CN104789539B - 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104789539B CN104789539B CN201510210023.XA CN201510210023A CN104789539B CN 104789539 B CN104789539 B CN 104789539B CN 201510210023 A CN201510210023 A CN 201510210023A CN 104789539 B CN104789539 B CN 104789539B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- trehalose
- trehalose synthase
- synthase
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010045348 trehalose synthase Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 23
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000432824 Asparagus densiflorus Species 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 27
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 241000135044 Thermobifida fusca YX Species 0.000 abstract description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 abstract description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 abstract description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 16
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000984622 Leucodon Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- -1 malt oligosaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-BTLHAWITSA-N alpha,beta-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-BTLHAWITSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01245—Alpha,alpha-trehalose synthase (2.4.1.245)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
- C12Y504/99016—Maltose alpha-D-glucosyltransferase (5.4.99.16)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶活性中心附近第289位的谷氨酸突变成甘氨酸得到突变体E289G；将第295位的组氨酸突变成天冬酰胺突变体H295N；将第344位的甲硫氨酸突变成赖氨酸突变体M344K；将第367位的甲硫氨酸突变成亮氨酸突变体M367L，并在H295N基础上进行双突变得到突变体H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L。突变体实现了底物中即使含有一定的葡萄糖，海藻糖合酶制备海藻糖的转化效率依然不会受到很大的影响，具有较高的工业价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
海藻糖是一种安全无毒以1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，有三种异构体即(α,α)、异海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。与蛋白质或者氨基酸共同加热，不会产生美拉德反应，并且在酸性、碱性、高温、超低温环境都能保持一定的稳定性。其独特的生物活性，使得海藻糖得到广泛的应用。大量的研究表明，海藻糖是单细胞生物、动物组织和器官、蛋白质、生物膜、医药制剂等的保护剂，能够抑制脂质酸化、淀粉老化、蛋白质变性，具有矫味矫臭功能、搞玻璃转化温度、低吸湿性、低甜度等性质，能够将其应用到医药业、农业、生化制品业、化妆品行业、食品加工业。
早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过低，成本过高。1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价格79元/kg。双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产。而海藻糖合酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多问题需要研究解决，其中海藻糖合酶是关键。因此，挖掘适合生产海藻糖的海藻糖合酶对于推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。
麦芽糖可以通过水解淀粉得到，生产过程中会产生一定的葡萄糖，工业化生产海藻糖使用纯的麦芽糖成本过高。海藻糖合酶除了转苷作用外还有微弱的水解反应，由此生成副产物葡萄糖。本发明所使用的来源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶若以工业级的麦芽糖(含有1％-10％的葡萄糖)为底物，海藻糖合酶酶转化率会受到一定的影响。本发明通过定点突变对海藻糖合酶进行改造，削弱葡萄糖对酶转化的抑制作用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种海藻糖合酶的突变体，其活性中心位点附近氨基酸发生突变，得到受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖合酶。所述突变体包括含有一个、两个或三个相对于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶活性氨基酸残基的取代。
所述海藻糖合酶的亲本的氨基酸序列与NCBI数据库中的Thermobifida fusca YX海藻糖合酶一致(登录号WP_011291031.1)。
所述突变体是将亲本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)，命名为E289G；或将第295位的组氨酸(His)突变成天冬酰胺(Asn)，所得突变体命名为H295N；或将第344位的甲硫氨酸(Met)突变成赖氨酸(Lys)，所得突变体命名为M344K；或将第367位的甲硫氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，所得突变体命名为M367L。
所述突变体还可以是将单突变体酶H295N中第289位的谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)，所得突变体命名为H295N/E289G；或将单突变体酶H295N中第344位的甲硫氨酸(Met)突变成赖氨酸(Lys)，所得突变体命名为H295N/M344K；或将单突变体酶H295N基因中第367位的甲硫氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，所得突变体命名为H295N/M367L。
