JP6767707B2 - マンナナーゼ及びその利用 - Google Patents
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Description
本明細書は、マンナナーゼ及びその利用に関する。
マンナンはマンノースを主成分とする多糖の総称であり、自然界に広く分布している。マンナンには、針葉樹の細胞壁やコンニャクに含まれるマンノース及びグルコースを主鎖とするグルコマンナンや、コーヒー豆や果実中に含まれるマンノース及びガラクトースを主鎖とするガラクトマンナンがある。これらはゲル状で存在するため、食品の増粘剤や安定剤として用いられている。また、その特性からコーヒーの抽出を妨げるため、マンナナーゼ（マンナン分解酵素）を加えることによってコーヒーの抽出効率を高めている。
カビやキノコは菌体外にマンナナーゼを分泌し、マンナンを低分子化した後、菌体内に取り込み資化している。これまで多種多様のマンナナーゼが見出されており、それらは食品の製造や工業用途に利用されている。
マンナナーゼは一般的に、最適ｐＨは酸性又は中性であり、最適温度は４０℃から７０℃付近である。また、改変等により耐熱性を向上したものマンナナーゼが報告されている（特許文献１）。
マンナンは多くの植物に含有されているが、その粘性の高さが工業的利用の障害となっている。そこで、効率の良いマンナン分解が可能となることで、マンナンを含む食品の製造やバイオマス利用において技術移転の可能性が見込まれる。マンナンの利用性向上にあたっては、低分子化以外の方法が未だ発見されていない。
マンナナーゼは、コーヒーの抽出を代表とする食品用途の他に、パルプの漂白や洗剤への含有といった工業用途にも利用されている。このような幅広い分野での利用において、マンナンの分解は様々な条件下で行われる。そこで、既知のマンナナーゼと異なる特性を持つマンナナーゼは、効率の良いマンナンの分解に有効な役割を果たし得る。
本明細書は、新規のマンナナーゼを提供することを目的とする。
本発明者らは、マンナンの粘度低下に関する研究において、マンナンを特異的に加水分解する、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans; A. nidulans）由来の新規のタンパク質を見出した。このタンパク質について検討したところ、既知のマンナナーゼとアミノ酸レベルで全く相同性を有さないにも関わらず、マンナナーゼ活性を有することがわかった。
また、本発明者らは、このアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae、A. oryzae）由来の新規マンナナーゼ及びストレプトマイセス属菌（Streptomyces. sp）由来の新規マンナナーゼも見出した。
本明細書は、こうした知見に基づき、本明細書の開示は、以下の手段を提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリペプチドを有する、マンナナーゼ。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるポリペプチド。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（２）前記マンナナーゼはAspergillus nidulans由来であることを特徴とする、（１）に記載のマンナナーゼ。
（３）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む発現ベクター。
（４）（３）に記載の発現ベクターを含有する、形質転換細胞。
（５）前記形質転換細胞は大腸菌である、（４）に記載の形質転換細胞。
（６）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物からポリペプチドを回収する工程と、
を備える、方法。
（７）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
前記マンナナーゼを産生する条件下で（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物から前記マンナナーゼを回収する工程と、
を備える、方法。
（８）マンナンの分解産物の生産方法であって、
（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、方法。
（９）前記マンナン含有材料を７０℃以上の温度で分解する、（８）に記載の方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるポリペプチド。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（２）前記マンナナーゼはAspergillus nidulans由来であることを特徴とする、（１）に記載のマンナナーゼ。
（３）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む発現ベクター。
（４）（３）に記載の発現ベクターを含有する、形質転換細胞。
（５）前記形質転換細胞は大腸菌である、（４）に記載の形質転換細胞。
（６）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物からポリペプチドを回収する工程と、
を備える、方法。
（７）（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
前記マンナナーゼを産生する条件下で（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物から前記マンナナーゼを回収する工程と、
を備える、方法。
（８）マンナンの分解産物の生産方法であって、
（１）又は（２）に記載のマンナナーゼを用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、方法。
（９）前記マンナン含有材料を７０℃以上の温度で分解する、（８）に記載の方法。
（１０）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるポリペプチドを有する、マンナナーゼ。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるポリペプチド。
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（１１）前記マンナナーゼはAspergillus oryzae由来であることを特徴とする、（１０）に記載のマンナナーゼ。
（１２）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む発現ベクター。
（１３）（１２）に記載の発現ベクターを含有する、形質転換細胞。
（１４）前記形質転換細胞は大腸菌である、（１３）に記載の形質転換細胞。
（１５）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物からポリペプチドを回収する工程と、
を備える、方法。
（１６）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
前記マンナナーゼを産生する条件下で（１３）又は（１４）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物から前記マンナナーゼを回収する工程と、
を備える、方法。
（１７）マンナンの分解産物の生産方法であって、
（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、方法。
（１８）前記マンナン含有材料を７０℃以上の温度で分解する、（１７）に記載の方法。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるポリペプチド。
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（１１）前記マンナナーゼはAspergillus oryzae由来であることを特徴とする、（１０）に記載のマンナナーゼ。
（１２）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む発現ベクター。
（１３）（１２）に記載の発現ベクターを含有する、形質転換細胞。
（１４）前記形質転換細胞は大腸菌である、（１３）に記載の形質転換細胞。
（１５）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
（４）又は（５）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物からポリペプチドを回収する工程と、
を備える、方法。
（１６）（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを生産する方法であって、
前記マンナナーゼを産生する条件下で（１３）又は（１４）に記載の形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物から前記マンナナーゼを回収する工程と、
を備える、方法。
（１７）マンナンの分解産物の生産方法であって、
（１０）又は（１１）に記載のマンナナーゼを用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、方法。
（１８）前記マンナン含有材料を７０℃以上の温度で分解する、（１７）に記載の方法。
（１９）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、前記アミノ酸配列の第１３８位〜１４８位に対応するWFAGHRNGXSG（Xは任意のアミノ酸を表す。）からなる第１のモチーフ、前記アミノ酸配列の第５４位〜６１位に対応するDLAI/VAMLEからなる第２のモチーフ、前記アミノ酸配の第８１位〜８９位に対応するNFGI/LFKQNWからなる第３のモチーフ、前記アミノ酸配列の第１８１位〜１９１位に対応するDTRFWVＸ1VX2AI（ただし、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。）を有し、
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、マンナナーゼ。
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、マンナナーゼ。
（２０）さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列における、第２７位（Ｒ）、第３１位（G）、第３４位（T）、第３７〜３９位（GLG）、第４１位〜４２位（RK）、第４８位〜５０位（AGG）、第６５位（M）、第６９位（Ｙ）、第７１位〜７３位（YGD）、第７５位（K）、第７８位（D）、第９２位〜９３位（LR）、第１１７位（S）、第１２２位〜１２３位（DV）、第１３３位〜１３４位（YG）、第１５２位（Ｐ）、第１５４位（T）、第１５６位〜１５７位（DI）、第１６０位（Ｙ）、第１６３位〜１６４位（AV）、第１６６位〜１６７位（ＷＩ）及び１７０位（Ｑ）の各アミノ酸に対応するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである、（１９）に記載のマンナナーゼ。
