 L-브로드(pH 7.0)에 접종하고 회전진탕 조건하에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 증식된 균체를 원심분리에 의해 배양물로부터 채취하고 종래의 알칼리 처리법으로 처리하여 재조합 DNA를 균체밖으로 추출한 다음, 정제하여 종래의 방법으로 분석한 결과, 형질 전환체 BBF4에 함유된 재조합 DNA, 즉 "pBBF4"는 약 6,300bp로 되어 있으며 도 1에 나온 바와 같은 제한 부위를 가지고 있음이 판명되었다. 도 1로부터 명백한 바와 같이 재조합 pBBF4에 있어서 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 1,365bp로 되어 있는 DNA가 제한효소 Eco RV에 의하여 제한 부위의 하류쪽에 연결되어 있다.

(실시예 1-6 : 뉴클레오티드 서열의 해독)

실시예 1-5에서의 재조합 DNA pBBF4를 1㎍ 취하여 용기에 넣고 여기에 "ABI PRISM™ READY REACTION TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT"(미합중국의 Applied Biosystems사 판매)에 사용된 예비 혼합액 9.5㎕와 0.02㎍의 시

싱 프라이머(sequencing primer)를 가한 다음, 적당량의 물을 가하여 전체 체적이 20㎕되게 하였다. 이 혼합물위에 적당량의 미네랄 오일을 피복하고, "MODEL PJ2000"(미합중국의 Perkin-Elmer사 판매)을 사용하여 이 혼합물을 96℃에서 30초, 50℃에서 15초, 그리고 60℃에서 4분간 유지하였는데, 상기한 순차적인 인큐베이션을 25회 반복하여 상보 DNA(cDNA)를 함유한 반응 생성물을 얻었다. 이어서 이 반응 생성물에 5w/v% 세틸트리메틸-암모늄 브로마이드를 함유한 0.5M 식염 수용액 2.5㎕을 가하여 침강시킨후 침강물을 종래의 에탄올법으로 정제하여 건조하였다. 이렇게 하여 수득한 분말상 생성물을 50mM EDTA 1㎕ 및 포름아미드 5㎕와 혼합하여 용해시키고, 이 용액을 90℃에서 2분간 유지한 다음 즉시 냉각하였다.

수득한 생성물을 적당량 칭량(稱量)하여 "MODEL 373"(미합중국의 Applied Biosystems사 판매의 DNA 서열분석 시스템)에 설치한 6w/v%, 폴리아크릴아미드 겔에 넣고 전기영동하여 분리 및 분석을 한 결과, 이 DNA는 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있음이 판명되었다. 뉴클레오티드 서열로부터 추정할 수 있는 아미노산 서열은 서열번호(SEQ ID NO:) 3이었다. 이 아미노산 서열과 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 부분 아미노산 서열을 비교한 결과, 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2는 서열번호(SEQ ID NO:) 3에서의 아미노산 1-21 및 아미노산 201-212와 각각 일치하였음이 판명되었다. 이들 데이타로부터 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 가지고 있고 바실루스 sp. V230 유래의 폴리펩티드는 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 아미노산 서열을 가지고 있음을 알 수 있는데, 더욱 상세하게는 이것은 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 DNA에 의하여 해독됨을 알 수 있다. 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 염기 361-456의 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 분비효소에서 발견되는 공통의 신호 펩티드 영역인 것으로 추정할 수 있다.

(실시예 2 : 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 제조 및 그 물리화학적인 성질)

(실시예 2-1 : 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 제조)

500ml 플라스크에 수크로오스 1.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 인산 수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 2수화물 0.06w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.05w/v%, 탄산 칼슘 0.3w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지를 100ml씩 취하여 넣고, 이 플라스크를 120℃에서 15분간 오토클레이브 처리하여 멸균한 다음 냉각하고, pH 7.0으로 조정하여 앰피실린 50㎍/ml을 혼합한후 여기에 실시예 1-5의 형질 전환체 BBF4를 접종한 다음, 이 혼합물을 회전 진탕 조건하에 37℃에서 20시간 동안 배양하여 종배양물을 얻었다.