所述突变体还可以是将双突变体酶H295N/M344K基因中第367位的谷氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，所得突变体命名为H295N/M344K/M367L。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖合酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在Thermobifida fusca YX海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化获得海藻糖合酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明削弱了以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物时葡萄糖对海藻糖合酶生产海藻糖的抑制作用，以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物，野生酶生产海藻糖转化率为62.2％，而突变体E289G、H295N、M344K、M367L、H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L，生产海藻糖的转化率分别达到69.7％、70.5％、70.3％、69.6％、70.4％、70.9％、72.3％、73.7％，达到野生酶使用纯麦芽糖为底物时生产海藻糖的转化率(70.7％)。
具体实施方式
实施例1：重组菌构建
实验室保藏有前期构建的含有编码海藻糖合酶的基因的质粒TreS/pMD18T。用于构建大肠杆菌的质粒是pET24a(+)，带有T7启动子。将pET24a(+)质粒和含有TreS基因的质粒分别进行Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养培养8h，挑转化子在含有30mg/L卡那霉素液体的LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒TreS/pET24a(+)。
将质粒TreS/pET24a(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素(30mg/L)的LB平板，37℃培养8h，命名为TreS/pET24a(+)/E.coli BL21(DE3)。挑单菌落到含有30mg/L卡那霉素液体LB培养基中，37℃培养过夜，保存甘油管。
实施例2：突变体的制备
(1)单突变
来源于Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的突变体酶E289G、H295N、M344K、M367L。
根据Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的基因序列，分别设计并合成引入E289G、H295N、M344K、M367L突变的引物，对海藻糖合酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，分别鉴别出第289位的Glu密码子变成Gly密码子，第295位的His密码子变成Asn密码子，第344位Met密码子变成Lys密码子，第367位Met密码子变成Leu密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变海藻糖合酶。单突变E289G、H295N、M344K、M367L的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体TreS/pET24a(+)为模板，
引入E289G突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GAATCCGGCGGCGACGGTTGCCACATGAACT-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-AGTTCATGTGGCAACCGTCGCCGCCGGATTCG-3’(下划线为突变碱基)引入H295N突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ATGCCACATGAACTTCAACTTCCCGCTGATGCC-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-GGCATCAGCGGGAAGTTGAAGTTCATGTGGCA-3’(下划线为突变碱基)引入M344K突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGAGCTGACCTTGGAGAAAGTCAGCGATGAAG-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-TCTTCATCGCTGACTTTCTCCAAGGTCAGCTCG-3’(下划线为突变碱基)引入M367L突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GCGGATGCGCGCCAACTTAGGGATCCGCCGCCGGC-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-GCCGGCGGCGGATCCCTAAGTTGGCGCGCATCCGC-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：5×PS buffer10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经Dpn Ⅰ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含30μg/mL卡那霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。
发酵产酶
(2)双突变
Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的双突变体酶H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L：将单突变体酶H295N基因中第289位的谷氨酸(Glu)突变成甘氨酸(Gly)，或者第344位的甲硫氨酸(Met)突变成赖氨酸(Lys)，或者第367位的甲硫氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，分别命名为H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L。双突变体酶的制备方法，以单突变体H295N编码基因为模板，分别设计并合成引入E289G、M344K、M367L突变的引物，对单突变体H295N编码基因进行定点突变，测定序列，鉴别出第289位的Glu变成Gly密码子，第344位的Met密码子变成Lys密码子，或者第367位的Met变成Leu密码子，将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到双突变海藻糖合酶突变体。
双突变H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L的定点突变：利用快速PCR技术，以表达载体H295N/pET24a(+)为模板，
引入E289G突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GAATCCGGCGGCGACGGTTGCCACATGAACT-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-AGTTCATGTGGCAACCGTCGCCGCCGGATTCG-3’(下划线为突变碱基)引入M344K突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGAGCTGACCTTGGAGAAAGTCAGCGATGAAG-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-TCTTCATCGCTGACTTTCTCCAAGGTCAGCTCG-3’(下划线为突变碱基)引入M367L突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGGATGCGCGCCAACTTAGGGATCCGCCGCCG-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-CCGGCGGCGGATCCCTAAGTTGGCGCGCATCC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。
(3)三突变
Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶的双突变体酶H295N/M344K/M367L：将双突变体酶H295N/M344K基因中第367位的甲硫氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，命名为H295N/M344K/M367L。三突变体酶的制备方法，以双突变体H295N/M344K编码基因为模板，设计并合成引入M367L突变的引物，对双突变体H295N/M344K编码基因进行定点突变，测定序列，鉴别出第367位的Met变成Leu密码子，将突变体基因置于适当的表达载体并导入大肠杆菌中进行表达，得到三突变海藻糖合酶突变体。
