KR102549630B1 - 신규한 한천 분해 세균 유래의 열안정성 ＧＨ１６Ｂ β­아가라아제를 이용한 아가로스의 액화 및 네오아가로테트라오스／네오아가로헥사오스의 생산 방법 - Google Patents

신규한 한천 분해 세균 유래의 열안정성 ＧＨ１６Ｂ β­아가라아제를 이용한 아가로스의 액화 및 네오아가로테트라오스／네오아가로헥사오스의 생산 방법 Download PDF

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장원영
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Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 열안정성(thermostable) GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 이용한 기질 아가로스(agarose) 액화(liquefaction)에 따른 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 고순도, 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 열안정성(thermostable) GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 이용한 기질 아가로스(agarose) 액화(liquefaction)에 따른 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 고순도, 대량 생산 방법은 아가로스 겔화 온도 이상의 고온에서 우수한 효소 활성을 나타내며, 고온에서도 장시간 열안정성을 가지므로 기질 아가로스 액화를 효율적으로 수행함으로서 고순도 및 대량의 NA4 및 NA6를 생산할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

신규한 한천 분해 세균 유래의 열안정성 ＧＨ１６Ｂ β­아가라아제를 이용한 아가로스의 액화 및 네오아가로테트라오스／네오아가로헥사오스의 생산 방법{METHOD FOR AGAROSE LIQUEFACTION AND NA4/NA6 PRODUCTION USING THERMOSTABLE GH6B β-AGARASE DERIVED FROM A NOVEL AGAR-DEGRADING BACTERIUM}
본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 열안정성(thermostable) GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 이용한 기질 아가로스(agarose) 액화(liquefaction)에 따른 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 고순도, 대량 생산 방법에 관한 것이다.
한천은 Gelidium, Gracilariais, 및 Gelidiella 등 해양성 홍조류의 세포벽을 구성하는 복합 다당류로 주로 약 60~70%의 아가로스와 30~40%의 아가로펙틴으로 이루어져 있다. 아가로스는 α-1,3-결합 3,6-안하이드로-L-갈락토스(L-AHG)와 β-1,4-결합 D-갈락토스의 교대로 구성된 중합체이고, 아가로펙틴은 동일한 아가로비오스 반복단위로 구성되지만, 일부 당 잔기들이 황산 에스테르화, 피루브산 및 에테르류로 치환된다 [Duckworth and Yaphe, 1971]. 한천은 미생물 분해에 강한 안정적인 겔 매트릭스를 형성하는 우수한 겔화 능력을 가지고 있어 미생물 배양 배지 및 식품 산업에 널리 사용되고 있다.
해양 세균의 몇 개 속과 적은 수의 비해양 세균은 한천을 단량체로 분해하는 것으로 알려져 있으며, 이를 유일한 탄소원으로 활용할 수 있다 [Agbo and Moss, 1979; Bannikova et al., 2008; Leehim et al., 2010; Fu and Kim, 2010; Jahromi and Barzkar, 2018]. 한천을 유일한 탄소원으로 자화시키기 위해 한천 분해 세균은 L-AHG와 D-갈락토스로 효율적이고 완전한 한천 가수분해를 위해 서로 다른 아가라아제의 조합을 생성한다. 대표적인 두 가지 유형의 아가라아제, 즉, β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 β-아가라아제(EC 3.2.1.81)와 α-1,3-글리코사이드 결합을 절단하는 α-아가라아제(EC 3.2.1.158)가 보고되었다 [Fu 및 Kim, 2010; Jahromi 및 Barkarz, 2018]. 현재까지 보고된 아가라아제들은 대부분 아가로스 분해로부터 네오아가로올리고당(NAOS)을 생성하는 엔도-β-아가라아제에 속한다. 아가로스에서 아가로올리고당(AOS)을 생성하는 α-아가라아제들에 대한 보고는 거의 없다. 세균성 아가라아제 사이의 아미노산 서열 유사성에 기초하여 아가라아제를 여러 다른 글리코사이드 가수분해효소(GH) 패밀리로 분류한다. 여기에는 β-아가라아제로 작용하는 GH16, GH50, GH86 및 GH118 [Michel et al., 2006; Cantarel et al., 2009; Chi et al., 2012]뿐만 아니라 α-아가라아제로 작용하는 GH96 및 GH117 [Flatment et al., 2007; Ha et al., 2011; Lee et al., 2019; Jang, 2021] 등 이 포함된다. 이들 각각의 아가라아제는 독특한 양상으로 아가로스를 분해한다. 즉, GH16, GH86 및 GH118 β-아가라아제는 아가로스를 엔도형으로 가수분해하여 네오아가로테트라오스(NA4)/네오아가로헥사오스(NA6), NA6/네오아가로락타오스(NA8), 및 NA8/네오아가로데카오스(NA10)를 각각 생성한다. GH50 패밀리 β-아가라아제는 엑소형 또는 엑소형 및 엔도형 활성의 조합에 의해 아가로스를 분해하여 최종 생성물로 네오아가로비오스(NA2), NA4 또는 NA2/NA4를 생성한다 [Fu and Kim, 2010; Liang et al., 2016; Liang et al., 2017; Chen et al., 2020; 2020; Kwon et al. 2020]. GH96 α-아가라아제는 아가로스를 주로 아가로테트라오스(A4)로 분해시키는 반면, GH117 α-네오아가로비오스 가수분해효소(α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 NA2를 L-AHG와 D-갈락토스로 분해시킨다 [Flament et al., 2007; Ha et al., 2011; Lee et al., 2019; Jang, 2021].
다수의 연구에서 미생물 효소 또는 산 가수분해에 의해 생성된 한천 분해 생성물(NAOS, AOS, NA2 및 L-AHG)의 다양한 생물학적 활성이 보고되었다. 여기에는 항산화 활성 [Chen and Yan, 2005; Xu et al., 2018], 프리바이오틱 활성 [Hu et al., 2006; Yun et al., 2021], 항종양 활성 [Enoki et al., 2012; Lee et al., 2017; Yun et al., 2021], 항염증 활성 [Yun et al., 2013; Wang et al., 2017], 항당뇨 및 항비만 활성 [Hong et al., 2017], 항우식 활성 [Yun et al., 2017; Yu et al., 2019;], 피부 보습 및 미백 활성 [Kobayashi et al., 1997; Yun et al., 2013; 김 등, 2017] 등이 포함된다. 또한, NA4의 경구 보충은 마우스 모델에서 장내 미생물총의 조절을 통해 격렬한 운동으로 인한 피로 손상 [Zhang et al., 2017] 및 간 손상 [Chen et al., 2019]으로부터 보호하는 것으로 보고되었다.
이러한 맥락에서, 한천 분해 세균으로부터 정제한 혹은 재조합 단백질로서 확보한 아가라아제들에 대한 특성 규명과 아가로스로부터 L-AHG, NA2, NA4 및 NAOS를 생산하는 개별 효소 과정의 개발을 위해 다양한 연구들이 진행되었다 [Park et al., 2020; Chen et al., 2021]. 그러나, 아가로스를 단량체인 L-AHG 및 D-Gal로 효소적으로 분해시키는 당화 공정은 더 개선되어야 할 필요가 있다. 이를 위해, 열처리에 의해 가용화된 아가로스를 효율적인 가수분해작용으로 액화하여 낮은 중합도(Degree of polymerization, DP)를 지닌 NAOS로 전환할 수 있는 내열성 GH16 패밀리 β-아가라아제에 대한 추가 탐색이 시급한 실정인데, 아가로스를 액화하여 낮은 DP의 NAOS를 생성시키는 내열성 엔도형 GH16 패밀리 β-아가라아제는 엑소형 GH50 β-아가라아제와 병합할 경우, NA2를 효율적으로 생산할 수 있는 더 바람직한 아가로스 당화과정을 위한 전제 조건이 될 뿐만 아니라, GH50 β-아가라아제 및 α-NABH와 병합할 경우에는 L-AHG/D-Gal을 최종 생성시킬 수 있는 당화과정의 전제 조건이 되기 때문이다.
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본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원의 열안정성이 우수한 GH16B β-아가라아제를 이용하여 기질 아가로스의 액화에 따른 NA4/NA6의 고순도, 대량 생산 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 기질에 처리하여 효소적 분해 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4)와 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 생산 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 기질은 아가로스(agarose) 또는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides, NAOS)인 것이 바람직하다.
상기 아가로스는 9중량% 이하의 농도인 것이 바람직하다.
상기 처리는 40~60℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 pH 5.0~8.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2 또는 MnSO4인 것이 바람직하다.
상기 MnCl2 또는 MnSO4는 0.5~2.5 mM의 농도인 것이 바람직하다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 트리스(2-카복시에틸)-포스핀은 5~15 mM의 농도인 것이 바람직하다.