（２１）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるいずれかのポリペプチドである、（１９）に記載のマンナナーゼ。
配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるいずれかのポリペプチドである、（１９）に記載のマンナナーゼ。
（２２）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるいずれかのポリペプチドである、（２０）に記載のマンナナーゼ。
配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるいずれかのポリペプチドである、（２０）に記載のマンナナーゼ。
本明細書は、上記した各種実施形態のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む発現ベクター、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞、前記形質転換細胞は大腸菌である、形質転換細胞、各種実施形態のマンナナーゼを生産する方法であって、上記形質転換細胞を培養する工程と、培養物からポリペプチドを回収する工程と、を備える方法、上記各種実施形態のマンナナーゼを用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、マンノースの分解産物の生産方法等を提供する。
（マンナナーゼ）
本明細書の開示は、新規なマンナナーゼ及びその利用に関する。
本明細書の開示は、新規なマンナナーゼ及びその利用に関する。
また、本明細書に開示されるマンナナーゼは、既知のマンナナーゼと比較して高い耐熱性を有するため、高温条件下でのマンナン分解への利用が見込まれる。
本開示のマンナナーゼは、マンナンが有する１，４−β−マンノシド結合を加水分解するエンド酵素で、β−マンナナーゼ、β−マンノシダーゼとも呼ばれている。また、ＥＣ酵素分類ではＥＣ３．２．１．７８に分類することができる。
従来公知のマンナナーゼは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate-Active enZYmes）のホームページ（http://www.cazy.org/）において提供される分類ではＧＨ５、ＧＨ２６等に分類されている。ここで、ＧＨとはGlycoside Hydrolase Familyを表している。こうしたＧＨに属するマンナナーゼとしては、Aspergillus nigerをはじめとするAspergillus属やTrichoderma reeseiなどの糸状菌、Bacillus属細菌等に由来のマンナナーゼが知られている。
本開示のマンナナーゼは、従来公知のマンナナーゼが属するＧＨファミリーには属しておらず、新規なＧＨファミリーに属すると考えられる。本開示のマンナナーゼの基質は、１，４−β−マンノシド結合を有するポリマーであれば特に限定しないが、主にグルコマンナン、ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンが挙げられる。
（マンナナーゼ活性の測定方法）
マンナナーゼ活性は、例えば、ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）を用いて測定できる。マンナンとマンナーゼとを混合し、一定の条件下で反応させ、マンナンを分解させる。反応条件については、例えば、０．２〜２．０％のグルコマンナンにマンナナーゼを終濃度０．５％となるように混合し、３７℃で反応させることができる。反応時間は、分解反応がおおむね終了する時間とすることもできるし、反応開始から分解反応がおおむね終了する時間の１又は２以上の時点で反応液を一定量分取することもできる。分解反応終了後、還元糖の量をＤＮＳ法によって測定する。還元糖量を測定することで、マンナナーゼのマンナン分解活性を測定することができる。
マンナナーゼ活性は、例えば、ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）を用いて測定できる。マンナンとマンナーゼとを混合し、一定の条件下で反応させ、マンナンを分解させる。反応条件については、例えば、０．２〜２．０％のグルコマンナンにマンナナーゼを終濃度０．５％となるように混合し、３７℃で反応させることができる。反応時間は、分解反応がおおむね終了する時間とすることもできるし、反応開始から分解反応がおおむね終了する時間の１又は２以上の時点で反応液を一定量分取することもできる。分解反応終了後、還元糖の量をＤＮＳ法によって測定する。還元糖量を測定することで、マンナナーゼのマンナン分解活性を測定することができる。
ＤＮＳ法について説明する。還元糖にジニトロサリチル酸を反応させると、黄色のジニトロサリチル酸が還元され、赤色の３−アミノ−５−ニトロサリチル酸が生成される。この時の５００〜５４０ｎｍにおける吸光度の増加は還元糖の増加と比例するため、吸光度を測定することで還元糖量を測定することができる。
また、マンナナーゼ活性は、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により測定することができる。マンナンとマンナナーゼとを混合し、一定の条件下で反応させ、マンナンを分解させる。反応条件については上記と同様である。分解反応終了後、生成したマンナン分解物をＴＬＣによって検出することができる。ＴＬＣによって、マンナン分解物が、例えば、二糖のマンノビオースや三糖のマンノトリオースまで分解されたといったように、マンナン分子がどの大きさの分子にまで分解されたのかを検出することができる。
（マンナン）
マンナンは、マンノースを主成分とする多糖類の総称をいう。マンナンは、一般に、酵母、カビ、植物の種子や果実、針葉樹の木質部に多く存在する、ヘミセルロースの一種である。
マンナンは、マンノースを主成分とする多糖類の総称をいう。マンナンは、一般に、酵母、カビ、植物の種子や果実、針葉樹の木質部に多く存在する、ヘミセルロースの一種である。
マンナンには、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナン、ガラクトマンナン、β−マンナン等が知られている。グルコマンナンは、グルコースとマンノースが１，４−β−マンノシド結合したものであり、例えば、グルコースとマンノースが約２：３の割合で結合したグルコマンナンが針葉樹やコンニャクイモに多く含まれている。グルコマンナンの側鎖にはガラクトースがα−１，６結合しており、その比率が高いものはガラクトグルコマンナンと呼ばれる。また、ガラクトマンナンは１，４−β−マンノシド結合したマンノースに、側鎖としてガラクトースが１，６−α−マンノシド結合したものであり、ガラクトースの比率はガラクトマンナンを含有する植物によって異なる。グアガム、コーヒー豆に多く含まれている。また、β−マンナンは、マンノースがβ−１，４結合したものである。
（第１のマンナナーゼ）
本明細書で開示されるマンナナーゼの１つは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。こうしたポリペプチドが有しうるアミノ酸配列の他の態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸変異を有することができる。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換があげられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
本明細書で開示されるマンナナーゼの１つは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。こうしたポリペプチドが有しうるアミノ酸配列の他の態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸変異を有することができる。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換があげられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
かかるポリペプチドの他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。同一性は好ましくは６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアライメントによって決定されるような、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質又はポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保持性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアライメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215 : p403-410（1990）, Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acid Res. 25 : p3398-3402（1997））を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
かかるポリペプチドの１つのさらに他の態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ（若しくはその一部）又は当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有し、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照にして設定することができる。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、配列番号１で表される塩基配列と６０％以上、より好ましくは６５％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上である。より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。さらに好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を用いる条件を挙げることができる。
かかるポリペプチドの１つのさらに他の一態様としては、配列番号１で表される塩基配列と６０％以上、より好ましくは６５％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡにコードされ、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
こうした各種態様のポリペプチドは、マンナナーゼ活性を有していればよく、その程度は問わない。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの有するマンナナーゼ活性の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、一層好ましくは６０％以上、より一層好ましくは７０％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上であり、さらに最も好ましくは１００％以上である。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるマンナナーゼは、１，４−β−マンノシド結合を有する限りにおいて、ヘミセルロースを基質とすることもできるし、五糖以上であれば低分子のマンノオリゴ糖を基質とすることもできる。マンノオリゴ糖としては、例えば、マンノペンタオース、マンノヘキサオース等を挙げることができる。
