KR101796060B1

KR101796060B1 - 한천을 분해하여 네오한천올리고당을 생성할 수 있는 아가라제

Info

Publication number: KR101796060B1
Application number: KR1020170077593A
Authority: KR
Inventors: 오철홍; 이영득; 조은영; 강도형; 박건후; 김태호
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2017-11-10

Abstract

본 발명은 서열번호 6의 아가라아제에 대한 것이다. 본 발명의 아가라아제는 한천 가수분해효소로서, 한천의 이용에 유용하다.

Description

한천을 분해하여 네오한천올리고당을 생성할 수 있는 아가라제{AGARASE GENERATING NEOAGAROOLIGOSACCHARIDE BY HYDROLYZING AGAR}

본 발명은 한천을 분해하여 네오한천올리고당을 생성할 수 있는 아가라아제에 대한 것이다.

해조류는 중성다당류로 전분과 셀룰로오스 외에 육상식물과 구분되는 한천, 카라기난 등 황화된 다당류를 풍부하게 가지고 있다. 한천은 홍조류인 photophyta에 속하는 종에서 유래하며 우뭇가사리, 석무, 꼬시래기 등의 세포벽을 구성하는 성분으로 이들 한천은 아가로스와 아가로펙틴으로 구성된 다당체로 3-O-linked β-D-galactopyranose와 4-O-linked 3,6-anhydro-α-L-galactose의 연결이 교차로 이루어져 있다.

한천은 그 자체로 식품산업과 의약품, 향장품 산업 등에 이용되고 있지만 네오한천올리고당은 항암효과 면역증진효과, 항산화효과, 프리바이오틱(prebiotic) 효과, 간보호 효과, 항균, 미백, 보습 효과등의 다양한 기능성이 보고되어 있어, 아가라아제를 이용한 한천올리고당의 생산은 기존의 한천 원재료를 직접 이용하는 것에 비하여 매우 높은 고부가가치를 가질 수 있다. 그러므로 한천으로부터 고부가가치 산물을 수득하려는 노력이 이루어지고 있다(한국등록특허 10-1641173호).

본 발명은 고부가가치를 지닌 네오한천올리고당을 생성할 수 있는 효소들을 연구하던 중 길비마리누스 아가로라이티쿠스 유래의 효소를 변형시켜 제조한 재조합 효소가 한천을 분해하여 높은 효율로 네오한천올리고당을 생성하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 한천으로부터 네오한천올리고당을 높은 수율로 생성할 수 있는 아가라아제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, 한천의 분해능을 갖는 아가라아제를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 아가라아제를 이용하여 한천을 가수분해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 아가라아제는 한천을 가수분해하여 네오한천올리고당을 높은 수율로 생성할 수 있다.

도 1은 Gaa16B (a), MGaa16B (b), MGaa16B-C (c)의 아미노산 서열구조를 나타낸다.
도 2는 재조합 Gaa16B (a), MGaa16B (b), MGaa16B-C (c) 의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 MGaa16B (1) 및 MGaa16B-C (2)의 재조합 단백질 정제에 대한 SDS-PAGE 분석결과이다.
도 4는 재조합 MGaa16B-C의 pH에 따른 효소 활성을 나타낸다.
도 5는 재조합 MGaa16B-C의 온도에 따른 효소 활성을 나타낸다.
도 6은 재조합 MGaa16B-C의 열에 대한 안정성을 나타낸다.
도 7은 금속이온 또는 화학물질에 의한 재조합 MGaa16B-C의 효소 활성을 나타낸다.
도 8은 재조합 MGaa16B-C의 아가로스 가수분해물 분석 결과이다.

본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되며, 한천의 분해능을 갖는 아가라아제에 대한 것이다.

또한 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자에 대한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 아가라아제를 준비하는 단계;및

상기 아가라아제를 한천에 가하는 단계를 포함하는

한천의 가수분해 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

아가라아제

본 발명의 아가라아제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 이는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 6과 80%의 상동성을 가지며 아가라아제 활성을 80% 이상 유지하는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 6과 85%의 상동성을 가지며 아가라아제 활성을 85% 이상 유지하는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 6과 90%의 상동성을 가지며 아가라아제 활성을 90% 이상 유지하는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 더더욱 바람직하게는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 6과 95%의 상동성을 가지며 아가라아제 활성을 95% 이상 유지하는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 6과 98%의 상동성을 가지며 아가라아제 활성을 98% 이상 유지하는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다.

본 발명의 아가라아제는 서열번호 5의 염기서열로부터 만들어질 수 있다. 이는 본 발명의 아가라아제가 서열번호 5와 80% 이상의, 바람직하게는 85 % 이상의, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 더더욱 바람직하게는 95% 이상의, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로부터 만들어지는 것을 포함한다.

본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자에 대한 것이다. 이는 서열번호 6과 80% 이상의, 바람직하게는 85 % 이상의, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 더더욱 바람직하게는 95% 이상의, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 포함한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 이용하여 제조된 아가라아제에 대한 것이다. 이는 서열번호 6와 80% 이상의, 바람직하게는 85 % 이상의, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 더더욱 바람직하게는 95% 이상의, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 이용하여 제조된 아가라아제를 포함한다.

본 발명의 아가라아제는 pH 9에서의 효소 활성을 기준으로 할 때(즉, pH 9에서의 효소 활성을 100%로 할 때), pH 6 초과 pH 9 미만의 pH 범위에서 80% 이상의 효소 활성을 갖는다. 또한 본 발명의 아가라아제는 pH 10에서 효소 활성이 없다.