본 발명의 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 열안정성(thermostable) GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 이용한 기질 아가로스(agarose) 액화(liquefaction)에 따른 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 고순도, 대량 생산 방법은 아가로스 겔화 온도 이상의 고온에서 우수한 효소 활성을 나타내며, 고온에서도 장시간 열안정성을 가지므로 기질 아가로스 액화를 효율적으로 수행함으로서 고순도 및 대량의 NA4 및 NA6를 생산할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 GH16A, GH16B, GH16C 및 GH16D β-아가라아제의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 아미노산 서열은 Clustal X [Larkin et al. 2007]를 사용하여 동일성이 최대로 나타나도록 열린해독틀(open reading frame)을 정렬하였으며, 이때 각 아미노산은 단일 문자 약어로 나타내었다. 두 서열 사이의 동일 잔기들은 배열 상단에 별표로 표시하였다. 각 아미노산 잔기들은 Clustal X 색 구성표를 사용하여 강조하였다. 결손은 대시로 표시하였다.
도 2는 E. coli에서 발현된 재조합 His-tag된 GH16A, GH16B, GH16C 및 GH16D β-아가라아제의 Lugol's iodine solution 및 SDS-PAGE로 검출한 것이다. (A) 재조합 His-tag된 GH16A, GH16B 또는 GH16C β-아가라아제를 발현하는 형질전환체를 1.5% 아가로스, 50 μg/mL 클로람페니콜, 25 μg/mL 카나마이신 및 IPTG(0.1 mM)를 함유하는 LB 아가로스 플레이트에 스팟팅하고 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 플레이트는 실온에서 Lugol's 요오드 용액으로 염색되었다. (B) 0.5 mM IPTG의 존재 하에 배양된 E. coli BL21(DE3) pLysS 형질전환체로부터 총(T), 가용성(S) 및 불용성(P) 세포내 부분 및 세포외 부분으로서 배양 상등액(CS)을 제조하였다. 동일한 양의 각 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 3은 GH16B β-아가라아제와 Genbank 데이터베이스에서 이용 가능한 9개의 GH16 계열 β-아가라아제를 비교한 다중 아미노산 서열 정렬 (A) 및 이들의 계통 발생적 관계 (B)를 나타낸다. 아미노산은 Clustal X를 사용하여 최대한의 동일성이 나타나도록 열린해독틀(open reading frame)을 정렬하였으며, 이때 각 아미노산을 단일 문자 약어로 나타내었다 [Larkin et al. 2007]. 모든 서열 사이의 동일한 잔기는 배열 상단에 별표로 표시하였다. 보존적인 치환은 콜론으로, 반보존적인 치환은 점으로 표시하였으며, 각 잔기들은 Clustal X 색 구성표로 강조하였다. 결손은 대시로 표시하였다. 뿌리가 없는 계통수는 UPGMA 방법 [Sneath and Sokal 1973]으로 구성하였다. 노드의 숫자는 부트스트랩 발생 수준이다.
도 4는 E. coli 형질전환체의 개별 세포 내 부분 및 배양액 (A) 및 배양액으로부터 정제된 GH16B β-아가라아제에서 N-말단 22-aa 신호 펩티드 서열이 있거나 없는 재조합 His-tag된 GH16B β-아가라아제의 SDS-PAGE 및 개별 세포내 부분 및 배양액 (B) 및 정제된 GH16B β-아가라아제에서 GH16B β-아가라아제의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 레인: SM, 미리 염색된 크기 마커; GH16B-w/SS, 신호 펩티드 서열을 갖는 GH16B β-아가라아제; GH16B-wo/SP, 신호 펩티드 서열이 없는 GH16B β-아가라아제; Crude GH16B-w/SS, 배양액의 효소; Salting-out GH16B-w/SS, 배양액의 황산암모늄 염석에 의한 농축 효소; 정제된 GH16B-w/SP, Ni-NTA 정제 시스템을 사용하여 농축된 GH16B-w/SS으로부터 정제된 효소.
도 5는 GH16B β-아가라아제의 생화학적 특성을 나타낸다. (A, B) 효소 활성에 대한 온도 및 pH의 영향은 0.4% 아가로스와 0.8 μg/mL의 정제된 GH16B β-아가라아제를 사용하여 측정되었다. 각 값은 평균 ± SEM으로 표시된다(n = 3, 독립 실험당 3회 반복). (C, D) 정제된 GH16B β-아가라아제의 온도 및 pH 안정성은 개별 온도에서 표시된 시간 동안 처리 후 또는 개별 pH에서 4시간 처리 후 조사되었다. 각 값은 평균 ± SEM으로 표시된다(n = 3, 독립 실험당 3회 반복). (E) 정제된 GH16B β-아가라아제의 Km 및 Vmax 값에 대한 Lineweaver-Burk 플롯은 표시된 농도의 효소와 기질 아가로스를 사용하여 조사하였다. 대표적인 결과가 표시되며, 두 개의 추가 실험이 유사한 결과를 낳았다.
도 6은 MnCl2와 TCEP가 GH16B β-아가라아제 활성에 미치는 영향을 나타낸다. GH16B β-아가라아제의 활성에 과한 MnCl2 및 TCEP의 개별적 효과 및 MnCl2 (1 mM) 및 TCEP(5 mM, 10 mM 또는 15 mM)의 공동 처리 효과는 정제된 효소(0.8 μg/mL)와 0.4% 아가로스를 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에 혼합하여 50℃에서 30분간 배양하여 활성을 측정하였다. MnCl2 및 TCEP를 첨가하지 않고 측정한 효소 활성을 100%로 정의하였다.
도 7은 TLC에 의한 아가로스, NAOS 및 AOS의 GH16B β-아가라아제 촉매 가수분해물의 시간-역학 분석 결과를 나타낸다. 각 기질의 가수분해를 위해 0.4% 아가로스 (A) 및 1.0% NAOS (B) 또는 1.0% AOS (C)를 50℃에서 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)에서 0.8 μg/mL의 효소로 반응시켰다. 표시된 기간 동안에 표준 네오아가로올리고당 (STD NAOS) 및 아가로올리고당 (AOS)은 하기 실시예에서 설명된 대로 준비되었다. 등량의 각 반응 혼합물을 Silica Gel 60 알루미늄 플레이트에 스팟팅하고 n-부탄올-에탄올-H2O[3:2:2(v/v)]로 현상하였다. 올리고당은 0.2%(w/v) 나프토레조르시놀과 10%(v/v) H2SO4가 포함된 에탄올 용액을 분사한 후 80℃에서 가열하여 가시화하였다. 대표적인 결과가 표시되었고, 두 번의 추가 실험에서 유사한 결과가 나타났다.
도 8은 MALDI-TOF/TOF MS에 의한 아가로스 및 AOS의 GH16B β-아가라아제 촉매 가수분해물 분석 결과를 나타낸다. 아가로스 가수분해를 위해 0.4% 아가로스를 50 mM Mcllvine 완충액 (pH 7.0)에서 0.8 μg/mL GH16B β-아가라아제와 함께 50℃에서 60분 동안 반응시켰다. AOS 가수분해의 경우, 1.0% AOS를 50 mM Mcllvine 완충액 (pH 7.0)에서 0.8 μg/mL GH16B β-아가라아제와 함께 50℃에서 60분 동안 반응시켰다. MALDI-TOF/TOF MS 분석은 하기 실시예에서 설명된 대로 수행되었다.
도 9는 GH16B β-아가라아제 촉매에 의한 아가로스의 NA4 및 NA6으로의 완전한 가수분해 및 Sephadex G-15 컬럼 크로마토그래피를 사용한 가수분해물로부터 NA4 및 NA6의 정제 결과를 나타낸다. (A) 최적의 반응 조건(5 mM MnCl2, 10 mM TCEP, 50 mM Mcllvine 완충액, pH 7.0)에서 다양한 농도 (5.0%, 7.0% 또는 9.0%)의 아가로스를 GH16B β-아가라아제 (1.6 μg/mL)로 50℃에서 14시간 동안 계속 자기 교반하면서 처리한 후 가수분해물을 TLC로 분석하여 아가로스의 NA4 및 NA6으로의 전환을 확인하였다. (B) GH16B β-아가라아제의 촉매 작용으로 얻이진 가수분해물로부터 NA4 및 NA6을 정제하기 위하여, 9.0% 아가로스 (20 mL)를 최적의 조건에서 14시간 동안 효소 (1.6 μg/mL)로 처리한 다음 동결건조하여 건조시켰다. 동결건조된 샘플을 이동상으로 DI water를 사용하여 Sephadex G-15 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다. 하기 실시예에서 설명된 대로 개별 분획의 등가 부피를 TLC로 분석하였다. 대표적인 결과가 표시되었고, 두 번의 추가 실험에서 유사한 결과가 나타났다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 최근에 담수 한천을 분해하는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 (KCTC 13629BP)의 유전체의 염기서열분석을 통해, 한천을 L-AHG와 D-갈락토스로 가수분해하는 아가라아제들을 암호화하는 유전정보를 보고한 바 있다 [Kwon et al., 2019]. KY-GH-1 균주는 약 77 kb에 걸쳐 있는 아가라아제 유전자 클러스터에 4개의 엔도형 β-아가라아제 [GH16A (서열번호 2), GH16B (서열번호 1), GH16C (서열번호 3) 및 GH16D (서열번호 4)]에 대한 유전정보를 보유하는 것으로 나타났다. 그러나, 이 4가지 동종효소 중 어떤 것이 아가로스 액화 및 아가로스 액화를 통해 NA4/NA6과 같은 NAOS 생성하는데 있어서 가장 주된 작용을 하는 엔도형 GH16 β-아가라아제 활성을 가지고 있는지는 알려진 바가 없다.