かかるマンナナーゼは、Ｃ末端についてはアミノ酸配列で終末することが好ましい。Ｃ末端に、タグ等を付加しないことが好ましく、少なくとも、ヒスタグを付加しないことが好ましい。
かかるマンナナーゼのマンナンに対する基質特異性や分子活性といった性質を調べるために、例えば、Ｋｍ値、Ｋｃａｔ値及びＫｃａｔ／Ｋｍ比を算出することができる。例えば、本開示のマンナナーゼのグルコマンナンに対するＫｍ値は１．２ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は３９０s−１であり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は３３０ｍｌ−１s−１ｍＭである。また、ガラクトマンナンに対するＫｍ値は４．７ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は２４０s−１であり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は５１ｍｌ-1s-1ｍＭである。なお、Ｋｍ値、Ｋｃａｔ値及びＫｃａｔ／Ｋｍ比の算出は、公知の方法を用いることができる。
かかるマンナナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ５以上ｐＨ７以下であることが好ましい。より好ましくはｐＨ５．５以上ｐＨ６．５以下である。なお、公知であるA. nidulans由来の既知のマンナナーゼ（ｒＭａｎ５）においてはｐＨ３以上５以下であり、最も好ましくは約４である。
かかるマンナナーゼの耐熱性は、２０℃における酵素活性に対する活性の割合（％）として６０℃で６０％以上であることが好ましい。より好ましくは、７０℃で６０％以上である。さらに好ましくは８０℃で６０％以上であり、一層好ましくは９０℃で６０％以上である。また、５０℃における酵素活性に対して６０℃で６５％以上であることが好ましい。より好ましくは、７０℃で６５％以上である。さらに好ましくは８０℃で６５％以上であり、一層好ましくは９０℃で６５％以上である。なお、例えば、ｒＭａｎ５においては、２０℃における酵素活性に対して７０℃で６０％以下であり、８０℃で１０％以下である。また、５０℃における酵素活性に対して７０℃で６５％以下であり、８０℃で１０％以下である。なお、酵素活性は、温度以外については同じ条件で測定するものとする。
第１のマンナナーゼは、A. nidulansをグルコマンナン培地で培養した培養上清から取得することができる。
以下、第２〜第５のマンナナーゼについて説明する。これらのマンナナーゼも、第１のマンナナーゼと同様、マンナンが有する１，４−β−マンノシド結合を加水分解するエンド酵素で、β−マンナナーゼ、β−マンノシダーゼとも呼ばれている。また、ＥＣ酵素分類ではＥＣ３．２．１．７８に分類することができる。また、これらのマンナナーゼも、従来のマンナナーゼが属する既知のＧＨファミリーでなく、第１のマンナナーゼとともに新規なＧＨファミリーに属していると考えられる。
また、これらのマンナナーゼについても、第１のマンナナーゼと同様、マンナンを基質とすることができ、１，４−β−マンノシド結合を有する限りにおいて、ヘミセルロースを基質とすることもできるし、五糖又は六糖以上であれば低分子のマンノオリゴ糖を基質とすることもできる。マンノオリゴ糖としては、例えば、マンノペンタオース、マンノヘキサオース等を挙げることができる。また、これらのマンナナーゼも、Ｃ末端についてはアミノ酸配列で終末することが好ましい。Ｃ末端に、タグ等を付加しないことが好ましく、少なくとも、ＨＩＳタグを付加しないことが好ましい。
（第２、第３のマンナナーゼ）
また、本明細書の開示は、さらに、A. nidulans由来のさらに他の新規なマンナナーゼ（以下、第２及び第３のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。これらのマンナナーゼは、第１のマンナナーゼのホモログであるといえる。第２及び第３のマンナナーゼであるタンパク質は、A. nidulansをグルコマンナン培地で培養した培養上清から取得することができる。
また、本明細書の開示は、さらに、A. nidulans由来のさらに他の新規なマンナナーゼ（以下、第２及び第３のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。これらのマンナナーゼは、第１のマンナナーゼのホモログであるといえる。第２及び第３のマンナナーゼであるタンパク質は、A. nidulansをグルコマンナン培地で培養した培養上清から取得することができる。
第２のマンナナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ４．５以上ｐＨ６．５以下であることが好ましい。第３のマンナナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ４．５以上ｐＨ６．５以下であることが好ましい。
第２及び第３のマンナナーゼは、それぞれ、配列番号４及び６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとすることができる。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、第１のマンナナーゼを規定することができる配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％の同一性を有している。また、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５４％の同一性を有している。
第２のマンナナーゼが有しうるポリペプチドの他の態様は、第１ののマンナナーゼについてのアミノ酸配列の他の態様と同様、配列番号４で表されるアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする配列番号３で表される塩基配列に基づく各種態様が挙げられる。第３のマンナナーゼが有しうるポリペプチドの他の態様は、第１のマンナナーゼについてのアミノ酸配列の他の態様と同様、配列番号６で表されるアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする配列番号５で表される塩基配列に基づく各種態様が挙げられる。
（第４のマンナナーゼ）
また、本明細書の開示は、さらに、A. oryzae由来の新規なマンナナーゼ（以下、第４のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。第４のマンナナーゼであるタンパク質は、A. oryzaeをグルコマンナン培地で培養した培養上清から取得することができる。
また、本明細書の開示は、さらに、A. oryzae由来の新規なマンナナーゼ（以下、第４のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。第４のマンナナーゼであるタンパク質は、A. oryzaeをグルコマンナン培地で培養した培養上清から取得することができる。
第４のマンナナーゼは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとすることができる。配列番号８で表されるアミノ酸配列は、先のマンナナーゼを規定することができる配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７１％の同一性を有している。
第４のマンナナーゼのマンナンに対する基質特異性や分子活性といった性質を調べるために、例えば、Ｋｍ値、Ｋｃａｔ値及びＫｃａｔ／Ｋｍ比を算出することができる。例えば、第４のマンナナーゼのグルコマンナンに対してのＫｍ値は１．8±０．２ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は、５９0／secであり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は３30ｍｌ／ｍｇ・secである。また、ガラクトマンナンに対するＫｍ値は５．1±０．４ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は、２９0／secであり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は５7ｍｌ／ｍｇ・secである。
第４のマンナナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ４以上ｐＨ７以下であることが好ましい。より好ましくはｐＨ４．５以上ｐＨ６．５以下である。
第４のマンナナーゼの耐熱性は、３７℃における酵素活性に対する活性の割合（％）として６０℃で７０％以上であることが好ましい。より好ましくは、７０℃で７０％以上である。さらに好ましくは８０℃で６０％以上である。
第４のマンナナーゼが有しうるポリペプチドの他の態様は、先のマンナナーゼについてのアミノ酸配列の他の態様と同様、配列番号８で表されるアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする配列番号７で表される塩基配列に基づく各種態様が挙げられる。
例えば、第４のマンナナーゼの配列番号８で表されるアミノ酸配列と高い同一性を示すA. oryzaeのタンパク質としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列（このアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号１１で表される。）が挙げられる。
（第５のマンナナーゼ）
また、本明細書の開示は、さらに、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces. sp）由来の新規なマンナナーゼ（以下、第５のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。第５のマンナナーゼであるタンパク質は、NCBIに登録されているWP_030268297.1のアミノ酸配列から、それをコードするDNAの配列を合成しpET28aに連結することでプラスミドを構築した。これを大腸菌BL21 CodonPlus株に形質転換することで、発現させた。
また、本明細書の開示は、さらに、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces. sp）由来の新規なマンナナーゼ（以下、第５のマンナナーゼという。）及びその利用に関する。第５のマンナナーゼであるタンパク質は、NCBIに登録されているWP_030268297.1のアミノ酸配列から、それをコードするDNAの配列を合成しpET28aに連結することでプラスミドを構築した。これを大腸菌BL21 CodonPlus株に形質転換することで、発現させた。
第５のマンナナーゼは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとすることができる。配列番号８で表されるアミノ酸配列は、第１のマンナナーゼを規定することができる配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して６１％の同一性を有している。
第５のマンナナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ４以上ｐＨ７以下であることが好ましい。より好ましくはｐＨ４．５以上ｐＨ６．５以下である。
第５のマンナナーゼが有しうるポリペプチドの他の態様は、先のマンナナーゼについてのアミノ酸配列の他の態様と同様、配列番号１０で表されるアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする配列番号９で表される塩基配列に基づく各種態様が挙げられる。
第１〜第５の各種マンナナーゼは、第１のマンナナーゼのアミノ酸配列である配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、以下の関係を有することができる。すなわち、これらのマンナナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、前記アミノ酸配列の第１３８位〜１４８位に対応するWFAGHRNGXSG（Xは任意のアミノ酸を表す。）からなる第１のモチーフ、前記アミノ酸配列の第５４位〜６１位に対応するDLAI/VAMLEからなる第２のモチーフ、前記アミノ酸配の第８１位〜８９位に対応するNFGI/LFKQNWからなる第３のモチーフ、前記アミノ酸配列の第１８１位〜１９１位に対応するDTRFWVＸ1VX2AI（ただし、Ｘは任意のアミノ酸を表す。）を有し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを有している。
アミノ酸配列のアライメントは、特に限定するものではないが、例えば、アミノ酸配列のアライメントは、各種公知のプログラムにて実施することができる。この種のプログラムとしては、例えば、BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、Clustal W（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）、PROSITE（http://prosite.expasy.org/）及びPRINTS（http://bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html）、ProDOM（http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php）、Pfam（http://www.sanger.ac.uk/science/tools）等のほか、商業的に入手可能なプログラムが挙げられる。当業者であれば、アライメントのためのプログラムを、NCBI、NIH、DDBJ、EBIなど公開ウェブサイトから適宜取得し、あるいはウェブサイト上で適宜利用し、あるいは商業的に入手可能なアライメントプログラムを用いて、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して比較対象とするアミノ酸配列をアライメントさせることができる。アライメントにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列上の１つのアミノ酸又は２以上のアミノ酸からなる部分アミノ酸配列に対応して、比較対象となるアミノ酸配列がどのようなアミノ酸又は部分アミノ酸配列を有しているかを特定することができる。
第１のモチーフにおけるＸは、特に限定するものではなく、天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸であってもよい。好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシンなどの疎水性アミノ酸とすることができ、好ましくはアラニンである。また、Ｘは、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸又はシステイン若しくはチロシンなどの極性負電荷アミノ酸とすることができ、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸である。
第４のモチーフにおけるＸ1は、特に限定するものではなく、天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸であってもよい。好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン若しくはシステイン又はアスパラギン、グルタミン、トレオニン若しくはセリンである。より好ましくは、アスパラギン酸、アスパラギン又はグルタミンである。
第４のモチーフにおけるＸ2は、特に限定するものではなく、天然アミノ酸であってもよいし、非天然アミノ酸であってもよい。好ましくはグルタミン、アスパラギン、トレオニン若しくはセリン又はアルギニン、リジン若しくはヒスチジンであり、好ましくはグルタミン、ヒスチジン、アルギニンである。又は、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン若しくはフェニルアラニンであり、好ましくは、バリン又はプロリンである。
さらに、第１〜第５の各種マンナナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して以下の関係を有することもできる。すなわち、これらのマンナナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列における、第２７位（Ｒ）、第３１位（G）、第３４位（T）、第３７〜３９位（GLG）、第４１位〜４２位（RK）、第４８位〜５０位（AGG）、第６５位（M）、第６９位（Ｙ）、第７１位〜７３位（YGD）、第７５位（K）、第７８位（D）、第９２位〜９３位（LR）、第１１７位（S）、第１２２位〜１２３位（DV）、第１３３位〜１３４位（YG）、第１５２位（Ｐ）、第１５４位（T）、第１５６位〜１５７位（DI）、第１６０位（Ｙ）、第１６３位〜１６４位（AV）、第１６６位〜１６７位（ＷＩ）及び１７０位（Ｑ）の各アミノ酸に対応するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有することができる。
さらにまた、第１〜第５の各種マンナナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第６１位及び第６３位のグルタミン酸に対応するグルタミン酸を有することが好ましい。これらのグルタミン酸は、マンナナーゼ活性に影響していると考えられる。
例えば、第１のマンナナーゼは、上記のモチーフのほか、特定のアミノ酸を有するほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、第２のマンナナーゼは、配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、第３のマンナナーゼは、配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、第４のマンナナーゼは、配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、第５のマンナナーゼは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。
本明細書で開示する第１〜第５のマンナナーゼが有することができるポリペプチド（以下、単に本ポリペプチドという。）は、ゲル電気泳動等の分離手段で精製された状態であってもよいし、他のタンパク質等が併存した未精製あるいは粗精製のものであってもよい。未精製又は粗精製の本ポリペプチドとして、後述する本ポリペプチドを分泌生産する形質転換体の培養上清又はその粗精製物が挙げられる。本ポリペプチドの製造方法は特に限定されない。本ポリペプチドの製造方法については後段で詳述する。
また、本ポリペプチドは、マンナナーゼ製剤として用いることもできる。マンナナーゼ製剤として使用する場合にも、上述と同様に、製造方法は特に限定されず、各種分離手段によって精製したものであってもよいし、未精製又は粗精製のものであってもよい。
（本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチドという。）は、本ポリペプチドをコードしている。本ポリヌクレオチドとしては、本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、マンナナーゼ活性を有するものが挙げられる。本ポリヌクレオチドは、一つのアミノ酸に対応して、遺伝コードの縮重により発生する複数の態様の塩基配列を包含している。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（一重鎖及び二重鎖）、ＲＮＡ（一重鎖）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ＤＮＡ一重鎖とＲＮＡ一重鎖のハイブリッド）、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、本ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ等、本ポリペプチドをコードするコード化配列のみを有するものであってもよいし、ゲノム等、所定の宿主で対応する本ポリペプチドに翻訳される限り、１又は２以上のイントロンを含んでいてもよい。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチドという。）は、本ポリペプチドをコードしている。本ポリヌクレオチドとしては、本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、マンナナーゼ活性を有するものが挙げられる。本ポリヌクレオチドは、一つのアミノ酸に対応して、遺伝コードの縮重により発生する複数の態様の塩基配列を包含している。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（一重鎖及び二重鎖）、ＲＮＡ（一重鎖）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ＤＮＡ一重鎖とＲＮＡ一重鎖のハイブリッド）、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、本ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ等、本ポリペプチドをコードするコード化配列のみを有するものであってもよいし、ゲノム等、所定の宿主で対応する本ポリペプチドに翻訳される限り、１又は２以上のイントロンを含んでいてもよい。
本ポリヌクレオチドは、例えば、本ポリヌクレオチドをコードする塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、本ポリペプチドの天然の取得源であるA. nidulansから抽出したＤＮＡ、他各種生物のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等由来のポリヌクレオチドを鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、ポリヌクレオチドを断片として得ることができる。また、上記ライブラリー等由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてはハイブリダイゼーションを行うことにより、ポリヌクレオチド断片として得ることができる。あるいは本ポリヌクレオチドは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、ＤＮＡ断片等として合成してもよい。さらにまた、配列番号２、４、６、８及び１０で表されるアミノ酸配列に変異を導入した態様のポリペプチドをコードするＤＮＡ等の本ポリペプチドは、公知のアミノ酸配列における変異導入法において取得される。変異導入法については後段で説明する。そのほか、当業者であれば、既出のMolecular CloningやCurrent protocols in Molecular Biology等を参照することにより、本ポリペプチドについて開示される塩基配列等に基づいて、各種態様の本ポリヌクレオチドを取得することができる。
（発現ベクター及び形質転換体）
本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、本ポリヌクレオチドを含み、好ましくは、さらに、本ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを宿主細胞で発現させるための１又は２以上の要素を含むことができる。こうした要素としては、公知技術に基づき適宜選択されるが、例えば、プロモーター、ターミネーター、ポリＡ配列、シグナルペプチド配列、宿主ゲノム等との相同組み換えによるゲノム導入のための相同配列等が挙げられる。また、ポリヌクレオチド構築物は、形質転換された宿主細胞を選択するためのマーカーを含むことができる。ポリヌクレオチド構築物は、環状あるいは線状のＤＮＡ分子とすることができるほか、典型的には発現ベクターの形態をとりうる。発現ベクター及びその構築方法は、既出のMolecular CloningやCurrent protocols in Molecular Biology等に記載されるほか、当業者において周知である。なお、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、本ポリヌクレオチドを含み、好ましくは、さらに、本ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを宿主細胞で発現させるための１又は２以上の要素を含むことができる。こうした要素としては、公知技術に基づき適宜選択されるが、例えば、プロモーター、ターミネーター、ポリＡ配列、シグナルペプチド配列、宿主ゲノム等との相同組み換えによるゲノム導入のための相同配列等が挙げられる。また、ポリヌクレオチド構築物は、形質転換された宿主細胞を選択するためのマーカーを含むことができる。ポリヌクレオチド構築物は、環状あるいは線状のＤＮＡ分子とすることができるほか、典型的には発現ベクターの形態をとりうる。発現ベクター及びその構築方法は、既出のMolecular CloningやCurrent protocols in Molecular Biology等に記載されるほか、当業者において周知である。なお、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。
ポリヌクレオチド構築物の宿主細胞への導入にあたっては、既出のMolecular CloningやCurrent protocols in Molecular Biology等に記載されている方法を適宜参照し、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
また、本ポリペプチドであって、配列番号２、４、６、８及び１０で表されるアミノ酸配列に点変異等を導入した態様のポリペプチドは、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（タカラバイオ社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。
上記形質転換体の宿主は、特に限定しないで、各種原核微生物や真核微生物を用いることができる。原核微生物や真核微生物は特にその種類を限定しないが、遺伝子組み換え系技術の確立した微生物を用いることが好ましく、特に酵母及び大腸菌が好ましい。
（マンナンの分解産物の生産方法）
本明細書に開示のマンナンの分解産物の生産方法は、本ポリペプチドを用いてマンナンを分解する工程を、備えることができる。
本明細書に開示のマンナンの分解産物の生産方法は、本ポリペプチドを用いてマンナンを分解する工程を、備えることができる。
本方法において分解対象とするマンナンの形態は特に限定しない。マンナンを含みうるリグノセルロース系あるいはその他のバイオマス材料（非可食材料）であってもよい。また、これらのバイオマス材料から分離されたヘミセルロース材料であってもよい。さらには、ある程度精製された又は精製されたマンナンであってもよい。また、マンナンを含む可食性材料であってもよい。こうした可食性材料としては、各種の果実、コーヒー豆、芋又は各種こんにゃくやゼリーなどの芋加工食品等が挙げられる。
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
（機能未知タンパク質の同定）
本実施例では、A. nidulansをグルコマンナン培地で培養した培養上清から機能未知タンパク質を同定した。５００ｍｌの三角フラスコに終濃度１．０％になるようにグルコマンナンを加えた液体培地（グルコマンナンを唯一の炭素源とした最少培地：グルコマンナン培地）を調製し、そこにカウンティングチェンバーを用いて胞子数を合わせた（１μｌあたり２，０００個の胞子数）野生株（ＷＴ株）の胞子懸濁液を５００μｌ接種した。３０℃で２４時間振とう培養し（１００ｒｐｍ）、菌体と培養液をブフナーの漏斗を用いて分離した。回収した培養ろ液を、ビバスピンを用いて２５ｍｌまで濃縮し、さらにそのうちの１ｍｌをＴＣＡ沈殿した。沈殿したタンパク質をアセトンで洗浄後、サンプルバッファーに溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミドゲルの濃度１５％）に供し、一定電流条件下（２０ｍＡ）で泳動した後に、クマシー染色を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。染色後、各バンドを切り出してタンパク質をトリプシンで処理後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳを用いて解析した。得られたデータ（ペプチドフィンガープリント及びＭＳ／ＭＳスペクトル）を用いてＭＡＳＣＯＴサーチすることで、各タンパク質を同定したところ、エンド−１，４−β−マンナナーゼと同様に、図１の表中のＮｏ．７に示す、細胞外に大量に分泌される機能未知タンパク質（ＨＰ）が同定された。
本実施例では、A. nidulansをグルコマンナン培地で培養した培養上清から機能未知タンパク質を同定した。５００ｍｌの三角フラスコに終濃度１．０％になるようにグルコマンナンを加えた液体培地（グルコマンナンを唯一の炭素源とした最少培地：グルコマンナン培地）を調製し、そこにカウンティングチェンバーを用いて胞子数を合わせた（１μｌあたり２，０００個の胞子数）野生株（ＷＴ株）の胞子懸濁液を５００μｌ接種した。３０℃で２４時間振とう培養し（１００ｒｐｍ）、菌体と培養液をブフナーの漏斗を用いて分離した。回収した培養ろ液を、ビバスピンを用いて２５ｍｌまで濃縮し、さらにそのうちの１ｍｌをＴＣＡ沈殿した。沈殿したタンパク質をアセトンで洗浄後、サンプルバッファーに溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミドゲルの濃度１５％）に供し、一定電流条件下（２０ｍＡ）で泳動した後に、クマシー染色を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。染色後、各バンドを切り出してタンパク質をトリプシンで処理後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳを用いて解析した。得られたデータ（ペプチドフィンガープリント及びＭＳ／ＭＳスペクトル）を用いてＭＡＳＣＯＴサーチすることで、各タンパク質を同定したところ、エンド−１，４−β−マンナナーゼと同様に、図１の表中のＮｏ．７に示す、細胞外に大量に分泌される機能未知タンパク質（ＨＰ）が同定された。
（リコンビナントＨＰ及びリコンビナントＭａｎ５の精製）
RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) により、グルコマンナンのみを炭素源として生育させたAspergillus nidulansからＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ（5’-CCCAAGCTTCGGCCCCCACGACGGACATGACCA-3’）（配列番号１３）、プライマーＢ（5’- CCGCTCGAGTTAGATAGCCTGGACATCAACCCAAAAGCG-3’)（配列番号１４）を用いてＰＣＲすることで、ＨＰ遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean(R) 15 DNA Purification Kit（MO BIO）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。制限酵素処理後、pET28aに連結し、ＨＰ発現用プラスミドを構築した。これを大腸菌BL21 CodonPlus株に形質転換することで、ＨＰ発現用大腸菌とした。
RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) により、グルコマンナンのみを炭素源として生育させたAspergillus nidulansからＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ（5’-CCCAAGCTTCGGCCCCCACGACGGACATGACCA-3’）（配列番号１３）、プライマーＢ（5’- CCGCTCGAGTTAGATAGCCTGGACATCAACCCAAAAGCG-3’)（配列番号１４）を用いてＰＣＲすることで、ＨＰ遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean(R) 15 DNA Purification Kit（MO BIO）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。制限酵素処理後、pET28aに連結し、ＨＰ発現用プラスミドを構築した。これを大腸菌BL21 CodonPlus株に形質転換することで、ＨＰ発現用大腸菌とした。
５ｍｌのＬＢ培地（カナマイシン、クロラムフェニコール添加）が入った試験管でＨＰ発現用大腸菌を３時間前培養（１００ｒｐｍ）後、培養液５０μｌを新しい５０ｍｌのＬＢ培地（カナマイシン、クロラムフェニコール、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ添加）が入った３００ｍｌの三角フラスコに移して８時間本培養した。大腸菌を５０ｍｌのファルコンチューブに回収し、遠心分離によって菌体を集めた。それを２５ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、ソニケーションすることで菌体を破砕した。破砕後、サンプルを遠心分離しフィルター（０．２２μｍ）に通すことで、不溶性のものを除去した。その後Ｎｉ−アフィニティーカラムにサンプルを通し、リコンビナントＨＰ（ｒＨＰ）をカラムに吸着させ、バッファーＡで三回洗浄し、３００ｍＭのイミダゾールを含むバッファーＡで溶出することでｒＨＰを精製した。精製したｒＨＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図２に示す。