본 발명의 아가라아제는 65 ℃에서의 효소 활성을 기준으로(즉, 65 ℃에서의 효소 활성을 100%로 할 때), 55℃에서 80% 이상 100 % 미만의 효소 활성을 갖는다.

본 발명의 아가라아제는 KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, FeSO4 또는 EDTA에 의하여 효소 활성이 증가된다. 바람직하게는 본 발명의 아가라아제는 MnCl2 또는 FeSO4의 처리 시 효소 활성이 2배 이상 증가한다. 그러나 본 발명의 아가라아제는 CuSO4 또는 ZnSO4 처리시에는 효소 활성이 현저히 감소하였다.

본 발명의 아가라아제는 서열번호 6의 염기서열을 포함하며, 한천의 분해능을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 아가라아제는 한천을 분해하여 네오한천올리고당을 생성한다. 바람직하게는 본 발명의 아가라아제는 한천을 분해하여 한천 분해 시 4당을 2당 또는 6당보다 더 많이 생성한다.

한천의 가수분해 방법

본 발명은,

본 발명의 아가라아제를 준비하는 단계;및

상기 아가라아제를 한천에 가하는 단계를 포함하는

한천의 가수분해 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명의 상기 한천의 가수분해 방법에 의하여 생성된 한천 가수분해물을 포함한다. 상기 한천 가수분해물은 4당을 2당보다 많이 포함한다. 또한 상기 한천 가수분해물은 4당을 6당보다 많이 포함한다. 상기 한천 가수분해물은 네오한천올리고당을 높은 비율로 포함한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1>

제주도 연안의 해조류가 많이 서식하는 지역의 해수를 채집하고 이를 한천배지에 도말하여 25°C 배양기에서 5일간 배양하여 한천 분해능을 보이는 균주 Gilvimarinus agarolyticus JEA5를 분리하였다. Illumina Hiseq 2000을 이용하여 염기서열을 분석한 후 NCBI BLAST를 이용하여 한천분해효소(agarase)와 높은 상동성(homology)를 보이는 유전자 Gaa16B(NCBI accession No. KP716980, 2015년 12월 31일 공개))를 확인하였는데, 그 염기서열은 서열번호 1과 같다.

<1-1> Gaa16B 서열 분석

Gaa16B는 1800 bp의 ORF로 600개의 아미노산을 암호화하는 것으로 나타났는데, Gaa16B가 코드하는 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다(표 1, 서열번호 2의 밑줄 부분은 신호(signal) 펩타이드 서열임). 예상되는 분자량은 65 kDa으로 N-말단 부위에 신호 펩타이드, C-말단 부위에 탄수화물(Carbohydrate) 결합(binding) 모듈(module) 6 (CBM6), 그리고 중앙에 글리코실(glycosyl) 하이드롤라제(hydrolase) 16 (GH16) 도메인으로 구성되어 있었다(도 1, a).

<표 1>

EMBL-EBI pairwise alignment tool (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)을 이용하여 NCBI에 등록된 아가라아제 서열과 Gaa16B의 서열의 상동성을 비교하였다. 그 결과, Gaa16B의 서열은 Gilvimarinus 속의 균주인 G. polysaccharolyticus, G. Chinesis와 90.7, 89.7%의 동일성(identity)를 보였으나, G. polysaccharolyticus 및 G. Chinesis의 이들 유전자에 대한 특성 분석은 기존에 수행되어 있지 않다. 한편, 기존에 특성 분석이 수행된 아가아라제 중에는 Saccharophagus degradans 2-40 (ABD80437)이 있으나 Gaa16B의 서열과 비교한 결과, 55.9%의 동일성 만을 나타내었다(표 2).

<표 2>

<1-2> MGaa16B의 제조 및 서열 분석

Gaa16B가 코드하는 아미노산 서열(서열번호 2)의 N-말단(terminal) 부위에서 신호 펩타이드를 제거하고 그 자리에 말토스(maltose) 결합(binding) 단백질(protein)을 연결시켜, MGaa16B를 제조하였다(도 1, b). 상기 MGaa16B을 코드하는 유전자의 염기서열은 서열번호 3과 같으며, 이는 2991 bp의 ORF로 997개의 아미노산을 암호화하고 있다. MGaa16B의 아미노산 서열은 서열번호 4와 같고, MGaa16B의 예상되는 분자량은 108 kDa이다(표 3).

<표 3>

<1-3> MGaa16B-C의 제조 및 서열 분석

Gaa16B가 코드하는 아미노산 서열(서열번호 2)의 N-말단 부위에서 신호 펩타이드를 제거하고, 그 자리에 말토스 결합 단백질을 연결시키고, C-말단 부위에서 탄수화물(Carbohydrate) 결합(binding) 모듈(module) 6 서열을 제거하여, 단백질 MGaa16B-C를 제조하였다(도 1, c). 상기 제거된 신호(signal) 펩타이드(peptide)의 아미노산 서열은 서열번호 12와 같고, 이를 코드하는 염기서열은 서열번호 13과 같다. 상기 연결된 말토스 결합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14와 같고, 이를 코드하는 염기서열은 서열번호 15이다. 상기 제거된 탄수화물 결합 모듈(carbohydrate binding module) 6의 아미노산 서열은 서열번호 16과 같고, 이를 코드하는 염기서열은 서열번호 17이다.

상기 MGaa16B-C을 코드하는 유전자의 염기서열은 서열번호 5와 같으며, 이는 2139 bp의 ORF로 713개의 아미노산을 암호화하고 있다. MGaa16B-C의 아미노산 서열은 서열번호 6과 같고, MGaa16B-C의 예상되는 분자량은 79 kDa이다(표 4).