引入M367L突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGGATGCGCGCCAACTTAGGGATCCGCCGCCG-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5’-CCGGCGGCGGATCCCTAAGTTGGCGCGCATCC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系、反应条件及突变基因的测序方法同单突变体的方法。
(4)突变体酶的发酵与纯化
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，在37℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液。
实施例3：HPLC检测海藻糖的产量
在反应器中加入麦芽糖300g/L(含葡萄糖10％)，加入一定量实例2中获得的野生酶和突变体的浓缩酶液，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到8.0，在30℃、150rpm的水浴摇床中反应30-50小时定时取样，煮沸10min终止反应后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：示差折光检测器，NH2柱(APS-2HYPERSIL，Thermo Scientific)，流动相(水:乙腈＝1:4)，流速：0.8mL·min-1，柱温：40℃。
表1以工业级麦芽糖为底物生产海藻糖的转化率
| 酶 | 转化率(％) |
| 野生酶 | 62.2％ |
| E289G | 69.7％ |
| H295N | 70.5％ |
| M344K | 70.3％ |
| M367L | 69.6％ |
| H295N/E289G | 70.4％ |
| H295N/M344K | 70.9％ |
| H295N/M367L | 71.3％ |
| H295N/M344K/M367L | 73.7％ |
结果见表1，突变体表达获得的突变酶与野生酶相比，可以发现，突变体实现了海藻糖合酶制备海藻糖转化效率的提高。野生酶生产海藻糖转化率为62.2％，而突变体E289G、H295N、M344K、M367L、H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L，生产海藻糖的转化率分别达到69.7％、70.5％、70.3％、69.6％、70.4％、70.9％、72.3％、73.7％，达到野生酶使用纯麦芽糖为底物时生产海藻糖的转化率(70.7％)。
Claims (7)
1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，相对于海藻糖合酶亲本，将第289位的谷氨酸突变成甘氨酸，或将第289位的谷氨酸突变成甘氨酸的同时将第295位的组氨酸突变成天冬酰胺；
海藻糖合酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在亲本海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体；
(2)将携带编码突变体的基因的质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化得到海藻糖合酶突变体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
4.权利要求1所述突变体在制备海藻糖中的应用。
5.编码权利要求1所述突变体的基因。
6.携带权利要求5所述基因的细胞。
7.权利要求6所述细胞在制备海藻糖中的应用。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510210023.XA CN104789539B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
| CN201710776849.1A CN107446900B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN201710776847.2A CN107384903B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN201710776826.0A CN107384902B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510210023.XA CN104789539B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710776849.1A Division CN107446900B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN201710776847.2A Division CN107384903B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN201710776826.0A Division CN107384902B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104789539A CN104789539A (zh) | 2015-07-22 |
| CN104789539B true CN104789539B (zh) | 2017-10-31 |
Family
ID=53554733
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710776847.2A Active CN107384903B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN201710776849.1A Active CN107446900B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN201710776826.0A Active CN107384902B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN201510210023.XA Active CN104789539B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710776847.2A Active CN107384903B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN201710776849.1A Active CN107446900B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN201710776826.0A Active CN107384902B (zh) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (4) | CN107384903B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105524936B (zh) * | 2016-02-02 | 2018-11-06 | 齐鲁工业大学 | 一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用 |
| CN106399426B (zh) * | 2016-10-10 | 2021-04-30 | 长沙理工大学 | 一种利用镉米生产海藻糖的方法 |
| CN110592059B (zh) * | 2017-09-13 | 2021-03-02 | 江南大学 | 麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体 |
| CN108753747B (zh) * | 2018-06-05 | 2021-02-26 | 江南大学 | 一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体 |
| CN108753746B (zh) * | 2018-06-05 | 2021-03-30 | 江南大学 | 一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体 |