また、A. nidulans由来の既知のマンナナーゼであるＭａｎ５については、P. pastrisにてリコンビナントＭａｎ５（ｒＭａｎ５）を生産させた後、精製した。A. nidulansのｃＤＮＡからプライマーＣ（5’-CGGGGTACCCGCAAGGGCTTTGTGACCACCAAAGGCGA-3’）（配列番号１５）及びプライマーＤ（5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTACCGTCTCCGGTTCAACTTGTT-3’）（配列番号１６）を用いてＰＣＲすることで、Ｍａｎ５遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean(R) 15 DNA Purification Kit（MO BIO）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。制限酵素処理後、pPICZα-A（Invitrogen）に連結し、Ｍａｎ５発現用プラスミドを構築した。これをPichia pastris KH71株に形質転換することで、Ｍａｎ５発現用P. pastrisとした。
Ｍａｎ５発現用P. pastrisによるリコンビナントＭａｎ５（ｒＭａｎ５）の生産はEasySelectTMPichia Expression Kit（Invitrogen）に添付のマニュアル通りに行った。３ＬのＢＭＭＹ培地でＭａｎ５発現用P. pastrisを培養後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムにてｒＭａｎ５を精製した。酵素活性の測定などに使用する際は透析し、脱塩して使用した。精製したｒＭａｎ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図２に示す。
（ｒＨＰの基質特異性）
本実施例では、ｒＨＰの基質特異性について調べた。１．０％の種々の炭素源を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＭａｎ５、ｒＨＰ又はＣ末端にヒスタグを付加したｒＨＰ（ｒＨＰ−ＣＨｉｓ）を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて還元糖量を測定した。種々の炭素源には、キチン、キシラン、セルロース、ガラクトマンナン、グルコマンナンを用いた。結果を図３に示す。
本実施例では、ｒＨＰの基質特異性について調べた。１．０％の種々の炭素源を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＭａｎ５、ｒＨＰ又はＣ末端にヒスタグを付加したｒＨＰ（ｒＨＰ−ＣＨｉｓ）を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて還元糖量を測定した。種々の炭素源には、キチン、キシラン、セルロース、ガラクトマンナン、グルコマンナンを用いた。結果を図３に示す。
また、ＴＬＣを用いて反応生成物を確認した。種々の炭素源とｒＨＰとによる反応液をＴＬＣ板に１μｌスポットし、展開した。展開層は、ｎ−ブタノール：エタノール：水＝１０：８：７とした。展開後、ドライヤーで完全に乾かした後に発色剤を吹きかけ、さらに５分間ドライヤーで加熱することで反応生成物を検出した。発色剤は、N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride(8.2g/L)及びSulfuric acid(8.6%)をエタノールで調製したものを用いた。種々の炭素源には、キシラン、キチン、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを用いた。なお、コントロールとして、ｒＨＰを添加していない炭素源をそれぞれスポットした。結果は図４に示す。
図３に示すように、ｒＨＰは、ｒＭａｎ５と同様に、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを加水分解し、マンナンでない炭素源のキチン、キシラン及びセルロースを加水分解しなかった。また、図４に示すように、ｒＨＰは、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを加水分解し、マンナンでない炭素源のキシラン、キチン、ＭＣＣ及びＣＭＣを加水分解しなかった。これらの結果から、ｒＨＰは、マンナンを特異的に加水分解とすることがわかった。
さらに、図３に示すように、ｒＨＰ−ＣＨｉｓは、ｒＭａｎ５及びｒＨＰと比較して、ガラクトマンナン及びグルコマンナンについても還元糖がほとんど生成しなかった。この結果は、ｒＨＰは、Ｃ末端にヒスタグを付加すると、エンド−１，４−β−マンナナーゼ活性が低下することを示唆している。
（ｒＨＰのエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性）
本実施例では、ｒＨＰのエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性について調べた。１．０％のグルコマンナン（Megazyme International）を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＭａｎ５又はｒＨＰを添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて経時的に還元糖量を測定することでエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を算出した。結果を図５の上図に示す。
本実施例では、ｒＨＰのエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性について調べた。１．０％のグルコマンナン（Megazyme International）を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＭａｎ５又はｒＨＰを添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて経時的に還元糖量を測定することでエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を算出した。結果を図５の上図に示す。
また、ＴＬＣを用いて反応生成物を確認した。グルコマンナンとｒＭａｎ５、グルコマンナンとｒＨＰとによる各反応液をＴＬＣ板に１μｌスポットし、展開した。ＴＬＣを用いた反応生成物の検出は、実施例２と同様の方法で行った。なお、反応生成物と対比するため、コントロール（ｓｔｄ）としてMegazyme Internationalより購入したマンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６）を用いた。結果を図５の下図に示す。
図５の上図及び下図に示すように、ｒＨＰのグルコマンナン分解生成物は、ｒＭａｎ５及びエンド−１，４−β−マンナナーゼによる分解生成物と同様のクロマトグラムを呈した。この結果から、ｒＨＰは、エンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を有することがわかった。
（ｒＨＰのマンノオリゴ糖に対する基質特異性）
本実施例では、ｒＨＰのマンノオリゴ糖に対する基質特異性について調べた。５ｍＭのマンノオリゴ糖（マンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６））を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＨＰを添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃で０分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、１２時間インキュベートした。これらの反応生成物を、実施例２及び３と同様の方法で、ＴＬＣを用いて検出した。結果を図６に示す。
本実施例では、ｒＨＰのマンノオリゴ糖に対する基質特異性について調べた。５ｍＭのマンノオリゴ糖（マンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６））を基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＨＰを添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃で０分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、１２時間インキュベートした。これらの反応生成物を、実施例２及び３と同様の方法で、ＴＬＣを用いて検出した。結果を図６に示す。
また、ＨＰＬＣ（Prominence reducing sugar analysis system、Shimadzu）を用いて基質の減少と反応物の生成をモニターした。カラムにはShim-pack ISA-07/S2504 column（４．０×２５０ｍｍ、Shimadzu）を用いた。ＨＰＬＣの溶離液には０．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）と０．４Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）を用いて、リニアグラジエントにて流速０．６ｍＬ ｍｉｎ−１、７０分間分析した。基質の減少量と反応物の生成量はそれぞれの標品を用いて定量した。結果を図７に示す。
図６及び図７に示すように、ｒＨＰは、マンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）及びマンノテトラオース（Ｍ４）を加水分解しなかったが、マンノペンタオース（Ｍ５）及びマンノヘキサオース（Ｍ６）を加水分解した。また、図７に示すように、マンノヘキサオース（Ｍ６）を基質とした場合には、分解物としてマンノトリオース（Ｍ３）を多く生成した。これらの結果から、ｒＨＰは、五糖以上のマンノオリゴ糖を基質として加水分解できることがわかった。
（ＨＰの属するＧＨファミリー）
本実施例では、ＨＰが属するＧＨファミリーについて検討した。ブラスト検索を行いＨＰのオルソログを選抜し、ClustalWにてアラインメントを作成した。また、ＭＥＧＡを用いて分子系統樹を作成した。なお、ＭＥＧＡ（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）は、分子進化や系統学的解析を行うためのソフトウェアである。分子系統樹を図８に示す。
本実施例では、ＨＰが属するＧＨファミリーについて検討した。ブラスト検索を行いＨＰのオルソログを選抜し、ClustalWにてアラインメントを作成した。また、ＭＥＧＡを用いて分子系統樹を作成した。なお、ＭＥＧＡ（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）は、分子進化や系統学的解析を行うためのソフトウェアである。分子系統樹を図８に示す。