<표 4>

<실시예 2>

바이오니아사의 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 Gilvimarinus agarolyticus JEA5로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 게놈 DNA를 주형으로 Gaa16B 재조합 단백질 생산을 위해 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍을, MGaa16B 재조합 단백질 생산을 위해 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을, MGaa16B-C 재조합 단백질 생산을 위해 서열번호 9 및 11의 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응을 통해 유전자를 각각 증폭 하였다 (표 5). 서열번호 7 및 8은 pET11a 발현 벡터에 클로닝 하기 위해 NdeI과 BamHI 자리(site) 부위에 5’과 3’ 말단의 연속된 15 bp를 포함하도록 제작하였으며, 서열번호 9, 10 및 11은 pMal-c2x 발현 벡터에 클로닝 하기 위해 BamHI과 SalI 삽입부위의 5´과 3´말단의 연속된 15 bp를 포함하도록 제작하였다. PCR반응액은 총 50 μL로 5 μL의 10X LA PCR 버퍼(buffer) II (Mg2+ free; TaKaRa, Japan), 5 μL의 25 mM MgCl2, 500 ng의 gDNA를 혼합하고 10 pmol의 프라이머 2개를 각각 1 μL를 첨가한 후 TaKaRa 사의 Thermal cycler를 이용하여 각각의 서열을 증폭한 후 1% 아가로스(agarose) 겔(gel)에 전기영동하여 확인하였고, 겔 정제 키트(gel purification kit) (Bioneer, Korea)를 이용하여 각각의 PCR 산물들을 정제하였다.

<표 5>

<실시예 3>

<3-1> Gaa16B 재조합 단백질 생산

pET11a (Novagen, USA) 발현벡터를 NdeI (TaKaRa, Japan) 과 BamHI (TaKaRa, Japan) 제한효소를 이용하여 37°C에서 2시간동안 절단한 후, 상기 <실시예 2>에서 Gaa16B 재조합 단백질 생산을 위해 PCR 증폭한 산물을 Ez-융합(Fusion) 클로닝(Cloning) 키트(Kit) (Enzynomics, Korea)을 이용하여 절단된 pET11a 벡터 내로 삽입하고 이를 E. coli DH5α에 형질전환 하였고, 이를 다시 발현용 세포인 E. coli BL21(DE3)에 재형질전환하였다. 형질전환된 대장균 세포를 ampicillin이 첨가된 5 mL의 LB 배지(broth)에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양 후, 이를 500 mL의 동일한 배지에서 OD600=0.6~08까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl-β-D-thiolgalactoside)를 최종농도 1 mM이 되도록 첨가하여 30 ℃에서 3시간동안 재조합 Gaa16B의 과발현을 유도하였다.

과발현된 단백질들의 확인을 위하여 발현된 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 4 ℃, 1,5000rpm에서 30분간 원심분리하여 용해성과 불용성 단백질을 구분하였고 SDS-PAGE로 단백질을 확인하였다.

그 결과, Gaa16B 는 강하게 발현된 것이 확인되었으나 과발현된 Gaa16B 단백질들 대부분이 불용성인 것으로 확인되었다 (도 2, a).

<3-2> MGaa16B 및 MGaa16B-C 재조합 단백질 생산

pMal-c2x (NEB, UK) 발현벡터는 BamHI과 SalI (TaKaRa, Japan)제한효소를 이용하여 37°C에서 2시간동안 절단한 후, 상기 <실시예 2>에서 MGaa16B 및 MGaa16B-C 재조합 단백질 생산을 위해 PCR 증폭한 산물들을 Ez-융합 클로닝 키트 (Enzynomics, Korea)을 이용하여 절단된 pMal-c2x 벡터 내로 삽입하고 이를 E. coli DH5α에 형질전환 하였고, 이를 다시 발현용 세포인 E. coli BL21(DE3)에 재형질전환하였다. 형질전환된 대장균 세포를 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 5 mL의 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양 후, 이를 500 mL의 동일한 배지에서 OD600=0.6~08까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl-β-D-thiolgalactoside)를 최종농도 1 mM이 되도록 첨가하여 30 ℃에서 3시간동안 재조합 MGaa16B 및 MGaa16B-C의 발현을 유도하였다.

과발현된 단백질들의 확인을 위하여 발현된 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 4 ℃, 1,5000rpm에서 30분간 원심분리하여 용해성과 불용성 단백질을 구분하였고 SDS-PAGE로 단백질을 확인하였으며, pMALTM 단백질 융합 및 정제 시스템(Protein Fusion and Purification System) (NEB, UK)를 이용하여 정제하였다. 그리고 그 결과를 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.

그 결과, MGaa16B 및 MGaa16B-C 둘 다 강하게 발현된 것이 확인되었다. MGaa16B 및 MGaa16B-C 둘 다 일부 불용성 단백질이 만들어지긴 하였으나 용해성 단백질이 더 많이 만들어 진 것을 확인할 수 있었다. (도 2, b 및 c). 그러므로 MGaa16B 및 MGaa16B-C는 Gaa16B 보다 용해성이 훨씬 높은 것으로 확인되었다.

단백질 정제시 MGaa16B의 경우 MGaa16B-C에 비해 정제도가 낮게 나타났다(도 3).

<3-3> 재조합 Gaa16B, MGaa16B 및 MGaa16B-C의 활성 비교

Gaa16B, MGaa16B 및 MGaa16B-C에서 세포내 전체 활성을 확인하기 위해 과발현이 유도된 세포를 초음파로 분쇄 후 상등액을 가지고 한천 분해 활성을 측정하였다. 1%로 녹인 아가로스 용액 150 μL에 상기 상등액 50ul 첨가하고 55 ℃에서 10분간 반응 후 3,5-디니트로살리시크산(dinitrosalicylic acid; DNS)을 첨가하고 100℃에서 20분간 끓인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비색정량하였다. 1분간 1 μmol의 환원당을 생성하는 효소량을 1 unit으로 표시하였다.