| CN111500566B (zh) * | 2019-01-28 | 2022-02-15 | 江南大学 | 一种海藻糖合成酶突变体及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101629166A (zh) * | 2009-08-20 | 2010-01-20 | 南宁中诺生物工程有限责任公司 | 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421761B (zh) * | 2013-08-23 | 2014-11-26 | 南宁中诺生物工程有限责任公司 | 一种耐热海藻糖合成酶融合酶突变体基因及其应用 |
-
2015
- 2015-04-28 CN CN201710776847.2A patent/CN107384903B/zh active Active
- 2015-04-28 CN CN201710776849.1A patent/CN107446900B/zh active Active
- 2015-04-28 CN CN201710776826.0A patent/CN107384902B/zh active Active
- 2015-04-28 CN CN201510210023.XA patent/CN104789539B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101629166A (zh) * | 2009-08-20 | 2010-01-20 | 南宁中诺生物工程有限责任公司 | 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究";王青艳 等;《广西农业生物科学》;20070630;第26卷(第2期);摘要，第116页第1-2段，第116-117页"1.2 方法" * |
| "谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究";朱绮霞 等;《广西科学》;20121231;第19卷(第2期);第169-173页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107446900A (zh) | 2017-12-08 |
| CN104789539A (zh) | 2015-07-22 |
| CN107384903B (zh) | 2019-05-17 |
| CN107384902B (zh) | 2019-05-17 |
| CN107384903A (zh) | 2017-11-24 |
| CN107384902A (zh) | 2017-11-24 |
| CN107446900B (zh) | 2019-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104789539B (zh) | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 | |
| CN103709236B (zh) | 一种可提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| CN109486794B (zh) | 一种酶活提高的甲壳素酶突变体 | |
| CN109385413B (zh) | 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用 | |
| CN104745562A (zh) | 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用 | |
| CN108102936B (zh) | 乳酸克鲁维酵母突变株及其糖苷酶和应用 | |
| CN107460138A (zh) | 一种产fad依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 | |
| CN114395541B (zh) | 一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1-MUT、其编码基因和应用 | |
| CN106434590A (zh) | 一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用 | |
| CN108424868A (zh) | 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 | |
| CN112725319B (zh) | polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用 | |
| CN108034667A (zh) | 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用 | |
| CN105002147B (zh) | 表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用 | |
| CN104877983B (zh) | 一种海藻糖合酶突变体及其制备与应用 | |
| CN113073074A (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN103103234A (zh) | 利用固定化酶合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的方法 | |
| CN111172089A (zh) | 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法 | |
| CN101831397B (zh) | 一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备l-半胱氨酸的方法 | |
| CN111471667B (zh) | 壳聚糖酶Csn-PT及其应用 | |
| CN108977427B (zh) | 一种海藻糖合酶突变体 | |
| CN112941059B (zh) | 一种l-天冬酰胺酶突变体及其在枯草芽孢杆菌中的表达 | |
| CN110951717A (zh) | 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用 | |
| CN111172090A (zh) | 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法 | |
| CN106222101B (zh) | 高温下高效利用菊芋一步生产高纯果糖的耐高温菌株及应用 | |
| CN114751966B (zh) | Yh66_04585蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160602 Address after: 421800 Dongjiang Industrial Park, Leiyang Economic Development Zone, Hunan 1, China Applicant after: HUNAN HUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 1800 No. 214122 Jiangsu city of Wuxi Province Li Lake Avenue Applicant before: Jiangnan University |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211217 Address after: 421800 room 211-212, zijingfu (building a-4a, Mingang new town), beside National Highway 107, TIYU North Road, Xili neighborhood committee, Wulipai street, Leiyang City, Hengyang City, Hunan Province Patentee after: Hunan Jindai Technology Development Co.,Ltd. Address before: 421800 Building 1, Dongjiang Industrial Park, Leiyang Economic Development Zone, Hunan Province Patentee before: HUNAN HUISHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |