CN101629166A - 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌海藻糖合成酶的突变体，其获得方法是通过定点突变技术对来源于谷氨酸棒杆菌的海藻糖合成酶氨基酸序列的第263位点的苯丙氨酸残基进行定点饱和突变，其获得的方法还包括对含有SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4的氨基酸序列至少80％的同源性的海藻糖合成酶的序列中至少一种氨基酸残基进行饱和突变得到。突变后海藻糖合成酶基因表达的海藻糖合成酶的反应动力学发生改变，如酶的比活、最适反应温度和最适pH值等酶学特性发生了改变，这种酶能够提高海藻糖合成酶的转化效率，可以进一步降低海藻糖的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及现代酶工程技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用。
背景技术
海藻糖，更确切地说是α，α-1，1-海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成。海藻糖是一种天然性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。但含量甚微。过去主要是从干酵母中提取。由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用。随着人类社会的发展和进步，要求将海藻糖应用于各类食品的鲜味保持与质地改善的趋势越来越明显，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。目前研究发现生物存在多种酶系能够合成海藻糖，海藻糖合成酶就是其中之一，它能够转化麦芽糖生成海藻糖，而麦芽糖可以通过水解淀粉制备，因而是一种具有工业应用前景生产海藻糖的酶。
发明内容
本发明的目的在提供谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶突变体及其应用。该突变体能够提高适反应温度和耐热性，其酶学特性更加适合用于工业化生产海藻糖，有利于降低海藻糖的生产成本。
本发明通过以下技术方案达到上述目的，
一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
所述谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其获得方法是对具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的海藻糖合成酶的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基进行置换，这些氨基酸对应第263位氨基酸残基。
所述氨基酸残基置换是用第263位的F氨基酸残基置换成其它19种氨基酸残基。
所述任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体的相关基因，或者还有该基因的载体。
所述任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其中的突变体酶F263C、F263Y、F263L和F263W比亲本野生型的海藻糖具有更低的反应pH和更高的反应温度，其中F263C和F263Y反应pH为7.5，F263L和F263W反应pH为6.5，F263W的反应温度为32℃。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶突变体，是采用定点突变技术以谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶为基础，对其氨基酸序列的F263的氨基酸残基进行饱和突变成其它其它的19个氨基酸，将突变得到海藻糖合成酶的基因进行表达得到新的海藻糖合成酶。
本发明突出的实质性特点和技术效果在于：
突变后海藻糖合成酶基因表达的海藻糖合成酶的反应动力学发生改变，如酶的比活、最适反应温度和最适pH值等酶学特性发生了改变，突变酶的热稳定性均有不同程度的提高，其中F263Y和F263W的Tm值为47℃比野生型的提高约1℃；突变酶F263L为48℃比野生型的提高约2℃，而突变酶F263C热稳定性提高了近4℃。
这种酶能够提高海藻糖合成酶的转化效率，可以进一步降低海藻糖的生产成本。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作详细描述：
本发明所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶是在本发明人研究谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶的基础上，利用定点突变技术对中国专利204410013006.9公布的谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法所述的海藻糖合成酶进行定点突变得到，谷氨酸棒杆菌菌种可以从工业微生物保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。本发明采用的微生物培养、基因克隆和表达技术和相关的技术方案是本领域中常用的成熟技术，本发明的涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语，因此对于本领域的专业员来说本发明的文本对于本领域的专业人员来说是显而易见的。
实施例1
1、海藻糖合成酶基因的定点饱和突变
本发明海藻糖合成酶的蛋白质分子结构进行结构的能量优化，结合分析其同源性较高的氨基酸序列，选择保守区氨基酸残基第263位氨基酸残基进行定点饱和突变，将野生型的苯丙氨酸残基突变成成其它的19个氨基酸残基从而获得19个新的突变酶。以构建好的海藻糖合成酶基因的表达质粒为模版，利用Stratagene公司的基因突变试剂盒进行基因的定点饱和突变，获得的突变基因进行测序分析证实得到的突变体与预期的结果相符，然后将突变的基因导入大肠杆菌进行表达实验，进一步纯化得到突变的海藻糖合成酶，经过和野生型的谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶进行酶学性质的比较得到本发明突变子的。
2、海藻糖合成酶在大肠杆菌中的表达
将突变好的海藻糖合成酶基因表达质粒转化到BL21感受态细胞，于37℃培养10～16小时，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，再继续于32℃培养24～36小时。离心收集菌体后，在5000r/分钟离心10分钟，用pH6.5的5mM磷酸缓冲液洗涤一次，进行超声波细胞破碎，于8000r/分钟离心15分钟，离心后取上清，就可以得到重组海藻糖合成酶的粗酶液。
3、转化麦芽糖生成海藻糖
取上步骤2制备的粗酶液1ml与等体积1ml 30％(m/v)的麦芽糖溶液混合，置于25℃中反应24小时，还原糖下降至原来的60％，经HPLC检测，25℃反应24小时后溶液中含有海藻糖、麦芽糖和葡萄糖，反应前后各组分浓度如下表：
表1转化麦芽糖生产海藻糖产物浓度表
4、海藻糖活力的测定：
将含15％(m/v)麦芽糖，pH 7.5，50mmol/L的PBS缓冲液20μL与等体积的酶液混合，在适宜温度下，反应30分钟，沸水加热5分钟终止酶反应。通过3，5-二硝基水杨酸法(DNS)测定麦芽糖的减少量，把酶与底物反应混合物稀释适当倍数，取500μL稀释液与375μL的DNS在沸水浴煮5分钟，冷却后加水5.375mL，测定其OD520，空白对照以水代替酶与底物反应混合物。酶活力的测定重复3次，取3次实验数据的平均值。
酶活力定义为：上述条件下，1分钟转化一定量麦芽糖生成1μg海藻糖所需酶的量为1U。
5、海藻糖合成酶的表达和纯化：
将饱和突变获得的19个突变子分别转化到大肠杆菌E.coli BL21菌株种进行诱导表达培养，表达培养后收集细胞进行超声波破胞后离心收集上清即得到粗酶液，对粗酶液进行海藻糖合成酶活力比较分析，选取活力高的突变子的粗酶液进行分离纯化作进一步的酶学性质比较分析。将粗酶液经镍柱亲和层析和Sephacryl-300柱层析纯化获得纯化的海藻糖合成酶蛋白，收集的目的酶蛋白经SDS-PAGE电泳分析显示单一条带，表明可以用于酶学性质分析。
6、突变酶的酶活力和Km的分析：
以原始野生的海藻糖合成酶为对照，将纯化得到的海藻糖合成酶利用双倒数法测定海藻糖酶Km值。经测定野生型Km值为19.77mmol/L，突变酶F263C的Km为14.70mmol/L比原始野生型的海藻糖合成酶降低了25.6％，表明突变体酶F263C比野生型对底物有更强的亲和力，有利于提高酶的催化效率。
7、突变酶最适反应温度分析
以原始野生的海藻糖合成酶为对照，将纯化得到的海藻糖合成酶在50mmol/L，pH7.5，的PBS和15％(m/v)麦芽糖的底物条件下，分别置于10℃、16℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、46℃、50℃、55℃不同的温度条件反应，然后比较测定海藻糖合成酶的酶活力即得到酶的最适反应温度。