図８に示すように、ＨＰは、既知のマンナナーゼが属しているＧＨ５又はＧＨ２６ファミリーに属していないことがわかった。すなわち、ＨＰは、新規のＧＨファミリーに属することが示唆された。
本実施例では、ｒＨＰのさらなる特徴について調べた。
（ｒＨＰの至適ｐＨ）
ｒＨＰのマンナナーゼ活性に対する至適ｐＨについて調べた。１％グルコマンナンを基質として、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．０−６．０）、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ５．０−７．０）及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０−１０．０）中にてエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を測定することによりｒＨＰ及びｒＭａｎ５の至適ｐＨを求めた。また、公知の方法を用いて、ｒＨＰ及びｒＭａｎ５についてグルコマンナン及びガラクトマンナンに対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値及びＫｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。これらの結果を図９に示す。
ｒＨＰのマンナナーゼ活性に対する至適ｐＨについて調べた。１％グルコマンナンを基質として、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．０−６．０）、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ５．０−７．０）及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０−１０．０）中にてエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を測定することによりｒＨＰ及びｒＭａｎ５の至適ｐＨを求めた。また、公知の方法を用いて、ｒＨＰ及びｒＭａｎ５についてグルコマンナン及びガラクトマンナンに対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値及びＫｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。これらの結果を図９に示す。
図９に示すように、ｒＨＰのグルコマンナンに対する至適ｐＨは、ｐＨ５〜７であることがわかった。また、ｒＭａｎ５の至適ｐＨはｐＨ３〜５の酸性域であるのに対し、ｒＨＰの至適ｐＨは中性域であることがわかった。また、ｒＨＰのＫｍ値は１．２ｍｇ／ｍｌ、Ｋｃａｔ値は３９０s−１、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は３３０ｍｌ−１s−１ｍＭであった。
（ｒＨＰの至適温度）
ｒＨＰの至適温度について調べた。１．０％のグルコマンナンを基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＨＰ又はｒＭａｎ５を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、２０〜１００℃にてインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて経時的に還元糖量を測定することでｒＨＰ及びｒＭａｎ５の至適温度を求めた。結果を図１０に示す。
ｒＨＰの至適温度について調べた。１．０％のグルコマンナンを基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＨＰ又はｒＭａｎ５を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、２０〜１００℃にてインキュベートし、ＤＮＳ法を用いて経時的に還元糖量を測定することでｒＨＰ及びｒＭａｎ５の至適温度を求めた。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ｒＭａｎ５の至適温度は約５０〜６０℃であるのに対し、ｒＨＰの至適温度は、３０〜４０℃であった。
（ｒＨＰの耐熱性）
ｒＨＰの耐熱性について調べた。２０ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）溶液にｒＨＰ又はｒＭａｎ５を溶解させ２０−１００℃にて１５分間インキュベート後、１．０％のグルコマンナンを基質として２０ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）溶液中（３７℃）で同様にエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を測定することで、ｒＨＰ及びｒＭａｎ５の温度耐性を算出した。結果を図１１に示す。
ｒＨＰの耐熱性について調べた。２０ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）溶液にｒＨＰ又はｒＭａｎ５を溶解させ２０−１００℃にて１５分間インキュベート後、１．０％のグルコマンナンを基質として２０ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）溶液中（３７℃）で同様にエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を測定することで、ｒＨＰ及びｒＭａｎ５の温度耐性を算出した。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ｒＨＰは、２０℃における酵素活性に対して、２０〜５０℃で８０％以上、５０〜１００℃で６０％以上の活性を有していた。また、ｒＭａｎ５は、２０℃における酵素活性に対して、７０℃で６０％以下であり、８０℃以上では１０％以下であった。この結果から、ｒＨＰは、既知のマンナナーゼと比較して、高い耐熱性をもつことがわかった。
本実施例では、ＨＰとアミノ酸レベルで高い相同性を持つ、Aspergillus oryzae由来のタンパク質ＡＯ４４５（配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなる。）について調べた。
（Pichia pastris発現系を利用したリコンビナントＡＯ４４５の調製）
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）により、グルコマンナンのみを炭素源として生育させたAspergillus oryzaeからＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＥ（5’-CGGGGTACCGCTCCAACTCCCGATGCTTCC-3’）（配列番号１７）、プライマーＦ（5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGATGGCACGAACATTGACCCAAA-3’）（配列番号１８）を用いてＰＣＲすることで、ＨＰ遺伝子と高い相同性を持つＡＯ４４５遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean(R) 15 DNA Purification Kit（MO BIO）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。制限酵素処理後、pPICZα-A（Invitrogen）に連結し、ＡＯ４４５発現用プラスミドを構築した。これをPichia pastris KH71株に形質転換することで、ＡＯ４４５発現用P. pastrisとした。
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）により、グルコマンナンのみを炭素源として生育させたAspergillus oryzaeからＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＥ（5’-CGGGGTACCGCTCCAACTCCCGATGCTTCC-3’）（配列番号１７）、プライマーＦ（5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGATGGCACGAACATTGACCCAAA-3’）（配列番号１８）を用いてＰＣＲすることで、ＨＰ遺伝子と高い相同性を持つＡＯ４４５遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean(R) 15 DNA Purification Kit（MO BIO）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。制限酵素処理後、pPICZα-A（Invitrogen）に連結し、ＡＯ４４５発現用プラスミドを構築した。これをPichia pastris KH71株に形質転換することで、ＡＯ４４５発現用P. pastrisとした。
ＡＯ４４５発現用P. pastrisによるリコンビナントＡＯ４４５（ｒＡＯ４４５）の生産はEasySelectTMPichia Expression Kit（Invitrogen）に添付のマニュアル通りに行った。３ＬのＢＭＭＹ培地でＡＯ４４５発現用P. pastrisを培養後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムにてｒＡＯ４４５を精製した。酵素活性の測定などに使用する際は透析し、脱塩して使用した。精製したｒＡＯ４４５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図１２に示す。
（ｒＡＯ４４５のエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性）
ｒＡＯ４４５のエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性について調べた。１．０％のグルコマンナンを基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＡＯ４４５又はｒＭａｎ５を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートした。これらの反応生成物を、実施例２と同様の方法で、ＴＬＣを用いて検出した。なお、反応生成物と対比するため、コントロール（ｓｔｄ）としてMegazyme Internationalより購入したマンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６）を用いた。結果を図１３に示す。
ｒＡＯ４４５のエンド−１，４−β−マンナナーゼ活性について調べた。１．０％のグルコマンナンを基質として、１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５）を１００μｌ及び終濃度が０．５μＭになるようにｒＡＯ４４５又はｒＭａｎ５を添加し、脱イオン水にて全量で５００μｌにした。その後、３７℃でインキュベートした。これらの反応生成物を、実施例２と同様の方法で、ＴＬＣを用いて検出した。なお、反応生成物と対比するため、コントロール（ｓｔｄ）としてMegazyme Internationalより購入したマンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６）を用いた。結果を図１３に示す。