동일한 신선한 액상의 영양배지 약 7리터를 10리터 용량의 자아 퍼멘터(jar fermenter)에 넣고 위와 마찬가지로 멸균한후 30℃로 냉각한 다음, pH를 조정하고 여기에 앰피실린을 혼합한후 종배양물 1v/v%을 접종하고 통기교반 조건하에서 상기 온도에서 20시간 동안 배양하였다. 수득한 배양물을 초음파로 처리하여 균체를 파쇄하고 원심분리하여 불순물을 제거한 다음, 상청액에 70w/v%의 포화도가 되도록 황산 암모늄을 혼합하고 4℃에서 24시간 방치하고 원심분리하여 침전물을 채취하였다. 이 침전물을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)중에 용해하고, 이 용액을 10mM 인산 완충액에 대하여 4℃에서 24시간 동안 투석하였다. 투석 내액에 대하여 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 측정한 결과, 배양물 1리터당 약 8단위의 폴리펩티드를 생성해 있었다. 수득한 미정제 폴리펩티드를 실시예 1-1의 방법으로 정제하여 배양물 1리터당 비활성이 205단위/mg 단백질인 폴리펩티드를 약 8mg 얻었다.

대조로서 에세리히아 콜리 XLI-Blue 또는 바실루스 sp. V230 균주를 앰피실린 무함유의 동일한 액상의 영양배지중에서 마찬가지로 배양하고 처리하였는데, 단, 바실루스 sp. V230 균주의 경우에는 그 배양온도를 30℃로 설정하였다. 수득한 상청액의 활성을 측정한 결과, 바실루스 sp. V230 균주는 β-프룩토푸라노시다아제를 배양물 1리터당 약 3.6단위 생성해 있었는데, 이것은 형질 전환체 BBF4의 경우보다 현저하게 낮은 레벨이었다. 한편, 에세리히아 콜리 XLI-Blue 균주를 숙주로 사용한 경우는 β-프룩토푸라노시다아제를 전혀 생성하지 않았다.

(실시예 2-2 : 폴리펩티드의 물리화학적인 성질)

(실시예 2-2(a) : 작용)

기질로서 수크로오스, 라피노오스, 에를로오스, 스타키오스, 락토수크로오스, 크실로실프룩토시드, 말토오스, 셀로비오스, 락토오스, 이눌린 또는 레반을 2w/v%의 농도로 함유하는 용액에 실험 2-1의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 고형물 기준으로 기질 1g당 2단위 혼합하고 40℃ 및 pH 5.5에서 24시간 동안 반응시켰다.

각 반응 혼합물의 적당량을 "KIESEL GEL 60"(미합중국의 Merck ＆ Co., Inc. 판매의 박층 크로마토그래피(TLC)용의 알루미늄판) 위에 스포팅하고, 1-부탄올, 피리딘 및 물 (=7:3:1, 체적비)로 된 전개용매계를 사용하여 실온에서 전개한 다음 건조하였다. 반응 혼합물중에 프룩토오스를 함유하고 있을 경우에는 0.2w/v% 나프토레조르시놀을 함유한 0.5N 포스페이트 용액을 분무하여 판을 발색시켜 110℃에서 약 5분간 가열한 반면, 20w/v% 황산을 함유한 메탄올 혼합용액을 분무하여 발색시키고 110℃에서 약 10분간 가열하였다. 그 결과, 본 실험에 사용된 폴리펩티드는 수크로오스, 라피노오스, 에를로오스, 스타키오스, 락토수크로오스 및 크실로실룩토시드에 작용하여 프룩토오스를 유리하는 한편으로는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 나타내었으나, 말토오스, 셀로비오스, 락토오스, 이눌린 및 레반에는 실질적으로 작용하지 않음을 확인하였다.