그 결과, Gaa16B의 경우 MGaa16B 및 MGaa16B-C에 비해 낮은 활성을 나타내었는데 (0.47 unit/ml), 이는 Gaa16B의 경우 대부분의 단백질이 불용성이기 때문으로 생각되었다. 한편, MGaa16B는 1.53 unit/ml, MGaa16B-C는 4.99 unit/ml로 활성을 나타내었다 (표 6).

활성이 낮고 대부분 불용성으로 만들어진 Gaa16B를 제외하고 MGaa16B와 MGaa16B-C는 정제 산물을 이용해 특이활성을 분석하였다. 효소 반응은 1% 아가로스 용액 100 μL에 95 μL 버퍼(buffer)와 5 μL 정제된 MGaa16B와 MGaa16B-C를 각각 처리한 후 60℃에서 10분간 반응시켰고 DNS 방법을 이용해 활성을 확인하였다.

그 결과 MGaa16B-C는 1327 unit/mg으로 MGaa16B의 292.3 unit/mg에 비해 효소 활성이 높게 나타난 것을 확인하였다 (표 6). 그러므로 탄수화물(Carbohydrate) 결합(binding) 모듈(module) 6 서열이 제거됨으로써 단백질의 분자량이 감소할 뿐 아니라, 효소 특이적 활성도 증가하는 것으로 판단되었다. 이에 이후 실험에서는 활성이 높게 나타난 MGaa16B-C을 가지고 실험을 수행하였다.

<표 6>

<실시예 4>

상기 실시예 3에서 정제된 재조합 MGaa16B-C의 효소 특성을 조사하였다. 이 때 효소 활성은 1% 아가로스 용액 100 μL에 95 μL 버퍼와 5 μL 정제된 MGaa16B-C를 처리한 후 특정 온도에서 10분간 반응시키고 DNS 방법을 이용하여 활성을 확인하여 측정하였다.

<4-1> pH가 MGaa16B-C 활성에 미치는 영향 평가

pH의 변화가 MGaa16B-C 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 구연산염(Citrate)-인산염(phosphate) 버퍼 (pH 3-7), 인산염 버퍼 (pH 7-8), 글리신(Glycine)-수산화나트륨(sodium hydroxide) 버퍼 (pH 9-11)을 이용하여 50°C에서 반응하여 효소의 상대적인 활성을 측정하였다.

그 결과, 재조합 Gaa16B는 pH 9에서 가장 높은 활성을 보였으며, 6-9사이에도 80 %이상의 활성을 나타내었다(도 4).

<4-2>

온도에 따른 MGaa16B-C의 활성 변화를 확인하기 위하여 40내지 75°C의 범위에서 효소들을 5°C 간격으로 반응 시킨 후 각각의 활성을 측정하였고, 활성이 가장 높은 온도를 기준으로 하여 상대적인 활성으로 나타내었다. 그 결과 재조합 MGaa16B-C는 65°C에서 가장 높은 활성을 나타내었다(도 5).

<4-3>

열에 대한 MGaa16B-C의 안정성을 확인하기 위하여 재조합 MGaa16B-C를 55, 60, 65°C에서 30, 60, 90, 120분 동안 방치한 후 65 ℃에서 활성을 확인하였다.

그 결과, 재조합 MGaa16B-C는 55 ℃에서 30분 후까지는 80%의 활성을 유지하였으나 60분 이후부터는 40% 이하의 활성만을 유지하다가 90분 이후에는 대부분의 활성을 잃어 버리는 결과를 나타내었다(도 6).

<4-4>

각종 금속이온 또는 화학물질에 의한 재조합 MGaa16B-C의 효소 활성 변화를 평가하였다.

그 결과, 재조합 MGaa16B-C은 KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, FeSO4 또는 EDTA의 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 확인되었다(도 7).

<실시예 5>

액체 크로마토그래피(Liquid chromatography)-질량 분석계(mass spectrometer)를 이용하여 재조합 MGaa16B-C의 분해산물을 분석하였다. 먼저, 증류수에 1 중량%가 되도록 아가로스를 첨가한 후 멸균하여 1% 아가로스 용액을 준비하고, 준비된 1% 아가로스 용액 100 uL와 200 U의 Gaa16B를 첨가하고 50 ℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 그 반응산물을 분석하였다.

그 결과, MGaa16B-C에 의한 아가로스 가수분해물은 갈락토스(galactose) 기반의 4당 (분자량 630 Da)이 주요 피크를 나타내었다(도 8).

<4-5> MGaa16B-C의 특이활성 평가

상기 실시예 3에서 정제된 재조합 MGaa16B-C를 가지고 최적 조건하에서 특이활성을 평가하였다. 기질과 효소반응은 하기와 같이 수행하였다. 95 μL의 pH9 버퍼에 증류수에 1%로 녹인 기질을 100 μL를 첨가하고 희석된 재조합 MGaa16B-C를 5 μL첨가하여 최종 부피가 200 μL가 되도록 하여 최적 온도구간에서 10분간 반응 후 3,5-디니트로살리시크산(dinitrosalicylic acid; DNS)을 첨가하고 100℃에서 20분간 끓인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비색정량하였다. 이 때, 1분간 1 μmol의 환원당을 생성하는 효소량을 1 unit으로 표시하였다.

그 결과MGaa16B-C는 MnCl2 첨가 시 효소 특이적 활성이 증가하는 것으로 확인되었다(표 7).

<표 7>

<110> KIOST <120> AGARASE GENERATING NEOAGAROOLIGOSACCHARIDE BY HYDROLYZING AGAR <130> LNP170039 <150> KR 10-2016-0167155 <151> 2016-12-08 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Gaa16B <400> 1 atgaaacaca ccattagtac cttaactgcc ctgctgctat gcagctcgtc gtttgccgcc 60 gactgggacg gcttacctgt ccccgccgat gccggcagcg gcaacacctg gcaactgcaa 120 agcaacgtct cggacgactt taactactcg gccccggcca atggtaaaag cgcagccttt 180 tacgatcgct ggtccgaggg ttttattaac gcctggcaag gcccgggcct aaccgactac 240 cacaacccca actcgcgggt tgaaaacggc gagctggtga ttcaagccac ccgcaaaccg 300 ggcaccaatc aggtgtacac cggcgccgtg cacaccaacg acagcatcca gtacccggtt 360 tacatcgaaa ccagcagtaa aattatggat caggtgctgg ctaacgccgt gtggatgtta 420 agcagtgatt ccaccgaaga gatcgacatt gtcgaggctt acggcagcag tcgccccgat 480 caaacctggt ttgccgagcg tatgcactta gcccaccacg tgtttatccg cgacccgttt 540 caggattacc aacctaaaga cgccggcgcc tggtacgccg acggccgctt atggcgtgac 600 caatacagcc gggttggggt ttactggcgc gatccttggc acctggagta ttacatcgac 660 ggccaattgg tacgcaccgt atccggtgta gacatgattg acccttacgg ctacaccaac 720 ggcaacggtt taagcaaacc tatgcaaatt atcgttgatg ccgaagatca ggactggcgc 780 tcagataacg gtattatcgc gactgatgcc gatcttgccg acagcagcaa aaaccagttt 840 tatgtcgatt ggattcgcgt ttataaaccg gtaccagatg ccaacggtgg cggagataac 900 ggcggcgata atggtggcga taacggaggt gacaatggcg gcgataacga cattaccagc 960 agcgtcgact ttgatagctt ttttgcgacc ggcaaagacg gcagcgccgt tgccggcgac 1020 agcgttaatg gctttaaccc ctcgggtaat ggcaacatca actacaacac cgtaggcgat 1080 tgggccgagt acagcatcaa tctacccgag gccggtgagt accgtttaga gctggacacg 1140 gcctcgacag tgagcacagg cctcggcgcc gacatcagta tcgacgacgt gtttgtcggc 1200 acagttgcta tctcgcaaac tggcggctgg gagagctatc aaacctttag ccttgccaac 1260 accatcaaca tcggtgccgg cacccacaca ctgcgcgtac aaagcgcagg aagctcgccg 1320 tggcagtgga acggcaacgc gatccgcatg gttaaagtgg gcgaaggctc aagcaacaac 1380 caaacaacca cacctacacc aagcgaaatg atcagcctgg aggccgaaag ctttaacagc 1440 accggtgggc cgtacgacgg gtttcaaact tatacccaaa gcggtatcac agctaccaac 1500 tacaaccagc gtggcgacta cgccgagtac accctgtcgg tacctaccgc aggcaactac 1560 aacgtgagtg ctattgtggc gactcccgaa agcggtgccg ccatgacgct aacgctaaac 1620 ggcaacgcgc tggttagctt agacgtaccc tcaaccggcg gctggaacac ctttaccgag 1680 gttaacgcaa gcggcgccgt ggcgttgccc gcgggcactc acaccctaag agtaaccagc 1740 tccggcaaca ccgccaacac ctgggagtgg aacgccgatc gctttatctt tacaccgcaa 1800 taa 1803 <210> 2 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Gaa16B <400> 2 Met Lys His Thr Ile Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu Leu Cys Ser Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ala Ala Asp Trp Asp Gly Leu Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Trp Gln Leu Gln Ser Asn Val Ser Asp Asp Phe Asn 35 40 45 Tyr Ser Ala Pro Ala Asn Gly Lys Ser Ala Ala Phe Tyr Asp Arg Trp 50 55 60 Ser Glu Gly Phe Ile Asn Ala Trp Gln Gly Pro Gly Leu Thr Asp Tyr 65 70 75 80 His Asn Pro Asn Ser Arg Val Glu Asn Gly Glu Leu Val Ile Gln Ala 85 90 95 Thr Arg Lys Pro Gly Thr Asn Gln Val Tyr Thr Gly Ala 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ttatcgctga tttataacaa agatctgctg 480 ccgaacccgc caaaaacctg ggaagagatc ccggcgctgg ataaagaact gaaagcgaaa 540 ggtaagagcg cgctgatgtt caacctgcaa gaaccgtact tcacctggcc gctgattgct 600 gctgacgggg gttatgcgtt caagtatgaa aacggcaagt acgacattaa agacgtgggc 660 gtggataacg ctggcgcgaa agcgggtctg accttcctgg ttgacctgat taaaaacaaa 720 cacatgaatg cagacaccga ttactccatc gcagaagctg cctttaataa aggcgaaaca 780 gcgatgacca tcaacggccc gtgggcatgg tccaacatcg acaccagcaa agtgaattat 840 ggtgtaacgg tactgccgac cttcaagggt caaccatcca aaccgttcgt tggcgtgctg 900 agcgcaggta ttaacgccgc cagtccgaac aaagagctgg cgaaagagtt cctcgaaaac 960 tatctgctga ctgatgaagg tctggaagcg gttaataaag acaaaccgct gggtgccgta 1020 gcgctgaagt cttacgagga agagttggcg aaagatccac gtattgccgc caccatggaa 1080 aacgcccaga aaggtgaaat catgccgaac atcccgcaga tgtccgcttt ctggtatgcc 1140 gtgcgtactg cggtgatcaa cgccgccagc ggtcgtcaga ctgtcgatga agccctgaaa 1200 gacgcgcaga ctcgtatcac caagatcgag ggaaggattt cagaattcgc cgactgggac 1260 ggcttacctg tccccgccga tgccggcagc ggcaacacct ggcaactgca aagcaacgtc 1320 tcggacgact ttaactactc ggccccggcc aatggtaaaa gcgcagcctt ttacgatcgc 1380 tggtccgagg gttttattaa cgcctggcaa ggcccgggcc taaccgacta ccacaacccc 1440 aactcgcggg ttgaaaacgg cgagctggtg attcaagcca cccgcaaacc gggcaccaat 1500 caggtgtaca ccggcgccgt gcacaccaac gacagcatcc agtacccggt ttacatcgaa 1560 accagcagta aaattatgga tcaggtgctg gctaacgccg tgtggatgtt aagcagtgat 1620 tccaccgaag agatcgacat tgtcgaggct tacggcagca gtcgccccga tcaaacctgg 1680 tttgccgagc gtatgcactt agcccaccac gtgtttatcc gcgacccgtt tcaggattac 1740 caacctaaag acgccggcgc ctggtacgcc gacggccgct tatggcgtga ccaatacagc 1800 cgggttgggg tttactggcg cgatccttgg cacctggagt attacatcga cggccaattg 1860 gtacgcaccg tatccggtgt agacatgatt gacccttacg gctacaccaa cggcaacggt 1920 ttaagcaaac ctatgcaaat tatcgttgat gccgaagatc aggactggcg ctcagataac 1980 ggtattatcg cgactgatgc cgatcttgcc gacagcagca aaaaccagtt ttatgtcgat 2040 tggattcgcg tttataaacc ggtaccagat gccaacggtg gcggagataa cggcggcgat 2100 aatggtggcg ataacggagg tgacaatggc ggcgataacg acattaccag cagcgtcgac 2160 tttgatagct tttttgcgac cggcaaagac ggcagcgccg ttgccggcga cagcgttaat 2220 ggctttaacc cctcgggtaa tggcaacatc aactacaaca ccgtaggcga ttgggccgag 2280 tacagcatca atctacccga ggccggtgag taccgtttag agctggacac ggcctcgaca 2340 gtgagcacag gcctcggcgc cgacatcagt atcgacgacg tgtttgtcgg cacagttgct 2400 atctcgcaaa ctggcggctg ggagagctat caaaccttta gccttgccaa caccatcaac 2460 atcggtgccg gcacccacac actgcgcgta caaagcgcag gaagctcgcc gtggcagtgg 2520 aacggcaacg cgatccgcat ggttaaagtg ggcgaaggct caagcaacaa ccaaacaacc 2580 acacctacac caagcgaaat gatcagcctg gaggccgaaa gctttaacag caccggtggg 2640 ccgtacgacg ggtttcaaac ttatacccaa agcggtatca cagctaccaa ctacaaccag 2700 cgtggcgact acgccgagta caccctgtcg gtacctaccg caggcaacta caacgtgagt 2760 gctattgtgg cgactcccga aagcggtgcc gccatgacgc taacgctaaa cggcaacgcg 2820 ctggttagct tagacgtacc ctcaaccggc ggctggaaca cctttaccga ggttaacgca 2880 agcggcgccg tggcgttgcc cgcgggcact cacaccctaa gagtaaccag ctccggcaac 2940 accgccaaca cctgggagtg gaacgccgat cgctttatct 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<400> 5 gtgttttcac gagcacttca ccaacaagga ccaattatga aaataaaaac aggtgcacgc 60 atcctcgcat tatccgcatt aacgacgatg atgttttccg cctcggctct cgccaaaatc 120 gaagaaggta aactggtaat ctggattaac ggcgataaag gctataacgg tctcgctgaa 180 gtcggtaaga aattcgagaa agataccgga attaaagtca ccgttgagca tccggataaa 240 ctggaagaga aattcccaca ggttgcggca actggcgatg gccctgacat tatcttctgg 300 gcacacgacc gctttggtgg ctacgctcaa tctggcctgt tggctgaaat caccccggac 360 aaagcgttcc aggacaagct gtatccgttt acctgggatg ccgtacgtta caacggcaag 420 ctgattgctt acccgatcgc tgttgaagcg ttatcgctga tttataacaa agatctgctg 480 ccgaacccgc caaaaacctg ggaagagatc ccggcgctgg ataaagaact gaaagcgaaa 540 ggtaagagcg cgctgatgtt caacctgcaa gaaccgtact tcacctggcc gctgattgct 600 gctgacgggg gttatgcgtt caagtatgaa aacggcaagt acgacattaa agacgtgggc 660 gtggataacg ctggcgcgaa agcgggtctg accttcctgg ttgacctgat taaaaacaaa 720 cacatgaatg cagacaccga ttactccatc gcagaagctg cctttaataa aggcgaaaca 780 gcgatgacca tcaacggccc gtgggcatgg tccaacatcg acaccagcaa agtgaattat 840 ggtgtaacgg 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gtatgcactt agcccaccac gtgtttatcc gcgacccgtt tcaggattac 1740 caacctaaag acgccggcgc ctggtacgcc gacggccgct tatggcgtga ccaatacagc 1800 cgggttgggg tttactggcg cgatccttgg cacctggagt attacatcga cggccaattg 1860 gtacgcaccg tatccggtgt agacatgatt gacccttacg gctacaccaa cggcaacggt 1920 ttaagcaaac ctatgcaaat tatcgttgat gccgaagatc aggactggcg ctcagataac 1980 ggtattatcg cgactgatgc cgatcttgcc gacagcagca aaaaccagtt ttatgtcgat 2040 tggattcgcg tttataaacc ggtaccagat gccaacggtg gcggagataa cggcggcgat 2100 aatggtggcg ataacggagg tgacaatggc ggcgataact aa 2142 <210> 6 <211> 713 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of MGaa16B-C <400> 6 Met Phe Ser Arg Ala Leu His Gln Gln Gly Pro Ile Met Lys Ile Lys 1 5 10 15 Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe 20 25 30 Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp 35 40 45 Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys 50 55 60 Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp 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490 495 Pro Gly Thr Asn Gln Val Tyr Thr Gly Ala Val His Thr Asn Asp Ser 500 505 510 Ile Gln Tyr Pro Val Tyr Ile Glu Thr Ser Ser Lys Ile Met Asp Gln 515 520 525 Val Leu Ala Asn Ala Val Trp Met Leu Ser Ser Asp Ser Thr Glu Glu 530 535 540 Ile Asp Ile Val Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Pro Asp Gln Thr Trp 545 550 555 560 Phe Ala Glu Arg Met His Leu Ala His His Val Phe Ile Arg Asp Pro 565 570 575 Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ala Trp Tyr Ala Asp Gly 580 585 590 Arg Leu Trp Arg Asp Gln Tyr Ser Arg Val Gly Val Tyr Trp Arg Asp 595 600 605 Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Gln Leu Val Arg Thr Val 610 615 620 Ser Gly Val Asp Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Asn Gly Asn Gly 625 630 635 640 Leu Ser Lys Pro Met Gln Ile Ile Val Asp Ala Glu Asp Gln Asp Trp 645 650 655 Arg Ser Asp Asn Gly Ile Ile Ala Thr Asp Ala Asp Leu Ala Asp Ser 660 665 670 Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Val 675 680 685 Pro Asp Ala Asn Gly Gly Gly Asp Asn Gly Gly Asp Asn Gly Gly Asp 690 695 700 Asn Gly Gly Asp Asn Gly Gly Asp Asn 705 710 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gaaB1-F for Gaa16B recombinant protein production <400> 7 aaggagatat acatatgaaa cacaccatta gtacc 35 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gaaB1-R for Gaa16B recombinant protein production <400> 8 gttagcagcc ggatcttatt gcggtgtaaa gataaag 37 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gaaB2/3-F for MGaa16B recombinant protein production <400> 9 ttcagaattc ggatccgccg actgggacgg ctta 34 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gaaB2-R for MGaa16B recombinant protein production <400> 10 ttgcctgcag gtcgattatt gcggtgtaaa gataaag 37 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gaaB3-R for MGaa16B-C recombinant protein production <400> 11 ttgcctgcag gtcgattatt gacgaccttt aatgctg 37 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of signal peptide <400> 12 Met Lys His Thr Ile Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu Leu Cys Ser Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ala <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding signal peptide <400> 13 atgaaacaca ccattagtac cttaactgcc ctgctgctat gcagctcgtc gtttgcc 57 <210> 14 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of maltose binding protein <400> 14 Met Phe Ser Arg Ala Leu His Gln Gln Gly Pro Ile Met Lys Ile Lys 1 5 10 15 Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe 20 25 30 Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp 35 40 45 Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys 50 55 60 Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys 65 70 75 80 Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp 85 90 95 Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly 100 105 110 Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr 115 120 125 Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr 130 135 140 Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu 145 150 155 160 Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu 165 170 175 Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro 180 185 190 Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys 195 200 205 Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala 210 215 220 Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys 225 230 235 240 His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn 245 250 255 Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn 260 265 270 Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile 290 295 300 Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro 325 330 335 Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp 340 345 350 Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met 355 360 365 Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala 370 375 380 Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys 385 390 395 400 Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys 405 <210> 15 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding maltose binding protein <400> 15 gtgttttcac gagcacttca ccaacaagga ccaattatga aaataaaaac aggtgcacgc 60 atcctcgcat tatccgcatt aacgacgatg atgttttccg cctcggctct cgccaaaatc 120 gaagaaggta aactggtaat ctggattaac ggcgataaag gctataacgg tctcgctgaa 180 gtcggtaaga aattcgagaa agataccgga attaaagtca ccgttgagca tccggataaa 240 ctggaagaga aattcccaca ggttgcggca actggcgatg gccctgacat tatcttctgg 300 gcacacgacc gctttggtgg ctacgctcaa tctggcctgt tggctgaaat caccccggac 360 aaagcgttcc aggacaagct gtatccgttt acctgggatg ccgtacgtta caacggcaag 420 ctgattgctt acccgatcgc tgttgaagcg ttatcgctga tttataacaa agatctgctg 480 ccgaacccgc caaaaacctg ggaagagatc ccggcgctgg ataaagaact gaaagcgaaa 540 ggtaagagcg cgctgatgtt caacctgcaa gaaccgtact tcacctggcc gctgattgct 600 gctgacgggg gttatgcgtt caagtatgaa aacggcaagt acgacattaa agacgtgggc 660 gtggataacg ctggcgcgaa agcgggtctg accttcctgg ttgacctgat taaaaacaaa 720 cacatgaatg cagacaccga ttactccatc gcagaagctg cctttaataa aggcgaaaca 780 gcgatgacca tcaacggccc gtgggcatgg tccaacatcg acaccagcaa agtgaattat 840 ggtgtaacgg tactgccgac cttcaagggt caaccatcca aaccgttcgt tggcgtgctg 900 agcgcaggta ttaacgccgc cagtccgaac aaagagctgg cgaaagagtt cctcgaaaac 960 tatctgctga ctgatgaagg tctggaagcg gttaataaag acaaaccgct gggtgccgta 1020 gcgctgaagt cttacgagga agagttggcg aaagatccac gtattgccgc caccatggaa 1080 aacgcccaga aaggtgaaat catgccgaac atcccgcaga tgtccgcttt ctggtatgcc 1140 gtgcgtactg cggtgatcaa cgccgccagc ggtcgtcaga ctgtcgatga agccctgaaa 1200 gacgcgcaga ctcgtatcac caagtaa 1227 <210> 16 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Carbohydrate binding module 6 <400> 16 Gly Gly Asp Asn Gly Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ser Ser Val Asp Phe 1 5 10 15 Asp Ser Phe Phe Ala Thr Gly Lys Asp Gly Ser Ala Val Ala Gly Asp 20 25 30 Ser Val Asn Gly Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Asn Ile Asn Tyr Asn 35 40 45 Thr Val Gly Asp Trp Ala Glu Tyr Ser Ile Asn Leu Pro Glu Ala Gly 50 55 60 Glu Tyr Arg Leu Glu Leu Asp Thr Ala Ser Thr Val Ser Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gly Ala Asp Ile Ser Ile Asp Asp Val Phe Val Gly Thr Val Ala Ile 85 90 95 Ser Gln Thr Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Gln Thr Phe Ser Leu Ala Asn 100 105 110 Thr Ile Asn Ile Gly Ala Gly Thr His Thr Leu Arg Val Gln Ser Ala 115 120 125 Gly Ser Ser Pro Trp Gln Trp Asn Gly Asn Ala Ile Arg Met Val Lys 130 135 140 Val Gly Glu Gly Ser Ser Asn Asn Gln Thr Thr Thr Pro Thr Pro Ser 145 150 155 160 Glu Met Ile Ser Leu Glu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Thr Gly Gly Pro 165 170 175 Tyr Asp Gly Phe Gln Thr Tyr Thr Gln Ser Gly Ile Thr Ala Thr Asn 180 185 190 Tyr Asn Gln Arg Gly Asp Tyr Ala Glu Tyr Thr Leu Ser Val Pro Thr 195 200 205 Ala Gly Asn Tyr Asn Val Ser Ala Ile Val Ala Thr Pro Glu Ser Gly 210 215 220 Ala Ala Met Thr Leu Thr Leu Asn Gly Asn Ala Leu Val Ser Leu Asp 225 230 235 240 Val Pro Ser Thr Gly Gly Trp Asn Thr Phe Thr Glu Val Asn Ala Ser 245 250 255 Gly Ala Val Ala Leu Pro Ala Gly Thr His Thr Leu Arg Val Thr Ser 260 265 270 Ser Gly Asn Thr Ala Asn Thr Trp Glu Trp Asn Ala Asp Arg Phe Ile 275 280 285 Phe Thr Pro Gln 290 <210> 17 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding Carbohydrate binding module 6 <400> 17 ggaggtgaca atggcggcga taacgacatt accagcagcg tcgactttga tagctttttt 60 gcgaccggca aagacggcag cgccgttgcc ggcgacagcg ttaatggctt taacccctcg 120 ggtaatggca acatcaacta caacaccgta ggcgattggg ccgagtacag catcaatcta 180 cccgaggccg gtgagtaccg tttagagctg gacacggcct cgacagtgag cacaggcctc 240 ggcgccgaca tcagtatcga cgacgtgttt gtcggcacag ttgctatctc gcaaactggc 300 ggctgggaga gctatcaaac ctttagcctt gccaacacca tcaacatcgg tgccggcacc 360 cacacactgc gcgtacaaag cgcaggaagc tcgccgtggc agtggaacgg caacgcgatc 420 cgcatggtta aagtgggcga aggctcaagc aacaaccaaa caaccacacc tacaccaagc 480 gaaatgatca gcctggaggc cgaaagcttt aacagcaccg gtgggccgta cgacgggttt 540 caaacttata cccaaagcgg tatcacagct accaactaca accagcgtgg cgactacgcc 600 gagtacaccc tgtcggtacc taccgcaggc aactacaacg tgagtgctat tgtggcgact 660 cccgaaagcg gtgccgccat gacgctaacg ctaaacggca acgcgctggt tagcttagac 720 gtaccctcaa ccggcggctg gaacaccttt accgaggtta acgcaagcgg cgccgtggcg 780 ttgcccgcgg gcactcacac cctaagagta accagctccg gcaacaccgc caacacctgg 840 gagtggaacg ccgatcgctt tatctttaca ccgcaa 876

Claims

서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되며, 한천의 분해능을 갖는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
한천을 분해하여 네오한천올리고당을 생성하는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
pH 9에서의 효소 활성을 기준으로, pH 6 초과 pH 9 미만의 pH 범위에서 80% 이상의 효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
pH 10에서 효소 활성이 없는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
65 ℃에서의 효소 활성을 기준으로, 55℃에서 80% 이상 100 % 미만의 효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, FeSO4 또는 EDTA에 의하여 효소 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
한천 분해 시 4당을 2당 또는 6당보다 더 많이 생성하는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항에 있어서,
서열번호 5의 염기 서열로부터 만들어지는 것을 특징으로 하는 아가라아제.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 아가라아제를 준비하는 단계;및
상기 아가라아제를 한천에 가하는 단계를 포함하는
한천의 가수분해 방법.
제 9항의 한천의 가수분해 방법에 의하여 생성되는 한천의 가수분해물.
서열번호 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자.
제 11항의 유전자를 이용하여 제조한 아가라아제.