図１３に示すように、ｒＡＯ４４５によるグルコマンナン分解生成物は、既知のマンナナーゼであるｒＭａｎ５による分解生成物と同様の検出パターンを示した。この結果から、ＡＯ４４５も、エンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を有することがわかった。
本タンパク質について、実施例６に準じて、至適ｐＨを調べたところ、図１４に示すように、至適ｐＨは５であった。また、本タンパク質のマンナナーゼとしてのグルコマンナンに対してのＫｍ値は１．8±０．２ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は、５９０／secであり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は３３０ｍｌ／ｍｇ・secであった。また、ガラクトマンナンに対するＫｍ値は５．1±０．４ｍｇ／ｍｌであり、Ｋｃａｔ値は、２９０／secであり、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値は５７ｍｌ／ｍｇ・secであった。
また、実施例６に準じて至適温度を測定したところ、至適温度は約３０℃であり、耐熱性は、８０℃で２０℃における酵素活性に対する活性の割合（％）として７０％以上であった。
実施例１で同定されたA. nidulans由来のマンナナーゼについての配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して高い同一性を有するものとして、A. nidulans由来の２種のタンパク質（6833及び6951）とStreptomyces. Sp由来のタンパク質（134）のアミノ酸配列を取得した（配列番号４、６及び１０）。
A. nidulans野生株を実施例１と同様の手法でグルコマンナン培地で培養してＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡを得たのち、抽出されたA. nidulans由来のタンパク質（6833、6951）のアミノ酸配列をそれぞれコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号３、５）に基づいて設計したプライマーを用いて、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を増幅して発現用プラスミドを調製し、大腸菌に形質転換し、目的タンパク質を製造させたのち、精製した。
第５のマンナナーゼであるタンパク質は、NCBIに登録されているWP_030268297.1のアミノ酸配列から、それをコードするDNAの塩基配列（配列番号９）を合成した。DNAの塩基配列（配列番号９）に基づいて設計したプライマーを用いて、目的タンパク質をコードする遺伝子を増幅してpET28aに連結することで発現用プラスミドを調製し、大腸菌に形質転換して目的タンパク質を製造させた後、精製した。
これらのタンパク質につき、実施例２に準じて、基質特異性について調べたところ、これらのタンパク質はいずれも、ｒＭａｎ５と同様に、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを加水分解し、マンナンでない炭素源のキチン、キシラン及びセルロースを加水分解しなかった。また、これらのタンパク質は、いずれも、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを加水分解し、マンナンでない炭素源のキシラン、キチン、ＭＣＣ及びＣＭＣを加水分解しなかった。これらの結果から、これらのタンパク質は、マンナンを特異的に加水分解とすることがわかった。
また、実施例３に準じて、エンド−１，４−β−マンナナーゼ活性について調べたところ、これらのタンパク質はいずれも、エンド−１，４−β−マンナナーゼ活性を有することがわかった。
また、実施例４に準じて、マンノオリゴ等に対する基質特定を調べたところ、配列番号４及び１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、五糖以上のマンノオリゴ糖を基質として加水分解でき、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、六糖以上のマンノオリゴ糖を基質として分解できることがわかった。
また、これらのタンパク質について、実施例６に準じて、至適ｐＨ及び耐熱性等を調べた。結果を、図１５に示す。図１５に示すように、いずれもｐＨ５近傍が至適ｐＨであった。
A. nidulans由来のマンナナーゼである、配列番号２、４、６でそれぞれ表されるアミノ酸配列と、A. oryzae由来のマンナナーゼである配列番号８で表されるアミノ酸配列と、配列番号１０で表されるStreptomyces. Sp由来のマンナナーゼを、ClustalW version 2.1 によってアライメントした。結果を図１６に示す。
図１６に示すように、これらのタンパク質は、４つの特徴的モチーフを有していることがわかった。また、これらのモチーフに加えて、同一のアミノ酸を４６個備えていることがわかった。
配列番号２で表されるA. nidulans由来のマンナナーゼにつき、マンナナーゼ活性が確認できたホモログやオルソログとのアライメント等から、活性部位に影響する可能性がある候補部位に部位特異的変異の導入によりアラニンを導入した。本実施霊では、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｅ６１Ａ、Ｅ６３Ａ、Ｄ７３Ａ、Ｄ７８Ａ、Ｅ１０６Ａ、Ｗ１６６Ａ及びＮ１１６Ａを得た。なお、部位特異変異導入は、インバースＰＣＲにより、目的に応じたプライマーを設計して、所望の変異を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換用プラスミドを作製し、実施例１に準じてタンパク質を取得した。これらのタンパク質につき、実施例６に準じてグルコマンナンに対する酵素学的パラメータを算出した。結果を図１７に示す。
図１７に示すように、Ｅ６１Ａ及びＥ６３Ａについては、マンナナーゼ活性が消失したため、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第６１位及び第６３位は、活性部位であることがわかった。また、他の変異体も、Ｋｍ値が低い、ｋｃａｔ値が高いなど、優れた変異体が得られた。例えば、Ｗ１６６Ａ（配列番号１９）は、好適な変異体であることがわかった。
配列番号１３〜１８：プライマー
配列番号１９：変異タンパク質
配列番号１９：変異タンパク質
Claims (11)
- 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドを有効成分とする、マンナナーゼ活性を有する酵素剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるポリペプチド。 - 前記マンナナーゼはAspergillus nidulans由来であることを特徴とする、請求項１に記載の酵素剤。
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、前記アミノ酸配列の第１３８位〜１４８位に対応するWFAGHRNGXSG（Xは任意のアミノ酸を表す。）からなる第１のモチーフ、前記アミノ酸配列の第５４位〜６１位に対応するDLAI/VAMLEからなる第２のモチーフ、前記アミノ酸配の第８１位〜８９位に対応するNFGI/LFKQNWからなる第３のモチーフ、前記アミノ酸配列の第１８１位〜１９１位に対応するDTRFWVＸ1VX2AI（ただし、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。）を有し、
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、マンナナーゼ活性を有する酵素剤。 - さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列における、第２７位（Ｒ）、第３１位（G）、第３４位（T）、第３７〜３９位（GLG）、第４１位〜４２位（RK）、第４８位〜５０位（AGG）、第６５位（M）、第６９位（Ｙ）、第７１位〜７３位（YGD）、第７５位（K）、第７８位（D）、第９２位〜９３位（LR）、第１１７位（S）、第１２２位〜１２３位（DV）、第１３３位〜１３４位（YG）、第１５２位（Ｐ）、第１５４位（T）、第１５６位〜１５７位（DI）、第１６０位（Ｙ）、第１６３位〜１６４位（AV）、第１６６位〜１６７位（ＷＩ）及び１７０位（Ｑ）の各アミノ酸に対応するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３に記載の酵素剤。
- 以下のポリペプチド；
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアラインメントしたとき、前記アミノ酸配列の第１３８位〜１４８位に対応するWFAGHRNGXSG（Xは任意のアミノ酸を表す。）からなる第１のモチーフ、前記アミノ酸配列の第５４位〜６１位に対応するDLAI/VAMLEからなる第２のモチーフ、前記アミノ酸配の第８１位〜８９位に対応するNFGI/LFKQNWからなる第３のモチーフ、前記アミノ酸配列の第１８１位〜１９１位に対応するDTRFWVＸ 1 VX 2 AI（ただし、Ｘ 1 及びＸ 2 は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を表す。）を有し、
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドでであって、
配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるいずれかのポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを有効成分とする、マンナナーゼ活性を有する酵素剤。 - 請求項１〜５のいずれかに記載の酵素剤の有効成分である前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１又は２以上の前記ポリヌクレオチドを発現させるための要素と、を含む、マンナナーゼ活性を有する酵素剤を生産するための発現ベクター。
- 請求項６に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞を含有する、マンナナーゼ活性を有する酵素剤を生産するための剤。
- 前記形質転換細胞は大腸菌である、請求項７に記載の剤。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の酵素剤を生産する方法であって、
マンナナーゼを産生する条件下で請求項７又は８に記載の剤に用いる前記形質転換細胞を培養する工程と、
前記培養物からマンナナーゼ活性を有するペプチドを回収する工程と、
を備える、方法。 - マンナンの分解産物の生産方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素剤を用いてマンナン含有材料を分解する工程、を備える、方法。 - 前記マンナン含有材料を７０℃以上の温度で分解する、請求項１０に記載の方法。
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