표 1에 나온 단당류, 올리고당류 및 알코올류를 프룩토푸라노실 수용체로 사용하여 본 발명의 폴리펩티드에 의한 프룩토푸라노실 전이의 활성을 조사하였다. 즉, 표 1에 나온 프룩토푸라노실 수용체중의 하나와 프룩토푸라노실 공여체로서의 수크로오스를 중량으로 동일량으로 하여 혼합하고, 이 혼합물을 물에 용해하여 농도 10w/v%의 수용액으로 한후, 여기에 실험 2-1의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 수크로오스 1g당 2단위 혼합하고 40℃ 및 pH 5.5에서 24시간 반응시켰다. 이어서 이 반응 혼합물을 위와 마찬가지로 TLC에 의하여 분리하고, 0.2w/v% 나프토레조르시놀을 함유한 0.5N 포스페이트 용액을 분무하여 판을 발새시킨 다음 이 판을 110℃에서 5분간 가열하여 프룩토푸라노실 전이 생성물을 발색시켜 검출하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다.

[표 1]

(계속)

(주) 판정 기준

수크로오스의 반응 혼합물과 비교하여 "-"는 변화없음을 나타내고;

"+"는 프룩토푸라노실 수용체의 스폿 크기와 색이 약간 감소하고 프룩토푸라노실 전이 생성물의 스폿은 약간 검출됨을 나타내며; "++"는 프룩토푸라노실 수용체의 스폿 크기와 색이 보다 많이 감소하고 프룩토푸라노실 전이 생성물의 스폿이 명확히 관찰됨을 나타냄.

표 1에 나온 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 프룩토푸라노실 공여체인 수크로오스로부터 D-크실로오스, D-갈락토오스, 말토오스, 이소말토오스, 셀로비오스, 말토트리오스, 파노오스, 락토오스, 멜리비오스 및 트레할로오스 등의 프룩토푸라노실 수용체에 프룩토실 잔기의 전이를 촉진하여 프룩토푸라노실 수용체에 상응한 프룩토푸라노실 전이 생성물을 형성한다. 상기한 당류외에 본 발명의 폴리펩티드는 D-크실리톨, D-소르비톨 및 말티톨 등의 당 알코올류와 글리세롤, 에틸렌글리콜 등의 알코올류에 작용하여 각각 상응한 프룩토푸라노실 전이 생성물을 생성한다.

(실시예 2-2(b) : 분자량)

실시예 2-1의 폴리펩티드를 10w/v% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동 처리하고, 이 폴리펩티드의 이동도를 동시에 전기영동 처리한 분자량 마아커 단백질의 이동도와 비교함으로써 분자량을 측정한 결과, 분자량은 44,000∼54,000이었음이 판명되었다. 분자량 마아커 단백질로서는 토끼 근육 포스포릴라아제 B(MW 97,4000 달톤), 소 혈청 알부민(MW 66,200 달톤), 오발부민(MW 45,000 달톤), 소의 탄산 탈수소 효소(MW 31,000 달톤), 대두 트립신 억제제(MW 21,500 달톤), 및 난백 리소자임(MW 14,400 달톤)이었다.

(실시예 2-2(c) : 최적 pH)

실시예 2-1의 폴리펩티드를 종래의 방법으로 상이한 pH의 20mM 완충액중에서 40℃에서 10분간 유지함으로써 도 2에 나온 바와 같이 그 최적 pH가 약 5.5∼6.0을 나타내었음이 판명되었다.

(실시예 2-2(d) : 최적 온도)

실시예 2-1의 폴리펩티드를 종래의 방법으로 20mM 완충액(pH 6.0)중에서 10분간 유지함으로써 도 3에 나온 바와 같이 그 최적 온도가 5mM 칼슘 이온 존재하에서는 약 50℃, 그리고 5mM 칼습 이온 부재하에서는 약 45℃를 나타내었음이 판명되었다.