经活力比较分析野生型海藻糖合成酶的最适反应温度为27℃，而突变子F263C、F263L、F263W的最适温度为32℃，比野生型有所提高，这表明突变子有利于通过提高反应温度来提高反应速度。
8、突变酶最适反应pH分析
以原始野生的海藻糖合成酶为对照，将纯化得到的海藻糖合成酶在30℃和15％(m/v)麦芽糖的底物条件下，分别置于pH5.0～pH9.0，梯度为0.5的不同pH的50mmol/L的PBS条件下反应，然后比较测定海藻糖合成酶的酶活力即得到酶的最适反应pH。
经活力比较分析野生型海藻糖合成酶的最适反应pH为pH8.0，突变酶F263C、F263Y最适pH为pH7.5，F263L、F263W为6.5，这表明突变酶的最适反应pH度得到了降低，在生产中可以减少碱的使用量，从而可以降低生产成本。
9、突变酶热稳定分析
将野生型和突变酶同时置于不同的温度下保温30分钟，冷却后于在各自最适反应条件下测定海藻糖酶残余的活力。结果表明各个突变酶的热稳定性均有不同程度的提高，其中F263Y和F263W的Tm值为47℃比野生型的提高约1℃；突变酶F263L为48℃比野生型的提高约2℃，而突变酶F263C热稳定性提高了近4℃。
本发明是经过对谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶多个氨基酸位点，包括多个突变酶的分析比较才获得本发明的，本发明所述不包括对其它氨基酸位点和其它突变酶的分析筛选过程的陈述，所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明。
序列表
<110>南宁中诺生物工程有限责任公司
<120>谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>617
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400>1
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<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400>4
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Claims (8)
1、一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其特征在于：该突变体含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2、一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其特征在于：该突变体含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3、一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其特征在于：该突变体含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
4、一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其特征在于：该突变体含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
5、一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其获得方法是对具有SEQID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的海藻糖合成酶的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基进行置换，这些氨基酸对应第263位氨基酸残基。
6、权利要求1-4中任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述氨基酸残基置换是用第263位的F氨基酸残基置换成其它19种氨基酸残基。
7、一种编码权利要求1-4中任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体的相关基因，或者还有该基因的载体。
8、权利要求1-4中任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其中的突变体酶F263C、F263Y、F263L和F263W比亲本野生型的海藻糖具有更低的反应pH和更高的反应温度，其中F263C和F263Y反应pH为7.5，F263L和F263W反应pH为6.5，F263W的反应温度为32℃。
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| CN200910114318A Pending CN101629166A (zh) | 2009-08-20 | 2009-08-20 | 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用 |
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104789539A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-07-22 | 江南大学 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
| CN104877983A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-09-02 | 江南大学 | 一种海藻糖合酶突变体及其制备与应用 |
| CN109456951A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-03-12 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种提高海藻糖合成酶产量的方法 |
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2009
- 2009-08-20 CN CN200910114318A patent/CN101629166A/zh active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104789539A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-07-22 | 江南大学 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
| CN104877983A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-09-02 | 江南大学 | 一种海藻糖合酶突变体及其制备与应用 |
| CN104789539B (zh) * | 2015-04-28 | 2017-10-31 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用 |
| CN107384902A (zh) * | 2015-04-28 | 2017-11-24 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN107384903A (zh) * | 2015-04-28 | 2017-11-24 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN107446900A (zh) * | 2015-04-28 | 2017-12-08 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN104877983B (zh) * | 2015-04-28 | 2018-02-23 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶突变体及其制备与应用 |
| CN107446900B (zh) * | 2015-04-28 | 2019-05-17 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN107384902B (zh) * | 2015-04-28 | 2019-05-17 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用 |
| CN107384903B (zh) * | 2015-04-28 | 2019-05-17 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用 |
| CN109456951A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-03-12 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种提高海藻糖合成酶产量的方法 |
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