본 발명에서는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 유래의 4가지 재조합 His-tagged GH16 패밀리 β-아가라아제 (GH16A, GH16B, GH16C 및 GH16D)를 pET-30a 벡터와 대장균 발현 시스템을 이용하여 생산하고 그 효소 활성을 비교한 결과로서, 이들 4가지 재조합 GH16 패밀리 β-아가라아제들 중 GH16B β-아가라아제가 가장 높은 엔도형 β-아가라아제 활성을 지니고 있음을 확인하였다. 아울러, 재조합 GH16B β-아가라아제를 대상으로 효소학적 특성을 조사하였으며, 이 효소를 이용한 아가로스 액화를 통한 NA4/NA6 생산 효율을 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 발명자들은 담수 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1에서 유래하는 4가지의 GH16 패밀리 β-아가라아제 (GH16A, GH16B, GH16C, GH16D)를 대장균 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질로 발현하여 그 효소활성을 비교하였다. 이러한 4가지 재조합 GH16 패밀리 β-아가라아제 중 N-말단 22-aa 신호 펩티드 서열이 존재하는 GH16B (597개의 아미노산, 63.8 kDa)만이 세포외 배양액으로 분비되었고, 아가로스를 효율적으로 엔도형으로 가수분해하여 최종 생성물인 네오아가로테트라오스 (NA4) 및 네오아가로헥사오스 (NA6)를 생성하였다. 이 재조합 GH16B β-아가라아제 효소의 최적 온도와 pH는 각각 50℃와 7.0으로 나타났다. 또한, 이 효소는 50℃까지 안정하였으며 pH 5.0~8.0에서 안정하였다. 아가로스에 대한 효소의 Km, Vmax, kcat 및 kcat/Km 값은 각각 14.40 mg/mL, 542.0 U/mg, 576.3 s-1, 4.80 × 106 s-1·M-1이었다. 1 mM MnCl2와 15 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)의 동시 첨가에 의해 효소 활성은 2.6배 향상되는 것으로 나타났다. 아가로스 또는 네오아가로올리고당 (NAOS)의 효소-촉매 가수분해에 의해 주로 NA4/NA6가 생성되었지만, 아가로올리고당 (AOS)의 효소-촉매 가수분해에 의해서는 NA4/NA6와 함께 아가로펜타오스 (A5)도 생성되었다. 열처리하여 가용화시킨 아가로스 용액을 50℃에서 14시간 동안 연속적으로 자석교반 (magnetic stirring) 하면서 재조합 GH16B β-아가라아제 효소 (1.6 μg/mL)로 처리했을 때, 9% 농도까지는 아가로스를 효율적으로 액화할 수 있었다. 이때, 아가로스 가수분해물 (9% 아가로스, 20 mL)로부터 Sephadex G-15 컬럼 크로마토그래피에 의해 NA4/NA6를 정제하였을 때, ~650 mg NA4/~900 mg NA6 (이론 최대 수율의 ~85.3%)을 회수하였다. 이러한 결과는 재조합 내열성 엔도형 GH16B β-아가라아제가 아가로스의 액화 및 이를 통한 NA4/NA6의 생산에 유용함을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 기질에 처리하여 효소적 분해 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4)와 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 생산 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 GH16B β-아가라아제는 GH16B β-아가라아제 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것이 바람직하다.
상기 GH16B β-아가라아제 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것이 바람직하다.
상기 기질은 아가로스(agarose) 또는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides, NAOS)인 것이 바람직하다.
상기 아가로스는 9중량% 이하의 농도인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 상기 아가로스의 농도는 예를 들어 1~9중량% 또는 5~9중량%일 수 있다.
상기 처리는 40~60℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 상기 온도는 50℃일 수 있다.
상기 처리는 pH 5.0~8.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 상기 pH는 7.0일 수 있다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2 또는 MnSO4인 것이 바람직하다.
상기 MnCl2 또는 MnSO4는 0.5~2.5 mM의 농도인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 상기 MnCl2 또는 MnSO4의 농도는 1mM일 수 있다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 트리스(2-카복시에틸)-포스핀은 5~15 mM의 농도인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 상기 TCEP의 농도는 5 mM, 10 mM 또는 15 mM일 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. 재료
나프토레조르시놀 (Naphthoresorcinol), D-갈락토스 (D-galactose), 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 3,5-디니트로살리실산 (DNS), 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) R-250, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 카나마이신 (kanamycin), 완전 프로인트 어주번트 (complete Freund's Adjuvant) 및 sodium dodecyl sulfate (SDS)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 제한 효소 (NedI 및 XhoI)와 T4 리가제는 Roche (Basel, Switzerland)에서 구입하였다. C-말단 6x His-tagged 단백질의 발현을 위한 벡터 pET-30a 및 Immobilon-P 막은 EMD Millipore Corporation에서 구입하였다 (Temecula, CA, USA). E. coli BL21 (DE3)은 Novagen (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Micro BCA 키트는 Pierce (Rockford, IL, USA)에서 구입하였고, 형광 지시약 F254로 코팅된 Silica Gel 60 알루미늄 박층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. PageRuler Prestained Protein Ladder 및 Ni-NTA 수지는 ThermoFisher Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. NA2 - NA18을 포함하는 NAOS 표준 혼합물은 앞서 설명한 대로 준비한 후 이상현 박사가 제공하였다 [Lee et al., 2008]. AOS 혼합물은 80 ℃에서 3 시간 동안 처리된 3 M 아세트산에서 1% 아가로스를 약한 산 가수분해한 다음 5 M NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하여 제조하였다. 동결건조 후 고체 시료를 95 %(v/v) 차가운 에탄올로 3 회 세척한 후 회전 증발기를 이용하여 건조시켜 AOS 분말을 얻었다 [Kwon et al., 2020].
1.2. E.coli 발현 시스템을 사용한 GH16 β-아가라아제 유전자의 클로닝 및 발현
Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 게놈 DNA에 있는 4 개의 GH16 β-아가라아제 유전자 (GH16A, GH16B, GH16C, and GH16D)는 NdeⅠ-forward primer [5'-GCGGCATA-TGAAAAAAATCACTTCATGTA-3', GH16B (서열번호 5); 5'-GCGGCATATGCAGTTAATAGATAATAAAGAG-3', GH16C (서열번호 6); 5'-GCGGCATATGCGTATTCGCTCACCTTG-3', GH16D (서열번호 7); 5'-CGCATATGGCCGATTGGGATTCAGTTCC-3', 신호 펩티드 서열 없는 GH16B (서열번호 8)]와 BamHⅠ-forward primer [5'-CGGGATCCATGAAAAAGCATATTTCATGCTG-3', GH16A (서열번호 9)]와 XhoⅠ-reverse primer[5'-CTAACTCGAGGGGTATCAATTCAAACTTG-3', GH16B 및 신호 펩티드 서열 없는 GH16B (서열번호 10); 5'-CGCGCTCGAGGGGTACTAATTCAAATTTATCC-3', GH16C (서열번호 11); 5'-CGCGCTCGAGATTTACTGGCACAAACTCAATG-3', GH16D (서열번호 12)]와 HindⅢ-reverse primer[5'-CGAAGCTTGAGTGAGCCAACTCGAGTAA-3', GH16A (서열번호 13)]를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 정제하고 각각의 적절한 제한 효소 세트에 의해 절단하고 T4 리가제를 사용하여 c-말단 6x his-tagged 단백질의 발현을 위해 pET-30a 벡터에 결찰시켰다. 재조합 pET-30a 플라스미드를 E.coli BL21 (DE3) pLysS로 형질전환시켰다. GH16 ß-아가라아제 유전자를 보유하고 있는 형질전환체를 50 μg/mL 클로람페니콜 및 25 μg/mL 카나마이신이 포함된 LB 플레이트에서 30 ℃에서 밤새 배양하였다.
E.coli BL21 (DE3) pLysS의 pET-30a 플라스미드에 삽입된 개별 β-아가라아제 유전자의 발현은 앞서 설명한 바와 같이 유도되었다 [Studier et al., 1990]. 요약하면, 형질전환체를 50 μg/mL chloramphenicol과 25 μg/mL kanamycin을 포함하는 LB 배지에서 25 ℃에서 진탕 배양하고, OD600이 0.4 - 0.6에 도달했을 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 재조합 GH16 β-아가라아제 단백질 생성을 유도하였다. 세포를 20 ℃에서 밤새 배양하였다. 형질전환체에 의해 생성된 재조합 효소 단백질을 확인하고 세포 외 분비 유무를 규명하기 위해 세포 배양물을 이전에 기술된 바와 같이 4 개의 부분(총, 가용성, 불용성 세포분획)으로 분획화하고, 세포 외 배양 상등액도 회수하였다. 동일한 양의 각 분획을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 재조합 효소는 CBB로 염색하여 시각화하였다.
1.3. LB 아가로스 플레이트에서 아가라아제 활성의 자이모그램
GH16A, GH16B, GH16C 또는 GH16D를 함유하는 재조합 pET-30a 플라스미드를 보유하고 있는 E. coli BL21 (DE3) pLysS 형질전환체를 1.5% 아가로스 (Invitrogen, Life technology, Grand Island, NY, USA), 50 μg/mL 클로람페니콜 및 25 μg/mL의 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 LB 아가로스 플레이트 상에 스팟팅하고, 37℃에서 3일간 배양하였다. 플레이트는 실온에서 Lugol's iodine solution으로 염색되었다.
1.4. 서열분석 및 계통수 구축
4개의 GH16 계열 β-아가라아제의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스의 BLAST 검색에 의해 얻어졌다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 개별 개방 판독 프레임의 아미노산 서열은 Clustal X를 사용하여 정렬되었고 [Larkin et al., 2007] 보존된 잔기는 Clustal X 색 구성표를 사용하여 강조 표시되었다. UPGMA를 사용하여 아미노산 서열 유사성을 기반으로 개별 GH16 패밀리 구성원의 뿌리가 없는 계통수를 구성하였다 [Sneath and Sokal, 1973].
1.5. 세포 용해물, 단백질 정량, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석
형질전환체에 의해 생성된 재조합 효소 단백질을 확인하고 국소화하기 위해 세포를 40 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 현탁시키고, 2초 동안 50회의 숏 버스트로 초음파 처리하여 파괴하고, 4℃에서 30분 동안 추출하고, 앞서 설명한 바와 같이 세 부분 (총, 가용성, 불용성 세포분획)으로 분획하였다 [Jun et al., 1996]. 세포 용해물의 단백질 정량은 Micro BCA 키트 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 동일한 양의 세포 용해물 (15 μg)을 Laemmli의 방법 [Lee et al., 2017]으로 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 젤은 단백질 밴드를 감지하기 위해 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) R-250으로 염색되었다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 E. coli 형질전환체의 세포 용해물과 배양 상등액의 등가량을 SDS-PAGE로 처리한 다음 다른 곳에서 설명한 대로 Immobilon-P 막으로 전기전달시켰다 [Lee et al., 2017]. 단백질 검출은 제조업체의 지침에 따라 ECL Prime Western Blotting Kit를 사용하여 수행되었다.
1.6. GH16B β-아가라아제의 정제
E. coli 형질전환체의 배양액 (300 mL)으로부터 재조합 His-tagged GH16B β-아가라아제를 회수하기 위해 원심분리 (8000 rpm, 20 분) 후 상층액을 얻었다. 배양 상등액을 암모늄 설페이트 (30% 포화)와 혼합하고 혼합물을 4 ℃에서 밤새 교반하여 GH16B β-아가라아제를 침전시켰다. 원심분리 (20,000 rpm, 20 분)하여 침전물을 모은 후 10mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 10 ml에 녹이고 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)으로 4 ℃에서 3 시간 동안 투석하였다. GH16B β-아가라아제를 정제하기 위해, 투석된 재조합 His-tagged GH16B β-아가라아제 용액을 앞서 설명한 바와 같이 Ni-NTA 수지를 사용하여 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 적용하였다 [Spriestersbach et al., 2015].
1.7. 아가라아제 활성 분석
GH16B β-아가라아제 활성에 대한 정량 분석은 아가로스에서 방출된 환원당을 검출하는 DNS 방법을 사용하여 수행되었다 [Miller, 1959]. 효소 용액 (100 μL)을 적절한 완충액에 녹인 동일한 부피의 0.8% 아가로스와 혼합하였다. 50℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물에 형성된 환원당을 DNS 시약을 사용하여 비색 측정하였다. 효소 활성의 한 단위는 분당 1 μmol의 D-갈락토스에 해당하는 환원력을 생성하는 효소의 양으로 정의되었다.
최적 온도는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)에서 25~70℃의 온도 범위에서 30분 동안 결정되었다. 최적의 pH는 50 mM McIlvine 완충액 (pH 40 내지 7.5)과 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5 내지 10.0)을 사용하여 결정되었다. 열 및 pH 안정성 분석의 경우, 효소의 분취량을 표시된 시간 동안 표시된 온도 및 pH에서 전 처리한 다음 표준 분석 조건 (30분, 50℃, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0)에서 상대적인 효소 활성을 측정하였다. GH16B β-아가라아제의 운동 매개변수는 알려진 양의 효소 용액을 아가로스의 기질 용액 (1~5 mg/mL, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5)에 첨가하여 결정하였다. Km 및 Vmax 값은 GraphPad Prism 8 통계 패키지 (GraphPad Software, Inc, USA)를 사용하여 Lineweaver-Burk 방정식에서 계산되었다. 효소 활성에 대한 금속 이온, 환원제 및 킬레이트제 EDTA의 영향을 조사하기 위해 표준 분석 조건에서 표시된 농도의 다양한 금속 이온 (CaCl2, CuSO4, KCl, MgCl2, MnCl2, MnSO4, 및 NaCl), TCEP 또는 EDTA를 사용하였다.
1.8. GH16B β-아가라아제에 대한 항체 생산
GH16B β-아가라아제에 특이적인 마우스 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 정제된 재조합 GH16B β-아가라아제 용액 (120 μg/300 μL PBS)을 동일한 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 혼합한 다음 혼합물 (20 μg/100 μL)을 마우스에 복강내 주사하였다. 2차, 3차, 4차 면역을 위해 정제된 GH16B β-아가라아제 용액을 Incomplete Freund's Adjuvant의 동량과 혼합하여 동일한 방법으로 10일마다 마우스에 주입하였다. 4차 예방접종 후 5일째에 채혈을 실시하였다. C57BL/6J 수컷 마우스 (6주)는 JA Bio (Suwon-si, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하여 특정 병원균이 없는 조건에서 경북대학교 동물자원센터에서 관리했습니다. 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행하였다 (KNU2020-97).
1.9. 박막 크로마토그래피 (TLC)
아가로스, NAOS 또는 AOS의 GH16B β-아가라아제 처리된 가수분해물에 대한 TLC 분석을 실리카겔 60 알루미늄 플레이트에서 수행하고 n-부탄올-에탄올-H2O [3:2:2 (v/v)]로 전개시켰다. 올리고당은 0.2%(w/v) 나프토레조르시놀과 10%(v/v) H2SO4 에탄올을 함유한 가시화 용액을 분무한 후 80 ℃에서 가열하여 검출하였다. NA2 및 NA2-NA18을 포함하는 NAOS 표준 혼합물을 표준으로 사용하였다 [Lee et al., 2008].
1.10. matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS)에 의한 효소 반응 생성물 분석
아가로스 또는 AOS에 대한 효소 반응에서 얻은 가수분해 생성물을 분석하기 위해 이전에 설명한 방법에 따라 MALDI-TOF/TOF MS를 수행하였다 [Lee et al., 2014]. The matrix-assisted laser desorption ionizationtandem time of fligh mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS) 분석은 ultrafleXtreme 시스템 (Bruker Daltonics)을 사용하여 양이온 반사 모드에서 수행되었다. 정제된 반응 생성물을 물에 녹이고, 가용화된 반응 생성물 1 μL를 스테인레스 스틸 타겟 플레이트에 스팟팅한 후, 0.01 M NaCl 0.3 μL 및 50 mg/mL 2,5-디히드록시벤조산 0.5 μL를 첨가하였다. 50% 아세토니트릴에서. 균일한 결정화를 위해 스팟을 진공하에 빠르게 건조시켰다. 획득한 각 스펙트럼은 1 kHz 레이저를 사용하여 해당 지점의 3개의 임의 위치에서 총 2,400개의 레이저 샷에서 800개의 레이저 샷에서 결합된 신호를 나타낸다. 레이저 감쇠기 오프셋 및 범위는 각각 68% 및 15%로 설정되었고 레이저 초점은 50%로 설정되었다. 질량 스펙트럼은 0에서 5,100 m/z 범위에 걸쳐 기록되었다. 고해상도 데이터를 얻기 위해 검출기 샘플링 속도는 최대 4.00gigasamples/s로 설정하고 검출기 이득은 4.0x으로 설정하였다. 질량 스펙트럼은 상업용 맥주에서 분리된 말토올리고당을 사용하여 외부적으로 보정되었다. 1 헥소스 단위 (162.053 Da) 간격으로 배치된 6탄당 중합체 사다리는 전체 질량 수집 범위에 대한 포괄적인 범위를 제공하여 샘플 분석 직전에 MALDI-TOF/TOF MS의 정확한 질량 보정을 가능하게 하였다. 원시 MS 데이터는 FlexAnalysis 소프트웨어 (version 3.3; Bruker Daltonics)로 처리되었다. MS 피크는 3.0의 신호 대 잡음비로 필터링되었으며 나트륨, 칼륨 또는 기타 일반적인 부가물의 형성을 검출하기 위하여 수동으로 검증하였다. 그런 다음 모든 피크를 디컨볼루션하고 샘플의 모든 중성 질량 목록을 생성했으며 풍부함은 질량 스펙트럼 피크 강도로 표시되었다.
1.11. 크기 배제 컬럼 크로마토그래피에 의한 NA4 및 NA6의 정제
아가로스 가수분해 생성물로부터 NA4 및 NA6을 정제하기 위해 9% 용융 아가로스 (20 mL)를 최적의 조건 (1 mM MnCl2 and 10 mM TCEP, 50℃, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 GH16B β-아가라아제로 14시간 동안 처리한 후 동결건조시켰다. 동결건조된 시료를 탈이온수에 녹이고 증류수로 평형화된 Sephadex G-15 컬럼 (I.D. 1.35 x 120 cm)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 탈이온수로 용리시키면서 각각의 2 mL 분획을 수집하였다. NA4 및 NA6을 함유하는 분획을 TLC로 측정하고, 수집하고, 동결건조하여 건조시켰다.
1.12. 통계 분석
달리 명시되지 않는 한 데이터는 최소 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD, 각 군에 대하여 n ≤ 3)로 표시된다. 통계적 분석은 두 그룹 간의 차이의 유의성을 평가하기 위해 Student's t-test를 사용하고 one way ANOVA에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 세 개 이상의 그룹을 비교하여 수행하였다. P 값 < 0.05는 유의미한 것으로 간주되었다. 통계 분석은 SPSS Statistics 버전 23 (IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행되었다.
2. 결과
2.1. Cellvibrio sp. KY-GH-1 유래의 4 가지 GH16 패밀리 β-아가라아제의 E. coli 발현계 및 pET-30a 벡터를 이용한 C-말단 His-태그된 재조합 단백질로서의 생산
담수 한천 분해 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 전체 게놈 서열 분석에 대한 이전 연구는 4개의 GH16 β-아가라아제 유전자들 (GH16A, GH16B, GH16C, GH16D)의 존재를 시사했다 [Kwon et al., 2019]. 도 1에 도시된 바와 같이, GH16A는 52.0-kDa 단백질 (GH16A β-아가라아제)을 구성하는 477개 아미노산(aa)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 가지며, GH16B는 63.8 kDa-단백질 (GH16B β-아가라아제)을 구성하는 597 aa를 암호화하는 ORF를 가지는 것으로 나타났다. 아울러 GH16C는 64.3 kDa-단백질 (GH16C β-아가라아제)을 구성하는 590 aa를 암호화하는 ORF를 가지고 있었다. 이와 대조적으로, GH16D는 108.1 kDa-단백질 (GH16D β-아가라아제)을 구성하는 998 aa를 암호화하는 ORF를 가지고 있으므로, GH16D β-아가라아제의 분자량이 다른 3가지 동종효소들에 비해 훨씬 크다는 것을 나타낸다. GH16B β-아가라아제의 ORF 아미노산 서열은 GH16A, GH16C 및 GH16D β-아가라아제와 각각 51.7%, 52.0% 및 41.0% 동일성을 나타냈다. 이것은 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주가 가지는 4가지의 GH16 패밀리 β-아가라아제들은 서로 간의 상동성이 낮은 수준임을 보여준다.
이 데이터를 기반으로 E. coli 발현계에서 발현되는 재조합 His-태그된 GH16 β-아가라아제들을 사용하여, 4 가지의 GH16 패밀리 β-아가라아제들 중에서 어느 효소가 아가로스 기질에 대한 가장 두드러진 엔도형 가수분해 활성을 갖는지를 조사하였다. 개별 GH16A, GH16B, GH16C, GH16D β-아가라아제를 발현하는 E. coli 형질전환체를 0.5 mM IPTG가 포함된 LB 아가로스 고체 배지 플레이트 상에서 2일 동안 배양한 후, Lugol's iodine 용액으로 염색하였다. 콜로니 주변의 밝고 투명한 영역에 의해 반영되는 아가로스 분해 활성은 GH16B β-아가라아제를 발현하는 형질전환체에서 가장 높았다 (도 2의 A). GH16A, GH16B, GH16C 및 GH16D β-아가라아제를 발현하는 개별 E. coli 형질전환체에 0.5 mM IPTG를 배양 배지에 첨가하여 단백질 발현을 유도한 다음, 세포내에서 발현된 재조합 효소가 세포외 배양액으로 분비되는지를 확인하기 위해 세포 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 세포외 분획으로 준비하였다. 이때 수확된 세포 펠렛을 처리하여, 전체 (total), 가용성 (soluble) 및 불용성 (insoluble) 세포내 분획을 각각 확보하였다. 각 분획을 동등량씩 취하고 8 % SDS-PAGE를 수행하여, 각 재조합 효소의 세포내 가용성/불용성 비율 및 세포외 분비율을 조사하였다. 도 2의 B에 나타난 바와 같이, GH16A β-아가라아제, GH16C β-아가라아제 및 GH16D β-아가라아제는 불용성 봉입체 부분에서 우세하게 검출되었다. 이에 반해, GH16B β-아가라아제는 배양 상등액에서 우세하게 검출되어, E. coli 형질전환체에서 발현되는 재조합 GH16B β-아가라아제는 세포외로 분비되는 것으로 보여졌다.
이러한 결과는, Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주가 지닌 아가로스 분해 효소 기구 (agarose-degrading enzyme machinery)에 있어서는 4 가지 GH16 β-아가라아제들 (GH16A, GH16B, GH16C, GH16D) 중에서 GH16B β-아가라아제가 아가로스 분해 효소 기구 (agarose-degrading enzyme machinery)의 구성원으로서 아가로스 액화를 위한 핵심적인 역할을 수행하는 엔도형 β-아가라아제임을 입증했다. 또한, 이러한 결과는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주에 있어서 GH16B β-아가라아제의 기능은 본질적으로 세포외 효소로서 수행됨을 시사했다.
2.2. GH16Bβ-아가라아제의 아미노산 서열과 다른 출처의 관련 효소의 아미노산 서열 비교
Cellvibrio sp. KY-GH-1에서 GH16B β-아가라아제의 아미노산 서열은 Clustal X 프로그램을 사용하여 다른 GH16 패밀리 β-아가라아제 배열과 정렬되었다 [Larkin, 2007]. 도 3의 A에 나타난 바와 같이, KY-GH-1 GH16B β-아가라아제 597 aa의 아미노산 배열 분석 결과, N-말단 신호 펩티드 서열 (22 aa)의 존재를 확인할 수 있었다. Cellvibrio sp. pealriver (GenBank 등록 번호, WP_04962945.1) [Xie et al., 2017], Cellvibrio sp. OA-2007 (Genbank 등록 번호 WP_062064993.1) [Syazni et al., 2015], 및 Cellvibrio sp. BR (Genbank 등록 번호 WP_007640762.1) 및 Cellvibrio sp. BR (GenBank 가입 번호 WP_007640762.1)은 N 말단 영역에서 공통적으로 신호 펩티드 서열을 포함하는 것으로 나타났으며, 이러한 GH16 패밀리의 β-아가라아제가 한천 분해 Cellvibrio sp.로부터 세포외 효소로서 생성되어 아가로스를 NA4/NA6으로 가수분해할 가능성을 뒷받침한다. 한편, Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH16B β-아가라아제 (GenBank 등록 번호 QEY14910.1)의 전체 아미노산 서열은 Cellvibrio sp. KY-YJ-3 GH16B β-아가라아제 (GenBank 등록 번호 QEY12839.1)의 아미노산 서열과 100% 동일하였다. KY-GH-1 GH16B β-아가라아제의 아미노산 서열은 또한 Cellvrio sp. pealriver, Cellvrio sp. OA-2007, Cellvibrio sp. BR, 및 미배양 세균 (GenBank 등록 번호 AAP49316.1)와 같은 비해양성 한천 분해 세균의 서열과 98.8%, 96.0%, 95.0%, 79.6%의 유사성을 각각 공유하였는데, 이는 Cellvibrio sp. GH16B β-아가라아제들 사이의 높은 수준의 상동성을 나타내었다. GH16B β-아가라아제의 아미노산 서열은 해양성 한천 분해 세균인 Pseudomonas sp. ND137 (GenBank 등록 번호 BAD88713.1) [Aoki and Kamei, 2006), Marinimicrobium Aglyticum (GenBank 등록 번호 WP_036188483.1), Gilvimarinus chinensis (GenBank 등록 번호 WP_0208740.1), 및 Simduia agarivorans (GenBank 등록 번호 WP_015048661.1)와 각각 53.1%, 52.1%, 50.9%, 50.8% 유사도를 나타내었다.
개별 GH16B β-아가라아제들의 유근 계통발생학적 관계 (rooted phylogenetic relationships)에 있어서, Cellvibrio sp. KY-GH-1/KY-YJ-1 GH16B β-아가라아제는 Pseudomonas sp. ND137, M. agarilyticum, G. chinensis 및 S. agrivorans 등과 같은 해양성 세균 유래의 GH16B β-아가라아제들에 비해 Cellvibrio sp. pealriver, Cellvibrio sp. OA-2007, Cellvibrio sp. BR 및 미배양 세균 (unclutured bacterium) 등과 같은 비해양성 세균 유래의 β-아가라아제들과 더 밀접하게 분류됨을 보여 주었다 (도 3의 B). 한편, 높은 수준의 서열 유사성으로 정렬된 모든 한천 분해 세균에서 GH16B β-아가라아제 상동체가 존재한다는 것은 한천 분해 세균에 있어서 아가로스의 β-1,4-결합을 엔도형으로 분해하는 GH16B β-아가라아제가 한천 분해 효소 장치의 필수 구성 요소임을 시사한다.
2.3. GH16B β-아가라아제의 효소적 특성
아미노산 서열 분석 데이터가 GH16B β-아가라아제에서 추정되는 N-말단 22-aa 신호 펩티드 서열의 존재를 보여주었기 때문에, 신호 펩티드 서열이 E. coli 발현계에서 재조합 GH16B β-아가라아제의 분비 및/또는 용해도와의 관련 여부를 조사하였다. 이와 관련하여, 22-aa 신호 펩티드 서열이 있는 GH16B β-아가라아제 또는 22-aa 신호 펩티드 서열이 없는 GH16B β-아가라아제를 발현하는 각각의 E. coli 형질전환체의 배양액에 0.5 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 형질전환체 세포내 및 세포외 분획에 분포하는 두 가지 GH16B β-아가라아제의 양을 항-GH16B β-아가라아제 및 항-His-tag 항체들을 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 비교하였다.
도 4의 A 및 도 4의 B에 나타난 바와 같이, 22-aa 신호 펩티드 서열을 갖는 GH16B β-아가라아제는 가용성 형태로서 세포외 배양상등액에서 현저하게 검출되었으나, 신호 펩티드 서열이 없는 GH16B β-아가라아제는 세포외로 분비되지 않고 세포 내 불용성으로만 검출되었다. 항-GH16B β-아가라아제를 이용한 웨스턴 분석에 의해 검출된 형질전환체의 GH16B β-아가라아제의 세포내 및 외 분포 양상은 항-His-tag 항체를 사용한 웨스턴 분석에 의해 검출된 양상과 일치하였다. 동일한 조건에서 E. coli에서 잘 알려진 세포내 효소인 β-갈락토시다아제 [Kuboi et al., 1995]도 22-aa 신호 펩티드 서열을 지닌 GH16B β-아가라아제를 발현하는 형질전환체의 세포외 배양 상등액에서 검출되었지만, 22-aa 신호 펩티드 서열이 없는 GH16B β-아가라아제를 발현하는 형질전환체에서는 세포 외 배양 상등액에서 검출되지 않았다. 이러한 결과는 22-aa 신호 펩티드 서열을 갖는 GH16B β-아가라아제의 발현이 GH16B β-아가라아제 자체의 세포외 분비뿐만 아니라 β-갈락토시다아제를 비롯한 일부 세포내 단백질들에 대해 세포외 누출을 야기할 수 있음을 시사한다. His-tagged GH16B β-아가라아제를 황산 암모니움 침전 (ammonium sulfate precipitation, 30% 포화) 및 Ni-NTA 정제 시스템을 사용하여 배양 상등액에서 정제한 결과, GH16B β-아가라아제 (63.8 kDa), 미지의 단백질들 (~37.5kDa 및 ~120kDa)을 포함한 최대 3개의 단백질을 제외한 대부분의 단백질들이 황산 암모늄 침전 절차에 의해 대부분 제외된 것으로 나타났으며, 뒤이은 Ni-NTA 정제에 의해서는 8% SDS-PAGE에서 단일 밴드로 검출될 정도로 높은 순도로 나타났다 (도 4의 C 및 도 4의 D).
아가로스로부터 NA4와 NA6의 대량 생산을 위한 재조합 GH16B β-아가라아제의 활용성을 파악하기 위해, 그 효소적 특성을 조사하였다. 다양한 온도에서 GH16B β-아가라아제 활성을 측정하였을 때, 50℃ 온도에서 가장 활성이 높았고, 또한 25~60℃ 범위 내에서는 최대 활성의 80% 이상이 유지되는 것으로 나타났다 (도 5의 A). 이러한 결과는 배양 상등액으로 분비되는 세포외 가용성 단백질로 재조합 GH16B β-아가라아제를 생산하고자 대장균 형질전환체를 배양하는 온도가 20 ℃인 점과 비교하여 볼 때, GH16B β-아가라아제의 효소 활성의 최적 온도 범위가 대장균 형질전환체의 배양온도에 비해 다소 높다는 것을 보여준다. 효소는 5.0~8.0 (최적 pH 7.0)의 광범위한 pH 범위에서 활성을 보였다 (도 5의 B). 효소는 50 ℃까지 안정하여 3시간 50 ℃에서 처리 후 최대 활성의 ~90%, 14시간 50℃에서 처리 후 최대 활성의 ~80%를 유지하였고, 55℃에서 14시간 또는 60℃에서 3시간 처리 후 대부분의 효소 활성을 상실하여 GH16B β-아가라아제가 내열성이 높은 효소임을 알 수 있었다(도 5의 C). GH16B β-아가라아제는 pH 5.0~8.0 범위에서 안정하였으나 4.0보다 낮은 산성 pH에서는 급속히 비활성화되어 pH 10.0 (도 5의 D)에서 4시간 처리 후 ~35%의 활성을 유지하였다. 이러한 결과는, GH16B β-아가라아제가 산성 pH보다 알칼리 pH에서 더 안정하다는 것을 보여준다. GH16B β-아가라아제의 아가로스에 대한 Km, Vmax, kcat 및 kcat/Km 값은 각각 14.40 mg/mL, 542.0 U/mg, 576.3 s-1, 4.80 × 106 s-1·M-1이었다(도 5의 E).
GH16B β-아가라아제 활성은 0.5~2.5 mM MnCl2 및 MnSO4의 존재 하에서 1.5배~1.6배 향상되었으며, 특히 MnCl2 농도 1 mM에서 최대 수준으로 향상되었는데, 이러한 결과는 GH16B β-아가라아제 효소 활성이 Mn2+에 의존적임을 시사한다 (표 1).
[표 1] GH16B β-아가라아제 활성에 관한 금속 이온 및 다른 화학종의 효과
Figure 112022080600035-pat00006
그러나 0.5~2.5 mM 농도의 CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl 및 EDTA의 존재는 효소 활성에 거의 영향을 미치지 않았으며, 2.5 mM CuSO4의 존재는 오히려 효소 활성 수준을 대조군의 74%로 감소시켰다. 또한, 현재 가장 널리 사용되는 SH 환원제인 항산화제 TCEP [Brans et al., 1991]는 5~15 mM 농도에서 최대 1.6배까지 농도에 비례하여 효소 활성을 향상시킬 수 있었다 (도 6). 특히, 1 mM MnCl2와 5~15 mM TCEP를 동시 처리할 경우 GH16B β-아가라아제 활성에 대한 향상 효과가 더욱 증진되어 1 mM MnCl2와 5 mm, 10 mM 및 15 mM TCEP가 동시 처리할 경우, 효소 활성이 최대 1.8배, 2.2배, 및 2.6배까지 각각 상승하는 것으로 확인되어 GH16B β-아가라아제 활성에 대한 Mn2+/TCEP의 상승효과를 보였다. 아울러 이러한 결과는, GH16B β-아가라아제가 적절한 효소 활성을 위해 필요로 하는 망간 이온과의 상호작용은 EDTA의 킬레이트 작용에 저항할 수 있을 정도로 강할 수 있음을 시사한다.
2.4. GH16B β-아가라아제의 기질 분해 모드
보고된 문헌에 따르면, GH16 β-아가라아제는 아가로스를 가수분해하여 최종 생성물 NA4/NA6을 생산하는 엔도형 효소이다 [Michel et al., 2006; Chi et al., 2012]. 기질 분해 모드를 결정하기 위해, 기질 (agarose, NA2~NA18의 NAOS 혼합물 및 AOS)을 GH16B β-아가라아제로 시간 별로 처리한 후 가수분해 생성물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, GH16B β-아가라아제의 처리 시간에 따른 아가로스 기질의 가수분해 양상은 초기 단계에서는 아가로스를 엔도형 분해를 통해 다양한 중합도 (DP)를 지닌 NAOS를 생성하였고, 60분의 반응 기간 동안 후기 단계에서 최종 생성물로서 NA4/NA6을 생성하였다 (도 7의 A 및 도 7의 B). 그러나, 이러한 조건에서는 NA2 생성은 검출되지 않았다. 또한, 주로 NA2~NA18로 이루어진 NAOS 혼합물을 기질로 하여 처리한 효소 가수분해물의 TLC 분석의 결과는 NA12-NA18보다 크거나 같은 NAOS가 NA4/NA6을 생성하는 효소 반응에 대한 바람직한 기질임을 보여주었다 (도 7의 B). 또한 TLC 분석의 결과는, GH16B β-아가라아제가 다양한 중합도 (DP)의 AOS 혼합물을 가수분해하여 주요 생성물로서 NA4/NA6을 생성할 수 있음을 보여주었다 (도 7의 C). 동시에, 이러한 AOS의 효소-촉매 분해 동안에는 AOS의 비환원 말단에서 생성된 것으로 추정되는 아가로펜타오스 (A5)를 유사한 양으로 생성하는 것으로 나타났다.
MALDI-TOF/TOFMS에 의해 GH16B β-아가라아제 촉매 가수분해물을 추가로 분석하였을 때, 검출된 NA4 ([M + Na]+: 653) 및 NA6 ([M + Na]+: 959)의 질량은 앞서 설명한 분자식으로부터 계산된 질량에 각각 일치하였다 (도 8의 A). 또한, AOS의 효소 촉매 가수분해물에 대한 MALDI-TOF/TOFMS 분석 결과, 효소 반응의 최종 산물로서 AOS로부터 NA4, NA6와 함께 상당한 양의 A5 ([M + Na]+: 815)가 생성되었음을 알 수 있었다 (도 8의 B). 이러한 결과는, GH16B β-아가라아제가 아가로스 기질을 엔도형으로 가수분해하여 NA4와 NA6를 생성시키는 반면, AOS 기질을 가수분해할 경우에는 NA4/NA6뿐만 아니라 A5도 효소반응에 의해 AOS로부터 생성됨을 확인시켰다.
결과적으로, 이러한 결과는 Cellvibrio sp. KY-GH-1로부터 유래하는 재조합 GH16B β-아가라아제가 아가로스, NAOS 또는 AOS 등과 같은 기질로부터 NA4와 NA6의 대량 생산하는데 활용될 수 있음을 시사한다.
2.5. 최적의 조건에서 아가로스를 GH16B β-아가라아제로 처리하였을 때의 NA4 및 NA6 수율
GH16B β-아가라아제가 아가로스로부터 NA4/NA6을 생산하는 효율적인 효소인지 여부를 추가로 조사하기 위해, 열처리에 의해 가용화시킨 아가로스 용액을 아가로스 겔화 온도 (~40℃)보다 높은 온도인 50℃에서 연속 자석 교반하면서, GH16B β-아가라아제를 처리하여 NA4 및 NA6으로 효율적으로 가수 분해될 수 있는 아가로스의 최대 농도를 측정하였다. 다양한 농도의 아가로스 (5.0%, 7.0%, 9.0%)를 GH16B β-아가라아제 (1.6 μg/mL)로 최적의 반응 조건 (1 mM MnCl2 및 10 mM TCEP, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50℃)에서 14시간 동안 처리한 후, 개별 가수분해 생성물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, 효소 처리에 따른 아가로스의 NA4/NA6으로의 완전한 가수분해는 최대 9.0% 아가로스 농도까지 관찰되었다 (도 9의 A). 이러한 최적의 조건에서 14시간 동안 1.6 μg/mL GH16B β-아가라아제로 9% 아가로스 용액 (20 mL)를 완전히 가수분해한 후, 반응 생성물을 동결건조하여 건조시켰다 건조된 시료를 초순수 (DI water)에 녹이고 Sephadex G-15 컬럼을 이용하여 크기-배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)를 수행하여 분획하였다. TLC 분석 결과, 분획 30~34에서는 NA4가, 분획 35~39에서는 NA6이 확인되었다 (도 9의 B). NA4 및 NA6 분말은 분획 30~33 및 분획 35~38을 각각 동결건조하여 얻었다. 1.8 g의 아가로스 (9%, 20 mL)의 효소 가수분해물을 Sephadex G-15 컬럼을 이용하여 크기-배제 크로마토그래피로 분획하였을 때, 총 ~650 mg의 NA4 및 ~900 mg의 NA6이 회수되었는데, 그 회수율은 이론적 최대 수율의 ~85.3%에 해당하였다.
3. 논의
본 발명의 발명자들은 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1로부터 유래하는 GH16B β-아가라아제를 E. coli 발현계에서 세포외 재조합단백질로 생산하여 아가로스의 β-1,4-결합을 가수분해하여 최종 생성물로서 NA4/NA6을 생성할 수 있음을 구명하였다. 열처리하여 가용화시킨 9% 아가로스 용액을 50℃에서 자석교반하면서 14시간 동안 재조합 GH16B β-아가라아제로 처리하고 그 가수분해물을 대상으로 Sephadex G-15 컬럼 크로마토그래피에 의해 NA4/NA6를 정제하였을 때, 이론 최대 수율의 ~85.3%에 해당하는 NA4와 NA6를 회수하였다.
선행연구를 통해 우리는 한천 분해 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 유전체에 4 가지의 GH16 β-아가라아제 유전자들 (β-CvAga16A, β-CvAga16B, β-CvAga16C, β-CvAga16D)이 포함되어 있으며, 이들 유전자들은 아가로스를 가수분해하여 NA4/NA6를 생성시키는 GH16A (477 aa, 52.0 kDa), GH16B (597 aa, 63.8 kDa), GH16C (590 aa, 64.3 kDa), 및 GH16D (998 aa, 108.1 kDa)를 각각 암호화할 수 있을 것으로 추정하였다 [Kwon et al. 2019]. 이들 4 가지 효소를 대장균 형질전환체에서 His-태그가 달린 재조합 단백질로 발현시켜 본 결과, N-말단 22-aa 신호 펩티드 서열을 갖는 GH16B β-아가라아제만이 가용성 상태로 세포 외 배양액에 분비되었으며 아가로스를 NA4/NA6로 가수분해하는 효율적인 엔도형 가수분해 활성을 잘 발휘하는 것으로 나타났다. 반면에, 22-aa 신호 펩티드 서열이 없는 GH16B β-아가라아제를 대장균 형질전환체에서 발현시켰을 경우에는 세포외로 분비되지 못하고 대부분이 세포내 불용성 분획 (inclusion body fraction)에 축적되었다. 이러한 결과는, 4 개의 추정 GH16 패밀리 β-아가라아제들 중에서 GH16B β-아가라아제가 KY-GH-1 균주에 의한 아가로스의 엔도형 가수분해를 담당하는 핵심 효소임을 나타내며, 또한 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 GH16B β-아가라아제의 N-말단 22-aa 신호 펩티드 서열이 대장균 형질전환체에서도 GH16B β-아가라아제의 세포외 분비에 기여할 수 있음을 시사한다. 일반적으로 세균 세포막을 가로질러 수송될 예정인 대부분의 단백질은 N-말단에 신호 펩티드 서열을 지닌 상태로 합성되고, 그 신호 펩티드 서열은 단백질의 막 통과 중에 또는 막 통과 직후에 신호 펩티다아제에 의해 제거되는 것으로 알려져 있다 [Dalbey et al., 2012; Freudl, 2018]. 그러나, 대장균 형질전환체에서 세포 외로 분비된 재조합 GH16B β-아가라아제가 22-aa 신호 펩티드 서열을 여전히 가지고 있는지 여부는 추가 연구를 통한 구명이 필요하다. 또한, SDS-PAGE 및 Western Blot 분석에 따르면, 대장균 형질전환체에서 22-aa 신호 펩티드 서열을 가진 GH16B β-아가라아제의 과다 발현은 GH16B β-아가라아제뿐만 아니라 β-갈락토시다아제를 포함한 여러 세포 내 단백질들의 세포 외 누출을 야기시키는 것으로 나타났다. 이 현상에 관한 근본적인 메커니즘 규명에도 역시 추가 연구가 필요하다.
Clustal X 프로그램 [Larkin et al. 2007]은 GH16B β-아가라아제 상동체가 해양성 또는 비해양 성의 모든 한천 분해 세균에 존재함을 보여주는데, 이는 GH16B β-아가라아제가 세균의 한천 분해 효소 기구의 필수 구성요소임을 시사한다. 또한, 이들 9개의 GH16B β-아가라아제 상동체들 중 어느 것도 효소적 특성에 대해 조사되지 않았기 때문에, 본 연구에서 보고된 GH16B β-아가라아제 관련 데이터는 GH16B β-아가라아제와 높은 상동성을 나타내는 GH16 계열 β-아가라아제에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
아가로스에 대한 KY-GH-1 GH16B β-아가라아제의 Km 및 Vmax 값 (14.40 mg/mL 및 542.0 U/mg)은 Catenovulum agarivorans YM01 유래의 GH16 β-아가라아제 (3.78 mg/mL 및 11400 U/mg) [Cui et al., 2014], Agarivorans sp. LQ48 유래의 GH16B β-아가라아제 (3.9 mg/mL 및 909.1 U/mg) [Long et al., 2010], Pseudoalteromonas hodoensis H7 유래의 GH16B β-아가라아제 (28.33 mg/mL 및 88.25 U/mg) [Park et al., 2015], Saccharophagus degradans 2-40T 유래의 GH16 β-아가라아제 (7.7 mg/mL 및 18.3 U/mg) [Kim et al., 2017], Microbulbifer sp. JAMB-A94 유래의 GH16 β-아가라아제 (4.8 mg/mL 및 517 U/mg) [Ohta et al., 2004], Vibrio sp. 균주 PO-303 유래의 GH16 β-아가라아제 (2.33 mg/mL 및 101 U/mg) [Dong et al., 2007] 등과 비교할 만한 수준이었다. 또한, KY-GH-1 GH16B β-아가라아제의 아가로즈 기질에 대한 kcat 및 kcat/Km 값 (576.3 s-1 및 4.80 × 106 s-1·M-1)과 관련하여 다른 비교 대상들 보다 더 촉매적인 것으로 나타났다.
일반적으로 Mg2+ 및 Na+의 존재에 의존하는 것으로 보고된 해양 기원 β-아가라아제 [An et al. 2018; Han et al., 2016; Xie et al. 2013]와는 달리, GH16B β-아가라아제 활성은 MgCl2 또는 NaCl의 영향을 크게 받지 않았다. 대신에 GH16B β-아가라아제 활성은 Mn2+ 또는 환원제 TCEP의 존재 하에서 농도에 비례하여 향상되었다. GH16B β-아가라아제 활성에 대한 Mn2+ 와 TCEP의 상승 효과가 관찰되어 1 mM MnCl2와 15 mM TCEP의 공존 하에서 효소 활성이 최대 2.6배까지 상승할 수 있었다. GH16B β-아가라아제 활성의 Mn2+/TCEP 의존적인 상승은 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주에서 유래한 GH50A β-아가라아제 활성 [Kwon et al., 2020] 또는 GH117A α-NABH 활성 [Jang et al., 2021]에서 관찰되었던 Mn2+/TCEP 의존적인 상승 경향과 유사하였다. 이러한 이전 및 현재의 연구 결과들은, 담수 유래 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주에 있어서 다당류 아가로스 기질을 단량체인 L-AHG 및 D-Gal로 가수분해하기 위해 관여하는 아가로스 분해 효소 기구 (agarose-degrading enzyme machinery)의 필수적 구성원들인 세 가지 효소들 모두는 Mn2+와 TCEP의 존재 하에서 그 활성이 공통적으로 증진되는 특징이 있음을 보여준다.
GH16B β-아가라아제는 50℃에서 3시간 동안 처리된 후에 최대 활성의 ~90%를 유지하였고, 또한 50℃에서 14시간 동안 처리 후에는 최대 활성의 ~80%를 유지할 정도로 열에 안정하다는 점에서 열 안정성이 매우 높은 효소로 확인되었다. 이전 연구에서 해양성 세균 C. agarivorans YM01 에서 유래한 재조합 GH16 β-아가라아제 YM01-3은 60℃에서 최적의 활성을 나타내었고 50℃에서 1시간 동안 처리된 후에도 80% 정도의 효소 활성을 유지하는 것으로 보고되어, 다른 GH16 β-아가라아제들에 비해 열 안정성이 매우 우수하다고 강조된 바 있다 [Cui et al., 2014]. 이러한 현재 및 이전 연구 결과에 따르면, KY-GH-1 균주 유래 GH16B β-아가라아제의 최적온도 (50℃)는 GH16 β-아가라아제 YM01-3의 최적온도 (60℃)에 비해 다소 낮지만, 50℃에서의 열 안정성에 있어서는 GH16 β-아가라아제 YM01-3보다 훨씬 더 우수한 것으로 확인된다.
열처리에 의해 가용화된 아가로스의 겔화 온도는 약 40℃이기 때문에, GH16B β-아가라아제의 최적 온도(50℃)와 열 안정성 (50℃에서 14시간 동안 안정)에 의해 확인된 GH16B β-아가라아제의 효소학적 특성에 근거하면, 본 GH16B β-아가라아제 효소는 열처리에 의해 가용화된 아가로스 용액을 아가로스 겔화 온도보다 더 높은 온도인 50℃에서 액화시켜 낮은 중합도 (DPs)의 NAOS로 전환 시키는 효소공정에 효과적으로 활용될 수 있음을 시사한다.
GH16 패밀리 α-아가라아제들은 아가로스를 엔도형으로 가수분해하여 NA4와 NA6를 최종 생성물로 생성한다는 이전의 연구 결과들과 마찬가지로 [Michel et al. 2006; Cantarel et al. 2009; Chi et al. 2012], 0.4% 아가로스 혹은 1.0% NAOS 기질을 0.8 μg/mL GH16B β-아가라아제로 50℃에서 1시간 처리하여 얻어진 가수분해물을 TLC로 분석한 결과는, NA4와 NA6가 최종 생성물로 생성됨을 보여주었다. 한편, 용해된 5%, 7%, 혹은 9% 아가로스 기질을 1.6 μg/mL GH16B β-아가라아제로 50℃에서 14시간 동안 자석교반하면서 연속적으로 처리하였을 경우에는 아가로스의 완전 가수분해에 따른 NA4 및 NA6의 생성과 함께 미량의 NA2도 함께 생성됨을 확인할 수 있었다. 이는 GH16B β-아가라아제가 1.6 μg/mL 농도에서는 NA6를 NA4와 NA2로 더 가수분해할 수 있음을 시사한다. 또한, 아가로스를 약산의 처리로써 가수분해 시켜 제조할 수 있는 다양한 DP의 AOS 혼합물 [Kwon et al., 2020]을 기질로 하여, GH16B β-아가라아제 처리로써 가수분해할 경우에는 최종 생성물로서 NA4 및 NA6와 함께 아가로펜타오스 (agaropentaose, A5)도 생성됨을 확인하였다.
열처리에 의해 용해된 아가로스 용액 (5%, 7%, 혹은 9%)을 1.6 μg/mL 농도의 GH16B β-아가라아제로 최적 조건 (1 mM MnCl2, 10 mM TCEP, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0, 50℃)으로 14시간 동안 연속적으로 자석교반하면서 처리한 후 얻은 가수분해물을 TLC로 분석한 결과, 9.0%의 아가로스 농도까지는 완전히 액화하여 최종 생성물 NA4 및 NA6로 전환시키는 것으로 나타났다. 이때 얻어진 아가로스 가수분해물에 함유된 NA4 와 NA6를 Sephadex G-15 컬럼을 이용한 크기-배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)로 정제하였을 때, 9% 아가로스 (20 mL)의 가수분해물로부터 ~650 mg NA4/~900 mg NA6를 얻었고 이에 따른 그 회수율은 이론상 최대 수율의 ~85.3%였다. 이러한 결과는, GH16B β-아가라아제의 최적 온도가 아가로스의 겔화 온도 (~40℃)보다 더 높은 50℃이며 아울러 열 안정성도 50℃에서 매우 우수하여서, 재조합 GH16B β-아가라아제는 아가로스의 효소적 액화 및 결과적으로 고농도 아가로스 기질로부터 단일 액화 공정 (one-step liquefaction process)을 통해 NA4/NA6을 대량 생산하기 위한 산업에 활용할 수 있는 매우 유용한 효소임을 나타낸다.
요약하면, 현재 결과는 한천 분해 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1 로부터 유래한 재조합 엔도형 GH16B β-아가라아제는 최대 9% 농도의 아가로스를 엔도형으로 가수분해하고 액화하여 효율적으로 NA4와 NA6를 생성할 수 있음을 보여준다. 이때 아가로스 가수분해를 위한 GH16B β-아가라아제의 최적 온도와 pH는 각각 40-50℃와 7.0이었다. 이 효소는 50℃까지 안정하였으며 pH 5.0~8.0에서 안정하였으며, 50℃ 보다 높은 온도 및 pH 5.0~8.0 범위 밖에서는 불안정하였다. 효소 활성은 1 m MnCl2 및 10 mM TCEP의 존재 하에서 2.6배 향상되었다. 아가로스에 대한 Km, Vmax, kcat 및 kcat/Km 값은 각각 14.40 mg/mL, 542.0 U/mg, 576.3 s-1 및 4.80 × 106 s-1·M-1이었다. GH16B β-아가라아제의 최적 온도, 열 안정성 및 엔도형 아가로스 분해 작용 양상과 같은 효소적 특성은, 열처리에 의해 용해된 고농도의 아가로스를 겔화 온도 (~40℃)보다 더 높은 온도인 50℃에서 GH16B β-아가라아제 효소로써 단일 액화 공정으로 처리하여 NA4와 NA6로 전환시키는데 매우 유용하며, 따라서 이 공정를 통한 NA4 와 NA6의 대량생산에 유용하다는 것을 보여준다. 또한, 재조합 GH16B β-아가라아제를 사용하는 아가로스 액화 공정은 강력한 엑소형 GH50 패밀리 β-아가라아제와 병합하면, 아가로스로부터 NA2의 대량생산 공정으로 발전될 수 있으며, 여기에 NA2를 단량체인 L-AHG 와 D-Gal로 효율적으로 분해하는 α-NABH를 더 병합하면 아가로스로부터 L-AHG를 대량생산하는 효소공정으로 더 발전될 수 있음을 시사한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC13629BP 20180827

Claims (11)

  1. 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제(GH16B β-agarase)를 기질에 처리하여 효소적 분해 반응시키되, 상기 처리는 Mn2+를 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4)와 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1을 포함하는 GH16B β-아가라아제는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 기질은 아가로스(agarose) 또는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides, NAOS)인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아가로스는 9중량% 이하인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 처리는 40~60℃의 온도 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 처리는 pH 5.0~8.0의 pH 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 Mn2+는 MnCl2 또는 MnSO4인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 MnCl2 또는 MnSO4는 0.5~2.5 mM의 농도인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법,
  11. 제 10항에 있어서, 상기 트리스(2-카복시에틸)-포스핀은 5~15mM의 농도인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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