(실시예 2-2(e) : pH 안정성)

실시예 2-1의 폴리펩티드를 종래의 방법으로 상이한 pH의 100mM 완충액중에서 40℃에서 24시간 유지함으로써 도 4에 나온 바와 같이 pH 약 5.0∼약 8.0에서 안정하였음이 판명되었다.

(실시예 2-2(f) : 열적 안정성)

실시예 2-1의 폴리펩티드를 종래의 방법으로 5mM 완충액(pH 6.0) 중에서 60분간 유지함으로써 도 5에 나온 바와 같이 온도 약 45℃까지는 안정하였음이 판명되었다.

(실시예 3 : 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 제조)

(실시예 3-1 : 형질 전환체 BB5의 제조)

실시예 1-5의 재조합 DNA pBBF4를 제한효소 Pst I으로 분해하고 분해된 부위를 "DNA BLUNTING KIT"(일본국의 Takara Shuzo사 판매)를 사용하여 블런팅한 후, 통상의 방법으로 아가로오스 겔 전기영동하여 이 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열을 가진 약 2,800bp의 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 "DNA LIGATION KIT"(일본국의 Takara Shuzo사 판매)를 사용하여 "pHY300PLK"(일본국의 Toyobo사 판매의 플라스미드 벡터)로 연결하였다.

수득한 재조합 DNA를 문헌[P. Schaeffer et al. in "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America"]에 보고된 방법에 준하여 원형질체로 하여둔 바실루스 서브틸리스 ISW1214 균주에 가하고, 이 균주를 문헌[J. Sekiguchi in "Agricultural and Biological Chemistry", Vol. 46, pp.1,617-1,621(1982)"]에 보고된 방법에 따라 형질 전환하였다. 이렇게 하여 수득한 형질 전환체를 "BBF5"로 명명하였다.

형질 전환체 BBF5를 테트라사이클린 10㎍/ml 함유의 L-브로드(broth)(pH 7.0)에 접종하고 회전진탕 조건하에서 30℃에서 24시간 유지하였다. 실시예 1-4에 따라 마찬가지로 소요의 재조합 DNA를 추출하고 정제한후 분석한 결과, 형질 전환체 BBF5를 함유한 재조합 DNA는 약 7,700bp로 구성되어 있고 도 6에 나온 바와 같은 제한부위를 가지고 있음이 판명되었다.

(실시예 3-2 : 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 생산)

수크로오스 5.0w/v%, 폴리펩톤 1w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 인산 수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 2수화물 0.06w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.05w/v%, 탄산 칼슘 0.3w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지 100ml씩을 취하여 500ml 용량의 플라스크에 나누어 넣고 오토클레이브에서 120℃에서 15분 동안 멸균한후 냉각한 다음 pH 7.0으로 조정한후, 여기에 테트라사이클린 10㎍/ml을 혼합하였다. 액상의 영양배지를 수용한 각 플라스크에 실시예 3-1의 형질 전환체 BBF5를 접종하고 회전진탕 조건하에 30℃에서 24시간 배양하여 종배양물을 얻었다.

위에서 사용한 것과 동일한 신선한 액상의 영양배지 약 19리터를 30리터 용량의 퍼멘터에 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 30℃로 냉각한후 pH를 조정하고, 여기에 테트라사이클린을 혼합하여 종배양물 1v/v%을 접종한후 통기교반 조건하에 24시간 배양하였다. 형질 전환체 BBF5에 의해 생산된 폴리펩티드 대부분은 β-프룩토푸라노시다아제 활성이 45단위/ml인 배양 상청액중에서 발견되었다. 이 배양 상청액을 MF 멤브레인으로 여과하고 UF 멤브레인으로 농축하여 본 발명의 폴리펩티드를 약 800단위/ml 함유하는 수용액 820ml을 얻었다.

실시예 1-1에서와 마찬가지로 이 폴리펩티드를 정제하고 실시예 2-2의 방법으로 그 물리화학적 성질을 조사한 결과, 실시예 2-1의 것과 동일한 물리화학적 성질을 가지고 있음이 판명되었다.

(실시예 4 : 락토오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 락토오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 20w/w% 수크로오스를 함유하는 수용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 2-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 수크로오스 1g당 1단위 혼합하고 55℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 폴리펩티드를 실활하고 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하여 고형물 기준으로 원료에 대하여 75w/w% 시럽상 제품을 95%의 수율로 얻었다.

고형물 기준으로 37% 락토수크로오스를 함유하는 이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하여 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 5 : 락토오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 18w/w% 락토오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 22w/w% 수크로오스를 함유하는 수용액을 pH 6.0로 조정하고, 여기에 실시예 3-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 수크로오스 1g당 1단위와 인베르타아제 결손효소를 습중량으로 5w/w% 혼합하고 1N 수산화 나트륨 용액을 가해 pH를 6∼7의 범위로 유지하면서 35℃에서 20시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 폴리펩티드를 실활하고 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하고 진공건조하여 분쇄함으로써 고형물 기준으로 원료에 대하여 분말상 제품을 70%의 수율로 얻었다.

고형물 기준으로 65% 락토수크로오스를 함유하는 이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하여 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 6 : 말토오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 20w/w% 말토오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 수크로오스를 함유하는 수용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 2-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 수크로오스 1g당 1단위 혼합하고 50℃에서 24시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 폴리펩티드를 실활하고 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하고 진공건조하여 분쇄함으로써 고형물 기준으로 원료에 대하여 75w/w% 시럽상 제품을 95%의 수율로 얻었다. 이 시럽상 제품은 고형물 기준으로 에를로오스를 약 28% 함유하고 있었다.

이 시럽상 제품을 농도 45%로 농축하고 "DOWEX 50W X4 (Ca형)"(미합중국의 Dow Chemical사 판매의 알칼리 금속형 강산성 양이온 교환수지)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 에를로오스 함유량을 증가시켰다. 즉, 내경 5.4cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개에 이온교환 수지를 주입하고, 이 칼럼을 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이를 20m로 한 후, 칼럼 내부 온도를 40℃로 유지하면서 5v/v%의 시럽상 제품을 이온교환 수지에 가한 다음 40℃의 온수를 SV(공간속도) 0.2로 공급하여 분획을 하였다. 이어서 에를로오스 고함유 획분을 채취하고 종래방법으로 정제, 농축, 진공건조 및 분쇄하여 고형물 기준으로 원료에 대하여 에를로오스를 84% 함유하는 분말상 제품을 25%의 수율로 얻었다.

이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하여 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다. 그리고 이 제품은 비교적 저환원성, 양호한 맛과 감미, 적당한 보습성 및 비교적 낮은 충치 유발성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 7 : 크실로오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 15w/w% 크실로오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 30w/w% 수크로오스를 함유하는 수용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 2-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 수크로오스 1g당 0.5단위 혼합하고 50℃에서 40시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 폴리펩티드를 실활하고 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하여 고형물 기준으로 원료에 대하여 75w/w% 시럽상 제품을 95%의 수율로 얻었다.

고형물 기준으로 35% 크실로실프룩토시드를 함유하는 이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하며 충치 유발성도 비교적 낮으므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 8 : 크실로오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 15w/w% 크실로오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 30w/w% 수크로오스를 함유하는 수용액을 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 실시예 3-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 수크로오스 1g당 0.5단위 혼합하고 50℃에서 40시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 수산화 나트륨을 가하여 pH 10 이상으로 유지하면서 100℃ 이상에서 가열하여 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하여 고형물 기준으로 원료에 대하여 75w/w% 시럽상 제품을 55%의 수율로 얻었다.

고형물 기준으로 60% 크실로실프룩토시드를 함유하는 이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하며 충치 유발성도 비교적 낮으므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 9 : 트레할로오스에의 프룩토푸라노실 전이)

프룩토푸라노실 수용체로서의 10w/w% 트레할로오스와 프룩토푸라노실 공여체로서의 14w/w% 라피노오스를 함유하는 수용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 2-1의 방법으로 얻은 미정제 폴리펩티드를 고형물 기준으로 라피노오스 1g당 0.4단위 혼합하고 50℃에서 40시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 폴리펩티드를 실활하고 냉각한후 종래의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 탈염 및 이온교환 수지에 의한 정제를 한 다음 농축하여 진공건조하고 분쇄함으로써 고형물 기준으로 원료에 대하여 분말상 제품을 95%의 수율로 얻었다.

고형물 기준으로 20% 프룩토푸라노실 트레할로오스를 함유하는 이 제품은 맛과 감미가 양호하고 보습성도 적당하여 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 사용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 재조합 DNA 기술을 적용하여 공업적으로 용이하게 생산할 수 있는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 전체적으로 혹은 부분적으로 밝혀진 아미노산 서열을 가진 것으로서 음식물, 화장품 및 의약품 등에 사용되는 프룩토푸라노실 전이 생성물 제조에 임의로 사용할 수 있다. 이러한 유용한 성질을 가진 폴리펩티드는 본 발명의 형질 전환체를 사용하는 방법으로 소요량을 쉽사리 생산할 수 있다.

따라서 이들 유용하고도 만족스러운 효과와 작용을 가진 본 발명은 이 기술분야에 크게 기여할 수 있는 의의를 가진 발명이다.

[서열표]

(1) 일반정보 :

(i) 출원인 : 주식회사 하야시바라(林源) 생물화학 연구소

(ii) 발명의 명칭 : 프룩토푸라노시드 활성을 가진 폴리펩티드

(ⅲ) 서열의 수 : 5

(iv) 주소 :

(A) 수신 : 주식회사 하야시바라(林源) 생물화학 연구소

(B) 번지 기타 : 시모이시 1쪼메 2-3

(C) 시 : 오카야마시

(E) 국 : 일본국

(F) 우편번호(ZIP) : 700

(vii) 선출원 사항 :

(A) 출원번호 : JP 170,630/1996

(B) 출원일 : June 10, 1996

(2) 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 서열의 길이 : 21 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(iii) 단편형 : N말단 단편

(xi) 서열 : 서열번호(SEQ ID NO:) 1 :

(3) 서열번호(SEQ ID NO:) 2 의 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 서열의 길이 : 12 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(iii) 단편형 : 중간부 단편

(xi) 서열 : 서열번호(SE ID NO:) 2 :

(4) 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 서열의 길이 : 455 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(xi) 서열 : 서열번호(SEQ ID NO:) 3 :

(5) 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 정보 :

(ⅰ) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 1365 염기쌍

(B) 서열의 형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열 : 서열번호(SEQ ID NO:) 4 :

(6) 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 2408 염기쌍

(B) 서열의 형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : genomic DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 바실루스(Bacillus) sp.

(B) 단리클론명 : V230(FERM BP-5054)

(ix) 서열의 특징 :

(A) 특징을 나타내는 기호 : 5' UTR

(B) 존재위치 : 1..360

(C) 특징을 결정하는 방법 : E

(A) 특징을 나타내는 기호 : signal peptide

(B) 존재위치 : 361..456

(C) 특징을 결정하는 방법 : S

(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide

(B) 존재위치 : 457..1821

(C) 특징을 결정하는 방법 : S

(A) 특징을 나타내는 기호 : 3' UTR

(B) 존재위치 : 1822..2408

(C) 특징을 결정하는 방법 : E

(xi) 서열 : 서열번호(SEQ ID NO:) 5 :

도 1은 본 발명에 의한 재조합 DNA PGGF4의 제한 지도.

도 2는 본 발명의 실시예에서의 폴리펩티드의 최적 pH를 나타내는 도면.

도 3은 본 발명의 실시예에서의 폴리펩티드의 최적 온도를 나타내는 도면.

도 4는 본 발명의 실시예에서의 폴리펩티드의 pH 안정성을 나타내는 도면.

도 5는 본 발명의 실시예에서의 폴리펩티드의 열적 안정성을 나타내는 도면.

도 6은 본 발명에 의한 재조합 DNA pBBF5의 제한 지도.

Claims

미생물 유래의 유전자의 발현에 의해 수득되고, 부분 아미노산 서열로서 서열번호(SEQ ID NO:) 1 및 2의 아미노산 서열 중의 한가지 서열을 가지거나, 혹은 두가지 서열을 모두 가지고 있는, β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 분리된 폴리펩티드:

서열번호(SEQ ID NO:) 1 :

서열번호(SEQ ID NO:) 2 :
청구항 1에 있어서, 프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체 사이의 프룩토푸라노실 전이를 촉진시키는 활성을 가진 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 아래의 물리화학적 성질을 가진 폴리펩티드:

(1) 분자량

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에서 44,000～54,000 달톤;

(2) 최적 pH

40℃에서 10분간 유지했을 경우 5.5～60;

(3) 최적 온도

pH 6.0에서 10분간 유지했을 경우, 칼슘 이온 부재하에서는 45℃이고 칼슘이온 존재하에서는 50℃;

(4) pH 안정성

4℃에서 24시간 유지했을 경우 pH 5.0～8.0 에서 안정함;

(5) 열적 안정성

pH 6.0에서 1시간 유지했을 경우 온도 45℃까지 안정함.
청구항 1에 있어서, 아래의 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드:

서열번호(SEQ ID NO:) 3 :
청구항 1에 있어서, 미생물을 숙주로 사용하고, 바실루스속에 속하는 미생물 유래의 유전자를 상기 숙주중에서 발현시켜 수득되는 폴리펩티드.
청구항 1의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
청구항 6에 있어서, 아래의 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA:

서열번호(SEQ ID NO:) 4 :
청구항 6에 있어서, 아래의 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA:

서열번호(SEQ ID NO:) 5 :
청구항 6에 있어서, 바실루스속에 속하는 미생물에서 유래하는 DNA.
자체 복제성 벡터를 가진 청구항 1의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
청구항 10에 있어서, 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
청구항 10에 있어서, 서열번호(SEQ ID NO:) 5 및 그 상보물로 된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
청구항 10에 있어서, 바실루스속에 속하는 미생물에서 유래하는 DNA.
청구항 1의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 숙주로서의 미생물에 도입하여 수득되는 형질 전환체.
청구항 1의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 숙주속에 도입하여 수득되는 형질 전환체를 영양배지에서 배양하여 상기 폴리펩티드를 생성시키고, 생성된 폴리펩티드를 배양물로부터 채취하는 단계를 포함하는 β-프룩토푸라노시다아제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조방법.
청구항 15에 있어서, 채취단계는 원심분리, 염석, 투석, 여과, 농축, 분별 침강, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전 전기영동으로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 제조방법.
프룩토푸라노실 공여체와 프룩토푸라노실 수용체를 청구항 1의 폴리펩티드 존재하에 반응시키는 단계를 포함하는 프룩토푸라노실 전이 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 프룩토푸라노실 공여체가 수크로오스, 라피노오스 및 에를로오스로 된 군으로부터 선택되는 1종인 프룩토푸라노실 전이 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 프룩토푸라노실 수용체가 알코올류, 당 알코올류 및 분자내에 β-프룩토푸라노시다아제 결합이 없는 당류로 된 군으로부터 선택되는 1종인 프룩토푸라노실 전이 방법.
청구항 17에 있어서, 반응 생성물이 크실로실프룩토시드, 에를로오스, 이소말토실프룩토시드, 락토수크로오스 및 프룩토실트레할로오스로 된 군으로부터 선택되는 1종인 프룩토푸라노실 전이 방법.
청구항 17에 있어서, 프룩토푸라실 수용체 1 중량부에 대하여 프룩토푸라노실 공여체 0.1～10 중량부를 pH 3.5 ～ 8.0 및 온도 4～60℃에서 반응시키는 프룩토푸라노실 전이 방법.